JP3535159B2 - Ｄｎａ分析への選択的アプローチ - Google Patents

Ｄｎａ分析への選択的アプローチ

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Description

【発明の詳細な説明】 関連出願に対するクロスリファレンス 本出願は、1993年11月12日に提出された出願第07/97
4,447号の一部継続出願である。
序 技術的分野 本発明の分野はDNA分析である。
背景 ゲノミックDNAの比較分析は、多型現象、感染性のDNA
ベースの作用物質、ガンなどの疾病に関連する病巣、優
性及び劣性の遺伝的形質などに関する情報を提供するこ
とのできる配列の発見を約束するものである。細胞の機
能をもつか又は細胞の機能に影響を及ぼす特定のDNA配
列を検出することができれば、血統を監視することがで
き、かくして動物を飼育するにあたり望ましい形質に結
びついた特定の配列の遺伝を追跡することが可能とな
る。人間においては、法医学、診断及び遺伝子型決定及
びさまざまな個体間の関係の決定において実質的に関心
が示されている。従って、複数の供給源の間の共通の配
列及び供給源によって異なる配列を検出できるようにす
る技術を提供することについて実質的関心が存在してい
る。
哺乳動物のゲノムは異常に大きく、約６×109bpであ
る。ヒトゲノムのプロジェクトはゲノム全体をマッピン
グし配列決定する研究努力を開始させた。しかしなが
ら、初期研究作業の多くは、特定の染色体の隣接する配
列を決定することよりもむしろ特定の遺伝子の部位を決
定することの方に向けられることだろう。
ヒトゲノムの複雑性のため、ヒトのゲノミックDNAに
ついてはきわめて実質的な取り扱い上及び処理上の問題
が存在する。このように大量なDNAを処理するために
は、望まれる情報をなおも提供しながら、単純化及び選
択を可能にする方法を開発しなければならない。従っ
て、２つの異なるDNA供給源の間で比較を行なうことの
できる、多少程度の差こそあれ問題のゲノムの一部分を
詳細に分析することを可能にするような機会を提供する
研究努力が行なわれなければならない。
関連文献 ゲノムレベルでの差異分析における研究努力について
は、Lamar及びPalmer,Cell（細胞）37,171（1984）;Kun
kel et al.,Proc.Natl.Acad.Sci,USA 82,4778（1985）;
Nussbaum et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84,6521（19
87）;Wieland et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87,2720
（1990）;Straus及びAusubel,Proc.Natl.Acad.Sci.USA
87,1889（1990）によって記述されている。
発明の要約 関係する２つのDNA供給源の間の類似性又は差異を決
定するため、代表差異分析が提供されている。第１段階
においては、各ゲノムの代表的部分を、制限エンドヌク
レアーゼ（RE1）、部分的に２本鎖であるアダプターの
連結及びポリメラーゼ連鎖反応ならびに、「アンプリコ
ン」と呼ばれる比較的小さいDNAフラグメントの個体群
を提供するためのRE1での分割、を用いて調製する。こ
の段階は、異なる制限エンドヌクレアーゼ又は異なるス
キーマ例えば分画などを用いて別々の分析において反復
することができる。
DNA供給源アンプリコンは「ドライバー」と呼ばれ、
このアンプリコンは、その後のもう１つの「テスター」
アンプリコンの処理において実質的に余剰に使用され
る。このテスターには、ドライバーアンプリコンの中に
存在しないか又は少ない量でしか存在しない「標的」DN
Aが含まれる。部分的２本鎖のPCRアダプターはテスター
アンプリコンフラグメントのみに連結され、テスターと
ドライバーDNAが組合わされ、溶融され再度アニールさ
れる。アンプリコンの末端は充てんされ、アダプターに
相補的なプライマを用いてDNA混合物は増幅に付され、
ここで標的DNAは対数増幅を受け、ドライバーDNAにアニ
ールする非標的テスターDNA及びドライバーDNAに比べて
実質的に富化されることになる。次に、アダプターを除
去し、異なるアダプターを用いてサイクルを反復するこ
とができる。さらに標的DNAの選択を強化するため異な
る段階でさまざまな修正を利用することも可能である。
図面の簡単な説明 図１は、遺伝子の増幅を検出するプローブを分離する
ためのRDAの応用のゲル電気泳動及びゲノミックブロッ
ト分析である。
図２は、異なる供給源からのドライバを用いた遺伝子
増幅のゲル電気泳動分析である。
図３は、ラットレトロトランスポゾンRat L1RnB6とヒ
ト前立腺ガンからの差異産物P35の配列比較である。
図４は、２つのcDNA個体群へ差異配列のゲル電気泳動
分析である。
特定の実施態様の説明 ２つのDNA供給源の間の代表差異分析（「RDN」）のた
めの方法が提供されている。この方法は、選択的なハイ
ブリダイゼーション条件の下で２つの供給源のうちの１
方からのDNAがもう１つの供給源からのDNAに対して有意
にハイブリッド形成されない状態で、２つの供給源の間
で異なる配列の検出を可能にする。供給源としては、ゲ
ノム、通常0.2kbp以上であるDNAフラグメントセット、
制限エンドヌクレアーゼで分割されたフラグメントの収
集物、cDNA又はcDNAライブラリなどが含まれる。この方
法には、代表と呼ばれる第１の段階と、問題の配列の実
質的な富化を提供するために反復することのできる減法
及び運動による富化と呼ばれる２つ以上のさらなる段階
が関与している。
本発明においては、一定数の新たな造語が用いられ
る。「ドライバー」DNAというのは、第２の供給源すな
わち「テスター」供給源内のDNAの存在を決定するのに
使用されることになる１つの供給源からのDNAである。
テスターDNAに唯一のものであるか又はドライバーDNAに
比べてテスターDNAに対する濃度が高いフラグメントは
「標的」DNAと呼ばれる。DNA配列は、制限エンドヌクレ
アーゼ消化とそれに続くアダプターの連鎖そして次にア
ダプターに対し相補的なプライマーでの増幅の結果とし
て第１段階にて得られる。結果として得られるDNAは、
「アンプリコン」と呼ばれる。このアンプリコンは、末
端が通常アダプターに対する連鎖に先立って同じ制限エ
ンドヌクレアーゼ認識配列を有している状態で、約2kb
未満、通常は少なくとも約0.5kb未満であるということ
を特徴とする。
本出願は、広範な状況の下で使用することができる。
特に劣性又は優性形質と結びつけられた特定のDNA配列
の存在又は不在を決定するにあたり、コーディング配列
であっても非コーディング配列であってもよいもののそ
の形質と結びつけられたDNA配列と結びついた状態で遺
伝されることになる特定の配列を共有しているか否かを
決定するべく、２つの関係するDNA供給源を比較するこ
とが可能である。当該方法は法医学において、２つの供
給源の間の関係の度合いに関心がある場合にこれら２つ
の供給源からのDNAの間の類似性を立証するために使用
できるものである。当該方法は同様に、ゲノム内に組込
むことのできる又はできないウイルス配列といったよう
な感染に結びついた配列の存在を調査することができ
る、疾病の研究においても応用可能である。同様に、ガ
ンの結果としてのゲノム内の変化を研究する上でも当該
方法を使用することができ、この場合、ガン細胞は正常
な野生型細胞に比較することができる。かくして、当該
方法は、遺伝的再配列、遺伝的喪失、遺伝子又はその他
のDNAの増幅を除去するための、ゲノム内に組込まれた
又は細胞宿主内に存在する病原性生体からのDNAの同定
のため、遺伝的疾患と結びつけられた遺伝子又はその近
くにある多型の同定のため、特に細胞宿主内で発現され
る遺伝子の同定のため、新生細胞内の病巣の同定のため
などに応用できるものである。
当該方法を実施するにあたっては、この方法を利用す
るときに考慮に入れるべき事項が存在する。PCRは、こ
のプロセスが確率論的な性格をもつことから、人為構造
の源となりうる。従って、各々の差異産物候補は、テス
ター及びドライバーアンプリコン内でのその存在又は不
在についてテストされるべきである。もう１つの人為構
造源は組織の試料採取の間に起こりうる。テスターの標
本を汚染する正常なフローラは、それがドライバ内にも
存在しない場合差異分析の間に容易に富化されることに
なる。遺伝的モザイク現象に遭遇する可能性もある。ポ
リクローナル組織を扱っている場合、つまり例えばガン
生検などにおいては、突然変異の存在を検出できるため
には特定の突然変異をもつ細胞が最低限の割合で存在し
なければならない。従って、テスターDNAのための供給
源として物理的分離によって得られたきわめて精製度の
高いガン細胞又はガン細胞の培養を使用することが望ま
れる。病原体の発見の場合には、感染を受けた又は受け
ていないDNA供給源からの多型性の入念な整合がなくて
はならない。後者の場合、テスター及び／又はドライバ
ーDNAは、同じ個体から誘導されてもよいし、同一の双
生児から又は別々であるが関連ある個体からのものであ
ってもよいし、テストされた個体の親からのプールされ
たDNAであってもよいし、関連ある供給源例えば細胞系
統、共通の遺伝的機能障害又は共通の形質などからのプ
ールされたDNAであってもよい。
最終的に、標的DNAを同定することのできる容易さに
ついて、全ての制限エンドヌクレアーゼが同等ではな
い。従って、各々の場合において、合理的な数のサイク
ル内で標的DNAを確実に得るようにするためのみなら
ず、得られる標的DNA配列の数を増大させるため、別々
の決定において複数の制限エンドヌクレアーゼを使用す
ることが望ましいだろう。
ここで特定のプロセスを見てみると、第１段階はDNA
の分離である。すでに記した通り、DNAは、あらゆる供
給源つまり真核生物、又は原核生物、無脊椎動物又は脊
椎動物、哺乳動物又は非哺乳動物、植物又はその他の高
等真核生物といった供給源からのものであってよい。ヒ
トの利益のため直接応用するという観点から見ると、供
給源はヒトDNAとなるが、当該方法は、実験用の動物、
植物、家畜などのような関連するDNAの存在又は不在を
同定することに関心がある場合、又は近交系又は非近交
系個体群が問題となっているその他のあらゆる状況の下
では、あらゆる複合ゲノムに対して応用することができ
る。DNAは通常、近い関係をもつ供給源からのものであ
り、かくして、得られる標的DNA配列の数は比較的制限
されることになり、往々にして約104未満、通常は約103
未満の異なる配列である。ゲノミックDNAが通常ドライ
バー及びテスターDNAの供給源となるが、２つの異なるm
RNA供給源からの２つのcDNA個体群の間の差に関心があ
る場合、cDNAを使用することもできる。
第１段階においては、DNAを分離させ、タンパク質を
除去し、その後、比較的頻繁でない切断を提供する制限
エンドヌクレアーゼを用いて完全に消化させる。通常エ
ンドヌクレアーゼは、６個以上のヌクレオチドから成る
コンセンサス配列を有し、平滑末端又は付着末端、通常
は付着末端を提供することができる。BamH I,Bgl II,Hi
nd IIIなどといったさまざまなエンドヌクレアーゼを利
用することができる。DNAの消化の後、ドライバからのD
NA及びテスターからのDNAの各々のストランドの端部
に、２本鎖オリゴヌクレオチドアダプターを連結させ
る。アダプターは通常両端で付着され、１方のストラン
ドが長めで、プライマに相補的な配列として役立つ。ア
ダプタは２本鎖であり、消化からのdsDNAの末端に対し
相補的な片端をもつ。２つの供給源からのDNAは次に、
プライマを付加し、最終ラウンドについての拡張を伴う
ポリメラーゼ連鎖反応を用い通常は10サイクル以上、よ
り通常的には15サイクル以上、一般には約30サイクル以
下、より通常的には15サイクル以上、一般には約30サイ
クル以下、より通常的には約25サイクル以下そして好ま
しくは約20サイクルを用いることによって、別々に増幅
される。このサイクル数の後、大部分について、フラグ
メントは主として約2kb未満、通常は約1.0kb未満とな
る。このとき、アダプタは、適切なあらゆる手段を用い
て、制限エンドヌクレアーゼ消化及び物理的分離により
除去される。
物理的分画とは異なり、代表を用いた場合出発物質の
量が制限条件となることはない。BamH I,Bgl II及びHin
d IIIでの分割の後、哺乳動物のDNAのアンプリコンを利
用する場合、結果として得られるアンプリコンの見積り
上の複合性は、それぞれ出発ゲノミックDNAでの複合性
の55分の1,13分の１及び８分の１である（Bishop et a
l.,Am.J.Hum.Gevet.35,795［1983］）。
ゲノムの複合性を減少させるために、このゲノムを代
表するその他の方法を利用することもできる。例えば、
4ntのコンセンサス配列制限酵素といったより頻繁に切
断するゲノムを用いた分割そしてそれに続くアダプター
の付加、PCR増幅及びサイズ分画が、この目的を達成す
ることになる。もう１つの方法によると、反復的配列を
フランキングするゲノムの代表部分を増幅するためゲノ
ム内の反復的DNAに対するプライマーとしてオリゴヌク
レオチドを使用する可能性がある。
次の段階では、単一のハイブリダイゼーション及び増
幅の作業において、減法及び運動による段階が利用され
る。望ましい場合には、段階を分離することもできる
が、好ましくは同時発生的に行なわれる。この段階の第
１の局面は、テスターアンプリコンフラグメントの5'末
端又は手順が反復される場合には先行する富化ラウンド
の産物に対するPCRアダプターの連結である。テスター
アンプリコンの3'末端に対する連結は避けるべきであ
り、これは例えば、その5'末端でリン酸化されていない
アダプタを用いることによって達成できる。通常、プラ
イマに対して相補的なアダプター鎖は少なくとも約12n
t、より通常的には少なくとも17nt、そして一般的には
約20nt未満、さらに一般的には約100nt未満となる。5'
末端に対するアダプターの連結のための適切なあらゆる
方法を適宜利用することができる。
次にアダプターに接合されたテスターアンプリコンフ
ラグメントをドライバーアンプリコンフラグメントと組
合わせ、溶融させ、再度アニールさせる。ドライバーア
ンプリコンフラグメントは実質的に余剰に、通常は少な
くとも５倍の余剰で存在し、この余剰は、50以上を超え
ることもあり、通常は約108倍の余剰を超えず、より通
常には500倍の余剰を超えない。テスターDNAに対するド
ライバーDNAの比率は、異なるラウンドについて一定で
ある必要はない。通常、この比率は、連続的ラウンドと
共に増大し、この増加は約1:1〜103まで変動しうる。初
期比率は一般に約10〜1000倍の余剰の範囲内となる。適
切には、高い温度、一般には95℃以上の温度での加熱に
より溶融が達成されハイブリダイゼーションは約60℃で
進行するか、ここで、必要な緊縮性を提供するべくさま
ざまな緩衝液ならびに塩濃度を利用することができる。
通常は、かなり高い緊縮性、つまり一般には少なくとも
約0.1M NaCl以上、通常は約1M NaClの緊縮性が用いら
れることになる。
溶融及び再アニールの後、ドライバーDNAの中に存在
する相補的配列の欠如又は相対的欠失のために標的DNA
が自己アニールの阻害を受けないことから、全２本鎖DN
A中の標的DNAの実質的富化が存在することになる。
このとき、４つのヌクレオチドの存在下で例えばTaq
DNAポリメラーゼといったあらゆる適切なDNAポリメラー
ゼを利用することにより、張出しは充てんされ、かくし
て２本鎖の自己再アニールされたテスターDNAのみが充
てん済みアダプターをアンプリコンの各端部において有
することになる。ドライバーDNAは非標的テスターDNAが
自己アニールするのを阻害するのに対して標的DNAが自
己アニールするのを阻害しないことから、全テスターDN
Aに比べて標的DNAにおける実質的な富化が存在する。
このとき、２本鎖の自己再アニールしたテスターアン
プリコンは、少なくとも約５サイクル、頻繁には10サイ
クル、又通常は約40サイクル以下、好ましくは約30サイ
クル以下が関与する従来のポリメラーゼ連鎖反応の下で
増幅される。この増幅をほぼ中間で中断させることもで
き、適切なヌクレアーゼを用いて一本鎖DNAを分解させ
ることができる。さまざまなヌクレアーゼ、特に緑豆ヌ
クレアーゼを利用することが可能である。
このとき、結果として得られた２本鎖DNA混合物を、
テスターDNAからのアダプターを除去する制限エンドヌ
クレアーゼを用いて消化することができる。サイズ毎の
分離を可能にするあらゆる適切な手段を用いて、アダプ
ター配列からテスターDNAを分離することが可能であ
る。適切には、ゲルろ過又はゲル電気泳動を利用するこ
とができる。このとき、アンプリコンは、第１のつまり
先行したセットとは通常異なるものである第２のアダプ
ターセットに連結され、余剰のドライバーアンプリコン
の存在下での溶融、アニーリング、張出しでの充てん及
びPCR増幅のサイクルが反復される。後のサイクルは先
行するアダプターに依存する可能性がある。当該プロセ
スにおいては、このサイクルを１回以上反復することが
でき、通常少なくとも２回のラウンドつまり反復があ
り、約６ラウンド以下、通常は２〜４ラウンドで充分で
ある。
各研究について異なる制限エンドヌクレアーゼが利用
される場合、往々にしてこのプロセスを１回以上行なう
ことが有利である。このようにして、異なるアンプリコ
ンが得られることになり、異なる情報を得ることが可能
である。このプロセスの用途に応じて、別々のアンプリ
コン調製において２つ以上の制限エンドヌクレアーゼを
利用することができる。同様に、異なる制限エンドヌク
レアーゼを用いて得られたプローブを比較してそれらか
重複するか、近接するゲノミックDNA配列に結合する
か、同じ遺伝子又は多型性領域の一部を成しているかな
どということを決定することもできる。
このプロセスを実施するにあたっては、最初のラウン
ドは主として減法による。それに続くラウンドは、運動
による富化の成分が大幅に増大する。例えば、標的DNA
がテスターDNAとの関係において等モルである場合（す
なわち単一コピー）、及びテスターアンプリコンに対し
てＮ倍の余剰でドライバーアンプリコンがとられる場
合、ドライバーアンプリコンの事実上完全な再アニーリ
ングを仮定すると、標的は最初のラウンドの後Ｎ倍富化
されることになる。第２ラウンドの後、標的は、減法成
分による率を乗じたN2だけ富化されることになり、第３
回目の後は、少なくともその２乗だけ富化される。Ｎが
50である場合、第２ラウンドの終りで、標的は約104だ
け富化され、第３ラウンドの終りでは約108だけ富化さ
れる。一般に、唯一回の減法サイクルは、Ｎをテスター
アンプリコンに対するドライバーアンプリコンのモル余
剰としｆが再アニールするドライバーアンプリコンの分
画であるものとしておよそfNの標的富化を生み出すと予
測することができる。
結果として得られる標的DNAつまり差異産物はさら
に、DNA配列間の差異を構成するプローブについて富化
することができる。適切には、配列をクローニングし、
その後、テスター及びドライバアンプリコンに対する相
補を見極めるべくサザンブロット又はその他の技術を用
いてスクリーニングすることができる。テスターアンプ
リコンに対しハイブリッド形成するがドライバアンプリ
コンに対してはハイブリッド形成しないクローンをこの
ときさらに使用することができる。
ドライバDNAとは異なるテスターDNAゲノム上の部位を
同定するためのプローブとして、結果として得られた標
的DNAを使用することができる。この用途のためには、
これらにさまざまな方法で、例えば放射性標識、ビオチ
ン、螢光剤などを用いて標識付けを行なうことができ
る。望ましくは、各々の標的アンプリコンの実質的に均
質な組成を得るためには、原核生物宿主内でのクローニ
ングを目的として適切なクローニングベクター内に挿入
することによって、標的アンプリコンをクローニングす
ることができる。望ましい場合には、クローニングされ
たDNAを配列決定して、標的DNAの性質を決定することが
できる。代替的には、クローニングされたDNAを上述の
とおりに標識付けして、標識DNAを支持するライブラリ
ー内のフラグメントを同定するためのプローブとして使
用することが可能である。標的DNAは、２つのDNA供給源
の間に存在しうる差異を同定するのに利用できる。
標的DNAに対する複数のプローブが得られる場合、こ
れらは真正プローブとして立証されるまで推定プローブ
と呼ぶことができる。適切にも、配列をクローニングさ
せて、次にテスター及びドライバーアンプリコンに対す
る相補を見極めるためサザンブロット又はその他の技術
をもちいてスクリーニングすることができる。かくし
て、プローブ群は、ドライバー及びテスターの両方のDN
Aに対しハイブリッド形成するハイブリッド形成配列を
含むことができる。ドライバー及びテスターアンプリコ
ンに対してプローブをハイブリッド形成、例えばサザン
ハイブリッド形成することにより、ドライバーDNAとテ
スターDNAの区別をしないような推定プローブを迅速に
見極めることが可能である。推定上のプローブがドライ
バー及びテスターアンプリコンの両方に結合する場合、
プローブを廃棄することができる。テスターアンプリコ
ンに対しハイブリッド形成するもののドライバアンプリ
コンにはハイブリッド形成しないクローンは、このと
き、さらに使用することができる。このスクリーンは、
少なくとも５つ、さらに一般的には少なくとも10個の推
定プローブが得られる場合に、特に有用である。
血統分析において、当該プロセスは、家族の１人の構
成員の中に存在するもののもう１人の構成員には存在し
ない配列を規定するのに使用することができる。このよ
うにして、このとき、家族のその他の構成員を、彼らが
同じDNAをもつか又はそれらが欠如しているかについて
比較することが可能である。これは、２つの個体、１つ
の供給源又は個体から得られた試料などの間の関係に関
心がある場合などの法医学において使用することができ
る。
当該方法は同様に、１つのゲノムからの増幅されたDN
Aの中に存在し同一の生体からの異なるゲノムからの増
幅DNA内には存在しない多型性制限エンドヌクレアーゼ
フラグメントとして作動的に構成されているPARFと呼ぶ
ことのできる遺伝子多型のためのプローブのライブラリ
を構成するためにも使用することができる。例えば、ド
ライバーDNAからの両方の対立遺伝子の中にテスターDNA
内の短かいBamH Iフラグメントをフランキングする２つ
のBamH I部位のうちの１つが欠如し、ドライバー内に大
きいBamH Iフラグメントのみを導いている場合、テスタ
ーの短かいBamH IフラグメントはそのBamH Iアンプリコ
ンの中にのみ存在し、ドライバのBamH Iアンプリコンの
中では欠如することになる。かくして、制限フラグメン
トは直接、２つのゲノムを区別することになるプローブ
を導き出すことになる。
アンプリコンがクローニングされる場合、個々にピッ
クアップされたクローンには実質的な重複性が存在しう
るということも認識すべきである。従って、異なるプロ
ーブを選択する効率は、増幅効率の変動又は方法論中に
組み込まれたその他の人為構造の結果としてもたらされ
るものでありうる、クローニングに先立って混合物中に
アンプリコンが存在した頻度に実質的に存在して変動す
ることになる。
当該方法は、感染を受けている疑いのあるDNAを感染
を受けていないと思われるDNAと比較することができる
状態で、病原体のためのプローブを分離するために使用
することができる。例えばＴ細胞及びマクロファージに
とってのHIV又は肝臓にとってのＢ型肝炎ウイルスとい
った特定の細胞型又は組織に対して屈性をもつウイルス
に関心があるとすると、そのウイルスが屈性をもつ感染
の疑いのある供給源からの組織及び同じ個体内のかかる
ウイルスが存在するはずのないもう１つの部位からの組
織をとることができる。プロセスを実施することによっ
て、細胞供給源の適切な選択によりその他のいかなる差
異も予期されないことから、そのウイルスに特異的であ
るプローブが得られるはずである。
ウイルスならびにその他の状況に対しても応用するこ
とができると思われる当該プロセスの制限条件は、標的
DNAを支持する個体群が、テスターDNAを誘導させる細胞
の合計数のうちの適正な割合を占めていなければならな
いという点にある。上述のとおり、組込まれた病原性DN
Aの存在に関心がある場合、組織内でこれらの細胞のわ
ずかな割合だけが感染を受けている可能性がある。従っ
て減法及び運動による富化に先立って、全てのテスター
配列の濃度を等化するためには、テスター配列を正規化
することが望まれる可能性がある。（Patanjali et a
l.,Proc Natl.Acad.Sci.USA 88,1943（1991））。
病原体の発見に対するRDAの応用には、望ましくは、
感染を受けた及び受けていないDNA供給源からの多型の
入念な整合が必要とされる。個体が遺伝的モザイクでな
い場合、同じ個体からテスター及びドライバーDNAを誘
導させることができる。これらのDNAは、関係の無い個
体に由来していてはならない。というのもそれらのDNA
内の豊富な多型性差異が病原体の検出を不明確にするか
らである。しかしながら、感染を受けていないDNA供給
源（ドライバ）は、原則として同一の双生児から来るか
又は感染を受けた個体の両親からのプールされたDNAで
ありうる。これは、感染を受けた個体のゲノミックDNA
内で発見されるDNA制限フラグメントのほぼ全てが少な
くとも１つの親DNAの中に存在しうると期待できるから
である。
当該方法は同様に、ガン細胞内で発生するゲノミック
変性を検出するためにも応用できる。これらは次の３つ
の全く異なるタイプのものでありうる：すなわち、異型
接合多型全体にわたり広がる欠失又は遺伝子変換から発
生しうるような制限エンドヌクレアーゼフラグメントの
喪失という結果をもたらすもの；点突然変異又はゲノム
再配列から結果としてもたらされうるような新しい制限
エンドヌクレアーゼフラグメントを産生するもの；及び
通常１つの遺伝子を取り込むDNAの増幅を結果としても
たらすもの。２番目と３番目のケースにおいは、RDA
は、テスターとしてガン細胞からのDNAを又ドライバー
として正常なDNAを使用して、修正無しで応用すること
ができる。しかしながら、ガン生検における正常な間質
（ストローマ）の存在は、ガン細胞内の遺伝子情報の喪
失の検出を妨げる可能性がある。従って、第１のケース
におけるテスターのための供給源として、物理的分離に
よって得られた高度に精製されたガン細胞又はガン細胞
の培養のいずれも必要とされない。
これらの制約条件は、ゲノム再配列の検出にはあては
まらない。転座、挿入、逆位及び欠失を含むゲノム再配
列は、再配列の部位を橋かけする新しい制限エンドヌク
レアーゼフラグメントを作り出す結果となる。これらの
橋かけフラグメントのいくつかは増幅可能でありうるの
に対し正常なDNA内でそれらが由来したフラグメントの
少なくとも１つは増幅不可能である。かかる橋かけフラ
グメントは、腫瘍からのDNAがテスターアンプリコンの
調製のために使用され同じ個体の正常な組織からのDNA
かドライバーアンプリコンの調製のために使用される場
合、RDAによって発見可能である。
ゲノム再配列により作り出された異なるサイズの制限
エンドヌクレアーゼフラグメントをもう１つの方法で開
発利用することができる。腫瘍のDNA消化物からの分画
されたサイズ等級は時として、正常なDNAからの比較可
能なサイズ等級の中に存在しない配列を含むことにな
る。前者をテスターとして後者をドライバーとして使用
することにより、第２の制限エンドヌクレアーゼでの分
割後にアンプリコンを調製し、遺伝子再配列点の近くに
おいて増幅可能な制限エンドヌクレアーゼフラグメント
をクローニングする目的でRDAによりこれらを比較する
ことができる。上述の方法のいずれかを用いると、腫瘍
細胞の間に正常な細胞が存在することによって、再配列
のためのプローブの検出が不明確になることはなくな
る。
最後の状況すなわちDNA増幅においては、増幅の検出
は、RDAの間の運動による富化の結果であると思われ
る。発ガン遺伝子の増幅は、予後の不良を表わすことが
分かっているため、増幅された配列を検出できるという
ことをガンの経過予想において応用することが可能であ
る。
RDAを異なる個体に応用すると、先にPARFとして言及
した１つのタイプの多型の収集物を生み出すことにな
る。かくして、予め広範な分子遺伝子特徴づけを受けて
いない種についてのみならず、ヒトやマウスといった周
知の種についても新たな多型セットを生成させるのにRD
Aを用いることが可能である。PARFは最も頻繁に２元性
多型を検出することから、これらは、遺伝的型別のため
に標準化されたフォーマットと共に用いることのできる
プローブの一団として役立つ可能性がある。
さらにもう１つの利用分野においては、RDAは、常染
色体性優性遺伝性疾患を患う創立者グループからの個体
のDNA（テスター）の中には存在するものの正常なグル
ープからの個体のDNA（ドライバー）の中には存在しな
いPARFのためのプローブを生み出すことができる。換言
すると、RDAは、正常な個体のDNA（テスター）の中には
存在するものの劣性遺伝性疾患を患う創立者グループか
らの１個体のDNA（ドライバー）の中には存在しないPAR
Fについてのプローブを生み出すことができる。併発ク
ローニングのための方法論（Brooks及びPorteous,Nuc,A
cid Res.19,2609［1991］）と組合わせると、このよう
な応用は、優性遺伝子座と連鎖不平衡状態にある稀なPA
RF又は劣性遺伝子座と連鎖不平衡状態にある一般的なPA
RFの欠如についてのプローブの発見を加速することがで
きる。
多くの実験用動物及び植物においても、もどし交雑の
連続的生成により１つの特定の遺伝子が１つの遺伝子背
景からもう１つの遺伝的背景へと移されている共通遺伝
子系系統が存在する。かかる系統は、問題の遺伝子をと
り囲む比較的小さい領域において以外、遺伝的に同一で
ある。この領域は、標準的には標的遺伝子までの染色体
歩行を可能にするように充分小さいものの、当該方法論
のニーズにとって充分大きいものである。
当該方法論は、疾病可能性又は行動異常といった遺伝
的形質に遺伝的に結びつけられる多型の発見に対し、応
用することのできるものである。この目的で当該方法論
を利用するためには、テスター又はドライバーとして又
はその両方として使用するべく１つの個体グループから
のDNAのプールを使用することが望ましい。このような
形で使用された場合、この方法は、１つのグループの中
には存在してもう１つのグループの中には存在しない多
型性対立遺伝子を検出するプローブを生み出すことがで
きる。特に、かかるプールがドライバとして使用される
場合、ドライバープール内の全ての個体からテスターを
区別するプローブが制限エンドヌクレアーゼ多型につい
て得られる（「PARFs」）。プールがテスターとして用
いられる場合、この方法は、ドライバー個体からテスタ
ープールの少なくとも１つの構成員を区別するPARFを生
み出す。最も興味深い例においては、テスター及びドラ
イバーの両方が個体グループからのプールされたDNAで
ある場合、この方法は、ドライバーグループの全ての構
成員からテスターグループの少なくとも１つの構成員を
区別するPARFを生み出す。
プーリングはさまざまな状況において立証できる。１
つの利用分野では、そのプールされたDNAが標的遺伝子
の領域において同型接合であるもののゲノム内のその他
の場所では異型接合であるという特性をもつ子孫の収集
物を産生するため伝達遺伝学が用いられる。一例を挙げ
ると、２つの近交系が問題の標的座Ｌで異なっており、
１つの系統Ａが劣性対立遺伝子（ａ）を有しもう１つの
系統Ｂが優性対立遺伝子（a+）を有している場合、テス
ターとして系統Ｂを用いることができ、一方ドライバー
については系統間のF2交雑を行ない、劣性表現型を示す
ｋ後代を選択し、それらのDNAを一緒に混合する。当該
方法を利用する場合、Ｂ対立遺伝子は、Ｌのまわりの領
域内を除いてゲノム内のあらゆる場所で減法されなくて
はならない。
遺伝子座Ｌが２つのフランキング遺伝標識Ｘ及びＹの
間で遺伝的にマッピングされた場合、この方法のターゲ
ティングをさらに改善することができる。ドライバーに
ついては、Ｘ及びＬの間で乗換えが起った1/2k後代及び
ＬとＹの間で乗換えが起った1/2k後代を選択することが
でき、こうしてＢ対立遺伝子の割合がＸ及びＹで25％で
あることが保証されることになる。又こうして全体にわ
たりＢ対立遺伝子の割合が非常に低い領域が、Ｘ−Ｙの
間隔に確実に制限されることになる。
プールは、DNA供給源に応じてさまざまなサイズのも
のであってよい。哺乳動物及び植物のゲノムといった大
きいゲノムから、８つ、通常は10個以上で一般的には50
個以下、通常は約20個以下の異なる供給源のプールを一
般に利用することができる。
その他の利用分野では自然発生的な生殖細胞系ゲノム
再配列が関与する可能性がある。このような感染を受け
た個体のゲノムは、いずれの親にも存在しない制限エン
ドヌクレアーゼフラグメントを含むことになる。この状
況は、前述のガン細胞内で起こる遺伝的再配列に類似し
ている。
当該プロセスが適切に作動したことを確認するため、
通常は、テスター及びドライバーアンプリコン内での存
在又は不在について差異産物候補（標的DNA）をテスト
することが望まれる。同様に、関心の的となるのは、テ
スターを汚染する可能性があるもののドライバー内に存
在しないフローラの存在であろう。遺伝的モザイク現象
は同様に当該方法論を妨げることになる。しかしながら
さまざまな情況の下で、当該方法は、多様な事象の結果
としての２つのゲノム間の差異を分析するために使用す
ることのできる配列を効率良く提供することだろう。
以下の実施例は、制限的な意味をもたずに一例として
示されるものである。
実験 アンプリコンの調製：リンパ球株DRL484（Baylor Col
legeのT.Caskey氏の提供による）から精製した高分子DN
A10μｇを用いてドライバーアンプリコンを調製し、等
モル量の標的（アデノウイルス−2 DNA120pg及び／又
は、λファージDNA160pg。いずれもNew England Biolab
sより入手）を含有する同一DNA10μｇを使用してテスタ
ーアンプリコンを調製した。テスター及びドライバーDN
Aをともに制限エンドヌクレアーゼ（New England Biola
bs）で消化し、各DNA消化物１μｇをT4DNAリガーゼ緩衝
液（New England Biolabs）30μｌ中で0.5nmolの24−me
r及び12−mer非リン酸化オリゴヌクレオチド（セット
１。表１参照）と混合した。
それぞれプライマーセット１（Ｒシリーズ）は代表物
として用い、セット２（Ｊシリーズ）及び３（Ｎシリー
ズ）は奇数及び偶数ハイブリダイゼーション／増幅とし
て用いる。OLIGOコンピュータープログラム（National
Biosciences）を用いて強力な二次構造の非存在に関し
てオリゴヌクレオチド設計を点検した。
混合物を１時間に50℃から10℃に漸次冷却することに
よりオリゴヌクレオチドをアニーリングし、次いで16℃
で400UのT4 DNAリガーゼを用いた一夜インキュベーショ
ンによりヒトDNA断片を結紮した。結紮後、テスター及
びドライバーDNAサンプルをともに増幅した。ドライバ
ーアンプリコンの調製のために使用した10本の試験管及
びテスターアンプリコンの調製用の２本の試験管の各々
は、400μｌの容量中に:67mMのTris−HCl,25℃でpH8.8,
16mMの（NH4）2SO4,10mMのβ−メルカプトエタノール、
100μg/mlのウシ血清アルブミン、（各々）200μＭのdA
TP,dGTP,dCTP及びdTTP,1μＭの24−merプライマー及び
結紮アダプターを伴う80ngのDNAを含入した。試験管を
サーマルサイクラーThermalcycler（Perkin Elmer Cetu
s）中で72℃で３分間インキュベートし、15UのTaqポリ
メラーゼ（Amplitaq,Perkin Elmer Cetus）を加え、反
応物に鉱油を上塗りして５分間インキュベートし、結紮
アダプターの5'突出端を充填し、20サイクル（各サイク
ルは95℃で１分間及び72℃で３分間のインキュベーショ
ンを含み、最終サイクル後に72℃で10分間伸長）の間増
幅した。増幅後、ドライバー及びテスターアンプリコン
をともに同一制限エンドヌクレアーゼ（10U/μｇ）で消
化してアダプターを切り離した。10μｇのテスターアン
プリコンDNA消化物を２％ NuSieveアガロース（低融
点。FMC Bio Products）を通して電気泳動処理し、DNA
断片（150〜1500bp）をアガローススライスの融解及びQ
iagen−tip20クロマトグラフィー（Quiagen Inc.）後に
回収してアダプターを除去した。ハイブリダイゼーショ
ン及び増幅の第一ラウンドに備えて、これらの断片を新
組のアダプターに結紮した。
DNAのハイブリダイゼーション及び増幅工程：アダプ
ターと結紮したテスターアンプリコン0.5μｇ及びドラ
イバーアンプリコンDNA40μｇを混合し、エタノール沈
殿させて、３×EE緩衝液（Straus and Ausbel,Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA 87,1889（1990））４μｌ中に溶解し、
30μｌの鉱油（Perkin Elmer Cetus）を上塗りした。熱
変性後、5MのNaCl溶液１μｌを加え、67℃で20時間DNA
をハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション終了時
に、その結果生じたDNAの1/10部をプライマーを含有し
ないPCR混合物400μｌ中のTaqポリメラーゼ15Uとともに
インキュベート（72℃で５分間）して再アニール化テス
ターの末端を充填し、次いでテスターが結紮される同一
24−merオリゴヌクレオチド付加後10サイクル間（95℃
で１分間、70℃で３分間、次いで最終ラウンドの間10分
間伸長）増幅した。供給元の推奨通りに400μｌの容量
中の20Uの緑豆ヌクレアーゼ（New England Biolabs）と
共に30分間インキュベーションし、その後50mM Tris−H
Cl,pH8.9中にサンプルを溶解して５倍希釈液とし、酵素
を熱不活性化（95℃で５分間）して、増幅後に認められ
た一本鎖DNA分子を分解した。緑豆ヌクレアーゼ処理前
と同じ条件下で15〜20サイクルの間、溶液40mLを増幅さ
せた。増幅DNA（３〜５μｇ）を原制限エンドヌクレア
ーゼで消化し、消化物200ngを第三アダプター組に結紮
した（表１参照）。50〜100ngのこのDNAを40ngのドライ
バーアンプリコンと混合し、第一サイクルの場合と同様
にハイブリダイゼーション及び増幅手順を反復した。第
二ハイブリダイゼーション／増幅工程後に得られた消化
物200ngを次に第二組のアダプターに結紮し、この物質1
00〜400pgをドライバーアンプリコン40μｇと一緒に第
三ラウンドのハイブリダイゼーションに用い、20〜25サ
イクル緑豆ヌクレアーゼ消化後に最終増幅した。第三組
のアダプターに結紮された第三ラウンドからの物質5pg
を用いてそれをドライバーアンプリコン40μｇと混合し
た後、第四ハイブリダイゼーション／増幅工程を実施し
た。
実施例1:標的として付加したウイルスDNAによる代表的
差異分析 １回コピーレベルのアデノウイルス及び／又はバクテ
リオファージλ DNAをヒトDNAに付加してモデルテスタ
ーを作り、ドライバーとしてウイルスDNAを有しない同
一ヒトDNAと一緒に用いた。標的としてアデノウイルス
及びλ DNAを有するヒトDNAからのBgl II又は標的とし
てλ DNAを有するHind IIIアンプリコンを調製した。Bg
l IIアンプリコンに関しては、アガロースゲル電気泳動
によって立証されたように、λ及びアデノウイルス小断
片が主な差異生成物であった。これは出発物質の＞５×
105倍の濃縮を、そしてアンプリコンの約４×105倍の濃
縮を示した。
Hind IIIアンプリコンからの濃縮は有効とは認められ
なかった。λHind III断片はプロットハイブリダイゼー
ションにより立証されるように第三ラウンド後に非常に
濃縮されたが、しかし依然として均質にはならなかっ
た。第四ラウンド後、予期された標的断片はほぼ均質に
精製された。Hind III制限エンドヌクレアーゼ及びBgl
II制限エンドヌクレアーゼを用いた場合の差異は、Hind
IIIアンプリコンの配列の複雑性がより大きいことに関
連があると思われる。ドライバーの複雑性が非常に高い
場合は、負の及び動的濃縮は低減し、競合工程が優位を
占める。競合工程はテスター中の有効増幅反復配列の出
現を伴う。
実施例2:2個体からのDNAの代表的差異分析 ヒトリンパ芽球細胞培養GM05901及びGM05987からそれ
ぞれドライバー及びテスターアンプリコンを調製した
（Amish Pedigree 884,Human Genetic Mutant Cell Rop
ository,Camden,NJ）。BamH I,Bgl II又はHind IIIで切
断後にアンプリコンを調製した。上記のようにアンプリ
コン間の差異生成物を得て、ゲル電気泳動によりサイズ
分別した。各場合に、別々のしかし複雑なパターンが観
察された。３回ハイブリダイゼーション／増幅後、差異
生成物をプラスミド中にクローニングした。各差異生成
物に関しては、プロットハイブリダイゼーションのため
に３つのプローブを選んだ。それらはすべてアマン派一
族データ内では多形性であることが判った。BamH I差異
生成物を最も詳細に分析した。
アマン派の７家系のリンパ芽球細胞培養GM05901（ド
ライバー）,GM05987（テスター）,GM05918,GM05961,GM0
5963,GM05993,GM05995（カラムＡ〜Ｇ）、５つの異なる
胎盤（カラムＨ〜Ｌ）、白血病患者の生検から確立され
た３つのリンパ芽球細胞株（カラムM,N,O）、並びにDMD
患者の生検から確立された２つの繊維芽細胞培養DRL 48
4及びDRL 569（T.Caskey,Baylor Collegeの提供によ
る）（カラムP,Q）からのDNAからBamH Iアンプリコンを
調製し、GeneScreen膜に移して指示されたプローブに対
してハイブリダイズした。“％”は指示クローンに対し
てハイブリダイズされた３回のハイブリダイゼーション
−増幅工程後にクローン化された差異生成物のBamH I P
ARF集合体中のクローンのパーセントを示す。“＋”
は、小BamH I PARF対立遺伝子がサンプル中に存在した
（即ちプローブがアンプリコン中の正しいサイズの帯に
対してハイブリダイズした）ことを意味する。“−”
は、小対立遺伝子が検出されなかったことを意味する。
実際のデータのサンプルに関しては図3Cを参照。PARFs
とハイブリダイズしている対立遺伝子の長さは、判って
いる場合には示してある。“ND"は測定しなかったこと
を意味する。
(a)2つの異なる小対立遺伝子がヒト集団で見出され
た。
(b)2つの異なる大対立遺伝子がヒト集団で見出され
た。
20の無作為選択クローンのうち、過剰物除去後に12の
独特のクローンが残存し、これらの９つからの挿入物
を、家系のテスター、ドライバー及び他の成員（アマン
派家系884からのGM05918,GM05987（テスター）,GM05901
（ドライバー）,GM05961,GM05963,GM05993及びGM0599
5）のサザンブロットにおけるプローブとして用いた。
全プローブがテスター中の小BamH I断片（表２、カラム
Ｂ）及びドライバー中の大BamH I断片のみ（表２、カラ
ムＡ）を検出した。各プローブに関するブロットハイブ
リダイゼーションパターンはメンデルの遺伝パターンと
完全に一致した。結果は、制限エンドヌクレアーゼ断片
多形現象に関するプローブの集合体が２つの関連個体間
で得られることを示した。
上記の実験から得られた各BamH Iプロープを、本家系
からのアンプリコン及び細胞株又は胎盤から抽出された
他の10種類の非関連ヒトDNAに対するブロットハイブリ
ダイゼーションにも用いた（表２）。本方法と全ゲノム
DNAのサザンブロッティングとの間の完全一致が見出さ
れた。これらの結果は、アマン派家系内の多形現象を検
出するプローブがヒト集団中の多形現象をも十分に検出
するという結論を支持する。前記のようにこれらの多形
現象はPARFs（多形性増幅性制限エンドヌクレアーゼ断
片）と呼ばれる。
PARFsのためのプローブは、異なる生成物中で等しく
十分にあるというわけではない。これらの不等性の測定
値を得るために、各クローン化BamH I PARFを２つの同
胞の差異生成物からの個別に無作為に選択した90クロー
ンのグリッドに対してハイブリダイズさせ、集合体中の
その頻度を確定した（表２中のパーセント値参照）。計
90の無作為選択要素から、20の明白な多形性プローブが
認められただけであった。
プロトコールは２つのほぼ等しいゲノム間の少数の差
異の検出のために企画されたということに留意すべきで
ある。多形性遺伝子座のためのプローブを慎重に捜す場
合、ハイブリダイゼーション／双幅のラウンド数を減少
し、代表物の複雑性を増大し、及び／又はPCRサイクル
の総数を低減することによりより代表的差異生成物が生
じ得る。
＊＊＊ 以下は、別記した場合を除いて、下記の実施
例に用いた典型的プロトコールである。
差異分析プロトコール I.アンプリコンの調製 a.ドライバー及びテスターDNA 10μｇを代表として選択
した制限酵素で消化した、10U/μｇの高分子DNAを得
る。
b.等容量のフェノール及びフェノール／クロロホルムで
抽出する。
c.NaOAcを加えて最終濃度を0.3Mとし、EtOH沈殿させ
て、70％EtOHで洗浄して、真空乾燥し、0.1mg/mlで再懸
濁する。
2.オリゴヌクレオチドの精製 a.Sep−Paqカートリッジ（Waters,Millipro）を5ml注射
器に取り付けてそれを10mlのアセトニトリル及び10mlの
水で洗浄する。
b.2mlの水中に溶解ました20 OD260のオリゴヌクレオチ
ドを載せて、10mlの水で洗浄し、60％MeOHで溶離し、Ep
pendorf試験管中に７分画を収集する（各試験管当たり
３滴）。
c.λ＝260nmで200倍希釈液のDNA濃度を測定し、分画を
含有するDNAを併合（約500μｌ）して、親液化により20
0〜300μｌまで濃縮する。
d.1/10容量の3M NaOAcの付加後EtOH沈殿（４容量のEtOH
を使用）させて、100％EtOHで洗浄し、乾燥して、62pmo
l/μｌ（24−merに関しては12 OD260/ml,12−merに関し
ては6 OD260/ml）で再懸濁する。
3.アダプターの結紮 a.混合物:20μｌ（２μｇ）のドライバー又はテスターD
NA消化物。
15μｌの各12−mer及び24−mer（プライマー
セット１）。
４μｌのddH2O。
６μｌの10xリガーゼ緩衝液。
b.オリゴヌクレオチドをアニーリングするために、50〜
55℃に加熱中のブロック（Termoline DriBath、穴をグ
リセロールで充填する）中に試験管を入れ、次いで温度
が10〜15℃に下がるまで、ブロックを室温に約１時間置
く。
c.試験管を氷上に３分間置いて、２μｌ（400U/μｌ）
のT4 DNAガーゼを付加し、12〜16℃で一夜インキュベー
トする。
4.PCR a.940μｌのTE（10mMのTris−HCl,pH8.0/1mM EDTA）＋t
RNA（20μg/ml）緩衝液を各結紮に加えて希釈液を作
る。
b.テスターアンプリコンの調製のためにPCRミックスの
試験管２本、及びドライバーアプンコンの調製用試験管
10本を用意し、各々以下のものを含有する： 80μｌの５×PCR緩衝液（335mM Tris−HCl,25℃でpH
8.8,20mM MgCl2,80mM（NH4）2SO4,50mM β−メルカプト
エタノール,0.5mg/mlのウシ血清アルブミン）。
32μｌの追跡溶液（各々4mMのdATP,dGTP,dCTP,dTT
P）。
８μｌの24−merオリゴヌクレオチド（プライマーセ
ット）。
240μｌのddH2 c.各試験管中のDNA結紮物希釈液（80ng）40μｌを加
え、試験管を72℃でThermocycler（Perkin Elmer Cetu
s）に入れる。
d.結紮化アダプターの5'突出端を充填するために、各試
験管に３μｌ（15U）のAmpli Taq DNAポリメラーゼを加
え（Aerosol Brrter Pipet Tips使用）、混合して、110
μｌの鉱油を上塗りし、５分間インキュベートする。
e.20サイクルの間増幅（95℃で１分間、72℃で３分間）
し、最終サイクル後、72℃で10分間伸長する。
5.アンプリコンの制限 a.鉱油を除去し、Eppendorf試験管の２本のPCR試験管の
各々の内容物を併合し、600μｌのフェノール及びフェ
ノール／クロロホルムで抽出する。
b.1/10容量の3M NaOAc及び等容量のイソプロパノールを
加え、氷浴中で15分間インキュベートし、攪拌して、洗
浄し、乾燥する。0.2〜0.4mg/mlの濃度でTE中にドライ
バー及びテスターアンプリコンを再懸濁（１本のPCRの
試験管から10〜20μｇのDNAアンプリコンが期待され
る）し、EtdBr溶液（２μg/ml）を用いてDNA濃度を調べ
る。
c.アダプターを切断するために最初に選択した制限エン
ドヌレアーゼでドライバーDNA（200μｇ）及びテスター
DNA（20μｇ）をともに消化し、上記のように抽出し
て、イソプロパノール沈殿させる。
d.約1mg/mlでTE中にドライバーアンプリコンDNA消化物
を、0.2〜0.4mg/mlでテスターアンプリコンDNA消化物を
再懸濁する。EtdBr蛍光およびアガロースゲル電気泳動
によりドライバー及びテスターDNA濃度を測定する。ド
ライバーDNA濃度を0.5mg/mlに、テスターDNA濃度を0.1m
g/mlに調整する。
6.テスターアンプリコン上のアダプターの変化 a.10μｇのテスターアンプリコンDNA消化物を２％NuSie
veアガロースゲル（低融点。FMC Bioproducts）上に載
せる。
b.断片を含有するアガローススライス（0.2〜0.4g）を1
50〜1500bpの長さに切断し、それを5ml Falcon試験管中
に入れる。0.4mlの0.5M MOPS pH7.0,0.4mlの5M NaCl及
び3mlのddH2Oを加える。
c.混合し、加熱ブロック中で72℃10分間融解し、この工
程をもう一回反復する。
d.供給元の推奨通りにQiagen−tip20（Qiagen Inc.）に
温溶液（30〜50℃）を通して、溶解し、DNA物質を沈殿
させる。TE緩衝液30μｌ中にDNAペレットを溶解し、Etd
Br蛍光によりDNA濃度を調べて、0.1mg/mlに調整する。
e.上記のように２μｇの精製テスターDNAアンプリコンD
NA消化物をプライマーセット２に結紮し、TE＋tRNAで10
μg/ml（Hind III代表物に関しては25μg/ml）まで希釈
する。
II.DNAハイブリダイゼーション／増幅工程 1.ハイブリダイゼーション１ a.80μｌのドライバーアンプリコンDNA消化物（0.5mg/m
l）及び40μｌの希釈テスターアンプリコン結紮物（大
半の６つのカッターで作った代表物に関しては0.4μg,H
ind III代表物に関しては１μｇ）を混合し、フェノー
ル／クロロホルムで１回抽出する。
b.30μｌの10M NH4OAc及び380μｌ（2.5容量）のEtOHを
加え、−70℃で10分間冷却し、37℃で２分間インキュベ
ートし、攪拌して、70％EtOHで２回洗浄し、乾燥する。
c.2分間攪拌しながら４μｌのEE×３緩衝液（Simga社か
らの30mM EPPS,20℃でpH8.0,3mM EDTA）中にペレットを
再懸濁し、サンプルを底まで攪拌して、35μｌの鉱油を
上塗りする。
d.加熱ブロック中で98℃で３〜４分間DNAを変性させ
て、注意深く5M NaCl 1μｌをDNA滴に加え、67℃で20時
間インキュベートする。
2.選択的増幅 a.油を除去し、tRNA溶液（5mg/ml）８μｌを加え、混合
して、TE緩衝液390μｌを加えて再び混合する。
b.アダプター端を充填するために、360μｌのPCR混合物
（上記）を有するが24−merプライマーは含まない試験
管２本を用意する。各試験管に40μｌのハイブリダイズ
化DNA希釈液を加え、72℃のThermocycler中に入れ、３
μｌのAmpliTaq DNAポリメラーゼを加えて、混合し、５
分間インキュベートする。10μｌの24−merプライマー
（セット２）を加え、混合して、鉱油を上塗りし、上記
のようにPCRの10サイクルを実行する。J Bgl24プライマ
ーに関しては、より低いアニーリング温度（70℃）を要
する。
c.上記のようにフェノール及びフェノール／クロロホル
ム抽出し、イソプロパノール沈殿させて、各試験管中の
ペレットを20mLのddH2Oに溶解し、併合する。
d.20μｌの増幅差異生成物１をとり、20μｌの２×緑豆
ヌクレアーゼ緩衝液及び２μｌの緑豆ヌクレアーゼ（10
U/μl,NEB）を加えて、30℃で30分間インキュベートす
る。160μｌの50mM Tris−HCl,pH8.9を加え、98℃で５
分間インキュベーションにより酵素を不活性化する。J2
4−merプライマ−を含有するPCRミックス（360μｌ）を
有する２本の試験管を調製し、各試験管に40μｌのMBN
処理差異生成物を加えて、上記のようにPCRを15サイク
ル実施する。
e.2％アガロースゲル上で増幅物10μｌを処理し、DNAの
量（通常は0.1〜0.3μｇ）を概算して、収量を改善する
必要がある場合には、３μｌの新鮮なAmpliTaq DNAポリ
メラーゼ付加後にさらに２〜４サイクル実施する。
3.差異生成物上のアダプターの変化 a.上記のようにフェノール及びフェノール／クロロホル
ム抽出し、イソプロパノール沈殿させて、約0.2mg/mlで
ペレットを溶解する。EtdBr蛍光によりDNA濃度を調べ
て、0.1mg/mlまでに調整する。
b.差異生成物を選択した制限酵素（10U/μｇ）で消化
し、上記のように抽出してEtOH沈殿させ、洗浄し、乾燥
して、20ng/μｌで溶解する。
c.10μｌ（200ng）のDNA溶液をとり、上記のように容量
60μｌ中でアダプター３（プライマーセット３）に直接
結紮する。結紮差異生成物をtDNAを含有する100μｌ（H
ind IIIに関しては20μｌ）のTE緩衝液で1.25ng/μｌ
（Hind III代表物に関しては2.5ng/μｌ）まで希釈す
る。
4.その後のハイブリダイゼーション／増幅工程 a.二次ハイブリダイゼーションのために、40μｌ（50n
g）のアダプター結紮差異生成物（Hind III代表物に関
しては100ng）及び80μｌ（40μｇ）のドライバーアン
プリコンDNA消化物を混合する。上記のようにハイブリ
ダイゼーション／増幅工程を進行させる。
b.第三ハイブリダイゼーション／増幅工程のために、ア
ダプター２に結紮された10pgの差異生成物２（Hind III
代表物に関しては400pg）をとり、20（Hind III代表物
に関しては25）サイクルの間のMBN処理後に最終増幅を
行なう。
c.Hind III代表物に関しては、時折第四ハイブリダイゼ
ーション／増幅工程を要する。アダプター３に結紮され
る5pgの差異生成物３をとり、27サイクルの間増幅す
る。
III.差異生成物のクローニング及び分析 1.クローニング a.最終ハイブリダイゼーション／増幅工程後に10μｇの
差異生成物をとり、選択制限酵素で消化し、フェノール
及びフェノール／クロロホルムで抽出して、エタノール
沈殿させる。
b.得られたDNAを100μｌのTAE緩衝液中に溶解し、上記
のように２％低融点（LMP）ゲル電気泳動及びDNA精製を
実施する。
c.消化差異生成物を30μｌのTE緩衝液中に溶解し、濃度
を調べてアリコート（２〜５μｇ）をTE緩衝液を含有す
るtRNAで10ng/mlまで希釈する。
d.プラスミドベクター中で差異生成物を結紮するため
に、以下のものを混合する： １μｌの10xリガーゼ緩衝液。
６μｌのddH2O。
１μｌ（10ng）のゲル精製差異生成物DNA消化物。
１μｌ（40ng）の選択制限酵素で消化され、脱リン酸
化されたあらゆるpUC由来ベクター。
１μｌ（400U）のT4 DNAリガーゼ。
16℃で１〜３時間インキュベートし、TEを含有するtR
N A70μｌを加えて希釈する。
e.標準方法でコンピテントDH ５α細胞を形質転換す
る。アンピシリン、Ｘ−Gal及びIPTGを含有するLB寒天
上に置く。
2.クローン化挿入物のPCR増幅 a.各々100μｌの標準PCR混合物、並びにシーケンシング
及び逆シーケンシングプライマー（それぞれseq,24及び
rev.25。表を参照）（試験管当たり各々500pmol）を含
有するPCR試験管を調製する。
b.1つの白色細菌コロニーを各試験管中に選択して移
し、攪拌して、95℃で５分間Thermocycler中に入れる。
c.72℃に切り替えて温度を下げて、１μｌ（5U）のAmpl
iTaqポリメラーゼを加えて、混合し、鉱油を上塗りし
て、RCRを30サイクル実施し（95℃で１分間、72℃で３
分間）、72℃で10分間最終伸長を行なう。
d.5μｌのアリコートの２％ゲル電気泳動処理により増
幅断片の収量及びサイズを分析する。Qiagen−tip20ク
ロマトグラフィーにより選択DNA断片を精製し、イソプ
ロパノール沈殿させて、洗浄し、乾燥して30μｌのTE中
に溶解する。
e.EtdBr蛍光によりDNA濃度を測定する。プロットハイブ
リダイゼーションのために、TE緩衝液を含有するtRNAを
用いて１〜２μｇの各断片を10μg/mlまで希釈する。
実施例3:癌における遺伝子増幅を検出するDNAプローブ
を単離するためのRDAの適用 腫瘍DNAをテスターとして選択し、ヒトからの正常DNA
をドライバーとして選択した場合、RDAは、腫瘍DNA中の
増幅配列に対してハイブリダイズする差異生成物を生じ
た。これは予想外の結果、おそらくRDA中の動的濃縮の
結果である。ヒト癌における増幅配列を検出するプロー
ブは、このような配列の存在が通常は不十分な予後を示
すため、臨床的価値がある。例えば、Ｎ−myc又はNEU腫
瘍遺伝子の増幅はそれぞれ神経芽細胞腫又は乳癌に関す
る不十分な予後を示す。
差異生成物は、黒色腫細胞株からのDNA又は小細胞肺
癌細胞株からのDNAをテスターとして、個々のドナーか
らのDNAをドライバーとしてそれぞれ用いた場合に見出
された。黒色腫の第一、第二及び第三ラウンド減数に関
する差異生成物を電気泳動分離処理し、その結果を図１
の右手パネルのレーンa,c及びｅに示す。肺癌の第一、
第二及び第三ラウンド減数に関する差異生成物をレーン
b,d及びｆに示す。サイズマーカーはレーンｇにあっ
て、右に示した塩基対の長さを有する。黒色腫細胞株は
AH−Melであり、小細胞癌細胞株はA1770であった。差異
生成物のいくつかをゲノムプロットの核酸ハイブリダイ
ゼーションプローブとして又は種々の癌細胞株からの制
限エンドヌクレアーゼ切断ヒトDNAとして用いた場合、
それらは小細胞癌細胞株（上部パネル。図１の左側）又
は黒色種細胞株（中及び下部パネル。図１の左側）中で
増幅された配列を検出した。小細胞癌細胞株のRDA分析
から得られるプローブも、神経芽細胞種細胞株IMR−５
（上部パネル。左側）中の増幅配列を検出した。RDAプ
ローブを確定して、それらをNIGMSヒト遺伝子突然変異
体細胞貯蔵所Human Genetic Mutant Cell Repositoryか
ら得られた単一染色体ハイブリッド細胞＃２のパネルに
対してそれらをハイブリダイズすることにより、ヒト第
二染色体（小細胞肺癌）及び第三染色体（黒色腫）に対
してマッピングした。第三染色体上の増幅は従来記載さ
れていない。
次に、ドライバーDNAはテスターと同一個体から得ら
れる必要はないことを確定した。テスターとして黒色腫
細胞株殻のDNAを用い、ドライバーとして適合する個々
のドナー、不適合個体又は10名の不適合個体のプールか
らのDNAを用いて、RDAを実施した。ドライバーDNAを用
いても用いなくても、同一パターンの差異生成物が見出
された（図２参照）。したがって、テスター及びドライ
バーDNAは、テスター中に存在する増幅DNAを検出するプ
ローブを探索中である場合には、同一個体からドライバ
ーDNAをＬ必要はない。
実施例4:新規のウイルスを発見するためのRDAの使用 RDAを用いてヒト前立腺癌生検物を分析した。前立腺
癌の外科的生検物から抽出したDNAをテスターとして用
い、同一個体の正常組織からのDNAをドライバーとして
用いた。単一差異生成物を得て、シーケンシングした。
コンピューター分析は、この差異配列が、ラットゲノム
全体に散在して見出される反復配列の一員であるラット
LINE要素と最も密接に対応することを立証した（配列比
較のために図３参照）。この要素の極左手及び右手配列
から得られるオリゴヌクレオチドPCRプライマーを用い
て、種々のDNA中のその存在を立証した。その存在はラ
ットDNA、及びヒト前立腺癌の２つの異なる領域中で検
出されたが、しかし癌が発生したヒトの正常組織からの
DNA中には検出されなかった。したがって、ラットから
の遺伝情報は、おそらくウイルスの作用を介して、ヒト
組織中に見出された。この考え得るウイルスのDNA配列
は、挿入された要素からの“染色体歩行”により得られ
る。この癌の病因におけるこのウイルスの原因的役割が
推論される。
実施例5:癌における遺伝子病変を検出するプローブを単
離するためのRDAの使用 純粋な又はほぼ純粋な（＞90％）癌細胞からのDNAを
テスターとして用い、それぞれの患者の正常細胞からの
DNAをドライバーとして用いて、多数の差異生成物を得
た。これらの差異生成物は、Ｙ染色体上のヘテロ接合性
の次落、ヘミ接合性欠落、又は腫瘍DNA中のホモ接合欠
落を検出した。RNAからのプローブをヒト染色体に対し
てマッピングした。その結果を表３に要約する。テスタ
ーとして、患者＃758からの４つの異なる腎細胞癌細胞
株UOK114,UOK124,UOK132及びUOK112からのDNA並びに１
つの食道ガン生検物からのDNAを用いた。あるプローブR
CC124.1（表３の脚注ｄ）は、１つの別の腎癌細胞株及
び２つの膀胱癌細胞株中の第二染色体上のホモ接合性欠
落を検出した。さらにあるプローブRCC138.12（表３の
脚注ｅ）は２つの黒色腫で第九染色体上にホモ接合性欠
損を検出した。あるプローブBAR.6（表３の脚注ｆ）
は、いくつかの結腸癌細胞株から第三染色体上のホモ接
合性欠落を検出した。ホモ接合性欠落を検出するプロー
ブは、腫瘍抑制遺伝子をコードする遺伝子座を限定する
のに有用である。腫瘍抑制遺伝子の機能の欠落を検出す
る方法は、癌の臨床的類型化に有用である。
a.異なる挿入物サイズを有するクローン。
b.括弧内の記載事項（x/y/z）は、欠落のタイプによる
断片の分布を示す。この場合、ｘはホモ接合性欠落を検
出するプローブの数であり、ｙはヘテロ接合性の欠落を
検出する数、ｚはＹ染色体からのヘミ接合性欠落を検出
する数である。
c.プローブの染色***置で、x/・・・の場合はホモ接合
性欠落を検出するプローブの位置であり、/xはヘテロ接
合性の欠落を検出するプローブの位置である。NDは未確
定であることを意味する。
d.プローブRCC124.1は、膀胱癌細胞株におけるホモ接合
性欠落を検出する。
e.あるプローブRCC132.12は、黒色腫患者の第九染色体
上のホモ接合性欠落を検出した。
f.プローブBAR.6は、７つの結腸癌細胞株のうちの４つ
及び１つの膀胱癌細胞株におけるホモ接合性欠落を検出
する。
実施例6:個体のプールからのDNAの分析のためのRDAの適
用 ヒトにおける疾病の疑い又は行動異常といったような
遺伝形質と遺伝子的に連鎖する多形現象の発見のため
に、RDAを用い得る。このためRDAを利用するには、テス
ター、ドライバー又はその両方として用いるための一群
の個体からのDNAのプールを用いるのが望ましい。この
方法を用いる場合、RDAは、ある群には存在するが別の
群には存在しない多形対立遺伝子を検出するプローブを
産生し得る。特にこのようなプールをドライバーとして
用いる場合には、RDAはドライバープール中の全個体か
らテスターを識別する制限エンドヌクレアーゼ多形現象
のためのプローブ（PARFs）を産生する。プールをテス
ターとして用いる場合、RDAはドライバー個体からテス
タープールの少なくとも一員を識別するRARFsを産生す
る。最も挑戦的な例ではテスター及びドライバーの両方
が個体の群からのプールDNAである場合、RDAはドライバ
ー群の全員からテスター群の少なくとも一員を識別する
PARFsを産生する。
これを表４に説明する。ヒトの２つの群を選択した：
即ち遺伝的異常であり、バッテン病としても公知のニュ
ーロン性セロイドリポフスチン沈着症を共有した10名と
この症状を有さなかった10名であった。各個体の細胞か
らDNAを調製し、適宜プールした。テスターとして一群
からのDNAを用い、ドライバーとして他の群からのDNAを
用いるRDAのためにDNAのプールを用い、次いでその逆の
手順を実施した。各々の場合に、PARFsを検出する差異
生成物を得た。表４には、プローブ名を列挙し、“＋”
はそれが指定個体におけるPARFの小対立遺伝子を検出す
ることを意味する。表に示すように、テスターとして正
常個体を用いた場合は、その群の少なくとも一員におい
て小PFRF対立遺伝子を検出するプローブ（pA1,pA2,pA4
及びpA9）が得られ、この対立遺伝子はバッテン病患者
では常に不在であった。同様に、罹患群からのDNAをテ
スターとして用いた場合は、罹患群の少なくとも一員に
おいて小PARF対立遺伝子を検出するプローブ（pN2,pN7,
pN9,pN13及びpN15）が得られ、この対立遺伝子は正常群
では常に不在であった。
実施例7:RNA集団における差異を反映するプローブを得
るに際してRDAの使用 RDAを適用してRNA由来の二本鎖cDNAの集団を比較する
ことができる。差異生成物は、別の供給源中では等価に
発現されないある供給源からのRNAの中で発現される配
列を検出するプローブを産生する。このようなプローブ
は時々診断（例えば細胞の起源を調べるための、又は感
染の証拠を見出すための）に用いられ、重要な組織特異
的又は疾患関連遺伝子の発見をもたらし得る。
雄マウス脳から抽出したRNAから二本鎖cDNA集団を調
製した。これをドライバーとして用いた。大腸菌E.coli
プラスミドによりコード化されるカナマイシン耐性遺伝
子からの100/1000部の二本鎖DNAをこのcDNAの小部分に
付加し、これをテスターとして用いた。このモデル系
は、２つの供給源からの発現RNA間の単一小差異の場合
を模倣するものである。酵素Sau3Aを用いてこれら２つ
のサンプルでRDAを実施してそれぞれのアンプリコンを
調製した。図４に示すように、２ラウンドの減数後の差
異生成物をゲル電気泳動を用いて分離した。左手レーン
には1.2kbのカナマイシン遺伝子から調製されたアンプ
リコンの電気泳動分離を示す。真ん中のレーンは、サイ
ズマーカーである。RDAからの差異生成物は右手レーン
に認められる。この生成物は、ブロットハイブリダイゼ
ーションにより示されるようにカナマイシン遺伝子から
得られ、したがってRDAを用いてRNA集団殻得られるDNA
における差異を検出できることを示している。
２つの関連するゲノム間の配列差異を同定するために
用い得るプローブを単離するための強力な道具が提供さ
れたということは上記の結果から明らかである。本技術
は、法医学、病原性DNAの存在の検出、腫瘍細胞中に生
じる病変、遺伝的カウンセリング、遺伝子疾患に関連し
た遺伝子の存在等に関する広範な種々の情況に用い得
る。
本明細書中に引用した出版物及び特許出願はすべて、
各々の個々の出版物又は特許出願が特に又は個別に参照
により組み込まれることが示されているように、参照に
より本明細書中に含めるものとする。
外国の発明は理解し易くするために説明及び実施例に
より多少詳細に記載したが、しかし添付の請求の範囲の
精神又は範囲の逸脱しない限りある種の変更及び修正を
なし得ることは、当業者には公知である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 リシツィン，ニコライ アメリカ合衆国，ニューヨーク 11724, コールド スプリング ハーバー，ポス ト オフィス ボックス 100（番地な し) (56)参考文献 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ．，Ｖｏｌ．87，Ｎｏ．７ （1990）ｐ．2720−2724 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ．，Ｖｏｌ．87，Ｎｏ．５ （1990）ｐ．1889−1893 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＰｕｂＭｅｄ

Claims (16)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】２つの関連する異なる真核性供給源からの
    DNA間の少なくとも１つの配列差を識別することができ
    るプローブの製造方法であって、 上記２つの異なる供給源（ここで、上記供給源の１つは
    ドライバーDNAであり、他の供給源はテスターDNAであっ
    て、上記テスターDNAは標的DNAを包含し、上記標的DNA
    は上記２つの供給源のDNA間の配列差を包含する）から
    のDNAを別々に制限エンドヌクレアーゼで実質的に完全
    に消化して消化断片を用意し； 第一組のアダプターを上記消化断片に連結し、上記第一
    組アダプターの鎖の１つに対するプライマーを用いて上
    記断片を増幅してアンプリコンとして約2kbp未満の上記
    消化された配列の増幅された量の断片を用意し； 標的DNAの濃縮のために以下の工程の第一ラウンドを実
    施し； 上記アンプリコンから上記第一組のアダプターを除去
    し、第二組のアダプターをテスターDNAのアンプリコン
    の5'末端に連結し； 融解及びアニーリング条件下で上記テスターアンプリコ
    ンを大過剰量のドライバーアンプリコンと結合させ、そ
    れによってその結果生じるdsDNAの一部は標的DNAを含む
    自己アニール化テスターDNAを包含し； アニール化DNAの3'末端をフィルインし；そして 上記dsDNAを上記第二組のアダプターの上記鎖の１つと
    相補的なプライマーで増幅して標的DNAを濃縮する； ことを含んで成る方法。
  2. 【請求項２】第二ラウンド又は継続ラウンドとして上記
    第一ラウンドを反復して上記テスター供給源及び上記ド
    ライバー供給源間のDNA配列における差異を同定するの
    に役立つDNA配列を提供する工程； を更に含んで成る、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】上記フィルイン後の、ヌクレアーゼによる
    一本鎖DNAの消化の別の工程を含む請求項１記載の方
    法。
  4. 【請求項４】上記第一ラウンドの工程が少なくとも１回
    反復される請求項１記載の方法。
  5. 【請求項５】異なる組のアダプターが少なくとも最初の
    ３ラウンドの間用いられる請求項４記載の方法。
  6. 【請求項６】上記消化が、少なくとも６つのヌクレオチ
    ドの認識配列を有しジグザグ（staggered）切断を提供
    する制限エンドヌクレアーゼによるものである請求項１
    記載の方法。
  7. 【請求項７】DNAの供給源が関連のあるヒト個体又は同
    一個体からの細胞である請求項１記載の方法。
  8. 【請求項８】上記２つの関連供給源からの上記DNAがcDN
    Aである請求項１記載の方法。
  9. 【請求項９】上記２つの関連供給源の少なくとも１つか
    らの上記DNAが複数の個体関連供給源からプールされたD
    NAである請求項１記載の方法。
  10. 【請求項１０】２つの関連する細胞供給源からのゲノム
    間の少なくとも１つの配列差を識別することができるプ
    ローブの製造方法であって、 上記２つの異なる供給源（ここで、上記供給源の１つは
    ドライバーDNAであり、他の供給源がテスターDNAであっ
    て、上記テスターDNAは標的DNAを包含し、上記標的DNA
    は上記２つの供給源のゲノム間の配列差を包含する）か
    らのDNAを別々に少なくとも４つのヌクレオチドのヌク
    レオチド認識配列を有する制限エンドヌクレアーゼで実
    質的に完全に消化し； 第一組のアダプターを上記消化断片に連結し、上記第一
    組アダプターの鎖の１つに対するプライマーを用いて上
    記断片を増幅してアンプリコンとして約2kbp未満の上記
    消化配列の増幅量の断片を用意し； 標的DNAの濃縮のために以下の工程の第一ラウンドを実
    施し； 上記アンプリコンから上記第一組のアダプターを除去
    し、第二組のアダプターをテスターDNAのアンプリコン
    の5'末端に連結し； 融解及びアニーリング条件下で上記テスターアンプリコ
    ンを大過剰量のドライバーアンプリコンと結合させ、そ
    れによってその結果生じるdsDNAの一部は標的DNAを含む
    自己アニール化テスターDNAを包含し； 3'オーバーハングをフィルインし； 上記dsDNAを上記第二組のアダプターの上記鎖の１つに
    対するプライマーで増幅して標的DNAを濃縮し； 上記第一ラウンドの間各連続ラウンドに異なる組のアダ
    プターを用いて少なくとも２回のラウンドの間上記第一
    ラウンドの工程を反復して優勢な量の標的DNAを包含す
    るDNA組成物を用意し；そして 上記DNA組成物をクローニングして推定される標的DNAの
    実質的に均質なプローブを有するクローンを用意する； 工程を含んで成る方法。
  11. 【請求項１１】推定される標的DNAの複数のプローブが
    得られる場合に、下記の工程： 推定される標的DNAをドライバー及びテスターアンプリ
    コンでハイブリダイズし、それによりドライバー及びテ
    スターアンプリコンの両方と結合している推定標的DNA
    のプローブが捨てられる； を含んで成る、請求項10に記載の方法。
  12. 【請求項１２】上記関連する細胞供給源がヒト細胞供給
    源であり、当該ヒト細胞供給源が同一個体からであり病
    原の疑わしい存在に関しては異なっている請求項10記載
    の方法。
  13. 【請求項１３】上記関連する細胞供給源がヒト細胞供給
    源であり、当該ヒト細胞供給源が同一個体からであり遺
    伝的病変の疑わしい存在に関しては異なっている請求項
    10記載の方法。
  14. 【請求項１４】上記関連する細胞供給源がヒト細胞供給
    源であり、当該ヒト細胞供給源が異なる個体からである
    請求項10記載の方法。
  15. 【請求項１５】腫瘍性細胞供給源及び関連する正常細胞
    供給源からのゲノム間の少なくとも１つの配列差を識別
    することができるプローブの製造方法であって、 上記２つの供給源（ここで、上記正常細胞供給源はドラ
    イバーDNAであり、上記腫瘍性細胞供給源はテスターDNA
    であって、上記テスターDNAは標的DNAを包含し、上記標
    的DNAは標的DNAを限定する挿入、欠失、転位又はDNA増
    幅の少なくとも１つを包含する上記２つの供給源のゲノ
    ム間の配列差を包含する）からのDNAを別々に少なくと
    も４つのヌクレオチドのヌクレオチド認識配列を有する
    制限エンドヌクレアーゼで実質的に完全に消化し； 第一組のアダプターを上記消化断片に連結し、上記第一
    組アダプターの鎖の１つに対するプライマーを用いて上
    記断片を増幅してアンプリコンとして約2kbp未満の上記
    消化配列の増幅量の断片を用意し； 標的DNAの濃縮のために以下の工程の第一ラウンドを実
    施し； 上記アンプリコンから上記第一組のアダプターを除去
    し、第二組のアダプターをテスターDNAのアンプリコン
    の5'末端に連結し； 融解及びアニーリング条件下で上記テスターアンプリコ
    ンを大過剰量のドライバーアンプリコンと結合させ、そ
    れによってその結果生じるdsDNAの一部は標的DNAを含む
    自己アニール化テスターDNAを包含し； オーバーハングの3'末端をフィルインし； 上記dsDNAを上記第二組のアダプターの上記鎖の１つに
    対するプライマーで増幅して標的DNAを濃縮し； 各連続ラウンドにおける前ラウンドに関しては異なる組
    のアダプターを用いて少なくともさらに１ラウンドの間
    上記第一ラウンドの工程を反復して優勢な量の標的DNA
    を包含するDNA組成物を用意し； 上記DNA組成物をクローニングして標的DNAの実質的に均
    質なプローブを有するクローンを提供する； 工程を含んで成る方法。
  16. 【請求項１６】腫瘍性細胞供給源及び関連する正常細胞
    供給源からのゲノム間の少なくとも１つの配列差を識別
    することができるプローブの製造方法であって、 上記２つの供給源（ここで、上記腫瘍性細胞供給源はド
    ライバーDNAであり、上記正常細胞供給源はテスターDNA
    であって、上記テスターDNAは標的DNAを包含し、上記標
    的DNAは標的DNAを限定するためのヘテロ接合性の欠落、
    ホモ接合性又はヘミ接合欠落を包含する上記２つの供給
    源のゲノム間の配列差を包含する）からのDNAを別々に
    少なくとも４つのヌクレオチドのヌクレオチド認識配列
    を有する制限エンドヌクレアーゼで実質的に完全に消化
    し； 第一組のアダプターを上記消化断片に連結し、上記第一
    組アダプターの鎖の１つに対するプライマーを用いて上
    記断片を増幅してアンプリコンとして約2kbp未満の上記
    消化配列の増幅量の断片を用意し； 標的DNAの濃縮のために以下の工程の第一ラウンドを実
    施し； 上記アンプリコンから上記第一組のアダプターを除去
    し、第二組のアダプターをテスターDNAのアンプリコン
    の5'末端に連結し； 融解及びアニーリング条件下で上記テスターアンプリコ
    ンを大過剰量のドライバーアンプリコンと結合させ、そ
    れによってその結果生じるdsDNAの一部は標的DNAを含む
    自己アニール化テスターDNAを包含し； オーバーハングの3'末端をフィルインし； 上記dsDNAを上記第二組のアダプターの上記鎖の１つに
    対するプライマーで増幅して標的DNAを濃縮し； 各連続ラウンドにおける前ラウンドに関しては異なる組
    のアダプターを用いて少なくともさらに１ラウンドの間
    上記第一ラウンドの工程を反復して優勢な量の標的DNA
    を包含するDNA組成物を用意し； 上記DNA組成物をクローニングして標的DNAの実質的に均
    質なプローブを有するクローンを用意する； 工程を含んで成る方法。
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Families Citing this family (99)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1382386A3 (en) * 1992-02-19 2004-12-01 The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. Novel oligonucleotide arrays and their use for sorting, isolating, sequencing, and manipulating nucleic acids
US20040197774A1 (en) * 1992-11-12 2004-10-07 Michael Wigler Representational approach to DNA analysis
US5436142A (en) * 1992-11-12 1995-07-25 Cold Spring Harbor Laboratory Methods for producing probes capable of distingushing variant genomic sequences
US6277606B1 (en) 1993-11-09 2001-08-21 Cold Spring Harbor Laboratory Representational approach to DNA analysis
US5710000A (en) * 1994-09-16 1998-01-20 Affymetrix, Inc. Capturing sequences adjacent to Type-IIs restriction sites for genomic library mapping
US6350576B1 (en) * 1994-12-20 2002-02-26 Cold Spring Harbor Laboratory Cancer detection probes
US5565340A (en) * 1995-01-27 1996-10-15 Clontech Laboratories, Inc. Method for suppressing DNA fragment amplification during PCR
US5707807A (en) * 1995-03-28 1998-01-13 Research Development Corporation Of Japan Molecular indexing for expressed gene analysis
US7803529B1 (en) 1995-04-11 2010-09-28 Sequenom, Inc. Solid phase sequencing of biopolymers
AU6643596A (en) * 1995-08-11 1997-03-12 United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services, The Isolation of amplified genes via cdna subtractive hybridization
DE69632252T2 (de) * 1995-12-22 2005-04-14 Exact Sciences Corp., Marlborough Verfahren zur erkennung von klonalen populationen von transformierten zellen in einer genomisch heterogenen zellulären probe
US6218119B1 (en) * 1996-01-16 2001-04-17 Keygene, N. V. Amplification of simple sequence repeats
US5759780A (en) * 1996-03-29 1998-06-02 Pathogenesis Corporation Methods for enriching target nucleic acid sequences
US6458530B1 (en) 1996-04-04 2002-10-01 Affymetrix Inc. Selecting tag nucleic acids
US5712127A (en) * 1996-04-29 1998-01-27 Genescape Inc. Subtractive amplification
US5804382A (en) * 1996-05-10 1998-09-08 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Methods for identifying differentially expressed genes and differences between genomic nucleic acid sequences
WO1997043443A1 (en) * 1996-05-14 1997-11-20 Boehringer Mannheim Gmbh Method for identifying and/or quantifying expression of nucleic acid molecules in a sample
US5871917A (en) 1996-05-31 1999-02-16 North Shore University Hospital Research Corp. Identification of differentially methylated and mutated nucleic acids
US6617434B1 (en) * 1996-05-31 2003-09-09 North Shore Long Island Jewish Research Institute Identificiaton of differentially methylated and mutated nucleic acids
US5935788A (en) * 1996-06-25 1999-08-10 Lifespan Biosciences, Inc. Subtractive hybridization techniques for identifying differentially expressed and commonly expressed nucleic acid
FR2751000B1 (fr) * 1996-07-12 1998-10-30 Inst Nat Sante Rech Med Adn specifiques des bacteries de l'espece neisseria meningitidis, leurs procedes d'obtention et leurs applications biologiques
US5827658A (en) * 1996-08-09 1998-10-27 The United States Of America As Reprsented By The Department Of Health And Human Services Isolation of amplified genes via cDNA subtractive hybridization
US6100029A (en) * 1996-08-14 2000-08-08 Exact Laboratories, Inc. Methods for the detection of chromosomal aberrations
US6146828A (en) * 1996-08-14 2000-11-14 Exact Laboratories, Inc. Methods for detecting differences in RNA expression levels and uses therefor
US6300077B1 (en) 1996-08-14 2001-10-09 Exact Sciences Corporation Methods for the detection of nucleic acids
US6020137A (en) * 1996-08-14 2000-02-01 Exact Laboratories, Inc. Methods for the detection of loss of heterozygosity
US5928870A (en) * 1997-06-16 1999-07-27 Exact Laboratories, Inc. Methods for the detection of loss of heterozygosity
US6203993B1 (en) 1996-08-14 2001-03-20 Exact Science Corp. Methods for the detection of nucleic acids
GB9618050D0 (en) * 1996-08-29 1996-10-09 Cancer Res Campaign Tech Global amplification of nucleic acids
WO1998008981A1 (en) * 1996-08-30 1998-03-05 Life Technologies, Inc. METHODS FOR IDENTIFICATION AND ISOLATION OF SPECIFIC NUCLEOTIDE SEQUENCES IN cDNA AND GENOMIC DNA
US5726022A (en) * 1996-11-18 1998-03-10 Lifespan Biosciences, Inc. Subtractive hybridization and capture methods and kits for differential isolation of nucleic acids including disease-associated sequences
US20040142327A1 (en) * 1996-11-22 2004-07-22 Jhy-Jhu Lin Methods for identifying and isolating DNA polymorphisms or genetic markers
US6060245A (en) * 1996-12-13 2000-05-09 Stratagene Methods and adaptors for generating specific nucleic acid populations
US6060240A (en) * 1996-12-13 2000-05-09 Arcaris, Inc. Methods for measuring relative amounts of nucleic acids in a complex mixture and retrieval of specific sequences therefrom
US6017701A (en) * 1996-12-13 2000-01-25 Stratgene Methods and adaptors for generating specific nucleic acid populations
US6306588B1 (en) * 1997-02-07 2001-10-23 Invitrogen Corporation Polymerases for analyzing or typing polymorphic nucleic acid fragments and uses thereof
US5958738A (en) * 1997-03-24 1999-09-28 Roche Diagnostics Corporation Procedure for subtractive hybridization and difference analysis
US6268136B1 (en) 1997-06-16 2001-07-31 Exact Science Corporation Methods for stool sample preparation
US6344554B1 (en) 1997-10-02 2002-02-05 Regents Of The University Of California Polynucleotide sequences from Candida albicans encoding polypeptides associated with filamentous growth
AU753505B2 (en) * 1997-10-30 2002-10-17 Cold Spring Harbor Laboratory Probe arrays and methods of using probe arrays for distinguishing DNA
US6221585B1 (en) 1998-01-15 2001-04-24 Valigen, Inc. Method for identifying genes underlying defined phenotypes
US6297010B1 (en) 1998-01-30 2001-10-02 Genzyme Corporation Method for detecting and identifying mutations
AU3747099A (en) 1998-04-16 1999-11-01 Case Western Reserve University Method for finding genetic markers of somaclonal variation
US6703228B1 (en) * 1998-09-25 2004-03-09 Massachusetts Institute Of Technology Methods and products related to genotyping and DNA analysis
AR021833A1 (es) * 1998-09-30 2002-08-07 Applied Research Systems Metodos de amplificacion y secuenciacion de acido nucleico
AU2144000A (en) * 1998-10-27 2000-05-15 Affymetrix, Inc. Complexity management and analysis of genomic dna
US7700324B1 (en) * 1998-11-03 2010-04-20 The Johns Hopkins University School Of Medicine Methylated CpG island amplification (MCA)
US6994991B1 (en) 1998-11-18 2006-02-07 North Shore - Long Island Jewish Research Institute Identification of differentially methylated multiple drug resistance loci
JP4013370B2 (ja) * 1998-11-25 2007-11-28 王子製紙株式会社 植物におけるｄｎａ断片の獲得方法とその利用
CA2362771A1 (en) * 1999-03-12 2000-09-21 Amersham Pharmacia Biotech Uk Limited Genetic analysis
WO2000068411A1 (en) * 1999-05-12 2000-11-16 Invitrogen Corporation Compositions and methods for enhanced sensitivity and specificity of nucleic acid synthesis
US20020119448A1 (en) * 1999-06-23 2002-08-29 Joseph A. Sorge Methods of enriching for and identifying polymorphisms
US6783933B1 (en) * 1999-09-15 2004-08-31 The Johns Hopkins University School Of Medicine CACNA1G polynucleotide, polypeptide and methods of use therefor
US6958225B2 (en) 1999-10-27 2005-10-25 Affymetrix, Inc. Complexity management of genomic DNA
US6524794B1 (en) * 1999-10-29 2003-02-25 Decode Genetics Ehf. Identical-by-descent fragment enrichment
AU2001257331A1 (en) 2000-04-28 2001-11-12 Sangamo Biosciences, Inc. Methods for designing exogenous regulatory molecules
WO2001084148A2 (en) * 2000-04-28 2001-11-08 Sangamo Biosciences, Inc. Pharmacogenomics and identification of drug targets by reconstruction of signal transduction pathways based on sequences of accessible regions
US7923542B2 (en) 2000-04-28 2011-04-12 Sangamo Biosciences, Inc. Libraries of regulatory sequences, methods of making and using same
ATE374249T1 (de) * 2000-04-28 2007-10-15 Sangamo Biosciences Inc Datenbanken von regulatorischen sequenzen, methoden zu ihrer herstellung und verwendung
WO2001083822A2 (en) * 2000-05-01 2001-11-08 Cold Spring Harbor Laboratory Use of representations of dna for genetic analysis
US6455255B1 (en) * 2000-08-02 2002-09-24 Abbott Laboratories Method of performing subtractive hybridization using RDA
US20020164634A1 (en) * 2000-08-26 2002-11-07 Perlegen Sciences, Inc. Methods for reducing complexity of nucleic acid samples
US6428964B1 (en) 2001-03-15 2002-08-06 Exact Sciences Corporation Method for alteration detection
US6632611B2 (en) * 2001-07-20 2003-10-14 Affymetrix, Inc. Method of target enrichment and amplification
US6872529B2 (en) * 2001-07-25 2005-03-29 Affymetrix, Inc. Complexity management of genomic DNA
US7498171B2 (en) 2002-04-12 2009-03-03 Anthrogenesis Corporation Modulation of stem and progenitor cell differentiation, assays, and uses thereof
US9388459B2 (en) * 2002-06-17 2016-07-12 Affymetrix, Inc. Methods for genotyping
US7459273B2 (en) * 2002-10-04 2008-12-02 Affymetrix, Inc. Methods for genotyping selected polymorphism
US20060166206A1 (en) * 2002-11-15 2006-07-27 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for analysis of regulatory sequences
US20040161833A1 (en) * 2003-02-13 2004-08-19 Mrugesh Shah Microorganisms producing petroleum from coal or hydrocarbons or from C, H or oxygen; producing C, H or oxygen from water or hydrocarbons
US20090124514A1 (en) * 2003-02-26 2009-05-14 Perlegen Sciences, Inc. Selection probe amplification
US20060183132A1 (en) * 2005-02-14 2006-08-17 Perlegen Sciences, Inc. Selection probe amplification
AU2004280531B2 (en) * 2003-05-23 2010-03-25 Cold Spring Harbor Laboratory Counting exact word matches in genomes
US20050032102A1 (en) * 2003-07-22 2005-02-10 Affymetrix, Inc. Mapping genomic rearrangements
US8114978B2 (en) * 2003-08-05 2012-02-14 Affymetrix, Inc. Methods for genotyping selected polymorphism
US20050100911A1 (en) * 2003-08-06 2005-05-12 Perlegen Sciences, Inc. Methods for enriching populations of nucleic acid samples
EP1689884A4 (en) * 2003-10-08 2007-04-04 Univ Boston METHODS OF PRENATAL DIAGNOSIS OF CHROMOSOMIC ANOMALIES
GB2412170A (en) * 2004-03-16 2005-09-21 Plant Bioscience Ltd A method for enriching for target nucleic acids in a sample
EP1623996A1 (en) * 2004-08-06 2006-02-08 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Improved method of selecting a desired protein from a library
US9109256B2 (en) 2004-10-27 2015-08-18 Esoterix Genetic Laboratories, Llc Method for monitoring disease progression or recurrence
WO2007044071A2 (en) 2005-04-21 2007-04-19 Exact Sciences Corporation Analysis of heterogeneous nucleic acid samples
US7452671B2 (en) * 2005-04-29 2008-11-18 Affymetrix, Inc. Methods for genotyping with selective adaptor ligation
US7572584B2 (en) * 2005-06-02 2009-08-11 The United States Of America As Represented By The U.S. Environmental Protection Agency Species-specific primer sets and identification of species-specific DNA sequences using genome fragment enrichment
US8058000B2 (en) * 2005-06-02 2011-11-15 The United States Of America As Represented By The U.S. Environmental Protection Agency Species-specific primer sets and identification of species-specific DNA sequences using genome fragment enrichment
GB0522310D0 (en) 2005-11-01 2005-12-07 Solexa Ltd Methods of preparing libraries of template polynucleotides
GB0524069D0 (en) * 2005-11-25 2006-01-04 Solexa Ltd Preparation of templates for solid phase amplification
WO2007070640A2 (en) * 2005-12-14 2007-06-21 Wigler Michael H Use of roma for characterizing genomic rearrangements
AU2006346804B2 (en) * 2005-12-14 2012-10-04 Cold Spring Harbor Laboratory Methods for assessing probabilistic measures of clinical outcome using genomic profiling
US11306351B2 (en) 2005-12-21 2022-04-19 Affymetrix, Inc. Methods for genotyping
US20080145844A1 (en) * 2006-01-25 2008-06-19 Evrogen Joint Stock Company Methods of cDNA preparation
EP2049682A2 (en) * 2006-07-31 2009-04-22 Illumina Cambridge Limited Method of library preparation avoiding the formation of adaptor dimers
WO2008093098A2 (en) * 2007-02-02 2008-08-07 Illumina Cambridge Limited Methods for indexing samples and sequencing multiple nucleotide templates
US20080293589A1 (en) * 2007-05-24 2008-11-27 Affymetrix, Inc. Multiplex locus specific amplification
US9388457B2 (en) 2007-09-14 2016-07-12 Affymetrix, Inc. Locus specific amplification using array probes
US9074244B2 (en) * 2008-03-11 2015-07-07 Affymetrix, Inc. Array-based translocation and rearrangement assays
WO2010059742A1 (en) * 2008-11-18 2010-05-27 Collabrx, Inc. Individualized cancer treatment
US20110059453A1 (en) * 2009-08-23 2011-03-10 Affymetrix, Inc. Poly(A) Tail Length Measurement by PCR
CN103502457A (zh) 2011-05-02 2014-01-08 先锋国际良种公司 用于发现编码杀虫剂的新型核酸分子的细菌信使核糖核酸筛选策略
CN111199773B (zh) * 2020-01-20 2023-03-28 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 一种精细定位性状关联基因组纯合片段的评估方法

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4675283A (en) * 1984-07-19 1987-06-23 Massachusetts Institute Of Technology Detection and isolation of homologous, repeated and amplified nucleic acid sequences
US4882269A (en) * 1985-12-13 1989-11-21 Princeton University Amplified hybridization assay
AU1626288A (en) * 1987-04-02 1988-11-02 Genelabs Incorporated Equal-abundance transcript composition and method
DE3722958A1 (de) * 1987-07-11 1989-01-19 Heinrich Dr Klefenz Verfahren zur identifizierung und/oder isolierung spezifischer molekuele bzw. molekuelpopulationen
US5032502A (en) * 1988-01-21 1991-07-16 The United States Of America As Represented By The United States Of Energy Purification of polymorphic components of complex genomes
US6107023A (en) * 1988-06-17 2000-08-22 Genelabs Technologies, Inc. DNA amplification and subtraction techniques
WO1990005789A1 (en) * 1988-11-15 1990-05-31 Yale University In situ suppression hybridization and uses therefor
AU628451B2 (en) * 1988-12-07 1992-09-17 General Hospital Corporation, The Method of enrichment and cloning for dna containing an insertion or corresponding to a deletion
US5045450A (en) * 1989-07-13 1991-09-03 Massachusetts Institute Of Technology Determination of a mutational spectrum
WO1991005861A1 (en) * 1989-10-16 1991-05-02 Genelabs Incorporated Non-specific dna amplification
GB9101757D0 (en) * 1991-01-26 1991-03-13 Medical Res Council Analysis of dna
US5436142A (en) * 1992-11-12 1995-07-25 Cold Spring Harbor Laboratory Methods for producing probes capable of distingushing variant genomic sequences

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，Ｖｏｌ．８７，Ｎｏ．５（１９９０）ｐ．１８８９−１８９３
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，Ｖｏｌ．８７，Ｎｏ．７（１９９０）ｐ．２７２０−２７２４

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Publication number Publication date
JPH08503365A (ja) 1996-04-16
DK0733125T3 (da) 2002-07-29
CA2149249A1 (en) 1994-05-26
EP0733125A4 (en) 1996-04-11
EP0733125A1 (en) 1996-09-25
US5876929A (en) 1999-03-02
US5436142A (en) 1995-07-25
US5501964A (en) 1996-03-26
EP0733125B1 (en) 2002-04-03
DE69331786T2 (de) 2002-11-28
DE69331786D1 (de) 2002-05-08
US6159713A (en) 2000-12-12
WO1994011383A1 (en) 1994-05-26

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