JP2002534359A - 血管内皮細胞増殖因子アンタゴニストとその用途 - Google Patents
血管内皮細胞増殖因子アンタゴニストとその用途Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）アンタゴニスト及びＶＥＧＦアンタゴニストを使用する方法を提供する。本発明で考えられるＶＥＧＦアンタゴニストはＶＥＧＦ抗体及びＶＥＧＦレセプター融合タンパク質を含む。さらにＶＥＧＦアンタゴニストを使用する浮腫及び脳卒中の治療方法も提供する。
Description
【０００１】 (発明の分野) 本発明は、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）アンタゴニスト、該アンタゴニ
ストを含む治療用組成物並びに診断および治療目的のために該アンタゴニストを
使用する方法に関する。特に、本発明はＶＥＧＦアンタゴニストを用いる脳卒中
又は浮腫の治療方法に関する。
ストを含む治療用組成物並びに診断および治療目的のために該アンタゴニストを
使用する方法に関する。特に、本発明はＶＥＧＦアンタゴニストを用いる脳卒中
又は浮腫の治療方法に関する。
【０００２】 (発明の背景) 脈管系の２つの主要な細胞成分は内皮細胞と平滑筋細胞である。内皮細胞は全
血管の内部表面の内張りを形成し、血液と組織の間の非血栓形成性界面を構成す
る。加えて、内皮細胞は新しい毛細血管や血管の発育のために重要な成分である
。よって、内皮細胞は、腫瘍増殖および転移並びに種々の非新生物疾病または疾
患に随伴した、脈管形成または新血管形成中に増殖する。 天然に生じる種々のポリペプチドは内皮細胞の増殖を誘発することが報告され
ている。これらのポリペプチドには、塩基性および酸性の線維芽細胞増殖因子（
ＦＧＦ）、ブルゲス（Burgess）およびマシアグ（Maciag）、Annual Rev．Bioch
em.、58:575（1989年）、血小板由来内皮細胞増殖因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）、イ
シカワ（Ishikawa）等、Nature、338:557（1989年）、並びに血管内皮増殖因子
（ＶＥＧＦ）、リュング（Leung）等、Science 246:1306（1989年）；フェララ
（Ferrara）およびヘンゼル（Henzel）、Biochem．Biophys．Res．Commun．161:
851（1989年）；ティッシャー（Tischer）等、Biochem．Biophys．Res．Commun
．165:1198（1989年）；フェララ等、ＰＣＴ公開特許第ＷＯ 90/13649号（1990
年11月15日公開）がある。 ＶＥＧＦは最初、ウシ下垂体小胞または星状小胞細胞で条件づけた培地中で同
定された。生化学分析によって、ウシＶＥＧＦは二量体タンパク質であって、見
かけ上の分子量は約45,000ダルトンであり、血管内皮細胞に対して明白な細胞分
裂誘発性特異性を有していることが示されている。ウシＶＥＧＦをコードするＤ
ＮＡは、ハイブリッド形成プローブとしてタンパク質のアミノ末端アミノ酸配列
に基づくオリゴヌクレオチドを使用して上記細胞から調製したｃＤＮＡライブラ
リーをスクリーニングして単離された。
血管の内部表面の内張りを形成し、血液と組織の間の非血栓形成性界面を構成す
る。加えて、内皮細胞は新しい毛細血管や血管の発育のために重要な成分である
。よって、内皮細胞は、腫瘍増殖および転移並びに種々の非新生物疾病または疾
患に随伴した、脈管形成または新血管形成中に増殖する。 天然に生じる種々のポリペプチドは内皮細胞の増殖を誘発することが報告され
ている。これらのポリペプチドには、塩基性および酸性の線維芽細胞増殖因子（
ＦＧＦ）、ブルゲス（Burgess）およびマシアグ（Maciag）、Annual Rev．Bioch
em.、58:575（1989年）、血小板由来内皮細胞増殖因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）、イ
シカワ（Ishikawa）等、Nature、338:557（1989年）、並びに血管内皮増殖因子
（ＶＥＧＦ）、リュング（Leung）等、Science 246:1306（1989年）；フェララ
（Ferrara）およびヘンゼル（Henzel）、Biochem．Biophys．Res．Commun．161:
851（1989年）；ティッシャー（Tischer）等、Biochem．Biophys．Res．Commun
．165:1198（1989年）；フェララ等、ＰＣＴ公開特許第ＷＯ 90/13649号（1990
年11月15日公開）がある。 ＶＥＧＦは最初、ウシ下垂体小胞または星状小胞細胞で条件づけた培地中で同
定された。生化学分析によって、ウシＶＥＧＦは二量体タンパク質であって、見
かけ上の分子量は約45,000ダルトンであり、血管内皮細胞に対して明白な細胞分
裂誘発性特異性を有していることが示されている。ウシＶＥＧＦをコードするＤ
ＮＡは、ハイブリッド形成プローブとしてタンパク質のアミノ末端アミノ酸配列
に基づくオリゴヌクレオチドを使用して上記細胞から調製したｃＤＮＡライブラ
リーをスクリーニングして単離された。
【０００３】 ヒトＶＥＧＦは、ウシＶＥＧＦ ｃＤＮＡをハイブリッド形成プローブとして
使用して、ヒト細胞から調製したｃＤＮＡライブラリーを先ずスクリーニングし
て得られた。こうして同定された１つのｃＤＮＡは、ウシＶＥＧＦと95％以上の
相同性を有する165アミノ酸のタンパク質をコードしており、このタンパク質は
ヒトＶＥＧＦ（ｈＶＥＧＦ）と称されている。ヒトＶＥＧＦの細胞***促進活性
は、哺乳動物宿主細胞中でヒトＶＥＧＦ ｃＤＮＡを発現することによって確認
された。ヒトＶＥＧＦ ｃＤＮＡでトランスフェクションした細胞で条件づけた
培地は毛細血管内皮細胞の増殖を促進したが、対照細胞では促進しなかった。リ
ュング等、Science 246:1306（1989年）。 更に幾つかのｃＤＮＡが、ｈＶＥＧＦの121−、189−および206−アミノ酸イ
ソ型(集合的に、ｈＶＥＧＦ関連タンパク質とも称される)をコードするヒトｃＤ
ＮＡライブリー中で同定された。121−アミノ酸タンパク質は、ｈＶＥＧＦの残
基116から159の間の44個のアミノ酸を欠失しているためｈＶＥＧＦと異なってい
る。189−アミノ酸タンパク質は、ｈＶＥＧＦの残基116に24個のアミノ酸挿入が
あるためｈＶＥＧＦと異なっており、明らかにヒト血管透過性因子（ｈＶＰＦ）
と同一である。206−アミノ酸タンパク質は、ｈＶＥＧＦの残基116に41個のアミ
ノ酸の挿入があるためｈＶＥＧＦと異なっている。フック（Houck）等、Mol．En
docrin．5:1806（1991年）；フェララ等、J．Cell．Biochem．47:211（1991年）
；フェララ等、Endocrine Reviews 13:18（1992年）；ケック（Keck）等、Scien
ce 246:1309（1989年）；コノリ（Connolly）等、J．Biol．Chem．264:20017（1
989年）；ケック等、ＥＰＯ公開特許第0 370 989号（1990年5月30日公開）。 ＶＥＧＦに対するレセプターは文献に記載されている。２つのこのようなレセ
プター、ｆｌｔ−１とｆｌｋ−１が、ＶＥＧＦ効果を媒介することがわかってい
る［デブリーズ（DeVries）等、Science 255:989（1992年）；シブヤ（Shibuya
）等、Oncogene 5:519（1990年）；マシューズ（Matthews）等、Proc．Nat．Aca
d．Sci．88:9026（1991年）；ターマン（Terman）等、Oncogene 6:1677（1991年
）；ターマン等、Biochem．Biophys．Res．Comm．187:1579（1992年）；ノイフ
ェルド（Neufeld）等、Prog. Growth Factor Res. 5:89-97（1994年）；ウォル
テンバーガー（Waltenberger）等、J. Biol. Chem. 269:26988（1994年）；クイ
ン(Quinn)等、Proc. Natl. Acad. Sci. 90:7533（1993年）］が、それらの調節
及びメカニズムはまだ十分には理解されていない。レンミラー（Lennmyr）等、J
. Neuropathology及びExp. Neurology 57:874-882（1998年）。ｆｌｔ−１レセ
プターとｆｌｋ−１レセプターの双方が膜貫通レセプターであり、クラスＩＩＩ
のチロシンキナーゼレセプターファミリーに属している。バーレオン（Barleon
）等、J. Cell Biochem. 54:56（1994年）；上掲のノイフェルド等。 ＶＥＧＦは血管内皮細胞増殖を刺激するばかりでなく、脈管形成をも誘発する
。先在する内皮からの新しい血管の形成を含む脈管形成は、腫瘍増殖および転移
、関節リウマチ、乾癬、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性網膜症、水晶体後線
維増殖症、血管新生性緑内障、加齢性黄斑変性、血管腫、移植された角膜組織と
その他の組織の免疫拒絶反応、および慢性炎症を含む様々な疾病や疾患の重要な
成分である。
使用して、ヒト細胞から調製したｃＤＮＡライブラリーを先ずスクリーニングし
て得られた。こうして同定された１つのｃＤＮＡは、ウシＶＥＧＦと95％以上の
相同性を有する165アミノ酸のタンパク質をコードしており、このタンパク質は
ヒトＶＥＧＦ（ｈＶＥＧＦ）と称されている。ヒトＶＥＧＦの細胞***促進活性
は、哺乳動物宿主細胞中でヒトＶＥＧＦ ｃＤＮＡを発現することによって確認
された。ヒトＶＥＧＦ ｃＤＮＡでトランスフェクションした細胞で条件づけた
培地は毛細血管内皮細胞の増殖を促進したが、対照細胞では促進しなかった。リ
ュング等、Science 246:1306（1989年）。 更に幾つかのｃＤＮＡが、ｈＶＥＧＦの121−、189−および206−アミノ酸イ
ソ型(集合的に、ｈＶＥＧＦ関連タンパク質とも称される)をコードするヒトｃＤ
ＮＡライブリー中で同定された。121−アミノ酸タンパク質は、ｈＶＥＧＦの残
基116から159の間の44個のアミノ酸を欠失しているためｈＶＥＧＦと異なってい
る。189−アミノ酸タンパク質は、ｈＶＥＧＦの残基116に24個のアミノ酸挿入が
あるためｈＶＥＧＦと異なっており、明らかにヒト血管透過性因子（ｈＶＰＦ）
と同一である。206−アミノ酸タンパク質は、ｈＶＥＧＦの残基116に41個のアミ
ノ酸の挿入があるためｈＶＥＧＦと異なっている。フック（Houck）等、Mol．En
docrin．5:1806（1991年）；フェララ等、J．Cell．Biochem．47:211（1991年）
；フェララ等、Endocrine Reviews 13:18（1992年）；ケック（Keck）等、Scien
ce 246:1309（1989年）；コノリ（Connolly）等、J．Biol．Chem．264:20017（1
989年）；ケック等、ＥＰＯ公開特許第0 370 989号（1990年5月30日公開）。 ＶＥＧＦに対するレセプターは文献に記載されている。２つのこのようなレセ
プター、ｆｌｔ−１とｆｌｋ−１が、ＶＥＧＦ効果を媒介することがわかってい
る［デブリーズ（DeVries）等、Science 255:989（1992年）；シブヤ（Shibuya
）等、Oncogene 5:519（1990年）；マシューズ（Matthews）等、Proc．Nat．Aca
d．Sci．88:9026（1991年）；ターマン（Terman）等、Oncogene 6:1677（1991年
）；ターマン等、Biochem．Biophys．Res．Comm．187:1579（1992年）；ノイフ
ェルド（Neufeld）等、Prog. Growth Factor Res. 5:89-97（1994年）；ウォル
テンバーガー（Waltenberger）等、J. Biol. Chem. 269:26988（1994年）；クイ
ン(Quinn)等、Proc. Natl. Acad. Sci. 90:7533（1993年）］が、それらの調節
及びメカニズムはまだ十分には理解されていない。レンミラー（Lennmyr）等、J
. Neuropathology及びExp. Neurology 57:874-882（1998年）。ｆｌｔ−１レセ
プターとｆｌｋ−１レセプターの双方が膜貫通レセプターであり、クラスＩＩＩ
のチロシンキナーゼレセプターファミリーに属している。バーレオン（Barleon
）等、J. Cell Biochem. 54:56（1994年）；上掲のノイフェルド等。 ＶＥＧＦは血管内皮細胞増殖を刺激するばかりでなく、脈管形成をも誘発する
。先在する内皮からの新しい血管の形成を含む脈管形成は、腫瘍増殖および転移
、関節リウマチ、乾癬、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性網膜症、水晶体後線
維増殖症、血管新生性緑内障、加齢性黄斑変性、血管腫、移植された角膜組織と
その他の組織の免疫拒絶反応、および慢性炎症を含む様々な疾病や疾患の重要な
成分である。
【０００４】 腫瘍増殖の場合には、脈管形成が過形成から新生物形成への変移および増殖中
の固形腫瘍への栄養供給に決定的に重要であるように思われる。フォークマン（
Folkman）等、Nature 339:58（1989年）。また、脈管形成は腫瘍と宿主の血管床
の接触を可能にし、この血管床が腫瘍細胞の転移経路を提供すると思われる。腫
瘍転移における脈管形成の役割の証拠は、例えば、ヒト浸潤乳癌の組織学的切片
中の微小血管の数および密度と実際の遠位転移の存在との間の関係を示す研究に
よって提供されている。ワイドナー（Weidner）等、New Engl．J．Med．324:1（
1991年）。 また、ＶＥＧＦは内皮及び血管透過性に関与していることが報告されている。
フェララ等、Endocrine Reviews 18:4-25（1997年）；ドブロゴウスカ（Dobrogo
wska）等、J. Neurocytology 27:163（1998年）。十分には理解されてはいない
が、ＶＥＧＦは皮膚、網膜及び腫瘍組織における内皮細胞漏洩を増加させると考
えられている。コリンズ（Collins）等、Brit. J. Pharmacology 109:195（1993
年）；コノリ等、J. Clin. Invest. 84:1470（1989年）；スウェイキ（Shweiki
）等、Nature 359:843（1992年）；モナシ（Monacci）等、Am. J. Physiol. 264
:C995（1993年）；ストーン(Stone)等、J. Neurosci. 15:4738（1995年）；デト
マー(Detmar)等、J. Invest. Dermatol. 108:263（1997年）；ウェインデル（We
indel）等、Neurosurgery 35:437（1994年）。また、内皮細胞及び血液脳関門の
透過性におけるＶＥＧＦ（そのレセプター、特にｆｌｔ−１レセプター）の潜在
的効果と役割も調査されている。例えば、ロセンステイン（Rosenstein）等、Pr
oc. Natl. Acad. Sci. 95:7086（1998年）；ドブロゴウスカ（Dobrogowska）等
、上掲；コバクス（Kovacs）等、Stroke 27:1865（1996年）を参照されたい。成
体ラットの脳において、ＶＥＧＦｍＲＮＡは、比較的広範囲で発現していること
が見出されているが、量は幾分少ない。モナシ等、Am. J. Physiol. 146:368-37
8（1993年）。しかしながら、酸素張力の低減により、ＶＥＧＦ発現が誘発され
ることも示されており[ドール（Dor）及びケシェット（Keshet）、Trends in Ca
rdiovascular Med. 7:289-294（1998年）]、ＶＥＧＦ、ｆｌｔ−１及びｆｌｋ−
１のレベルの増加は、ラットの脳において、限局性脳虚血の誘発に続いて生じる
ことが示されている。ハヤシ等、Stroke 28:2039（1997年）；コバクス等、上掲
；レンミラー等、J. Neuropathology and Experimental Neurology 57:874（199
8年）。脳卒中及びＢＢＢ（血液脳関門）衰弱の病原におけるＶＥＧＦの役割は
、文献に引用された矛盾する実験観察により明白にはされていない。例えば、ナ
グ（Nag）等、J. Neuropathology and Experimental Neurology 56:912（1997年
）には、この皮質が冷傷害を受けたラットモデルにおいて、ダメージを受けた組
織内の透過性軟膜血管及び細動脈に壁在性ＶＥＧＦが存在していることが示され
ており、この観察から、ＶＥＧＦがＢＢＢ衰弱及び浮腫形成を媒介するいくつか
の要因の一つであることが推察される。他方、ハヤシ等、J. Cerebral Blood Fl
ow and Metabolism, 18:887（1998年）には、ＶＥＧＦそれ自体を一過性脳動脈
閉塞後に再灌流したラットの脳表面に局所的に適用すると、虚血による脳損傷、
梗塞容量及び浮腫形成が低減されることが報告されている。
の固形腫瘍への栄養供給に決定的に重要であるように思われる。フォークマン（
Folkman）等、Nature 339:58（1989年）。また、脈管形成は腫瘍と宿主の血管床
の接触を可能にし、この血管床が腫瘍細胞の転移経路を提供すると思われる。腫
瘍転移における脈管形成の役割の証拠は、例えば、ヒト浸潤乳癌の組織学的切片
中の微小血管の数および密度と実際の遠位転移の存在との間の関係を示す研究に
よって提供されている。ワイドナー（Weidner）等、New Engl．J．Med．324:1（
1991年）。 また、ＶＥＧＦは内皮及び血管透過性に関与していることが報告されている。
フェララ等、Endocrine Reviews 18:4-25（1997年）；ドブロゴウスカ（Dobrogo
wska）等、J. Neurocytology 27:163（1998年）。十分には理解されてはいない
が、ＶＥＧＦは皮膚、網膜及び腫瘍組織における内皮細胞漏洩を増加させると考
えられている。コリンズ（Collins）等、Brit. J. Pharmacology 109:195（1993
年）；コノリ等、J. Clin. Invest. 84:1470（1989年）；スウェイキ（Shweiki
）等、Nature 359:843（1992年）；モナシ（Monacci）等、Am. J. Physiol. 264
:C995（1993年）；ストーン(Stone)等、J. Neurosci. 15:4738（1995年）；デト
マー(Detmar)等、J. Invest. Dermatol. 108:263（1997年）；ウェインデル（We
indel）等、Neurosurgery 35:437（1994年）。また、内皮細胞及び血液脳関門の
透過性におけるＶＥＧＦ（そのレセプター、特にｆｌｔ−１レセプター）の潜在
的効果と役割も調査されている。例えば、ロセンステイン（Rosenstein）等、Pr
oc. Natl. Acad. Sci. 95:7086（1998年）；ドブロゴウスカ（Dobrogowska）等
、上掲；コバクス（Kovacs）等、Stroke 27:1865（1996年）を参照されたい。成
体ラットの脳において、ＶＥＧＦｍＲＮＡは、比較的広範囲で発現していること
が見出されているが、量は幾分少ない。モナシ等、Am. J. Physiol. 146:368-37
8（1993年）。しかしながら、酸素張力の低減により、ＶＥＧＦ発現が誘発され
ることも示されており[ドール（Dor）及びケシェット（Keshet）、Trends in Ca
rdiovascular Med. 7:289-294（1998年）]、ＶＥＧＦ、ｆｌｔ−１及びｆｌｋ−
１のレベルの増加は、ラットの脳において、限局性脳虚血の誘発に続いて生じる
ことが示されている。ハヤシ等、Stroke 28:2039（1997年）；コバクス等、上掲
；レンミラー等、J. Neuropathology and Experimental Neurology 57:874（199
8年）。脳卒中及びＢＢＢ（血液脳関門）衰弱の病原におけるＶＥＧＦの役割は
、文献に引用された矛盾する実験観察により明白にはされていない。例えば、ナ
グ（Nag）等、J. Neuropathology and Experimental Neurology 56:912（1997年
）には、この皮質が冷傷害を受けたラットモデルにおいて、ダメージを受けた組
織内の透過性軟膜血管及び細動脈に壁在性ＶＥＧＦが存在していることが示され
ており、この観察から、ＶＥＧＦがＢＢＢ衰弱及び浮腫形成を媒介するいくつか
の要因の一つであることが推察される。他方、ハヤシ等、J. Cerebral Blood Fl
ow and Metabolism, 18:887（1998年）には、ＶＥＧＦそれ自体を一過性脳動脈
閉塞後に再灌流したラットの脳表面に局所的に適用すると、虚血による脳損傷、
梗塞容量及び浮腫形成が低減されることが報告されている。
【０００５】 （発明の概要） 本発明はＶＥＧＦのアンタゴニストを提供し、これらには（ａ）ｈＶＥＧＦ、
ｈＶＥＧＦレセプター、またはｈＶＥＧＦレセプターと会合したｈＶＥＧＦを含
む複合体と特異的に結合できる抗体およびそれらの変異体、（ｂ）ｈＶＥＧＦレ
セプターおよびそれらの変異体、並びに（ｃ）ｈＶＥＧＦ変異体が含まれる。こ
れらのアンタゴニストはｈＶＥＧＦの細胞***活性、脈管形成活性、血管透過活
性、又は他の生物学的活性を抑制、隔絶または中和するので、望ましくない過度
の新血管形成を特徴とする疾病または疾患の治療に有用であり、これらの例とし
ては腫瘍、特に固形悪性腫瘍、関節リウマチ、乾癬、アテローム性動脈硬化症、
糖尿病性および他の網膜症、水晶体後線維増殖症、加齢性黄斑変性、血管新生性
緑内障、血管腫、甲状腺過形成（バセドウ病を含む）、角膜および他の組織の移
植、並びに慢性炎症が含まれる。また、アンタゴニストは、腫瘍、脳卒中、頭部
外傷に随伴した浮腫、悪性腫瘍に随伴した腹水、メーグス症候群、肺炎症、ネフ
ローゼ症候群、心膜滲出液（例えば、心膜炎に随伴するもの）、並びに胸水等の
疾病または疾患の治療にも有用である。 他の側面では、ＶＥＧＦアンタゴニストは、（ａ）非ｈＶＥＧＦエピトープ、
例えば、血栓形成もしくは血栓溶解に関与するタンパク質のエピトープ、または
腫瘍細胞表面抗原、又は（ｂ）ｈＶＥＧＦ、ｈＶＥＧＦレセプターまたはｈＶＥ
ＧＦレセプターと会合したｈＶＥＧＦを含む複合体と結合し得る多特異性モノク
ローナル抗体である。 更に他の側面では、ＶＥＧＦアンタゴニストは細胞毒性部分と抱合体を形成す
る。 もう１つの側面では、本発明は、上記したようなモノクローナル抗体をコード
する単離核酸およびこのようなモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細
胞株に関するものである。 もう１つの側面では、本発明は、哺乳動物においてｈＶＥＧＦ介在細胞***活
性、脈管形成活性、又は他の生物学的活性を減少させるかまたは消失させるのに
有効な量のＶＥＧＦアンタゴニストを含む製薬組成物のような組成物に関するも
のである。 別の側面では、本発明は、哺乳動物、好ましくは治療を必要としているヒト患
者に有効量のＶＥＧＦアンタゴニストを投与することを含む治療方法に関するも
のである。所望される場合には、ＶＥＧＦアンタゴニストは一または複数の他の
ＶＥＧＦアンタゴニスト、抗腫瘍もしくは抗脈管形成物質と、同時にまたは順次
に同時投与され、もしくは処理されている疾病又は病状に適した療法において投
与される。 もう１つの側面では、本発明は、ｈＶＥＧＦと特異的に結合可能な抗体と試験
試料を接触させ、このような結合の程度を測定することによって試験試料中のｈ
ＶＥＧＦを検出する方法に関するものである。
ｈＶＥＧＦレセプター、またはｈＶＥＧＦレセプターと会合したｈＶＥＧＦを含
む複合体と特異的に結合できる抗体およびそれらの変異体、（ｂ）ｈＶＥＧＦレ
セプターおよびそれらの変異体、並びに（ｃ）ｈＶＥＧＦ変異体が含まれる。こ
れらのアンタゴニストはｈＶＥＧＦの細胞***活性、脈管形成活性、血管透過活
性、又は他の生物学的活性を抑制、隔絶または中和するので、望ましくない過度
の新血管形成を特徴とする疾病または疾患の治療に有用であり、これらの例とし
ては腫瘍、特に固形悪性腫瘍、関節リウマチ、乾癬、アテローム性動脈硬化症、
糖尿病性および他の網膜症、水晶体後線維増殖症、加齢性黄斑変性、血管新生性
緑内障、血管腫、甲状腺過形成（バセドウ病を含む）、角膜および他の組織の移
植、並びに慢性炎症が含まれる。また、アンタゴニストは、腫瘍、脳卒中、頭部
外傷に随伴した浮腫、悪性腫瘍に随伴した腹水、メーグス症候群、肺炎症、ネフ
ローゼ症候群、心膜滲出液（例えば、心膜炎に随伴するもの）、並びに胸水等の
疾病または疾患の治療にも有用である。 他の側面では、ＶＥＧＦアンタゴニストは、（ａ）非ｈＶＥＧＦエピトープ、
例えば、血栓形成もしくは血栓溶解に関与するタンパク質のエピトープ、または
腫瘍細胞表面抗原、又は（ｂ）ｈＶＥＧＦ、ｈＶＥＧＦレセプターまたはｈＶＥ
ＧＦレセプターと会合したｈＶＥＧＦを含む複合体と結合し得る多特異性モノク
ローナル抗体である。 更に他の側面では、ＶＥＧＦアンタゴニストは細胞毒性部分と抱合体を形成す
る。 もう１つの側面では、本発明は、上記したようなモノクローナル抗体をコード
する単離核酸およびこのようなモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細
胞株に関するものである。 もう１つの側面では、本発明は、哺乳動物においてｈＶＥＧＦ介在細胞***活
性、脈管形成活性、又は他の生物学的活性を減少させるかまたは消失させるのに
有効な量のＶＥＧＦアンタゴニストを含む製薬組成物のような組成物に関するも
のである。 別の側面では、本発明は、哺乳動物、好ましくは治療を必要としているヒト患
者に有効量のＶＥＧＦアンタゴニストを投与することを含む治療方法に関するも
のである。所望される場合には、ＶＥＧＦアンタゴニストは一または複数の他の
ＶＥＧＦアンタゴニスト、抗腫瘍もしくは抗脈管形成物質と、同時にまたは順次
に同時投与され、もしくは処理されている疾病又は病状に適した療法において投
与される。 もう１つの側面では、本発明は、ｈＶＥＧＦと特異的に結合可能な抗体と試験
試料を接触させ、このような結合の程度を測定することによって試験試料中のｈ
ＶＥＧＦを検出する方法に関するものである。
【０００６】 （発明の詳細な説明） 本発明は、ｈＶＥＧＦの一または複数の生物学的活性を阻止、封鎖又は中和し
得るｈＶＥＧＦのアンタゴニストを提供する。ｈＶＥＧＦのアンタゴニストは、
ｈＶＥＧＦと細胞レセプターの結合を妨げ、ｈＶＥＧＦによって活性化されてい
る細胞を無能力化もしくは死滅させ、またはｈＶＥＧＦと細胞レセプターの結合
後に血管内皮細胞活性化を妨げることによって作用する。ｈＶＥＧＦアンタゴニ
ストによるかかる介入点は全て、本発明の目的に対しては等価であると考えるべ
きである。よって、ｈＶＥＧＦ、ｈＶＥＧＦレセプターまたはｈＶＥＧＦレセプ
ターと会合したｈＶＥＧＦを含む複合体と結合する抗体、モノクロール抗体及び
ヒト化抗体、またはそれらのフラグメントが本発明の範囲内に含まれる。更に、
ｈＶＥＧＦレセプターと結合するが天然ｈＶＥＧＦの生物学的活性を示さないｈ
ＶＥＧＦのフラグメントおよびアミノ酸配列変異体も本発明の範囲内に含まれる
。さらに、ｈＶＥＧＦを結合し得るｈＶＥＧＦレセプターおよびそれらのフラグ
メントおよびアミノ酸配列変異体も本発明の範囲内に含まれる。 ここで使用する「ｈＶＥＧＦ」という用語は、リュング等、Science 246:1306
（1989年）、及びフック等、Mol．Endocrin．5:1806（1991年）に記載されてい
るような、165−アミノ酸ヒト血管内皮細胞増殖因子、および関連のある121−、
189−および206−アミノ酸血管内皮細胞増殖因子と、これら増殖因子の天然に生
じる対立遺伝子体およびプロセシングを受けた形態を意味する。 ここで使用する「ｈＶＥＧＦレセプター」または「ｈＶＥＧＦr」という用語
は、ｈＶＥＧＦの細胞レセプターで、通常は血管内皮細胞に見られる細胞表面レ
セプター、並びにｈＶＥＧＦを結合する能力を保持しているそれらのフラグメン
トと変異体を意味する。典型的には、ｈＶＥＧＦアンタゴニストであるｈＶＥＧ
Ｆレセプターおよびそれらのフラグメント及び変異体は、天然での場合のように
細胞膜中に組み入れられるかまたは細胞表面に固定されているというよりむしろ
単離された形態であろう。ｈＶＥＧＦレセプターの一例は、fms様チロシンキナ
ーゼ（ｆｌｔ又はｆｌｔ−１）、即ちチロシンキナーゼ属の膜貫通レセプターで
ある。デブリーズ（DeVries）等、Science 255:989（1992年）；シブヤ（Shibuy
a）等、Oncogene 5:519（1990年）。全長ｆｌｔレセプターは、チロシンキナー
ゼ活性を持つ細胞内ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞外ドメインを含んで
いる。細胞外ドメインはｈＶＥＧＦの結合に関与しているが、細胞内ドメインは
シグナル伝達に関与している。
得るｈＶＥＧＦのアンタゴニストを提供する。ｈＶＥＧＦのアンタゴニストは、
ｈＶＥＧＦと細胞レセプターの結合を妨げ、ｈＶＥＧＦによって活性化されてい
る細胞を無能力化もしくは死滅させ、またはｈＶＥＧＦと細胞レセプターの結合
後に血管内皮細胞活性化を妨げることによって作用する。ｈＶＥＧＦアンタゴニ
ストによるかかる介入点は全て、本発明の目的に対しては等価であると考えるべ
きである。よって、ｈＶＥＧＦ、ｈＶＥＧＦレセプターまたはｈＶＥＧＦレセプ
ターと会合したｈＶＥＧＦを含む複合体と結合する抗体、モノクロール抗体及び
ヒト化抗体、またはそれらのフラグメントが本発明の範囲内に含まれる。更に、
ｈＶＥＧＦレセプターと結合するが天然ｈＶＥＧＦの生物学的活性を示さないｈ
ＶＥＧＦのフラグメントおよびアミノ酸配列変異体も本発明の範囲内に含まれる
。さらに、ｈＶＥＧＦを結合し得るｈＶＥＧＦレセプターおよびそれらのフラグ
メントおよびアミノ酸配列変異体も本発明の範囲内に含まれる。 ここで使用する「ｈＶＥＧＦ」という用語は、リュング等、Science 246:1306
（1989年）、及びフック等、Mol．Endocrin．5:1806（1991年）に記載されてい
るような、165−アミノ酸ヒト血管内皮細胞増殖因子、および関連のある121−、
189−および206−アミノ酸血管内皮細胞増殖因子と、これら増殖因子の天然に生
じる対立遺伝子体およびプロセシングを受けた形態を意味する。 ここで使用する「ｈＶＥＧＦレセプター」または「ｈＶＥＧＦr」という用語
は、ｈＶＥＧＦの細胞レセプターで、通常は血管内皮細胞に見られる細胞表面レ
セプター、並びにｈＶＥＧＦを結合する能力を保持しているそれらのフラグメン
トと変異体を意味する。典型的には、ｈＶＥＧＦアンタゴニストであるｈＶＥＧ
Ｆレセプターおよびそれらのフラグメント及び変異体は、天然での場合のように
細胞膜中に組み入れられるかまたは細胞表面に固定されているというよりむしろ
単離された形態であろう。ｈＶＥＧＦレセプターの一例は、fms様チロシンキナ
ーゼ（ｆｌｔ又はｆｌｔ−１）、即ちチロシンキナーゼ属の膜貫通レセプターで
ある。デブリーズ（DeVries）等、Science 255:989（1992年）；シブヤ（Shibuy
a）等、Oncogene 5:519（1990年）。全長ｆｌｔレセプターは、チロシンキナー
ゼ活性を持つ細胞内ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞外ドメインを含んで
いる。細胞外ドメインはｈＶＥＧＦの結合に関与しているが、細胞内ドメインは
シグナル伝達に関与している。
【０００７】 ｈＶＥＧＦレセプターのもう一つの例はｆｌｋ−１レセプター（ＫＤＲとも称
される）である。マシューズ（Matthews）等、Proc．Nat．Acad．Sci．88:9026
（1991年）；ターマン（Terman）等、Oncogene 6:1677（1991年）；ターマン等
、Biochem．Biophys．Res．Commun．187:1579（1992年）。 ｈＶＥＧＦとｆｌｔレセプターの結合によって、見かけ上の分子量が205,000
と300,000ダルトンである少なくとも２つの高分子量複合体が形成される。300,0
00ダルトンの複合体はｈＶＥＧＦの１分子にレセプター２分子が結合したものを
含む二量体であると考えられる。 ｈＶＥＧＦrの変異体も本発明の範囲内に含まれる。代表的な例には、少なく
とも膜貫通および細胞質ドメインが全長レセプター分子から欠失しているレセプ
ターの切断型、および非ｈＶＥＧＦrポリマーまたはポリペプチドがｈＶＥＧＦr
と抱合している融合タンパク質、または好ましくはそれらの切断型が含まれる。
このような非ｈＶＥＧＦポリペプチドの例は免疫グロブリンである。その場合に
は、例えば、ｈＶＥＧＦrの細胞外ドメイン配列は免疫グロブリン軽鎖または（
好ましくは）重鎖のＦｖドメインと置換しており、レセプターの細胞外ドメイン
のＣ末端は重鎖のＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２または他のフラグメントのアミノ末端
と共有結合している。このような変異体は既知のイムノアドヘシンと同じように
して製造される。例えば、ガスコイン（Gascoigne）等、Proc．Nat．Acad．Sci
．84:2936（1987年）；カポン（Capon）等、Nature 337:525（1989年）；アルフ
ォ（Aruffo）等、Cell 61:1303（1990年）；アシュケナジ（Ashkenazi）等、Pro
c．Nat．Acad．Sci．88:10535（1991年）；ベネット（Bennett）等、J．Biol．C
hem．266:23060（1991年）参照。種々のｆｌｔ−ＩｇＧ融合タンパク質の例を以
下の実施例３に記載する。本発明において使用を意図しているｈＶＥＧＦレセプ
ターの細胞外ドメインの切断された形態には、ＥＣＤフラグメント（例えば、欠
失したＥＣＤ配列において一又は複数のアミノ酸を有するもの）及び欠失したＥ
ＣＤにおいて一又は複数の免疫グロブリン様ドメインを有するＥＣＤ形態のもの
が含まれる。例えば、実施例３Ｂには、Ｆｃ−ＩｇＧに融合したｆｌｔの最初の
３つの免疫グロブリン様ドメインのみを含有する切断された形態のＥＣＤが記載
されている。好ましくは、アンタゴニスト分子の作製に使用される切断された形
態のＥＣＤは、ｈＶＥＧＦに対する所望の結合を確実にするのに十分な免疫グロ
ブリン様ドメインを含む。
される）である。マシューズ（Matthews）等、Proc．Nat．Acad．Sci．88:9026
（1991年）；ターマン（Terman）等、Oncogene 6:1677（1991年）；ターマン等
、Biochem．Biophys．Res．Commun．187:1579（1992年）。 ｈＶＥＧＦとｆｌｔレセプターの結合によって、見かけ上の分子量が205,000
と300,000ダルトンである少なくとも２つの高分子量複合体が形成される。300,0
00ダルトンの複合体はｈＶＥＧＦの１分子にレセプター２分子が結合したものを
含む二量体であると考えられる。 ｈＶＥＧＦrの変異体も本発明の範囲内に含まれる。代表的な例には、少なく
とも膜貫通および細胞質ドメインが全長レセプター分子から欠失しているレセプ
ターの切断型、および非ｈＶＥＧＦrポリマーまたはポリペプチドがｈＶＥＧＦr
と抱合している融合タンパク質、または好ましくはそれらの切断型が含まれる。
このような非ｈＶＥＧＦポリペプチドの例は免疫グロブリンである。その場合に
は、例えば、ｈＶＥＧＦrの細胞外ドメイン配列は免疫グロブリン軽鎖または（
好ましくは）重鎖のＦｖドメインと置換しており、レセプターの細胞外ドメイン
のＣ末端は重鎖のＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２または他のフラグメントのアミノ末端
と共有結合している。このような変異体は既知のイムノアドヘシンと同じように
して製造される。例えば、ガスコイン（Gascoigne）等、Proc．Nat．Acad．Sci
．84:2936（1987年）；カポン（Capon）等、Nature 337:525（1989年）；アルフ
ォ（Aruffo）等、Cell 61:1303（1990年）；アシュケナジ（Ashkenazi）等、Pro
c．Nat．Acad．Sci．88:10535（1991年）；ベネット（Bennett）等、J．Biol．C
hem．266:23060（1991年）参照。種々のｆｌｔ−ＩｇＧ融合タンパク質の例を以
下の実施例３に記載する。本発明において使用を意図しているｈＶＥＧＦレセプ
ターの細胞外ドメインの切断された形態には、ＥＣＤフラグメント（例えば、欠
失したＥＣＤ配列において一又は複数のアミノ酸を有するもの）及び欠失したＥ
ＣＤにおいて一又は複数の免疫グロブリン様ドメインを有するＥＣＤ形態のもの
が含まれる。例えば、実施例３Ｂには、Ｆｃ−ＩｇＧに融合したｆｌｔの最初の
３つの免疫グロブリン様ドメインのみを含有する切断された形態のＥＣＤが記載
されている。好ましくは、アンタゴニスト分子の作製に使用される切断された形
態のＥＣＤは、ｈＶＥＧＦに対する所望の結合を確実にするのに十分な免疫グロ
ブリン様ドメインを含む。
【０００８】 他の実施態様では、ｈＶＥＧＦr又はそれらのフラグメント又は変異体は、ポ
リエチレングリコール（ＰＥＧ）のような非タンパク様ポリマー（例えば、デー
ビス（Davis）等、米国特許第4,179,337号；グッドソン（Goodson）等、BioTech
no1ogy 8:343〜346（1990年）；アバチョウスキー（Abuchowski）等、J．Biol．
Chem．252:3578（1977年）；アバチョウスキー等、J．Biol．Chem．252:3582（1
977年）参照）または炭水化物（例えば、マーシャル（Marshall）等、Arch．Bio
chem．Biophys．167:77（1975年）参照）と抱合している。これは、ｈＶＥＧＦr
の生物学的半減期を延ばし、レセプターが投与される哺乳動物で免疫原性である
可能性を減少させるのに役立つ。 ｈＶＥＧＦrは、アンタゴニストの親和性およびｈＶＥＧＦに対するその原子
価を考慮して、ｈＶＥＧＦの抗体と実質的に同じ態様で使用される。ｈＶＥＧＦ
レセプター自体または免疫グロブリンポリペプチドもしくは他の担体ポリペプチ
ドと融合したｈＶＥＧＦレセプターの細胞外ドメイン配列は、宿主中に存在して
いるが細胞表面のｈＶＥＧＦrと結合していないｈＶＥＧＦを隔離する能力によ
って、ｈＶＥＧＦのアンタゴニストとして特に有用である。 ｈＶＥＧＦrとそのフラグメント及び変異体は、ｈＶＥＧＦのアゴニストおよ
びアンタゴニストを同定するスクリーニングアッセイにも有用である。例えば、
ｈＶＥＧＦr（例えば、ｆｌｔまたはｆｌｋ−１）をコードするＤＮＡでトラン
スフェクションされた宿主細胞は細胞表面でレセプターポリペプチドを過剰発現
し、このような組換え体宿主細胞を、試験化合物（例えば、小分子、線形もしく
は環状ペプチドまたはポリペプチド）のｈＶＥＧＦrとの結合能の分析に理想的
に適したものとする。ｈＶＥＧＦrおよびｈＶＥＧＦr融合タンパク質、例えばｈ
ＶＥＧＦr−ＩgＧ融合タンパク質は類似の態様で使用することができる。例えば
、融合タンパク質を固定支持体に結合させ、試験化合物が融合タンパク質のｈＶ
ＥＧＦrドメインから放射標識ｈＶＥＧＦを追い出す能力を測定する。 ｈＶＥＧＦ、ｈＶＥＧＦレセプター、抗体または他のタンパク質に関して使用
される用語「組換え体」は、宿主細胞中で組換え体ＤＮＡ発現によって産生され
るタンパク質を意味する。宿主細胞は原核細胞（例えば、大腸菌のような細菌細
胞）または真核細胞（例えば、酵母または哺乳動物細胞）でありうる。
リエチレングリコール（ＰＥＧ）のような非タンパク様ポリマー（例えば、デー
ビス（Davis）等、米国特許第4,179,337号；グッドソン（Goodson）等、BioTech
no1ogy 8:343〜346（1990年）；アバチョウスキー（Abuchowski）等、J．Biol．
Chem．252:3578（1977年）；アバチョウスキー等、J．Biol．Chem．252:3582（1
977年）参照）または炭水化物（例えば、マーシャル（Marshall）等、Arch．Bio
chem．Biophys．167:77（1975年）参照）と抱合している。これは、ｈＶＥＧＦr
の生物学的半減期を延ばし、レセプターが投与される哺乳動物で免疫原性である
可能性を減少させるのに役立つ。 ｈＶＥＧＦrは、アンタゴニストの親和性およびｈＶＥＧＦに対するその原子
価を考慮して、ｈＶＥＧＦの抗体と実質的に同じ態様で使用される。ｈＶＥＧＦ
レセプター自体または免疫グロブリンポリペプチドもしくは他の担体ポリペプチ
ドと融合したｈＶＥＧＦレセプターの細胞外ドメイン配列は、宿主中に存在して
いるが細胞表面のｈＶＥＧＦrと結合していないｈＶＥＧＦを隔離する能力によ
って、ｈＶＥＧＦのアンタゴニストとして特に有用である。 ｈＶＥＧＦrとそのフラグメント及び変異体は、ｈＶＥＧＦのアゴニストおよ
びアンタゴニストを同定するスクリーニングアッセイにも有用である。例えば、
ｈＶＥＧＦr（例えば、ｆｌｔまたはｆｌｋ−１）をコードするＤＮＡでトラン
スフェクションされた宿主細胞は細胞表面でレセプターポリペプチドを過剰発現
し、このような組換え体宿主細胞を、試験化合物（例えば、小分子、線形もしく
は環状ペプチドまたはポリペプチド）のｈＶＥＧＦrとの結合能の分析に理想的
に適したものとする。ｈＶＥＧＦrおよびｈＶＥＧＦr融合タンパク質、例えばｈ
ＶＥＧＦr−ＩgＧ融合タンパク質は類似の態様で使用することができる。例えば
、融合タンパク質を固定支持体に結合させ、試験化合物が融合タンパク質のｈＶ
ＥＧＦrドメインから放射標識ｈＶＥＧＦを追い出す能力を測定する。 ｈＶＥＧＦ、ｈＶＥＧＦレセプター、抗体または他のタンパク質に関して使用
される用語「組換え体」は、宿主細胞中で組換え体ＤＮＡ発現によって産生され
るタンパク質を意味する。宿主細胞は原核細胞（例えば、大腸菌のような細菌細
胞）または真核細胞（例えば、酵母または哺乳動物細胞）でありうる。
【０００９】 （アンタゴニスト抗体） ここで使用する「モノクローナル抗体」という用語は実質的に同種の抗体集団
から得られる抗体、即ち、少量で存在することがある天然に生じうる突然変異を
除いて、特異性および親和性が同一の集団を構成する個々の抗体を意味する。こ
のような天然に生じる突然変異等の結果として、ｈＶＥＧＦ、ｈＶＥＧＦrまた
はｈＶＥＧＦrと会合したｈＶＥＧＦを含む複合体（「ｈＶＥＧＦ−ｈＶＥＧＦr
複合体」）と特異的に結合し得る抗体を主として含有する本発明のモノクローナ
ル抗体組成物は少量の他の抗体も含有する可能性があることは理解されなければ
ならない。 よって、「モノクローナル」という修飾語は、このような実質的に同種の抗体
集団から得られるような抗体の特徴を示すものであって、何か特別の方法で抗体
が産生されることを要求していると考えるべきでない。例えば、本発明のモノク
ローナル抗体は、最初にコーラー（Kohler）およびミルスタイン（Milstein）、
Nature256:495（1975年）に記載されたハイブリドーマ方法を使用して製造する
ことができ、または組換えＤＮＡ方法によって製造することができる。カビリ（
Cabilly）等、米国特許第4,816,567号を参照されたい。 ハイブリドーマ方法では、マウスまたは他の適当な宿主動物を皮下、腹腔内、
または筋肉内経路で抗原を用いて免疫化して、免疫化に使用されたタンパク質と
特異的に結合する抗体を産生するかまたは産生し得るリンパ球を誘引する。或い
は、リンパ球をインビトロで免疫化することができる。次に、リンパ球はポリエ
チレングリコールのような適当な融合剤を使用してミエローマ細胞と融合させて
ハイブリドーマ細胞を形成させる。ゴーディング（Goding）、モノクローナル抗
体：原理と実際、59〜103頁（Academic Press、1986年）。 抗原はｈＶＥＧＦ、ｈＶＥＧＦr、またはｈＶＥＧＦ−ｈＶＥＧＦr複合体であ
りうる。抗原は、場合によってはｈＶＥＧＦとそのレセプターの１つとの結合に
関与する一又は複数のアミノ酸残基を有するｈＶＥＧＦまたはｈＶＥＧＦrのい
ずれか１つのフラグメントまたは部分又は変異体である。例えば、ｈＶＥＧＦr
の細胞外ドメイン配列（例えば、少なくとも膜貫通および細胞内ドメインを欠失
している切断ｈＶＥＧＦrポリペプチド）による免疫化は、ｈＶＥＧＦ結合に関
与しているのが細胞外ドメイン内の領域であるので、ｈＶＥＧＦのアンタゴニス
トである抗体を産生するのに特に有用であろう。
から得られる抗体、即ち、少量で存在することがある天然に生じうる突然変異を
除いて、特異性および親和性が同一の集団を構成する個々の抗体を意味する。こ
のような天然に生じる突然変異等の結果として、ｈＶＥＧＦ、ｈＶＥＧＦrまた
はｈＶＥＧＦrと会合したｈＶＥＧＦを含む複合体（「ｈＶＥＧＦ−ｈＶＥＧＦr
複合体」）と特異的に結合し得る抗体を主として含有する本発明のモノクローナ
ル抗体組成物は少量の他の抗体も含有する可能性があることは理解されなければ
ならない。 よって、「モノクローナル」という修飾語は、このような実質的に同種の抗体
集団から得られるような抗体の特徴を示すものであって、何か特別の方法で抗体
が産生されることを要求していると考えるべきでない。例えば、本発明のモノク
ローナル抗体は、最初にコーラー（Kohler）およびミルスタイン（Milstein）、
Nature256:495（1975年）に記載されたハイブリドーマ方法を使用して製造する
ことができ、または組換えＤＮＡ方法によって製造することができる。カビリ（
Cabilly）等、米国特許第4,816,567号を参照されたい。 ハイブリドーマ方法では、マウスまたは他の適当な宿主動物を皮下、腹腔内、
または筋肉内経路で抗原を用いて免疫化して、免疫化に使用されたタンパク質と
特異的に結合する抗体を産生するかまたは産生し得るリンパ球を誘引する。或い
は、リンパ球をインビトロで免疫化することができる。次に、リンパ球はポリエ
チレングリコールのような適当な融合剤を使用してミエローマ細胞と融合させて
ハイブリドーマ細胞を形成させる。ゴーディング（Goding）、モノクローナル抗
体：原理と実際、59〜103頁（Academic Press、1986年）。 抗原はｈＶＥＧＦ、ｈＶＥＧＦr、またはｈＶＥＧＦ−ｈＶＥＧＦr複合体であ
りうる。抗原は、場合によってはｈＶＥＧＦとそのレセプターの１つとの結合に
関与する一又は複数のアミノ酸残基を有するｈＶＥＧＦまたはｈＶＥＧＦrのい
ずれか１つのフラグメントまたは部分又は変異体である。例えば、ｈＶＥＧＦr
の細胞外ドメイン配列（例えば、少なくとも膜貫通および細胞内ドメインを欠失
している切断ｈＶＥＧＦrポリペプチド）による免疫化は、ｈＶＥＧＦ結合に関
与しているのが細胞外ドメイン内の領域であるので、ｈＶＥＧＦのアンタゴニス
トである抗体を産生するのに特に有用であろう。
【００１０】 ｈＶＥＧＦ−ｈＶＥＧＦr複合体と結合し得るモノクローナル抗体は、特に非
会合（非複合化）ｈＶＥＧＦおよびｈＶＥＧＦrにも結合しないならば、有用で
ある。よって、このような抗体はｈＶＥＧＦによって直ぐに活性化を受ける細胞
と結合するだけで、従って哺乳動物中に通常見られるような遊離のｈＶＥＧＦま
たはｈＶＥＧＦrでは隔絶されない。このような抗体は、典型的には、レセプタ
ーとｈＶＥＧＦ間の一または複数の接触点に及ぶエピトープと結合する。このよ
うな抗体は他のリガンドレセプター複合体に対して産生されており、ここで同じ
態様で産生させることができる。これらの抗体は、抗体が非会合ｈＶＥＧＦまた
はｈＶＥＧＦrと結合し得るか否かに拘わらず、非会合ｈＶＥＧＦもしくはｈＶ
ＥＧＦrの生物学的活性を中和または阻止する必要はなく、中和または阻止する
こともできない。 このようにして調製されたハイブリドーマ細胞は、融合していない親ミエロー
マ細胞の増殖または生存を阻止する一又は複数の物質を好ましくは含有する適当
な培養培地に接種し、増殖させる。例えば、親ミエローマ細胞が酵素ヒポキサン
チン・グアニン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰ
ＲＴ）を欠いている場合、ハイブリドーマ用の培地は典型的にはヒポキサンチン
、アミノプテリンおよびチミジンを含有し（ＨＡＴ培地）、これら物質がＨＧＰ
ＲＴ欠損細胞の増殖を阻止する。 好ましいミエローマ細胞は効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗
体の安定した高レベル発現を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に感受性であるも
のである。これらのなかで、好ましいミエローマ細胞株はネズミミエローマ株、
例えば、米国カリフォルニア州サンジエゴのソーク・インスチチュート・セル・
ディストリビューション・センター（Salk Institute Cell Distribution Cente
r）から入手できるＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍、米国バージ
ニア州マナッサスのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手で
きるＳＰ−２細胞、およびイエルトン（Yelton）等がCurr．Top．Microbiol．Im
munol．81:1（1978年）に記載したＰ３Ｘ６３Ａg８Ｕ．１細胞から誘導されるも
のである。ヒトミエローマおよびマウス−ヒトヘテロミエローマ細胞株もヒトモ
ノクローナル抗体の産生に対して記載されている。コズボル（Kozbor）、J．Imm
unol．133:3001（1984年）；ブロデュア（Brodeur）等のモノクローナル抗体産
生技術と応用、51〜63頁（Marcel Dekker，Inc．ニューヨーク、1987年）。 ハイブリドーマ細胞が増殖している培地は、抗原に対するモノクローナル抗体
の産生についてアッセイされる。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生
されたモノクローナル抗体の結合特異性は免疫沈降法またはインビトロ結合アッ
セイ、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着検定法（
ＥＬＩＳＡ）によって測定される。本発明のモノクローナル抗体は、ｈＶＥＧＦ
、ｈＶＥＧＦrもしくはｈＶＥＧＦ−ｈＶＥＧＦr複合体を優先的に免疫沈降させ
るかまたは結合アッセイで上記抗原の少なくとも１つと優先的に結合し、ｈＶＥ
ＧＦの生物学的活性を阻止し得るものである。
会合（非複合化）ｈＶＥＧＦおよびｈＶＥＧＦrにも結合しないならば、有用で
ある。よって、このような抗体はｈＶＥＧＦによって直ぐに活性化を受ける細胞
と結合するだけで、従って哺乳動物中に通常見られるような遊離のｈＶＥＧＦま
たはｈＶＥＧＦrでは隔絶されない。このような抗体は、典型的には、レセプタ
ーとｈＶＥＧＦ間の一または複数の接触点に及ぶエピトープと結合する。このよ
うな抗体は他のリガンドレセプター複合体に対して産生されており、ここで同じ
態様で産生させることができる。これらの抗体は、抗体が非会合ｈＶＥＧＦまた
はｈＶＥＧＦrと結合し得るか否かに拘わらず、非会合ｈＶＥＧＦもしくはｈＶ
ＥＧＦrの生物学的活性を中和または阻止する必要はなく、中和または阻止する
こともできない。 このようにして調製されたハイブリドーマ細胞は、融合していない親ミエロー
マ細胞の増殖または生存を阻止する一又は複数の物質を好ましくは含有する適当
な培養培地に接種し、増殖させる。例えば、親ミエローマ細胞が酵素ヒポキサン
チン・グアニン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰ
ＲＴ）を欠いている場合、ハイブリドーマ用の培地は典型的にはヒポキサンチン
、アミノプテリンおよびチミジンを含有し（ＨＡＴ培地）、これら物質がＨＧＰ
ＲＴ欠損細胞の増殖を阻止する。 好ましいミエローマ細胞は効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗
体の安定した高レベル発現を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に感受性であるも
のである。これらのなかで、好ましいミエローマ細胞株はネズミミエローマ株、
例えば、米国カリフォルニア州サンジエゴのソーク・インスチチュート・セル・
ディストリビューション・センター（Salk Institute Cell Distribution Cente
r）から入手できるＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍、米国バージ
ニア州マナッサスのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手で
きるＳＰ−２細胞、およびイエルトン（Yelton）等がCurr．Top．Microbiol．Im
munol．81:1（1978年）に記載したＰ３Ｘ６３Ａg８Ｕ．１細胞から誘導されるも
のである。ヒトミエローマおよびマウス−ヒトヘテロミエローマ細胞株もヒトモ
ノクローナル抗体の産生に対して記載されている。コズボル（Kozbor）、J．Imm
unol．133:3001（1984年）；ブロデュア（Brodeur）等のモノクローナル抗体産
生技術と応用、51〜63頁（Marcel Dekker，Inc．ニューヨーク、1987年）。 ハイブリドーマ細胞が増殖している培地は、抗原に対するモノクローナル抗体
の産生についてアッセイされる。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生
されたモノクローナル抗体の結合特異性は免疫沈降法またはインビトロ結合アッ
セイ、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着検定法（
ＥＬＩＳＡ）によって測定される。本発明のモノクローナル抗体は、ｈＶＥＧＦ
、ｈＶＥＧＦrもしくはｈＶＥＧＦ−ｈＶＥＧＦr複合体を優先的に免疫沈降させ
るかまたは結合アッセイで上記抗原の少なくとも１つと優先的に結合し、ｈＶＥ
ＧＦの生物学的活性を阻止し得るものである。
【００１１】 ハイブリドーマ細胞が所望の特異性、親和性および活性のアンタゴニスト抗体
を産生することを確認した後、クローンを限界希釈法でサブクローン化し、標準
的方法で増殖させることができる。ゴーディング、モノクローナル抗体：原理と
実際、59〜104頁（Academic Press、1986年）。この目的に適する培地には、例
えば、ダルベッコの修正イーグル培地またはＲＰＭＩ−1640培地が含まれる。さ
らに、ハイブリドーマ細胞は動物の腹水腫瘍としてインビボで増殖させることが
できる。 サブクローンが分泌したモノクローナル抗体は、例えば、プロテインＡ−セフ
ァロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析また
はアフィニティクロマトグラフィーのような慣用の免疫グロブリン精製方法を使
用して培地、腹水または血清から適切に分離される。 本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは容易に単離されそして常套
的な方法を使用して（例えば、ネズミ抗体の重および軽鎖をコードする遺伝子と
特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを使用して）配列が決定される
。本発明のハイブリドーマ細胞はこのようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひ
とたび単離されると、ＤＮＡを発現ベクター中に入れ、次にこれをシミアンＣＯ
Ｓ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または免疫グロブリンタ
ンパク質を産生等しないミエローマ細胞のような宿主細胞中にトランスフェクシ
ョンして組換え体宿主細胞内でモノクローナル抗体の合成を得る。 場合によっては、発現によって産生される免疫グロブリンの特性を変えるため
にＤＮＡを修飾することができる。例えば、ネズミ抗体のヒト型化形態は、ネズ
ミ抗体可変ドメインの相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒト抗体の対応する領域で置
換することによって産生される。或る実施態様では、ネズミ抗体の選択されたフ
レームワーク領域（ＦＲ）アミノ酸残基がまたヒト抗体中の対応するアミノ酸残
基で置換される。カーター（Carter）等、Proc．Nat．Acad．Sci．89:4285（199
2年）；カーター等、BioTechno1ogy 10:163（1992年）。ネズミ抗体のキメラ形
態も、選択したヒト重および軽鎖定常ドメインのコード化配列を同種ネズミ配列
の代わりに置換して産生される。カビリ等、米国特許第4,816,567号；モリソン
（Morrison）等、Proc．Nat．Acad．Sci．81:6851（1984年）。
を産生することを確認した後、クローンを限界希釈法でサブクローン化し、標準
的方法で増殖させることができる。ゴーディング、モノクローナル抗体：原理と
実際、59〜104頁（Academic Press、1986年）。この目的に適する培地には、例
えば、ダルベッコの修正イーグル培地またはＲＰＭＩ−1640培地が含まれる。さ
らに、ハイブリドーマ細胞は動物の腹水腫瘍としてインビボで増殖させることが
できる。 サブクローンが分泌したモノクローナル抗体は、例えば、プロテインＡ−セフ
ァロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析また
はアフィニティクロマトグラフィーのような慣用の免疫グロブリン精製方法を使
用して培地、腹水または血清から適切に分離される。 本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは容易に単離されそして常套
的な方法を使用して（例えば、ネズミ抗体の重および軽鎖をコードする遺伝子と
特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを使用して）配列が決定される
。本発明のハイブリドーマ細胞はこのようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひ
とたび単離されると、ＤＮＡを発現ベクター中に入れ、次にこれをシミアンＣＯ
Ｓ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または免疫グロブリンタ
ンパク質を産生等しないミエローマ細胞のような宿主細胞中にトランスフェクシ
ョンして組換え体宿主細胞内でモノクローナル抗体の合成を得る。 場合によっては、発現によって産生される免疫グロブリンの特性を変えるため
にＤＮＡを修飾することができる。例えば、ネズミ抗体のヒト型化形態は、ネズ
ミ抗体可変ドメインの相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒト抗体の対応する領域で置
換することによって産生される。或る実施態様では、ネズミ抗体の選択されたフ
レームワーク領域（ＦＲ）アミノ酸残基がまたヒト抗体中の対応するアミノ酸残
基で置換される。カーター（Carter）等、Proc．Nat．Acad．Sci．89:4285（199
2年）；カーター等、BioTechno1ogy 10:163（1992年）。ネズミ抗体のキメラ形
態も、選択したヒト重および軽鎖定常ドメインのコード化配列を同種ネズミ配列
の代わりに置換して産生される。カビリ等、米国特許第4,816,567号；モリソン
（Morrison）等、Proc．Nat．Acad．Sci．81:6851（1984年）。
【００１２】 本発明において使用が考えられる特定のヒト化抗体には、公開されたPCT出願W
O98/45331（1998年10月15日公開）及びWO98/45332（1998年10月15日公開）に記
載されているヒト化及び親和成熟抗ｈＶＥＧＦ抗体が含まれる。このようなヒト
化又は親和成熟抗ＶＥＧＦ抗体はWO98/45331及びWO98/45332に記載されている方
法と技術を使用して調製され又は作製されうる。好ましくは、抗ｈＶＥＧＦ抗体
は、上述したPCT出願において、ＹＯ３１７と命名された親和成熟抗体、又はＦ
（ａｂ）−１２と命名されたヒト化Ｆ（ａｂ）を含む。Ｆｉｇ１４Ａ−Ｂ及び１
５Ａ−Ｂは、ＹＯ１９２；ＹＯ２３８−３；ＹＯ２３９−１９；ＹＯ３１３−２
；ＹＯ２４３−１；及びＹＯ３１３−１と命名された他の親和成熟抗ＶＥＧＦ抗
体と共に、これらの抗ＶＥＧＦ抗体のアミノ酸配列（軽及び重鎖）を示している
。このような抗ＶＥＧＦ抗体は全てここで記載した方法での使用が考えられるも
のである。これらのPCT出願に開示されているように、いくつかのヒト化及び親
和成熟抗体は異なる種類のインビトロアッセイにおいてＶＥＧＦ活性を低減又は
阻害し、よってＶＥＧＦアンタゴニストとして作用することが示された。 よって、本発明の範囲内に含まれる抗体には、ｈＶＥＧＦ、ｈＶＥＧＦrまた
はｈＶＥＧＦ−ｈＶＥＧＦr複合体、並びに非ｈＶＥＧＦエピトープと結合し得
る免疫グロブリン鎖を有するキメラ（「ヒト化型」を含む）抗体およびハイブリ
ッド抗体のような変異体抗体が含まれる。 ここでの抗体には、全ての起源種、並びに免疫グロブリンクラス（例えば、Ｉ
gＡ、ＩgＤ、ＩgＥ、ＩgＧおよびＩgＭ）およびサブクラス、並びに抗体フラグ
メント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ）が、ｈＶＥＧＦ、ｈＶ
ＥＧＦrまたはｈＶＥＧＦ−ｈＶＥＧＦr複合体と結合可能であり、ｈＶＥＧＦの
生物学的活性と拮抗し得る限り、含まれる。 本発明の好ましい実施態様では、抗体は、例えば、ムンソン（Munson）および
ポラード（Pollard）、Anal．Biochem．107:220（1980年）のスカッチャード分
析によって測定して、免疫化抗原に対して少なくとも約109リツトル／モルの親
和性を有する。さらに、モノクローナル抗体は典型的には、例えば、WO98/45331
及びWO98/45332に記載されたような、又は実施例２に記載されるようなインビト
ロ細胞生存または増殖アッセイによって測定して、ｈＶＥＧＦの細胞***促進活
性または脈管形成活性を少なくとも約50％、好ましくは80％を越えて、そして最
も好ましくは90％を越えて阻止する。 或る治療上および診断上の応用に対しては、モノクローナル抗体がｈＶＥＧＦ
の異なる分子形態の全てよりもより少ないものと反応性であることが望ましい。
例えば、165−アミノ酸配列ｈＶＥＧＦとは特異的に結合できるが121−または18
9−アミノ酸配列ｈＶＥＧＦポリペプチドとは結合できないモノクローナル抗体
を有することが望ましい。このような抗体は異なったｈＶＥＧＦポリペプチドの
比較ＥＬＩＳＡアッセイまたは比較免疫沈降法によって容易に同定される。
O98/45331（1998年10月15日公開）及びWO98/45332（1998年10月15日公開）に記
載されているヒト化及び親和成熟抗ｈＶＥＧＦ抗体が含まれる。このようなヒト
化又は親和成熟抗ＶＥＧＦ抗体はWO98/45331及びWO98/45332に記載されている方
法と技術を使用して調製され又は作製されうる。好ましくは、抗ｈＶＥＧＦ抗体
は、上述したPCT出願において、ＹＯ３１７と命名された親和成熟抗体、又はＦ
（ａｂ）−１２と命名されたヒト化Ｆ（ａｂ）を含む。Ｆｉｇ１４Ａ−Ｂ及び１
５Ａ−Ｂは、ＹＯ１９２；ＹＯ２３８−３；ＹＯ２３９−１９；ＹＯ３１３−２
；ＹＯ２４３−１；及びＹＯ３１３−１と命名された他の親和成熟抗ＶＥＧＦ抗
体と共に、これらの抗ＶＥＧＦ抗体のアミノ酸配列（軽及び重鎖）を示している
。このような抗ＶＥＧＦ抗体は全てここで記載した方法での使用が考えられるも
のである。これらのPCT出願に開示されているように、いくつかのヒト化及び親
和成熟抗体は異なる種類のインビトロアッセイにおいてＶＥＧＦ活性を低減又は
阻害し、よってＶＥＧＦアンタゴニストとして作用することが示された。 よって、本発明の範囲内に含まれる抗体には、ｈＶＥＧＦ、ｈＶＥＧＦrまた
はｈＶＥＧＦ−ｈＶＥＧＦr複合体、並びに非ｈＶＥＧＦエピトープと結合し得
る免疫グロブリン鎖を有するキメラ（「ヒト化型」を含む）抗体およびハイブリ
ッド抗体のような変異体抗体が含まれる。 ここでの抗体には、全ての起源種、並びに免疫グロブリンクラス（例えば、Ｉ
gＡ、ＩgＤ、ＩgＥ、ＩgＧおよびＩgＭ）およびサブクラス、並びに抗体フラグ
メント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ）が、ｈＶＥＧＦ、ｈＶ
ＥＧＦrまたはｈＶＥＧＦ−ｈＶＥＧＦr複合体と結合可能であり、ｈＶＥＧＦの
生物学的活性と拮抗し得る限り、含まれる。 本発明の好ましい実施態様では、抗体は、例えば、ムンソン（Munson）および
ポラード（Pollard）、Anal．Biochem．107:220（1980年）のスカッチャード分
析によって測定して、免疫化抗原に対して少なくとも約109リツトル／モルの親
和性を有する。さらに、モノクローナル抗体は典型的には、例えば、WO98/45331
及びWO98/45332に記載されたような、又は実施例２に記載されるようなインビト
ロ細胞生存または増殖アッセイによって測定して、ｈＶＥＧＦの細胞***促進活
性または脈管形成活性を少なくとも約50％、好ましくは80％を越えて、そして最
も好ましくは90％を越えて阻止する。 或る治療上および診断上の応用に対しては、モノクローナル抗体がｈＶＥＧＦ
の異なる分子形態の全てよりもより少ないものと反応性であることが望ましい。
例えば、165−アミノ酸配列ｈＶＥＧＦとは特異的に結合できるが121−または18
9−アミノ酸配列ｈＶＥＧＦポリペプチドとは結合できないモノクローナル抗体
を有することが望ましい。このような抗体は異なったｈＶＥＧＦポリペプチドの
比較ＥＬＩＳＡアッセイまたは比較免疫沈降法によって容易に同定される。
【００１３】 （細胞毒性部分との抱合体） 或る実施態様では、ｈＶＥＧＦ特異的モノクローナル抗体またはｈＶＥＧＦr
と抱合した細胞毒性部分を提供することが望ましい。これらの実施態様では、細
胞毒素はｈＶＥＧＦもしくはそのレセプターを発現または結合している細胞を無
力化するかまたは死滅させるのに役立つ。ｈＶＥＧＦ、ｈＶＥＧＦrまたはｈＶ
ＥＧＦ−ｈＶＥＧＦr複合体と結合し得るドメインによって抱合体が細胞に標的
とされる。しかして、ｈＶＥＧＦ、ｈＶＥＧＦrまたはｈＶＥＧＦ−ｈＶＥＧＦr
複合体と結合できるモノクローナル抗体が細胞毒素と抱合させられる。同様に、
ｈＶＥＧＦrが細胞毒素と抱合させられる。モノクローナル抗体は最も望ましく
は、ｈＶＥＧＦ単独（細胞毒素を有していない）の活性を中和できるが、この実
施態様ではモノクローナル抗体またはレセプターがｈＶＥＧＦ、ｈＶＥＧＦrま
たはｈＶＥＧＦ−ｈＶＥＧＦr複合体ともはや結合できる必要はない。 或るクラスの免疫グロブリンの場合には、モノクローナル抗体自体のＦｃドメ
インが細胞毒素を提供するようになることがある（例えばＩgＧ2抗体の場合には
、該抗体は補体を固定し、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）に関与することがで
きる）が、典型的には、細胞毒素はタンパク質細胞毒素、例えばジフテリア、リ
シンまたはシュードモナス毒素である。しかしながら、細胞毒素はタンパク質様
である必要はなく、例えば腫瘍治療用にこれまでに使用されている化学療法剤を
含めることができる。 細胞毒素は典型的には、抗体のＦｃドメイン内で（またはＦｃドメインの一部
もしくは全ての代わりに）骨格のアミド結合によってモノクローナル抗体または
そのフラグメントと結合する。標的化機能がｈＶＥＧＦｒによって提供される場
合、細胞毒性部分はｈＶＥＧＦ結合に関与しないレセプターの任意のドメイン上
に置換され；好ましくは、該部分はレセプターの膜貫通および／または細胞質ド
メインの代わりまたは該ドメイン上に置換される。最適な置換部位は日常的な実
験によって決定され、十分に通常の技量の範囲内である。 タンパク質融合体である抱合体は、抱合体をコードする遺伝子を発現させるこ
とによって組換え体細胞培養物中で容易に作成される。或いは、抱合体は、例え
ば、イミノチオレートやメチル−４−メルカプトブチリマデートを使用して、チ
オエステル結合によるジスルフィド交換または結合のようなそれ自体既知の方法
を使用して、細胞毒性部分を抗体またはレセプターのアミノ酸残基側鎖またはＣ
末端カルボキシルに共有的に交差結合させて製造される。
と抱合した細胞毒性部分を提供することが望ましい。これらの実施態様では、細
胞毒素はｈＶＥＧＦもしくはそのレセプターを発現または結合している細胞を無
力化するかまたは死滅させるのに役立つ。ｈＶＥＧＦ、ｈＶＥＧＦrまたはｈＶ
ＥＧＦ−ｈＶＥＧＦr複合体と結合し得るドメインによって抱合体が細胞に標的
とされる。しかして、ｈＶＥＧＦ、ｈＶＥＧＦrまたはｈＶＥＧＦ−ｈＶＥＧＦr
複合体と結合できるモノクローナル抗体が細胞毒素と抱合させられる。同様に、
ｈＶＥＧＦrが細胞毒素と抱合させられる。モノクローナル抗体は最も望ましく
は、ｈＶＥＧＦ単独（細胞毒素を有していない）の活性を中和できるが、この実
施態様ではモノクローナル抗体またはレセプターがｈＶＥＧＦ、ｈＶＥＧＦrま
たはｈＶＥＧＦ−ｈＶＥＧＦr複合体ともはや結合できる必要はない。 或るクラスの免疫グロブリンの場合には、モノクローナル抗体自体のＦｃドメ
インが細胞毒素を提供するようになることがある（例えばＩgＧ2抗体の場合には
、該抗体は補体を固定し、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）に関与することがで
きる）が、典型的には、細胞毒素はタンパク質細胞毒素、例えばジフテリア、リ
シンまたはシュードモナス毒素である。しかしながら、細胞毒素はタンパク質様
である必要はなく、例えば腫瘍治療用にこれまでに使用されている化学療法剤を
含めることができる。 細胞毒素は典型的には、抗体のＦｃドメイン内で（またはＦｃドメインの一部
もしくは全ての代わりに）骨格のアミド結合によってモノクローナル抗体または
そのフラグメントと結合する。標的化機能がｈＶＥＧＦｒによって提供される場
合、細胞毒性部分はｈＶＥＧＦ結合に関与しないレセプターの任意のドメイン上
に置換され；好ましくは、該部分はレセプターの膜貫通および／または細胞質ド
メインの代わりまたは該ドメイン上に置換される。最適な置換部位は日常的な実
験によって決定され、十分に通常の技量の範囲内である。 タンパク質融合体である抱合体は、抱合体をコードする遺伝子を発現させるこ
とによって組換え体細胞培養物中で容易に作成される。或いは、抱合体は、例え
ば、イミノチオレートやメチル−４−メルカプトブチリマデートを使用して、チ
オエステル結合によるジスルフィド交換または結合のようなそれ自体既知の方法
を使用して、細胞毒性部分を抗体またはレセプターのアミノ酸残基側鎖またはＣ
末端カルボキシルに共有的に交差結合させて製造される。
【００１４】 （他の部分との抱合体） ｈＶＥＧＦのアンタゴニストであるモノクローナル抗体およびｈＶＥＧＦrも
また、それら自体では細胞毒素として容易には分類されないが、ここでの組成物
の活性を増す物質と抱合される。例えば、ｈＶＥＧＦ、ｈＶＥＧＦrまたはｈＶ
ＥＧＦ−ｈＶＥＧＦr複合体と結合し得るモノクローナル抗体またはｈＶＥＧＦr
は、ウイルス配列のような異種ポリペプチド、細胞レセプター、ＴＮＦ、インタ
ーフェロンまたはインターロイキンのようなサイトカイン、凝血促進活性を有す
るポリペプチドおよび他の生物学的または免疫学的に活性なポリペプチドと融合
される。このような融合体は組換え方法によって容易に製造される。典型的には
、このような非免疫グロブリンポリペプチドは抗ｈＶＥＧＦもしくは抗ｈＶＥＧ
Ｆ−ｈＶＥＧＦr複合体抗体の定常ドメイン、またはｈＶＥＧＦrの膜貫通および
／または細胞内ドメインに置換される。或いは、それらは、ここに記載した抗ｈ
ＶＥＧＦ抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインに置換される。 好ましい実施態様では、このような非免疫グロブリンポリペプチドは、ここに
記載した抗体の定常ドメインと結合されるかまたはそれらに置換される。ベネッ
ト等、J．Biol．Chem．266:23060〜23067（1991年）。或いは、上記ポリペプチ
ドは本発明の抗体のＦｖに置換され、ｈＶＥＧＦ、ｈＶＥＧＦrまたはｈＶＥＧ
Ｆ−ｈＶＥＧＦr複合体に対して特異性を有する少なくとも１つの残存抗原結合
部位、および出発抗体とは異なる機能または特異性を有する代用抗原結合部位を
含むキメラ多価抗体が創製される。
また、それら自体では細胞毒素として容易には分類されないが、ここでの組成物
の活性を増す物質と抱合される。例えば、ｈＶＥＧＦ、ｈＶＥＧＦrまたはｈＶ
ＥＧＦ−ｈＶＥＧＦr複合体と結合し得るモノクローナル抗体またはｈＶＥＧＦr
は、ウイルス配列のような異種ポリペプチド、細胞レセプター、ＴＮＦ、インタ
ーフェロンまたはインターロイキンのようなサイトカイン、凝血促進活性を有す
るポリペプチドおよび他の生物学的または免疫学的に活性なポリペプチドと融合
される。このような融合体は組換え方法によって容易に製造される。典型的には
、このような非免疫グロブリンポリペプチドは抗ｈＶＥＧＦもしくは抗ｈＶＥＧ
Ｆ−ｈＶＥＧＦr複合体抗体の定常ドメイン、またはｈＶＥＧＦrの膜貫通および
／または細胞内ドメインに置換される。或いは、それらは、ここに記載した抗ｈ
ＶＥＧＦ抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインに置換される。 好ましい実施態様では、このような非免疫グロブリンポリペプチドは、ここに
記載した抗体の定常ドメインと結合されるかまたはそれらに置換される。ベネッ
ト等、J．Biol．Chem．266:23060〜23067（1991年）。或いは、上記ポリペプチ
ドは本発明の抗体のＦｖに置換され、ｈＶＥＧＦ、ｈＶＥＧＦrまたはｈＶＥＧ
Ｆ−ｈＶＥＧＦr複合体に対して特異性を有する少なくとも１つの残存抗原結合
部位、および出発抗体とは異なる機能または特異性を有する代用抗原結合部位を
含むキメラ多価抗体が創製される。
【００１５】 （異種特異性抗体） ｈＶＥＧＦ、ｈＶＥＧＦrまたはｈＶＥＧＦ−ｈＶＥＧＦr複合体と結合し得る
モノクローナル抗体は、列挙したエピトープ、典型的には１つの重−軽鎖複合体
またはそのフラグメントに対して１つの結合部位を有してさえいれば良い。しか
しながら、このような抗体は、場合によってはｈＶＥＧＦ、ｈＶＥＧＦrまたは
ｈＶＥＧＦ−ｈＶＥＧＦr複合体のいずれの内部にも見られないエピトープと結
合し得る抗原結合ドメインも有している。例えば、ｈＶＥＧＦ、ｈＶＥＧＦrま
たはｈＶＥＧＦ−ｈＶＥＧＦr複合体以外の抗原に対して特異性を有する抗体の
相補性決定残基および、必要ならば、フレームワーク残基で、天然の抗ｈＶＥＧ
Ｆ、抗ｈＶＥＧＦrまたは抗ｈＶＥＧＦ−抗ｈＶＥＧＦr複合体抗体の対応するア
ミノ酸配列またはアミノ酸残基を置換することによって、ｈＶＥＧＦ、ｈＶＥＧ
ＦrまたはｈＶＥＧＦ−ｈＶＥＧＦr複合体に対して特異性を有する１つの抗原結
合部位と非ｈＶＥＧＦ、ｈＶＥＧＦrまたはｈＶＥＧＦ−ｈＶＥＧＦr複合体抗原
に対して特異性を有するもう１つの抗原結合部位を含む多特異的抗体が創製され
る。これらの抗体は少なくとも二価であるが、選択される抗体クラスに所有され
ている抗原結合部位の数に応じて、多価であることもできる。例えば、ＩgＭク
ラスの抗体は多価である。 本発明の好ましい実施態様では、このような抗体はｈＶＥＧＦまたはｈＶＥＧ
Ｆrエピトープと、（ａ）プロテインＣもしくは組織因子のような血液凝固に活
性のポリペプチド、（ｂ）腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）のような細胞毒性タンパク質
、または（ｃ）ＣＤ４もしくはＨＥＲ−２レセプターのような非ｈＶＥＧＦr細
胞表面レセプターのいずれかと結合することができる（マッドン（Maddon）等、
Cell 42:93（1985年）；コーセンス（Coussens）等、Science 230:1137（1985年
））。異種特異性の多価抗体は、宿主細胞を両抗体の重鎖および軽鎖をコードす
るＤＮＡで同時形質転換させ、その後免疫アフィニティークロマトグラフィ等に
よって回収して簡便に製造され、発現された抗体の部分は所望の抗原結合特性を
有している。或いは、このような抗体は単一特異性抗体のインビトロ組換えによ
って製造される。
モノクローナル抗体は、列挙したエピトープ、典型的には１つの重−軽鎖複合体
またはそのフラグメントに対して１つの結合部位を有してさえいれば良い。しか
しながら、このような抗体は、場合によってはｈＶＥＧＦ、ｈＶＥＧＦrまたは
ｈＶＥＧＦ−ｈＶＥＧＦr複合体のいずれの内部にも見られないエピトープと結
合し得る抗原結合ドメインも有している。例えば、ｈＶＥＧＦ、ｈＶＥＧＦrま
たはｈＶＥＧＦ−ｈＶＥＧＦr複合体以外の抗原に対して特異性を有する抗体の
相補性決定残基および、必要ならば、フレームワーク残基で、天然の抗ｈＶＥＧ
Ｆ、抗ｈＶＥＧＦrまたは抗ｈＶＥＧＦ−抗ｈＶＥＧＦr複合体抗体の対応するア
ミノ酸配列またはアミノ酸残基を置換することによって、ｈＶＥＧＦ、ｈＶＥＧ
ＦrまたはｈＶＥＧＦ−ｈＶＥＧＦr複合体に対して特異性を有する１つの抗原結
合部位と非ｈＶＥＧＦ、ｈＶＥＧＦrまたはｈＶＥＧＦ−ｈＶＥＧＦr複合体抗原
に対して特異性を有するもう１つの抗原結合部位を含む多特異的抗体が創製され
る。これらの抗体は少なくとも二価であるが、選択される抗体クラスに所有され
ている抗原結合部位の数に応じて、多価であることもできる。例えば、ＩgＭク
ラスの抗体は多価である。 本発明の好ましい実施態様では、このような抗体はｈＶＥＧＦまたはｈＶＥＧ
Ｆrエピトープと、（ａ）プロテインＣもしくは組織因子のような血液凝固に活
性のポリペプチド、（ｂ）腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）のような細胞毒性タンパク質
、または（ｃ）ＣＤ４もしくはＨＥＲ−２レセプターのような非ｈＶＥＧＦr細
胞表面レセプターのいずれかと結合することができる（マッドン（Maddon）等、
Cell 42:93（1985年）；コーセンス（Coussens）等、Science 230:1137（1985年
））。異種特異性の多価抗体は、宿主細胞を両抗体の重鎖および軽鎖をコードす
るＤＮＡで同時形質転換させ、その後免疫アフィニティークロマトグラフィ等に
よって回収して簡便に製造され、発現された抗体の部分は所望の抗原結合特性を
有している。或いは、このような抗体は単一特異性抗体のインビトロ組換えによ
って製造される。
【００１６】 （一価抗体） ｈＶＥＧＦrまたはｈＶＥＧＦ−ｈＶＥＧＦr複合体と結合し得る一価抗体はｈ
ＶＥＧＦのアンタゴニストとして特に有用である。本発明を如何なる特定の生物
学的活性のメカニズムにも限定するものではないが、細胞ｈＶＥＧＦレセプター
の活性化は、ｈＶＥＧＦと細胞ｈＶＥＧＦレセプターとの結合がレセプターの凝
固を誘発し、ついで細胞内レセプターキナーゼ活性を活性化するというメカニズ
ムで進行すると考えられる。一価の抗ｈＶＥＧＦレセプター抗体はこのような凝
固を誘発できず、それ故上記メカニズムによってｈＶＥＧＦレセプターを活性化
できないので、上記抗体はｈＶＥＧＦの理想的なアンタゴニストである。 しかしながら、これらの抗体はレセプターのｈＶＥＧＦ結合部位を指向するか
またはそうでない場合、ｈＶＥＧＦレセプターと結合するｈＶＥＧＦを、例えば
レセプターに対するｈＶＥＧＦの接近を立体的に障害することによって、妨げる
ことが可能でなければならないことに注意すべきである。しかしながら、本願明
細書の他の場所で記載したように、ｈＶＥＧＦの結合を妨げることができない抗
ｈＶＥＧＦr抗体は、非免疫グロブリン部分、例えば細胞毒素と抱合したとき有
用である。 一価抗体の調製方法は当該分野で良く知られている。例えば、一つの方法は免
疫グロブリン軽鎖および修飾した重鎖の組換え発現を含む。重鎖は一般に重鎖架
橋を防止するようにＦｃ領域の任意の点で切断される。或いは、関連システイン
残基は、架橋を防止するようにもう一つのアミノ酸残基で置換されるかまたは欠
失される。インビトロ方法もまた一価抗体の調製に適している。例えば、Ｆａｂ
フラグメントは無傷の抗体の酵素開裂によって調製される。
ＶＥＧＦのアンタゴニストとして特に有用である。本発明を如何なる特定の生物
学的活性のメカニズムにも限定するものではないが、細胞ｈＶＥＧＦレセプター
の活性化は、ｈＶＥＧＦと細胞ｈＶＥＧＦレセプターとの結合がレセプターの凝
固を誘発し、ついで細胞内レセプターキナーゼ活性を活性化するというメカニズ
ムで進行すると考えられる。一価の抗ｈＶＥＧＦレセプター抗体はこのような凝
固を誘発できず、それ故上記メカニズムによってｈＶＥＧＦレセプターを活性化
できないので、上記抗体はｈＶＥＧＦの理想的なアンタゴニストである。 しかしながら、これらの抗体はレセプターのｈＶＥＧＦ結合部位を指向するか
またはそうでない場合、ｈＶＥＧＦレセプターと結合するｈＶＥＧＦを、例えば
レセプターに対するｈＶＥＧＦの接近を立体的に障害することによって、妨げる
ことが可能でなければならないことに注意すべきである。しかしながら、本願明
細書の他の場所で記載したように、ｈＶＥＧＦの結合を妨げることができない抗
ｈＶＥＧＦr抗体は、非免疫グロブリン部分、例えば細胞毒素と抱合したとき有
用である。 一価抗体の調製方法は当該分野で良く知られている。例えば、一つの方法は免
疫グロブリン軽鎖および修飾した重鎖の組換え発現を含む。重鎖は一般に重鎖架
橋を防止するようにＦｃ領域の任意の点で切断される。或いは、関連システイン
残基は、架橋を防止するようにもう一つのアミノ酸残基で置換されるかまたは欠
失される。インビトロ方法もまた一価抗体の調製に適している。例えば、Ｆａｂ
フラグメントは無傷の抗体の酵素開裂によって調製される。
【００１７】 （診断用途） 診断適用では、本発明の抗体またはｈＶＥＧＦrは典型的には検出可能部分で
標識される。検出可能部分は、検出可能なシグナルを直接的にまたは間接的に作
りだすことができる任意のものでありうる。例えば、検出可能部分は、3Ｈ、14
Ｃ、32Ｐ、35Ｓもしくは125Ｉのような放射性同位元素、蛍光イソチオシアネー
ト、ローダミンもしくはルシフェリンのような蛍光または化学ルミネセンス化合
物、例えば125Ｉ、32Ｐ、14Ｃもしくは3Ｈのような放射性同位元素標識、または
アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼもしくは西洋わさびペルオキシダ
ーゼのような酵素でありうる。 抗体またはｈＶＥＧＦrを検出可能部分と別個に抱合させる当該分野で既知の
任意の方法を使用することができ、これらの方法にはハンター（Hunter）等、Na
ture 144:945（1962年）；デービッド（David）等、Biochemistry 13:1014（197
4年）；ペイン（Pain）等、J．Immunol．Meth．40:219（1981年）；およびニグ
レン（Nygren）、J．Histochem．and Cytochem．30:407（1982年）に記載されて
いる方法が含まれる。本発明の抗体およびレセプターは既知の任意のアッセイ方
法、例えば競合結合アッセイ、直接および間接的サンドイッチアッセイおよび免
疫沈降アッセイを使用することができる。ゾラ（Zola）、モノクローナル抗体：
技術マニュアル、147〜158頁（CRC Press，Inc.、1987年）。
標識される。検出可能部分は、検出可能なシグナルを直接的にまたは間接的に作
りだすことができる任意のものでありうる。例えば、検出可能部分は、3Ｈ、14
Ｃ、32Ｐ、35Ｓもしくは125Ｉのような放射性同位元素、蛍光イソチオシアネー
ト、ローダミンもしくはルシフェリンのような蛍光または化学ルミネセンス化合
物、例えば125Ｉ、32Ｐ、14Ｃもしくは3Ｈのような放射性同位元素標識、または
アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼもしくは西洋わさびペルオキシダ
ーゼのような酵素でありうる。 抗体またはｈＶＥＧＦrを検出可能部分と別個に抱合させる当該分野で既知の
任意の方法を使用することができ、これらの方法にはハンター（Hunter）等、Na
ture 144:945（1962年）；デービッド（David）等、Biochemistry 13:1014（197
4年）；ペイン（Pain）等、J．Immunol．Meth．40:219（1981年）；およびニグ
レン（Nygren）、J．Histochem．and Cytochem．30:407（1982年）に記載されて
いる方法が含まれる。本発明の抗体およびレセプターは既知の任意のアッセイ方
法、例えば競合結合アッセイ、直接および間接的サンドイッチアッセイおよび免
疫沈降アッセイを使用することができる。ゾラ（Zola）、モノクローナル抗体：
技術マニュアル、147〜158頁（CRC Press，Inc.、1987年）。
【００１８】 競合結合アッセイは標識された標準（これはｈＶＥＧＦまたはその免疫学的反
応性部分でありえる）の一定量の抗体と結合する試験試料分析物（ｈＶＥＧＦ）
との競合能力に依拠している。試験試料中のｈＶＥＧＦ量は、抗体またはレセプ
ターと結合されることになる標準品の量に逆比例する。結合されることになる標
準品の量の測定を促進するために、抗体またはレセプターは一般に競合前後に不
溶化されるので、抗体またはレセプターと結合する標準品およびアナライトは結
合していない標準品およびアナライトから便宜的に分離することができる。 サンドイッチアッセイは、検出すべきタンパク質の異なった免疫原性部分また
はエピトープとそれぞれ結合し得る２つの抗体またはレセプターを使用すること
を含む。サンドイッチアッセイでは、試験試料分析物は固形支持体上に固定され
ている第１の抗体またはレセプターによって結合され、その後第２の抗体が分析
物に結合し、よって不溶性の３つの部分からなる複合体を形成する。デービッド
およびグリーン（Greene）、米国特許第4,376,110号。第２の抗体またはレセプ
ターはそれ自体検出可能部分で標識されうるか（直接的サンドイッチアッセイ）
、検出可能部分で標識されている抗免疫グロブリン抗体を使用して測定すること
ができる（間接的サンドイッチアッセイ）。例えば、サンドイッチアッセイの１
つのタイプはＥＬＩＳＡアッセイであり、その場合は、検出可能部分は酵素であ
る。 ここでの抗体またはレセプターはインビボ画像診断にも有用であり、検出可能
部分で標識された抗体またはｈＶＥＧＦrが患者の好ましくは血流に直接投与さ
れ、患者内の標識抗体またはレセプターの存在と位置がアッセイされる。この画
像診断技術は、例えば、新生物の段階付けおよび治療に有用である。抗体または
ｈＶＥＧＦrは、核磁気共鳴であろうと、放射学であろうと、それとも当該分野
で知られている他の検出手段であろうと、哺乳動物において検出可能である任意
の部分で標識される。
応性部分でありえる）の一定量の抗体と結合する試験試料分析物（ｈＶＥＧＦ）
との競合能力に依拠している。試験試料中のｈＶＥＧＦ量は、抗体またはレセプ
ターと結合されることになる標準品の量に逆比例する。結合されることになる標
準品の量の測定を促進するために、抗体またはレセプターは一般に競合前後に不
溶化されるので、抗体またはレセプターと結合する標準品およびアナライトは結
合していない標準品およびアナライトから便宜的に分離することができる。 サンドイッチアッセイは、検出すべきタンパク質の異なった免疫原性部分また
はエピトープとそれぞれ結合し得る２つの抗体またはレセプターを使用すること
を含む。サンドイッチアッセイでは、試験試料分析物は固形支持体上に固定され
ている第１の抗体またはレセプターによって結合され、その後第２の抗体が分析
物に結合し、よって不溶性の３つの部分からなる複合体を形成する。デービッド
およびグリーン（Greene）、米国特許第4,376,110号。第２の抗体またはレセプ
ターはそれ自体検出可能部分で標識されうるか（直接的サンドイッチアッセイ）
、検出可能部分で標識されている抗免疫グロブリン抗体を使用して測定すること
ができる（間接的サンドイッチアッセイ）。例えば、サンドイッチアッセイの１
つのタイプはＥＬＩＳＡアッセイであり、その場合は、検出可能部分は酵素であ
る。 ここでの抗体またはレセプターはインビボ画像診断にも有用であり、検出可能
部分で標識された抗体またはｈＶＥＧＦrが患者の好ましくは血流に直接投与さ
れ、患者内の標識抗体またはレセプターの存在と位置がアッセイされる。この画
像診断技術は、例えば、新生物の段階付けおよび治療に有用である。抗体または
ｈＶＥＧＦrは、核磁気共鳴であろうと、放射学であろうと、それとも当該分野
で知られている他の検出手段であろうと、哺乳動物において検出可能である任意
の部分で標識される。
【００１９】 （ｈＶＥＧＦのアンタゴニスト変異体） ここに記載した抗体に加えて、ｈＶＥＧＦの他の有用なアンタゴニストには、
ｈＶＥＧＦレセプターと結合するが天然ｈＶＥＧＦの生物学的活性を示さない天
然ｈＶＥＧＦのフラグメントおよびアミノ酸配列変異体が含まれる。例えば、こ
のようなアンタゴニストには、ｈＶＥＧＦのレセプター結合ドメインを含むが生
物学的活性を与えるドメインを欠いているかまたはそうでない場合、細胞ｈＶＥ
ＧＦレセプターの活性化が不完全なフラグメントおよびアミノ酸配列変異体、例
えば、細胞ｈＶＥＧＦ−レセプターの凝集または活性化誘発能力を欠いているフ
ラグメントまたはアミノ酸配列変異体の場合が含まれる。「レセプター結合ドメ
イン」という用語は、ｈＶＥＧＦレセプター結合に関与するｈＶＥＧＦ中のアミ
ノ酸配列を意味する。「生物学的活性ドメイン」または「生物学的活性付与ドメ
イン」という用語は、細胞***促進活性、脈管形成活性、又は血管透過活性のよ
うな、因子の特定の生物学的活性をもたらすｈＶＥＧＦ中のアミノ酸配列を意味
する。 ｈＶＥＧＦが細胞表面上の２つまたはそれ以上のｈＶＥＧＦr分子と複合体を
形成できるように思われるという知見は、ｈＶＥＧＦがｈＶＥＧＦrへの少なく
とも２つの別個の結合部位を有しており、成長ホルモン、プロラクチン等の態様
で活性化が生じる前に、ｈＶＥＧＦが連続的な態様で、最初に１つの部位で、そ
の後他の部位で上記細胞レセプターと結合することを示唆している（例えば、カ
ニングハム（Cunningham）等、Science 264:821（1991年）；ディブオス（deVos
）等、Science 255:306（1992年）；フー（Fuh）等、Science 256:1677（1992年
）を参照されたい）。従って、ｈＶＥＧＦの１つのレセプター結合部位（典型的
にはｈＶＥＧＦとｈＶＥＧＦrの初期結合に関与している部位）が修飾されない
まま残っている（または修飾されている場合、結合を高めるように変えられてい
る）一方、ｈＶＥＧＦの第２のレセプター結合部位が典型的には、該結合部位を
無効にするために、非保存的アミノ酸残基置換または欠失で修飾されているｈＶ
ＥＧＦのアンタゴニスト変異体が選択される。 ｈＶＥＧＦ中のレセプター結合ドメインおよびｈＶＥＧＦr中のｈＶＥＧＦ結
合ドメインはＸ線試験、突然変異分析および抗体結合実験を含む当該分野で既知
の方法によって測定される。突然変異方法には、逸脱突然変異体の選択と組み合
わせた無作為飽和突然変異誘発および挿入突然変異誘発の技術が含まれる。リガ
ンド内のレセプター結合ドメインの同定に適する他の方策はアラニン（Ａla）ス
キャンニング突然変異誘発として知られている。カニングハム等、Science 244
、1081〜1985（1985年）。この方法は、荷電アミノ酸側鎖を含む領域の同定を含
んでいる。同定された各領域中の荷電残基（即ち、Ａrg、Ａsp、Ｈis、Ｌysおよ
びＧlu）はＡlaで置換され（突然変異体１分子当たり１つの領域）、得られたリ
ガンドのレセプター結合が試験されて、レセプター結合における特定の領域の重
要性を評価する。レセプター結合ドメインを局在化させるさらに強力な方法は抗
ｈＶＥＧＦ抗体の中和の使用によるものである。キム（Ｋim）等、Growth Facto
rs 7:53（1992年）。通常、これら方法と類似方法を組み合せて、レセプター結
合に関与するドメインの局在化に使用する。
ｈＶＥＧＦレセプターと結合するが天然ｈＶＥＧＦの生物学的活性を示さない天
然ｈＶＥＧＦのフラグメントおよびアミノ酸配列変異体が含まれる。例えば、こ
のようなアンタゴニストには、ｈＶＥＧＦのレセプター結合ドメインを含むが生
物学的活性を与えるドメインを欠いているかまたはそうでない場合、細胞ｈＶＥ
ＧＦレセプターの活性化が不完全なフラグメントおよびアミノ酸配列変異体、例
えば、細胞ｈＶＥＧＦ−レセプターの凝集または活性化誘発能力を欠いているフ
ラグメントまたはアミノ酸配列変異体の場合が含まれる。「レセプター結合ドメ
イン」という用語は、ｈＶＥＧＦレセプター結合に関与するｈＶＥＧＦ中のアミ
ノ酸配列を意味する。「生物学的活性ドメイン」または「生物学的活性付与ドメ
イン」という用語は、細胞***促進活性、脈管形成活性、又は血管透過活性のよ
うな、因子の特定の生物学的活性をもたらすｈＶＥＧＦ中のアミノ酸配列を意味
する。 ｈＶＥＧＦが細胞表面上の２つまたはそれ以上のｈＶＥＧＦr分子と複合体を
形成できるように思われるという知見は、ｈＶＥＧＦがｈＶＥＧＦrへの少なく
とも２つの別個の結合部位を有しており、成長ホルモン、プロラクチン等の態様
で活性化が生じる前に、ｈＶＥＧＦが連続的な態様で、最初に１つの部位で、そ
の後他の部位で上記細胞レセプターと結合することを示唆している（例えば、カ
ニングハム（Cunningham）等、Science 264:821（1991年）；ディブオス（deVos
）等、Science 255:306（1992年）；フー（Fuh）等、Science 256:1677（1992年
）を参照されたい）。従って、ｈＶＥＧＦの１つのレセプター結合部位（典型的
にはｈＶＥＧＦとｈＶＥＧＦrの初期結合に関与している部位）が修飾されない
まま残っている（または修飾されている場合、結合を高めるように変えられてい
る）一方、ｈＶＥＧＦの第２のレセプター結合部位が典型的には、該結合部位を
無効にするために、非保存的アミノ酸残基置換または欠失で修飾されているｈＶ
ＥＧＦのアンタゴニスト変異体が選択される。 ｈＶＥＧＦ中のレセプター結合ドメインおよびｈＶＥＧＦr中のｈＶＥＧＦ結
合ドメインはＸ線試験、突然変異分析および抗体結合実験を含む当該分野で既知
の方法によって測定される。突然変異方法には、逸脱突然変異体の選択と組み合
わせた無作為飽和突然変異誘発および挿入突然変異誘発の技術が含まれる。リガ
ンド内のレセプター結合ドメインの同定に適する他の方策はアラニン（Ａla）ス
キャンニング突然変異誘発として知られている。カニングハム等、Science 244
、1081〜1985（1985年）。この方法は、荷電アミノ酸側鎖を含む領域の同定を含
んでいる。同定された各領域中の荷電残基（即ち、Ａrg、Ａsp、Ｈis、Ｌysおよ
びＧlu）はＡlaで置換され（突然変異体１分子当たり１つの領域）、得られたリ
ガンドのレセプター結合が試験されて、レセプター結合における特定の領域の重
要性を評価する。レセプター結合ドメインを局在化させるさらに強力な方法は抗
ｈＶＥＧＦ抗体の中和の使用によるものである。キム（Ｋim）等、Growth Facto
rs 7:53（1992年）。通常、これら方法と類似方法を組み合せて、レセプター結
合に関与するドメインの局在化に使用する。
【００２０】 ｈＶＥＧＦに関して使用される「アミノ酸配列変異体」という用語は、ｈＶＥ
ＧＦの天然形態のアミノ酸配列と或る程度異なっているアミノ酸配列を有するポ
リペプチドを意味する。通常、アンタゴニストアミノ酸配列変異体は天然のｈＶ
ＥＧＦの少なくとも１つのレセプター結合ドメインと少なくとも約70％の相同性
を有しており、好ましくは天然ｈＶＥＧＦのレセプター結合ドメインと少なくと
も約80％、さらに好ましくは少なくとも約90％の相同性を有している。アミノ酸
配列変異体は、ｈＶＥＧＦレセプターと結合する能力を保持する（その結果、ｈ
ＶＥＧＦレセプターとの結合に関して天然ｈＶＥＧＦと競合する）が、内皮細胞
増殖、脈管形成または血管透過性のようなｈＶＥＧＦの１つまたは複数の生物学
的効果を誘発できないように、天然ｈＶＥＧＦのアミノ酸配列内の或る位置での
置換、欠失および／または挿入を有している。 「相同性」は、いかなる保存的置換も配列相同性パーセントの一部とはみなさ
ずに、配列を整列させ、必要な場合には最大パーセントの相同性を達成するため
に間隙を導入した後に、天然ｈＶＥＧＦのレセプター結合ドメインのアミノ酸配
列中の残基と同一であるアミノ酸配列変異体中の残基のパーセントとして定義さ
れる。整列の方法およびコンピュータープログラムは当該分野で良く知られてい
る。一つのこのようなコンピュータープログラムはジェネンテック（Genentech
）Inc．の著作の「Align ２」であり、これは1991年12月10日に20559ワシントン
ＤＣの米国著作権庁に使用者用説明書と共に提出された。当業者であれば、日常
的な技量を使用して、比較されている配列の長さにわたって最大のアラインメン
トを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定す
るための適切なパラメータを決定することができる。
ＧＦの天然形態のアミノ酸配列と或る程度異なっているアミノ酸配列を有するポ
リペプチドを意味する。通常、アンタゴニストアミノ酸配列変異体は天然のｈＶ
ＥＧＦの少なくとも１つのレセプター結合ドメインと少なくとも約70％の相同性
を有しており、好ましくは天然ｈＶＥＧＦのレセプター結合ドメインと少なくと
も約80％、さらに好ましくは少なくとも約90％の相同性を有している。アミノ酸
配列変異体は、ｈＶＥＧＦレセプターと結合する能力を保持する（その結果、ｈ
ＶＥＧＦレセプターとの結合に関して天然ｈＶＥＧＦと競合する）が、内皮細胞
増殖、脈管形成または血管透過性のようなｈＶＥＧＦの１つまたは複数の生物学
的効果を誘発できないように、天然ｈＶＥＧＦのアミノ酸配列内の或る位置での
置換、欠失および／または挿入を有している。 「相同性」は、いかなる保存的置換も配列相同性パーセントの一部とはみなさ
ずに、配列を整列させ、必要な場合には最大パーセントの相同性を達成するため
に間隙を導入した後に、天然ｈＶＥＧＦのレセプター結合ドメインのアミノ酸配
列中の残基と同一であるアミノ酸配列変異体中の残基のパーセントとして定義さ
れる。整列の方法およびコンピュータープログラムは当該分野で良く知られてい
る。一つのこのようなコンピュータープログラムはジェネンテック（Genentech
）Inc．の著作の「Align ２」であり、これは1991年12月10日に20559ワシントン
ＤＣの米国著作権庁に使用者用説明書と共に提出された。当業者であれば、日常
的な技量を使用して、比較されている配列の長さにわたって最大のアラインメン
トを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定す
るための適切なパラメータを決定することができる。
【００２１】 置換変異体は、天然配列中の少なくとも１つのアミノ酸残基を除去し、同じ位
置の場所に別のアミノ酸が挿入されているものである。置換は単一で、分子中の
一つのアミノ酸だけが置換されているか、多重で、２つもしくはそれより多いア
ミノ酸が同じ分子内で置換されている。 挿入変異体は天然配列の特定の位置のアミノ酸に直ぐに隣接して挿入された一
又は複数のアミノ酸を有するものである。アミノ酸に直ぐに隣接するとは、アミ
ノ酸のα−カルボキシまたはα−アミノ官能基のいずれかと結合することを意味
する。 欠失変異体は、天然配列の一又は複数のアミノ酸残基が除去されているもので
ある。通常、欠失変異体は分子の特定の領域で１つまたは２つのアミノ酸残基が
欠失している。 ｈＶＥＧＦのフラグメントおよびアミノ酸配列変異体は当該分野の既知の方法
、例えば天然因子をコードするＤＮＡの部位特異的突然変異誘発によって容易に
製造される。突然変異ＤＮＡを適当な発現ベクター中に挿入し、ついで宿主細胞
を組換えベクターでトランスフエクションする。組換え宿主細胞と適当な培地で
増殖させ、その後宿主細胞で発現された所望のフラグメントまたはアミノ酸配列
変異体をクロマトグラフィーまたは他の精製方法で組換え細胞培養物から回収す
る。 或いは、当該分野で既知の他の等価な化学合成法を使用することができるが、
ｈＶＥＧＦのフラグメントおよびアミノ酸変異体を、例えば、天然ｈＶＥＧＦの
タンパク質分解によって、またはメリーフィールド（Merrifield）（J．Am．Che
m．Soc．85:2149（1963年））が記載した標準的な固相ペプチド合成方法を使用
する合成によってインビトロで製造される。固相合成は、保護されたα−アミノ
酸を適当な樹脂に結合させてペプチドのＣ末端から開始される。アミノ酸は、ペ
プチド結合の形成に対して当該分野で周知の技術を使用してペプチド鎖と結合さ
れる。
置の場所に別のアミノ酸が挿入されているものである。置換は単一で、分子中の
一つのアミノ酸だけが置換されているか、多重で、２つもしくはそれより多いア
ミノ酸が同じ分子内で置換されている。 挿入変異体は天然配列の特定の位置のアミノ酸に直ぐに隣接して挿入された一
又は複数のアミノ酸を有するものである。アミノ酸に直ぐに隣接するとは、アミ
ノ酸のα−カルボキシまたはα−アミノ官能基のいずれかと結合することを意味
する。 欠失変異体は、天然配列の一又は複数のアミノ酸残基が除去されているもので
ある。通常、欠失変異体は分子の特定の領域で１つまたは２つのアミノ酸残基が
欠失している。 ｈＶＥＧＦのフラグメントおよびアミノ酸配列変異体は当該分野の既知の方法
、例えば天然因子をコードするＤＮＡの部位特異的突然変異誘発によって容易に
製造される。突然変異ＤＮＡを適当な発現ベクター中に挿入し、ついで宿主細胞
を組換えベクターでトランスフエクションする。組換え宿主細胞と適当な培地で
増殖させ、その後宿主細胞で発現された所望のフラグメントまたはアミノ酸配列
変異体をクロマトグラフィーまたは他の精製方法で組換え細胞培養物から回収す
る。 或いは、当該分野で既知の他の等価な化学合成法を使用することができるが、
ｈＶＥＧＦのフラグメントおよびアミノ酸変異体を、例えば、天然ｈＶＥＧＦの
タンパク質分解によって、またはメリーフィールド（Merrifield）（J．Am．Che
m．Soc．85:2149（1963年））が記載した標準的な固相ペプチド合成方法を使用
する合成によってインビトロで製造される。固相合成は、保護されたα−アミノ
酸を適当な樹脂に結合させてペプチドのＣ末端から開始される。アミノ酸は、ペ
プチド結合の形成に対して当該分野で周知の技術を使用してペプチド鎖と結合さ
れる。
【００２２】 （治療用途） ここで使用される「治療する」、「治療」、「療法」及び「治療的」という用
語は、治癒治療、予防（prophylactic）治療及び防止（preventative）治療を意
味する。 治療用途では、本発明のアンタゴニストは哺乳動物、好ましくはヒトに、大量
瞬時投与（ボーラス）として静脈内にまたは一定期間の連続注入によって、筋肉
内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液嚢内、硬膜内、くも膜下内、経口、
局所もしくは吸入経路でヒトに投与されるようなものを含む、許容できる投与形
態で投与される。アンタゴニストはまた、腫瘍内、腫瘍周囲、病変内または病変
周囲経路で適切に投与されて局所的並びに全身的治療効果を発揮する。腹膜内経
路は、例えば、卵巣腫瘍の治療に特に有用である。静脈注入は、例えば脳浮腫の
治療に、特に有用であると予想される。 このような投与形態は、本来的に非毒性で非治療的な担体を含む。このような
担体の例には、イオン交換剤、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン
、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、緩衝物質、例えばホスフェート
、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分的グリ
セリド混合物、水、塩類または電解質、例えば硫酸プロタミン、リン酸水素二ナ
トリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイドシリカ、三
ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質およびポリエチ
レングリコールが含まれる。アンタゴニストの局所用またはゲル系形態用の担体
には多糖類、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウムまたはメチルセルロ
ース、ポリビニルピロリドン、ポリアクリレート、ポリオキシエチレン−ポリオ
キシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよびモクロウア
ルコールが含まれる。慣用的なデポー形態を適切に使用することができる。この
ような形態には、例えば、マイクロカプセル、ナノカプセル、リポソーム、プラ
スター、吸入形態、鼻用スプレー、舌下錠および徐放製剤が含まれる。アンタゴ
ニストは典型的には、約0.1mg／mlから100mg／mlの濃度でこのようなビヒクル中
に処方される。 徐放製剤の適当な例には、アンタゴニストを含有する固形の疎水性ポリマーの
半透過性マトリックスが含まれ、これらマトリックスは成形物、例えば膜または
マイクロカプセルの形態である。徐放製剤マトリックスの例にはポリエステル、
ヒドロゲル（例えば、ランガー（Langer）等、J．Biomed．Mater．Res．15:167
（1981年）およびランガー、Chem．Tech.、12:98〜105（1982年）に記載されて
いるポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）またはポリ（ビニルアルコ
ール）、ポリラクチド（米国特許第3,773,919号））、Ｌ−グルタミン酸とγエ
チル−Ｌ−グルタメートのコポリマー（シドマン（Sidman）等、Biopolymers、2
2:547（1983年））、非分解性エチレン−ビニルアセテート（ランガー等、上掲
）、ルプロンデポー（Lupron Depot）（登録商標）のような分解性乳酸−グリコ
ール酸コポリマー（乳酸−グリコール酸コポリマーおよびロイプロリドアセテー
トからなる注入可能な微小球体）並びにポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸
が含まれる。エチレン−ビニルアセテートおよび乳酸−グリコール酸のようなポ
リマーは100日間以上にわたって分子を放出させることができるが、或るヒドロ
ゲルはより短い期間タンパク質を放出する。カプセルに入れたポリペプチドアン
タゴニストが体内に長時間留まると、37℃で水分に暴露された結果として変性ま
たは凝集し、その結果、生物学的活性の消失が生じ、おそらく免疫原性の変化が
生じることがある。関与するメカニズムに応じて安定化のために合理的な方策を
工夫することができる。例えば、凝集メカニズムがチオ−ジスルフィド交換によ
る分子内Ｓ−Ｓ結合形成であることが発見された場合は、安定化はスルフヒドリ
ル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥し、水分量を制御し、適当な添加剤を使
用し、特定なポリマーマトリックス組成物を開発することによって達成すること
ができる。
語は、治癒治療、予防（prophylactic）治療及び防止（preventative）治療を意
味する。 治療用途では、本発明のアンタゴニストは哺乳動物、好ましくはヒトに、大量
瞬時投与（ボーラス）として静脈内にまたは一定期間の連続注入によって、筋肉
内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液嚢内、硬膜内、くも膜下内、経口、
局所もしくは吸入経路でヒトに投与されるようなものを含む、許容できる投与形
態で投与される。アンタゴニストはまた、腫瘍内、腫瘍周囲、病変内または病変
周囲経路で適切に投与されて局所的並びに全身的治療効果を発揮する。腹膜内経
路は、例えば、卵巣腫瘍の治療に特に有用である。静脈注入は、例えば脳浮腫の
治療に、特に有用であると予想される。 このような投与形態は、本来的に非毒性で非治療的な担体を含む。このような
担体の例には、イオン交換剤、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン
、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、緩衝物質、例えばホスフェート
、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分的グリ
セリド混合物、水、塩類または電解質、例えば硫酸プロタミン、リン酸水素二ナ
トリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイドシリカ、三
ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質およびポリエチ
レングリコールが含まれる。アンタゴニストの局所用またはゲル系形態用の担体
には多糖類、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウムまたはメチルセルロ
ース、ポリビニルピロリドン、ポリアクリレート、ポリオキシエチレン−ポリオ
キシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよびモクロウア
ルコールが含まれる。慣用的なデポー形態を適切に使用することができる。この
ような形態には、例えば、マイクロカプセル、ナノカプセル、リポソーム、プラ
スター、吸入形態、鼻用スプレー、舌下錠および徐放製剤が含まれる。アンタゴ
ニストは典型的には、約0.1mg／mlから100mg／mlの濃度でこのようなビヒクル中
に処方される。 徐放製剤の適当な例には、アンタゴニストを含有する固形の疎水性ポリマーの
半透過性マトリックスが含まれ、これらマトリックスは成形物、例えば膜または
マイクロカプセルの形態である。徐放製剤マトリックスの例にはポリエステル、
ヒドロゲル（例えば、ランガー（Langer）等、J．Biomed．Mater．Res．15:167
（1981年）およびランガー、Chem．Tech.、12:98〜105（1982年）に記載されて
いるポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）またはポリ（ビニルアルコ
ール）、ポリラクチド（米国特許第3,773,919号））、Ｌ−グルタミン酸とγエ
チル−Ｌ−グルタメートのコポリマー（シドマン（Sidman）等、Biopolymers、2
2:547（1983年））、非分解性エチレン−ビニルアセテート（ランガー等、上掲
）、ルプロンデポー（Lupron Depot）（登録商標）のような分解性乳酸−グリコ
ール酸コポリマー（乳酸−グリコール酸コポリマーおよびロイプロリドアセテー
トからなる注入可能な微小球体）並びにポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸
が含まれる。エチレン−ビニルアセテートおよび乳酸−グリコール酸のようなポ
リマーは100日間以上にわたって分子を放出させることができるが、或るヒドロ
ゲルはより短い期間タンパク質を放出する。カプセルに入れたポリペプチドアン
タゴニストが体内に長時間留まると、37℃で水分に暴露された結果として変性ま
たは凝集し、その結果、生物学的活性の消失が生じ、おそらく免疫原性の変化が
生じることがある。関与するメカニズムに応じて安定化のために合理的な方策を
工夫することができる。例えば、凝集メカニズムがチオ−ジスルフィド交換によ
る分子内Ｓ−Ｓ結合形成であることが発見された場合は、安定化はスルフヒドリ
ル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥し、水分量を制御し、適当な添加剤を使
用し、特定なポリマーマトリックス組成物を開発することによって達成すること
ができる。
【００２３】 徐放ｈＶＥＧＦアンタゴニスト組成物にはリポソームとして取り込まれたアン
タゴニスト抗体又はｈＶＥＧＦrも含まれる。アンタゴニストを含有するリポソ
ームは、エプスタイン（Epstein）等、Proc．Natl．Acad．Sci．USA、82:3688（
1985年）；フワング（Hwang）等、Proc．Natl．Acad．Sci．USA、77:4030（1980
年）；米国特許第4,485,045号；米国特許第4,544,545号に記載されたような当該
分野で既知の方法で製造される。通常、リポソームは小さい（約200〜800オング
ストローム）単層タイプであり、脂質含量は約30モル％のコレステロールより多
く、選択された割合は最適のＨＲＧ療法のために調節される。循環時間が長くな
ったリポソームが米国特許第5,013,556号に開示されている。 本発明のもう一つの用途は成形物中にｈＶＥＧＦアンタゴニストを導入するこ
とを含む。このような物品は、例えば内皮細胞増殖および脈管形成の調節に使用
することができる。加えて、腫瘍浸潤および転移をこれら物品で調節することが
できる。 アンタゴニストの適切で有効な投与量は、ここで特定した治療される疾病又は
病状のタイプ、疾病又は病状の重症度および経過、アンタゴニストが予防目的で
投与されるのか治療目的で投与されるのか、以前の療法、患者の臨床的履歴およ
びアンタゴニストに対する応答、並びに担当医の自由裁量に依存する。アンタゴ
ニストの有効な投与量は、典型的には、投与されるアンタゴニストにより、最も
効果的な所望量のＶＥＧＦ生物学的活性の阻害が達成される量である。アンタゴ
ニストは適切には、１回でまたは一連の治療にわたって患者に投与される。
タゴニスト抗体又はｈＶＥＧＦrも含まれる。アンタゴニストを含有するリポソ
ームは、エプスタイン（Epstein）等、Proc．Natl．Acad．Sci．USA、82:3688（
1985年）；フワング（Hwang）等、Proc．Natl．Acad．Sci．USA、77:4030（1980
年）；米国特許第4,485,045号；米国特許第4,544,545号に記載されたような当該
分野で既知の方法で製造される。通常、リポソームは小さい（約200〜800オング
ストローム）単層タイプであり、脂質含量は約30モル％のコレステロールより多
く、選択された割合は最適のＨＲＧ療法のために調節される。循環時間が長くな
ったリポソームが米国特許第5,013,556号に開示されている。 本発明のもう一つの用途は成形物中にｈＶＥＧＦアンタゴニストを導入するこ
とを含む。このような物品は、例えば内皮細胞増殖および脈管形成の調節に使用
することができる。加えて、腫瘍浸潤および転移をこれら物品で調節することが
できる。 アンタゴニストの適切で有効な投与量は、ここで特定した治療される疾病又は
病状のタイプ、疾病又は病状の重症度および経過、アンタゴニストが予防目的で
投与されるのか治療目的で投与されるのか、以前の療法、患者の臨床的履歴およ
びアンタゴニストに対する応答、並びに担当医の自由裁量に依存する。アンタゴ
ニストの有効な投与量は、典型的には、投与されるアンタゴニストにより、最も
効果的な所望量のＶＥＧＦ生物学的活性の阻害が達成される量である。アンタゴ
ニストは適切には、１回でまたは一連の治療にわたって患者に投与される。
【００２４】 ｈＶＥＧＦアンタゴニストは、種々の新生物および非新生物疾病および病状の
治療に有用である。治療を受けられる新生物および関連状態には乳癌、肺癌、胃
癌、食道癌、結腸直腸癌、肝臓癌、卵巣癌、莢膜細胞種、男性胚腫、頚部癌、子
宮内膜癌、子宮内膜過形成、子宮内膜症、繊維肉腫、絨毛癌、頭部および頚部癌
、鼻咽頭癌、喉頭癌、肝芽腫、カポジ肉腫、メラノーマ、皮膚癌、血管腫、海綿
状血管腫、血管腫、血管芽腫、膵臓癌、網膜芽腫、星状細胞腫、神経膠芽細胞、
シュワン鞘腫、寡突起膠腫、髄芽腫、神経芽腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、平滑筋肉
腫、尿路癌、甲状腺癌、ウイルムス腫瘍、腎細胞癌、前立腺癌、母斑症に関連し
た異常な血管増殖、並びにメーグス症候群が含まれる。 一実施態様では、腫瘍の血管形成を併用療法で攻撃する。一又は複数のｈＶＥ
ＧＦアンタゴニストを腫瘍を持つ患者に、例えば腫瘍または存在するならば、そ
の転移病巣の壊死を観察して決定される治療的に有効な投与量で投与する。この
治療は、もはや更なる有益な効果が観察されないかまたは臨床検査で痕跡量の腫
瘍も示されないかもしくはどんな転移病巣も示されないようなときまで継続され
る。他の補助的薬剤は、例えば腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、α−、β−もしくはγ
−インターフェロン、抗ＨＥＲ２抗体、ヘレグリン、抗ヘレグリン抗体、Ｄ因子
、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、顆
粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、または、抗プロテイ
ンＣ抗体、抗プロテインＳ抗体もしくはＣ４ｂ結合タンパク質（1991年2月21日
に公開されたエスモン等のＰＣＴ公開特許第ＷＯ91／01753号参照）のような腫
瘍の微小血管凝固を促進する薬剤、または加熱もしくは照射である。 補助的薬剤は有効性が変わるので、常套的な形でマトリックススクリーニング
によってそれらが腫瘍に与える影響を比較することが望ましい。ｈＶＥＧＦアン
タゴニストおよび例えばＴＮＦの投与は、所望の臨床効果が達成されるまで繰り
返すことができる。或いは、ｈＶＥＧＦアンタゴニストは、ＴＮＦと場合によっ
ては補助的薬剤と一緒に投与される。固形腫瘍が四肢または全身循環から隔離し
易い他の場所に見られる場合、ここに記載した治療薬剤は隔離された腫瘍または
器官に投与する。他の実施態様では、ＦＧＦまたは血小板由来増殖因子（ＰＤＧ
Ｆ）アンタゴニスト、例えば抗ＦＧＦまたは抗ＰＤＧＦ中和抗体がｈＶＥＧＦア
ンタゴニストと一緒に患者に投与される。ｈＶＥＧＦアンタゴニストによる治療
は、最適には外傷治癒または所望の血管新形成の期間中中止することができる。
治療に有用である。治療を受けられる新生物および関連状態には乳癌、肺癌、胃
癌、食道癌、結腸直腸癌、肝臓癌、卵巣癌、莢膜細胞種、男性胚腫、頚部癌、子
宮内膜癌、子宮内膜過形成、子宮内膜症、繊維肉腫、絨毛癌、頭部および頚部癌
、鼻咽頭癌、喉頭癌、肝芽腫、カポジ肉腫、メラノーマ、皮膚癌、血管腫、海綿
状血管腫、血管腫、血管芽腫、膵臓癌、網膜芽腫、星状細胞腫、神経膠芽細胞、
シュワン鞘腫、寡突起膠腫、髄芽腫、神経芽腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、平滑筋肉
腫、尿路癌、甲状腺癌、ウイルムス腫瘍、腎細胞癌、前立腺癌、母斑症に関連し
た異常な血管増殖、並びにメーグス症候群が含まれる。 一実施態様では、腫瘍の血管形成を併用療法で攻撃する。一又は複数のｈＶＥ
ＧＦアンタゴニストを腫瘍を持つ患者に、例えば腫瘍または存在するならば、そ
の転移病巣の壊死を観察して決定される治療的に有効な投与量で投与する。この
治療は、もはや更なる有益な効果が観察されないかまたは臨床検査で痕跡量の腫
瘍も示されないかもしくはどんな転移病巣も示されないようなときまで継続され
る。他の補助的薬剤は、例えば腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、α−、β−もしくはγ
−インターフェロン、抗ＨＥＲ２抗体、ヘレグリン、抗ヘレグリン抗体、Ｄ因子
、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、顆
粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、または、抗プロテイ
ンＣ抗体、抗プロテインＳ抗体もしくはＣ４ｂ結合タンパク質（1991年2月21日
に公開されたエスモン等のＰＣＴ公開特許第ＷＯ91／01753号参照）のような腫
瘍の微小血管凝固を促進する薬剤、または加熱もしくは照射である。 補助的薬剤は有効性が変わるので、常套的な形でマトリックススクリーニング
によってそれらが腫瘍に与える影響を比較することが望ましい。ｈＶＥＧＦアン
タゴニストおよび例えばＴＮＦの投与は、所望の臨床効果が達成されるまで繰り
返すことができる。或いは、ｈＶＥＧＦアンタゴニストは、ＴＮＦと場合によっ
ては補助的薬剤と一緒に投与される。固形腫瘍が四肢または全身循環から隔離し
易い他の場所に見られる場合、ここに記載した治療薬剤は隔離された腫瘍または
器官に投与する。他の実施態様では、ＦＧＦまたは血小板由来増殖因子（ＰＤＧ
Ｆ）アンタゴニスト、例えば抗ＦＧＦまたは抗ＰＤＧＦ中和抗体がｈＶＥＧＦア
ンタゴニストと一緒に患者に投与される。ｈＶＥＧＦアンタゴニストによる治療
は、最適には外傷治癒または所望の血管新形成の期間中中止することができる。
【００２５】 治療を受けられる非新生物状態には関節リウマチ、乾癬、アテローム性動脈硬
化症、糖尿病性および他の網膜症、水晶体後線維増殖症、血管新生性緑内障、加
齢性黄斑変性、甲状腺過形成（バセドウ病を含む）、角膜および他の組織移植、
慢性炎症、肺炎症、ネフローゼ症候群、子癇前症、腹水、心膜滲出液（例えば、
心膜炎に関連したもの）、および胸膜滲出液が含まれる。 加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）は、年輩者において程度の酷い視覚喪失に至る第１
の原因である。ＡＭＤの滲出形態は脈絡膜新血管形成及び網膜色素内皮細胞剥離
により特徴付けられる。脈絡膜新血管新生が予後の劇的悪化に関連しているため
、本発明のＶＥＧＦアンタゴニストは、ＡＭＤの重症度を低減させるのに特に有
用であると予想される。 治療可能な他の病状には浮腫が含まれる。ここで、「浮腫」という用語は一般
的な意味で使用され、遊離の細胞外水単独のため、もしくは増加した細胞内水と
組み合わされるために生じる血管外組織水含量の増加により特徴付けられる体の
症状または付随する脳卒中又は頭部損傷を含む。浮腫は体内の種々の組織中に存
在し得る。特に、ｈＶＥＧＦアンタゴニストは、典型的には脳容積の増加により
特徴付けられる脳浮腫、並びに脊髄又は脊髄管浮腫又は頭蓋内圧の増加に至る他
の病状（例えば、局所的脊髄損傷）を含む中枢神経系（ＣＮＳ）浮腫の治療に使
用することができると考えられる。例えば、脳容積の増加は、脳血液量の増加及
び／又は組織水分量の増加の結果でありうる。ここで使用する「浮腫」という用
語は、当該技術において、血管原性浮腫及び細胞毒性浮腫と称される病状を含む
。典型的には、血管原性浮腫と称される病状は血液脳関門（ＢＢＢ）の崩壊を伴
うものとして特徴付けられており、細胞毒性浮腫は無傷のＢＢＢを伴うものとし
て特徴付けられている。脳浮腫は、一般的に概説文献であるハリリ（Hariri）、
Neurosurgical Intensive Care 5:687（1994年）に記載されている。
化症、糖尿病性および他の網膜症、水晶体後線維増殖症、血管新生性緑内障、加
齢性黄斑変性、甲状腺過形成（バセドウ病を含む）、角膜および他の組織移植、
慢性炎症、肺炎症、ネフローゼ症候群、子癇前症、腹水、心膜滲出液（例えば、
心膜炎に関連したもの）、および胸膜滲出液が含まれる。 加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）は、年輩者において程度の酷い視覚喪失に至る第１
の原因である。ＡＭＤの滲出形態は脈絡膜新血管形成及び網膜色素内皮細胞剥離
により特徴付けられる。脈絡膜新血管新生が予後の劇的悪化に関連しているため
、本発明のＶＥＧＦアンタゴニストは、ＡＭＤの重症度を低減させるのに特に有
用であると予想される。 治療可能な他の病状には浮腫が含まれる。ここで、「浮腫」という用語は一般
的な意味で使用され、遊離の細胞外水単独のため、もしくは増加した細胞内水と
組み合わされるために生じる血管外組織水含量の増加により特徴付けられる体の
症状または付随する脳卒中又は頭部損傷を含む。浮腫は体内の種々の組織中に存
在し得る。特に、ｈＶＥＧＦアンタゴニストは、典型的には脳容積の増加により
特徴付けられる脳浮腫、並びに脊髄又は脊髄管浮腫又は頭蓋内圧の増加に至る他
の病状（例えば、局所的脊髄損傷）を含む中枢神経系（ＣＮＳ）浮腫の治療に使
用することができると考えられる。例えば、脳容積の増加は、脳血液量の増加及
び／又は組織水分量の増加の結果でありうる。ここで使用する「浮腫」という用
語は、当該技術において、血管原性浮腫及び細胞毒性浮腫と称される病状を含む
。典型的には、血管原性浮腫と称される病状は血液脳関門（ＢＢＢ）の崩壊を伴
うものとして特徴付けられており、細胞毒性浮腫は無傷のＢＢＢを伴うものとし
て特徴付けられている。脳浮腫は、一般的に概説文献であるハリリ（Hariri）、
Neurosurgical Intensive Care 5:687（1994年）に記載されている。
【００２６】 哺乳動物における浮腫は、限定されるものではないが、急性高血圧、髄膜炎、
脳炎、膿瘍、新生物疾患（例えば上述したもの）（特に固形腫瘍）、外傷（例え
ば頭部損傷）、出血、ウイルス感染、脳マラリア症、脳卒中、放射、多発性硬化
症、後心停止、出生時仮死、グルタミン酸毒性、脳症、低酸素症、虚血及び腎臓
透析を含む種々の病状または刺激を伴うか又はこれらから生じるものである。 特に、本発明は、脳内における新生物に付随する脳浮腫、及び脳卒中に付随す
る脳浮腫を含む浮腫を治療するために、ｈＶＥＧＦアンタゴニストを用いて療法
を意図している。脳組織内に新生物を有する哺乳動物において、哺乳動物に脳浮
腫が発症し又はこれを被ることはよくあることである。本発明のｈＶＥＧＦアン
タゴニストは、単独で又は脳新生物を治療するために施される化学療法又は放射
線療法等の他の療法と組み合わせて投与され、脳内におけるこのような浮腫を低
減し又は阻害することを意図している。 また、脳卒中を発症しているか、これを発症したことがある哺乳動物において
も、脳浮腫が発症しているか、またはこれを被っていることがよくある。本出願
における脳卒中という用語は一般的な意味に使用され、虚血性脳卒中及び出血性
脳卒中として当業者に周知の臨床状態を含む。患者の脳卒中は、例えば血流妨害
の原因又は病原、病気に襲われている細胞又は組織の種類、及び組織（例えば脳
組織）への管外滲出の存在性に依存して、様々な特定の種類の脳卒中に特徴付け
され又は分類されることが当該分野において認められる。臨床的に特徴付けられ
ている種々の種類の脳卒中には、限定するものではないが、血栓性脳卒中、塞栓
性脳卒中、血行力学的脳卒中、陰窩性脳卒中、及び脳内、くも膜下、脳室内、又
は硬膜下出血に誘導されるか、又はこれらの結果生じる出血性脳卒中が含まれる
。医療従事者であれば、このような脳卒中状態の種類を素早く認識して理解し、
患者にこのような病状が存在するのか、又はその徴候があるのか検出し診断でき
るであろう。本発明の方法は、ｈＶＥＧＦアンタゴニスト分子が、全てのこのよ
うな脳卒中症状の治療において、特に浮腫を低減又は阻害し、細胞及び組織ダメ
ージを保護するために使用できることを意図している。ｈＶＥＧＦアンタゴニス
トは脳卒中の開始に続く急性治療として投与され、例えば脳浮腫を低減又は阻害
し、よって哺乳動物の脳卒中からの回復性を高める。ｈＶＥＧＦアンタゴニスト
を使用することにより、この治療で哺乳動物における手術（開頭術）の実施を防
止又は回避し、脳組織内の過度の水分蓄積による頭蓋内圧を低減又は緩和すると
いった恩恵がある。また、ｈＶＥＧＦアンタゴニストによりこのような浮腫が低
減又は防止されて、典型的に頭蓋内圧及び浮腫によりダメージを受けるおそれの
ある脳及びニューロン組織の量が低減するであろう（すなわち保護効果）。
脳炎、膿瘍、新生物疾患（例えば上述したもの）（特に固形腫瘍）、外傷（例え
ば頭部損傷）、出血、ウイルス感染、脳マラリア症、脳卒中、放射、多発性硬化
症、後心停止、出生時仮死、グルタミン酸毒性、脳症、低酸素症、虚血及び腎臓
透析を含む種々の病状または刺激を伴うか又はこれらから生じるものである。 特に、本発明は、脳内における新生物に付随する脳浮腫、及び脳卒中に付随す
る脳浮腫を含む浮腫を治療するために、ｈＶＥＧＦアンタゴニストを用いて療法
を意図している。脳組織内に新生物を有する哺乳動物において、哺乳動物に脳浮
腫が発症し又はこれを被ることはよくあることである。本発明のｈＶＥＧＦアン
タゴニストは、単独で又は脳新生物を治療するために施される化学療法又は放射
線療法等の他の療法と組み合わせて投与され、脳内におけるこのような浮腫を低
減し又は阻害することを意図している。 また、脳卒中を発症しているか、これを発症したことがある哺乳動物において
も、脳浮腫が発症しているか、またはこれを被っていることがよくある。本出願
における脳卒中という用語は一般的な意味に使用され、虚血性脳卒中及び出血性
脳卒中として当業者に周知の臨床状態を含む。患者の脳卒中は、例えば血流妨害
の原因又は病原、病気に襲われている細胞又は組織の種類、及び組織（例えば脳
組織）への管外滲出の存在性に依存して、様々な特定の種類の脳卒中に特徴付け
され又は分類されることが当該分野において認められる。臨床的に特徴付けられ
ている種々の種類の脳卒中には、限定するものではないが、血栓性脳卒中、塞栓
性脳卒中、血行力学的脳卒中、陰窩性脳卒中、及び脳内、くも膜下、脳室内、又
は硬膜下出血に誘導されるか、又はこれらの結果生じる出血性脳卒中が含まれる
。医療従事者であれば、このような脳卒中状態の種類を素早く認識して理解し、
患者にこのような病状が存在するのか、又はその徴候があるのか検出し診断でき
るであろう。本発明の方法は、ｈＶＥＧＦアンタゴニスト分子が、全てのこのよ
うな脳卒中症状の治療において、特に浮腫を低減又は阻害し、細胞及び組織ダメ
ージを保護するために使用できることを意図している。ｈＶＥＧＦアンタゴニス
トは脳卒中の開始に続く急性治療として投与され、例えば脳浮腫を低減又は阻害
し、よって哺乳動物の脳卒中からの回復性を高める。ｈＶＥＧＦアンタゴニスト
を使用することにより、この治療で哺乳動物における手術（開頭術）の実施を防
止又は回避し、脳組織内の過度の水分蓄積による頭蓋内圧を低減又は緩和すると
いった恩恵がある。また、ｈＶＥＧＦアンタゴニストによりこのような浮腫が低
減又は防止されて、典型的に頭蓋内圧及び浮腫によりダメージを受けるおそれの
ある脳及びニューロン組織の量が低減するであろう（すなわち保護効果）。
【００２７】 治療される疾病又は病状のタイプおよび重症度に応じて、例えば、１回または
複数回の分割投与によるかそれとも連続注入によろうとも、約１μg／kgから15m
g／kgのアンタゴニストが患者に投与する初期候補投与量である。典型的な１日
投与量は、上述の要因に依存して約１μg／kgから100mg／kgまたはそれ以上まで
の範囲であろう。数日間またはそれより長い反復投与では、病状に依存して、治
療は疾病徴候の所望の抑制が生じるまで繰り返される。しかしながら、他の投与
計画が有用であることがある。例えば、脳浮腫又は脳卒中の治療方法においては
、損傷又は脳卒中の始まりから数時間内、もしくは１〜４日以内に、検出又は診
断の際に直ぐにｈＶＥＧＦアンタゴニストを患者に投与することが望ましい。望
ましい投与プロトコールは、典型的には医療従事者の裁量の範囲内である。ｈＶ
ＥＧＦアンタゴニスト療法の進捗状況は、損傷又は脳卒中に関連した新生物病状
及び浮腫形成については、例えば放射線写真技術（特に、磁気共鳴映像法、ＭＲ
Ｉ）含む慣用的の技術および検査法によって容易に監視され、また脳浮腫につい
ては頭蓋内圧が監視される。 本発明の他の実施態様では、疾病又は病状の予防または治療におけるアンタゴ
ニストの効能は、これらの目的に効果的である別の薬剤、例えば、腫瘍壊死因子
（ＴＮＦ）、酸性もしくは塩基性の線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）もしくは肝細
胞増殖因子（ＨＧＦ）の脈管形成活性を阻止もしくは中和し得る抗体、組織因子
、プロテインＣもしくはプロテインＳの凝固活性を阻止もしくは中和し得る抗体
（1991年2月21日に公開されたエスモン（Esmon）等のＰＣＴ公開特許第ＷＯ91／
01753号参照）、ＨＥＲ２レセプターに結合可能な抗体（1989年7月27日に公開さ
れたハドジアック（Hudziak）等のＰＣＴ公開特許第WO89/06692）、または例え
ば、アルキル化剤、葉酸アンタゴニスト、核酸代謝の抗代謝物、抗生物質、ピリ
ミジン類似体、５−フルオロウラシル、シスプラチン、プリンヌクレオシド、ア
ミン、アミノ酸、トリアゾールヌクレオシドもしくはコルチコステロイドのよう
な一または複数の慣用的な治療剤と組み合わせてまたは連続的にアンタゴニスト
を投与することによって改善することができる。このような他の薬剤は投与され
る組成物中に存在するかまたは別々に投与することができる。特に、浮腫又は脳
卒中の治療では、アンタゴニストは、抗ウイルス剤、抗真菌剤又は駆虫剤、抗生
物質、血栓溶解剤（例えばｔ−ＰＡ）、浸透圧治療剤（例えばマンニトール）、
又はステロイド類（デカドロン又はプレドニゾン）と組み合わせてまたは連続し
て投与されうる。アンタゴニストと組み合わせられるこのような薬剤の使用は、
医療従事者の通常の技量の範囲内で行われ、このような薬剤の選択は、例えば治
療される疾患又は病状に依存する。 本願で提供されるさらなる治療方法では、ｈＶＥＧＦアンタゴニストは、特に
脳卒中の治療において、ｈＶＥＧＦと連続して投与されることが考えられる。脳
卒中の診断と検出の際には、ｈＶＥＧＦアンタゴニストは脳卒中の開始後直ちに
又は約１〜４日内に投与され得る。浮腫形成を低減又は阻害するアンタゴニスト
の投与の完了に続いて、再血管形成を刺激又は促進させるのに十分な量のｈＶＥ
ＧＦを患者に投与することが有益であると考えられる。好ましくは、ｈＶＥＧＦ
はｈＶＥＧＦの組換え形態であり、製薬的に許容可能な担体に投与される。
複数回の分割投与によるかそれとも連続注入によろうとも、約１μg／kgから15m
g／kgのアンタゴニストが患者に投与する初期候補投与量である。典型的な１日
投与量は、上述の要因に依存して約１μg／kgから100mg／kgまたはそれ以上まで
の範囲であろう。数日間またはそれより長い反復投与では、病状に依存して、治
療は疾病徴候の所望の抑制が生じるまで繰り返される。しかしながら、他の投与
計画が有用であることがある。例えば、脳浮腫又は脳卒中の治療方法においては
、損傷又は脳卒中の始まりから数時間内、もしくは１〜４日以内に、検出又は診
断の際に直ぐにｈＶＥＧＦアンタゴニストを患者に投与することが望ましい。望
ましい投与プロトコールは、典型的には医療従事者の裁量の範囲内である。ｈＶ
ＥＧＦアンタゴニスト療法の進捗状況は、損傷又は脳卒中に関連した新生物病状
及び浮腫形成については、例えば放射線写真技術（特に、磁気共鳴映像法、ＭＲ
Ｉ）含む慣用的の技術および検査法によって容易に監視され、また脳浮腫につい
ては頭蓋内圧が監視される。 本発明の他の実施態様では、疾病又は病状の予防または治療におけるアンタゴ
ニストの効能は、これらの目的に効果的である別の薬剤、例えば、腫瘍壊死因子
（ＴＮＦ）、酸性もしくは塩基性の線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）もしくは肝細
胞増殖因子（ＨＧＦ）の脈管形成活性を阻止もしくは中和し得る抗体、組織因子
、プロテインＣもしくはプロテインＳの凝固活性を阻止もしくは中和し得る抗体
（1991年2月21日に公開されたエスモン（Esmon）等のＰＣＴ公開特許第ＷＯ91／
01753号参照）、ＨＥＲ２レセプターに結合可能な抗体（1989年7月27日に公開さ
れたハドジアック（Hudziak）等のＰＣＴ公開特許第WO89/06692）、または例え
ば、アルキル化剤、葉酸アンタゴニスト、核酸代謝の抗代謝物、抗生物質、ピリ
ミジン類似体、５−フルオロウラシル、シスプラチン、プリンヌクレオシド、ア
ミン、アミノ酸、トリアゾールヌクレオシドもしくはコルチコステロイドのよう
な一または複数の慣用的な治療剤と組み合わせてまたは連続的にアンタゴニスト
を投与することによって改善することができる。このような他の薬剤は投与され
る組成物中に存在するかまたは別々に投与することができる。特に、浮腫又は脳
卒中の治療では、アンタゴニストは、抗ウイルス剤、抗真菌剤又は駆虫剤、抗生
物質、血栓溶解剤（例えばｔ−ＰＡ）、浸透圧治療剤（例えばマンニトール）、
又はステロイド類（デカドロン又はプレドニゾン）と組み合わせてまたは連続し
て投与されうる。アンタゴニストと組み合わせられるこのような薬剤の使用は、
医療従事者の通常の技量の範囲内で行われ、このような薬剤の選択は、例えば治
療される疾患又は病状に依存する。 本願で提供されるさらなる治療方法では、ｈＶＥＧＦアンタゴニストは、特に
脳卒中の治療において、ｈＶＥＧＦと連続して投与されることが考えられる。脳
卒中の診断と検出の際には、ｈＶＥＧＦアンタゴニストは脳卒中の開始後直ちに
又は約１〜４日内に投与され得る。浮腫形成を低減又は阻害するアンタゴニスト
の投与の完了に続いて、再血管形成を刺激又は促進させるのに十分な量のｈＶＥ
ＧＦを患者に投与することが有益であると考えられる。好ましくは、ｈＶＥＧＦ
はｈＶＥＧＦの組換え形態であり、製薬的に許容可能な担体に投与される。
【００２８】 （他の用途） 本発明の抗ｈＶＥＧＦ抗体はまたアフィニティー精製剤としても有用である。
この方法では、ｈＶＥＧＦに対する抗体を当該分野で周知の方法を使用して、セ
ファデックス樹脂または濾紙のような適切な支持体上に固定する。次に、固定し
た抗体を精製すべきｈＶＥＧＦを含有する試料と接触させ、その後、固定された
抗体と結合しているｈＶＥＧＦ以外の試料中の物質を全て実質的に除去する適当
な溶媒で支持体を洗浄する。最後に、抗体からｈＶＥＧＦを放出させるグリシン
緩衝液、ｐＨ 5.0のような別の適当な溶媒を用いて支持体を洗浄する。 以下の実施例は説明のためだけに提供するものであって、決して本発明を限定
することを意図するものではない。本明細書における全ての特許と引用文献はそ
の全体が出典明示によってここに取り込まれる。
この方法では、ｈＶＥＧＦに対する抗体を当該分野で周知の方法を使用して、セ
ファデックス樹脂または濾紙のような適切な支持体上に固定する。次に、固定し
た抗体を精製すべきｈＶＥＧＦを含有する試料と接触させ、その後、固定された
抗体と結合しているｈＶＥＧＦ以外の試料中の物質を全て実質的に除去する適当
な溶媒で支持体を洗浄する。最後に、抗体からｈＶＥＧＦを放出させるグリシン
緩衝液、ｐＨ 5.0のような別の適当な溶媒を用いて支持体を洗浄する。 以下の実施例は説明のためだけに提供するものであって、決して本発明を限定
することを意図するものではない。本明細書における全ての特許と引用文献はそ
の全体が出典明示によってここに取り込まれる。
【００２９】
実施例に引用されている市販試薬は、特に示さない限りは製造者の使用説明書
に従い使用した。次の実施例と本明細書を通してＡＴＣＣ受託番号により特定さ
れている細胞の供給源はバージニア州マナッサスのアメリカン・タイプ・カルチ
ャー・コレクションである。 実施例１ 抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体の調製 免疫化用のキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）と抱合したｈＶＥＧ
Ｆを得るために、組換え体ｈＶＥＧＦ（165アミノ酸）、リュング等、Science 2
46:1306（1989年）を0.05％グルタルアルデヒドの存在下４：１の比率でＫＬＨ
と混合し、その混合物を穏やかに撹拌しながら室温で３時間インキュベートした
。次に、この混合物をリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）に対して４℃で一夜透析した。 Ｂａｌｂ／ｃマウスを、腹腔内注射によって20μｇのＫＬＨと抱合した５μｇ
のｈＶＥＧＦで２週間毎に４回免疫化し、細胞融合前に４日間ＫＬＨと抱合した
同一投与量のｈＶＥＧＦで追加免疫した。 免疫したマウスから得た脾細胞を、Ｐ3Ｘ63Ａｇ8Ｕ．１ミエローマ細胞、エル
トン等、Curr．Top．Microbiol．Immunol．81:1（1978年）と、記載されたよう
にして35％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を使用して融合させた。ヤーマ
ッシュ（Yarmush）等、Proc．Nat．Acad．Sci．77:2899（1980年）。ハイブリド
ーマをＨＡＴ培地中で選択した。 ハイブリドーマ細胞培養物から得た上清を、ｈＶＥＧＦ被覆マイクロタイター
プレートを使用するＥＬＩＳＡアッセイによって抗ｈＶＥＧＦ抗体産生のために
スクリーニングした。各ウエル中のｈＶＥＧＦと結合した抗体を、アルカリホス
ファターゼ抱合ヤギ抗マウスＩgＧ免疫グロブリンおよび色素産生基質ｐ−ニト
ロフェニルホスフェートを使用して判定した。ハーロー（Harlow）およびレーン
（Lane）、抗体：実験室マニュアル、597頁（Cold Spring Harbor Laboratory、
1988年）。このようにして抗ｈＶＥＧＦ抗体を産生すると判定されたハイブリド
ーマ細胞を限界希釈によってサブクローン化し、Ａ４.６.１およびＢ２.６.２と
命名した二種のクローンをさらなる実験のために選択した。
に従い使用した。次の実施例と本明細書を通してＡＴＣＣ受託番号により特定さ
れている細胞の供給源はバージニア州マナッサスのアメリカン・タイプ・カルチ
ャー・コレクションである。 実施例１ 抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体の調製 免疫化用のキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）と抱合したｈＶＥＧ
Ｆを得るために、組換え体ｈＶＥＧＦ（165アミノ酸）、リュング等、Science 2
46:1306（1989年）を0.05％グルタルアルデヒドの存在下４：１の比率でＫＬＨ
と混合し、その混合物を穏やかに撹拌しながら室温で３時間インキュベートした
。次に、この混合物をリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）に対して４℃で一夜透析した。 Ｂａｌｂ／ｃマウスを、腹腔内注射によって20μｇのＫＬＨと抱合した５μｇ
のｈＶＥＧＦで２週間毎に４回免疫化し、細胞融合前に４日間ＫＬＨと抱合した
同一投与量のｈＶＥＧＦで追加免疫した。 免疫したマウスから得た脾細胞を、Ｐ3Ｘ63Ａｇ8Ｕ．１ミエローマ細胞、エル
トン等、Curr．Top．Microbiol．Immunol．81:1（1978年）と、記載されたよう
にして35％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を使用して融合させた。ヤーマ
ッシュ（Yarmush）等、Proc．Nat．Acad．Sci．77:2899（1980年）。ハイブリド
ーマをＨＡＴ培地中で選択した。 ハイブリドーマ細胞培養物から得た上清を、ｈＶＥＧＦ被覆マイクロタイター
プレートを使用するＥＬＩＳＡアッセイによって抗ｈＶＥＧＦ抗体産生のために
スクリーニングした。各ウエル中のｈＶＥＧＦと結合した抗体を、アルカリホス
ファターゼ抱合ヤギ抗マウスＩgＧ免疫グロブリンおよび色素産生基質ｐ−ニト
ロフェニルホスフェートを使用して判定した。ハーロー（Harlow）およびレーン
（Lane）、抗体：実験室マニュアル、597頁（Cold Spring Harbor Laboratory、
1988年）。このようにして抗ｈＶＥＧＦ抗体を産生すると判定されたハイブリド
ーマ細胞を限界希釈によってサブクローン化し、Ａ４.６.１およびＢ２.６.２と
命名した二種のクローンをさらなる実験のために選択した。
【００３０】 実施例２ 抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体の特徴づけ Ａ．抗原特異性 Ａ４.６.１およびＢ２.６.２ハイブリドーマによって産生された抗ｈＶＥＧＦ
モノクローナル抗体の結合特異性をＥＬＩＳＡで測定した。モノクローナル抗体
は、ｈＶＥＧＦ、ＦＧＦ、ＨＧＦまたは表皮増殖因子（ＥＧＦ）で前もって被覆
されたマイクロタイタープレートのウエルに加えた。ペルオキシダーゼ抱合ヤギ
抗マウスＩgＧ免疫グロブリンを用いて結合抗体を検出した。これらアッセイの
結果、Ａ４.６.１およびＢ２.６.２ハイブリドーマが産生したモノクローナル抗
体はｈＶＥＧＦとは結合するが他のタンパク質増殖因子とは検出できるほどには
結合しないことが確認された。 Ｂ．エピトープマッピング 競合結合ＥＬＩＳＡを使用して、Ａ４.６.１およびＢ２.６.２ハイブリドーマ
が産生したモノクローナル抗体がｈＶＥＧＦ内の同一のエピトープ（部位）に結
合するのかそれとも異なるエピトープ（部位）に結合するのかを決定した。キム
等、Infect．Immun．57:944（1989年）。個々の非標識抗ｈＶＥＧＦモノクロー
ナル抗体（Ａ４.６.１またはＢ２.６.２）または無関係の抗ＨＧＦ抗体（ＩgＧ
１イソタイプ）を、ｈＶＥＧＦで前もって被覆されたマイクロタイタープレート
のウエルに加えた。次に、ビオチン化抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体（BIO−
Ａ４.６.１またはBIO−Ｂ２.６.２）を加えた。ビオチチニル化抗体対非標識抗
体の比率は１：1000であった。ビオチン化抗体の結合は、アビジン抱合ペルオキ
シダーゼ、続いてｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロリドおよび過酸化水素を
添加して視覚化した。結合したビオチン化抗体の量を示す着色反応は、495nmの
波長で光学密度（Ｏ.Ｄ.）を測定することにより決定した。 Ｆｉｇ１に示されるように、各々の場合に、ビオチン化抗ｈＶＥＧＦ抗体の結
合は対応する非標識抗体で阻止されたが、他の非標識抗ｈＶＥＧＦ抗体または抗
ＨＧＦ抗体では阻止されなかった。これらの結果は、Ａ４.６.１およびＢ２.６.
２ハイブリドーマが産生したモノクローナル抗体がｈＶＥＧＦ内の異なったエピ
トープと結合することを示している。
モノクローナル抗体の結合特異性をＥＬＩＳＡで測定した。モノクローナル抗体
は、ｈＶＥＧＦ、ＦＧＦ、ＨＧＦまたは表皮増殖因子（ＥＧＦ）で前もって被覆
されたマイクロタイタープレートのウエルに加えた。ペルオキシダーゼ抱合ヤギ
抗マウスＩgＧ免疫グロブリンを用いて結合抗体を検出した。これらアッセイの
結果、Ａ４.６.１およびＢ２.６.２ハイブリドーマが産生したモノクローナル抗
体はｈＶＥＧＦとは結合するが他のタンパク質増殖因子とは検出できるほどには
結合しないことが確認された。 Ｂ．エピトープマッピング 競合結合ＥＬＩＳＡを使用して、Ａ４.６.１およびＢ２.６.２ハイブリドーマ
が産生したモノクローナル抗体がｈＶＥＧＦ内の同一のエピトープ（部位）に結
合するのかそれとも異なるエピトープ（部位）に結合するのかを決定した。キム
等、Infect．Immun．57:944（1989年）。個々の非標識抗ｈＶＥＧＦモノクロー
ナル抗体（Ａ４.６.１またはＢ２.６.２）または無関係の抗ＨＧＦ抗体（ＩgＧ
１イソタイプ）を、ｈＶＥＧＦで前もって被覆されたマイクロタイタープレート
のウエルに加えた。次に、ビオチン化抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体（BIO−
Ａ４.６.１またはBIO−Ｂ２.６.２）を加えた。ビオチチニル化抗体対非標識抗
体の比率は１：1000であった。ビオチン化抗体の結合は、アビジン抱合ペルオキ
シダーゼ、続いてｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロリドおよび過酸化水素を
添加して視覚化した。結合したビオチン化抗体の量を示す着色反応は、495nmの
波長で光学密度（Ｏ.Ｄ.）を測定することにより決定した。 Ｆｉｇ１に示されるように、各々の場合に、ビオチン化抗ｈＶＥＧＦ抗体の結
合は対応する非標識抗体で阻止されたが、他の非標識抗ｈＶＥＧＦ抗体または抗
ＨＧＦ抗体では阻止されなかった。これらの結果は、Ａ４.６.１およびＢ２.６.
２ハイブリドーマが産生したモノクローナル抗体がｈＶＥＧＦ内の異なったエピ
トープと結合することを示している。
【００３１】 Ｃ．イソタイプ決定 Ａ４.６.１およびＢ２.６.２ハイブリドーマが産生した抗ｈＶＥＧＦモノクロ
ーナル抗体のイソタイプをＥＬＩＳＡで決定した。各ハイブリドーマが増殖して
いる培地の試料（上清）をｈＶＥＧＦで前もって被覆されたマイクロタイタープ
レートに加えた。捕捉された抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体を、異なったイソ
タイプ特異性のアルカリホスファターゼ抱合ヤギ抗マウス免疫グロブリンと共に
インキュベートし、抱合抗体と抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体との結合をｐ−
ニトロフェニルホスフェートを添加して測定した。着色反応をＥＬＩＳＡプレー
ト読取り器を用いて405nmで測定した。 上記方法によって、Ａ４.６.１およびＢ２.６.２ハイブリドーマの両方で産生
したモノクローナル抗体のイソタイプはＩgＧ１であると決定された。
ーナル抗体のイソタイプをＥＬＩＳＡで決定した。各ハイブリドーマが増殖して
いる培地の試料（上清）をｈＶＥＧＦで前もって被覆されたマイクロタイタープ
レートに加えた。捕捉された抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体を、異なったイソ
タイプ特異性のアルカリホスファターゼ抱合ヤギ抗マウス免疫グロブリンと共に
インキュベートし、抱合抗体と抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体との結合をｐ−
ニトロフェニルホスフェートを添加して測定した。着色反応をＥＬＩＳＡプレー
ト読取り器を用いて405nmで測定した。 上記方法によって、Ａ４.６.１およびＢ２.６.２ハイブリドーマの両方で産生
したモノクローナル抗体のイソタイプはＩgＧ１であると決定された。
【００３２】 Ｄ．結合親和性 Ａ４.６.１およびＢ２.６.２ハイブリドーマが産生した抗ｈＶＥＧＦモノクロ
ーナル抗体のｈＶＥＧＦに対する親和性を競合結合アッセイで測定した。予め定
めた最適以下の濃度のモノクローナル抗体を、20,000〜40,000cpmの125Ｉ−ｈＶ
ＥＧＦ（１〜２ng）および種々の既知量の非標識ｈＶＥＧＦ（１〜1000ng）を含
有する試料に加えた。室温で１時間後、100μlのヤギ抗マウスＩg抗血清（米国
アーカンソー州ロジャーズのPel−Freez）を加え、この混合物を室温でさらに１
時間インキュベートした。抗体と結合タンパク質の複合体（免疫複合体）を、４
℃で６％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ、モル分子量8000）を500μｌ添加し
、続いて2000×Ｇ、４℃で20分間遠心分離して沈殿させた。各試料中の抗ｈＶＥ
ＧＦモノクローナル抗体と結合した125Ｉ−ｈＶＥＧＦの量を、ペレット化した
材料をガンマ計数器で計数することにより測定した。 親和性定数はスカッチャード分析によってデータから計算した。Ａ４.６.１ハ
イブリドーマが産生した抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体の親和性は1.2×109リ
ットル／モルであると計算された。Ｂ２.６.２ハイブリドーマが産生した抗ｈＶ
ＥＧＦモノクローナル抗体の親和性は2.5×109リットル／モルであると計算され
た。
ーナル抗体のｈＶＥＧＦに対する親和性を競合結合アッセイで測定した。予め定
めた最適以下の濃度のモノクローナル抗体を、20,000〜40,000cpmの125Ｉ−ｈＶ
ＥＧＦ（１〜２ng）および種々の既知量の非標識ｈＶＥＧＦ（１〜1000ng）を含
有する試料に加えた。室温で１時間後、100μlのヤギ抗マウスＩg抗血清（米国
アーカンソー州ロジャーズのPel−Freez）を加え、この混合物を室温でさらに１
時間インキュベートした。抗体と結合タンパク質の複合体（免疫複合体）を、４
℃で６％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ、モル分子量8000）を500μｌ添加し
、続いて2000×Ｇ、４℃で20分間遠心分離して沈殿させた。各試料中の抗ｈＶＥ
ＧＦモノクローナル抗体と結合した125Ｉ−ｈＶＥＧＦの量を、ペレット化した
材料をガンマ計数器で計数することにより測定した。 親和性定数はスカッチャード分析によってデータから計算した。Ａ４.６.１ハ
イブリドーマが産生した抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体の親和性は1.2×109リ
ットル／モルであると計算された。Ｂ２.６.２ハイブリドーマが産生した抗ｈＶ
ＥＧＦモノクローナル抗体の親和性は2.5×109リットル／モルであると計算され
た。
【００３３】 Ｅ．ｈＶＥＧＦの細胞***促進活性の阻止 ウシ副腎皮質毛細血管内皮（ＡＣＥ）細胞、フェララ等、Proc，Nat．Acad．S
ci．84:5773（1987年）を12個のマルチウエルプレート中に104細胞／mlの密度で
接種し、2.5ng／mlのｈＶＥＧＦを、Ａ４.６.１もしくはＢ２.６.２ハイブリド
ーマが産生した種々の濃度の抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体または無関係の抗
ＨＧＦモノクローナル抗体の存在下または不存在下で各ウエルに加えた。５日間
の培養後、各ウエルの細胞数をコールター（Coulter）計数器で計測した。対照
として、ｈＶＥＧＦを添加しないでＡＣＥ細胞を培養した。 Ｆｉｇ２に示されるように、抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体は両方とも、添
加したｈＶＥＧＦがウシＡＣＥ細胞の増殖または生存を支持する能力を阻害した
。Ａ４.６.１ハイブリドーマが産生したモノクローナル抗体はｈＶＥＧＦの細胞
***促進活性を完全に阻止する一方（約90％以上の阻止）、Ｂ２.６.２が産生し
たモノクローナル抗体はｈＶＥＧＦの細胞***促進活性を部分的にしか阻止しな
かった。
ci．84:5773（1987年）を12個のマルチウエルプレート中に104細胞／mlの密度で
接種し、2.5ng／mlのｈＶＥＧＦを、Ａ４.６.１もしくはＢ２.６.２ハイブリド
ーマが産生した種々の濃度の抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体または無関係の抗
ＨＧＦモノクローナル抗体の存在下または不存在下で各ウエルに加えた。５日間
の培養後、各ウエルの細胞数をコールター（Coulter）計数器で計測した。対照
として、ｈＶＥＧＦを添加しないでＡＣＥ細胞を培養した。 Ｆｉｇ２に示されるように、抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体は両方とも、添
加したｈＶＥＧＦがウシＡＣＥ細胞の増殖または生存を支持する能力を阻害した
。Ａ４.６.１ハイブリドーマが産生したモノクローナル抗体はｈＶＥＧＦの細胞
***促進活性を完全に阻止する一方（約90％以上の阻止）、Ｂ２.６.２が産生し
たモノクローナル抗体はｈＶＥＧＦの細胞***促進活性を部分的にしか阻止しな
かった。
【００３４】 Ｆ．ｈＶＥＧＦ結合の阻止 ウシＡＣＥ細胞を、10％の仔ウシ血清、２mＭのグルタミンおよび１ng／mlの
塩基性線維芽細胞増殖因子を含有するダルベッコの修正イーグル培地（ＤＭＥＭ
）中24のウエルのマイクロタイタープレートに2.5×104細胞／0.5ml／ウエルの
密度で蒔いた。一夜培養した後、細胞を４℃で結合緩衝液（等量のＤＭＥＭおよ
びＦ12培地プラス25mＭのＨＥＰＥＳおよび１％のウシ血清アルブミン）を用い
て１回洗浄した。 12,000cpmの125Ｉ−ｈＶＥＧＦ（約５×104cpm／ng／ml）を、Ａ４.６.１、Ｂ
２.６.２またはＡ２.６.１ハイブリドーマ（250μｌの総容量）が産生した抗ｈ
ＶＥＧＦモノクローナル抗体５μgと共に30分間予めインキュベートし、その後
この混合物をマイクロタイタープレート中のウシＡＣＥ細胞に加えた。細胞を４
℃で３時間インキュベートした後、細胞を４℃で結合緩衝液を用いて３回洗浄し
、0.5mlの0.2Ｎ、ＮaＯＨを添加して溶解させ、ガンマ計数器で計数した。 Ｆｉｇ３（上）に示されるように、Ａ４.６.１およびＢ２.６.２ハイブリドー
マが産生した抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体はｈＶＥＧＦとウシＡＣＥ細胞の
結合を阻止した。対照的に、Ａ２.６.１ハイブリドーマが産生した抗ｈＶＥＧＦ
モノクローナル抗体はｈＶＥＧＦとウシＡＣＥ細胞の結合に与える明白な影響は
なかった。上記した細胞増殖アッセイで得た結果と一致して、Ａ４.６.１ハイブ
リドーマが産生したモノクローナル抗体はＢ２.６.２が産生したモノクローナル
抗体よりさらに強くｈＶＥＧＦの結合を阻止した。 Ｆｉｇ３（下）に示されるように、Ａ４.６.１ハイブリドーマが産生したモノ
クローナル抗体は、１：250のｈＶＥＧＦ対抗体のモル比でｈＶＥＧＦとウシＡ
ＣＥ細胞の結合を完全に阻止した。
塩基性線維芽細胞増殖因子を含有するダルベッコの修正イーグル培地（ＤＭＥＭ
）中24のウエルのマイクロタイタープレートに2.5×104細胞／0.5ml／ウエルの
密度で蒔いた。一夜培養した後、細胞を４℃で結合緩衝液（等量のＤＭＥＭおよ
びＦ12培地プラス25mＭのＨＥＰＥＳおよび１％のウシ血清アルブミン）を用い
て１回洗浄した。 12,000cpmの125Ｉ−ｈＶＥＧＦ（約５×104cpm／ng／ml）を、Ａ４.６.１、Ｂ
２.６.２またはＡ２.６.１ハイブリドーマ（250μｌの総容量）が産生した抗ｈ
ＶＥＧＦモノクローナル抗体５μgと共に30分間予めインキュベートし、その後
この混合物をマイクロタイタープレート中のウシＡＣＥ細胞に加えた。細胞を４
℃で３時間インキュベートした後、細胞を４℃で結合緩衝液を用いて３回洗浄し
、0.5mlの0.2Ｎ、ＮaＯＨを添加して溶解させ、ガンマ計数器で計数した。 Ｆｉｇ３（上）に示されるように、Ａ４.６.１およびＢ２.６.２ハイブリドー
マが産生した抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体はｈＶＥＧＦとウシＡＣＥ細胞の
結合を阻止した。対照的に、Ａ２.６.１ハイブリドーマが産生した抗ｈＶＥＧＦ
モノクローナル抗体はｈＶＥＧＦとウシＡＣＥ細胞の結合に与える明白な影響は
なかった。上記した細胞増殖アッセイで得た結果と一致して、Ａ４.６.１ハイブ
リドーマが産生したモノクローナル抗体はＢ２.６.２が産生したモノクローナル
抗体よりさらに強くｈＶＥＧＦの結合を阻止した。 Ｆｉｇ３（下）に示されるように、Ａ４.６.１ハイブリドーマが産生したモノ
クローナル抗体は、１：250のｈＶＥＧＦ対抗体のモル比でｈＶＥＧＦとウシＡ
ＣＥ細胞の結合を完全に阻止した。
【００３５】 Ｇ．他のＶＥＧＦイソ型との交差反応性 Ａ４.６.１ハイブリドーマが産生した抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体がｈＶ
ＥＧＦの121−および189−アミノ酸形態と反応性であるかどうかを決定するため
に、これらのポリペプチドを免疫沈降させる能力について抗体をアッセイした。 ヒト293細胞を、上記したようにして、121−および189−アミノ酸ｈＶＥＧＦ
ポリペプチドの配列をコードするヌクレオチドを有するベクターでトランスフェ
クションした。リュング等、Science 246:1306（1988年）。トランスフェクショ
ンして２日後、システインおよびメチオニンを欠く培地に細胞を移した。細胞を
上記培地中で30分問インキュベートし、その後100μＣi／mlの各35Ｓ−メチオニ
ンおよび35Ｓ−システインを培地に加え、細胞をさらに２時間インキュベートし
た。細胞を無血清培地に移し、３時間インキュベートすることによって標識を追
跡した。細胞培養培地を集め、溶解緩衝液（150mＭ ＮaＣｌ、１％ ＮＰ40、0.5
％デオキシコレート、0.1％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、50mＭ トリス
、ｐＨ 8.0）中で30分間インキュベートして細胞を溶解させた。細胞屑は、200
×Ｇで30分間遠心分離して溶解物から除去した。 細胞培養培地および細胞溶解物の500μl試料を、２μlのＡ４.６.１ハイブリ
ドーマ抗体（2.4mg／ml）と共に４℃で１時間インキュベートし、その後５μlの
ウサギ抗マウスＩgＧ免疫グロブリンと共に４℃で１時間インキュベートした。3 5 Ｓ−標識ｈＶＥＧＦと抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体の免疫複合体をプロテ
インＡセファロース（Pharmacia）で沈殿させ、その後還元条件下でＳＤＳ−12
％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を施した。免疫沈降させ、放射標識したタン
パク質をオートラジオグラフィーで分析するため、ゲルをＸ線フィルムに露出さ
せた。 上記分析の結果、Ａ４.６.１ハイブリドーマが産生した抗ｈＶＥＧＦモノクロ
ーナル抗体がｈＶＥＧＦの121−および189−アミノ酸形態の両方と交差反応性で
あることが示された。
ＥＧＦの121−および189−アミノ酸形態と反応性であるかどうかを決定するため
に、これらのポリペプチドを免疫沈降させる能力について抗体をアッセイした。 ヒト293細胞を、上記したようにして、121−および189−アミノ酸ｈＶＥＧＦ
ポリペプチドの配列をコードするヌクレオチドを有するベクターでトランスフェ
クションした。リュング等、Science 246:1306（1988年）。トランスフェクショ
ンして２日後、システインおよびメチオニンを欠く培地に細胞を移した。細胞を
上記培地中で30分問インキュベートし、その後100μＣi／mlの各35Ｓ−メチオニ
ンおよび35Ｓ−システインを培地に加え、細胞をさらに２時間インキュベートし
た。細胞を無血清培地に移し、３時間インキュベートすることによって標識を追
跡した。細胞培養培地を集め、溶解緩衝液（150mＭ ＮaＣｌ、１％ ＮＰ40、0.5
％デオキシコレート、0.1％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、50mＭ トリス
、ｐＨ 8.0）中で30分間インキュベートして細胞を溶解させた。細胞屑は、200
×Ｇで30分間遠心分離して溶解物から除去した。 細胞培養培地および細胞溶解物の500μl試料を、２μlのＡ４.６.１ハイブリ
ドーマ抗体（2.4mg／ml）と共に４℃で１時間インキュベートし、その後５μlの
ウサギ抗マウスＩgＧ免疫グロブリンと共に４℃で１時間インキュベートした。3 5 Ｓ−標識ｈＶＥＧＦと抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体の免疫複合体をプロテ
インＡセファロース（Pharmacia）で沈殿させ、その後還元条件下でＳＤＳ−12
％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を施した。免疫沈降させ、放射標識したタン
パク質をオートラジオグラフィーで分析するため、ゲルをＸ線フィルムに露出さ
せた。 上記分析の結果、Ａ４.６.１ハイブリドーマが産生した抗ｈＶＥＧＦモノクロ
ーナル抗体がｈＶＥＧＦの121−および189−アミノ酸形態の両方と交差反応性で
あることが示された。
【００３６】 実施例３ ＶＥＧＦレセプター−ＩgＧ融合タンパク質の調製 Ａ． ｆｌｔ ｈＶＥＧＦレセプターのヌクレオチドおよびアミノ酸コード化配列は
シブヤ等、Oncogene 5:519〜524（1990年）に開示されている。ｆｌｔ ｈＶＥＧ
Ｆレセプターの全細胞外ドメインのコード化配列を２段階方法でヒトＩgＧ１重
鎖のコード化配列に融合させた。 部位特異的突然変異誘発を使用して、ｆｌｔのアミノ酸759のコドンに対して
５’部位にｆｌｔをコードするＤＮＡ中にＢｓｔＢ１制限を導入し、プラスミド
ｐＢＳＳＫ’ＦＣ、ベネット等、J．Biol．Chem．266:23060〜23067（1991年）
の独特のＢｓｔＥＩＩ制限部位をＢｓｔＢＩ部位に変換した。改変したプラスミ
ドをＥｃｏＲＩおよびＢｓｔＢＩで消化し、得られたプラスミドＤＮＡの大きい
フラグメントを、ｆｌｔ ｈＶＥＧＦレセプターの細胞外ドメイン（アミノ酸１
〜758）をコードするｆｌｔ ＤＮＡのＥｃｏＲＩ−ＢｓｔＢＩフラグメントと一
緒にライゲートさせた。 得られた作成物を、ＣlａＩおよびＮｏｔＩで消化して約3.3kbのフラグメント
を生成させ、次にこれをライゲーションによって哺乳動物発現ベクターｐＨＥＢ
Ｏ２（リュング等、Neuron 8:1045（1992年））の複数のクローニング部位に挿
入する。3.3kbのフラグメントの末端を、例えばリンカーを加えて修飾して、正
しい発現方向でのベクターへのフラグメント挿入がなされる。 哺乳動物宿主細胞（例えば、ＣＥＮ4細胞（リュング等、上掲））をエレクト
ロポーレーションによってｆｌｔ挿入物を含有するｐＨＥＢＯ２プラスミドでト
ランスフェクションする。トランスフェクションされた細胞を約10％のウシ胎児
血清、２mＭのグルタミンおよび抗生物質を含有する培地中で培養し、約75％の
集密性で血清不含培地に移した。培地を収集前の３〜４日間馴化し、ｆｌｔ−Ｉ
gＧ融合タンパク質を、本質的にベネット等、J．Biol．Chem．266:23060〜23067
（1991年）に記載されたようにして、プロテインＡアフィニティーマトリックス
でのクロマトグラフィーにかけて条件培地から精製する。
シブヤ等、Oncogene 5:519〜524（1990年）に開示されている。ｆｌｔ ｈＶＥＧ
Ｆレセプターの全細胞外ドメインのコード化配列を２段階方法でヒトＩgＧ１重
鎖のコード化配列に融合させた。 部位特異的突然変異誘発を使用して、ｆｌｔのアミノ酸759のコドンに対して
５’部位にｆｌｔをコードするＤＮＡ中にＢｓｔＢ１制限を導入し、プラスミド
ｐＢＳＳＫ’ＦＣ、ベネット等、J．Biol．Chem．266:23060〜23067（1991年）
の独特のＢｓｔＥＩＩ制限部位をＢｓｔＢＩ部位に変換した。改変したプラスミ
ドをＥｃｏＲＩおよびＢｓｔＢＩで消化し、得られたプラスミドＤＮＡの大きい
フラグメントを、ｆｌｔ ｈＶＥＧＦレセプターの細胞外ドメイン（アミノ酸１
〜758）をコードするｆｌｔ ＤＮＡのＥｃｏＲＩ−ＢｓｔＢＩフラグメントと一
緒にライゲートさせた。 得られた作成物を、ＣlａＩおよびＮｏｔＩで消化して約3.3kbのフラグメント
を生成させ、次にこれをライゲーションによって哺乳動物発現ベクターｐＨＥＢ
Ｏ２（リュング等、Neuron 8:1045（1992年））の複数のクローニング部位に挿
入する。3.3kbのフラグメントの末端を、例えばリンカーを加えて修飾して、正
しい発現方向でのベクターへのフラグメント挿入がなされる。 哺乳動物宿主細胞（例えば、ＣＥＮ4細胞（リュング等、上掲））をエレクト
ロポーレーションによってｆｌｔ挿入物を含有するｐＨＥＢＯ２プラスミドでト
ランスフェクションする。トランスフェクションされた細胞を約10％のウシ胎児
血清、２mＭのグルタミンおよび抗生物質を含有する培地中で培養し、約75％の
集密性で血清不含培地に移した。培地を収集前の３〜４日間馴化し、ｆｌｔ−Ｉ
gＧ融合タンパク質を、本質的にベネット等、J．Biol．Chem．266:23060〜23067
（1991年）に記載されたようにして、プロテインＡアフィニティーマトリックス
でのクロマトグラフィーにかけて条件培地から精製する。
【００３７】 Ｂ． ヒトｆｌｔ−ＩｇＧ（ｈｆｌｔ(１−３)−ＩｇＧと称する）ｃＤＮＡを、デー
ビス−スミス等、EMBO J. 15:4919-4927（1996年）に記載されているようにして
作成した。この切断レセプター型には、Ｆｃ−ＩｇＧに融合したヒトｆｌｔの最
初の３つの免疫グロブリン様ドメインのみが含まれていた。フェララ等、Nature
Medicine 4:336（1998年）を参照。 ネズミｆｌｔ−ＩｇＧ（ｍｆｌｔ(１−３)−ＩｇＧと称する）を、上掲のフェ
ララ等に記載されているプライマーを使用し、マウスの１７日齢の胚ｃＤＮＡを
ＰＣＲ増幅させることにより作成した(Clontech, Palo Alto, CA)。３’ＰＣＲ
プライマーの設計により、mｆｌｔ−１（１−３）の発現がネズミＩｇＧ２ｂ Ｆ
ｃクローンと同じフレーム内であることが確実になった。得られた１−ｋｂフラ
グメントを、Ｃ１ａＩ−ＢｓｔＥＩＩフラグメントとしてＴＡクローニングベク
ター（インビトロゲン、サンティエゴ、ＣＡ）中に最初にクローニングした。こ
のフラグメントをｐＲＫベクター中でネズミＩｇＧ２ｂ Ｆｃの５'末端にライゲ
ートさせた。哺乳動物細胞中にトランスフェクションしたとき、このプラスミド
によりｍｆｌｔ（１−３）−ＩｇＧ融合タンパク質の発現が可能になった。 ＣＨＯ細胞中での発現のために、ｃＤＮＡをdicistronicなベクター中でサブ
クローン化し、ｆｌｔ誘導融合タンパク質の発現に、マーカーであるジヒドロホ
ラートレダクターゼの発現を関連させる。ルカス（Lucas）等、Nucleic Acid れ
Ｓ。24:1774-1779（1996年）を参照。プラスミドをリポフェクションを介して、
ＤＰ１２細胞、エル・チャシン（L. Chasin）（コロンビア大学、ニューヨーク）
により開発されたＣＨＯ−Ｋ１ＤＵＸＢ１１細胞系の誘導体に導入し、グリシン
−ヒポキサンチン−チミジン（Ｇ−Ｈ−Ｔ）不含培地で増殖させるように選択し
た。チショルム（Chisholm）等、ＤＮＡクローニング 4：実用的アプローチ、哺
乳動物系（eds. Glover & Hames）、1〜39頁（Oxford Press、1995年）。続いて
、第１ラウンドの選択からのクローンをメトトレキサートの濃度を増加させて培
養した。ついで、クローンをヒト又はネズミＦｃのＥＬＩＳＡによる生産のため
にスクリーニングした。最も高い生産性を示したクローンを懸濁培養用にし、無
血清培養物を収集し、プロテインＡ−セファロースで精製した。タンパク質濃度
をアミノ酸分析により決定した。最終的に精製された物質のエンドドキシン含有
量は０．５ｅｕ／ｍｇを越えていなかった。 上掲のフェララ等に記載されたように、ネズミｆｌｔ（１−３）−ＩｇＧ融合
タンパク質とヒトｆｌｔ（１−３）−ＩｇＧ融合タンパク質は両方とも試験した
齧歯動物モデルにおいてＶＥＧＦの生物活性を阻害する活性を有していた。
ビス−スミス等、EMBO J. 15:4919-4927（1996年）に記載されているようにして
作成した。この切断レセプター型には、Ｆｃ−ＩｇＧに融合したヒトｆｌｔの最
初の３つの免疫グロブリン様ドメインのみが含まれていた。フェララ等、Nature
Medicine 4:336（1998年）を参照。 ネズミｆｌｔ−ＩｇＧ（ｍｆｌｔ(１−３)−ＩｇＧと称する）を、上掲のフェ
ララ等に記載されているプライマーを使用し、マウスの１７日齢の胚ｃＤＮＡを
ＰＣＲ増幅させることにより作成した(Clontech, Palo Alto, CA)。３’ＰＣＲ
プライマーの設計により、mｆｌｔ−１（１−３）の発現がネズミＩｇＧ２ｂ Ｆ
ｃクローンと同じフレーム内であることが確実になった。得られた１−ｋｂフラ
グメントを、Ｃ１ａＩ−ＢｓｔＥＩＩフラグメントとしてＴＡクローニングベク
ター（インビトロゲン、サンティエゴ、ＣＡ）中に最初にクローニングした。こ
のフラグメントをｐＲＫベクター中でネズミＩｇＧ２ｂ Ｆｃの５'末端にライゲ
ートさせた。哺乳動物細胞中にトランスフェクションしたとき、このプラスミド
によりｍｆｌｔ（１−３）−ＩｇＧ融合タンパク質の発現が可能になった。 ＣＨＯ細胞中での発現のために、ｃＤＮＡをdicistronicなベクター中でサブ
クローン化し、ｆｌｔ誘導融合タンパク質の発現に、マーカーであるジヒドロホ
ラートレダクターゼの発現を関連させる。ルカス（Lucas）等、Nucleic Acid れ
Ｓ。24:1774-1779（1996年）を参照。プラスミドをリポフェクションを介して、
ＤＰ１２細胞、エル・チャシン（L. Chasin）（コロンビア大学、ニューヨーク）
により開発されたＣＨＯ−Ｋ１ＤＵＸＢ１１細胞系の誘導体に導入し、グリシン
−ヒポキサンチン−チミジン（Ｇ−Ｈ−Ｔ）不含培地で増殖させるように選択し
た。チショルム（Chisholm）等、ＤＮＡクローニング 4：実用的アプローチ、哺
乳動物系（eds. Glover & Hames）、1〜39頁（Oxford Press、1995年）。続いて
、第１ラウンドの選択からのクローンをメトトレキサートの濃度を増加させて培
養した。ついで、クローンをヒト又はネズミＦｃのＥＬＩＳＡによる生産のため
にスクリーニングした。最も高い生産性を示したクローンを懸濁培養用にし、無
血清培養物を収集し、プロテインＡ−セファロースで精製した。タンパク質濃度
をアミノ酸分析により決定した。最終的に精製された物質のエンドドキシン含有
量は０．５ｅｕ／ｍｇを越えていなかった。 上掲のフェララ等に記載されたように、ネズミｆｌｔ（１−３）−ＩｇＧ融合
タンパク質とヒトｆｌｔ（１−３）−ＩｇＧ融合タンパク質は両方とも試験した
齧歯動物モデルにおいてＶＥＧＦの生物活性を阻害する活性を有していた。
【００３８】 実施例４ ｈＶＥＧＦアンタゴニストによる腫瘍増殖の阻止 培養物中で増殖している様々なヒト腫瘍細胞株をｈＶＥＧＦの産生についてＥ
ＬＩＳＡでアッセイした。卵巣、肺、大腸、胃、乳および脳腫瘍細胞株はｈＶＥ
ＧＦを産生することが分かった。さらなる試験のために、ｈＶＥＧＦを産生した
３つの細胞株、ＮＥＧ55（Ｇ55とも称される）（Ｇ55とも称される）（ドイツ、
ハンブルグのエッペンドル大学病院神経外科部のM．ウエストファル（Westphal
）医師から得たヒト神経膠腫細胞株）、Ａ−673（細胞株番号ＣＲＬ 1598として
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から取得したヒト
横紋筋肉腫細胞株）およびＳＫ−ＬＭＳ−１（細胞株番号ＨＴＢ 88としてＡＴ
ＣＣから取得した平滑筋肉腫細胞株）を使用した。 生後６〜10週齢の雌ベージュ／ヌードマウス（米国マサチューセッツ州ウィル
ミントンのCharles River Laboratory）に100〜200μｌのＰＢＳ中１〜５×106
個の腫瘍細胞を皮下注射した。腫瘍増殖を確立した後種々の時間で、種々の投与
量のＡ４.６.１抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体、無関係の抗ｇｐ120モノクロ
ーナル抗体（5Ｂ6）またはＰＢＳを１週間当たり１回または２回マウスに腹腔内
注射した。腫瘍サイズを毎週測定し、試験終結時に腫瘍を切開し重量を測定した
。 マウスのＮＥＧ55腫瘍の増殖に与える種々の量のＡ４.６.１抗ｈＶＥＧＦモノ
クローナル抗体の効果をＦｉｇ４およびＦｉｇ５に示す。Ｆｉｇ４は、ＮＥＧ55
細胞を接種して１週間後に開始し25μgまたは100μgのＡ４.６.１抗ｈＶＥＧＦ
モノクローナル抗体で治療したマウスを無関係の抗体またはＰＢＳで治療したマ
ウスと比較したとき、腫瘍増殖速度が大幅に減少していたことを示している。Ｆ
ｉｇ５は、ＮＥＧ55細胞を接種して５週間後に、Ａ４.６.１抗ｈＶＥＧＦ抗体で
治療したマウスの腫瘍の大きさが無関係抗体またはＰＢＳで治療したマウスの腫
瘍の大きさより約50％（25μg投与量の抗体で治療したマウスの場合）から85％
（100μg投与量の抗体で治療したマウスの場合）小さかったことを示している。 マウスのＳＫ−ＬＭＳ−１腫瘍の増殖に与えるＡ４.６.１抗ｈＶＥＧＦモノク
ローナル抗体治療の効果をＦｉｇ６に示す。ＳＫ−ＬＭＳ−１細胞を接種して５
週間後に、Ａ４.６.１抗ｈＶＥＧＦ抗体で治療したマウスの腫瘍の大きさは、無
関係抗体またはＰＢＳで治療したマウスの腫瘍の大きさより約75％小さかった。 マウスのＡ673腫瘍の増殖に与えるＡ４.６.１抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗
体治療の効果をＦｉｇ７に示す。Ａ673細胞を接種して４週間後に、Ａ４.６.１
抗ｈＶＥＧＦ抗体で治療したマウスの腫瘍の平均的な大きさは、無関係抗体また
はＰＢＳで治療したマウスの腫瘍の大きさより約60％（10μg投与量の抗体で治
療したマウスの場合）から90％以上（50〜400μg投与量の抗体で治療したマウス
の場合）小さかった。
ＬＩＳＡでアッセイした。卵巣、肺、大腸、胃、乳および脳腫瘍細胞株はｈＶＥ
ＧＦを産生することが分かった。さらなる試験のために、ｈＶＥＧＦを産生した
３つの細胞株、ＮＥＧ55（Ｇ55とも称される）（Ｇ55とも称される）（ドイツ、
ハンブルグのエッペンドル大学病院神経外科部のM．ウエストファル（Westphal
）医師から得たヒト神経膠腫細胞株）、Ａ−673（細胞株番号ＣＲＬ 1598として
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から取得したヒト
横紋筋肉腫細胞株）およびＳＫ−ＬＭＳ−１（細胞株番号ＨＴＢ 88としてＡＴ
ＣＣから取得した平滑筋肉腫細胞株）を使用した。 生後６〜10週齢の雌ベージュ／ヌードマウス（米国マサチューセッツ州ウィル
ミントンのCharles River Laboratory）に100〜200μｌのＰＢＳ中１〜５×106
個の腫瘍細胞を皮下注射した。腫瘍増殖を確立した後種々の時間で、種々の投与
量のＡ４.６.１抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体、無関係の抗ｇｐ120モノクロ
ーナル抗体（5Ｂ6）またはＰＢＳを１週間当たり１回または２回マウスに腹腔内
注射した。腫瘍サイズを毎週測定し、試験終結時に腫瘍を切開し重量を測定した
。 マウスのＮＥＧ55腫瘍の増殖に与える種々の量のＡ４.６.１抗ｈＶＥＧＦモノ
クローナル抗体の効果をＦｉｇ４およびＦｉｇ５に示す。Ｆｉｇ４は、ＮＥＧ55
細胞を接種して１週間後に開始し25μgまたは100μgのＡ４.６.１抗ｈＶＥＧＦ
モノクローナル抗体で治療したマウスを無関係の抗体またはＰＢＳで治療したマ
ウスと比較したとき、腫瘍増殖速度が大幅に減少していたことを示している。Ｆ
ｉｇ５は、ＮＥＧ55細胞を接種して５週間後に、Ａ４.６.１抗ｈＶＥＧＦ抗体で
治療したマウスの腫瘍の大きさが無関係抗体またはＰＢＳで治療したマウスの腫
瘍の大きさより約50％（25μg投与量の抗体で治療したマウスの場合）から85％
（100μg投与量の抗体で治療したマウスの場合）小さかったことを示している。 マウスのＳＫ−ＬＭＳ−１腫瘍の増殖に与えるＡ４.６.１抗ｈＶＥＧＦモノク
ローナル抗体治療の効果をＦｉｇ６に示す。ＳＫ−ＬＭＳ−１細胞を接種して５
週間後に、Ａ４.６.１抗ｈＶＥＧＦ抗体で治療したマウスの腫瘍の大きさは、無
関係抗体またはＰＢＳで治療したマウスの腫瘍の大きさより約75％小さかった。 マウスのＡ673腫瘍の増殖に与えるＡ４.６.１抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗
体治療の効果をＦｉｇ７に示す。Ａ673細胞を接種して４週間後に、Ａ４.６.１
抗ｈＶＥＧＦ抗体で治療したマウスの腫瘍の平均的な大きさは、無関係抗体また
はＰＢＳで治療したマウスの腫瘍の大きさより約60％（10μg投与量の抗体で治
療したマウスの場合）から90％以上（50〜400μg投与量の抗体で治療したマウス
の場合）小さかった。
【００３９】 実施例５ 培養物中で増殖している腫瘍細胞に与える 抗ｈＶＥＧＦ抗体の直接的な効果の
分析 ＮＥＧ55ヒト神経膠腫細胞またはＡ673横紋筋肉腫細胞を、10％のウシ胎児血
清、２mＭのグルタミンおよび抗生物質を含有するＦ12／ＤＭＥＭ培地のマルチ
ウエルプレート（12ウエル／プレート）中に７×103細胞／ウエルの密度で蒔い
た。次に、Ａ４.６.１抗ｈＶＥＧＦ抗体を最終濃度が０〜20.0μgの抗体／mlに
なるように細胞培養物に加えた。５日後、ウエル内で増殖している細胞を、トリ
プシンに暴露して分離させ、コールター計数器で計数した。 Ｆｉｇ８および９はこれらの試験結果を示す。明らかなように、Ａ４.６.１抗
ｈＶＥＧＦ抗体は、培養物中のＮＥＧ55またはＡ673細胞の増殖に対して何ら有
意な効果を有していなかった。これらの結果は、Ａ４.６.１抗ｈＶＥＧＦ抗体が
細胞毒性でないことを示しており、抗体の観察された抗腫瘍効果はＶＥＧＦ媒介
性新血管形成の阻止によるものであることを強く示唆している。
分析 ＮＥＧ55ヒト神経膠腫細胞またはＡ673横紋筋肉腫細胞を、10％のウシ胎児血
清、２mＭのグルタミンおよび抗生物質を含有するＦ12／ＤＭＥＭ培地のマルチ
ウエルプレート（12ウエル／プレート）中に７×103細胞／ウエルの密度で蒔い
た。次に、Ａ４.６.１抗ｈＶＥＧＦ抗体を最終濃度が０〜20.0μgの抗体／mlに
なるように細胞培養物に加えた。５日後、ウエル内で増殖している細胞を、トリ
プシンに暴露して分離させ、コールター計数器で計数した。 Ｆｉｇ８および９はこれらの試験結果を示す。明らかなように、Ａ４.６.１抗
ｈＶＥＧＦ抗体は、培養物中のＮＥＧ55またはＡ673細胞の増殖に対して何ら有
意な効果を有していなかった。これらの結果は、Ａ４.６.１抗ｈＶＥＧＦ抗体が
細胞毒性でないことを示しており、抗体の観察された抗腫瘍効果はＶＥＧＦ媒介
性新血管形成の阻止によるものであることを強く示唆している。
【００４０】 実施例６ 内皮細胞走化性に与える抗ｈＶＥＧＦ抗体の効果 内皮細胞並びに単球およびリンパ球を含む他の細胞の走化性は関節リウマチの
病原において重要な役割を果たしている。内皮細胞の遊走および増殖はリウマト
イド滑膜内で生じる脈管形成を伴う。血管形成性組織（パンヌス）は関節軟骨に
侵入し、これを破壊する。 ｈＶＥＧＦアンタゴニストがこのプロセスを妨げるかどうかを決定するために
、我々は、関節リウマチの患者から得た滑液で刺激した内皮細胞の走化性に与え
るＡ４.６.１抗ｈＶＥＧＦ抗体の効果をアッセイした。対照として、我々は骨関
節炎（関節リウマチで生じる脈管形成は骨関節炎では生じない）患者から得た滑
液で剌激した内皮細胞の走化性に与えるＡ４.６.１抗ｈＶＥＧＦ抗体の効果もア
ッセイした。 内皮細胞の走化性は確立された方法に従って、変更したボイデンチャンバーを
使用してアッセイした。トンプソン（Thompson）等、Cancer Res．51:2670（199
1年）；フィリップス（Phillips）等、Proc．Exp．Biol．Med．197:458（1991年
）。約104個のヒト臍静脈内皮細胞を、0.1％のウシ胎児血清を含有する培養培地
の48ウエルのマルチウエルマイクロチェンバー中でゼラチン被覆フィルター（0.
8ミクロンの孔サイズ）に接着させた。約２時間後、チャンバーを逆さにし、試
験試料（関節リウマチ滑液、骨関節炎滑液、塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ））（１μ
g／mlの最終濃度までか、またはＰＢＳ）およびＡ４.６.１抗ｈＶＥＧＦ抗体（1
0μg／mlの最終濃度まで）をウエルに加えた。２ないし４時間後、遊走した細胞
を染色しそして計数した。 Ｆｉｇ１０は上記の試験の平均化した結果を示すものである。「滑液」と表示
した欄および対照に関する頁の下部に示された値は滑液、ｂＦＧＦまたはＰＢＳ
単独の存在下で遊走した内皮細胞の平均数である。「滑膜液＋ｍＡＢ ＶＥＧＦ
」と表示した欄の値は、滑液プラス添加したＡ４.６.１−抗ｈＶＥＧＦ抗体の存
在下で遊走した内皮細胞の平均数である。「抑制％］と表示した欄の値は、抗ｈ
ＶＥＧＦ抗体の添加により生じた滑液誘発内皮細胞遊走の低下パーセントを示す
。示されているように、抗ｈＶＥＧＦ抗体は、関節リウマチの滑液が内皮細胞の
遊走を誘発する能力を有意に阻止する（平均53.40パーセントの阻止）が、骨関
節炎の滑液はそうではなかった（平均13.64パーセントの阻止）。
病原において重要な役割を果たしている。内皮細胞の遊走および増殖はリウマト
イド滑膜内で生じる脈管形成を伴う。血管形成性組織（パンヌス）は関節軟骨に
侵入し、これを破壊する。 ｈＶＥＧＦアンタゴニストがこのプロセスを妨げるかどうかを決定するために
、我々は、関節リウマチの患者から得た滑液で刺激した内皮細胞の走化性に与え
るＡ４.６.１抗ｈＶＥＧＦ抗体の効果をアッセイした。対照として、我々は骨関
節炎（関節リウマチで生じる脈管形成は骨関節炎では生じない）患者から得た滑
液で剌激した内皮細胞の走化性に与えるＡ４.６.１抗ｈＶＥＧＦ抗体の効果もア
ッセイした。 内皮細胞の走化性は確立された方法に従って、変更したボイデンチャンバーを
使用してアッセイした。トンプソン（Thompson）等、Cancer Res．51:2670（199
1年）；フィリップス（Phillips）等、Proc．Exp．Biol．Med．197:458（1991年
）。約104個のヒト臍静脈内皮細胞を、0.1％のウシ胎児血清を含有する培養培地
の48ウエルのマルチウエルマイクロチェンバー中でゼラチン被覆フィルター（0.
8ミクロンの孔サイズ）に接着させた。約２時間後、チャンバーを逆さにし、試
験試料（関節リウマチ滑液、骨関節炎滑液、塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ））（１μ
g／mlの最終濃度までか、またはＰＢＳ）およびＡ４.６.１抗ｈＶＥＧＦ抗体（1
0μg／mlの最終濃度まで）をウエルに加えた。２ないし４時間後、遊走した細胞
を染色しそして計数した。 Ｆｉｇ１０は上記の試験の平均化した結果を示すものである。「滑液」と表示
した欄および対照に関する頁の下部に示された値は滑液、ｂＦＧＦまたはＰＢＳ
単独の存在下で遊走した内皮細胞の平均数である。「滑膜液＋ｍＡＢ ＶＥＧＦ
」と表示した欄の値は、滑液プラス添加したＡ４.６.１−抗ｈＶＥＧＦ抗体の存
在下で遊走した内皮細胞の平均数である。「抑制％］と表示した欄の値は、抗ｈ
ＶＥＧＦ抗体の添加により生じた滑液誘発内皮細胞遊走の低下パーセントを示す
。示されているように、抗ｈＶＥＧＦ抗体は、関節リウマチの滑液が内皮細胞の
遊走を誘発する能力を有意に阻止する（平均53.40パーセントの阻止）が、骨関
節炎の滑液はそうではなかった（平均13.64パーセントの阻止）。
【００４１】 実施例７ 脳浮腫に与えるアンタゴニストの効果 インビボアッセイを行い、脳浮腫に与えるｆｌｔ−ＩｇＧアンタゴニストの効
果を測定した。ＢＢＢ完全性の喪失と脳浮腫形成により脳梗塞がしばしば生じる
。虚血性脳卒中におけるＢＢＢの破壊は、主として、脳卒中開始の最初の２４時
間後に生じると考えられている。さらに、急性虚血の発生に続く血流の迅速で十
分な復活という有益な効果は、ＢＢＢを含む脳微小血管に対する再灌流損傷によ
って台無しになると信じられており、脳浮腫の形成に寄与する。クラトゾ（Klat
zo）等、Eds., Brain Edema, Tokyo, Springer（1984年）,1〜5頁。以下に記載
するインビボアッセイは、臨床状態のこれら側面を反映するように計画された。
果を測定した。ＢＢＢ完全性の喪失と脳浮腫形成により脳梗塞がしばしば生じる
。虚血性脳卒中におけるＢＢＢの破壊は、主として、脳卒中開始の最初の２４時
間後に生じると考えられている。さらに、急性虚血の発生に続く血流の迅速で十
分な復活という有益な効果は、ＢＢＢを含む脳微小血管に対する再灌流損傷によ
って台無しになると信じられており、脳浮腫の形成に寄与する。クラトゾ（Klat
zo）等、Eds., Brain Edema, Tokyo, Springer（1984年）,1〜5頁。以下に記載
するインビボアッセイは、臨床状態のこれら側面を反映するように計画された。
【００４２】 限局性皮質虚血を、チェン（Chen）等、脳卒中 17:738-743（1986年）に過去
に記載された方法を使用し、中脳動脈（ＭＣＡ）の閉塞によりマウス脳内に誘発
した。マウス（Ｃ５７ＢＬ−６Ｊ；１８−２５グラム）に、酸素中１．５％イソ
フランを用いて麻酔をかけた。右側ＭＣＡを開頭術により暴露させ１１−０縫合
で結紮した。さらに、同側の共通する頸動脈を虚血中に閉塞させた。血管を４５
分間、閉塞状態のままにした。手術に先だって、動物を無作為に２つの群に分け
、ネズミｆｌｔ−ＩｇＧ（上述した実施例３Ｂに記載；さらにフェララ等、Natu
re Medicine 4:336（1998年）にも記載）又はｆｌｔ−ＩｇＧのＦｃと同じイソ
タイプに属する無関係対照ネズミ抗ＧＰ１２０抗体［フェララ等、上掲］を、手
術の１２時間前、再灌流時、及びまた手術後１及び２日後に１０ｍｇ／ｋｇ投与
量で腹腔内に投与した。浮腫形成の度合いを、虚血の開始後２４時間、Ｔ２加重
ＭＲ画像診断により評価した。梗塞の最終的な大きさを高分解能解剖学用ＭＲＩ
を使用し、８−１２週間後に評価した。常套的な組織学的方法を使用して梗塞の
大きさを検査するために、動物のサブセット（ｎ＝１２）を取り出した。 Ｆｉｇ１１に示すように、ｆｌｔ−Ｉｇの投与により、虚血開始の１日後に得
られたＴ２加重ＭＲＩスキャン上の超強度領域により定められた脳浮腫容積の有
意な低減が引き起こされた（２７％低減、ｐ＝０．０１スチューデントｔ検定、
対照及び治療群のそれぞれにおいてｎ＝１５及びｎ＝１６）。反対側と比べて高
信号強度領域として皮質浮腫の出現を示す代表的なＴ２加重ＭＲ画像をＦｉｇ１
２に示す。このモデルにおいては、虚血ダメージの進行により、空洞形成及び皮
質組織の喪失に至る。よって、梗塞の最大容量は、影響を受けていない皮質の量
を描き、反対側の半球と比較することにより、高分解能解剖用画像から推定する
ことができる。Ｆｉｇ１３に示すように、皮質梗塞のサイズは、８−１２週後に
測定したところでは、ｆｌｔ−ＩｇＧの投与により有意に低減している（梗塞の
サイズで２６％低減、ｐ＝０．００９ステューデントｔ検定、対照及び治療群の
それぞれにおいてｎ＝１１及びｎ＝１４）。ＭＲＩにより測定された梗塞のサイ
ズと、常套的な組織学を使用して測定された梗塞のサイズとの間には良好な相関
関係があった（Ｒ２＝．６３３）。従って、治療された動物では脳浮腫の発達が
低減されることが示されており、これはさらに神経保護の増大をもたらす。これ
らの結果には、ＶＥＧＦの生物学的活性を阻害することで、虚血−再灌流関連脳
浮腫及び損傷を低減可能であることが示されている。
に記載された方法を使用し、中脳動脈（ＭＣＡ）の閉塞によりマウス脳内に誘発
した。マウス（Ｃ５７ＢＬ−６Ｊ；１８−２５グラム）に、酸素中１．５％イソ
フランを用いて麻酔をかけた。右側ＭＣＡを開頭術により暴露させ１１−０縫合
で結紮した。さらに、同側の共通する頸動脈を虚血中に閉塞させた。血管を４５
分間、閉塞状態のままにした。手術に先だって、動物を無作為に２つの群に分け
、ネズミｆｌｔ−ＩｇＧ（上述した実施例３Ｂに記載；さらにフェララ等、Natu
re Medicine 4:336（1998年）にも記載）又はｆｌｔ−ＩｇＧのＦｃと同じイソ
タイプに属する無関係対照ネズミ抗ＧＰ１２０抗体［フェララ等、上掲］を、手
術の１２時間前、再灌流時、及びまた手術後１及び２日後に１０ｍｇ／ｋｇ投与
量で腹腔内に投与した。浮腫形成の度合いを、虚血の開始後２４時間、Ｔ２加重
ＭＲ画像診断により評価した。梗塞の最終的な大きさを高分解能解剖学用ＭＲＩ
を使用し、８−１２週間後に評価した。常套的な組織学的方法を使用して梗塞の
大きさを検査するために、動物のサブセット（ｎ＝１２）を取り出した。 Ｆｉｇ１１に示すように、ｆｌｔ−Ｉｇの投与により、虚血開始の１日後に得
られたＴ２加重ＭＲＩスキャン上の超強度領域により定められた脳浮腫容積の有
意な低減が引き起こされた（２７％低減、ｐ＝０．０１スチューデントｔ検定、
対照及び治療群のそれぞれにおいてｎ＝１５及びｎ＝１６）。反対側と比べて高
信号強度領域として皮質浮腫の出現を示す代表的なＴ２加重ＭＲ画像をＦｉｇ１
２に示す。このモデルにおいては、虚血ダメージの進行により、空洞形成及び皮
質組織の喪失に至る。よって、梗塞の最大容量は、影響を受けていない皮質の量
を描き、反対側の半球と比較することにより、高分解能解剖用画像から推定する
ことができる。Ｆｉｇ１３に示すように、皮質梗塞のサイズは、８−１２週後に
測定したところでは、ｆｌｔ−ＩｇＧの投与により有意に低減している（梗塞の
サイズで２６％低減、ｐ＝０．００９ステューデントｔ検定、対照及び治療群の
それぞれにおいてｎ＝１１及びｎ＝１４）。ＭＲＩにより測定された梗塞のサイ
ズと、常套的な組織学を使用して測定された梗塞のサイズとの間には良好な相関
関係があった（Ｒ２＝．６３３）。従って、治療された動物では脳浮腫の発達が
低減されることが示されており、これはさらに神経保護の増大をもたらす。これ
らの結果には、ＶＥＧＦの生物学的活性を阻害することで、虚血−再灌流関連脳
浮腫及び損傷を低減可能であることが示されている。
【Ｆｉｇ１Ａ】 ｈＶＥＧＦに対する抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体の
結合に対する抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体（Ａ４.６.１）または無関係な抗
肝細胞増殖因子抗体（抗ＨＧＦ）の効果を示す。
結合に対する抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体（Ａ４.６.１）または無関係な抗
肝細胞増殖因子抗体（抗ＨＧＦ）の効果を示す。
【Ｆｉｇ１Ｂ】 ｈＶＥＧＦに対する抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体の
結合に対する抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体（Ｂ２.６.２）または無関係な抗
肝細胞増殖因子抗体（抗ＨＧＦ）の効果を示す。
結合に対する抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体（Ｂ２.６.２）または無関係な抗
肝細胞増殖因子抗体（抗ＨＧＦ）の効果を示す。
【Ｆｉｇ２】 ウシ副腎皮質毛細血管内皮（ＡＣＥ）細胞の培養物中のｈＶ
ＥＧＦの生物学的活性に対する抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体（Ａ４.６.１ま
たはＢ２.６.２）または無関係な抗ＨＧＦ抗体の効果を示す。
ＥＧＦの生物学的活性に対する抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体（Ａ４.６.１ま
たはＢ２.６.２）または無関係な抗ＨＧＦ抗体の効果を示す。
【Ｆｉｇ３Ａ】 ウシＡＣＥ細胞に対するｈＶＥＧＦの結合における抗ｈＶ
ＥＧＦモノクローナル抗体（Ａ４.６.１、Ｂ２.６.２またはＡ２.６.１）の効果
を示す。
ＥＧＦモノクローナル抗体（Ａ４.６.１、Ｂ２.６.２またはＡ２.６.１）の効果
を示す。
【Ｆｉｇ３Ｂ】 Ｆｉｇ３Ａと同様の図である。
【Ｆｉｇ４】 マウスにおけるＮＥＧ55腫瘍増殖の増殖速度に対するＡ４.
６.１抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体治療の効果を示す。
６.１抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体治療の効果を示す。
【Ｆｉｇ５】 治療から５週後のマウスにおけるＮＥＧ55腫瘍のサイズに対
するＡ４.６.１抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体治療の効果を示す。
するＡ４.６.１抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体治療の効果を示す。
【Ｆｉｇ６】 マウスにおけるＳＫ−ＬＭＳ−１腫瘍の増殖に対するＡ４.
６.１抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体（ＶＥＧＦ Ａｂ）治療の効果を示す。
６.１抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体（ＶＥＧＦ Ａｂ）治療の効果を示す。
【Ｆｉｇ７】 マウスにおけるＡ673腫瘍の増殖に対するＡ４.６.１抗ｈＶ
ＥＧＦモノクローナル抗体（ＶＥＧＦ Ａｂ）治療の様々な投与量の効果を示す
。
ＥＧＦモノクローナル抗体（ＶＥＧＦ Ａｂ）治療の様々な投与量の効果を示す
。
【Ｆｉｇ８】 培養中のＮＥＧ55（Ｇ55）膠芽腫細胞の増殖および生存に対
するＡ４.６.１抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体の効果を示す。
するＡ４.６.１抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体の効果を示す。
【Ｆｉｇ９】 培養中のＡ673横紋筋肉腫細胞の増殖および生存に対するＡ
４.６.１抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体の効果を示す。
４.６.１抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体の効果を示す。
【Ｆｉｇ１０】 ヒト内皮細胞のヒト滑液誘発走化性に与えるＡ４.６.１抗
ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体の効果を示す。
ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体の効果を示す。
【Ｆｉｇ１１】 Ｔ２加重磁気共鳴画像の高信号強度により示された浮腫組
織範囲に対するｆｌｔ−ＩｇＧ治療の効果を示す。
織範囲に対するｆｌｔ−ＩｇＧ治療の効果を示す。
【Ｆｉｇ１２】 対照群（上部パネル）と治療群（底部パネル）の両方に対
する、虚血の始まりに続く２４時間に記録した代表的なＴ２加重磁気共鳴画像を
示すもので、治療群において浮腫組織が減少してることを示す。
する、虚血の始まりに続く２４時間に記録した代表的なＴ２加重磁気共鳴画像を
示すもので、治療群において浮腫組織が減少してることを示す。
【Ｆｉｇ１３】 虚血の始まりに続く８−１２週に高分解能解剖用ＭＲＩを
使用して測定した梗塞のサイズに対するｆｌｔ−ＩｇＧ処置の効果を示す。
使用して測定した梗塞のサイズに対するｆｌｔ−ＩｇＧ処置の効果を示す。
【Ｆｉｇ１４Ａ】 Ｆ（ａｂ）−１２抗体と比較した、親和成熟抗ＶＥＧＦ
抗体の各軽及び重可変ドメインに対するアミノ酸配列のアラインメントを示すも
ので、Ｆｉｇ１４Ｂと対をなしている図である（配列番号：１はＦｉｇ１４Ａに
示し、配列番号：９はＦｉｇ１４Ｂに示す）。ＣＤＲには下線を付し、Ｌは軽鎖
又はＨは重鎖を表し、１〜３の番号を付している。親和成熟配列はＹＯ２４３−
１（配列番号２：はＦｉｇ１４Ａに示し；配列番号：１０はＦｉｇ１４Ｂに示す
）；ＹＯ２３８−３（配列番号：３はＦｉｇ１４Ａに示し；配列番号：１１はＦ
ｉｇ１４Ｂに示す）；ＹＯ３１３−１（配列番号：４はＦｉｇ１４Ａに示し；配
列番号：１２はＦｉｇ１４Ｂに示す）；及びＹＯ３１７（配列番号：５はＦｉｇ
１４Ａに示し；配列番号：１３はＦｉｇ１４Ｂに示す）と命名している。Ｆ（ａ
ｂ）−１２との相違点は影付きボックスで示している。
抗体の各軽及び重可変ドメインに対するアミノ酸配列のアラインメントを示すも
ので、Ｆｉｇ１４Ｂと対をなしている図である（配列番号：１はＦｉｇ１４Ａに
示し、配列番号：９はＦｉｇ１４Ｂに示す）。ＣＤＲには下線を付し、Ｌは軽鎖
又はＨは重鎖を表し、１〜３の番号を付している。親和成熟配列はＹＯ２４３−
１（配列番号２：はＦｉｇ１４Ａに示し；配列番号：１０はＦｉｇ１４Ｂに示す
）；ＹＯ２３８−３（配列番号：３はＦｉｇ１４Ａに示し；配列番号：１１はＦ
ｉｇ１４Ｂに示す）；ＹＯ３１３−１（配列番号：４はＦｉｇ１４Ａに示し；配
列番号：１２はＦｉｇ１４Ｂに示す）；及びＹＯ３１７（配列番号：５はＦｉｇ
１４Ａに示し；配列番号：１３はＦｉｇ１４Ｂに示す）と命名している。Ｆ（ａ
ｂ）−１２との相違点は影付きボックスで示している。
【Ｆｉｇ１４Ａ】 上で説明した図である。
【Ｆｉｇ１５Ａ】 Ｆ（ａｂ）−１２抗体と比較した、親和成熟抗ＶＥＧＦ
抗体の各軽及び重可変ドメインに対するアミノ酸配列のアラインメントを示すも
ので、Ｆｉｇ１５Ｂと対をなしている図である（配列番号：１はＦｉｇ１４Ａ及
び１５Ａに示し、配列番号：９はＦｉｇ１４Ｂ及び１５Ｂに示す）。ＣＤＲには
下線を付し、Ｌは軽鎖又はＨは重鎖を表し、１〜３の番号を付している。親和成
熟配列はＹＯ１９２（配列番号６：はＦｉｇ１５Ａに示し；配列番号：１４はＦ
ｉｇ１５Ｂに示す）；ＹＯ２３８−３（配列番号：３はＦｉｇ１４Ａ及び１４Ｂ
に示し；配列番号：１１はＦｉｇ１４Ｂ及び１５Ｂに示す）；ＹＯ２３９−１９
（配列番号：７はＦｉｇ１５Ａに示し；配列番号：１５はＦｉｇ１５Ｂに示す）
；及びＹＯ３１３−２（配列番号：８はＦｉｇ１５Ａに示し；配列番号：１６は
Ｆｉｇ１５Ｂに示す）と命名している。Ｆ（ａｂ）−１２との相違点は影付きボ
ックスで示している。
抗体の各軽及び重可変ドメインに対するアミノ酸配列のアラインメントを示すも
ので、Ｆｉｇ１５Ｂと対をなしている図である（配列番号：１はＦｉｇ１４Ａ及
び１５Ａに示し、配列番号：９はＦｉｇ１４Ｂ及び１５Ｂに示す）。ＣＤＲには
下線を付し、Ｌは軽鎖又はＨは重鎖を表し、１〜３の番号を付している。親和成
熟配列はＹＯ１９２（配列番号６：はＦｉｇ１５Ａに示し；配列番号：１４はＦ
ｉｇ１５Ｂに示す）；ＹＯ２３８−３（配列番号：３はＦｉｇ１４Ａ及び１４Ｂ
に示し；配列番号：１１はＦｉｇ１４Ｂ及び１５Ｂに示す）；ＹＯ２３９−１９
（配列番号：７はＦｉｇ１５Ａに示し；配列番号：１５はＦｉｇ１５Ｂに示す）
；及びＹＯ３１３−２（配列番号：８はＦｉｇ１５Ａに示し；配列番号：１６は
Ｆｉｇ１５Ｂに示す）と命名している。Ｆ（ａｂ）−１２との相違点は影付きボ
ックスで示している。
【Ｆｉｇ１５Ｂ】 上で説明した図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 7/10 Ａ６１Ｐ 9/10 9/10 11/00 11/00 17/06 17/06 19/02 19/02 27/02 27/02 27/06 27/06 29/00 １０１ 29/00 １０１ 35/00 35/00 43/00 １１１ 43/00 １１１ Ａ６１Ｋ 37/02 // Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ， ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，Ｓ Ｌ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ヴァン ブルッゲン，ニコラス アメリカ合衆国 カリフォルニア 94109， サン フランシスコ，ラーキン ストリー ト 2701 302号室 (72)発明者 フェララ，ナポレオン アメリカ合衆国 カリフォルニア 94109， サン フランシスコ，パシフィック アヴ ェニュー 2090 704号室 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA63 CA04 DA02 GA14 HA03 HA17 4C084 AA02 AA17 BA03 CA62 ZA33 ZA45 ZA89 ZB11 ZB15 ZB26 ZC03 ZC42 4C085 AA13 AA14 BB31
Claims (29)
- 【請求項１】 有効量のｈＶＥＧＦアンタゴニストを哺乳動物に投与するこ
とを含む浮腫を患っている哺乳動物の治療方法。 - 【請求項２】 前記浮腫が脳浮腫を含む請求項１に記載の方法。
- 【請求項３】 前記哺乳動物がさらに新生物疾患を患っているヒトである請
求項１に記載の方法。 - 【請求項４】 前記新生物疾患が脳腫瘍を含む請求項３に記載の方法。
- 【請求項５】 前記ｈＶＥＧＦアンタゴニストを化学療法又は放射線療法と
組み合わせるか又は連続して前記哺乳動物に投与する請求項４に記載の方法。 - 【請求項６】 前記哺乳動物が、さらに脳卒中を被っているか、又は被った
ことのあるヒトである請求項１に記載の方法。 - 【請求項７】 前記ｈＶＥＧＦアンタゴニストが抗ｈＶＥＧＦ抗体を含む請
求項１に記載の方法。 - 【請求項８】 前記抗ｈＶＥＧＦ抗体がキメラ抗体を含む請求項７に記載の
方法。 - 【請求項９】 前記抗ｈＶＥＧＦ抗体がヒト化抗体を含む請求項７に記載の
方法。 - 【請求項１０】 前記抗体がモノクローナル抗体を含む請求項７に記載の方
法。 - 【請求項１１】 前記ｈＶＥＧＦアンタゴニストがｈＶＥＧＦレセプター融
合タンパク質を含む請求項１に記載の方法。 - 【請求項１２】 前記ｈＶＥＧＦレセプター融合タンパク質が、免疫グロブ
リンに融合したｈＶＥＧＦレセプターの細胞外ドメイン配列を含む請求項１１に
記載の方法。 - 【請求項１３】 前記ｈＶＥＧＦレセプター融合タンパク質がｆｌｔ−Ｉｇ
Ｇ融合タンパク質を含む請求項１２に記載の方法。 - 【請求項１４】 有効量のｈＶＥＧＦアンタゴニストを哺乳動物に投与する
ことを含む、脳卒中を被っているか、又は被ったことのある哺乳動物の治療方法
。 - 【請求項１５】 前記ｈＶＥＧＦアンタゴニストが抗ｈＶＥＧＦ抗体を含む
請求項１４に記載の方法。 - 【請求項１６】 前記抗ｈＶＥＧＦ抗体がキメラ抗体を含む請求項１５に記
載の方法。 - 【請求項１７】 前記抗ｈＶＥＧＦ抗体がヒト化抗体を含む請求項１５に記
載の方法。 - 【請求項１８】 前記抗体がモノクローナル抗体を含む請求項１５に記載の
方法。 - 【請求項１９】 前記ｈＶＥＧＦアンタゴニストがｈＶＥＧＦレセプター融
合タンパク質を含む請求項１４に記載の方法。 - 【請求項２０】 前記ｈＶＥＧＦレセプター融合タンパク質が、免疫グロブ
リンに融合したｈＶＥＧＦレセプターの細胞外ドメイン配列を含む請求項１９に
記載の方法。 - 【請求項２１】 前記ｈＶＥＧＦレセプター融合タンパク質がｆｌｔ−Ｉｇ
Ｇ融合タンパク質を含む請求項２０に記載の方法。 - 【請求項２２】 有効量のｈＶＥＧＦアンタゴニストを哺乳動物に投与する
ことを含む脳浮腫を患っている哺乳動物の治療方法。 - 【請求項２３】 前記ｈＶＥＧＦアンタゴニストが抗ｈＶＥＧＦ抗体を含む
請求項２２に記載の方法。 - 【請求項２４】 前記抗ｈＶＥＧＦ抗体がキメラ抗体を含む請求項２３に記
載の方法。 - 【請求項２５】 前記抗ｈＶＥＧＦ抗体がヒト化抗体を含む請求項２３に記
載の方法。 - 【請求項２６】 前記抗体がモノクローナル抗体を含む請求項２３に記載の
方法。 - 【請求項２７】 前記ｈＶＥＧＦアンタゴニストがｈＶＥＧＦレセプター融
合タンパク質を含む請求項２２に記載の方法。 - 【請求項２８】 前記ｈＶＥＧＦレセプター融合タンパク質が、免疫グロブ
リンに融合したｈＶＥＧＦレセプターの細胞外ドメイン配列を含む請求項２７に
記載の方法。 - 【請求項２９】 前記ｈＶＥＧＦレセプター融合タンパク質がｆｌｔ−Ｉｇ
Ｇ融合タンパク質を含む請求項２８に記載の方法。
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