JP2002538837A

JP2002538837A - 遺伝分析

Info

Publication number: JP2002538837A
Application number: JP2000605780A
Authority: JP
Inventors: マイケル・アラン・リーブ; ニコラス・イアン・ワークマン; ルイス・マルティン−パラス
Original assignee: アマシャムバイオサイエンスユーケイリミテッド
Priority date: 1999-03-12
Filing date: 2000-03-10
Publication date: 2002-11-19
Also published as: WO2000055364A2; WO2000055364A3; AU3178200A; EP1173609A2; CA2362771A1

Abstract

(57)【要約】全ゲノム分析に使用される方法が記載されている。異集団間パーフェクトマッチ二重らせんデプリーションと呼ばれる方法は、単離集団内におけるＳＮＰおよび連鎖不平衡に基いた現行方法の限界の多くを克服し得る。異集団間パーフェクトマッチ二重らせんデプリーションにより、「変化」および「未変化」集団または細胞間における差異を含む一フラグメント(または複数フラグメント)が単離される。好都合な方法−末端制限部位プロファイリングアレイ(ＴＲＳＰＡ)−が上記フラグメントの分析を目的として報告されている。部分消化の範囲および正確な性質が異集団間パーフェクトマッチ二重らせんデプリーションまたはＴＲＳＰＡ制限に関して明白に決定され得る総合診断的内部対照ＤＮＡについても記載されている。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 (緒論) 現行方法の限界ヒト集団内における一塩基多型(ＳＮＰ)および連鎖不平衡を用いたアソーシエ
ーションスタディ(関連解析)の実施には若干の限界がある(上記方法の検討につ
いてはScience、第２７８巻、１５８０頁(１９９７)参照)。我々は、所定の遺伝
子座をめぐる組換え頻度または過去のヒト遺伝的交雑を制御してはいない。突然
変異の中には近くのＳＮＰと密接な相関関係を示すものもあれば、そうではない
ものもある。

【０００２】全ゲノム分析に関する必要性ＳＮＰおよび連鎖不平衡方法(および多くの他方法)の場合、マーカーが本質的
には配列決定用手段として使用されており、マーカーが多いほど良好である。上
記主張の理論的終点は、ヒトゲノムにおけるあらゆる塩基を調べ、そして全ゲノ
ムアソーシエーションスタディと称され得るものを実施することである。本質的
に、あらゆる塩基における配列が、表現型的「変化(affected)」および表現型的
「未変化(unaffected)」集団の各構成員のゲノムについて決定される。次いで、
統計的相関関係(関連性、アソーシエーション)が配列差異および表現型間で引き
出され得る。かかる関連性は興味の対象である表現型について将来の予測的価値
を有し、表現型を知ることにより、医学および薬理遺伝学において非常に貴重な
ものとなり得る。

【０００３】本発明は、「変化」集団において表現型を決定するＤＮＡフラグメントを選択
的に濃厚化するもので、従って、ヒトおよび他の種に関する全ゲノムアソーシエ
ーションスタディを実施するという期待が非常に現実的な可能性を帯びることに
なる。

【０００４】 (本発明で使用されている語の定義) 本発明の範囲内で、全ゲノム分析に選択された個体は、ヒト、動物または植物
であり得、それらは真核生物、原核生物または古細菌起源であり得る。

【０００５】「変化」および「未変化」の語は、興味の対象である明確な表現型を有する群
(「変化個体」)および興味の対象である表現型を有しない群(「未変化個体」)の
２群に個体を分類するため限定せずに使用される。「変化」個体に共通した表現
型は、有益(例、これらの個体の場合、特定医薬品(pharmaceutical entity)はＩ
Ｉ相臨床試験で高い有効性を示し得る)または有害(例、これらの個体の場合、特
定医薬品はＩ相臨床試験で有害な毒性作用を示し得る)であり得る。

【０００６】「変化」集団は、本発明の実施態様(下記参照)に従い１体またはそれ以上の個
体を含み得、「未変化」集団も同様に１体またはそれ以上の個体を含み得る。

【０００７】ＤＮＡの語は、わかり易くするため全体を通して使用されている。本発明の範
囲内において、ＤＮＡの語は、１つまたはそれ以上の生殖系列または体細胞(複
数も可)の半数体、二倍体または倍数体ゲノムＤＮＡ含量の全部または一部に同
等に適用され得る。ＤＮＡは、個体(複数も可)から直接採取された細胞から抽出
され得るか、ＤＮＡは、個体(複数も可)から培養または不死化された細胞から抽
出され得るか、またはＤＮＡは、個体(複数も可)から誘導された挿入体と共にク
ローンのライブラリーから調製され、適当な宿主およびクローニングベクター系
で増殖され得る。ＤＮＡの語が一つまたはそれ以上の体細胞の半数体、二倍体ま
たは倍数体ゲノムＤＮＡ含量の発現部分を指し、ＤＮＡが個体(複数も可)から誘
導された挿入体と共に、クローンのライブラリーから調製され、適当な宿主およ
びクローニングベクター系で増殖される特定ケースの場合、ｃＤＮＡライブラリ
ー(基準化または他の状態)が使用され得る。

【０００８】本発明では、ＤＮＡをフラグメント化形態で比較する。フラグメント化は、Ｄ
ＮＡ抽出後、クローニング前および／またはクローニング後に遂行され得る。制
限酵素消化は、上記フラグメント化に好ましい方法であるが、他の方法(例、シ
アリングまたは音波処理)も当業界の熟練者にとっては明白なものである。

【０００９】ＤＮＡが、個体(複数も可)から誘導された挿入体と共にクローン(ゲノムクロ
ーンまたはｃＤＮＡクローン)のライブラリーから調製され、適当な宿主および
クローニングベクター系で増殖され、また制限酵素フラグメント化がクローニン
グ前に使用される特定ケースの場合、ポリメラーゼ連鎖反応増幅法を使用するこ
とにより、フラグメント形態で比較するためのＤＮＡが調製され得る。クローン
化制限酵素フラグメント化挿入体の両側に隣接するベクター配列内のプライミン
グ部位は、興味の対象であるフラグメント化ＤＮＡの１回またはそれ以上のサイ
クルのポリメラーゼ連鎖反応増幅法に有益に使用され得る。興味の対象であるフ
ラグメント化ＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応増幅法に使用されるプライマーはま
た、表現型決定フラグメント濃厚化プロセス後に使用され、濃厚化フラグメント
を「救出」およびクローン化し得る。

【００１０】本発明の範囲内において、ビオチニル化およびストレプトアビジン捕獲の語は
、一例としてかつ本発明の好ましい態様として使用され得る。ストレプトアビジ
ンは、不活性粒子(磁気または他の形態)または容器壁(例、マイクロタイタープ
レートウェル)に表面結合され得る。ビオチンは、ポリメラーゼを用いデオキシ
ヌクレオチド三リン酸類似体を介して、ビオチンコンジュゲートプライマーおよ
びポリメラーゼ連鎖反応増幅法を用いることにより、化学的または光化学的に導
入され得る。ビオチンおよびストレプトアビジンの使用は、本発明にとって限定
ではない。本発明は、当業界の熟練者に熟知されている他の高アフィニティー捕
獲システム(例、「ｈｉｓ標識」導入および金属イオンアフィニティー捕獲)の場
合でも同等に使用され得る。

【００１１】本発明の範囲内において、「正常な」の語に対して使用される「異常な」の語
は、「正常な」対の片方で見られるもの(または複数のもの)とは異なる一体細胞
突然変異(または体細胞突然変異のセット)の獲得から生じる識別可能な一表現型
特性(または複数の特性)をもつ一体細胞(または複数の体細胞)を示すために非限
定的に使用される。細胞は、ほとんど通常、次の表現型特性：改変されたマーカ
ー遺伝子発現、改変されたゲノム体制、ある種の選択的培養条件下における成長
、培地における不死化培養、インビボまたはインビトロでの制御されていない成
長、インビボまたはインビトロでの正常なアポトーシス制御機構の機能不全、新
生血管形成の誘導、上皮全域における細胞の逸脱、遊走細胞の生存または転移の
うちの一つまたはそれ以上に至る異なる一体細胞突然変異(または体細胞突然変
異のセット)の獲得を通してそれらの「正常な」対の片方に対して「異常である
」と考えられる。

【００１２】本発明の範囲内において、ミスマッチ認識タンパク質の語は、その全長にそっ
てパーフェクトマッチしているわけではないＤＮＡ二重らせんの選択的認識(お
よびそれへの結合)が可能な真核生物、原核生物または古細菌起源のタンパク質
を示すのに限定せずに使用されている。この認識(および結合)は、好ましくは正
確なワトソンおよびクリック対合に関与していない塩基および小さな欠失または
挿入に関するものである。多くの上記タンパク質が当業界の熟練者に知られてい
る。原核生物および真核生物ｍｕｔＳ同族体、ファージＴ４エンドヌクレアーゼ
VII、ファージＴ７エンドヌクレアーゼＩおよび植物酵素ＣＥＬ−１は、該当す
る幾つかの例である。

【００１３】異集団間パーフェクトマッチ二重らせん欠失異集団間パーフェクトマッチ二重らせんデプリーション(depletion)方法にお
いて、我々は、「変化」個体のプールされたＤＮＡを「未変化」個体のプールさ
れたＤＮＡと(フラグメント形態で)比較する(異系交配された集団および他に可
能な限り互いに類似した集団からの両方)。我々は、差異が「変化」および「未
変化」ＤＮＡ分子間に見られる領域に関心があるのにすぎない。上記集団の場合
、(「未変化」プールの場合と比べた)「変化」プール内における優勢な配列差異
だけは、当然それらに共通の表現型を実際に決定する遺伝子(複数も可)(遺伝子
の語を、エキソン、イントロン並びに全ての関連した上流および下流調節配列を
含めその最も広い意味で用いる)内のどこかにあるはずである。これは、我々が
、高い遺伝的等質性が存在する希有な(および恐らくは非典型的)集団を対象とす
る研究に積極的には取り組まないことを意味する。

【００１４】全表現型確定集団からのＤＮＡをプールすることにより、それに係る労働量が
大きく低減化される。

【００１５】集団におけるＤＮＡ配列変異 Nickersonら、Nature Genetics、第１９巻、２３３頁(１９９８)によると、７
１個体(アフリカ系アメリカ人２４人、ヨーロッパ人２４人およびヨーロッパ系
アメリカ人２３人)からの９.７kbのリポタンパク質リパーゼ遺伝子が配列決定さ
れた。この遺伝子はかなり典型的である(９０％イントロンおよび１０％エキソ
ン−１０エキソンを伴う総サイズ３０kb)。

【００１６】８８配列変異型が見出された(すなわち、平均して１１０bpにつき一つ)。ほと
んどの変異型は非コーディング配列から見出された。これらの９０％はＳＮＰで
あった(その６０％はトランジションであり、４０％はトランスバージョンであ
った)。ＳＮＰは全て２アレル性(２多型性、biallelic)であった。配列変異型の
１０％は反復配列における挿入または欠失であった。

【００１７】配列変異型の５８％は、３種の全民族集団に存在していた。これらの半分はヘ
テロ接合体形態で見出され、もう半分はホモ接合体形態で見出された。

【００１８】ヌクレオチド多様性(集団から取り出された染色体のランダム対間における一
部位当たりのヌクレオチド差異の予測数として定義される)は、一般にＤＮＡに
ついては１／５００であり、コーディング配列ＤＮＡについては１／２０００で
ある。これは、平均して、かかる集団から一緒にアニーリングされた２つのＤＮ
Ａフラグメントは５００塩基ごとにミスマッチを含むことを意味する。

【００１９】従って、ＤＮＡ配列変異型は非常に一般的である。しかしながら、それらは全
体的にランダムではなく、５００程度の塩基ごとに見られる変異型は制限されて
いる。それらは一般的にちょうどその単一塩基において２多型性を示す。それこ
そ、異集団間パーフェクトマッチ二重らせんデプリーション方法が選択的に利用
しているというこの事実である。

【００２０】異集団間パーフェクトマッチ二重らせんデプリーションフラグメント化プロセ
スの統計的分析ＤＮＡフラグメントの長さがＦ塩基であり、２個のＤＮＡ分子間における配列
差異間の平均長が５００塩基である場合、２個のランダムＤＮＡフラグメント間
のハイブリッド二重らせんがミスマッチを全く含まないという確率は、Ｐｒ(０)＝ｅ^{−(Ｆ／５００)} により与えられ、２個のランダムＤＮＡ分子間のハイブリッド二重らせんが何ら
かのミスマッチを含む確率は、Ｐｒ(≧１)＝{１−(ｅ^{−(Ｆ／５００)})} により与えられる。

【００２１】異なる値のＦに関するＰｒ(０)およびＰｒ(≧１)の例としての価は次の通りで
ある。

【表１】

【００２２】６つの６bpカッターおよび４つ以下の４bpカッターによるＤＮＡ消化に関する
実例的平均制限フラグメントサイズ各６bpカッターは、平均して４０９６bpごとにＤＮＡを切断し、各４bpカッタ
ーは、平均して２５６bpごとにＤＮＡを切断する。

【００２３】Ａ６bpカッターおよびＢ４bpカッターの与えられたセットの場合(制限酵素切
断配列の重複を伴わない)、平均フラグメント長Ｆは、 {(Ａ／４０９６)＋(Ｂ／２５６)}^−１となる。

【００２４】ＡおよびＢを変えるに従いＦに関する例としての価は下表に与えられている。

【表２】

【００２５】我々は、上記状況が、４bpカッター認識部位のいずれも６bpカッター認識部位
のいずれかの範囲内には存しないと仮定していることに留意すべきである。例え
ば、我々が６bpカッター認識部位内に組込まれた４bpカッター認識部位を有する
場合(例、フラグメント化におけるＭｂｏＩおよびＢａｍＨＩの使用による)、我
々は、上記においてＡの価を６から５に減らすべきである。

【００２６】一般に、我々が、平均してａ bpごとにＤＮＡを切断するＡ酵素、平均してｂ
bpごとにＤＮＡを切断するＢ酵素、...平均してｚ bpごとにＤＮＡを切断するＺ
酵素から成る与えれらたセット(制限酵素切断配列の重複を伴わない)を有する場
合、平均フラグメント長Ｆは {(Ａ／ａ)＋(Ｂ／ｂ)＋...＋(Ｚ／ｚ)}^−１となる。

【００２７】フラグメント化用６bpカッターおよび４bpカッターの実例的セット末端制限部位プロファイリングアレイ(ＴＲＳＰＡ)解析(下記参照)と適合性の
ある６つの６bpカッターのパネルを含む６bpカッターおよび４bpカッターの実例
的セットが下記に与えられている：実例的酵素セット１Ｍ緩衝液＋ＢＳＡにおける制限の場合

【表３】

【００２８】酵素セット２Ｍ緩衝液＋ＢＳＡにおける制限の場合

【表４】

【００２９】態様(Ｉ) 一態様において、本発明は、変化ＤＮＡをフラグメント化形態で提供し、未変
化ＤＮＡをフラグメント化形態で提供することによる、興味の対象である表現型
に特有なフラグメントに富むＤＮＡフラグメントの混合物の提供方法であって、
ａ)ハイブリダイゼーション条件下、変化ＤＮＡのフラグメントおよび未変化Ｄ
ＮＡのフラグメントを混合し、ｂ)ミスマッチを含むハイブリッド混合物を回収し、ｃ)ミスマッチを含むハイブリッド混合物から変化ＤＮＡのフラグメントを回収
することを含み、そして所望によりステップａ)、ｂ)およびｃ)を１回またはそれ以上反復して
もよい方法を提供する。

【００３０】異集団間ミスマッチ含有二重らせん選択「変化」対「未変化」(すなわち、異集団間)ミスマッチ含有二重らせん選択は
、ミスマッチ結合性タンパク質を固体支持体に結合させ(またはミスマッチ結合
性タンパク質を溶解状態で用い、次いで後続の固相捕獲を行う)、フラグメント
化および変性「変化」ＤＮＡを採取し、これを過剰のフラグメント化、変性およ
びビオチニル化「未変化」ＤＮＡとハイブリダイズさせ、次いでミスマッチ含有
二重らせん分子を捕獲することにより達成され得る。変性、ストレプトアビジン
捕獲を伴わずにミスマッチ含有二重らせん分子を放出させ、次いで非ビオチニル
化鎖を放出させると、下記に示されている所望の種類のみ得られる。

【００３１】 (方法) 「変化」ＤＮＡをフラグメントにする。「未変化」ＤＮＡをビオチンによりフ
ラグメントおよび誘導体化する。この集団からのＤＮＡのみストレプトアビジン
捕獲される。融解およびアニーリングすることにより、次のものが得られる。

【表５】

【００３２】ミスマッチ結合性タンパク質を選択する。ミスマッチ含有二重らせんのみを捕
獲する。変性を伴わずに放出させると、次のものが得られる。

【表６】

【００３３】ストレプトアビジン捕獲により、次のものが得られる。

【表７】

【００３４】非ビオチニル化鎖を放出させると、次のものが得られる。

【表８】必要に応じて反復する。

【００３５】上記連続反応の反復により、異集団間パーフェクトマッチ二重らせんデプリー
ションが誘導される。

【００３６】何が精製されるか？上記異集団間ミスマッチ含有二重らせん選択法は、様々な表現型決定フラグメ
ント(「変化」集団に特有)の全てが後続分析用に捕獲されるのを確実にするが、
それはまた非常に多くのＳＮＰ含有(「ノイズ」)フラグメントの共精製を誘発す
ることにもなる。

【００３７】上記の異集団間パーフェクトマッチ二重らせんデプリーションサイクルを実施
する際、我々は、様々なタイプのフラグメント(すなわち、表現型を決定するも
のおよび決定しないもの)の結末を考える必要がある。

【００３８】ストレプトアビジン捕獲後の「変化」ＤＮＡ分子の回収特定フラグメントについて、完全なハイブリダイゼーション後に「変化」ＤＮ
ＡのＸ分子および「未変化」ビオチニル化ＤＮＡのＹ分子がある場合、{Ｘ／(Ｘ
＋Ｙ)}ストレプトアビジン非捕獲可能分子に対する{Ｙ／(Ｘ＋Ｙ)}ストレプトア
ビジン捕獲可能分子の割合が得られる。すなわち、ＸおよびＹを変えることによ
り、ストレプトアビジン捕獲可能ハイブリッドの収率が操作され得る。

【００３９】様々なＸおよびＹに関する実例的回収および喪失値が、下表に示されている。

【表９】ｎサイクル後の、表現型決定フラグメントに関する回収率は、{Ｙ／(Ｘ＋Ｙ)} ^ｎにより与えられる。

【００４０】異集団間パーフェクトマッチ二重らせんデプリーションサイクル中における全
般的ＳＮＰ含有(「ノイズ」)フラグメントの喪失フラグメント化ＤＮＡ分子を一緒にアニーリングし、ミスマッチ含有二重らせ
んのみを捕獲する場合、かかるプロセスをｎ回反復することにより、もとのフラ
グメント数が次のフラクションに低減化される。 {１−(ｅ^{‐(Ｆ／５００)})}^ｎ・{Ｙ／(Ｘ＋Ｙ)}^ｎ

【００４１】従って、異集団間パーフェクトマッチ二重らせんデプリーションサイクル中に
おけるＳＮＰ含有(「ノイズ」)フラグメントに対する表現型決定フラグメントに
関する濃厚化は、 {１−(ｅ)^{‐(Ｆ／５００)}}^―ｎにより与えられる。

【００４２】濃厚化に関する実例的値は下記に与えられており、Ｆ＝５０、１００、２００
、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００および１０００お
よびｎ＝１、２、３、４、５、６、７、８、９および１０である。

【表１０】

【００４３】異集団間パーフェクトマッチ二重らせんデプリーションサイクル中における特
異的ＳＮＰ含有(「ノイズ」)フラグメントの喪失非多型およびＳＮＰ含有(「ノイズ」)フラグメントは、上記要領でデプリーシ
ョンされる。

【００４４】しかしながら、全てのフラグメントが必ずしも同じ割合でデプリーションされ
るわけではない。個々のＳＮＰ含有(「ノイズ」)フラグメントは、下記で概説さ
れている異集団間パーフェクトマッチ二重らせんデプリーションサイクルごとに
デプリーションされる。

【００４５】特定フラグメント内に多型に関して２種のアレルが存在すると仮定する。これ
らをＰおよびＱと呼ぶ。ｐを、(異系交配)「変化」および「未変化」集団におけ
るＰアレルのフラクションとし、ｑをＱアレルのフラクションとする。(ｐ＋ｑ)
＝１とし、従ってｑ＝(１−ｐ)である。

【００４６】変性およびアニーリング後、起こり得る４種の事象はＰＰ、ＰＱ、ＱＰおよび
ＱＱである。ＰＰおよびＱＱはパーフェクトマッチ二重らせんを形成し、従って
喪失されるが、ＰＱおよびＱＰはミスマッチ含有二重らせんを形成するため回収
される。

【００４７】一サイクル後、回収された分子のフラクションは次の通りである。 {２ｐｑ／(ｐ^２＋２ｐｑ＋ｑ^２)} ＝{２ｐｑ／((ｐ＋ｑ)^２)}} ＝２ｐｑ＝２ｐ(１−ｐ)

【００４８】このため、集団からのＤＮＡのＭ分子により出発する場合、第１ラウンドの異
集団間ミスマッチ含有二重らせん選択後に２Ｍｐｑ分子が残存する。第２ラウン
ドの異集団間ミスマッチ含有二重らせん選択に入る分子の数をＭ'で表すと、Ｍ'＝２Ｍｐｑであり、そして喪失分子のフラクションは、次の通りである。 {(ｐ^２＋ｑ^２)／(ｐ^２＋２ｐｑ＋ｑ^２)} ＝{(ｐ^２＋ｑ^２)／((ｐ＋ｑ)^２)} ＝ｐ^２＋ｑ^２＝ｐ^２＋{１−２ｐ＋ｐ^２} ＝１−２ｐ＋２ｐ^２１−２ｐ(１−ｐ) ＝１−２ｐｑＰアレル分子のフラクション喪失はｐ^２となり、Ｑアレル分子のフラクション
喪失はｑ^２(＝(１−ｐ))となる。

【００４９】集団からのＤＮＡのＭ分子から出発する場合、異集団間ミスマッチ含有二重ら
せん選択前にはＰアレル分子のＭｐおよびＭｑ＝Ｑアレル分子のＭ(１−ｐ)とい
う関係が存する。従って、異集団間ミスマッチ含有二重らせん選択後、Ｍｐ−Ｍ
ｐ^２＝Ｍｐ(１−ｐ)＝Ｐアレル分子のＭｐｑおよびＭｑ−Ｍｑ^２＝Ｍｑ(１−ｑ)
＝Ｑアレル分子のＭｑｐとなる。言い換えれば、ミスマッチ含有二重らせん選択
の第１ラウンド後、Ｑアレル分子の場合と同数のＰアレル分子が存在する。

【００５０】新たなアレル頻度ｐ'およびｑ'は、次の通り定義され得る。ｐ’＝ｑ’＝０.５

【００５１】異集団間ミスマッチ含有二重らせん選択の第２ラウンドを遂行する場合、第１
ラウンドからのＤＮＡのＭ'分子から出発する。異集団間ミスマッチ含有二重ら
せん選択前にはＰアレル分子のＭ'ｐ'およびＱアレル分子のＭ'ｑ'という関係が
存在する。

【００５２】従って、異集団間ミスマッチ含有二重らせん選択後、Ｍ'ｐ'−Ｍｐｐ'＝Ｍ'ｐ
'(１−ｐ)＝Ｐアレル分子のＭ'ｐ'ｑおよびＭ'ｑ'−Ｍｑｑ'＝Ｍ'ｑ'(１−ｑ)＝
Ｑアレル分子のＭ'ｑ'ｐという関係が存在する。

【００５３】分子(Ｍ")の総数は、Ｍ'ｐ'ｑ＋Ｍ'ｑ'ｐ＝Ｍ'(ｐ'ｑ−ｑ'ｐ)となるが、ｐ'＝ｑ'＝０.５であるため、Ｍ"＝０.５^★Ｍ'(ｐ＋ｑ)であるが、 (ｐ＋ｑ)＝１であるため、Ｍ"＝(Ｍ'／２)となる。

【００５４】言い換えれば、第２ラウンドの異集団間ミスマッチ含有二重らせん選択後、や
はりＱアレル分子と同数のアレル分子が存在することになる。すなわち、新規ア
レル頻度ｐ"およびｑ"は、以前の通りｐ"＝ｑ"＝０.５のままである。

【００５５】現時点で一つのパターンが出現する。異集団間ミスマッチ含有二重らせん選択
の第１サイクル後、アレル頻度を等しくし、分子数を２Ｍｐｑ(各アレル分子の
Ｍｐｑ)に減少させる。その後、どのサイクルでも分子数は半減され、両アレル
とも同じ頻度に保たれる。

【００５６】従って、ｎサイクル後、Ｐアレル分子数は、Ｍｐｑ(０.５)^ｎ−１となり、Ｑアレル分子数は、Ｍｑｐ(０.５)^ｎ−１となり、勿論、両方とも等しい。

【００５７】捕獲収率(上記参照)を考慮に入れる場合、ＳＮＰ含有(「ノイズ」)フラグメン
ト収率は、２Ｍｐｑ(０.５)^ｎ−１・{Ｙ／(Ｘ＋Ｙ)}^ｎにより与えられ、その場合両アレル変異体とも捕獲された「ノイズ」であるとみ
なされる。

【００５８】制限消化のパターンを妨害する多型異集団間パーフェクトマッチ二重らせんデプリーションサイクル(上記)中にお
ける一般的および特異的ＳＮＰ含有(「ノイズ」)フラグメントが両方とも失われ
る場合およびＳＮＰが制限消化パターンを妨害する場合で、ミスマッチ結合性タ
ンパク質がまた長さの等しくない(例、制限部位多型の部位周囲での異集団間ア
ニーリングにより生じる)二重らせん分子に結合する場合、上記分析は依然とし
て有効である(パーフェクトマッチ二重らせんが等しい長さの二重らせんにより
置き換えられ、ミスマッチ含有二重らせんが等しくないパートナー長の二重らせ
んにより置き換えられている)。

【００５９】興味の対象である表現型を実際に決定する配列変化故に制限部位が失われてい
る希なケースでは、２倍長のフラグメントが得られる。これは、二重末端制限部
位プロファイリングアレイ(ＴＲＳＰＡ)のサインを生じさせる(下記参照)。特定
二重サインを有する多単離体は、フラグメントおよび興味の対象である表現型間
における関係の指標である。

【００６０】表現型決定フラグメントのプールからのＳＮＰ含有「ノイズ」の選択的除去を
促進するさらなる「動力学的」濃厚化上記手順による多サイクルの濃厚化後、濃厚化ＤＮＡプールには、当然、全表
現型決定フラグメントのコピーが多数含まれるが、多くの異なる表現型非決定フ
ラグメントのコピー数は低い。個々の各種「ノイズ」の数は非常に少数であるに
もかかわらず、「ノイズ」フラグメントの総数は、表現型決定フラグメントの数
を越え得る。従って、「ノイズ」フラグメントにより、パターンが現れる前にＴ
ＲＳＰＡ分析に要求されるプローブの数は増加する。この問題を大幅に削減する
ため、さらなる動力学的濃厚化方法を使用する。下記戦略ＡおよびＢの一方また
は両方を用いることにより、「動力学的」濃厚化が達成され得る。

【００６１】戦略Ａ−異集団間ミスマッチ含有二重らせんデプリーションからの濃厚化ＤＮ
Ａの減算異集団間ミスマッチ含有二重らせんデプリーションからのフラグメントプール
が、迅速に自己ハイブリダイズすることにより、希有な「ノイズ」フラグメント
の場合より高い効率で共通の表現型決定フラグメントによるパーフェクトマッチ
二重らせんの形成が可能となる。次いで、パーフェクトマッチ二重らせんに関す
る選択により、フラグメントの選択的にさらに濃厚化されたプールが得られる。
必要ならば、多サイクルの減算が実施され得る。

【００６２】戦略Ｂ−「変化」ＤＮＡプールに対する異集団間ミスマッチ含有二重らせんデ
プリーションからの濃厚化ＤＮＡのハイブリダイゼーション次いで、異集団間ミスマッチ含有二重らせんデプリーションから濃厚化された
フラグメントプールを、「変化」プールからの過剰のビオチニル化ＤＮＡとハイ
ブリダイズさせる。この結果、希有な「ノイズ」フラグメントの場合よりも高い
効率で、共通表現型決定フラグメントによるパーフェクトマッチ二重らせんの形
成が可能となる。パーフェクトマッチ二重らせんに関する選択、次いでストレプ
トアビジン捕獲および変性により非ビオチニル化鎖が放出され、さらに濃厚化さ
れたフラグメントプールが得られる。必要ならば、かかる「変化」プールのバッ
クハイブリダイゼーションが実施され得る。

【００６３】「変化」および「未変化」間の区別が明確な集団内における単一表現型的「変
化」個体の場合への本発明への拡張上記では、「変化」集団からの非ビオチニル化ＤＮＡフラグメントおよび「未
変化」集団からのビオチニル化ＤＮＡフラグメント間における異集団間パーフェ
クトマッチ二重らせんデプリーションについて記載している。「未変化」集団が
充分に複雑であるため、単一「変化」個体から見出される全ての非表現型決定配
列変異型がそこに含まれている場合、異集団間パーフェクトマッチ二重らせんデ
プリーションは、当然、「変化」および「未変化」間の区別が明確な「未変化」
集団に対する単一表現型的「変化」個体について可能である。「未変化」集団に
おける少数の誤診「変化」個体により、異集団間パーフェクトマッチ二重らせん
分子デプリーション中における表現型決定フラグメントの除去が誘発されないこ
とを保証するために後者の条件は必要とされる。

【００６４】新規表現型決定突然変異が一ファミリー内で自然発生する事例における疾患遺
伝子同定の場合への本発明の拡大少数の配列変化を除き、我々は、各々我々の両親に由来するＤＮＡ配列を含ん
でおり、それが、正確に我々が受け継いでいる親のアレルから生じる我々の個性
である。上記少数の配列変化の一つにより表現型の変化が生じる場合、異集団間
パーフェクトマッチ二重らせんデプリーションを用いることにより、表現型にお
けるこの変化をコード化するフラグメントについて濃厚化することができる。

【００６５】ビオチニル化フラグメントの供給源として「未変化全祖先」細胞(ここでは、
「未変化」祖先の完全セット、例えば両親、または母親＋２父方祖父母、または
父親＋２母方祖父母、または２母方祖父母および２父方祖父母等に由来する細胞
を意味する)および非ビオチニル化フラグメントの供給源として「変化」子孫か
らの細胞を採取する場合、「未変化」祖先世代および「変化」子孫世代間におけ
る獲得性表現型決定配列変化を有するフラグメントはいずれも、ビオチニル化「
未変化全祖先」フラグメントとのパーフェクトマッチ二重らせんを形成すること
はできない。すなわち、連続サイクルのかかる異集団間パーフェクトマッチ二重
らせんデプリーションにより、全ての上記配列を担うフラグメントの濃厚化が誘
導され、１サイクル当たりの濃厚化の程度は下記に記載されている通りである。

【００６６】 (統計的分析) 等しい数のフラグメントが「未変化」祖先の各々から使用されるものとする。
上記祖先の数をＡとする。

【００６７】異集団間パーフェクトマッチ二重らせんデプリーションにおけるアニーリング
の{１／Ａ}は、自己対自己異集団間パーフェクトマッチ二重らせんデプリーショ
ンと統計的に均等内容である、自己対祖先伝達アレルである(下記参照)。

【００６８】異集団間パーフェクトマッチ二重らせんデプリーションにおけるアニーリング
の{(Ａ−１)／Ａ}は、非関連個体間における異集団間パーフェクトマッチ二重ら
せんデプリーションと統計的に均等内容である、自己対祖先非伝達アレルである
。

【表１１】

【００６９】 Nickersonらのデータから、非関連個体間におけるＤＮＡ配列変異は５００塩
基対ごとに生じている(我々が、自己対祖先非伝達アレルによる異集団間パーフ
ェクトマッチ二重らせんデプリーションおよび非関連個体間における異集団間パ
ーフェクトマッチ二重らせんデプリーションについて使用しているのはこの数字
である)。さらに、与えられた個体は、当然５７３塩基対ごとに１回ヘテロ接合
性である(この数字は、自己対祖先伝達アレルによる異集団間パーフェクトマッ
チ二重らせんデプリーションおよび自己対自己異集団間パーフェクトマッチ二重
らせん分子デプリーションに使用されている)。伝達アレルおよび非伝達アレル
に対する異集団間パーフェクトマッチ二重らせんデプリーションは、現時点では
別々に考えられる。

【００７０】自己対祖先伝達アレル異集団間パーフェクトマッチ二重らせんデプリーション「変化」子孫からのＤＮＡおよび「未変化」祖先の伝達アレルを含むＤＮＡを
用いて、一フラグメントに関する２本の相補鎖をアニーリングする場合、フラグ
メントの{１−ｅ^{(‐Ｆ／573)}}は、１個またはそれ以上のヘテロ接合性部位を含
む。アニーリングの{１／Ａ}はこのタイプに属する。かかるアニーリングについ
て、ヘテロ接合性部位が存在する場合、ビオチニル化フラグメントおよびヘテロ
接合性部位を含む非ビオチニル化フラグメント間におけるミスマッチ含有二重ら
せんが得られる確率は０.５である。

【００７１】自己対祖先非伝達アレル異集団間パーフェクトマッチ二重らせんデプリーショ
ン「変化」子孫からのＤＮＡおよび「未変化」祖先の非伝達アレルを含むＤＮＡ
を用いて一フラグメントに関する２本の相補鎖をアニーリングする場合、フラグ
メントの{１−ｅ^{(-Ｆ／５００)}}は１個またはそれ以上のＤＮＡ配列変異部位を
含む。{(Ａ−１)／Ａ}アニーリングはこのタイプに属する。

【００７２】表現型決定フラグメント濃厚化従って、第１サイクルの異集団間パーフェクトマッチ二重らせんデプリーショ
ンを通して担われたフラグメントのフラクションは、次の通りとなる： ([0.5・{1/A}・{1−e^{(‐Ｆ／５７３)}}]＋[{(A−1)/A}・{1−e^{(‐Ｆ／５００)}}])・{Y
/(X＋Y)} (式中、{Ｙ／(Ｘ＋Ｙ)}はストレプトアビジン捕獲分子の収率を表す)

【００７３】このため、かかるプロセスのｎ回反復により、もとのフラグメント数が次のフ
ラクションに低減化される： ([0.5{1/A}・{1-e^(‐F/573)}]+[{(A-1)/A}・{1-e^(-F/500)}])ⁿ・{Y/(X+Y)}ⁿ

【００７４】従って、異集団間パーフェクトマッチ二重らせんデプリーションサイクル中に
おけるＳＮＰ含有(「ノイズ」)フラグメント全体にわたる表現型決定フラグメン
トに関する濃厚化は、下式により与えられる： ([0.5{1/A}・{1-e^(‐F/573)}]+[{(A-1)/A}・{1-e^(-F/500)}])ⁿ・{Y/(X+Y)}^-n

【００７５】濃厚化に関する例示値は、下記Ａ＝２、３および４について、Ｆ＝５０、１０
０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００および
１０００であり、ｎ＝１、２、３、４、５、６、７、８、９および１０である。

【００７６】

【表１２】

【００７７】

【表１３】

【００７８】

【表１４】

【００７９】個体内における完全包括的「異常」細胞突然変異プロファイリングの事例への
本発明の拡大ビオチニル化フラグメントの供給源として「正常」細胞および非ビオチニル化
フラグメントの供給源として同じ個体からの「異常」細胞を採取する場合、「異
常な」ものになる途中における獲得性配列変化を有するフラグメントでは、ビオ
チニル化「正常」フラグメントとのパーフェクトマッチ二重らせんを形成し得な
い。すなわち、連続サイクルの上記異集団間パーフェクトマッチ二重らせんデプ
リーションにより、「正常」細胞および「異常」細胞間における配列差異の全て
を担うフラグメントが濃厚化され、１サイクル当たりの濃厚化の程度は下記の通
りとなる。

【００８０】 Nickersonらのデータから、与えられた個体は、当然５７３塩基対ごとに約１
回ヘテロ接合性を示す。「異常」細胞からのＤＮＡおよび「正常」細胞からのＤＮＡを用いて一フラグ
メントに関する２本の相補鎖をアニーリングする場合、フラグメントの{１−ｅ⁽ ^-F/573) }は１個またはそれ以上のヘテロ接合性部位を含む。

【００８１】ヘテロ接合性部位の場合、ｐおよびｑは両方とも０.５である。ビオチニル化
フラグメントおよび上記部位を含む非ビオチニル化フラグメント間においてパー
フェクトマッチ二重らせんが得られる確率は、０.５である。同様に、ビオチニ
ル化フラグメントおよび上記部位を含む非ビオチニル化フラグメント間において
ミスマッチ含有二重らせんが得られる確率もまた０.５である。

【００８２】従って、第１サイクルの異集団間パーフェクトマッチ二重らせんデプリーショ
ンを通して担われたフラグメントのフラクションは、次の通りとなる： 0.5・{1−e^{(‐Ｆ／５７３)}}・{Y/(X＋Y)}

【００８３】このため、かかるプロセスのｎ回反復により、もとのフラグメント数が次のフ
ラクションに低減化される： [0.5・{1-e^(‐F/573)}]ⁿ・{Y/(X+Y)}ⁿ

【００８４】従って、異集団間パーフェクトマッチ二重らせんデプリーションサイクル中に
おけるＳＮＰ含有(「ノイズ」)フラグメント全体にわたる表現型決定フラグメン
トに関する濃厚化は、下式により与えられる： [0.5・{1-e^(‐F/573)}]^-n

【００８５】濃厚化に関する例示値は、Ｆ＝５０、１００、２００、３００、４００、５０
０、６００、７００、８００、９００および１０００であり、ｎ＝１、２、３、
４、５、６、７、８、９および１０である。

【表１５】

【００８６】この方法により、「異常」細胞内の配列差異全てを含むフラグメントが濃厚化
され、調べられる必要があり得る遺伝子(癌遺伝子、腫瘍サプレッサー遺伝子等)
に関する予備知識は全く要求されない。

【００８７】このように「変化」および「未変化」集団間における差異を決定する一フラグ
メント(または複数フラグメント)を単離することにより、それらの分析が続行さ
れ得る。

【００８８】 (態様II) 別の態様において、本発明は、興味の対象であるＤＮＡフラグメントのアレイ
のセットを作製する方法であって、ａ)ｎ制限エンドヌクレアーゼ酵素のセットから、ｒ制限エンドヌクレアーゼ酵
素のサブセットを選別し、ｂ)ｒ酵素のサブセットによりゲノムＤＮＡを消化し、ｃ)生成したフラグメントに、特有なポリメラーゼ連鎖反応増幅可能配列をもつ
制限酵素切断部位特異的アダプターを連結させ、ｄ)生成したフラグメントをｒ^２アリコートに分割し、ｅ)２つの制限酵素特異的プライマーにより各アリコートを増幅し、ｆ)アンプリファイアのｒ^２アリコートのアレイを形成し、そしてｇ)ｒ制限エンドヌクレアーゼ酵素の異なるサブセットを用いてステップａ)〜ｆ
)を反復することを含む方法を提供する。本発明はまた、この方法により得られたかまたは得
られるアレイのセットを包含する。

【００８９】ｎ制限エンドヌクレアーゼ酵素は、４カッターおよび５カッターおよび６カッ
ターから選択され得、一セットはこれらの範ちゅうの１種、２種または３種から
の酵素を含み得る。ｎの値は、下記で検討されている理由により好ましくは３〜
１０である。ｒの値はｎより小さく、好ましくは２〜４であり、選択された酵素
が核酸を切断する頻度、およびＰＣＲによるフラグメント増幅の容易さに関して
選択される。

【００９０】末端制限部位プロファイリングアレイ(ＴＲＳＰＡ) フラグメント化に使用される酵素の全セット内の全部でｎ個の６bpカッター制
限酵素を使用する場合、ｒ個の６bpカッター酵素のサブセット(全セットｎ個か
ら採取)を使用することにより、下記の通り(ｒ×ｒ)ＴＲＳＰＡ試験マトリック
スを製作する。

【００９１】バージョン１−(ＴＲＳＰＡ−１) 各(ｒ×ｒ)ＴＲＳＰＡ試験マトリックスの場合、全てのｒ制限酵素によりＤＮ
Ａを完全に消化する。制限酵素切断部位特異的アダプターにおいて特有なポリメ
ラーゼ連鎖反応増幅可能標識を連結する。ｒ^２アリコートに分離し、各アリコー
トについて、ビオチニル化制限酵素_ｊおよび非ビオチニル化制限酵素_ｋ標識特異
的プライマーにより増幅し、１およびｒ間のｊおよびｋの全値について非ビオチ
ニル化鎖を整列させる。

【００９２】 (実施例) 下記ｄｓＤＮＡについて考える：

【化１】 (式中、制限酵素切断部位をＡ、ＢおよびＣで示し、制限消化後のフラグメント
を１、２、３、４および５で示し、＋および−は鎖のセンスを示す。)

【００９３】Ａ、ＢおよびＣにより完全に切断すると、次のものが得られる：

【化２】

【００９４】下記プライマーマトリックスおよびストレプトアビジン捕獲に従いポリメラー
ゼ連鎖反応により増幅すると、下記のものが得られる：

【表１６】

【００９５】非ビオチニル化鎖のみを保つと、次のものが得られる：

【表１７】

【００９６】簡易化形態：

【表１８】制限酵素の全^ｎＣ_ｒの組み合わせについて反復すると、ＴＲＳＰＡが生成され
る。

【００９７】ＴＲＳＰＡ−１ハイブリダイゼーションパターン異集団間パーフェクトマッチ二重らせんデプリーションにより得られるプロー
ブを用いて当然予測される２タイプのＴＲＳＰＡ−１ハイブリダイゼーションパ
ターンは次の通りである：１．対角線からはずれた成分(例、横行ｘ、縦列ｙ、ただしｘおよびｙは異なる)
および対角線の反対側に映し出されたその相補的成分(すなわち、横行ｙ、縦列
ｘ)とのハイブリダイゼーションおよび２．対角線上成分(例、横行ｚ、縦列ｚにおけるエレメント)とのハイブリダイゼ
ーション。

【００９８】ＴＲＳＰＡ−１分析−ｎ＝３およびｒ＝２の場合の実施例ｄｓＤＮＡを例として挙げる： -C-1-B-2-B-3-A-4-A-5-C-6-C-7-B-8-A-9-A- (式中、Ａ、ＢおよびＣは制限酵素切断部位を示す。１、２、３、４、５、６、
７、８および９は消化後の制限フラグメントを示す)

【００９９】ＴＲＳＰＡ−１試験マトリックス ^３Ｃ_２＝３ＴＲＳＰＡ−１試験マトリックス−ＡＢ、ＢＣおよびＡＣが存在
する。

【０１００】試験マトリックスハイブリダイゼーションパターン試験マトリックスの各々について、{(２・(２＋１))／２}＝３の可能なハイブ
リダイゼーションパターンが存在する：

【表１９】

【０１０１】組み合わせの多様性３種の可能なＴＲＳＰＡ−１試験マトリックスハイブリダイゼーションパター
ンおよび３種の可能な試験マトリックスが存在する場合、３^３＝２７の可能なＴ
ＲＳＰＡ−１サインが存在する。

【０１０２】フラグメント４分析−ＡＢＴＲＳＰＡ−１マトリックスｄｓＤＮＡを例に取る： -C-1-B-2-B-3-A-4-A-5-C-6-C-7-B-8-A-9-A- ＡおよびＢにより切断すると、次のものが得られる： −Ｃ−１−ＢＢ−２−ＢＢ−３−ＡＡ−４−ＡＡ−５−Ｃ−６−Ｃ−７−ＢＢ−８−ＡＡ−９−Ａ−

【０１０３】フラグメント４に相補的なフラグメントはＡ−４−Ａとなる。ポリメラーゼ連鎖反応により増幅し、適正なフラグメント４によりハイブリダ
イズすると、次のものが得られる：

【表２０】

【０１０４】フラグメント４分析−ＢＣＴＲＳＰＡ−１マトリックスｄｓＤＮＡを例に取る： -C-1-B-2-B-3-A-4-A-5-C-6-C-7-B-8-A-9-A-

【０１０５】ＢおよびＣにより切断すると、次のものが得られる： −Ｃ−１−ＢＢ−２−ＢＢ−３−Ａ−４−Ａ−５−ＣＣ−６−ＣＣ−７−ＢＢ−８−Ａ−９−Ａ−

【０１０６】フラグメント４に相補的なフラグメントは次の通りである：Ｂ−３−Ａ−４−Ａ−５−Ｃ

【０１０７】ポリメラーゼ連鎖反応により増幅し、適正なフラグメント４によりハイブリダ
イズすると、次のものが得られる：

【表２１】

【０１０８】フラグメント４分析−ＡＣＴＲＳＰＡ−１マトリックスｄｓＤＮＡを例に取る： -C-1-B-2-B-3-A-4-A-5-C-6-C-7-B-8-A-9-A-

【０１０９】ＡおよびＣにより切断すると、次のものが得られる： −ＣＣ−１−Ｂ−２−Ｂ−３−ＡＡ−４−ＡＡ−５−ＣＣ−６−ＣＣ−７−Ｂ−８−ＡＡ−９−ＡＡ−

【０１１０】フラグメント４に相補的なフラグメントは次の通りである：Ａ−４−Ａ

【０１１１】ポリメラーゼ連鎖反応により増幅し、適正なフラグメント４によりハイブリダ
イズすると、次のものが得られる：

【表２２】

【０１１２】フラグメント５分析−ＡＢＴＲＳＰＡ−１マトリックスｄｓＤＮＡを例に取る： -C-1-B-2-B-3-A-4-A-5-C-6-C-7-B-8-A-9-A-

【０１１３】ＡおよびＢにより切断すると、次のものが得られる： −Ｃ−１−ＢＢ−２−ＢＢ−３−ＡＡ−４−ＡＡ−５−Ｃ−６−Ｃ−７−ＢＢ−８−ＡＡ−９−Ａ―

【０１１４】フラグメント５に相補的なフラグメントは次の通りである：Ａ−５−Ｃ−６−Ｃ−７−Ｂ

【０１１５】ポリメラーゼ連鎖反応により増幅し、適正なフラグメント５によりハイブリダ
イズすると、次のものが得られる：

【表２３】

【０１１６】フラグメント５分析−ＢＣＴＲＳＰＡ−１マトリックスｄｓＤＮＡを例に取る： -C-1-B-2-B-3-A-4-A-5-C-6-C-7-B-8-A-9-A-

【０１１７】ＢおよびＣにより切断すると、次のものが得られる： −Ｃ−１−ＢＢ−２−ＢＢ−３−Ａ−４−Ａ−５−ＣＣ−６−ＣＣ−７−ＢＢ−８−Ａ−９−Ａ−

【０１１８】フラグメント５に相補的なフラグメントは次の通りである：Ｂ−３−Ａ−４−Ａ−５−Ｃ

【０１１９】ポリメラーゼ連鎖反応により増幅し、適正なフラグメント５によりハイブリダ
イズすると、次のものが得られる：

【表２４】

【０１２０】フラグメント５分析−ＡＣＴＲＳＰＡ−１マトリックスｄｓＤＮＡを例に取る： -C-1-B-2-B-3-A-4-A-5-C-6-C-7-B-8-A-9-A-

【０１２１】ＡおよびＣにより切断すると、次のものが得られる： −ＣＣ−１−Ｂ−２−Ｂ−３−ＡＡ−４−ＡＡ−５−ＣＣ−６−ＣＣ−７−Ｂ−８−ＡＡ−９−ＡＡ−

【０１２２】フラグメント５に相補的なフラグメントは次の通りである：Ａ−５−Ｃ

【０１２３】ポリメラーゼ連鎖反応により増幅し、適正なフラグメント５によりハイブリダ
イズすると、次のものが得られる：

【表２５】

【０１２４】フラグメント６分析−ＡＢＴＲＳＰＡ−１マトリックスｄｓＤＮＡを例に取る： -C-1-B-2-B-3-A-4-A-5-C-6-C-7-B-8-A-9-A-

【０１２５】ＡおよびＢにより切断すると、次のものが得られる： −Ｃ−１−ＢＢ−２−ＢＢ−３−ＡＡ−４−ＡＡ−５−Ｃ−６−Ｃ−７−ＢＢ−８−ＡＡ−９−Ａ−

【０１２６】フラグメント６に相補的なフラグメントは次の通りである：Ａ−５−Ｃ−６−Ｃ−７−Ｂ

【０１２７】ポリメラーゼ連鎖反応により増幅し、適正なフラグメント６によりハイブリダ
イズすると、次のものが得られる：

【表２６】

【０１２８】フラグメント６分析−ＢＣＴＲＳＰＡ−１マトリックスｄｓＤＮＡを例に取る： -C-1-B-2-B-3-A-4-A-5-C-6-C-7-B-8-A-9-A-

【０１２９】ＢおよびＣにより切断すると、次のものが得られる： −Ｃ−１−ＢＢ−２−ＢＢ−３−Ａ−４−Ａ−５−ＣＣ−６−ＣＣ−７−ＢＢ−８−Ａ−９−Ａ−

【０１３０】フラグメント６に相補的なフラグメントは次の通りである：Ｃ−４−Ｃ

【０１３１】ポリメラーゼ連鎖反応により増幅し、適正なフラグメント６によりハイブリダ
イズすると、次のものが得られる：

【表２７】

【０１３２】フラグメント６分析−ＡＣＴＲＳＰＡ−１マトリックスｄｓＤＮＡを例に取る： -C-1-B-2-B-3-A-4-A-5-C-6-C-7-B-8-A-9-A-

【０１３３】ＡおよびＣにより切断すると、次のものが得られる： −ＣＣ−１−Ｂ−２−Ｂ−３−ＡＡ−４−ＡＡ−５−ＣＣ−６−ＣＣ−７−Ｂ−８−ＡＡ−９−ＡＡ−

【０１３４】フラグメント６に相補的なフラグメントは次の通りである：Ｃ−６−Ｃ

【０１３５】ポリメラーゼ連鎖反応により増幅し、適正なフラグメント６によりハイブリダ
イズすると、次のものが得られる：

【表２８】

【０１３６】 (全体的結果) フラグメント４ＴＲＳＰＡ−１分析

【表２９】

【０１３７】フラグメント５ＴＲＳＰＡ−１分析

【表３０】

【０１３８】フラグメント６ＴＲＳＰＡ−１分析

【表３１】

【０１３９】バージョン２−(ＴＲＳＰＡ−２) 各(ｒ×ｒ)ＴＲＳＰＡ試験マトリックスの場合、全てのｒ制限酵素によりＤＮ
Ａを完全に消化する。制限酵素切断部位特異的アダプターにおいて特有なポリメ
ラーゼ連鎖反応増幅可能標識を連結する。ｒ^２アリコートに分離し、各アリコー
トについて、非ビオチニル化制限酵素_ｊおよび非ビオチニル化制限酵素_ｋ標識特
異的プライマーにより増幅し、１およびｒ間のｊおよびｋの全値について変性鎖
を整列させる。

【０１４０】 (実施例) 下記ｄｓＤＮＡについて考える：

【化３】 (式中、制限酵素切断部位をＡ、ＢおよびＣで示し、制限消化後のフラグメント
を１、２、３、４および５で示し、＋および−は鎖のセンスを示す。)

【０１４１】Ａ、ＢおよびＣにより完全に切断すると、次のものが得られる：

【化４】

【０１４２】下記プライマーマトリックスに従いポリメラーゼ連鎖反応により増幅すると、
下記のものが得られる：

【表３２】

【０１４３】簡易化形態：

【表３３】制限酵素の全^ｎＣ_ｒの組み合わせについて反復すると、ＴＲＳＰＡが生成され
る。

【０１４４】ＴＲＳＰＡ−２ハイブリダイゼーションパターン異集団間パーフェクトマッチ二重らせんデプリーションにより得られるプロー
ブを用いて当然予測される２タイプのＴＲＳＰＡ−２ハイブリダイゼーションパ
ターンは次の通りである：１．対角線からはずれた成分(例、横行ｘ、縦列ｙ、ただしｘおよびｙは異なる)
および対角線の反対側に映し出されたその相補的成分(すなわち、横行ｙ、縦列
ｘ)とのハイブリダイゼーションおよび２．対角線上成分(例、横行ｚ、縦列ｚにおけるエレメント)において交差する横
行および縦列全体とのハイブリダイゼーション。

【０１４５】ＴＲＳＰＡ−２分析−ｎ＝３およびｒ＝２の場合の実施例ｄｓＤＮＡを例として挙げる： -C-1-B-2-B-3-A-4-A-5-C-6-C-7-B-8-A-9-A- (式中、Ａ、ＢおよびＣは制限酵素切断部位を示す。１、２、３、４、５、６、
７、８および９は消化後の制限フラグメントを示す)

【０１４６】ＴＲＳＰＡ−２試験マトリックス ^３Ｃ_２＝３ＴＲＳＰＡ−２試験マトリックス−ＡＢ、ＢＣおよびＡＣが存在
する。

【０１４７】試験マトリックスハイブリダイゼーションパターン試験マトリックスの各々について、{(２・(２＋１))／２}＝３の可能なハイブ
リダイゼーションパターンが存在する：

【表３４】

【０１４８】組み合わせの多様性３種の可能なＴＲＳＰＡ−２試験マトリックスハイブリダイゼーションパター
ンおよび３種の可能な試験マトリックスが存在する場合、３^３＝２７の可能なＴ
ＲＳＰＡ−２サインが存在する。

【０１４９】フラグメント４分析−ＡＢＴＲＳＰＡ−２マトリックスｄｓＤＮＡを例に取る： -C-1-B-2-B-3-A-4-A-5-C-6-C-7-B-8-A-9-A-

【０１５０】ＡおよびＢにより切断すると、次のものが得られる： −Ｃ−１−ＢＢ−２−ＢＢ−３−ＡＡ−４−ＡＡ−５−Ｃ−６−Ｃ−７−ＢＢ−８−ＡＡ−９−Ａ−

【０１５１】フラグメント４に相補的なフラグメントはＡ−４−Ａとなる。ポリメラーゼ連鎖反応により増幅し、適正なフラグメント４によりハイブリダ
イズすると、次のものが得られる：

【表３５】

【０１５２】フラグメント４分析−ＢＣＴＲＳＰＡ−２マトリックスｄｓＤＮＡを例に取る： -C-1-B-2-B-3-A-4-A-5-C-6-C-7-B-8-A-9-A-

【０１５３】ＢおよびＣにより切断すると、次のものが得られる： −Ｃ−１−ＢＢ−２−ＢＢ−３−Ａ−４−Ａ−５−ＣＣ−６−ＣＣ−７−ＢＢ−８−Ａ−９−Ａ−

【０１５４】フラグメント４に相補的なフラグメントは次の通りである：Ｂ−３−Ａ−４−Ａ−５−Ｃ

【０１５５】ポリメラーゼ連鎖反応により増幅し、適正なフラグメント４によりハイブリダ
イズすると、次のものが得られる：

【表３６】

【０１５６】フラグメント４分析−ＡＣＴＲＳＰＡ−２マトリックスｄｓＤＮＡを例に取る： -C-1-B-2-B-3-A-4-A-5-C-6-C-7-B-8-A-9-A-

【０１５７】ＡおよびＣにより切断すると、次のものが得られる： −ＣＣ−１−Ｂ−２−Ｂ−３−ＡＡ−４−ＡＡ−５−ＣＣ−６−ＣＣ−７−Ｂ−８−ＡＡ−９−ＡＡ−

【０１５８】フラグメント４に相補的なフラグメントは次の通りである：Ａ−４−Ａ

【０１５９】ポリメラーゼ連鎖反応により増幅し、適正なフラグメント４によりハイブリダ
イズすると、次のものが得られる：

【表３７】

【０１６０】フラグメント５分析−ＡＢＴＲＳＰＡ−２マトリックスｄｓＤＮＡを例に取る： -C-1-B-2-B-3-A-4-A-5-C-6-C-7-B-8-A-9-A-

【０１６１】ＡおよびＢにより切断すると、次のものが得られる： −Ｃ−１−ＢＢ−２−ＢＢ−３−ＡＡ−４−ＡＡ−５−Ｃ−６−Ｃ−７−ＢＢ−８−ＡＡ−９−Ａ―

【０１６２】フラグメント５に相補的なフラグメントは次の通りである：Ａ−５−Ｃ−６−Ｃ−７−Ｂ

【０１６３】ポリメラーゼ連鎖反応により増幅し、適正なフラグメント５によりハイブリダ
イズすると、次のものが得られる：

【表３８】

【０１６４】フラグメント５分析−ＢＣＴＲＳＰＡ−２マトリックスｄｓＤＮＡを例に取る： -C-1-B-2-B-3-A-4-A-5-C-6-C-7-B-8-A-9-A-

【０１６５】ＢおよびＣにより切断すると、次のものが得られる： −Ｃ−１−ＢＢ−２−ＢＢ−３−Ａ−４−Ａ−５−ＣＣ−６−ＣＣ−７−ＢＢ−８−Ａ−９−Ａ−

【０１６６】フラグメント５に相補的なフラグメントは次の通りである：Ｂ−３−Ａ−４−Ａ−５−Ｃ

【０１６７】ポリメラーゼ連鎖反応により増幅し、適正なフラグメント５によりハイブリダ
イズすると、次のものが得られる：

【表３９】

【０１６８】フラグメント５分析−ＡＣＴＲＳＰＡ−２マトリックスｄｓＤＮＡを例に取る： -C-1-B-2-B-3-A-4-A-5-C-6-C-7-B-8-A-9-A-

【０１６９】ＡおよびＣにより切断すると、次のものが得られる： −ＣＣ−１−Ｂ−２−Ｂ−３−ＡＡ−４−ＡＡ−５−ＣＣ−６−ＣＣ−７−Ｂ−８−ＡＡ−９−ＡＡ−

【０１７０】フラグメント５に相補的なフラグメントは次の通りである：Ａ−５−Ｃ

【０１７１】ポリメラーゼ連鎖反応により増幅し、適正なフラグメント５によりハイブリダ
イズすると、次のものが得られる：

【表４０】

【０１７２】フラグメント６分析−ＡＢＴＲＳＰＡ−２マトリックスｄｓＤＮＡを例に取る： -C-1-B-2-B-3-A-4-A-5-C-6-C-7-B-8-A-9-A-

【０１７３】ＡおよびＢにより切断すると、次のものが得られる： −Ｃ−１−ＢＢ−２−ＢＢ−３−ＡＡ−４−ＡＡ−５−Ｃ−６−Ｃ−７−ＢＢ−８−ＡＡ−９−Ａ−

【０１７４】フラグメント６に相補的なフラグメントは次の通りである：Ａ−５−Ｃ−６−Ｃ−７−Ｂ

【０１７５】ポリメラーゼ連鎖反応により増幅し、適正なフラグメント６によりハイブリダ
イズすると、次のものが得られる：

【表４１】

【０１７６】フラグメント６分析−ＢＣＴＲＳＰＡ−２マトリックスｄｓＤＮＡを例に取る： -C-1-B-2-B-3-A-4-A-5-C-6-C-7-B-8-A-9-A-

【０１７７】ＢおよびＣにより切断すると、次のものが得られる： −Ｃ−１−ＢＢ−２−ＢＢ−３−Ａ−４−Ａ−５−ＣＣ−６−ＣＣ−７−ＢＢ−８−Ａ−９−Ａ−

【０１７８】フラグメント６に相補的なフラグメントは次の通りである：Ｃ−６−Ｃ

【０１７９】ポリメラーゼ連鎖反応により増幅し、適正なフラグメント６によりハイブリダ
イズすると、次のものが得られる：

【表４２】

【０１８０】フラグメント６分析−ＡＣＴＲＳＰＡ−２マトリックスｄｓＤＮＡを例に取る： -C-1-B-2-B-3-A-4-A-5-C-6-C-7-B-8-A-9-A-

【０１８１】ＡおよびＣにより切断すると、次のものが得られる： −ＣＣ−１−Ｂ−２−Ｂ−３−ＡＡ−４−ＡＡ−５−ＣＣ−６−ＣＣ−７−Ｂ−８−ＡＡ−９−ＡＡ−

【０１８２】フラグメント６に相補的なフラグメントは次の通りである：Ｃ−６−Ｃポリメラーゼ連鎖反応により増幅し、適正なフラグメント６によりハイブリダ

【０１８３】イズすると、次のものが得られる：

【表４３】

【０１８４】 (全体的結果) フラグメント４ＴＲＳＰＡ−２分析

【表４４】

【０１８５】フラグメント５ＴＲＳＰＡ−２分析

【表４５】フラグメント６ＴＲＳＰＡ−２分析

【０１８６】

【表４６】

【０１８７】試験マトリックスの数フラグメント化に使用される全部でｎ個の酵素および(ｒ×ｒ)試験マトリック
スにつきｒ個の酵素のパネルについて、^ｎＣ_ｒの可能な(ｒ×ｒ)試験マトリック
スが存在し、^ｎＣ_ｒ＝(ｎ！)／［(ｎ−ｒ)！・ｒ！］である。様々なｎおよびｒに対する^ｎＣ_ｒは下表で与えられている：

【表４７】

【０１８８】整列されたＴＲＳＰＡスポットの数ＴＲＳＰＡスポットの総数は、下式により与えられる：ｒ^２・{^ｎＣ_ｒ}＝ｒ^２・{(ｎ！)／［(ｎ−ｒ)！・ｒ！］} 様々なｎおよびｒに対するｒ^２・{^ｎＣ_ｒ}は下表に与えられている：

【表４８】

【０１８９】上記の各試験により、特定のハイブリダイゼーション「サイン」が生じる。ＴＲＳＰＡ−１ＴＲＳＰＡ−２ (ｎ＝６およびｒ＝３の場合) (ｎ＝６およびｒ＝３の場合)

【表４９】

【０１９０】 (ｒ×ｒ)試験マトリックスにつき{１＋２＋...＋ｒ}＝{ｒ(ｒ＋１)／２}パタ
ーンが存在する。^ｎＣ_ｒ(ｒ×ｒ)の試験マトリックスが存在する場合、可能なサ
インの総数は、^ｎＣ_ｒに累乗された{ｒ(ｒ＋１)／２}により与えられる。我々は
、上記の異なるサインの数が、フラグメント化時に生成されるフラグメントの数
を大きく上回ることを必要とする。

【０１９１】ｎ＝６およびｒ＝３を選ぶ場合、一試験当たり６種の可能なハイブリダイゼー
ションパターンが存在し、２０の可能な試験では６^２０＝３.７・１０^１５の組
み合わせの多様性が与えられる。従って、好ましい計画では、３群で試験される
、６酵素が使用され、一実験当たり１８０スポットが得られる。制限断片長多型
問題を回避するために、第１セットと共通している切断部位を全く共有していな
い酵素の異なるセットによりデュプリケイト分析が遂行され得る。

【０１９２】ＴＲＳＰＡ用試験マトリックスを製造するための実例的制限酵素セット (酵素選択基準) ＴＲＳＰＡを作製するためには、適当な酵素の選択は重要な因子である。理想
的には、表現型決定多型が選択された制限部位の中に含まれ得るため、生じるサ
インの特異性に不都合が生じ得るという小さな可能性を排除するために２セット
の異なる酵素が要求される。酵素の選択は下記の若干の基準に基づき得る：ａ)酵素は６bpカッターであるものとする。ｂ)選択された酵素による開裂により、５'末端に４bpオーバーハングが残される
べきである。ｃ)各セットで選択された酵素は全て、同じ緩衝条件下において有効に機能すべ
きである。ｄ)各セットで選択された酵素は、理想的には単一インキュベーション温度で有
効に機能すべきである。ｅ)選択された酵素は、市販されており、理想的には１０Ｕ／μlまたはそれ以上
の濃度とすべきである。ｆ)同じセットにおいて２種の酵素により残された５'オーバーハングは同一では
ないものとする。ｇ)ＴＲＳＰＡ製作用の両セットにおいて酵素は全く現れないものとする。ｈ)酵素は哺乳類メチル化パターンの作用を回避または最小限とするように選択
されるべきである。特に、酵素が^ｍ５ＣｐＧ部位を制限し得ることが知られてい
ない場合、認識部位にＣＧジヌクレオチドを伴う酵素は回避されるべきである。

【０１９３】ＤＮＡメチル化脊椎動物におけるＤＮＡでは、ＣｐＧの配列におけるシトシンの５位がメチル
化されている場合が多く、これは脊椎動物のＤＮＡが生理学的条件下で含む唯一
の化学的修飾である。認識部位内にＣｐＧ配列を含まない酵素を注意深く選択す
るか、または^ｍ５ＣｐＧメチル化部位を自由に制限する酵素を選択することによ
り、ＴＲＳＰＡ分析からのＤＮＡメチル化の潜在的に有害な副作用を除去するこ
とが可能である。^ｍ５ＣｐＧ修飾ＤＮＡを有効に制限することにより、５'の４
塩基オーバーハングを残すことが知られている６bpカッターは、ＢｓｐＥＩおよ
びＸｍａＩである。従って、これらの酵素のみが、ＴＲＳＰＡ分析において潜在
的に有用なＣｐＧジヌクレオチドを含む制限部位をもつ酵素である。

【０１９４】 (酵素選択方法) １６種の可能な４塩基対オーバーハングが存在し(非対称認識配列を伴う例外
的酵素、例えばＢｓｓＳＩまたはＢｓｉＩは除外する)、そのうち５種は配列に
ＣＧを含む。Ｃが先行し、Ｇが後に続く場合、さらなる４オーバーハングは、潜
在的に制限認識部位内にＣＧ配列を含み得る。従って、酵素は残りの６群から優
先的に選択される。

【０１９５】アイソシゾマーを除くと、特定の５' ４bpオーバーハングを残す４種以下の可
能な酵素が存在する。例えば、ＣＴＡＧオーバーハングを残す酵素は次の通りで
ある：

【表５０】

【０１９６】酵素選択は、オーバーハング群によっては他よりもさらに限定される場合があ
るため、フランキング塩基の全組み合わせをもつ部位を開裂する酵素が、全ての
オーバーハングについて利用可能なわけではない。

【０１９７】酵素選択のための一次段階として、アマーシャム・ファーマシア・バイオテク
(ニューイングランド・バイオラブズおよびプロメガ)により供給される酵素を、
オーバーハング配列により下記に整理している。補足的詳細事項、例えば、共通
緩衝液中における活性パーセンテージ、反応温度、濃度および供給業者について
も記録されている。３種のオーバーハング配列については、利用可能な酵素は存
在せず、残りの１３種が下記に記載されている。メチル化感受性故に不適当であ
るとみなされる酵素には陰をつけている(濃い方)。ある程度まではメチル化ＤＮ
Ａを実際に制限するが、ＣｐＧ部位の存在故に不利であると考えられる酵素にも
陰をつけている(淡い方)。

【０１９８】 (ＧＴＡＣの５'オーバーハングを残す候補制限酵素)

【表５１】

【０１９９】 (ＴＴＡＡの５'オーバーハングを残す候補制限酵素)

【表５２】

【０２００】 (ＡＡＴＴの５'オーバーハングを残す候補制限酵素)

【表５３】

【０２０１】 (ＣＡＴＧの５'オーバーハングを残す候補制限酵素)

【表５４】

【０２０２】 (ＧＡＴＣの５'オーバーハングを残す候補制限酵素)

【表５５】

【０２０３】 (ＣＣＧＧの５'オーバーハングを残す候補制限酵素)

【表５６】 (ＧＣＧＣの５'オーバーハングを残す候補制限酵素)

【表５７】 (ＴＣＧＡの５'オーバーハングを残す候補制限酵素)

【表５８】 (ＡＧＣＴの５'オーバーハングを残す候補制限酵素)

【表５９】 (ＣＧＣＧの５'オーバーハングを残す候補制限酵素)

【表６０】 (ＧＧＣＣの５'オーバーハングを残す候補制限酵素)

【表６１】 (ＴＧＣＡの５'オーバーハングを残す候補制限酵素)

【表６２】 (ＣＴＡＧの５'オーバーハングを残す候補制限酵素)

【表６３】

【０２０４】上表から、最も有用な酵素の選抜候補リストを、示された緩衝液条件の各々に
ついて下記に示す。

【表６４】

【０２０５】上記で説明された基準の全てを考慮した上で、２種の６酵素セットの実例的選
択を下記に示す。同じく使用され得る予備酵素についても示す。酵素利用可能性
または性能に関する実践的問題が生じる場合、これらの予備酵素は置き換えられ
得る(これによりオーバーハング重複が誘発されないものとする)。 (実例的酵素セット１−緩衝液Ｍ＋ＢＳＡにおける制限の場合)

【表６５】 (実例的酵素セット２−緩衝液Ｍ＋ＢＳＡにおける制限の場合)

【表６６】番号酵素部位Ｍ＋ＢＳＡ活性％最適℃ 供給業者不活化℃／分

【０２０６】１．実例的予備酵素

【表６７】

【０２０７】６酵素の上記２セットに関する実例的特異的(３×３)末端制限部位プロファイ
リングアレイ(ＴＲＳＰＡ)試験マトリックスＢａｍＨ１、ＢｓｒＧ１、ＨｉｎｄIII、Ｎｃｏ１、Ｓｐｅ１およびＡｆIIIか
らのトリプレットの組み合わせ実例的セット１の場合―ＢａｍＨ１、ＢｓｒＧ１、ＨｉｎｄIII、Ｎｃｏ１、
Ｓｐｅ１およびＡｆIII−２０(＝^６Ｃ_３)トリプレットの組み合わせは次の通り
である：

【表６８】

【０２０８】ＥｃｏＲ１、ＢｓｐＨ１、ＢｇIII、Ｘｂａ１、Ａｃｃ６５１およびＡｐａＬ
１からのトリプレットの組み合わせ実例的セット２の場合−ＥｃｏＲ１、ＢｓｐＨ１、ＢｇIII、Ｘｂａ１、Ａｃ
ｃ６５１およびＡｐａＬ１−２０(＝^６Ｃ_３)トリプレットの組み合わせは次の通
りである：

【表６９】

【０２０９】セット１に関する実例的ＴＲＳＰＡ−１試験マトリックス−ＢａｍＨ１、Ｂｓ
ｒＧ１、ＨｉｎｄIII、Ｎｃｏ１、Ｓｐｅ１およびＡｆIII

【表７０】

【表７１】

【表７２】

【０２１０】セット２に関する実例的ＴＲＳＰＡ−１試験マトリックス−ＥｃｏＲ１、Ｂｓ
ｐＨ１、ＢｇIII、Ｘｂａ１、Ａｃｃ６５１およびＡｐａＬ１

【表７３】

【表７４】

【表７５】

【表７６】

【０２１１】セット１に関する実例的ＴＲＳＰＡ−２試験マトリックス−ＢａｍＨ１、Ｂｓ
ｒＧ１、ＨｉｎｄIII、Ｎｃｏ１、Ｓｐｅ１およびＡｆIII

【表７７】

【表７８】

【表７９】

【０２１２】セット２に関する実例的ＴＲＳＰＡ−２試験マトリックス−ＥｃｏＲ１、Ｂｓ
ｐＨ１、ＢｇIII、Ｘｂａ１、Ａｃｃ６５１およびＡｐａＬ１

【表８０】

【表８１】

【表８２】

【０２１３】 (ハイブリダイゼーションパターン) ＴＲＳＰＡ−１分析において(３×３)試験マトリックスによる異集団間パーフ
ェクトマッチ二重らせんデプリーション濃厚化から与えられたプローブフラグメ
ントについて６種の可能なハイブリダイゼーションパターンが存在する。同じく、ＴＲＳＰＡ−２分析において(３×３)試験マトリックスによる異集団
間パーフェクトマッチ二重らせんデプリーション濃厚化から与えられたプローブ
フラグメントについて６種の可能なハイブリダイゼーションパターンが存在する
。

【０２１４】これらのパターンは次の要領で示され得る： (ＴＲＳＰＡ−１分析) パターンａ(１のみ)

【表８３】

【０２１５】パターンｂ(２および４)

【表８４】

【０２１６】パターンｃ(３および７)

【表８５】

【０２１７】パターンｄ(５のみ)

【表８６】

【０２１８】パターンｅ(６および８)

【表８７】

【０２１９】パターンｆ(９のみ)

【表８８】

【０２２０】 (ＴＲＳＰＡ−２分析) パターンａ(横１および縦１)

【表８９】

【０２２１】パターンｂ(２および４)

【表９０】

【０２２２】パターンｃ(３および７)

【表９１】

【０２２３】パターンｄ(横２および縦２)

【表９２】

【０２２４】パターンｅ(６および８)

【表９３】

【０２２５】パターンｆ(横３および縦３)

【表９４】

【０２２６】 (サイン) ４０の上記(３×３)試験マトリックスを有し、可能なハイブリダイゼーション
パターンａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅおよびｆを表す場合、次の通り、全体的ＴＲＳＰＡ
ハイブリダイゼーションサインを記することができる：

【表９５】

【０２２７】 (態様III) 別の態様において、本発明は、ハイブリダイゼーション条件下で興味の対象で
ある核酸フラグメントを上記アレイのセットに呈示し、ハイブリダイゼーション
パターンを観察することを含む、核酸特性検定方法を提供する。好ましくは、興
味の対象である複数の核酸フラグメントをアレイのセットに別々に呈示し、得ら
れたハイブリダイゼーションパターンを比較する。好ましくは、興味の対象であ
る複数の核酸フラグメントは、上記発明(１)のところで記載されている通り、興
味の対象である表現型に特有なフラグメントに富む、ＤＮＡフラグメントの混合
物から取り出される。

【０２２８】すなわち、この態様において、本発明は、興味の対象である表現型に特有なＤ
ＮＡフラグメントの同定方法であって、上記発明(１)で得られたＤＮＡフラグメ
ントの混合物から個々のＤＮＡフラグメントを回収し、クローン化し、および増
幅し、ハイブリダイゼーション条件下で上記アレイのセットに個々のＤＮＡフラ
グメントを呈示し、個々の各ＤＮＡフラグメントにより生成されたハイブリダイ
ゼーションパターンを観察し、そしてハイブリダイゼーションパターンが類似ま
たは同一である２つまたはそれ以上の個々のＤＮＡフラグメントをさらに調査す
ることを含む方法を提供する。

【０２２９】ＴＲＳＰＡサインおよび全ゲノムアソシエーションスタディ所定数のサイクルの異集団間パーフェクトマッチ二重らせんデプリーション後
、表現型決定フラグメントは濃厚化されるが、完全に「ノイズ」フラグメントを
含まないわけではない。ノイズは、２集団間におけるある種のＮＳＰに関する等
しくないアレル頻度により生じ得る。ノイズはまた、本発明の態様の一部におい
てＤＮＡフラグメントの製造に使用される細胞における体細胞突然変異の存在お
よびポリメラーゼ連鎖反応の使用により生じる。

【０２３０】好ましい態様の場合、ＤＮＡは、クローン(ゲノムクローンまたはｃＤＮＡク
ローン)のライブラリーから調製され、個体(複数も可)から誘導され、適当な宿
主およびクローニングベクター系で増殖された挿入体を伴う。制限酵素フラグメ
ント化は、クローニング前に使用され、ポリメラーゼ連鎖反応増幅を用いること
により、フラグメント化形態で比較するためのＤＮＡを調製する。クローン化制
限酵素フラグメント化挿入体の両側に隣接するベクター配列内におけるプライミ
ング部位は、興味の対象であるフラグメント化ＤＮＡに対する１回またはそれ以
上のサイクルのポリメラーゼ連鎖反応増幅に使用される。興味の対象であるフラ
グメント化ＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応増幅に使用されるプライマーもまた、
表現型決定フラグメント濃厚化プロセス後に使用され、濃厚化フラグメントが「
救出」およびクローン化される。クローンされた濃厚化フラグメントをコロニー
精製し、適当な貯蔵容器に集め、目録を作り、アーカイブに保管し、ＤＮＡプロ
ーブをこれらの単一クローンから調製し、上記１８０スポットＴＲＳＰＡアレイ
に対し個々にハイブリダイズさせる。多くのコロニーについてＴＲＳＰＡサイン
を決定する。ほとんどのノイズフラグメントは本質的にランダムであるため、６ ^２０＝３.７・１０^１５の可能なタイプのＴＲＳＰＡサイン間においてランダム
分布している。しかしながら、表現型決定シグナルフラグメントは、サンプル採
取されるコロニーの増加に従い反復ＴＲＳＰＡサインが得られるものである。サ
ンプル採取された一単位コロニー当たりに現れる所定のＴＲＳＰＡサインの反復
頻度が高くなると、シグナル対ノイズ比は大きくなり、濃厚化はさらに有効にな
る。

【０２３１】このプロセスにおけるステップのかなり多くは高スループットオートメーショ
ン化され易いため、非常に多数のシングルコロニーＴＲＳＰＡサインが容易に決
定され得、本発明の包括範囲はシグナル対ノイズ比が現行方法を越える場合にま
で拡大される。

【０２３２】統計的相関関係(関連性)は、最初ＴＲＳＰＡサインおよび表現型間で引き出さ
れ得る。次いで、興味の対象である表現型との有用な関連性を示す特定ＴＲＳＰ
Ａサインを生じさせるクローンを配列決定することにより、ＤＮＡ配列レベルで
興味の対象である表現型との関連性(複数も可)が測定され得る。かかる関連性は
、表現型を知る、興味の対象である表現型について将来の予測的価値を有し、医
学および薬理遺伝学において多大な価値を有することになる。

【０２３３】興味の対象であるゲノムを全体的または部分的に配列決定する場合、ＤＮＡを
全ｎ酵素によりin silico(インシリコ)で制限し、各フラグメントについて予測
されるサインを算出し、これらの予測されるサインと観察されたサインについて
パターンが適合するものを見つけることにより(レファレンス配列と比較された
多型変異故に制限部位の喪失または増加があればそれらを考慮する)、遺伝子、
ゲノム領域、染色体または前ゲノム内において興味の対象であるフラグメントが
直接同定され得る。この後者の方法は、非常に多くの表現型決定フラグメントが
得られ、反復サインが希少または得られない場合には非常に貴重なものとなる。
すなわち、隣接ＤＮＡ領域へ表現型決定フラグメントが集中することにより、そ
れらのゲノム領域および興味の対象である表現型間の関連性が得られる。

【０２３４】態様(IV) さらに別の態様において、本発明は、配列ａ−Ａ−ｂ−Ｂ...Ｘ−ｙ−Ｙ−ｚ(
式中、Ａ、Ｂ...ＸおよびＹは、ｎ個の異なる制限エンドヌクレアーゼ酵素につ
いて特有な制限部位であり、ａ、ｂ...ｙ、ｚは塩基対間の距離を示す)を有する
２本鎖ＤＮＡ分子を提供するもので、１個またはそれ以上かつｎ個以下の制限酵
素手段によりＤＮＡ分子を切断することにより得られる各フラグメントが互いに
他のフラグメントとは異なる長さを有することを特徴とする。

【０２３５】実例的セット１(または実例的セット２)６bpカッター部分消化の範囲および正
確な性質の両方の、異集団間パーフェクトマッチ二重らせんデプリーションまた
はＴＲＳＰＡ制限に関する明確な測定を可能にする一例としての総合診断用内部
対照ＤＮＡ上記の両計画では、限界消化産物の得られることが重要である。多酵素制限に
より生じる部分消化の範囲をモニターし、どの酵素が切断し損ねたかを正確に測
定することは、非常に重要な作業である。

【０２３６】ＤＮＡ消化用に６種以下の酵素を有する場合、これらをＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅお
よびＦと名付ける。これらが全て、異集団間パーフェクトマッチ二重らせんデプ
リーションのためおよび同じくＴＲＳＰＡ製作でのアダプター連結前における消
化ステップのためのフラグメント化段階中に完全切断したことを何らかの方法で
測定する必要がある。酵素のいずれかが完全切断をし損ねた場合、問題を効果的
に修正するためにはどの酵素であるか、およびどの程度であるかを知る必要があ
る。

【０２３７】内部対照ＤＮＡの構造下記構造をもつ２本鎖ＤＮＡ分子を構築する場合：末端---t---A---u---B---v---C---w---D---x---E---y---F---z---末端 (式中、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦは制限酵素切断部位を示し、ｔ、ｕ、ｖ、
ｗ、ｘ、ｙおよびｚは塩基対間の距離を示す)

【０２３８】この内部対照ＤＮＡは、均一に予め標識され、制限前に適当な濃度で興味の対
象であるＤＮＡに付加されているか、または制限後の興味の対象であるＤＮＡか
らは見出されない相補的配列によりサザーンブロットプローブされている。

【０２３９】６酵素は全て一通りでのみ切断し得る。１酵素は^６Ｃ_１＝６通りで切断し損ね得、これらは、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅまた
はＦ切断不能である。２酵素は^６Ｃ_２＝１５通りで切断し損ね得、これらは、ＡＢ、ＡＣ、ＡＤ、Ａ
Ｅ、ＡＦ、ＢＣ、ＢＤ、ＢＥ、ＢＦ、ＣＤ、ＣＥ、ＣＦ、ＤＥ、ＤＦまたはＥＦ
切断不能である。３酵素は^６Ｃ_３＝２０通りで切断し損ね得、これらは、ＡＢＣ、ＡＢＤ、ＡＢ
Ｅ、ＡＢＦ、ＡＣＤ、ＡＣＥ、ＡＣＦ、ＡＤＥ、ＡＤＦ、ＡＥＦ、ＢＣＤ、ＢＣ
Ｅ、ＢＣＦ、ＢＤＥ、ＢＤＦ、ＢＥＦ、ＣＤＥ、ＣＤＦ、ＣＥＦまたはＤＥＦ切
断不能である。４酵素は^６Ｃ_４＝１５通りで切断し損ね得、これらは、ＡＢＣＤ、ＡＢＣＥ、
ＡＢＣＦ、ＡＢＤＥ、ＡＢＤＦ、ＡＢＥＦ、ＡＣＤＥ、ＡＣＤＦ、ＡＣＥＦ、Ａ
ＤＥＦ、ＢＣＤＥ、ＢＣＤＦ、ＢＣＥＦ、ＢＤＥＦまたはＣＤＥＦ切断不能であ
る。５酵素は^６Ｃ_５＝６通りで切断し損ね得、これらは、ＡＢＣＤＥ、ＡＢＣＤＦ
、ＡＢＣＥＦ、ＡＢＤＥＦ、ＡＣＤＥＦまたはＢＣＤＥＦ切断不能である。６酵素は全て一通りでのみ切断し損ね得る。

【０２４０】上記可能性の各々により、内部対照ＤＮＡからの一つまたはそれ以上のフラグ
メントが生成される。可能な各フラグメントが他と見分けられるサイズを有する
場合、生成されたフラグメントのサイズ分布から、どの酵素が切断したか、どれ
が切断していないかが正確に測定され得る。従って、果たすべき仕事は、かかる
ＤＮＡ分子を設計することである。

【０２４１】 (実施例シミュレーション) 部位間フラグメントのサイズを変えている、７通りのシミュレーションが下記
に与えられている。好結果を得るための基準には次の事項が含まれる。１．フラグメント間スペーシングは、大きいフラグメントについては大きくする
べきである(電気泳動分離を促すため)。２．可能なフラグメントは全て、互いにサイズの上で明確に分離可能とするべき
である。３．異なる数の部位間単位を含むバンド間のサイズギャップは、同数の部位間単
位を含むバンド間のサイズギャップよりも大きくすべきである。４．サイズギャップおよび最大から最小フラグメントへのサイズ間隔は、電気泳
動的に共存し得るべきである。

【０２４２】シミュレーション１部位間フラグメントサイズ(bpで)

【表９６】得られる可能な消化産物(bpで)

【表９７】間隔＝６９０ｂｐ

【０２４３】シミュレーション２部位間フラグメントサイズ(bpで)

【表９８】得られる可能な消化産物(bpで)

【表９９】間隔＝７５０ｂｐ

【０２４４】シミュレーション３部位間フラグメントサイズ(bpで)

【表１００】得られる可能な消化産物(bpで)

【表１０１】間隔＝８１０

【０２４５】シミュレーション４部位間フラグメントサイズ(bpで)

【表１０２】得られる可能な消化産物(bpで)

【表１０３】間隔＝８７０ｂｐ

【０２４６】シミュレーション５部位間フラグメントサイズ(bpで)

【表１０４】得られる可能な消化産物(bpで)

【表１０５】間隔＝９３０ｂｐ

【０２４７】シミュレーション６部位間フラグメントサイズ(bpで)

【表１０６】得られる可能な消化産物(bpで)

【表１０７】間隔＝９９０

【０２４８】シミュレーション７部位間フラグメントサイズ(bpで)

【表１０８】得られる可能な消化産物(bpで)

【表１０９】間隔＝１０５０ｂｐ

【０２４９】好結果を得るための上記基準によると、上記シミュレーション７が明らかに必
要条件を全て満たしている。

【０２５０】実例的セット１(または実例的セット２)４bpカッター部分消化の範囲および正
確な性質の両方の、異集団間パーフェクトマッチ二重らせんデプリーションに関
する明確な測定を可能にする一例としての総合診断用内部対照ＤＮＡ

【０２５１】ＤＮＡ消化用に３種以下の酵素を有する場合、これらをＡ、ＢおよびＣと名付
ける。これらが、異集団間パーフェクトマッチ二重らせんデプリーションのため
のフラグメント化段階中に全て完全切断したことを何らかの方法で測定する必要
がある。酵素のいずれかが完全切断をし損ねた場合、問題を効果的に修正するた
めにはどの酵素であるか、およびどの程度であるかを知る必要がある。

【０２５２】内部対照ＤＮＡの構造下記構造をもつ２本鎖ＤＮＡ分子を構築する場合：末端---t---A---u---B---v---C---w---末端 (式中、Ａ、ＢおよびＣは制限酵素切断部位を示し、ｔ、ｕ、ｖおよびｗは塩基
対間の距離を示す)

【０２５３】この内部対照ＤＮＡは、均一に予め標識され、制限前に適当な濃度で興味の対
象であるＤＮＡに付加されているか、または制限後の興味の対象であるＤＮＡか
らは見出されない相補的配列によりサザーンブロットプローブされている。

【０２５４】３酵素は全て一通りでのみ切断し得る。１酵素は^３Ｃ_１＝３通りで切断し損ね得、これらは、Ａ、ＢまたはＣ切断不能
である。２酵素は^３Ｃ_２＝３通りで切断し損ね得、これらは、ＡＢ、ＡＣまたはＢＣ切
断不能である。３酵素は全て一通りでのみ切断し損ね得る。

【０２５５】上記可能性の各々により、内部対照ＤＮＡからの一つまたはそれ以上のフラグ
メントが生成される。可能な各フラグメントが他と(および６種以下の酵素のパ
ネルに関する上記シミュレーション７におけるフラグメントのいずれかから)見
分けられるサイズを有する場合、生成されたフラグメントのサイズ分布から、ど
の酵素が切断したか、どれが切断していないかが正確に測定され得る。従って、
果たすべき仕事は、かかるＤＮＡ分子を設計することである。

【０２５６】 (実施例シミュレーション) 部位間フラグメントのサイズを変えている、６通りのシミュレーションが下記
に与えられている。好結果を得るための基準には次の事項が含まれる。１．フラグメント間スペーシングは、大きいフラグメントについては大きくする
べきである(電気泳動分離を促すため)。２．可能なフラグメントは全て、互いにサイズの上で明確に分離可能とするべき
である。３．異なる数の部位間単位を含むバンド間のサイズギャップは、同数の部位間単
位を含むバンド間のサイズギャップよりも大きくすべきである。４．サイズギャップおよび最大から最小フラグメントへのサイズ間隔は、電気泳
動的に共存し得るべきである。５．得られる最大フラグメントは、理想的には６種以下の酵素のパネルに関する
上記シミュレーション７で得られた最小フラグメントよりも小さくするべきであ
る。

【０２５７】シミュレーション１部位間フラグメントサイズ(bpで)

【表１１０】

【０２５８】得られる可能な消化産物(bpで)

【表１１１】間隔＝９０bp

【０２５９】シミュレーション２部位間フラグメントサイズ(bpで)

【表１１２】得られる可能な消化産物(bpで)

【表１１３】間隔＝１０５bp

【０２６０】シミュレーション３部位間フラグメントサイズ(bpで)

【表１１４】得られる可能な消化産物(bpで)

【表１１５】間隔＝１２０bp

【０２６１】シミュレーション４部位間フラグメントサイズ(bpで)

【表１１６】得られる可能な消化産物(bpで)

【表１１７】間隔＝１３５bp

【０２６２】シミュレーション５部位間フラグメントサイズ(bpで)

【表１１８】得られる可能な消化産物(bpで)

【表１１９】間隔＝９０bp

【０２６３】シミュレーション６部位間フラグメントサイズ(bpで)

【表１２０】得られる可能な消化産物(bpで)

【表１２１】間隔＝１０５bp 好結果を得るための上記基準によると、上記シミュレーション６が明らかに必
要条件を全て満たしている。

【０２６４】６種以下の制限酵素のパネルに関する内部対照ＤＮＡ限界および部分消化パタ
ーンの完全セットの実例的測定実例シミュレーション７の場合、６種以下の制限酵素のパネルに関する内部対
照ＤＮＡ限界および部分消化パターンの完全セットは下記の通り測定され得る。部位間フラグメントサイズ(bpで)

【表１２２】

【０２６５】得られる可能な消化産物６酵素全て一通りのみで切断し得る。

【表１２３】

【０２６６】１酵素は^６Ｃ_１＝６通りで切断し損ね得、これらはＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅまたは
Ｆ切断不能である。

【表１２４】

【０２６７】２酵素は^６Ｃ_２＝１５通りで切断し損ね得、これらは、ＡＢ、ＡＣ、ＡＤ、Ａ
Ｅ、ＡＦ、ＢＣ、ＢＤ、ＢＥ、ＢＦ、ＣＤ、ＣＥ、ＣＦ、ＤＥ、ＤＦまたはＥＦ
切断不能である。

【表１２５】

【０２６８】３酵素は^６Ｃ_３＝２０通りで切断し損ね得、これらは、ＡＢＣ、ＡＢＤ、ＡＢ
Ｅ、ＡＢＦ、ＡＣＤ、ＡＣＥ、ＡＣＦ、ＡＤＥ、ＡＤＦ、ＡＥＦ、ＢＣＤ、ＢＣ
Ｅ、ＢＣＦ、ＢＤＥ、ＢＤＦ、ＢＥＦ、ＣＤＥ、ＣＤＦ、ＣＥＦまたはＤＥＦ切
断不能である。

【表１２６】

【０２６９】４酵素は^６Ｃ_４＝１５通りで切断し損ね得、これらは、ＡＢＣＤ、ＡＢＣＥ、
ＡＢＣＦ、ＡＢＤＥ、ＡＢＤＦ、ＡＢＥＦ、ＡＣＤＥ、ＡＣＤＦ、ＡＣＥＦ、Ａ
ＤＥＦ、ＢＣＤＥ、ＢＣＤＦ、ＢＣＥＦ、ＢＤＥＦまたはＣＤＥＦ切断不能であ
る。

【表１２７】

【０２７０】５酵素は^６Ｃ_５＝６通りで切断し損ね得、これらは、ＡＢＣＤＥ、ＡＢＣＤＦ
、ＡＢＣＥＦ、ＡＢＤＥＦ、ＡＣＤＥＦまたはＢＣＤＥＦ切断不能である。

【表１２８】

【０２７１】６酵素は全て一通りでのみ切断し損ね得る。

【表１２９】

【０２７２】３種以下の制限酵素のパネルに関する内部対照ＤＮＡ限界および部分消化パタ
ーンの完全セットの実例的測定実例シミュレーション６の場合、３種以下の制限酵素のパネルに関する内部対
照ＤＮＡ限界および部分消化パターンの完全セットは下記の通り測定され得る。

【０２７３】部位間フラグメントサイズ(bpで)

【表１３０】

【０２７４】得られる可能な消化産物３酵素全て一通りのみで切断し得る。

【表１３１】

【０２７５】１酵素は^３Ｃ_１＝３通りで切断し損ね得、これらはＡ、ＢまたはＣ切断不能で
ある。

【表１３２】

【０２７６】２酵素は^３Ｃ_２＝３通りで切断し損ね得、これらは、ＡＢ、ＡＣまたはＢＣ切
断不能である。

【表１３３】

【０２７７】３酵素は全て一通りでのみ切断し損ね得る。

【表１３４】

【０２７８】実施例１ａ−６bpカッターセット１ＴＲＳＰＡ酵素ＢａｍＨ１、ＢｓｒＧ１
、ＨｉｎｄIII、Ｎｃｏ１、Ｓｐｅ１およびＡｆIIIに関する消化内部対照プラス
ミド６bpカッターＴＲＳＰＡ酵素部位を全て伴う挿入体を含むように、プラスミド
ｐＮＷ３３(下記に示されている)を構築した。

【化５】ＢｓｐＥ１部位は、１４０bpおよび２００bpフラグメントの外側末端を画定す
る。ｐＮＷ３３に関する完全配列を下記に示す。

【０２７９】

【表１３５】

【表１３６】

【０２８０】挿入体は、Ｋｐｎ１／ＳａII消化ｐＵＣ１９ｃＤＮＡ(ジェンバンクＸ０２５
１４)への１４０(Ｋｐｎ１−ＢａｍＨ１)、１５０／１６０(ＢａｍＨ１−Ｈｉｎ
ｄIII)、１７０／１８０(ＨｉｎｄIII-Ｓｐｅ１)および１９０／２００(Ｓｐｅ
１−Ｘｈｏ１)の４フラグメント連結反応として導入された。ＳａIIおよびＸｈ
ｏ１部位は、それらの適合性付着末端結合の結果失われた。挿入体はＢｓｐＥ１
またはＰｖｕIIにより除去され得る。

【０２８１】１１９０bpの挿入体領域およびベクター結合部位への短いフランキング領域に
ついて各方向で２回配列決定することにより、プラスミド配列が確立された。さ
らに、合計６３の分析制限消化物および一マイナス酵素対照について、下表に詳
述された要領で遂行した：

【表１３７】

【表１３８】

【０２８２】これらの消化物は全て、アガロースゲル電気泳動において予測されるフラグメ
ントパターンを生じ、上表で陰を付けた、これらのうち若干のものを図１に示す
。図１で示された制限消化は、下記条件を用いて実施された：消化物１(マイナス酵素対照)

【表１３９】

【０２８３】消化物５

【表１４０】

【０２８４】消化物９

【表１４１】

【０２８５】消化物３７

【表１４２】

【０２８６】消化物４９

【表１４３】

【０２８７】消化物６１

【表１４４】

【０２８８】６４種の制限消化物を全て３７℃で６時間インキュベーションし、次いで試料
を、図１に示されている通り２.５％ＦＭＣメタファー・アガロースゲルにおけ
る電気泳動にかけた。Ｍを記したレーンは、消化物１−６４の全部からの混合試
料を含んでおり、ストラタジーンＫｂラダーマーカーに対するフラグメントサイ
ズの確認後これらのレーンをサイズマーカーとして使用した。

【０２８９】ゲノムＤＮＡ消化物へスパイクされた場合、生成される内部対照制限フラグメ
ントパターンは、消化程度および限界消化未満における部分制限があればその性
質の両方の指標である。ＤＮＡを後続分析または濃厚化処置で使用する前に、あ
るとすれば、酵素のどれが、切断し損ね、従ってこれを補正する行動をとり損ね
たかを存在するバンドから誘導することが可能である。

【０２９０】Ｂｓｐ−ＥＩ放出内部対照ＤＮＡの大規模製造内部対照ＰＣＲ産物ＤＮＡ(ｄＮＴＰ汚染不含有)の生成に使用される方法が、
下図に描かれている。

【化６】

【０２９１】プライマーおよびＰＣＲ２０マイクロモルのＢＩＯ１４０アップ５'ビオチン−CGCAGCTGGTAATCCGGACGCCCGCGTCGAAGATGTT３' ２０マイクロモルのＢＩＯ２００ダウン５'ビオチン‐CGCAGCTGGTAATCCGGACCCGCCGCCGTTGTTGTT３' 大量ＰＣＲ増幅(１９２×１００μl反応物)を、下記条件に従い実施した：

【表１４５】

【０２９２】マスター混合物を迅速にＰＣＲ管に分配した。次のパラメーター：１分間９７
℃、２分間５０℃、および３分間７２℃、５分間７２℃、次いで４℃の３０サイ
クルを用いて温度循環工程を開始させた。

【０２９３】ＰＣＲ増幅後、試料をプールし、ビオチニル化ＰＣＲ産物末端の捕獲および内
部対照ＤＮＡのＢｓｐＥ１放出に付した。

【０２９４】ビオチニル化ＰＣＲ産物末端の捕獲および内部対照ＤＮＡのＢｓｐＥ１放出全ての分離操作は、ダイナルＭＰＣ−１セパレーター(ダイナル、製品＃１２
００１)を用いて実施された。

【０２９５】プールしたＰＣＲ反応物２０mlを、２０ミリモルのトリス−ＨＣｌ(ｐＨ７.４
)、２ミリモルのＥＤＴＡ(ｐＨ８.０)、２モルのＮａＣｌ中２０mlのダイナビー
ズＭ−２８０と混合した。管を回転させながら室温で１時間インキュベーション
した。

【０２９６】次いで、ダイナビーズを、２０mlの１０ミリモルのトリス−ＨＣｌ(ｐＨ７.４
)、１ミリモルのＥＤＴＡ(ｐＨ８.０)、１モルのＮａＣｌにより４回洗浄した。

【０２９７】ＢｓｐＥ１消化は、１×ＮＥＢ緩衝液＃３中２mlの０.５Ｕ／μl ＢｓｐＥ１
において３７℃で１時間行なわれた。次いで、０.１倍体積の３モル酢酸ナトリ
ウム(ｐＨ５.２)および２.５倍体積のエタノールを加え、−２０℃に冷却し、次
いで、遠心分離することにより消化物をエタノール沈澱させた。ペレットを７０
％エタノールですすいだ後、１×ＴＥ緩衝液５００μlに再溶解した。

【０２９８】ＢｓｐＥ１放出内部対照ＤＮＡ１μlを、５０％グリセリンＡＧＥローディン
グ染料１０μlと混合し、１.５％アガロースゲルでの電気泳動にかけることによ
り、精製ＤＮＡのサイズが予測されたものと一致していることを確認した。

【０２９９】６種のセット１・６bpカッター混合物の系列希釈物による内部対照ＤＮＡの存
在下における高分子量ゲノムＤＮＡ消化高分子量イヌゲノムＤＮＡをまず６種のセット１・６bpカッター混合物の系列
希釈物−各々同数の単位で−と混合した。次いで、アリコートを除去し、上記Ｂ
ｓｐＥ１放出内部対照ＤＮＡと混合した。２０μgのイヌゲノムＤＮＡを、２０
０μl中０.２５、０.０２５、０.００２５、０.０００２５、０.００００２５、
０.０００００２５および０Ｕ／μlのＢａｍＨ１／ＢｓｒＧ１／ＨｉｎｄIII／
Ｎｃｏ１／Ｓｐｅ１／ＡｆIIIにより消化した。０.４μlのイヌゲノムＤＮＡお
よび１μlのＢｓｐＥ１放出内部対照ＤＮＡを、４μl中０.２５、０.０２５、０
.００２５、０.０００２５、０.００００２５、０.０００００２５および０Ｕ／
μlのＢａｍＨ１／ＢｓｒＧ１／ＨｉｎｄIII／Ｎｃｏ１／Ｓｐｅ１／ＡｆIIIに
より消化した。ヴィストラ・グリーン染色を用いて、内部対照ＤＮＡ消化および
高分子量ＤＮＡ消化の範囲をモニターした。内部対照ＤＮＡからのフラグメント
パターンは、消化程度および限界消化未満における部分制限があればその性質の
両方について特徴的である。

【０３００】制限酵素、緩衝液およびＢＳＡの予混物を、下記に詳述した要領で製造した：

【表１４６】総体積＝４０μl

【０３０１】従って、予混物は、１×ＮＥＢ緩衝液＃２および１×ＢＳＡ中２.５Ｕ／μlで
各制限酵素を含んでいた。次いで、この予混物の系列１０倍希釈物を、１×ＮＥ
Ｂ緩衝液＃２および１×ＢＳＡ中で製造した。

【０３０２】また、イヌゲノムＤＮＡ、緩衝液およびＢＳＡの予混物についても下記詳細に
従い製造した：

【表１４７】従って、これらの予混物は、１×ＮＥＢ緩衝液＃２および１×ＢＳＡ中０.２
５mg／mlでイヌゲノムＤＮＡを含む。

【０３０３】次いで、イヌゲノムＤＮＡおよび制限酵素混合物を次のように設定した：

【表１４８】

【０３０４】次いで、２μlアリコートを管１−７から除去し、１μlのＢｓｐＥ１放出内部
対照ＤＮＡおよび１μlの２×ＮＥＢ緩衝液＃２および２×ＢＳＡに加えること
により、試料１−７ｉｃが得られた。次いで、試料１−７ｉｃに鉱油５０μlを
塗ることにより、蒸発を防いだ。

【０３０５】次いで、管１−７からの残量を、１００μlの１×ＮＥＢ緩衝液＃２および１
×ＢＳＡに加えた。全試料を最後に３７℃で一夜インキュベーションした。

【０３０６】消化後、２０μlの消化物１−７を、１０μlの５０％グリセリンＡＧＥローデ
ィング染料と混合し、４μlの消化物１−７icを２μlの５０％グリセリンＡＧＥ
ローディング染料と混合した。次いで、ローディング染料中の消化物を、１×Ｔ
ＢＥ中２.５％メタファー・アガロースゲルで電気泳動させた。このゲルを、６
０分間５０μlのヴィストラ・グリーンを含む１×ＴＢＥ５００ml中で染色した
。染色されたゲルを、次の設定条件：４８８nmレーザー、５７０ＤＦ３０フィル
ター、７００ＶのＰＭＴ設定、２００μm解像能および低感受性での蛍光映像装
置(Fluorimager)により最後に画像化した。

【０３０７】制限消化物−最終条件従って、制限消化物１−７は次の条件下で遂行された：

【表１４９】総容量＝２００μl

【０３０８】同様に、制限消化物１−７icを次の条件下で遂行した：

【表１５０】ＩＣ＝ＢｓｐＥ１−放出内部対照ＤＮＡ総容量＝４μl 結果は図２に示されている。

【０３０９】実施例１ｂ−４bpカッターセット１ＴＲＳＰＡ酵素ＨａｅIII、Ｍｂｏ１およ
びＭｓｅ１に関する消化内部対照プラスミド４bpカッターＴＲＳＰＡ酵素部位を全て伴う挿入体を含むように、プラスミド
ｐＮＷ３５(下記に示されている)を構築した。

【化７】ＨｉｎｄIIIおよびＥｃｏＲ１部位は、２５bpおよび４０bpフラグメントの外
側末端を画定する。ｐＮＷ３５の配列は下記に示されており、挿入領域は太字で
示されている。

【０３１０】

【表１５１】

【表１５２】

【０３１１】制限酵素ＨａｅIII、Ｍｂｏ１およびＭｓｅIIに関する４bp内部対照プラスミ
ドを、ＨｉｎｄIII／ＥｃｏＲＩ−消化ｐＭＯＳblue(アマーシャム・ファーマシ
ア・バイオテク)へ合成１３０bpフラグメントを挿入することにより調製した。

【０３１２】１３０bpの挿入領域について各方向で２回配列決定することにより、プラスミ
ド配列を確立した。また、制限消化およびポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
り制限部位の存在および放出されたフラグメントの移動度についてチェックした
。

【０３１３】プラスミドからの内部対照スパイクＤＮＡの調製次式は、ＥｃｏＲ１放出内部対照ＤＮＡの調製に使用される戦略について記載
している。

【表１５３】

【０３１４】プライマーおよびＰＣＲＵ−１９量体ビオプライマー５'ビオ−GTTTTCCCAGTCACGACGT３' ＩＣＰＣＲ(Ｆ)プライマー５'TCCGGACGTCTCAGGCTAATGTT３' 大量ＰＣＲ増幅(９６×１００μl反応物、反復することにより、全部で１９２
反応物が得られた)を、下記条件(体積は全てμlである)に従い実施した：

【表１５４】

【０３１５】ＰＣＲマスター混合物を迅速に９６のＰＣＲ管に分配した。次のパラメーター
：２分間９４℃、２分間５０℃、２９サイクルの２分間７２℃、４５秒間９４℃
、および１分間５０℃、８分間７２℃、次いで４℃を用いて温度循環工程を開始
させた。

【０３１６】ビオチニル化ＰＣＲ産物末端の捕獲および内部対照ＤＮＡのＥｃｏＲ１放出全ての分離操作は、ダイナルＭＰＣ−１セパレーター(ダイナル、製品＃１２
００１)を用いて実施された。

【０３１７】プールしたＰＣＲ反応物２０mlを、２０ミリモルのトリス−ＨＣｌ(ｐＨ７.４
)、２ミリモルのＥＤＴＡ(ｐＨ８.０)、２モルのＮａＣｌ中２０mlのダイナビー
ズＭ−２８０と混合した。管をデンリー・スピラミックス５において混合しなが
ら室温で１時間インキュベーションした。

【０３１８】次いで、ダイナビーズを、２０mlの１０ミリモルのトリス−ＨＣｌ(ｐＨ７.４
)、１ミリモルのＥＤＴＡ(ｐＨ８.０)、１モルのＮａＣｌにより４回洗浄した。
５回目の洗浄は２０mlの１×緩衝液Ｍにおいて行なわれた。

【０３１９】ＥｃｏＲ１消化は、１×緩衝液Ｍ中５mlの０.２５Ｕ／μl ＥｃｏＲ１におい
て３７℃で１時間行なわれた。次いで、消化物を１０個の５００μlアリコート
分量に分割した。１μlのシー(See)ＤＮＡ、０.１倍体積の３モル酢酸ナトリウ
ム(ｐＨ５.２)および２.５倍体積のエタノールを加えることによりアリコートを
エタノール沈澱させた。沈澱物を混合し、氷上で３０分間０℃に冷却し、次いで
、２００００最大ＲＣＦで１０分間遠心分離した。ペレットを７０％エタノール
ですすいだ後、合計５００μlの１×ＴＥ緩衝液に再溶解した。

【０３２０】ＥｃｏＲ１放出内部対照ＤＮＡの１μlアリコートを、８％ポリアクリルアミ
ドゲルでの電気泳動にかけることにより、精製ＤＮＡのサイズが予測されたもの
と一致していることを確認した。

【０３２１】酵素ＨａｅIII、Ｍｓｅ１およびＭｂｏ１の系列希釈物による４bpカッター内
部対照ＤＮＡの存在下における高分子量ゲノムＤＮＡ消化高分子量ヒト胎盤ＤＮＡを、３種のセット１・４bpカッター制限エンドヌクレ
アーゼ混合物−各々同数の単位−の系列希釈物と混合した。次いで、アリコート
を除去し、ＥｃｏＲ１放出内部対照ＤＮＡと混合した。３.６μgのヒト胎盤ＤＮ
Ａ(シグマ)を、総量３６μlでＨａｅIII、Ｍｂｏ１およびＭｓｅ１の各々０.５
Ｕ／μl、０.１Ｕ／μl、０.０２Ｕ／μl、０.００４Ｕ／μlおよび０Ｕ／μlに
より消化した。０.４μlの胎盤ＤＮＡおよび１μlのＥＣＯＲ１放出内部対照Ｄ
ＮＡを、総量４μlでＨａｅIII、Ｍｂｏ１およびＭｓｅ１の各々０.５Ｕ／μl、
０.１Ｕ／μl、０.０２Ｕ／μl、０.００４Ｕ／μlおよび０Ｕ／μlにより消化
した。ヴィストラ・グリーン(アマーシャム・ファーマシア・バイオテク)染色を
用いて、内部対照ＤＮＡ消化および高分子量ＤＮＡ消化の範囲をモニターした。

【０３２２】制限酵素(各酵素５Ｕ／μl)、緩衝液およびＢＳＡの予混物を下記要領で製造
した：

【表１５５】

【０３２３】予混物の系列５倍希釈物を、１×ＮＥＢ緩衝液＃２および１×ＢＳＡ中で製造
した。ヒト胎盤ＤＮＡ、緩衝液およびＢＳＡの６×予混物についても、下記要領で製
造した：

【表１５６】

【０３２４】この予混物は、１×ＮＥＢ緩衝液＃２および１×ＢＳＡ中０.２５mg／mlで胎
盤ＤＮＡを含んでいた。ヒト胎盤ＤＮＡおよび制限酵素混合物を次のように設定した：

【表１５７】

【０３２５】次いで、２μlアリコートを管１−５から除去し、１μlのＥＣＯＲ１放出内部
対照ＤＮＡおよび１μlの２×ＮＥＢ緩衝液＃２および２×ＢＳＡに加えること
により、試料１−５ｉｃが得られた。次いで、試料１−５ｉｃに５０μlの鉱油
を塗ることにより、蒸発を防いだ。

【０３２６】次いで、管１−５からの残量を１８μlの１×ＮＥＢ緩衝液＃２および１×Ｂ
ＳＡに加えた。全試料を最後に３７℃で一夜インキュベーションした。

【０３２７】制限消化物−最終条件従って、制限消化物１−５は、下記条件下で行なわれた：

【表１５８】総量＝３６μl

【０３２８】同様に、制限消化物１−５ｉｃは、下記条件下で行なわれた：

【表１５９】ＩＣ＝ＥｃｏＲ１放出内部対照ＤＮＡ総量＝４μl

【０３２９】１０μlの消化物１−５を各々３μlのローディング染料と混合し、４μlの消
化物１−５ｉｃを１μlのローディング染料と混合した。試料番号５ｉｃに、１
８０ngのＰＣＲ分子量マーカーを加えることにより、サイズ標準としての役割を
与えた。これらのマーカーに関するバンドサイズは、５０bp、１００bp、２００
bp、３００bp、４００bp、５００bp、５２５bp、７００bpおよび１０００bpであ
る。次いで、消化物を、下記要領で１×ＴＢＥ中８％ポリアクリルアミドゲルに
おける電気泳動にかけた：１０mlの１０×ＴＢＥ１９.５mlの４０％アクリルアミド１９mlの２％メチレンビスアクリルアミド５０.４mlの水１mlの新たに製造された１０％(ｗ／ｖ)過硫酸アンモニウム１００μlのＴＥＭＥＤ

【０３３０】ケンブリッジ・エレクトロフォレーシス・リミテッド製垂直タンパク質電気泳
動ユニットを、１mmのプレート間隔をおいて使用した。試料を、１×ＴＢＥ中２
時間３０ｍＡで電気泳動にかけた。次いで、ゲルを３０分間５０μlのヴィスト
ラ・グリーンを含む１×ＴＢＥ５００ml中で染色した。染色されたゲルを、次の
設定条件：４８８nmレーザー、５７０ＤＦ３０フィルター、７００ＶのＰＭＴ設
定、２００μm解像能および低感受性での蛍光映像装置(Fluorimager)で画像化し
た。結果は図３に示されている。

【０３３１】実施例２ｐＮＷ３３からの１４０bpＢｓｐＥ１〜ＢａｍＨ１フラグメントでプローブさ
れたｐＮＷ３３ＢａｍＨ１、ＨｉｎｄIIIおよびＡｆIIIマトリックスおよびｐ
ＮＷ３３ＨｉｎｄIII、Ｎｃｏ１およびＳｐｅ１マトリックスによるＴＲＳＰＡ
−２分析各末端に異なる制限部位をもつ整列ＰＣＲフラグメントにプローブがハイブリ
ダイズする場合の一実施例として、ｐＮＷ３３ＢａｍＨ１、ＨｉｎｄIIIおよび
ＡｆIIIマトリックス(マトリックス＃７)を、ｐＮＷ３３内における１４０bpの
ＢｓｐＥ１(４６６)〜ＢａｍＨ１(６０５)制限フラグメントからのＰＣＲ産物に
よりプローブした。この実施例では、プローブは、ｐＮＷ３３内における１６０
bpのＨｉｎｄIII(４４５)〜ＢａｍＨ１(６０５)制限フラグメントから誘導され
た２０４bpのＨｉｎｄIII〜ＢａｍＨ１ＰＣＲ産物に結合する(下記参照)。

【０３３２】

【化８】

【０３３３】各末端に同じ制限部位をもつ整列ＰＣＲフラグメントにプローブがハイブリダ
イズする場合の一実施例として、ｐＮＷ３３ＨｉｎｄIII、Ｎｃｏ１およびＳｐ
ｅ１マトリックス(マトリックス＃１７)を、ｐＮＷ３３内における１４０bpのＢ
ｓｐＥ１(４６６)〜ＢａｍＨ１(６０５)制限フラグメントからのＰＣＲ産物によ
りプローブした。この実施例では、プローブは、ｐＮＷ３３内における４７０bp
のＨｉｎｄIII(４４５)〜ＨｉｎｄIII(９１５)制限フラグメントから誘導された
５１４bpのＨｉｎｄIII〜ＨｉｎｄIII ＰＣＲ産物に結合する(上記参照)。

【０３３４】 (オリゴヌクレオチド)

【表１６０】

【表１６１】

【０３３５】ｐＮＷ３３の制限消化ｐＮＷ３３の制限消化物を次のものを組み合わせることにより設定した：マトリックス＃７

【表１６２】

【０３３６】マトリックス＃１７

【表１６３】次いで、試料を渦状混合し、３７℃で一夜インキュベーションした。

【０３３７】ｐＮＷ３３制限消化物の子牛腸アルカリ性ホスファターゼ(ＣＩＡＰ)消化２０制限消化物(各々６.６μgの消化されたｐＮＷ３３を含む)の４００μｌフ
ラクションを、１μlのシー(Ｓｅｅ)ＤＮＡ、０.１倍量の３モル酢酸ナトリウム
(ｐＨ５.２)および２.５倍量のエタノールを加えることによりエタノール沈澱さ
せ、−２０℃に冷却し、次いで遠心分離にかけた。ペレットを７０％エタノール
ですすいだ後、４０ＵのＣＩＡＰを含む２０μlの１×ＣＩＡＰ緩衝液に再溶解
させた。ＣＩＡＰ消化は、３７℃で５時間行なわれ、次いで１×ＴＥ緩衝液を加
えて４００μlにした。

【０３３８】ｐＮＷ３３ＣＩＡＰ消化物のフェノール抽出希釈消化物を４００μlのフェノールで抽出し、次いで上記と同様にしてエタ
ノール沈澱させたが、７０％エタノール洗浄後に１００％エタノール洗浄を行っ
た。最後に、試料を２０μlのＴＥ緩衝液に再溶解した。

【０３３９】短ＰＣＲプライマーの同族アダプターへのアニーリング短ＰＣＲプライマーおよびそれらの同族アダプターについて、２０μlの５０
ミリモルＮａＣｌ、１×ＴＥ緩衝液中１μlの２００マイクロモル同族アダプタ
ーに１μlの２００マイクロモル短ＰＣＲプライマーを加えることによりアニー
リングした。混合オリゴヌクレオチドに軽質鉱油３０μlを塗り、次いで５分間
９０℃に加熱した後、ゆっくりと室温に冷却した。次いで、アニーリングされた
短ＰＣＲプライマー／同族アダプター複合体を、１mlの１×ＴＥ緩衝液により希
釈し、−２０℃で冷凍貯蔵した。

【０３４０】アニーリングされた短ＰＣＲプライマーおよび同族アダプターへの連結反応１μlのフェノール抽出ｐＮＷ３３消化物を一連結反応につき使用した。連結
反応は、１ミリモルのＡＴＰおよび１０μl(１００Ｕ)のＴ４ＤＮＡリガーゼを
含む１×リガーゼ緩衝液１００μl中で遂行された。アニーリングされた短ＰＣ
Ｒプライマー／同族アダプター複合体１mlからの２０μlアリコートを、下表に
従い加えた。

【表１６４】

【０３４１】連結反応は、１６℃で２４時間行なわれた。次いで、試料をＴＥ緩衝液により
１mlに希釈し、−２０℃で貯蔵した。次いで、希釈された連結反応物をさらに１０分の１に希釈し、１０μlを１０
０μl反応物当たりのＰＣＲ鋳型として使用した。

【０３４２】ヒト胎盤ＤＮＡの制限消化１Ｕ(〜５０ng)のヒト胎盤ＤＮＡを、１００μg／mlＢＳＡを含む４００μlの
１×ＮＥＢ緩衝液＃２中各々１００ＵのＢａｍＨ１、ＢｓｒＧ１、ＨｉｎｄIII
、Ｎｃｏ１、Ｓｐｅ１およびＡｆIIIにより３７℃で一夜消化した。

【０３４３】ヒト胎盤ＤＮＡ制限消化物のＣＩＡＰ消化消化物を、１μlのシー(Ｓｅｅ)ＤＮＡ、０.１倍量の３モル酢酸ナトリウム(
ｐＨ５.２)および２.５倍量のエタノールを加えることによりエタノール沈澱さ
せ、−２０℃に冷却し、次いで遠心分離にかけた。ペレットを７０％エタノール
ですすいだ後、１００ＵのＣＩＡＰを含む５０μlの１×ＣＩＡＰ緩衝液に再溶
解させた。ＣＩＡＰ消化は、３７℃で５時間行なわれ、次いで１×ＴＥ緩衝液を
加えて４００μlにした。

【０３４４】ヒト胎盤ＤＮＡＣＩＡＰ消化物のフェノール抽出希釈ＣＩＡＰ消化物を４００μlのフェノールで抽出し、次いで上記と同様に
してエタノール沈澱させたが、７０％エタノール洗浄後に１００％エタノール洗
浄を行った。最後に、試料を１０μlのＴＥ緩衝液に再溶解した。

【０３４５】アニーリングされた短ＰＣＲプライマーおよび同族アダプターへの連結反応短ＰＣＲプライマーを上記と同様にしてそれらの同族アダプターへアニーリン
グした。アニーリングされた短ＰＣＲプライマーおよび同族アダプターへの連結反応は
、１ミリモルのＡＴＰ、１００ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼおよび６種の短ＰＣＲ
プライマー／同族アダプター複合体各々１０μlを含む１×リガーゼ緩衝液１０
０μlにおいて上記要領で遂行された。

【０３４６】連結反応は、１６℃で２４時間行なわれた。次いで、試料を１×ＴＥ緩衝液に
より１mlに希釈し、−２０℃で貯蔵した。０.２μlを１００μl反応物についてのＰＣＲ鋳型として使用した。

【０３４７】ＰＣＲ増幅条件初回タッチダウン反応は、４種のｄＮＴＰ全て２００マイクロモルおよび０.
０５Ｕ／μlのＴａｑＤＮＡポリメラーゼを含む１×ＰＣＲ緩衝液５０μl中で
実施された。長ＰＣＲプライマーを４００ナノモルで使用した。１０μlのｐＮ
Ｗ３３ＰＣＲ鋳型を一反応について使用し、０.２μlのヒト胎盤ＤＮＡＰＣＲ
鋳型を一反応について使用した。試料に４０μlの軽質鉱油を塗り、下記要領で
タッチダウン温度循環させた。１分間９８℃、２分間７２℃、５分間７２℃ １分間９８℃、２分間６９℃、５分間７２℃ １分間９８℃、２分間６６℃、５分間７２℃ １分間９８℃、２分間６３℃、５分間７２℃ １分間９８℃、２分間６０℃、５分間７２℃

【０３４８】次いで、主たる温度循環は、４種のｄＮＴＰ全て２００マイクロモルおよび０
.０５Ｕ／μlのＴａｑＤＮＡポリメラーゼを含む１×ＰＣＲ緩衝液１００μl中
で実施された。長ＰＣＲプライマーを４００ナノモルで使用した。試料を、１分
間９８℃、２分間６０℃、５分間７２℃、次いで１０分間７２℃の２０サイクル
に付した後、１０℃で冷蔵し、油下から回収した。

【０３４９】ナイロン膜への配列ＰＣＲ増幅試料からの１μlのアリコートを、ハイボンドＮ＋ナイロン膜へス
ポットした。次いで、膜を、３枚の３ＭＭ紙のスタックに転移させ、０.４モル
のＮａＯＨで飽和させ、１０分間インキュベーションした。ＮａＯＨを２×ＳＳ
Ｃ中ですすぎ、膜をプレ‐ハイブリダイゼーションに直接使用した。

【０３５０】プローブ合成ＰＣＲマスター混合物を次の要領で製造した(体積は全てμl)：

【表１６５】

【０３５１】５回のＰＣＲ反応が行なわれた。各反応について、５μlの３３Ｐ標識ｄＣＴ
ＰをＰＣＲ管に加えた。次いで、４５μlのマスター混合物を各管に加えること
により、反応物を５０μlにした。各反応物を静かに混合した。

【０３５２】ＰＣＲ循環パラメーター９４℃ ２分間５０℃ ２分間７２℃ ２分間９４℃ ４５秒間 }２５サイクル５０℃ １分間７２℃ ８分間４℃ ホールド温度循環後、５種のＰＣＲ増幅物をプールした。次いで、２５０μlの標識Ｄ
ＮＡを下記磁気ビーズ精製方法に使用した。

【０３５３】ビオチニル化ＰＣＲ産物の捕獲および非ビオチニル化鎖の放出分離は全て、ダイナルＭＰＣ−４分離装置(ダイナル、製品＃１２００４)を用
いて実施された。

【０３５４】プールされたＰＣＲ２５０μlを、２０ミリモルのトリス−ＨＣｌ(ｐＨ７.４)
、２ミリモルのＥＤＴＡ(ｐＨ８.０)、２モルのＮａＣｌ中、等量の１０mg／ml
ストレプトアビジン被覆コロイド状Ｆｅ３Ｏ４粒子と混合した。管を室温で１時
間、デンリー・オービタル・ミキサーで混合しながらインキュベーションした。

【０３５５】次いで、ストレプトアビジン被覆コロイド状Ｆｅ３Ｏ４粒子を、１mlの１０ミ
リモルのトリス−ＨＣｌ(ｐＨ７.４)、１ミリモルのＥＤＴＡ(ｐＨ８.０)、１モ
ルのＮａＣｌにより洗浄した。さらに３回同じ洗浄を遂行した。

【０３５６】洗浄されたストレプトアビジン被覆コロイド状Ｆｅ３Ｏ４粒子を、室温で１０
分間５００μlの０.１モルＮａＯＨ中でインキュベーションした。上清を除去し
、５００μlの０.５モルＨＥＰＥＳに加えた。次いで、０.１倍量の３モル酢酸
ナトリウム(ｐＨ５.２)および２.５倍量のエタノールを加え、０℃に冷却(氷上
で３０分間)し、次いで１０分間２００００最大ＲＣＦで遠心分離することによ
り、試料をエタノール沈澱させた。ペレットを７０％エタノールですすいだ後、
１００μlのＴＥ緩衝液に溶解した。

【０３５７】 (ハイブリダイゼーション) 各膜を５５mm×３５mm×２１mmのプラスチック箱に入れ、１.２５mlのプレ‐
ハイブリダイゼーション溶液(５×ＳＳＣ、デンハート溶液、１％ＳＤＳ、１０
％デキストランスルフェート［分子量５０００００］、０.３％ピロリン酸４ナ
トリウム、１００μg／mlの変性音波処理ＤＮＡ−６５℃に予熱)を加えた。各箱
を密閉し、振動プラットホームにおいて６５℃で５０分間インキュベーションし
た。プレ‐ハイブリダイゼーション溶液を除去し、ハイブリダイゼーション溶液
(５×ＳＳＣ、デンハート溶液、１％ＳＤＳ、１０％デキストランスルフェート
［分子量５０００００］、０.３％ピロリン酸４ナトリウム、１００μg／mlの変
性音波処理ＤＮＡ−適当な３３Ｐ−標識プローブ含有)により置き換え、箱を振
動プラットホームにおいて６５℃で３時間インキュベーションした。

【０３５８】 (洗浄) 膜を乾かし、６８℃で３０分間２００mlの２×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳに移し
た。７１℃で３０分間、０.２×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ中でさらに洗浄を行った
。膜を室温で２×ＳＳＣによりすすぎ、ブロッティング紙に広げることにより、
過剰の液体を除去した。一旦乾燥後、膜をサランラップで覆い、コダック・ホス
ファー(蛍光体)・スクリーンに１時間暴露した。それに続いて、蛍光体スクリー
ンを、モレキュラー・ダイナミクス・ストーム８６０ホスファーイメージャーを
用いて画像化した。結果は図４および５に示されている。

【０３５９】実施例＃３ａエシェリキア・コリ(E.coli)ＭｕｔＳタンパク質が、Ａ／Ａミスマッチ含有二
重らせんの捕獲に使用される、単一サイクルの異集団間パーフェクトマッチ二重
らせんデプリーション「変化」対「未変化」(すなわち、異集団間)ミスマッチ含有二重らせん選択は
、ミスマッチ結合タンパク質を固体支持体に結合(または溶解状態でミスマッチ
結合タンパク質を使用後、固相捕獲)し、変性「変化」ＤＮＡフラグメントを採
取し、これらを変性ビオチニル化「未変化」ＤＮＡフラグメントにハイブリダイ
ズさせ、そしてミスマッチ結合タンパク質によりミスマッチ含有二重らせん分子
を捕獲することにより達成され得る。ミスマッチ含有二重らせん分子(鎖変性を
伴わない)を放出させ、ストレプトアビジン捕獲、次いで非ビオチニル化鎖の解
離により、目的とする種類のみが得られる。

【０３６０】この実施例において、ＰＣＲフラグメントを調製し、使用することにより、エ
シェリキア・コリ(E.coli)ＭｕｔＳタンパク質を用いた単一サイクルの異集団間
パーフェクトマッチ二重らせんデプリーションに関する個々の段階が各々立証さ
れる。

【０３６１】クローン挿入体設計当業界の熟練専門家に熟知されている標準クローニング方法を用いて、クロー
ン挿入体を構築し、ｐＭＯＳＢｌｕｅ(アマーシャム・ファーマシア・バイオテ
ク)のＡｖａ１部位およびＥｃｏＲ１間に挿入した。

【０３６２】クローン挿入体は、単一ヌクレオチド変化または挿入が配置され得る共通の９
塩基対内部コア配列を含む。内部コア配列は、ヒトｐ５３のコドン２７２−２７
４から誘導される。これらのコドン(ＧＴＧＣＧＴＧＧＴ)は、肺および他のタ
イプの癌から見出される突然変異ホットスポット(Ｒ２７３L)に相当する。一ミ
スマッチ(下記に示されている完全な連続配列から一つのみ)を含むクローン挿入
体を設計するため、このコア配列の５位におけるヌクレオチドを修飾する(ＧＴ
ＧＣＸＴＧＧＴ)。

【０３６３】内部コア配列の両側にはランダム配列が隣接しており、クローン挿入体の混合
集団からクローン＃１およびクローン＃７挿入配列が独立検出され得る。

【０３６４】クローン＃１突然変異配列(＃１Ｍ)

【化９】

【０３６５】対照配列(＃１Ｃ)

【化１０】

【０３６６】クローン＃７対照配列(＃７Ｃ)

【化１１】

【０３６７】上方鎖５'−ビオチニル化および下方鎖５'−ビオチニル化＃１Ｃ二本鎖ＰＣＲ
産物、並びに上方鎖５'−ビオチニル化および下方鎖５'−ビオチニル化＃７Ｃ二
本鎖ＰＣＲ産物の製造 (オリゴヌクレオチド) ＢＩＯＵＰＳＴ２５'ビオ−ＣＴＡＣＴＧＡＴＣＧＧＡＴＣＣＣＣＧ３' ＢＩＯＤＯＷＮ３５'ビオ−ＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＡＡＴ３'

【０３６８】ＰＣＲ反応構成(＃１Ｃ) ２.５０μg／mlでのｐＭＯＳＢｌｕｅ中＃１Ｃ１００μl 水８４００μl １０×ＰＣＲ緩衝液１０００μl ５０マイクロモルＢＩＯＵＰＳＴ２１００μl ５０マイクロモルＢＩＯＤＯＷＮ３１００μl １０ミリモルｄＮＴＰ２００μl ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ(５Ｕ／μｌ) １００μｌ

【０３６９】ＰＣＲ反応構成(＃７Ｃ) ３.３２μg／mlでのｐＭＯＳＢｌｕｅ中＃７Ｃ１００μl 水８４００μl １０×ＰＣＲ緩衝液１０００μl ５０マイクロモルＢＩＯＵＰＳＴ２１００μl ５０マイクロモルＢＩＯＤＯＷＮ３１００μl １０ミリモルｄＮＴＰ２００μl ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ(５Ｕ／μｌ) １００μｌ

【０３７０】下記要領で、９６ウェルのパーキン・エルマー・シータス・ジーンアンプＰＣ
Ｒシステム９６００機において、９６×２００μlの反応は、鋳型＃１Ｃに関し
て行なわれ、９６×２００μlの反応は鋳型＃７Ｃに関して行なわれた。９５℃、５分間１サイクル９５℃、１分間５０℃、１分間 }３０サイクル７２℃、１分間７２℃、５分間１サイクル４℃、ホールド

【０３７１】ＰＣＲ産物を一緒にプールし、０.１倍量の３モル酢酸ナトリウムおよび１倍
量のイソプロパノールを加え、次に４℃で３０分間、１６０００rpmでの遠心分
離(セントリコンＴ−２０７０超遠心管で、スイングバケットのコントロンロー
ターＴＳＴ４１.１４)にかけることにより沈澱させた。ペレットを１４mlのエタ
ノールで洗浄し、２００００rpmで３０分間遠心分離した。最後に、ペレットを
風乾し、総量０.６mlのＴＥ緩衝液に再懸濁した。

【０３７２】０.６mlＰＣＲ試料を、製造業者のプロトコルに従い１２のマイクロスピンＳ
−３００ＨＲカラム(１カラムにつき５０μl)中で精製した。簡単に述べると、
カラム中の樹脂を渦状にしながら再懸濁した。カラムを７３５×g(微細遠心管中
で３０００rpm)で１分間遠心分離した。次いで、床を乱さないよう注意しながら
、試料を樹脂の中央に適用した。カラムを７３５×gで２分間遠心分離し、ＰＣ
Ｒ産物を含む流動物質を集めた。溶離した１２の５０μl量を一緒にプールした(
プール１)。カラムを５０μlのＴＥ緩衝液により洗浄し、溶離フラクションを新
たなＳ−３００ＨＲカラムに充填した。生成物収率およびＰＣＲプライマーの除
去効率を１.５％アガロースゲルで分析した。

【０３７３】非ビオチニル化＃１Ｍ１本鎖ＤＮＡおよび非ビオチニル化＃７Ｃ１本鎖ＤＮＡ
の製造 (オリゴヌクレオチド) ＢＩＯＵＰＳＴ２５'ビオ−ＣＴＡＣＴＧＡＴＣＧＧＡＴＣＣＣＣＧ３' ＤＯＷＮ３５'ＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＡＡＴ３' ＰＣＲ反応構成(＃１Ｍ) ３.５６μg／mlでのｐＭＯＳＢｌｕｅ中＃１Ｍ１００μl 水８４００μl １０×ＰＣＲ緩衝液１０００μl ５０マイクロモルＢＩＯＵＰＳＴ２１００μl ５０マイクロモルＢＩＯＤＯＷＮ３１００μl １０ミリモルｄＮＴＰ２００μl ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ(５Ｕ／μｌ) １００μｌ

【０３７４】ＰＣＲ反応構成(＃７Ｃ) ３.３２μg／mlでのｐＭＯＳＢｌｕｅ中＃７Ｃ１００μl 水８４００μl １０×ＰＣＲ緩衝液１０００μl ５０マイクロモルＢＩＯＵＰＳＴ２１００μl ５０マイクロモルＤＯＷＮ３１００μl １０ミリモルｄＮＴＰ２００μl ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ(５Ｕ／μｌ) １００μｌ

【０３７５】下記要領で、９６ウェルのパーキン・エルマー・シータス・ジーンアンプＰＣ
Ｒシステム９６００機において、４８×２００μlの反応は、鋳型＃１Ｍに関し
て行なわれ、４８×２００μlの反応は鋳型＃７Ｃに関して行なわれた。９５℃、５分間１サイクル９５℃、１分間５０℃、１分間 }３０サイクル７２℃、１分間７２℃、５分間１サイクル４℃、ホールド

【０３７６】非ビオチニル化＃１Ｍ１本鎖ＤＮＡおよび非ビオチニル化＃７Ｃ１本鎖ＤＮＡ
の製造を目的とするビオチニル化ＰＣＲ産物鎖の捕獲および非ビオチニル化鎖の
放出プールした＃１Ｍおよび＃７ＣＰＣＲ増幅物１０mlを、２０ミリモルのトリ
ス−ＨＣｌ(ｐＨ７.４)、２ミリモルのＥＤＴＡ(ｐＨ８.０)、２モルのＮａＣｌ
中にとった等量の４mg／mlストレプトアビジン被覆コロイド状Ｆｅ_３Ｏ_４粒子と
各々混合した。管を混合しながら室温で６０分間インキュベーションした。

【０３７７】次いで、ストレプトアビジン被覆コロイド状Ｆｅ_３Ｏ_４粒子を、２０mlの１０
ミリモルのトリス−ＨＣｌ(ｐＨ７.４)、１ミリモルのＥＤＴＡ(ｐＨ８.０)、１
モルのＮａＣｌにより洗浄した。さらに２回同じ洗浄を行った。

【０３７８】最後に、洗浄したストレプトアビジン被覆コロイド状Ｆｅ_３Ｏ_４粒子を、８０
０μlの０.１モルＮａＯＨ中室温で１０分間インキュベーションした。上清を除
去し、２００μlの２モルＨＥＰＥＳ(遊離酸)に加えた。試料を２６０nmの吸光
度で定量した。

【０３７９】 (変性およびアニーリング) 変性およびアニーリング反応物は、次のものを混合することにより製造された
：

【表１６６】

【０３８０】従って、Ａの上方鎖および１本鎖Ｃ間の再アニーリングにより、クローン挿入
体＃１について、上方鎖が５'−ビオチニル化された、Ａ／Ａミスマッチ含有二
重らせんが生じる。

【０３８１】従って、Ｂの上方鎖および１本鎖Ｄ間の再アニーリングにより、クローン挿入
体＃７について、上方鎖が５'−ビオチニル化された、パーフェクトマッチ含有
二重らせんが生じる。

【０３８２】次いで、０.１倍量の１モルＮａＯＨを加えた後、室温で１０分間インキュベ
ーションした。最後に、０.２５倍量の２モルＨＥＰＥＳ(遊離酸)を加えた後、
４２℃で１時間インキュベーションした。

【０３８３】試料を５０μlに調節し、ＰＢＳ中１×およびＢＳＡ中１mg／mlにすることに
より、ＭｕｔＳタンパク質被覆磁気ビーズとの反応に備えた。

【０３８４】１個の５０μl試料(濃厚化前対照、試料６)を、ビオチニル化ＰＣＲ産物鎖の
捕獲および非ビオチニル化鎖の放出のために直接使用した。

【０３８５】 (ミスマッチ捕獲) ２０μlのＭ_２Ｂ_２ＭｕｔＳタンパク質被覆磁気粒子(ジーンチェック、ロッ
ト＃２０)を、上記のアニーリングされたＤＮＡに加えた。試料を振とうしなが
ら室温で１時間インキュベーションした。

【０３８６】次いで、試料を２００μlの氷冷ＰＢＳにより２回洗浄した。最後に試料が、下記物質５０μl中室温で１０分間磁気ビーズから溶離された
。

【表１６７】

【０３８７】ビオチニル化ＰＣＲ産物鎖の捕獲および非ビオチニル化鎖の放出分離は全て、アマーシャムの磁気分離装置(ＲＰＮ１６８２、バッチ＃１)を用
いて行なわれた。５０μlのＭｕｔＳタンパク質被覆磁気ビーズからの溶離液および濃厚化前対
照(試料６)を、２０ミリモルのトリス−ＨＣｌ(ｐＨ７.４)、２ミリモルのＥＤ
ＴＡ(ｐＨ８.０)、２モルのＮａＣｌ中４mg／mlストレプトアビジン被覆コロイ
ド状Ｆｅ_３Ｏ_４粒子の等量と各々混合した。管を一定混合しながら室温で３０分
間インキュベーションした。

【０３８８】次いで、ストレプトアビジン被覆コロイド状Ｆｅ_３Ｏ_４粒子を、室温で５００
μlの１０ミリモルのトリス−ＨＣｌ(ｐＨ７.４)、１ミリモルＥＤＴＡ(ｐＨ８.
０)、１モルＮａＣｌにより２回洗浄した。

【０３８９】洗浄したストレプトアビジン被覆コロイド状Ｆｅ_３Ｏ_４粒子を、室温で１０分
間０.１モルのＮａＯＨ１０μl中でインキュベーションした。上清を除去し、２
.５μlの２モルＨＥＰＥＳ(遊離酸)に加えた。

【０３９０】最後に、５μlフラクションを、２００ng、２０ng、２ngおよび２００pg量の
下記成分と一緒にハイボンドＮ＋ナイロン膜にスポットした。

【表１６８】

【０３９１】 (プローブ標識) オリゴヌクレオチド＃１プローブオリゴ５'ＧＧＣＣＧＡＧＴＴＴＴＧＧＴＣＣＧＴＡＧ３' ＃７プローブオリゴ５'ＧＴＣＴＴＧＣＧＴＣＡＣＣＴＧＧＴＣＴＣＡＧ３'

【０３９２】プローブの製造下記(体積は全てμlである)Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、＃１プ
ローブオリゴおよび＃７プローブオリゴを放射性５'末端標識した。

【表１６９】反応物を３７℃で３０分間インキュベーションし、次いで５分間７０℃に加熱
して、酵素を変性させた。

【０３９３】マイクロスピンＧ−２５カラム精製２本のＧ−２５カラム(ＡＰＢ２７−５３２５−０１、ロット＃９０１５３２
５０１１)を、渦状にすることにより再懸濁し、製造業者の使用説明書の記載に
従い底部のファスナーを手早く閉じた。カラムのプレスピンを、ヘチッヒ・ツォ
イトリフーゲンＥＢＡ１２ベンチトップ遠心管中７３０最大ＲＣＦ−２６７０rp
mで１分間行い、そして溶離液を廃棄した。２５μlの反応物を各カラムに適用し
、カラムを７３０最大ＲＣＦで２分間遠心分離した。第２スピンからの溶離液を
貯蔵し、プローブとして使用した。

【０３９４】 (ハイブリダイゼーション) 各膜を５５mm×３５mm×２１mmのプラスチック箱に入れ、２.５mlのプレ‐ハ
イブリダイゼーション溶液(５×ＳＳＣ、デンハート溶液、１％ＳＤＳ、１０％
デキストランスルフェート［分子量５０００００］、０.３％ピロリン酸４ナト
リウム、１００μg／mlの変性音波処理ＤＮＡ−４２℃に予熱)を加えた。各箱を
密閉し、振動プラットホームにおいて４２℃で１時間インキュベーションした。
プレ‐ハイブリダイゼーション溶液を除去し、ハイブリダイゼーション溶液(５
×ＳＳＣ、デンハート溶液、１％ＳＤＳ、１０％デキストランスルフェート［分
子量５０００００］、０.３％ピロリン酸４ナトリウム、１００μg／mlの変性音
波処理ＤＮＡ−適当な^３３Ｐ−標識プローブ２.５μl含有)により置き換え、箱
を振動プラットホームにおいて４２℃で一夜インキュベーションした。

【０３９５】 (洗浄) 膜を乾かし、４２℃で１０分間２００mlの２×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳに移し
た。４２℃で１０分間、０.２×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ中でさらに洗浄を行った
。膜を室温で２×ＳＳＣによりすすぎ、ブロッティング紙に広げることにより、
過剰の液体を除去した。一旦乾燥後、膜をサランラップで覆い、コダック・ホス
ファー(蛍光体)・スクリーンに１時間暴露した。それに続いて、蛍光体スクリー
ンを、モレキュラー・ダイナミクス・ストーム８６０ホスファーイメージャーを
用いて画像化した。

【０３９６】 (ドットブロットのレイアウト)

【表１７０】

【０３９７】 (プローブハイブリダイゼーション結果)

【表１７１】イメージクワント５.０ソフトウェア(モレキュラー・ダイナミクス)を用いて
上記スポットからのシグナル強度を記録し、ＳｕｍＡｂｏｖｅ(サムアバブ)ＢＧ
図は、スポット配置全体に６×３の方眼を描いた後に使用された。

【０３９８】＃１プローブＳｕｍＡｂｏｖｅＢＧシグナル

【表１７２】

【０３９９】＃７プローブＳｕｍＡｂｏｖｅＢＧシグナル

【表１７３】

【０４００】 (回収率)

【表１７４】

【０４０１】回収率の図は、様々な異なる溶離条件について下記にプロットされている。

【表１７５】

【０４０２】実施例＃３ｂ開裂−不活化Ｎ６２Ｄ点突然変異を含むバクテリオファージＴ４エンドヌクレ
アーゼVIIIタンパク質が、Ａ／Ａミスマッチ含有二重らせんの捕獲に使用される
、単一サイクルの異集団間パーフェクトマッチ二重らせんデプリーションこの実施例では、同じくＰＣＲフラグメントを調製し、使用することにより、
開裂−不活化Ｎ６２Ｄ点突然変異を含むバクテリオファージＴ４エンドヌクレア
ーゼVIIIタンパク質を用いる単一サイクルの異集団間パーフェクトマッチ二重ら
せんデプリーションに関する個々の段階の各々が立証されている。

【０４０３】クローン設計およびＤＮＡ調製クローン挿入体設計は、実施例＃３ａの記載と正確に同じであった(クローン
＃１：突然変異配列(＃１Ｍ)、対照配列(＃１Ｃ)およびクローン＃７：対照配列
(＃７Ｃ)参照)。

【０４０４】上方鎖５'−ビオチニル化および下方鎖５'−ビオチニル化＃１Ｃ２本鎖ＰＣＲ
産物、並びに上方鎖５'−ビオチニル化および下方鎖５'−ビオチニル化＃７Ｃ２
本鎖ＰＣＲ産物の調製は、実施例＃３ａの記載と同様であった。

【０４０５】非ビオチニル化＃１Ｍ１本鎖ＤＮＡおよび非ビオチニル化＃７Ｃ１本鎖ＤＮＡ
の調製もまた、実施例＃３ａの記載と同様であった。

【０４０６】 (変性およびアニーリング) 変性およびアニーリング反応物は、実施例＃３ａの記載と同様にして製造され
た。

【０４０７】従って、再アニーリングはまた、クローン挿入体＃１について、上方鎖が５'
−ビオチニル化された、Ａ／Ａミスマッチ含有二重らせん、およびクローン挿入
体＃７について、上方鎖が５'−ビオチニル化された、パーフェクトマッチ二重
らせんを生じさせる。

【０４０８】１個の５０μl試料(濃厚化前対照)をＴＥ緩衝液により１００μlに調節し、ビ
オチニル化ＰＣＲ産物鎖の捕獲および非ビオチニル化鎖の放出に直接使用した。

【０４０９】 (ミスマッチ捕獲) アニーリング反応の５０μl試料を、等量の２００ミリモルのリン酸ナトリウ
ム(ｐＨ６.５)、１００ミリモルのＫＣｌと混合した。１０μgのＧＳＴ標識Ｔ４
エンドヌクレアーゼVII Ｎ６２Ｄ突然変異体(ボーリース・ケンパー教授から入
手、ケルン大学)を、アニーリングされたＤＮＡに加え、試料を１６℃で１５分
間インキュベーションした。

【０４１０】次いで、試料を、１００ミリモルのリン酸ナトリウム(ｐＨ６.５)、５０ミリ
モルのＫＣｌ中グルタチオン・セファロース４Ｂ(アマーシャム・ファーマシア
・バイオテク、ロット＃２７９９９１)の５０％スラリー２００μlと混合した。
管を一定混合しながら１６℃で３０分間インキュベーションした。次いで、混合
物をスピンカラムに移して、液相から固体を分離した。

【０４１１】最後に、試料を、５０ミリモルのトリス−ＨＣｌ(ｐＨ８.０)中１０ミリモル
の還元グルタチオン１００μlにおいて、室温で１０分間グルタチオン・セファ
ロース４Ｂマトリックスから溶離した。

【０４１２】ビオチニル化ＰＣＲ産物鎖の捕獲および非ビオチニル化鎖の放出分離は全て、アマーシャム磁気分離装置(ＲＰＮ１６８２、バッチ＃１)を用い
て行なわれた。

【０４１３】Ｎ６２ＤＴ４エンドヌクレアーゼVIIミスマッチ捕獲反応からの溶離液１００
μl、および濃厚化前対照を、各々、２０ミリモルのトリス−ＨＣｌ(ｐＨ７.４)
、２ミリモルのＥＤＴＡ(ｐＨ８.０)、２モルのＮａＣｌ中４mg／mlストレプト
アビジン被覆コロイド状Ｆｅ_３Ｏ_４粒子の等量と混合した。管を一定混合しなが
ら室温で３０分間インキュベーションした。

【０４１４】次いで、ストレプトアビジン被覆コロイド状Ｆｅ_３Ｏ_４粒子を、室温で５００
μlの１０ミリモルのトリス−ＨＣｌ(ｐＨ７.４)、１ミリモルのＥＤＴＡ(ｐＨ
８.０)、１モルのＮａＣｌにより２回洗浄した。

【０４１５】洗浄したストレプトアビジン被覆コロイド状Ｆｅ_３Ｏ_４粒子を、室温で１０分
間１０μlの０.１モルＮａＯＨ中でインキュベーションした。上清を除去し、２
モルのＨＥＰＥＳ(遊離酸)２.５μlに加えた。

【０４１６】最後に、５μlフラクションを、２００ng、２０ng、２ngおよび２００pg量の
下記成分と一緒にハイボンドＮ＋ナイロン膜にスポットした。

【表１７６】

【０４１７】 (プローブ標識) プローブ標識は、正確に実施例＃３ａの記載に従った。

【０４１８】 (ハイブリダイゼーション) 各膜を５５mm×３５mm×２１mmのプラスチック箱に入れ、２.５mlのプレ‐ハ
イブリダイゼーション溶液(５×ＳＳＣ、デンハート溶液、１％ＳＤＳ、１０％
デキストランスルフェート［分子量５０００００］、０.３％ピロリン酸４ナト
リウム、１００μg／mlの変性音波処理ＤＮＡ−４２℃に予熱)を加えた。各箱を
密閉し、振動プラットホームにおいて４２℃で１時間インキュベーションした。
プレ‐ハイブリダイゼーション溶液を除去し、ハイブリダイゼーション溶液(５
×ＳＳＣ、デンハート溶液、１％ＳＤＳ、１０％デキストランスルフェート［分
子量５０００００］、０.３％ピロリン酸４ナトリウム、１００μg／mlの変性音
波処理ＤＮＡ−適当な^３３Ｐ−標識プローブ２.５μl含有)により置き換え、箱
を振動プラットホームにおいて４２℃で一夜インキュベーションした。

【０４１９】 (洗浄) 膜を乾かし、４２℃で１０分間２００mlの２×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳに移し
た。４２℃で１０分間、０.２×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ中でさらに洗浄を行った
。膜を室温で２×ＳＳＣによりすすぎ、ブロッティング紙に広げることにより、
過剰の液体を除去した。一旦乾燥後、膜をサランラップで覆い、コダック・ホス
ファー(蛍光体)・スクリーンに１時間暴露した。それに続いて、蛍光体スクリー
ンを、モレキュラー・ダイナミクス・ストーム８６０ホスファーイメージャーを
用いて画像化した。

【０４２０】また、イメージクワント５.０ソフトウェア(モレキュラー・ダイナミクス)を
用いて上記スポットからのシグナル強度を記録し、ＳｕｍＡｂｏｖｅ(サムアバ
ブ)ＢＧ図は、スポット配置全体に６×３の方眼を描いた後に使用された。

【０４２１】＃１プローブＳｕｍＡｂｏｖｅＢＧシグナル

【表１７７】

【０４２２】＃７プローブＳｕｍＡｂｏｖｅＢＧシグナル

【表１７８】

【０４２３】 (回収率)

【表１７９】

【０４２４】濃厚化結果を下記のグラフに示す：

【表１８０】

【０４２５】故Chris Griffin および故Richard Beerに敬意を表して本書を捧ぐ。

【図面の簡単な説明】

【図１】制限消化物電気泳動にかけた図である。

【図２】１μgのストラタジーンKb ＤＮＡラダー(バンドサイズ：２５０b
p、５００bp、７５０bp、１kb、１.５kb、２kb、３kb、４kb、５kb、６kb、７kb
、８kb、９kb、１０kbおよび１２kb)、３×ギャップ、０.２５、０.０２５、０.
００２５、０.０００２５、０.００００２５、０.０００００２５および０Ｕ／
μlのＢａｍＨＩ／ＢｓｒＧＩ／ＨｉｎｄIII／ＮｃｏＩ／ＳｐｅＩ／ＡｆIIIに
より消化されたイヌゲノムＤＮＡ２μg、ギャップ、０.４μgのイヌゲノムＤＮ
Ａおよび０.２５、０.０２５、０.００２５、０.０００２５、０.００００２５
、０.０００００２５および０Ｕ／μlのＢａｍＨＩ／ＢｓｒＧＩ／ＨｉｎｄIII
／ＮｃｏＩ／ＳｐｅＩ／ＡｆIIIにより消化されたＢｓｐＥＩ−放出内部対照Ｄ
ＮＡ１μlを示す。

【図３】８％ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動後における制限消化の
生成物を示す。

【図４】ｐＮＷ３３からの１４０bp ＢｓｐＥＩ−ＢａｍＨＩフラグメン
トによりプローブされたｐＮＷ３３ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄIIIおよびＡｆIIIマ
トリックスについて予測されるＴＲＳＰＡ−２パターンおよびｐＮＷ３３からの
１４０bp ＢｓｐＥＩ−ＢａｍＨＩフラグメントによりプローブされたｐＮＷ３
３ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄIIIおよびＡｆIIIマトリックスについて観察されたＴ
ＲＳＰＡ−２パターンを示す。

【図５】ｐＮＷ３３からの１４０bp ＢｓｐＥＩ−ＢａｍＨＩフラグメン
トによりプローブされたｐＮＷ３３ＨｉｎｄIII、ＮｃｏＩおよびＳｐｅＩマト
リックスについて予測されるＴＲＳＰＡ−２パターンおよびｐＮＷ３３からの１
４０bp ＢｓｐＥＩ−ＢａｍＨＩフラグメントによりプローブされたｐＮＷ３３
ＨｉｎｄIII、ＮｃｏＩおよびＳｐｅＩマトリックスについて予測されるＴＲＳ
ＰＡ−２パターンを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 37/00 １０２Ｆ１０３Ｇ０１Ｎ 1/28 Ｊ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ニコラス・イアン・ワークマンイギリス、エイチピー21・７エヌゼット、バッキンガムシャー、エールズベリー、キャンフォード・コート４番 (72)発明者ルイス・マルティン−パラスイギリス、エイチピー13・７エヌダブリュー、バッキンガムシャー、ハイ・ウィカム、グラッドストーン・ライズ７番Ｆターム(参考） 2G052 AA28 AB20 AD46 DA05 DA08 EC12 FA08 FB06 GA18 GA25 GA27 GA28 GA30 JA04 JA07 JA09 4B024 AA11 CA03 EA04 HA09 HA13 HA14 4B063 QA08 QA13 QQ01 QQ42 QR14 QR32 QR48 QR51 QR56 QR62 QR82 QS16 QS25 QS34

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】フラグメント化形態で変化ＤＮＡを提供し、フラグメント化
形態で未変化ＤＮＡを提供することにより、興味の対象である表現型に特有なフ
ラグメントに富むＤＮＡフラグメントの混合物を提供する方法であって、ａ)ハイブリダイゼーション条件下、変化ＤＮＡのフラグメントおよび未変化
ＤＮＡのフラグメントを混合し、ｂ)ミスマッチを含むハイブリッドの混合物を回収し、ｃ)ミスマッチを含むハイブリッドの混合物から変化ＤＮＡのフラグメントを
回収することを含み、そして所望によりステップａ)、ｂ)およびｃ)を１回またはそれ以上の回数反
復してもよい方法。
【請求項２】変化ＤＮＡが、興味の対象である表現型を示す個体のプール
されたＤＮＡであり、未変化ＤＮＡが、興味の対象である表現型を示さない個体
のプールされたＤＮＡである、請求項１記載の方法。
【請求項３】変化ＤＮＡが、興味の対象である表現型を示す一個体のＤＮ
Ａであり、未変化ＤＮＡが、興味の対象である表現型を示さない個体のプールさ
れたＤＮＡである、請求項１記載の方法。
【請求項４】変化ＤＮＡが、興味の対象である表現型を示す一個体のＤＮ
Ａであり、未変化ＤＮＡが、興味の対象である表現型を示さない祖先の完全なセ
ットのプールされたＤＮＡである、請求項１記載の方法。
【請求項５】変化ＤＮＡが、興味の対象である表現型を示す個体の細胞か
らのＤＮＡであり、未変化ＤＮＡが、興味の対象である表現型を示さない個体の
細胞からのＤＮＡである、請求項１記載の方法。
【請求項６】ステップｂ)がミスマッチ結合タンパク質の使用により遂行
される、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】変化ＤＮＡのフラグメントまたは未変化ＤＮＡのフラグメン
トが、特異的結合対の一方により標識され、ステップｃ)が特異的結合対の他方
を用いることにより遂行される、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】未変化ＤＮＡのフラグメントがビオチンにより標識され、ス
テップｃ)が固定化ストレプトアビジンの使用により遂行される、請求項７記載
の方法。
【請求項９】興味の対象である表現型に特有なフラグメントに富むＤＮＡ
フラグメントの混合物を、自己ハイブリダイゼーションにかけた後、パーフェク
トマッチ二重らせんを回収する、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】興味の対象である表現型に特有なフラグメントに富むＤＮ
Ａフラグメントの混合物を、ハイブリダイゼーション条件下過剰の変化ＤＮＡフ
ラグメントと混合した後、パーフェクトマッチ二重らせんを回収する、請求項１
〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】変化ＤＮＡおよび未変化ＤＮＡの各々が、０〜５の４カッ
ター制限エンドヌクレアーゼ酵素と一緒に４〜７の６カッター制限エンドヌクレ
アーゼ酵素で消化することによりフラグメント化形態で提供される、請求項１〜
１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】請求項１〜１１のいずれか１項記載の方法により提供され
る、興味の対象である表現型に特有なフラグメントに富むＤＮＡフラグメントの
混合物。
【請求項１３】興味の対象であるＤＮＡフラグメントのアレイのセットを
作製する方法であって、ａ)ｎ制限エンドヌクレアーゼ酵素のセットから、ｒ制限エンドヌクレアーゼ酵
素のサブセットを選別し、ｂ)ｒ酵素のサブセットによりゲノムＤＮＡを消化し、ｃ)生成したフラグメントに、特有なポリメラーゼ連鎖反応増幅可能配列をもつ
制限酵素切断部位特異的アダプターを連結させ、ｄ)生成したフラグメントをｒ^２アリコートに分割し、ｅ)一方が標識されている２つの制限酵素特異的プライマーにより各アリコート
を増幅し、ｆ)ｒ^２アリコートの非標識アンプリファイア鎖のアレイを形成し、そしてｇ)ｒ制限エンドヌクレアーゼ酵素の一つまたはそれ以上の異なるサブセットを
用いてステップａ)〜ｆ)を反復することを含む方法。
【請求項１４】興味の対象であるＤＮＡフラグメントのアレイのセットを
作製する方法であって、ａ)ｎ制限エンドヌクレアーゼ酵素のセットから、ｒ制限エンドヌクレアーゼ酵
素のサブセットを選別し、ｂ)ｒ酵素のサブセットによりゲノムＤＮＡを消化し、ｃ)生成したフラグメントに、特有なポリメラーゼ連鎖反応増幅可能配列をもつ
制限酵素切断部位特異的アダプターを連結させ、ｄ)生成したフラグメントをｒ^２アリコートに分割し、ｅ)２つの制限酵素特異的プライマーにより各アリコートを増幅し、ｆ)ｒ^２アリコートのアンプリファイア鎖のアレイを形成し、そしてｇ)ｒ制限エンドヌクレアーゼ酵素の一つまたはそれ以上の異なるサブセットを
用いてステップａ)〜ｆ)を反復することを含む方法。
【請求項１５】ｒの制限エンドヌクレアーゼ酵素の相異なる各サブセット
を用いてステップａ〜ｆ)を反復することにより、(ｎ！)／［(ｎ−ｒ)！ｒ！］
の異なるアレイが得られる、請求項１３または請求項１４記載の方法。
【請求項１６】ｎの制限エンドヌクレアーゼ酵素が、４−カッターおよび
５−カッターおよび６−カッターから選択される、請求項１３〜１５のいずれか
１項記載の方法。
【請求項１７】ｎが３〜１０であり、ｒが２〜４である、請求項１３〜１
６のいずれか１項記載の方法。
【請求項１８】ｎ＝６およびｒ＝３である、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】興味の対象であるＤＮＡフラグメントのアレイのセットで
あり、請求項１３〜１８のいずれか１項記載の方法の遂行により生成されるセッ
ト。
【請求項２０】セットが請求項１３および請求項１４および請求項１５記
載の方法の遂行により生成される、請求項１９記載のアレイのセット。
【請求項２１】ＢａｍＨＩ、ＢｓｒＧＩ、ＨｉｎｄIII、Ｎｃｏｌ、Ｓｐ
ｅＩおよびＡｆIIIである、ｎ＝６の６カッター制限エンドヌクレアーゼ酵素の
セットから誘導される、請求項１９または請求項２０記載のアレイのセット。
【請求項２２】ＥｃｏＲＩ、ＢｓｐＨＩ、ＢｇIII、ＸｂａＩ、Ａｃｃ６
５ＩおよびＡｐａＬＩであるｎ＝６の６カッター制限エンドヌクレアーゼ酵素の
セットから誘導される、請求項１９または請求項２０記載のアレイのセット。
【請求項２３】ハイブリダイゼーション条件下、請求項１９〜２２のいず
れか１項記載のアレイのセットに興味の対象である核酸フラグメントを呈示し、
ハイブリダイゼーションのパターンを観察することを含む、核酸特性検定方法。
【請求項２４】興味の対象である複数の核酸フラグメントを、アレイのセ
ットに別々に呈示し、得られたハイブリダイゼーションパターンを比較する、請
求項２３記載の方法。
【請求項２５】興味の対象である複数の核酸フラグメントが、請求項１３
記載の、興味の対象である表現型に特有なフラグメントに富む、ＤＮＡフラグメ
ントの混合物から取り出される、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】興味の対象である表現型に特有なＤＮＡのフラグメントを
同定する方法であって、請求項１２記載のＤＮＡフラグメントの混合物から個々
のＤＮＡフラグメントを回収し、クローン化し、増幅し、ハイブリダイゼーショ
ン条件下、個々のＤＮＡフラグメントを請求項１９〜２２のいずれか１項記載の
アレイのセットに呈示し、個々の各ＤＮＡフラグメントにより生成されるハイブ
リダイゼーションパターンを観察し、そのハイブリダイゼーションパターンが、
興味の対象であるゲノムにおいて互いに類似または同一、または近いものである
２またはそれ以上の個々のＤＮＡフラグメントをさらなる探索にかけることを含
む方法。
【請求項２７】いずれか１種またはそれ以上でｎ以下の制限酵素手段によ
りＤＮＡ分子を切断することにより得られる各フラグメントが、その他全てのフ
ラグメントとは異なる長さを有することを特徴とする、配列ａ−Ａ−ｂ−Ｂ...
Ｘ−ｙ−Ｙ−ｚ(ただし、Ａ、Ｂ...ＸおよびＹは、ｎの異なる制限エンドヌクレ
アーゼ酵素について特有な制限部位であり、そしてａ、ｂ...ｙ、ｚは塩基対に
おける距離を示す)を有する２本鎖ＤＮＡ分子。
【請求項２８】下記の基準：ａ)フラグメント間長の差異が、大きいフラグメントの場合には大きい；ｂ)可能なフラグメントが全て互いに電気泳動により明白に分解可能である；ｃ)異なる数の制限部位間単位を含むバンド間のサイズギャップが、同数の制限
部位間単位を含むバンド間のサイズギャップよりも大きい；ｄ)サイズギャップおよび最大フラグメントから最小フラグメントまでのサイズ
間隔が、電気泳動的に共存し得るが満たされている、請求項２７記載の２本鎖ＤＮＡ分子。