JP5166276B2 - トランスポゾンタギング集団のハイスループットスクリーニングおよび挿入部位の大規模並行配列特定のための方法 - Google Patents
トランスポゾンタギング集団のハイスループットスクリーニングおよび挿入部位の大規模並行配列特定のための方法 Download PDFInfo
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Description
以下の説明および例において、多くの用語が使用される。そのような用語が与えられるべき範囲を含む、明細書および特許請求の範囲の明確でおよび一貫した理解を提供するために、以下の定義が提供される。本願中で特別定義される場合を除き、使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者が通常理解する意味と同一の意味を有する。全ての文献、特許出願、特許およびその他の参考文献の開示は、その全てが本願に援用される。
本発明者らは、ハイスループットシーケンシング戦略を用いて、前述の目的が達成でき、およびトランスポゾン集団、またはトランスポゾン挿入によって起こされる関心ある表現型を保持するメンバーを含む集団は、関心ある遺伝子への挿入の存在について効率的にスクリーニングされることを発見した。
本発明は、以下の工程を含む、トランスポゾン集団のメンバーにおける関心ある遺伝子または配列に関連した挿入の同定のための方法に関する:
(a) 個々にまたはプール中にて、トランスポゾン集団のゲノムDNAを単離すること;
(b) 任意に、工程(a)で得られるDNAをプールすること;
(c) 1以上、好ましくは2以上、最も好ましくは2つの制限酵素(好ましくはその少なくとも1つが、トランスポゾンを切断しない高頻度切断制限エンドヌクレアーゼであり、好ましくは少なくとも1つが、トランスポゾンで切断する希少切断制限酵素である)を使用してDNAを制限処理し(restrict)、制限断片にアダプターを結合し(ligate)、それによってアダプター結合制限断片を作製すること;
(d) 一対の(任意に、ラベルした)プライマーを用いてアダプター結合制限断片を増幅すること、ここにおいて、プライマーの1つは、(既知の)トランスポゾン配列の一部に相補的(ハイブリダイズ可能)であるセクションを含み、更にシーケンスプライマー結合部位を含み、ここにおいて他方のプライマーは少なくともアダプターに相補的であり、ここにおいて一方または両方のプライマーはタグを含む;
(e) 任意に、工程(d)の増幅産物をプールし、増幅産物のライブラリーを構築すること;
(f) 任意に、ライブラリー中の増幅産物を断片化すること;
(g) ハイスループットシーケンシングを使用して、(d)、(e)または(f)の断片のヌクレオチド配列を決定すること;
(h) 任意に、in silicoで断片の配列を整え、それによって何れかのアダプターおよび/またはトランスポゾンに関連した配列情報を削除すること;
(i) データベースからのヌクレオチド配列をアライニングできる、工程(g)または(h)の1以上の断片を同定し、それによってデータベースからのヌクレオチド配列と関心ある表現型との相関関係を示すこと;
(j) 工程(i)の断片を含んでいるトランスポゾン集団のメンバーを同定すること;
(k) 任意に、工程(i)の断片に基づいてプローブまたはPCRプライマーペアを設計し、およびそれを使用して(j)で同定されたメンバーのゲノムの関心ある遺伝子におけるトランスポゾン挿入を確認すること。
(i)続くシーケンシング工程にて使用可能な位置に結合するシーケンスプライマー、
(ii)プライマー(および結果的に生じる増幅産物)と集団の本来のメンバーとを関連付けるのに役立つタグ、および
(iii)ハイスループットシーケンシング工程にて使用されるビーズへの結合を可能にするビーズ結合配列。
シーケンスプライマー結合部位−−−任意的タグ−−−トランスポゾン特異的PCRプライマー配列、または
ビーズ結合部位−−−任意的タグ−−−トランスポゾン特異的PCRプライマー配列。
シーケンスプライマー結合部位−−−任意的タグ−−−アダプター特異的PCRプライマー配列、または
ビーズ結合部位−−−任意的タグ−−−アダプター特異的PCRプライマー配列。
(1) (a)5’−定常セクション、それに繋がる(b)縮重タグセクション(NNNN)、それに繋がる(c)トランスポゾンまたはアダプター特異的セクション−3’を含む長いプライマー、および
(2) (a)5’−定常セクション、それに繋がる(b)非縮重タグセクション−3’(すなわち、NNNNの中からの選択)から成る、引き続く増幅における短いプライマー。
(1)シーケンシング−アダプター−結合断片をビーズにアニーリングさせる、ここにおいて、それぞれのビーズは単一の断片とアニーリングする;
(2)油中水マイクロリアクター中でビーズを乳化する、ここにおいて、油中水マイクロリアクターは単一のビーズを含む;
(3)エマルジョンPCRを行い、ビーズの表面上でアダプター結合断片を増幅する;
(4)増幅したアダプター結合断片を含むビーズを選択/濃縮する;
(6)ウェルにビーズを充填する、ここにおいて、それぞれのウェルは単一のビーズを含む;および
(7)ピロリン酸シグナルを作る。
1)トランスポゾン集団の3072の植物のゲノムDNAが単離される;
2)植物当りの等量のDNAの三次元プーリングスキームが設定され(例えば15x15x14)、3072/14=219または3072/15=205の異なるDNAサンプルを含む44のプール(15+15+14=44)がもたらされる(Vandenbusscheら、2003);このプーリング工程は、配列データからの直接の挿入を含む個々の植物の同定を可能とするのに役立つ。ゲノムDNAのプーリングは、更に、PCR増幅の前にDNAを標準化し、全てのDNAが配列ライブラリーにて等しく見受けられる可能性を増加させることに役立つ;
3)アダプター結合制限断片テンプレート(AFLPテンプレート、EP534858、Vos らNAR 1995, 23, 4407参照)は、250−500bpごとにゲノムを切断する単一の制限酵素を使用して(例えば4−または5カッターを使用して、例えばMseI)、全ての44のプールされたDNAから作られた;
4)一方向性PCR増幅を、トランスポゾン配列の境界に位置して外方向に向くPCRプライマーおよび非選択的アダプタープライマーを使用して実行し、マルチプレックスで全てのトランスポゾンの隣接配列を増幅する。200のトランスポゾンを含む植物につき、これは、境界側につき200×約250bp=50kbの隣接配列をもたらし、その20kbは、100bpリード長の場合に配列決定されるだろう。3072の植物のために、これは153Mb隣接配列に等しく、その61Mbが、100bpの配列リード長の場合に配列決定可能である;
5)全ての44ウェルからのPCR産物の等量は、プールされたPCR産物ライブラリーを構築するためにプールされる;
6)プールされたPCR産物ライブラリーは、PCR産物の更なる分画を行うことなく、454 Life Sciences合成による配列決定技術(sequencing−by−synthesis technology)を使用して、配列決定される。出力は、約200,000の100bp配列であり、3072の植物の全ての隣接配列の平均の0.33X(20/61Mb)被覆度(coverage)を意味する。それゆえ、少なくとも3回の配列決定行程が、全3072の植物の隣接配列の非常に大多数を標的とするために必要である;
7)結果として生じる配列をBLAST検索し、ESTまたはゲノム配列とのヒットを同定する;
8)関心ある遺伝子にトランスポゾン挿入を保持している植物をそれらのタグに基づいて同定し、任意にプローブまたはPCRプライマーを作製し確認する。
1000ペチュニアW138植物の集団を、Vandenbusscheらの文献(2003)またはその他の文献の記載の通りに3次元戦略にそってサンプル取得し、3つの座標で集団全体の全ての個体を網羅する、30のプールされたサンプル(X1−X10、Y1−Y10およびZ1−Z10)を得た。これは、何れかの特定のPCR産物の起源を、集団内の起源の植物に突き止めることを可能にする。
方法の概要は以下の通りである:
DNA調製(3D様式で標本抽出される1000の植物、30のプールされたDNAに帰着する);
MunI/MseI消化(約5μgのプールされたDNA);
Bio−Mun及びMseアダプターライゲーション連結;
精製(PCR精製カラム、bio−Munアダプターおよび非常に小さい断片の除去);
ビーズ抽出(Mun/Mse断片の濃縮);
トランスポゾンディスプレイPCR増幅:
MunACAC及びMse+0プライマーによる予備増幅(トランスポゾン隣接配列の濃縮);
プールされた特異的なIR**outw及びMse+0プライマーによる選択的PCR(トランスポゾン隣接配列の増幅);
「ブロック(Block)」、「ロウ」および「カラム」プールへの第2のプーリング;
標準化;
二本鎖分子への転換;
MunI/MseI消化;
454−Mun−B及び454−Mse−Aアダプターライゲーション;
bio−AmpB及びAmpAプライマーによるPCR増幅;
1サンプルへの最終的なプーリング;
454シーケンシング。
3D様式で標本抽出される1000の植物から、それぞれ100植物を代表する30のDNAサンプルがもたらされる;方法は、Vandenbusscheら、Plant Cell 15 (11): 2680−2693 (2003)による。
MunI(bio)アダプター:bio−5’−CTCGTAGACTGCGTACG−3’
3’−CTGACGCATGCTTAA−5’
MseIアダプター:5’−GACGATGAGTCCTGAG−3’
3’−TACTCAGGACTCAT−5’
QuiagenPCR増幅キットを用いたDNAの精製。55μlのEB緩衝液で溶出(1.5%アガロースゲル上で5μl)。
MunI+ACAC:5’−AGACTGTGTACGAATTGACAC−3’
MseI+0 :5’−GACGATGAGTCCTGAGTAA−3’
1.5%アガロースゲル上で5μlを分析、および水で10倍にサンプルを希釈、選択的PCR増幅を実行。
IRoutw:* 5’−CATATATTAANNNNGTAGCTCCGCCCCTG−3’
全てのプールされたサンプルは、NNNN位置で特定されるユニークなIRoutwプライマーで増幅する;これは、得られた配列を、それらの起源の座標に割り当てることを可能にする。
MseI+0: 5’−GACGATGAGTCCTGAGTAA−3’。
それぞれの次元由来の10サンプルからのPCR産物をプールし、3サンプルを作製:カラム/ロウ/ブロック。
多くのまたは全ての個体に共有される断片の背景(backdrop)に対するユニークな断片の量を強化するために、第2のプールされたサンプルを、従来の既知の方法に基づいて標準化する。方法は、一本鎖分子を得るための、ハイブリダイゼーションおよび精製工程を含む。
プールされたサンプルのDNAの沈殿、および15−35μlに溶解
15μlのホルムアミドに添加(相対的量):
4.5μl TE
3 μl H2O
鉱油の下で80℃まで3分間加熱
添加 3μl 緩衝液A
4.5μl H2O
プローブO/Nを30℃でインキュベート
一本鎖分子を、de Fatima Bonaldoら、Genome Research, 6: 791−806 (1996)に記載されるとおりに、標準的HAPクロマトグラフィーにて選択し、引き続いて2本鎖分子に変換する。
Mun IアダプターB:
MIBUS803
5’−CCTATCCCCTGTGTGCCTTGCCTATCCCCTGTTGCGTGTCTCAG−3’
MIBUS795
3’−AGGGGACACACGGAACGGATAGGGGACAACGCACAGAGTCTTAA−5’
MseIアダプターA:
MIBUS800
5’−CCATCTCATCCCTGCGTGTCCCATCTGTTCCCTCCCTGTCTCAG−3’
MIBUS801
3’−GAGTAGGGACGCACAGGGTAGACAAGGGAGGGACAGAGTCAT−5’。
増幅アダプタープライマーAおよびB:
MIBUS803 bio−5’−CCTATCCCCTGTGTGCCTTG−3’
MIBUS802 5’−CCATCTCATCCCTGCGTGTC−3’。
ハイスループットシーケンシングに備えて、サンプルをプールし、1スーパープールを作製。
挿入サイズ分布試験のためのpGEM−Tクローニング 1サンプル
標準化方法の効率を試験するため、我々は、サイズ分布の決定のためにランダムに22の断片を単離した。1μl PCRミックス(454シーケンシングのためのスーパープールサンプル由来)を取る
以下を添加
E.coli(DH5α細胞)へ形質転換
LB−Ampプレートに100μlをまく
インキュベート:o/n、37℃
22コロニーをひろう
AmpA/AmpBプライマーを用いて、煮沸したプレップにてPCRを実行
および、2%アガロースゲルで泳動。
平均102塩基対の318.000配列タグのデータベースを得た。230.000配列のサブセットは、3つのレベルに完全に並べられた:
1)トランスポゾンの逆方向反復に隣接する(CCGCCCCTGで終了する)、配列の配列同一性。同一の挿入を同定する全ての配列は1つのグループとみなされる。
2)それぞれのグループ内にて、配列を、それらの5’配列における異なる3Dタグに従って並べる。
Claims (14)
- 以下の工程を含む、トランスポゾン集団のメンバーにおける関心ある遺伝子または配列に関連した挿入の同定のための方法:
(a) 個々にまたはプール中にて、トランスポゾン集団のゲノムDNAを単離すること;
(b) 1以上、好ましくは2以上、最も好ましくは2つの制限エンドヌクレアーゼ(好ましくはその少なくとも1つが、トランスポゾン中で切断しない高頻度切断制限エンドヌクレアーゼであり、好ましくは少なくとも1つが、トランスポゾン中で切断する希少切断制限エンドヌクレアーゼである)を使用してDNAを制限処理し、制限断片にアダプターを結合し、それによってアダプター結合制限断片を作製すること;
(c) 一対のプライマーを用いてアダプター結合制限断片を増幅すること、ここにおいて、プライマーの1つは、(既知の)トランスポゾン配列の一部に相補的(ハイブリダイズ可能)であるセクションを含み、更にシーケンスプライマー結合部位を含み、ここにおいて他方のプライマーは少なくとも前記アダプターに相補的であり、ここにおいて一方または両方のプライマーはタグを含む;
(d) ハイスループットシーケンシングを使用して、(c)の断片のヌクレオチド配列を決定すること;
(e) データベースのヌクレオチド配列とアライニングできる、工程(d)の1以上の断片を同定し、それによってデータベースのヌクレオチド配列と関心ある表現型との相関関係を示すこと;
(f) 工程(e)の断片を含んでいるトランスポゾン集団のメンバーを同定すること。 - 工程(a)で得られたDNAがプールされる請求項1に記載の方法。
- 工程(c)の増幅産物がプールされて増幅産物のライブラリーが構築され、前記増幅産物のヌクレオチド配列がハイスループットシーケンシングを使用して決定される請求項1に記載の方法。
- 前記増幅産物が断片化され、前記断片化された増幅産物のヌクレオチド配列がハイスループットシーケンシングを使用して決定される請求項1に記載の方法。
- 前記断片の配列をコンピュータで(in silico)整え、それによって何れかのアダプターおよび/またはトランスポゾンに関連した配列情報を削除し、データベースのヌクレオチド配列とアライニング可能である前記整えられた断片の一以上が同定され、これによってデータベースのヌクレオチド配列と関心のある表現型とを関係づける請求項1に記載の方法。
- 工程(e)の前記断片に基づいてプローブまたはPCRプライマーペアが設計され、前記プローブまたはPCRプライマーペアを使用して、工程(f)で同定されたメンバーのゲノム中の関心のある遺伝子におけるトランスポゾン挿入を確認する請求項1に記載の方法。
- 工程(c)の前記プライマーがラベルされる請求項1に記載の方法。
- プーリングが3Dプーリング戦略である請求項2及び3の何れか1項に記載の方法。
- 前記データベースが、EST配列、関心ある種のゲノム配列および/またはGenBankの非重複配列データベース、または同様の配列データベースを含む請求項1〜8の何れか1項に記載の方法。
- 前記ハイスループットシーケンシングが、好ましくはキャピラリー電気泳動法による、サンガーシーケンシングに基づく請求項1〜9の何れか1項に記載の方法。
- 前記ハイスループットシーケンシングは、合成による配列決定、好ましくはパイロシーケンシングである請求項1〜10の何れか1項に記載の方法。
- 前記シーケンシングがビーズなどの固体担体上で行われる請求項1から11の何れか1項に記載の方法。
- 前記シーケンシングが以下の工程を含む請求項12に記載の方法:
(1)シーケンシング−アダプター−結合断片をビーズにアニーリングさせる、ここにおいて、それぞれのビーズは単一の断片とアニーリングする;
(2)前記ビーズを、油中水マイクロリアクター中で乳化する、ここにおいて、油中水マイクロリアクターは単一のビーズを含む;
(3)エマルジョンPCRを行い、ビーズの表面上でアダプター結合断片を増幅する;
(4)増幅したアダプター結合断片を含むビーズを選択/濃縮する;
(6)ウェルにビーズを充填する、ここにおいて、それぞれのウェルは単一のビーズを含む;および
(7)ピロリン酸シグナルを作る。 - 前記プライマーの少なくとも1つが、増大した結合親和性を有する1以上のヌクレオチドを含む請求項1から13の何れか1項に記載の方法。
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