CN112359116A

CN112359116A - 一种检测dna跨损伤合成修复通路关键突变基因的试剂盒

Info

Publication number: CN112359116A
Application number: CN202011404867.5A
Authority: CN
Inventors: 刘松柏; 位伟
Original assignee: Suzhou Vocational Health College
Current assignee: Suzhou Vocational Health College
Priority date: 2019-12-06
Filing date: 2020-12-04
Publication date: 2021-02-12
Also published as: CN110878357A

Abstract

本发明提供了一种检测DNA跨损伤合成修复通路关键突变基因的试剂盒，所述探针库由SEQ ID NO.1～175所示探针组成，将该探针库制备成检测试剂盒可用于与DNA跨损伤合成修复通路相关的基因的检测。使用该探针库对待分析的目标DNA片段进行富集，然后再对富集后的DNA片段通过测序手段进行测序，从而实现对基因检测的有效性。DNA跨损伤合成修复通路关键突变基因可用于预测肿瘤发生的倾向性、评估肿瘤恶性程度和临床预后、指导新药筛选与研发，因此，本发明对基因功能性的研究方向起到重要的指导意义。

Description

一种检测DNA跨损伤合成修复通路关键突变基因的试剂盒

技术领域

本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种检测DNA跨损伤合成修复通路关键突变基因的试剂盒。

背景技术

异常的DNA损伤修复通路与肿瘤发生倾向性及诱导DNA损伤类抗肿瘤药物对细胞的敏感性关系密切。DNA跨损伤合成修复通路是DNA修复机制中最重要的途径之一。修复过程简单来说，当DNA在复制过程中遇到损伤而停滞时，DNA聚合酶与解旋酶分离并在损伤处产生DNA单链，RPA将DNA单链封闭起来。接着，泛素化连接酶Rad6及Rad18对PCNA进行单泛素化修饰，低保真的DNA聚合酶（无校对功能）将高保真聚合酶替换掉，并在损伤DNA链互补链进行核苷酸***，继续进行DNA复制延伸。DNA跨损伤合成修复通路在***核苷酸时不依赖碱基互补配对原则，因此修复途径具有较高的差错可能和致突变倾向。严格来说，DNA跨损伤合成修复通路是一种DNA损伤的容忍机制，而非典型的DNA修复机制。

合成致死（Synthetic Lethality）的策略近年来在肿瘤的研究中得到广泛应用。合成致死在肿瘤研究中的概念为：当将两个不在同一修复通路中的重要基因的功能抑制掉其中之一时，细胞不会致死，但是将这两个基因的功能都抑制掉后，细胞死亡。在临床上，如果肿瘤细胞中存在其中之一的突变，而正常细胞中该基因正常，我们可以将另外一个基因作为靶点，并将其功能抑制住，达到特异性杀死肿瘤细胞，个体化治疗的目的。

前期研究发现，DNA跨损伤合成修复通路参与的基因发生胚系遗传突变、特异组织中体细胞突变与肿瘤的发生、治疗效果高度相关。其中，POLH基因的多态性变异与多种肿瘤的发生高度相关；另外，通路参与基因的突变与肿瘤化疗的敏感性高度相关。这些基因的突变导致DNA跨损伤合成修复通路有效性的改变（减弱或缺失），对肿瘤的发生、预后、治疗策略的制定都具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测DNA跨损伤合成修复通路关键突变基因的试剂盒。

为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：

一种检测DNA跨损伤合成修复通路关键突变基因的试剂盒，所述的试剂盒包括针对DNA跨损伤合成修复通路关键突变基因的如SEQ ID NO.1～175所示探针组成的探针库。

进一步的，DNA跨损伤合成修复通路关键突变基因包括USP1、POLH、PCNA。

进一步的，所述基因USP1对应的探针序列如SEQ ID NO. 1～72所示，所述基因POLH对应的探针序列如SEQ ID NO.73～146所示，所述基因PCNA对应的探针序列如SEQ IDNO.147～175所示。

一种检测DNA跨损伤合成修复通路关键突变基因的方法，包括以下步骤：

（1）获得受试者的DNA样本库；

（2）将权利要求1所述的试剂盒中SEQ ID NO.1～175所示的全部探针与所述DNA样本库进行杂交；

（3）分离步骤（2）的杂交产物，并释放出与试剂盒中探针杂交的基因片段，采用测序技术对分离出的基因片段进行测序从而检测基因的突变情况。

进一步的，所述步骤（1）中的DNA样本库由双链DNA片段组成；

所述步骤（1）包括以下步骤：提取全基因组DNA，然后将其片段化；或者提取mRNA，将其片段化，然后以该经片段化的mRNA为模板合成双链cDNA。

进一步的，所述步骤（2）中的探针进行选择性标记。

进一步的，所述步骤（2）中的探针进行生物素标记。

有益效果：本发明开发了一种检测DNA跨损伤合成修复通路关键突变基因的试剂盒，其对DNA跨损伤合成修复通路关键突变基因的变异情况进行整体检测分析，其主要具有以下几方面的意义：

1. 通过对DNA跨损伤合成修复通路关键突变基因的变异情况分析，评估人体组织或细胞中DNA跨损伤合成修复通路的有效性（减弱或缺失），预测肿瘤疾病发生的倾向性，并指导患者采取相应的预防措施。

2. 通过对DNA跨损伤合成修复通路关键突变基因的变异情况分析，评估肿瘤患者细胞中DNA跨损伤合成修复通路的有效性（减弱或缺失），对肿瘤恶性程度、临床预后的评估具有重要的指导意义。

3. 通过对DNA跨损伤合成修复通路关键突变基因的变异情况分析，评估肿瘤患者细胞中DNA跨损伤合成修复通路的有效性（减弱或缺失），对放射、化疗药物选择及治疗策略的制定（如，合成致死方案等）具有重要指导意义。

4. 通过对DNA跨损伤合成修复通路关键突变基因的变异情况分析，评估肿瘤患者细胞中DNA跨损伤合成修复通路的有效性（减弱或缺失），对新的治疗靶点选择、靶向药物研发等具有重要指导意义。

附图说明

图1 为本发明所述检测方法的流程图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本发明提供了一种检测DNA跨损伤合成修复通路关键突变基因的方法，主要包括以下步骤：

（1）获得受试者的DNA样本库；提取全基因组DNA，然后将其片段化；或者提取mRNA，将其片段化，然后以该经片段化的mRNA为模板合成双链cDNA；

（2）针对要检测的基因片段设计与该基因杂交的DNA探针，从中筛选出多个探针作为DNA探针库；

（3）将DNA探针库与DNA样本库进行杂交，从DNA样本库中富集得到待检测基因的DNA片段；

（4）分离步骤（3）的杂交产物，并释放出与试剂盒中探针杂交的基因片段，采用测序技术对分离出的基因片段进行测序从而检测基因的突变情况。

在实施过程中，可以先将DNA探针库中的各个探针进行生物素标记，然后在杂交后用标记有链霉亲和素的磁珠吸附杂交产物，从磁珠上释放出富集的待检测基因片段，再对基因片段进行测序分析。

具体实验过程如下：

一、准备cDNA/DNA样本库

1. 制备DNA样本库

1.1 DNA提取

采用德国QIAGEN公司DNA提取试剂盒提取人的基因组DNA，对提取的DNA使用分光光度定量仪以及凝胶电泳***检测DNA模板质量和浓度。DNA模板260nm吸光率大于0.05以上，吸光率A260/A280比值在1 .8到2之间为合格。

1.2 DNA片段化

将10μg合格的基因组DNA用TE缓冲液稀释至100μL。使用组织匀浆机将DNA片段化，片段长度为150～200碱基。

采用碧云天公司纯化试剂盒对DNA进行纯化。

1.3 DNA样本库质量检测

用生物分析仪进行DNA定性定量分析，确认DNA片段长度峰值合理。

2. 制备cDNA样本库

2.1 mRNA提取

采用天根生物公司mRNA提取试剂盒提取人的mRNA，对提取的mRNA使用分光光度定量仪以及凝胶电泳***检测mRNA质量和浓度。吸光率A260/A280比值在1 .8到2之间为合格。

2.2 mRNA片段化

采用碧云天公司试剂盒对mRNA进行片段化；再用天根生物公司试剂盒对mRNA进行过柱纯化。

2.3 用美国Thermo Scientific公司试剂cDNA合成试剂盒合成mRNA的第一链以及第二链cDNA

再用碧云天公司试剂盒对cDNA过柱纯化。3. cDNA/DNA末端修复

利用Klenow片段、T4 DNA聚合酶和T4多核苷酸激酶对DNA片段进行末端修复，由于Klenow片段具有5’-3’聚合酶活性和3’-5’聚合酶活性，但缺少5’-3’外切酶活性。由此，能够方便准确地对DNA片段进行末端修复。将修复后的DNA片段进行过柱纯化。

利用T4聚合酶及Klenow大肠杆菌聚合酶片断，对于cDNA/DNA 5 '突出粘末端补平以及3 ‘突出粘末端打平，产生平末端，用于后续的平端连接。反应在PCR扩增仪中进行，20℃，30min。

表1

4. 在cDNA/DNA样本3'末端加上碱基A

采用具有3’-5’外切酶活性的Klenow，在经末端修复的DNA片段的3’末端添加碱基A，以便获得具有粘性末端A的DNA片段，反应在PCR扩增仪中进行，37℃，30min。将处理后的DNA片段进行过柱纯化。

表2

5. 在cDNA/DNA两端加上接头

表3

6. 分离出合适长度的cDNA片段

使用电泳凝胶对DNA片段进行分离，对照DNA分子量，在凝胶上剪切出150-250碱基的cDNA片段。

采用碧云天公司试剂盒将含有cDNA样本库的凝胶样本过柱纯化。

7. cDNA片段样本库质量检测

使用生物分析仪，进行cDNA定性定量分析，并确认分离出的cDNA片断长度峰值合理。

PCR条件：置于PCR扩增仪中，95℃预变性10秒，95℃变性30秒，65℃退火30秒，72℃延伸1min，共循环20次（cDNA样本库）或者5-8次（DNA样本库），最后在72℃延伸5分钟。

采用商品化试剂盒对PCR扩增产物过柱纯化。

8. 扩增DNA模板

采用PCR扩增仪对处理后的DNA样本进行聚合酶链反应增加DNA的含量，以满足与探针进行杂交的需求。

表4

采用碧云天公司试剂盒对PCR扩增产物过柱纯化。

9. 扩增后cDNA/DNA样本库质量检测

使用生物分析仪，进行cDNA/DNA定性定量分析，并确认纯化后片段长度峰值合理，约200bp。

二、探针的设计原则

根据人类参考基因组HG19，结合Ensembl、CCDS、Gencode、 VEGA、SNP以及CytoBand数据库，获取本发明所述的与DNA碱基切除修复通路相关的基因及其所有编码序列。

探针的设计主要有以下几个考虑因素：

（1）特异性

严格的特异性参数可以有效的降低非目标区域上的探针结合，但也限制了部分外显子上有较低程度重复性的区域，导致探针设计的覆盖率降低。过于宽松的特异性参数会直接降低目标区域上的数据量，导致捕获效率降低，测序成本上升。因此，一个合理的特异性参数是平衡覆盖率和捕获效率的关键。我们认为一条探针在基因组上的相似性序列不超过3是最佳的特异性参数阈值。

（2）结合稳定性

探针与模板结合能力的指标是最小自由能（ΔG）和解链温度（Tm），由于这两个参数计算起来稍显复杂，一般用更为直接和简便的GC含量来间接表示探针与模板的结合能力。一般来说，GC含量越大，结合稳定性越高。实际上，GC含量越接近50%的探针，其捕获效果越好。GC含量越高，虽然探针与目标DNA片段的结合能力很好，但是与目标DNA片段结合能力最好的是其原始的互补片段（一方面长度一致，另一方面是无突变错配），因此，探针需要更高的浓度来促使其在与DNA互补片段结合的竞争中取得一定优势。

我们会优先设计GC含量接近50% 的探针，对于无法避免的GC极端情况下的探针设计，我们会在探针上增加修饰碱基从而改变GC极端情况。

（3）探针浓度

由上面的结合稳定性可知，不同结合能力的探针，其捕获效果有较大的差异。结合能力太高和太低都不利于捕获，因此，为了达到捕获效率最大程度的均一，需要对于不同GC含量的探针设定不同的浓度。通过对历史捕获数据的归纳总结，我们对不同GC含量的探针设定了不同的探针浓度参数，设定GC含量在40-60%的探针浓度基数为1，那么GC含量在30-40%和60-70%的探针，其浓度基数为1 x 22，GC含量在20-30%和70-80%的探针，其浓度基数为1 x24。

（4）探针位置

1、最佳的探针摆放位置是和目标区域100%重合，但是由于随机打断的文库、序列重复性、GC含量、突变类型等的影响，实际的探针设计策略如下：

2、由于文库一般是通过随机打断的方式产生的，为了最大限度的捕获目标文库，一般会采取tiling的方式来设计探针；

3、如果目标区域上有重复序列区域，那么设计时会在保证目标区域覆盖的情况下，向两侧延伸搜索特异性更好的区域设计探针；

4、如果目标区域上是极端GC区域，那么设计时会在保证目标区域覆盖的情况下，向两侧延伸搜索GC含量更合适的区域设计探针；

对于不同的突变类型，也需要有不同的设计思路：

1、对于超过60bp的***或者缺失，除了需要覆盖其上的探针之外，还需要在突变断点两侧设计探针，越接近断点越好；

2、对于超过10k bp的CNV区域，最佳的探针设计策略是间隔放置稀疏探针，这样做一方面可检测CNV，另外一方可以降低测序成本；

3、对于融合发生的内含子区域，如果融合位点不确定，那么需要整个内含子全部覆盖；如果融合位点确定，那么需要在融合位点两侧设计探针。

4、对于MSI，STR等短串重复区域，除了覆盖其上的探针之外，还需要在其两侧延伸60bp设计探针。

三、DNA捕获探针杂交

1. 将DNA样本库与生物素化的DNA探针库杂交

将cDNA/DNA样本库与杂交缓冲液混合，反应条件为95℃ 5分钟，之后保持在65℃。反应在PCR扩增仪中进行。

然后将该混合物与探针库混合，反应条件为65℃ 5分钟。将杂交反应置于PCR扩增仪中，65℃孵育24小时。

四、得到经杂交的基因片段

1. 准备链霉亲和素磁珠

使用Dynabeads链霉亲和素磁珠进行杂交产物的分离。将磁珠置于混匀仪上混匀，每个样本需要50μL磁珠。

磁珠洗涤：将混合50μL磁珠和200μL结合缓冲液在混匀仪上混匀，通过外界磁场将磁珠与缓冲液分离纯化，弃掉缓冲液，重复三次。

2. 分离杂交产物

将杂交产物与链霉亲和素磁珠进行充分混合，在室温下振摇30分钟。通过外界磁场将磁珠分离纯化。

向磁珠中加入500μL洗涤缓冲液，在65℃孵育10分钟，通过外界磁场将磁珠分离纯化。以上步骤重复三次。

3. cDNA/DNA富集样本释放

将磁珠与50μL洗脱缓冲液混合，室温孵化10分钟，通过外界磁场将磁珠分离弃掉，收集上清液，上清液即为富集的与DNA碱基切除修复通路相关的基因片段。

五、PCR扩增与纯化

将富集的基因片段进行进一步扩增，为测序仪器上样做准备。

表5

采用碧云天公司试剂盒对PCR扩增产物过柱纯化。

六、采用下一代测序技术检测基因的突变

使用Illumina X10测序仪器平台进行测序，测序结果用已有的测序软件分析包进行分析。

实施例1 检测USP1、POLH、PCNA基因的突变

一、构建样本库

1. DNA的提取

按照常规的组织样本的DNA提取方法采用德国QIAGEN公司试剂盒提取样本DNA。

2. DNA片段化

使用DNA破碎仪将DNA样本片段化，使片段长度为150-200bp。

3. DNA样本库质量检测

4. DNA末端修补

利用T4聚合酶及Klenow大肠杆菌聚合酶片断，对于DNA 5 '突出粘末端补平以及3 '突出粘末端打平，产生平末端，用于后续的平端连接。反应体系见表1所示，反应在PCR扩增仪中进行，20℃，30min。

5. 在DNA样本3 '末端加上碱基A

反应在PCR扩增仪中进行，37℃，30分钟，反应体系见表2所示。

6. 在DNA两端加上接头

反应体系见表3所示。

7. 扩增获得的DNA片段样本库

聚合酶链反应（PCR），在PCR扩增仪中进行，反应体系见表4所示。

8. 扩增后DNA样本库的质量检测

使用生物分析仪，进行DNA定性定量分析，并确认纯化后片段长度峰值合理，约200bp。

若得到的DNA样本库的浓度较低，须将样品经过真空浓缩机低温干燥（低于45℃），再用无核酸酶水溶解至所需浓度。

二、制备USP1、POLH、PCNA基因的DNA探针库

根据上述的探针设计方法和思路，设计并合成探针进行试验，在5’端有生物素（Biotin）。

三、将DNA样本库与生物素化的DNA探针库杂交

将DNA样本库与杂交缓冲液（10mM Tris-HCl , 2%牛血清白蛋白, pH8.0）混合（混合后，DNA样本库浓度至多不超过50ng/μL），反应条件为95℃ 5分钟，之后保持在65℃。反应在PCR扩增仪中进行。

然后以DNA样本库：探针库为1:100的摩尔比，将探针库加入上述混合物，反应条件为65℃ 5分钟。将杂交反应置于PCR扩增仪中，65℃孵育24小时。

四、得到经杂交富集的USP1、POLH、PCNA基因片段

1. 准备链霉亲和素磁珠

使用Dynabeads链霉亲和素磁珠置于混匀仪上混匀，混合50μL磁珠和200μL结合缓冲液（10mM Tris-HCl，2%牛血清白蛋白，pH8.0），在混匀仪上混匀，使用外界磁场将磁珠与缓冲液分离纯化，弃掉缓冲液，重复三次，每次加入200μL结合缓冲液。

2. 分离杂交产物

将步骤三中的杂交反应混合物与步骤四的处理后的链霉亲和素磁珠进行混合，在室温下振摇30分钟。使用外界磁场将磁珠与缓冲液分离纯化，然后向磁珠中加入500微升洗涤缓冲液（磷酸缓冲液，0.1% Tween-20，0.1% SDS，pH7.4），在65℃孵育10分钟，每隔5分钟混匀一次。使用外界磁场将磁珠与缓冲液分离纯化，以上步骤重复三次。

3. 释放富集的DNA样本

将磁珠与50微升洗脱缓冲液（10mM氢氧化钠溶液）混合，室温孵化10分钟，每隔5分钟混匀一次。使用外界磁场将磁珠与缓冲液分离纯化，保留上清液，弃掉磁珠，上清液中即含有富集过的USP1、POLH、PCNA基因片段DNA样本库。

五、PCR扩增与纯化

将富集DNA样本库进一步扩增，为测序仪器上样做准备，反应体系见表5所示。

六、检测灵敏度及特异性的验证

针对通路中与疾病相关、具有典型代表性的突变位点USP1（c.1985del A）、POLH（c.788G>T）、PCNA（c.683G>T），分别构建了突变型和野生型的质粒，按照突变型在野生型中拷贝数比例混合而不同丰度的样品，同时加入同等质量的293T细胞提取的人源基因组DNA样品，混合均匀。采用上述的探针库进行捕获、测序考察灵敏性及特异性，每个样本重复测试 3次，结果如下：

表6

从表中可以看出，本发明提供的检测探针库和检测方法能够对低丰度的样本也具有较好的检测灵敏度和特异性，基本能够将0.5%的突变情况准确检测出来。

采用优化后的探针库对3例肺癌患者肿瘤样本进行4个通路关键基因的检测，检测结果如表7所示。选取部分在东亚人群中在1000g2015aug_eas数据库、ExAC_EAS数据库及gnomAD_exome_EAS数据库中频率均小于0.01，造成氨基酸改变，且在SIFT、Polyphen、CADD等有害性预测软件至少一款预测软件预测为有害突变的基因突变结果进行展示。

注：

1000g2015aug_eas：千人基因组计划数据库2015年8月版中该突变的等位基因频率，仅包含东亚的人群。

ExAC_EAS：Exome Aggregation Consortium数据库，包括60000多个无亲缘关系个体的数据，仅包含东亚人群。

gnomAD_exome_EAS：Genome Aggregation Database数据库，是由各国研究者联合发展起来的基因组突变数据库，其中数据集包括123136个全外显子数据和15496个全基因组数据，来源于各种疾病研究项目和大型人群测序项目。本数据库包含东亚人群的全外显子数据。

表7

。

序列表

<110> 苏州卫生职业技术学院

<120> 一种检测DNA跨损伤合成修复通路关键突变基因的试剂盒

<141> 2020-12-04

<150> 2019112410758

<151> 2019-12-06

<160> 175

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 1

gatttgaaga aaaaaatgcc tggtgtcata cctagtgaaa gtaatggact ttcaagaggt 60

agcccttcaa agaaaaacag actttcctta aagttttttc 100

<210> 2

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 2

agtgaaagta atggactttc aagaggtagc ccttcaaaga aaaacagact ttccttaaag 60

ttttttcaga aaaaggaaac taagagagct ttggatttca 100

<210> 3

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 3

tcaaagaaaa acagactttc cttaaagttt tttcagaaaa aggaaactaa gagagctttg 60

gatttcacag attctcaaga aaatgaagaa aaagcttctg 100

<210> 4

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 4

cagaaaaagg aaactaagag agctttggat ttcacagatt ctcaagaaaa tgaagaaaaa 60

gcttctgaat atagagcatc tgaaatgtat gtatcttaca 100

<210> 5

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 5

acagattctc aagaaaatga agaaaaagct tctgaatata gagcatctga aatgtatgta 60

tcttacattt ctgtacttta aaaattctac agtaaagcag 100

<210> 6

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 6

tttcaccttg tttctttaag ataactactt atcgttctcc cttctatatt tcatagtgat 60

caagttgttc ctgcagcaca gtcttcacct ataaactgtg 100

<210> 7

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 7

gttctccctt ctatatttca tagtgatcaa gttgttcctg cagcacagtc ttcacctata 60

aactgtgaga agagagaaaa cttgttacca tttgtgggac 100

<210> 8

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 8

gttcctgcag cacagtcttc acctataaac tgtgagaaga gagaaaactt gttaccattt 60

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<210> 9

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 9

gagaagagag aaaacttgtt accatttgtg ggactgaata atctcggcaa tacttgctat 60

cttaatagta tacttcaggt aaattgacaa ttttgctata 100

<210> 10

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 10

ctgaataatc tcggcaatac ttgctatctt aatagtatac ttcaggtaaa ttgacaattt 60

tgctatatca taaagcttta gtaggcaaag attgatgtag 100

<210> 11

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 11

agtatacttc aggtaaattg acaattttgc tatatcataa agctttagta ggcaaagatt 60

gatgtagcat ttaatgtttt tgagttattg gaggacttta 100

<210> 12

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 12

tgtattgttt gttcagtaaa cacttaagac aatctcactt tttataggta ttatattttt 60

gtcccggttt taaatctgga gtaaagcact tatttaatat 100

<210> 13

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 13

tgttcagtaa acacttaaga caatctcact ttttataggt attatatttt tgtcccggtt 60

ttaaatctgg agtaaagcac ttatttaata ttatttcaag 100

<210> 14

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 14

agtaaacact taagacaatc tcacttttta taggtattat atttttgtcc cggttttaaa 60

tctggagtaa agcacttatt taatattatt tcaaggaaga 100

<210> 15

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 15

ataaagaaca gaaaataatg taaaaagcaa aagtaaatta atggaaattt acttgcctgg 60

aaatgaagag gactgggggg gtggatgaca aagattattt 100

<210> 16

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 16

tgtgtttctt tcttgacagg gaaattgcaa agaagattct ttggcaagtt atgaattgat 60

atgcagttta cagtccttaa tcatttcggt tgaacagctc 100

<210> 17

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 17

agattctttg gcaagttatg aattgatatg cagtttacag tccttaatca tttcggttga 60

acagctccag gctagttttc tcttaaatcc agagaaatat 100

<210> 18

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 18

tttacagtcc ttaatcattt cggttgaaca gctccaggct agttttctct taaatccaga 60

gaaatatact gatgaacttg ccactcagcc aaggcgactg 100

<210> 19

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 19

ccaggctagt tttctcttaa atccagagaa atatactgat gaacttgcca ctcagccaag 60

gcgactgctt aacacactga ggtatagcct ataatataat 100

<210> 20

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 20

tactgatgaa cttgccactc agccaaggcg actgcttaac acactgaggt atagcctata 60

atataatttt agggtttcaa tttagctact tgtttatatc 100

<210> 21

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 21

atggaaattt ttatttatag ggaactcaac cctatgtatg aaggatatct acagcatgat 60

gcacaggaag tattacaatg tattttggga aacattcaag 100

<210> 22

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 22

ctcaacccta tgtatgaagg atatctacag catgatgcac aggaagtatt acaatgtatt 60

ttgggaaaca ttcaagaaac atgccaactc ctaaaaaaag 100

<210> 23

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 23

ccctatgtat gaaggatatc tacagcatga tgcacaggaa gtattacaat gtattttggg 60

aaacattcaa gaaacatgcc aactcctaaa aaaagaagaa 100

<210> 24

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 24

aaaaaagaag aagtaaaaaa tgtggcagaa ttacctacta aggtagaaga aatacctcat 60

ccgaaagagg aaatgaatgg tattaacagc atagagatgg 100

<210> 25

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 25

aaaaatgtgg cagaattacc tactaaggta gaagaaatac ctcatccgaa agaggaaatg 60

aatggtatta acagcataga gatggacagt atgaggcatt 100

<210> 26

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 26

gaaatacctc atccgaaaga ggaaatgaat ggtattaaca gcatagagat ggacagtatg 60

aggcattctg aagactttaa agagaaactc ccaaaaggaa 100

<210> 27

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 27

attaacagca tagagatgga cagtatgagg cattctgaag actttaaaga gaaactccca 60

aaaggaaatg ggaaaagaaa aagtgacact gaatttggta 100

<210> 28

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 28

tgaggcattc tgaagacttt aaagagaaac tcccaaaagg aaatgggaaa agaaaaagtg 60

acactgaatt tggtaacatg aagaaaaaag ttaaattatc 100

<210> 29

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 29

aatgggaaaa gaaaaagtga cactgaattt ggtaacatga agaaaaaagt taaattatcc 60

aaggaacacc agtcattgga agagaaccag agacaaacta 100

<210> 30

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 30

agaaaaaagt taaattatcc aaggaacacc agtcattgga agagaaccag agacaaacta 60

gatcaaaaag aaaagctaca agtgatacat tagagagtcc 100

<210> 31

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 31

caccagtcat tggaagagaa ccagagacaa actagatcaa aaagaaaagc tacaagtgat 60

acattagaga gtcctcctaa aataattccc aagtatattt 100

<210> 32

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 32

agatcaaaaa gaaaagctac aagtgataca ttagagagtc ctcctaaaat aattcccaag 60

tatatttctg aaaatgagag tccaagaccc tcacaaaaga 100

<210> 33

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 33

gagagtcctc ctaaaataat tcccaagtat atttctgaaa atgagagtcc aagaccctca 60

caaaagaaat caagagttaa aataaattgg ttaaagtctg 100

<210> 34

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 34

tctgaaaatg agagtccaag accctcacaa aagaaatcaa gagttaaaat aaattggtta 60

aagtctgcaa ctaagcaacc cagcattctt tctaaatttt 100

<210> 35

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 35

aaatcaagag ttaaaataaa ttggttaaag tctgcaacta agcaacccag cattctttct 60

aaattttgta gtctgggaaa aataacaaca aaccaaggag 100

<210> 36

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 36

gcaactaagc aacccagcat tctttctaaa ttttgtagtc tgggaaaaat aacaacaaac 60

caaggagtca aaggacaatc taaagaaaat gaatgtgatc 100

<210> 37

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 37

tgtagtctgg gaaaaataac aacaaaccaa ggagtcaaag gacaatctaa agaaaatgaa 60

tgtgatcctg aagaggactt ggggaagtgt gaaagtgata 100

<210> 38

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 38

gtcaaaggac aatctaaaga aaatgaatgt gatcctgaag aggacttggg gaagtgtgaa 60

agtgataaca caactaatgg ttgtggactt gaatctccag 100

<210> 39

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 39

cctgaagagg acttggggaa gtgtgaaagt gataacacaa ctaatggttg tggacttgaa 60

tctccaggaa atactgttac acctgtaaat gttaatgaag 100

<210> 40

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 40

aacacaacta atggttgtgg acttgaatct ccaggaaata ctgttacacc tgtaaatgtt 60

aatgaagtta aacccataaa caaaggttag tataattctt 100

<210> 41

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 41

ggaaatactg ttacacctgt aaatgttaat gaagttaaac ccataaacaa aggttagtat 60

aattcttaga ctttgatagg tagaagcatt agcagctaca 100

<210> 42

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 42

tattttcatt ttaggtgaag aacaaattgg ttttgagcta gtggagaaat tatttcaagg 60

tcagctggta ttaaggacgc gttgcttgga atgtgaaagt 100

<210> 43

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 43

tgagctagtg gagaaattat ttcaaggtca gctggtatta aggacgcgtt gcttggaatg 60

tgaaagttta acagaaagaa gagaagattt tcaagacatc 100

<210> 44

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 44

ggtattaagg acgcgttgct tggaatgtga aagtttaaca gaaagaagag aagattttca 60

agacatcagt gtgccagtac aagaagatga gctttccaaa 100

<210> 45

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 45

tttaacagaa agaagagaag attttcaaga catcagtgtg ccagtacaag aagatgagct 60

ttccaaagta gaggagagtt ctgaaagtaa gcaaaattgg 100

<210> 46

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 46

gattctcttt tttagtttct ccagagccaa aaacagaaat gaagaccctg agatgggcaa 60

tttcacaatt tgcttcagta gaaaggattg taggagaaga 100

<210> 47

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 47

agccaaaaac agaaatgaag accctgagat gggcaatttc acaatttgct tcagtagaaa 60

ggattgtagg agaagataaa tatttctgtg aaaactgcca 100

<210> 48

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 48

atttctgtga aaactgccat cattatactg aagctgaacg aagtcttttg tttgacaaaa 60

tgcctgaagt tataactatt catttgaagt gctttgctgc 100

<210> 49

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 49

tgtgaaaact gccatcatta tactgaagct gaacgaagtc ttttgtttga caaaatgcct 60

gaagttataa ctattcattt gaagtgcttt gctgctagtg 100

<210> 50

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 50

ctgaagctga acgaagtctt ttgtttgaca aaatgcctga agttataact attcatttga 60

agtgctttgc tgctagtggt ttggagtaag tattgtaaat 100

<210> 51

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 51

tttttcctcc caaaggtttg attgttatgg tggtggactt tccaagatca acactccttt 60

attgacacct cttaaattgt cactagaaga atggagcaca 100

<210> 52

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 52

tggactttcc aagatcaaca ctcctttatt gacacctctt aaattgtcac tagaagaatg 60

gagcacaaag ccaactaacg acagctatgg attatttgcg 100

<210> 53

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 53

acctcttaaa ttgtcactag aagaatggag cacaaagcca actaacgaca gctatggatt 60

atttgcggtt gtgatgcata gtggcattac aattagtagt 100

<210> 54

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 54

aaagccaact aacgacagct atggattatt tgcggttgtg atgcatagtg gcattacaat 60

tagtagtggg cattacactg cttctgttaa agtcactgac 100

<210> 55

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 55

ggttgtgatg catagtggca ttacaattag tagtgggcat tacactgctt ctgttaaagt 60

cactgacctt aacagtttag aactagataa aggaaatttt 100

<210> 56

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 56

tgggcattac actgcttctg ttaaagtcac tgaccttaac agtttagaac tagataaagg 60

aaattttgtg gttgaccaaa tgtgtgaaat aggtaagcca 100

<210> 57

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 57

ccttaacagt ttagaactag ataaaggaaa ttttgtggtt gaccaaatgt gtgaaatagg 60

taagccagaa ccattgaatg aggaggaagc aaggggtgtg 100

<210> 58

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 58

tgtggttgac caaatgtgtg aaataggtaa gccagaacca ttgaatgagg aggaagcaag 60

gggtgtggtt gagaattata atgatgaaga agtgtcaatt 100

<210> 59

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 59

agaaccattg aatgaggagg aagcaagggg tgtggttgag aattataatg atgaagaagt 60

gtcaattaga gttggtggaa atacacagcc aagtaaagtt 100

<210> 60

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 60

ggttgagaat tataatgatg aagaagtgtc aattagagtt ggtggaaata cacagccaag 60

taaagttttg aacaaaaaaa atgtagaagc tattggactt 100

<210> 61

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 61

tagagttggt ggaaatacac agccaagtaa agttttgaac aaaaaaaatg tagaagctat 60

tggacttctt ggaggacaaa agagcaaagc agattatgag 100

<210> 62

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 62

tttgaacaaa aaaaatgtag aagctattgg acttcttgga ggacaaaaga gcaaagcaga 60

ttatgagcta tacaacaaag cctctaatcc tgataaggtt 100

<210> 63

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 63

tcttggagga caaaagagca aagcagatta tgagctatac aacaaagcct ctaatcctga 60

taaggttgct agtacagcgt ttgctgaaaa tagaaattct 100

<210> 64

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 64

gctatacaac aaagcctcta atcctgataa ggttgctagt acagcgtttg ctgaaaatag 60

aaattctgag actagtgata ctactgggac ccatgaatct 100

<210> 65

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 65

tgctagtaca gcgtttgctg aaaatagaaa ttctgagact agtgatacta ctgggaccca 60

tgaatctgat agaaacaagg aatccagtga ccaaacaggc 100

<210> 66

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 66

tgagactagt gatactactg ggacccatga atctgataga aacaaggaat ccagtgacca 60

aacaggcatt aatattagtg gatttgagaa caaaatttca 100

<210> 67

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 67

tgatagaaac aaggaatcca gtgaccaaac aggcattaat attagtggat ttgagaacaa 60

aatttcatac gtagtgcaaa gcttaaagga gtatgagggg 100

<210> 68

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 68

cattaatatt agtggatttg agaacaaaat ttcatacgta gtgcaaagct taaaggagta 60

tgaggggaag tggttgcttt ttgatgattc tgaagtcaaa 100

<210> 69

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 69

atacgtagtg caaagcttaa aggagtatga ggggaagtgg ttgctttttg atgattctga 60

agtcaaagtt actgaagaga aggactttct gaattctctt 100

<210> 70

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 70

gaagtggttg ctttttgatg attctgaagt caaagttact gaagagaagg actttctgaa 60

ttctctttcc ccttctacat ctcctacttc tactccttac 100

<210> 71

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 71

agttactgaa gagaaggact ttctgaattc tctttcccct tctacatctc ctacttctac 60

tccttacttg ctattttata agaaattata gagtgagtgt 100

<210> 72

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 72

ttccccttct acatctccta cttctactcc ttacttgcta ttttataaga aattatagag 60

tgagtgtatt ttccttgtgt atatattaaa cacacccata 100

<210> 73

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 73

ggattaggtg tttttctaac tgtccataaa atgttgtgtt acagaaaaat ggctactgga 60

caggatcgag tggttgctct cgtggacatg gactgttttt 100

<210> 74

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 74

ttgtgttaca gaaaaatggc tactggacag gatcgagtgg ttgctctcgt ggacatggac 60

tgtttttttg ttcaagtgga gcagcggcaa aatcctcatt 100

<210> 75

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 75

cgagtggttg ctctcgtgga catggactgt ttttttgttc aagtggagca gcggcaaaat 60

cctcatttga ggaataaacc ttgtgcagtt gtacagtaca 100

<210> 76

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 76

tttgttcaag tggagcagcg gcaaaatcct catttgagga ataaaccttg tgcagttgta 60

cagtacaaat catggaaggg tggtgggtat gtatcattgt 100

<210> 77

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 77

ttgaggaata aaccttgtgc agttgtacag tacaaatcat ggaagggtgg tgggtatgta 60

tcattgttat tgtcacaact attcaatggt aacacagtgg 100

<210> 78

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 78

aaatcatgga agggtggtgg gtatgtatca ttgttattgt cacaactatt caatggtaac 60

acagtggcac tgtggcaggt cctttgttgt tgtggtggtg 100

<210> 79

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 79

cttgtgatca tataatatgt tttctgtttc cttttttttc taaccttaga ataattgcag 60

tgagttatga agctcgtgca tttggagtca ctagaagtat 100

<210> 80

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 80

ttttttctaa ccttagaata attgcagtga gttatgaagc tcgtgcattt ggagtcacta 60

gaagtatgtg ggcagatgat gctaagaagt tatgtccaga 100

<210> 81

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 81

atgaagctcg tgcatttgga gtcactagaa gtatgtgggc agatgatgct aagaagttat 60

gtccagatct tctactggca caagttcgtg agtcccgtgg 100

<210> 82

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 82

tgtgggcaga tgatgctaag aagttatgtc cagatcttct actggcacaa gttcgtgagt 60

cccgtgggaa agctaacctc accaagtaag aaaaaaacat 100

<210> 83

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 83

atcttctact ggcacaagtt cgtgagtccc gtgggaaagc taacctcacc aagtaagaaa 60

aaaacattat ttaaggagac ataaaggagt cgaaaataat 100

<210> 84

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 84

ggaaagctaa cctcaccaag taagaaaaaa acattattta aggagacata aaggagtcga 60

aaataatact ccatgaggct aggaactggt gttttgaatt 100

<210> 85

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 85

atgaatgatc cttatacttc ttaggtaccg ggaagccagt gttgaagtga tggagataat 60

gtctcgtttt gctgtgattg aacgtgccag cattgatgag 100

<210> 86

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 86

agccagtgtt gaagtgatgg agataatgtc tcgttttgct gtgattgaac gtgccagcat 60

tgatgaggct tacgtagatc tgaccagtgc tgtacaagag 100

<210> 87

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 87

ttttgctgtg attgaacgtg ccagcattga tgaggcttac gtagatctga ccagtgctgt 60

acaagagaga ctacaaaagc tacaaggtca gcctatctcg 100

<210> 88

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 88

ggcttacgta gatctgacca gtgctgtaca agagagacta caaaagctac aaggtcagcc 60

tatctcggca gacttgttgc caagcactta cattgaaggg 100

<210> 89

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 89

gagactacaa aagctacaag gtcagcctat ctcggcagac ttgttgccaa gcacttacat 60

tgaagggttg ccccaaggcc ctacaacggc agaagagact 100

<210> 90

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 90

ggcagacttg ttgccaagca cttacattga agggttgccc caaggcccta caacggcaga 60

agagactgtt cagaaaggta cttccatagc atcatactgc 100

<210> 91

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 91

gttgccccaa ggccctacaa cggcagaaga gactgttcag aaaggtactt ccatagcatc 60

atactgcttc tgcttcctgc ctttggaacc tgctttgctt 100

<210> 92

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 92

cttaattcat ttcagagggg atgcgaaaac aaggcttatt tcaatggctc gattctcttc 60

agattgataa cctcacctct ccagacctgc agctcaccgt 100

<210> 93

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 93

gcttatttca atggctcgat tctcttcaga ttgataacct cacctctcca gacctgcagc 60

tcaccgtggg agcagtgatt gtggaggaaa tgagagcagc 100

<210> 94

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 94

ataacctcac ctctccagac ctgcagctca ccgtgggagc agtgattgtg gaggaaatga 60

gagcagccat agagagggag actggttttc agtgttcagc 100

<210> 95

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 95

tgggagcagt gattgtggag gaaatgagag cagccataga gagggagact ggttttcagt 60

gttcagctgg aatttcacac aataaggtga aggctaatag 100

<210> 96

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 96

ccatagagag ggagactggt tttcagtgtt cagctggaat ttcacacaat aaggtgaagg 60

ctaatagtag atttcaaaga gaaacattga tatccttagt 100

<210> 97

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 97

tttgatgggt tgacagtaat gaggttttta tactttgcat gcttccaggt cctggcaaaa 60

ctggcctgtg gactaaacaa gcccaaccgc caaaccctgg 100

<210> 98

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 98

tttgcatgct tccaggtcct ggcaaaactg gcctgtggac taaacaagcc caaccgccaa 60

accctggttt cacatgggtc agtcccacag ctcttcagcc 100

<210> 99

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 99

tgtggactaa acaagcccaa ccgccaaacc ctggtttcac atgggtcagt cccacagctc 60

ttcagccaaa tgcccattcg caaaatgtaa gtattcaggc 100

<210> 100

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 100

gtttcacatg ggtcagtccc acagctcttc agccaaatgc ccattcgcaa aatgtaagta 60

ttcaggcagc atgttaaatt tcacttctat ccatgtgtag 100

<210> 101

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 101

caaatgccca ttcgcaaaat gtaagtattc aggcagcatg ttaaatttca cttctatcca 60

tgtgtagaaa ctctctggtt gtagtttctt gtgttactaa 100

<210> 102

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 102

tgctaattag atagttatga tgtgacctat caattctttg tctcctttgt tatcagccgt 60

agtcttggag gaaagctagg ggcctctgtc attgagatcc 100

<210> 103

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 103

ttctttgtct cctttgttat cagccgtagt cttggaggaa agctaggggc ctctgtcatt 60

gagatcctag ggatagaata catgggtgaa ctgacccagt 100

<210> 104

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 104

ggaggaaagc taggggcctc tgtcattgag atcctaggga tagaatacat gggtgaactg 60

acccagttca ctgaatccca gctccagagt cattttgggg 100

<210> 105

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 105

ctagggatag aatacatggg tgaactgacc cagttcactg aatcccagct ccagagtcat 60

tttggggaga agaatgggta agtgattcat tttttttaaa 100

<210> 106

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 106

ttcactgaat cccagctcca gagtcatttt ggggagaaga atgggtaagt gattcatttt 60

ttttaaaatc ataaccttta tggagatgct atattcaaat 100

<210> 107

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 107

ttaacaagaa taatcattta atttcacctt aacgtttttt gctggtctta ttaggtcttg 60

gctatatgcc atgtgccgag ggattgaaca tgatccagtt 100

<210> 108

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 108

gttttttgct ggtcttatta ggtcttggct atatgccatg tgccgaggga ttgaacatga 60

tccagttaaa cccaggcaac tacccaaaac cattggctgt 100

<210> 109

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 109

tgccatgtgc cgagggattg aacatgatcc agttaaaccc aggcaactac ccaaaaccat 60

tggctgtagt aagaacttcc caggaaaaac agctcttgct 100

<210> 110

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 110

taaacccagg caactaccca aaaccattgg ctgtagtaag aacttcccag gaaaaacagc 60

tcttgctact cgggaacagg taagctggca ttcttgacag 100

<210> 111

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 111

tagtaagaac ttcccaggaa aaacagctct tgctactcgg gaacaggtaa gctggcattc 60

ttgacagaac actacctctt ttaaaggggt cagtgggtag 100

<210> 112

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 112

taaagtctca atactttttt aggtacaatg gtggctgttg caattagccc aggaactaga 60

ggagagactg actaaagacc gaaatgatgt aagattttct 100

<210> 113

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 113

tctcaatact tttttaggta caatggtggc tgttgcaatt agcccaggaa ctagaggaga 60

gactgactaa agaccgaaat gatgtaagat tttctttctt 100

<210> 114

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 114

atactttttt aggtacaatg gtggctgttg caattagccc aggaactaga ggagagactg 60

actaaagacc gaaatgatgt aagattttct ttctttattc 100

<210> 115

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 115

cctttccacc cacagaatga cagggtagcc acccagctgg ttgtgagcat tcgtgtacaa 60

ggagacaaac gcctcagcag cctgcgccgc tgctgtgccc 100

<210> 116

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 116

cagctggttg tgagcattcg tgtacaagga gacaaacgcc tcagcagcct gcgccgctgc 60

tgtgccctta cccgctatga tgctcacaag atgagccatg 100

<210> 117

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 117

aaacgcctca gcagcctgcg ccgctgctgt gcccttaccc gctatgatgc tcacaagatg 60

agccatgatg catttactgt catcaagaac tgtaatactt 100

<210> 118

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 118

cttacccgct atgatgctca caagatgagc catgatgcat ttactgtcat caagaactgt 60

aatacttctg gaatccagac agaatggtga gttcttttct 100

<210> 119

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 119

gatgcattta ctgtcatcaa gaactgtaat acttctggaa tccagacaga atggtgagtt 60

cttttctagc tcatcttctc agaatagatg atgattctta 100

<210> 120

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 120

ctttactttc tgtataggtc tcctcctctc acaatgcttt tcctctgtgc tacaaaattt 60

tctgcctctg ccccttcatc ttctacagac atcaccagct 100

<210> 121

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 121

atgcttttcc tctgtgctac aaaattttct gcctctgccc cttcatcttc tacagacatc 60

accagcttct tgagcagtga cccaagttct ctgccaaagg 100

<210> 122

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 122

tctgcccctt catcttctac agacatcacc agcttcttga gcagtgaccc aagttctctg 60

ccaaaggtgc cagttaccag ctcagaagct aagacccagg 100

<210> 123

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 123

ttcttgagca gtgacccaag ttctctgcca aaggtgccag ttaccagctc agaagctaag 60

acccagggaa gtggcccagc ggtgacagcc actaagaaag 100

<210> 124

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 124

gtgccagtta ccagctcaga agctaagacc cagggaagtg gcccagcggt gacagccact 60

aagaaagcaa ccacgtctct ggaatcattc ttccaaaaag 100

<210> 125

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 125

ggaagtggcc cagcggtgac agccactaag aaagcaacca cgtctctgga atcattcttc 60

caaaaagctg cagaaaggca gaaagttaaa gaagcttcgc 100

<210> 126

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 126

gcaaccacgt ctctggaatc attcttccaa aaagctgcag aaaggcagaa agttaaagaa 60

gcttcgcttt catctcttac tgctcccact caggctccca 100

<210> 127

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 127

gctgcagaaa ggcagaaagt taaagaagct tcgctttcat ctcttactgc tcccactcag 60

gctcccatga gcaattcacc atccaagccc tcattacctt 100

<210> 128

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 128

ctttcatctc ttactgctcc cactcaggct cccatgagca attcaccatc caagccctca 60

ttaccttttc aaaccagtca aagtacagga actgagccct 100

<210> 129

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 129

atgagcaatt caccatccaa gccctcatta ccttttcaaa ccagtcaaag tacaggaact 60

gagcccttct ttaagcagaa aagtctgctt ctaaagcaga 100

<210> 130

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 130

tttcaaacca gtcaaagtac aggaactgag cccttcttta agcagaaaag tctgcttcta 60

aagcagaaac agcttaataa ttcttcagtt tcttcccccc 100

<210> 131

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 131

ttctttaagc agaaaagtct gcttctaaag cagaaacagc ttaataattc ttcagtttct 60

tccccccaac aaaacccatg gtccaactgt aaagcattac 100

<210> 132

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 132

aaacagctta ataattcttc agtttcttcc ccccaacaaa acccatggtc caactgtaaa 60

gcattaccaa actctttacc aacagagtat ccagggtgtg 100

<210> 133

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 133

caacaaaacc catggtccaa ctgtaaagca ttaccaaact ctttaccaac agagtatcca 60

gggtgtgtcc ctgtttgtga aggggtgtcg aagctagaag 100

<210> 134

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 134

ccaaactctt taccaacaga gtatccaggg tgtgtccctg tttgtgaagg ggtgtcgaag 60

ctagaagaat cctctaaagc aactcctgca gagatggatt 100

<210> 135

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 135

gtccctgttt gtgaaggggt gtcgaagcta gaagaatcct ctaaagcaac tcctgcagag 60

atggatttgg cccacaacag ccaaagcatg cacgcctctt 100

<210> 136

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 136

gaatcctcta aagcaactcc tgcagagatg gatttggccc acaacagcca aagcatgcac 60

gcctcttcag cttccaaatc tgtgctggag gtgactcaga 100

<210> 137

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 137

ttggcccaca acagccaaag catgcacgcc tcttcagctt ccaaatctgt gctggaggtg 60

actcagaaag caaccccaaa tccaagtctt ctagctgctg 100

<210> 138

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 138

tcagcttcca aatctgtgct ggaggtgact cagaaagcaa ccccaaatcc aagtcttcta 60

gctgctgagg accaagtgcc ctgtgagaag tgtggctccc 100

<210> 139

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 139

aaagcaaccc caaatccaag tcttctagct gctgaggacc aagtgccctg tgagaagtgt 60

ggctccctgg taccggtatg ggatatgcca gaacacatgg 100

<210> 140

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 140

gaggaccaag tgccctgtga gaagtgtggc tccctggtac cggtatggga tatgccagaa 60

cacatggact atcattttgc attggagttg cagaaatcct 100

<210> 141

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 141

ctggtaccgg tatgggatat gccagaacac atggactatc attttgcatt ggagttgcag 60

aaatcctttt tgcagcccca ctcttcaaac ccccaggttg 100

<210> 142

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 142

gactatcatt ttgcattgga gttgcagaaa tcctttttgc agccccactc ttcaaacccc 60

caggttgttt ctgccgtatc tcatcaaggc aaaagaaatc 100

<210> 143

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 143

tttttgcagc cccactcttc aaacccccag gttgtttctg ccgtatctca tcaaggcaaa 60

agaaatccca agagcccttt ggcctgcact aataaacgcc 100

<210> 144

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 144

gtttctgccg tatctcatca aggcaaaaga aatcccaaga gccctttggc ctgcactaat 60

aaacgcccca ggcctgaggg catgcaaaca ttggaatcat 100

<210> 145

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 145

cccaagagcc ctttggcctg cactaataaa cgccccaggc ctgagggcat gcaaacattg 60

gaatcatttt ttaagccatt aacacattag tgctgccctc 100

<210> 146

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 146

cccaggcctg agggcatgca aacattggaa tcatttttta agccattaac acattagtgc 60

tgccctcagg cttgcctgta ggatttaata ttttttatct 100

<210> 147

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 147

tttcttgaat tttaagaatg cctaagatcc ttcttcatcc tcgatcttgg gagccaagta 60

gtattttaag tgtcccatat ccgcaatttt atactctaca 100

<210> 148

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 148

ttcatcctcg atcttgggag ccaagtagta ttttaagtgt cccatatccg caattttata 60

ctctacaact gaaagacagg aagatggtta attactgagg 100

<210> 149

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 149

taagtgtccc atatccgcaa ttttatactc tacaactgaa agacaggaag atggttaatt 60

actgaggagt atgtatcaca tatgactacc tacaaaacaa 100

<210> 150

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 150

aactgaaaga caggaagatg gttaattact gaggagtatg tatcacatat gactacctac 60

aaaacaaggt tcaaatttat tatcttacca aggggtacat 100

<210> 151

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 151

gagtatgtat cacatatgac tacctacaaa acaaggttca aatttattat cttaccaagg 60

ggtacatctg cagacatact gagtgtcacc gttgaagaga 100

<210> 152

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 152

aggttcaaat ttattatctt accaaggggt acatctgcag acatactgag tgtcaccgtt 60

gaagagagtg gagtggcttt tgtaaagaag ttcaggtacc 100

<210> 153

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 153

tctgcagaca tactgagtgt caccgttgaa gagagtggag tggcttttgt aaagaagttc 60

aggtacctca gtgcaaaagt tagttgaact ggttcattca 100

<210> 154

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 154

agtggagtgg cttttgtaaa gaagttcagg tacctcagtg caaaagttag ttgaactggt 60

tcattcatct ctatggtaac ctacaaaaca aaagattcat 100

<210> 155

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 155

ctcagtgcaa aagttagttg aactggttca ttcatctcta tggtaaccta caaaacaaaa 60

gattcatcat tgaaaaacat caagaaagtt gcaatctatt 100

<210> 156

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 156

ttacttaaaa actacttaca gcttcctcct ctttatcgac attacttgtc tgtgacaatt 60

taatgtttcc atttccaagt tctccacttg cagaaaattt 100

<210> 157

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 157

tatcgacatt acttgtctgt gacaatttaa tgtttccatt tccaagttct ccacttgcag 60

aaaatttcac tccgtctttt gcacaggaaa ttacaacagc 100

<210> 158

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 158

ttccatttcc aagttctcca cttgcagaaa atttcactcc gtcttttgca caggaaatta 60

caacagcatc tccaatatgg ctgagatctc ggcatatacg 100

<210> 159

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 159

tcactccgtc ttttgcacag gaaattacaa cagcatctcc aatatggctg agatctcggc 60

atatacgtgc aaattcacca gaaggcatct ttactacaca 100

<210> 160

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 160

catctccaat atggctgaga tctcggcata tacgtgcaaa ttcaccagaa ggcatcttta 60

ctacacagct gtactcctgt tcctattaag aacaaaaatt 100

<210> 161

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 161

aatatggctg agatctcggc atatacgtgc aaattcacca gaaggcatct ttactacaca 60

gctgtactcc tgttcctatt aagaacaaaa attttccaaa 100

<210> 162

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 162

ttccaagttg ttcaacatct aaatccatca acttcatttc atagtctgaa actttctcct 60

ggtctaccaa aagaaagcag atgcttttga gaaatactga 100

<210> 163

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 163

ttgttcaaca tctaaatcca tcaacttcat ttcatagtct gaaactttct cctggtctac 60

caaaagaaag cagatgcttt tgagaaatac tgacacagag 100

<210> 164

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 164

atagtctgaa actttctcct ggtctaccaa aagaaagcag atgcttttga gaaatactga 60

cacagagttt tgattttctg tagcttcgtg actcggtaaa 100

<210> 165

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 165

aaagcagatg cttttgagaa atactgacac agagttttga ttttctgtag cttcgtgact 60

cggtaaaaag gtacgactta cttggtgctt caaatactag 100

<210> 166

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 166

gttttgattt tctgtagctt cgtgactcgg taaaaaggta cgacttactt ggtgcttcaa 60

atactagcgc caaggtatcc gcgttatctt cggcccttag 100

<210> 167

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 167

aaaggtacga cttacttggt gcttcaaata ctagcgccaa ggtatccgcg ttatcttcgg 60

cccttagtgt aatgatatct tcattgccgg cgcattttag 100

<210> 168

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 168

gcgccaaggt atccgcgtta tcttcggccc ttagtgtaat gatatcttca ttgccggcgc 60

attttagtat tttggacata ctagaagaca ggagacacat 100

<210> 169

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 169

gtgtaatgat atcttcattg ccggcgcatt ttagtatttt ggacatacta gaagacagga 60

gacacatgct ttaaaatcaa cgccgtctgc tgaagggctg 100

<210> 170

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 170

ttcccggggc cgcgaggctc acctggtgag gttcacgccc atggccaggt tgcggtcgca 60

gcggtaggtg tcgaagccct cagaccgcag ggtgagctgc 100

<210> 171

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 171

cacgcccatg gccaggttgc ggtcgcagcg gtaggtgtcg aagccctcag accgcagggt 60

gagctgcacc aaagagacgt gggacgagtc catgctctgc 100

<210> 172

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 172

ggtgtcgaag ccctcagacc gcagggtgag ctgcaccaaa gagacgtggg acgagtccat 60

gctctgcagg tttacaccgc tggagctaat atcccagcag 100

<210> 173

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 173

caccaaagag acgtgggacg agtccatgct ctgcaggttt acaccgctgg agctaatatc 60

ccagcaggcc tcgttgatga ggtccttgag tgcctccaac 100

<210> 174

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 174

tctgcaggtt tacaccgctg gagctaatat cccagcaggc ctcgttgatg aggtccttga 60

gtgcctccaa caccttcttg aggatggagc cctggaccag 100

<210> 175

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 175

ggcctcgttg atgaggtcct tgagtgcctc caacaccttc ttgaggatgg agccctggac 60

caggcgcgcc tcgaacatgg tggcggagtg gcaacaacgc 100

Claims

1. 一种检测DNA跨损伤合成修复通路关键突变基因的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括针对DNA跨损伤合成修复通路关键突变基因的如SEQ ID NO.1～175所示探针组成的探针库。

2.根据权利要求1所述的一种检测DNA跨损伤合成修复通路关键突变基因的试剂盒，其特征在于，DNA跨损伤合成修复通路关键突变基因包括USP1、POLH、PCNA。

3. 根据权利要求1所述的一种检测DNA跨损伤合成修复通路关键突变基因的试剂盒，其特征在于，所述基因USP1对应的探针序列如SEQ ID NO. 1～72所示，所述基因POLH对应的探针序列如SEQ ID NO.73～146所示，所述基因PCNA对应的探针序列如SEQ ID NO.147～175所示。

4.一种检测DNA跨损伤合成修复通路关键突变基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）获得受试者的DNA样本库；

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中的DNA样本库由双链DNA片段组成；

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中的探针进行选择性标记。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中的探针进行生物素标记。