ES2245833T3 - Antagonistas del factor de crecimiento endotelial y sus utilizaciones. - Google Patents

Abstract

Uso de un antagonista de hVEGF en la fabricación de un medicamento para tratar a un mamífero que tiene edema asociado a una enfermedad o afección no neoplásica, o para prevenir el edema en un mamífero donde el edema está asociado a una enfermedad o afección no neoplásica.

Description

Antagonistas del factor de crecimiento celular del endotelio vascular y usos de los mismos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al uso de antagonistas del factor de crecimiento celular del endotelio vascular (VEGF) en la fabricación de un medicamento para propósitos terapéuticos. En particular, la presente invención se refiere a la fabricación de un medicamento para el tratamiento de edema asociado con una enfermedad o afección no neoplásica.

Antecedentes de la invención

Los dos componentes celulares principales de la vasculatura son las células endoteliales y las células del músculo liso. Las células endoteliales forman el revestimiento de la superficie interna de todos los vasos sanguíneos, y constituyen una superficie de contacto no trombogénica entre la sangre y el tejido. Además, las células endoteliales son un componente importante para el desarrollo de nuevos capilares y vasos sanguíneos. Por tanto, las células endoteliales proliferan durante la angiogénesis, o neovascularización, asociada con crecimiento tumoral y metástasis, así como una diversidad de enfermedades o trastornos no neoplásicos.

Según se dice, diversos polipéptidos de origen natural inducen la proliferación de células endoteliales. Entre esos polipéptidos están los factores de crecimiento de fibroblastos (FGF) básicos o ácidos, Burgess and Maciag, Annual Rev. Biochem., 58:575 (1989), factor de crecimiento de células endoteliales derivado de plaquetas (PD-ECGF), Ishikawa, et al., Nature, 338:557 (1989), y factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF), Leung, et al., Science 246:1306 (1989); Ferrara & Henzel, Biochem. Biophys. Res. Commun. 161:851 (1989); Tischer, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 165:1198 (1989); Ferrara, et al., Publicación de Patente PCT Nº WO 90/13649 (publicada el 15 de noviembre de 1990).

VEGF se identificó por primera vez en medios condicionados por células foliculares y foliculoestrelladas de pituitaria bovina. Los análisis bioquímicos indican que VEGF bovino es una proteína dimérica con una masa molecular aparente de aproximadamente 45.000 Dalton, y con una especificidad mitogénica aparente para células del endotelio vascular. El ADN que codifica VEGF bovino se aisló explorando una biblioteca de ADNc preparada a partir de dichas células, usando oligonucleótidos basados en la secuencia de aminoácidos amino-terminal de la proteína como sondas de hibridación.

El VEGF humano se obtuvo explorando primero una biblioteca de ADNc preparada a partir de células humanas, usando el ADNc de VEGF bovino como sonda de hibridación. Un ADNc identificado de este modo codifica una proteína de 165 aminoácidos que tiene más del 95% de homología con VEGF bovino, mencionándose dicha proteína como VEGF humano (hVEGF). La actividad mitogénica de VEGF humano se confirmó expresando el ADNc de VEGF humano en células hospedadoras de mamífero. Los medios condicionados por células transfectadas con el ADNc de VEGF humano promovieron la proliferación de células del endotelio capilar, mientras que las células de control no. Véase, Leung, et al., Science 246:1306 (1989).

Se identificaron varios ADNc adicionales en bibliotecas de ADNc humano que codifican isoformas de 121, 189, y 206 aminoácidos de hVEGF (también mencionadas colectivamente como proteínas relacionadas con hVEGF). La proteína de 121 aminoácidos difiere de hVEGF debido a la deleción de los 44 aminoácidos entre los restos 116 y 159 en hVEGF. La proteína de 189 aminoácidos difiere de hVEGF debido a la inserción de 24 aminoácidos en el resto 116 en hVEGF, y aparentemente es idéntica al factor de permeabilidad vascular humano (hVPF). La proteína de 206 aminoácidos difiere de hVEGF debido a una inserción de 41 aminoácidos en el resto 116 en hVEGF. Houck, et al., Mol. Endocrin. 5:1806 (1991); Ferrara, et al., J. Cell. Biochem. 47:211 (1991); Ferrara, et al., Endocrine Reviews 13:18 (1992); Keck, et al., Science 246:1309 (1989); Connolly, et al., J. Biol. Chem. 246:20017 (1989); Keck, et al., Publicación de Patente EPO Nº 0 370 989 (publicada el 30 de mayo de 1990).

Los receptores para VEGF se han descrito en la bibliografía. Se ha descubierto que dos de dichos receptores, flt-1 y flk-1, median los efectos de VEGF [DeVries et al., Science 255:989 (1992); Shibuya et al., Oncogene 5:519 (1990); Matthews et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 88:9026 (1991); Terman et al., Oncogene 6:1677 (1991); Terman et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 187:1579 (1992); Neufeld et al., Prog, Growth Factor Res. 5:89-97 (1994); Waltenberger et al., J. Biol. Chem. 269:26988 (1994); Quinn et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 90:7533 (1991)], pero su regulación y mecanismos aún no se entienden completamente. Lennmyr et al., J. Neuropathology and Exp. Neurology 57:874-882 (1998). Ambos receptores flt-1 y flk-1 son receptores de membrana y pertenecen a la familia del receptor tirosina quinasa clase III. Barleon et al., J. Cell Biochem. 54:56 (1994); Neufeld et al., supra.

VEGF no sólo estimula la proliferación de células del endotelio vascular, sino que también induce la angiogénesis. La angiogénesis, que implica la formación de nuevos vasos sanguíneos a partir del endotelio preexistente, es un componente importante de una diversidad de enfermedades y trastornos incluyendo crecimiento tumoral y metástasis, artritis reumatoide, psoriasis, aterosclerosis, retinopatía diabética, fibroplasia retrolental, glaucoma neovascular, degeneración macular relacionada con la edad, hemangiomas, rechazo inmune de tejido corneal transplantado y otros tejidos, e inflamación crónica.

En el caso de crecimiento tumoral, la angiogénesis parece ser crucial para la transición de hiperplasia a neoplasia, y para proporcionar alimento al crecimiento del tumor sólido. Folkman, et al., Nature 339:58 (1989). La angiogénesis también permite a los tumores que estén en contacto con el lecho vascular del hospedador que puede proporcionar una vía para la metástasis de las células tumorales. Se proporciona una evidencia del papel de la angiogénesis en la metástasis tumoral, por ejemplo, por estudios que muestran la correlación entre la cantidad y densidad de microvasos en secciones histológicas de carcinoma de mama humano invasivo y la presencia real de metástasis distante. Weidner, et al., New Engl. J. Med. 324:1 (1991).

También se ha informado de que VEGF está implicado en la permeabilidad endotelial y vascular. Véase, Ferrara et al., Endocrine Reviews 18:4-25 (1997); Dobrogowska et al., J. Neurocytology 27:163 (1998). Aunque no se entiende completamente, se cree que VEGF aumenta la filtración de las células endoteliales en la piel, retina, y tejidos tumorales. Collins et al., Brit. J. Pharmacology 109:195 (1993); Connolly et al., J. Clin. Invest. 84:1470 (1989); Sheweiki et al., Nature 359:843 (1992); Monacci et al., Am. J. Physiol. 246:C995 (1993); Stone et al., J. Neurosci. 15:4738 (1995); Detmar et al., J. Invest. Dermatol. 108:263 (1997); Weindel et al., Neurosurgery 35:437 (1994). También se han examinado los efectos potenciales y el papel de VEGF (y sus receptores, particularmente, el receptor flt-1), sobre las células endoteliales y la permeabilidad de la barrera sangre-cerebro. Véase, por ejemplo, Rosenstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 95:7086 (1998); Dobrogowska, supra; Kovacs et al., Stroke 27:1865 (1996). Se ha observado expresión de ARNm de VEGF relativamente difusa en cerebro de rata adulta pero a abundancia algo baja. Monacci et al., Am. J. Physiol. 146:368-378 (1993). Sin embargo, se ha demostrado que la tensión de oxígeno reducida desencadena la expresión de VEGF [Dor and Keshet, Trends in Cardiovascular Med., 7:289-294 (1998)] y se ha demostrado que se encuentran niveles potenciados de VEGF, flt-1, y flk-1 en cerebro de rata después de la inducción de isquemia cerebral focal. Hayashi et al., Stroke 28:2039 (1997); Kovacs et al., supra; Lennmyr et al., J. Neuropathology and Experimental Neurology, 57:874 (1998). El papel de VEGF en la patogénesis de apoplejía y fallo BBB ha sido poco claro con observaciones experimentales contradictorias mencionadas en la bibliografía. Por ejemplo, Nag et al., J. Neuropathology and Experimental Neurology 56:912 (1997), en su modelo de lesión cortical por frío, demostraron la presencia de VEGF murino en los vasos piales permeables y arteriolas en el tejido dañado y, a partir de esta observación, se dedujo que VEGF es uno de varios factores que puede mediar el fallo BBB y la formación de edema. Por otra parte, en Hayashi et al., J. Cerebral Blood Flow and Metabolism, 18:887 (1998), se informa de que VEGF en sí mismo, cuando se aplicó por vía tópica a la superficie de un cerebro de rata con reperfusión después de oclusión transitoria de la arteria cerebral, redujo el daño cerebral isquémico, volumen de infarto y formación de edema.

El documento WO 94/10202 (D1) describe antagonistas de VEGF y expone que los antagonistas son útiles para el tratamiento de enfermedades o trastornos caracterizados por proliferación de células endoteliales o neovascularización no deseable o excesiva.

El documento WO 98/16551 (D2) describe antagonistas de VEGF y expone que los antagonistas son útiles para el tratamiento de indicaciones donde se desea la modulación del crecimiento de células endoteliales y angiogénesis.

El documento WO 00/29584 (D6), que coincide en los términos del Artículo 54(3) EPC, describe antagonistas de VEGF y expone que los antagonistas son útiles para el tratamiento de afecciones neoplásicas y no neoplásicas.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona el uso de un antagonista de hVEGF en la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir edema asociado con una enfermedad o afección no neoplásica en un mamífero.

Las realizaciones adicionales de la invención son como se describe en las reivindicaciones 2-20.

Aspectos relacionados de la invención

La presente solicitud también describe antagonistas de VEGF, incluyendo (a) anticuerpos y variantes de los mismos que son capaces de unirse específicamente a hVEGF, el receptor de hVEGF, o un complejo que comprende hVEGF junto con el receptor de hVEGF, (b) el receptor de hVEGF y variantes del mismo, y (c) variantes de hVEGF. Los antagonistas inhiben, secuestran o neutralizan la actividad mitogénica, angiogénica, de permeabilidad vascular y otras actividades biológicas de hVEGF, y por tanto son útiles para el tratamiento de enfermedades o afecciones caracterizadas por neovascularización excesiva no deseable, incluyendo, a modo de ejemplo, artritis reumatoide, psoriasis, aterosclerosis, retinopatía diabética y otras retinopatías, fibroplasia retrolental, degeneración macular relacionada con la edad, glaucoma neovascular, hemangiomas, hiperplasias de tiroides (incluyendo enfermedad de Grave), transplante de córnea y otros tejidos, e inflamación crónica. Los antagonistas también son útiles para el tratamiento de enfermedades o afecciones tales como edema que pueden estar asociadas a, por ejemplo, apoplejía, traumatismo craneal, ascitis asociado con malignidades, enfermedad de Meig, inflamación pulmonar, síndrome nefrótico, efusión pericárdica (tal como la asociada con pericarditis), y efusión pleural.

En otros aspectos, los antagonistas de VEGF son anticuerpos monoclonales poliespecíficos que son capaces de unirse a (a) un epítopo no hVEGF, por ejemplo, un epítopo de una proteína implicada en trombogénesis o trombólisis, o un antígeno de superficie de célula tumoral, o a (b) hVEGF, el receptor de hVEGF, o un complejo que comprende hVEGF junto con el receptor de hVEGF.

En otros aspectos más, los antagonistas de VEGF se conjugan con un resto citotóxico.

En otro aspecto, la invención concierne a ácidos nucleicos aislados que codifican los anticuerpos monoclonales como se ha descrito anteriormente, y líneas celulares de hibridoma que producen dichos anticuerpos monoclonales.

En otro aspecto, la invención concierne a composiciones, tales como composiciones farmacéuticas, que comprenden un antagonista de VEGF en una cantidad eficaz para reducir o eliminar la actividad mitogénica, angiogénica u otra actividad biológica mediada por hVEGF en un mamífero.

En un aspecto diferente, la invención concierne a la fabricación de un medicamento que comprende una cantidad eficaz de un antagonista de VEGF para la administración a un mamífero, preferiblemente un paciente humano en necesidad del mismo. Si se desea, el antagonista de VEGF se co-administra, de manera simultánea o secuencial, con uno o más antagonistas de VEGF diferentes, sustancias antitumorales o anti-angiogénicas, o terapias apropiadas para la enfermedad o afección que se está tratando.

En otro aspecto, la invención concierne a un método para detectar hVEGF en una muestra de ensayo haciendo contactar la muestra de ensayo con un anticuerpo capaz de unirse específicamente a hVEGF y determinando el grado de dicha unión.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra el efecto de anticuerpos monoclonales anti-hVEGF (A4.6.1 o B2.6.2) o un anticuerpo anti-factor de crecimiento de hepatocitos irrelevante (anti-HGF) en la unión de los anticuerpos monoclonales anti-hVEGF a hVEGF.

La Figura 2 muestra el efecto de los anticuerpos monoclonales anti-hVEGF (A4.6.1 o B2.6.2) o un anticuerpo anti-HGF irrelevante en la actividad biológica de hVEGF en cultivos de células del endotelio capilar de la corteza suprarrenal (ACE) bovinas.

La Figura 3 muestra el efecto de los anticuerpos monoclonales anti-hVEGF (A4.6.1, B2.6.2, o A2.6.1) en la unión de hVEGF a células ACE bovinas.

La Figura 4 muestra el efecto del tratamiento con anticuerpo monoclonal anti-hVEGF A4.6.1 sobre la velocidad de crecimiento de tumores NEG55 en ratones.

La Figura 5 muestra el efecto del tratamiento con anticuerpo monoclonal anti-hVEGF A4.6.1 sobre el tamaño de tumores NEG55 en ratones después de cinco semanas de tratamiento.

La Figura 6 muestra el efecto del tratamiento con anticuerpo monoclonal anti-hVEGF A4.6.1 (Ab VEGF) sobre el crecimiento de tumores SK-LMS-1 en ratones.

La Figura 7 muestra el efecto de dosis variadas de tratamiento con anticuerpo monoclonal anti-hVEGF A4.6.1 (Ab VEGF) sobre el crecimiento de tumores A673 en ratones.

La Figura 8 muestra el efecto del anticuerpo monoclonal anti-hVEGF A4.6.1 sobre el crecimiento y supervivencia de células de glioblastoma NEG55 (G55) en cultivo.

La Figura 9 muestra el efecto del anticuerpo monoclonal anti-hVEGF A4.6.1 sobre el crecimiento y supervivencia de células de rabdomiosarcoma A673 en cultivo.

La Figura 10 muestra el efecto del anticuerpo monoclonal anti-hVEGF A4.6.1 sobre la quimiotaxis de células endoteliales humanas inducida por fluido sinovial humano.

La Figura 11 muestra el efecto del tratamiento con flt-IgG sobre el alcance del tejido edematoso representado por una intensidad de señal elevada en la imagen de MR ponderada-T2.

La Figura 12 muestra imágenes de MR ponderadas-T2 representativas registradas 24 horas después de la aparición de isquemia para el grupo tanto de control (panel superior) como de tratamiento (panel inferior), mostrando reducción del tejido edematoso en el grupo de tratamiento.

La Figura 13 muestra el efecto del tratamiento con flt-IgG sobre el tamaño de infarto determinado usando MRI anatómica de alta resolución 8-12 semanas después de la aparición de isquemia.

Las Figuras 14A-B muestran un alineamiento de las secuencias de aminoácidos para los dominios variables de la cadena ligera y pesada respectivamente de anticuerpos anti-VEGF de afinidad madurada en comparación con el anticuerpo F(ab)-12 (SEC.ID.Nº 1 mostrada en la Figura 14A; SEC.ID.Nº 9 mostrada en la Figura 14B). Los CDR están subrayados y denominados por L, cadena ligera, o H, pesada, y los números 1-3. Las secuencias de afinidad madurada se denominan Y0243-1 (SEC.ID.Nº 2 mostrada en la Figura 14A; SEC.ID.Nº 10 mostrada en la Figura 14B); Y0238-3 (SEC.ID.Nº 3 mostrada en la Figura 14A; SEC.ID.Nº 11 mostrada en la Figura 14B); Y0313-1 (SEC.ID.Nº 4 mostrada en la Figura 14A; SEC.ID.Nº 12 mostrada en la Figura 14B); e Y0317 (SEC.ID.Nº 5 mostrada en la Figura 14A; SEC.ID.Nº 13 mostrada en la Figura 14B). Las diferencias a partir F(ab)-12 se muestran en recuadros sombreados.

Las Figuras 15A-B muestran un alineamiento de las secuencias de aminoácidos para los dominios variables de la cadena ligera y pesada respectivamente de anticuerpos anti-VEGF de afinidad madurada en comparación con el anticuerpo F(ab)-12 (SEC.ID.Nº 1 mostrada en las Figuras 14A y 15A; SEC.ID.Nº 9 mostrada en las Figuras 14B y 15B). Los CDR están subrayados y denominados por L, cadena ligera, o H, pesada, y los números 1-3. Las secuencias de afinidad madurada se denominan Y0192 (SEC.ID.Nº 6 mostrada en la Figura 15A; SEC.ID.Nº 14 mostrada en la Figura 15B); Y0238-3 (SEC.ID.Nº 3 mostrada en las Figuras 14A y 14B; SEC.ID.Nº 11 mostrada en las Figuras 14B y 15B); Y0239-19 (SEC.ID.Nº 7 mostrada en la Figura 15A; SEC.ID.Nº 15 mostrada en la Figura 15B); e Y0313-2 (SEC.ID.Nº 8 mostrada en la Figura 15A; SEC.ID.Nº 16 mostrada en la Figura 15B). Las diferencias de F(ab)-12 se muestran en recuadros sombreados.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona la fabricación de medicamentos que contienen antagonistas de hVEGF que son capaces de inhibir, secuestrar, o neutralizar una o más de las actividades biológicas de hVEGF. Los antagonistas de hVEGF funcionan impidiendo la unión de hVEGF a un receptor celular, incapacitando o eliminando las células que se han activado por hVEGF, o impidiendo la activación de las células del endotelio vascular después de la unión de hVEGF a un receptor celular. Todos estos puntos de intervención por un antagonista de hVEGF se considerarán equivalentes para los propósitos de esta invención. Por tanto, se incluyen en el alcance de la invención anticuerpos, anticuerpos monoclonales y anticuerpos humanizados, o fragmentos de los mismos, que se unen a hVEGF, el receptor de hVEGF, o un complejo que comprende hVEGF junto con el receptor de hVEGF. También se incluyen en el alcance de la invención fragmentos y variantes de la secuencia de aminoácidos de hVEGF que se unen al receptor de hVEGF pero que no muestran una actividad biológica de hVEGF nativo. También se incluyen en el alcance de la invención el receptor de hVEGF y fragmentos y variantes de la secuencia de aminoácidos del mismo que son capaces de unirse a hVEGF.

El término "hVEGF" como se usa en este documento se refiere al factor de crecimiento celular del endotelio vascular humano de 165 aminoácidos, y los factores de crecimiento celular del endotelio vascular relacionados de 121, 189, y 206 aminoácidos, como se describe por Leung, et al., Science 246:1306 (1989), y Houck, et al., Mol. Endocrin. 5:1806 (1991), junto con las formas alélicas y procesadas de origen natural de esos factores de crecimiento.

El término "receptor de hVEGF" o "hVEGFr" como se usa en este documento se refiere a un receptor celular para hVEGF, generalmente un receptor de superficie celular que se encuentra en las células del endotelio vascular, así como fragmentos y variantes del mismo que mantienen la capacidad de unirse a hVEGF. Típicamente, los receptores de hVEGF y fragmentos y variantes de los mismos que son antagonistas de hVEGF estarán en forma aislada, en lugar estar integrados en una membrana celular o fijados a una superficie celular como puede ser el caso en la naturaleza. Un ejemplo de un receptor de hVEGF es el fms-tipo tirosina quinasa (flt o flt-1), un receptor transmembrana de la familia tirosina quinasa. DeVries, et al., Science 255:989 (1992); Shibuya, et al., Oncogene 5:519 (1990). El receptor flt de longitud completa comprende un dominio extracelular, un dominio transmembrana, y un dominio intracelular con actividad tirosina quinasa. El dominio extracelular está implicado en la unión a hVEGF, mientras que el dominio intracelular está implicado en la transducción de señal.

Otro ejemplo de un receptor de hVEGF es el receptor flk-1 (también mencionado como KDR). Matthews, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 88:9026 (1991); Terman, et al., Oncogene 6:1677 (1991); Terman, et al., Biochem. Biphys. Res. Commun. 187:1579 (1992).

La unión de hVEGF al receptor flt da como resultado la formación de al menos dos complejos de alto peso molecular, que tienen un peso molecular aparente de 205.000 y 300.000 Dalton. Se cree que el complejo de 300.000 Dalton es un dímero que comprende dos moléculas de receptor unidas a una única molécula de hVEGF.

Las variantes de hVEGFr también se incluyen en el alcance del mismo. Los ejemplos representativos incluyen formas truncadas de un receptor en el que al menos los dominios transmembrana y citoplásmico están delecionados de la molécula de receptor de longitud completa, y proteínas de fusión en las que se conjugan polímeros o polipéptidos no hVEGFr con hVEGFr o, preferiblemente, formas truncadas del mismo. Un ejemplo de dicho polipéptido no hVEGF es una inmunoglobulina. En ese caso, por ejemplo, se sustituye una secuencia del dominio extracelular del hVEGFr por el domino Fv de la cadena ligera o (preferiblemente) pesada de una inmunoglobulina, con el extremo C-terminal del dominio extracelular del receptor unido covalentemente al extremo amino terminal del CH1, bisagra, CH2 u otro fragmento de la cadena pesada. Dichas variantes se hacen del mismo modo que las inmunoadhesinas conocidas. Véase por ejemplo, Gascoigne, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 84:2936 (1987); Capon, et al., Nature 337:525 (1989); Aruffo, et al., Cell 61:1303 (1990); Ashkenazi, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 88:10535 (1991); Bennett, et al., J. Biol. Chem. 266:23060 (1991). Los ejemplos de diversas proteínas de fusión flt-IgG se describen en el Ejemplo 3 a continuación. Las formas truncadas del dominio extracelular del receptor de hVEGF contempladas para su uso en la invención incluyen fragmentos ECD (por ejemplo, que tienen uno o más aminoácidos en la secuencia ECD delecionados) y formas ECD que tienen uno o más dominios tipo inmunoglobulina en el ECD delecionados. El ejemplo 3B describe, por ejemplo, una forma ECC truncada que incluye sólo los primeros tres dominios tipo inmunoglobulina de flt fusionados a un Fc-IgG. Preferiblemente, una forma truncada del ECD usada para hacer una molécula antagonista incluirá suficientes dominios tipo inmunoglobulina para asegurar una unión deseada a
hVEGF.

En otras realizaciones, el hVEGFr o fragmentos o variantes del mismo se conjugan con un polímero no proteico tal como polietilenglicol (PEG) (véase, por ejemplo, Davis, et al., Patente de Estados Unidos Nº 4.179.337; Goodson, et al., BioTechnology 8:343-346 (1990); Abuchowski, et al., J. Biol. Chem. 252:3578 (1977); Abuchowski, et al., J. Biol. Chem. 252:3582 (1977)) o carbohidratos (véase, por ejemplo, Marshall, et al., Arch. Biochem. Biophys., 167:77 (1975)). Esto pude servir para prolongar la vida media biológica del hVEGFr y reducir la posibilidad de que el receptor sea inmunogénico en el mamífero al que se administra.

El hVEGFr se usa sustancialmente de la misma manera que los anticuerpos frente a hVEGF, teniendo en cuenta la afinidad del antagonista y su valencia para hVEGF. Es especialmente útil una secuencia del dominio extracelular del receptor de hVEGF, por sí mismo o fusionado a un polipéptido de inmunoglobulina u otro polipéptido de vehículo, como antagonista de hVEGF, debido a su capacidad para secuestrar hVEGF que está presente en un hospedador pero que no se une a hVEGF en una superficie celular.

hVEGFr y fragmentos y variantes del mismo también son útiles en ensayos de exploración para identificar agonistas y antagonistas de hVEGF. Por ejemplo, la células hospedadoras transfectadas con ADN que codifica hVEGFr (por ejemplo, flt o flk-1) sobre-expresan el polipéptido receptor en la superficie celular, haciendo a dichas células hospedadoras recombinantes apropiadas de manera ideal para analizar la capacidad de un compuesto de ensayo (por ejemplo, una molécula pequeña, péptido lineal o cíclico, o polipéptido) de unirse a hVEGFr. Las proteínas hVEGFr y hVEGFr de fusión, tales como una proteína de fusión hVEGFr-IgG, pueden usarse de un modo similar. Por ejemplo, la proteína de fusión se une a un soporte inmovilizado y se determina la capacidad de un compuesto de ensayo de desplazar hVEGF radiomarcado del dominio hVEGFr de la proteína de fusión.

El término "recombinante" usado con referencia a hVEGF, receptor de hVEGF, anticuerpos, u otras proteínas, se refiere a proteínas que se producen por expresión de ADN recombinante en una célula hospedadora. La célula hospedadora puede ser procariota (por ejemplo, una célula bacteriana tal como E. coli) o eucariota (por ejemplo, una célula de levadura o de mamífero).

Anticuerpos Antagonistas

El término "anticuerpo monoclonal" como se usa en este documento se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos en especificidad y afinidad excepto para posibles mutaciones de origen natural que pueden estar presentes en cantidades minoritarias. Debe apreciarse que como resultado de dichas mutaciones de origen natural y similares, una composición de anticuerpos monoclonales de la invención, que contendrá predominantemente anticuerpos capaces de unirse específicamente a hVEGF, hVEGFr, o un complejo que comprende hVEGF junto con hVEGFr ("complejo hVEGF-hVEGFr"), también puede contener cantidades minoritarias de otros anticuerpos.

Por tanto, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como obtenido de dicha población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no se entiende como que requiere la producción del anticuerpo por ningún método particular. Por ejemplo, pueden fabricarse anticuerpos monoclonales de la presente invención usando el método de hibridoma descrito por primera vez por Kohler & Milstein, Nature 256:495 (1975), o pueden fabricarse por métodos de ADN recombinante. Véase, por ejemplo, Cabilly, et al., Patente de Estados Unidos Nº 4.816.597.

En el método de hibridoma, un ratón u otro animal hospedador apropiado se inmuniza con antígeno por vía subcutánea, intraperitoneal, o intramuscular para provocar linfocitos que produzcan o sean capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente a la proteína o proteínas usadas para inmunización. Como alternativa, pueden inmunizarse linfocitos in vitro. Después los linfocitos se fusionan con células de mieloma usando un agente de fusión apropiado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma. Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, páginas 59-103 (Academic Press, 1986).

El antígeno puede ser hVEGF, hVEGFr, o complejo hVEGF-hVEGFr. El antígeno opcionalmente es un fragmento o porción o variante de uno cualquiera de hVEGF o hVEGFr que tiene uno o más restos de aminoácidos que participan en la unión de hVEGF a uno de sus receptores. Por ejemplo, la inmunización con una secuencia de dominio extracelular de un hVEGFr (tal como, un polipéptido hVEGFr truncado que carece de al menos los dominios transmembrana e intracelular) será especialmente útil para producir anticuerpos que son antagonistas de hVEGF, ya que la región o regiones del dominio extracelular son las que están implicadas en la unión de hVEGF.

Los anticuerpos monoclonales capaces de unirse al complejo hVEGF-hVEGFr son útiles, particularmente si no se unen también a hVEGF y hVEGFr no asociados (no complejados). Dichos anticuerpos, por tanto, sólo se unen a células que experimentan activación intermedia por hVEGF y por consiguiente con están secuestradas por hVEGF o hVEGFr libres como se encuentran habitualmente en un mamífero. Dichos anticuerpos típicamente unen un epítopo que abarca uno o más puntos de contacto entre el receptor y hVEGF. Dichos anticuerpos se han producido para otros complejos ligando-receptor y pueden producirse aquí del mismo modo. Estos anticuerpos no necesitan, o pueden no necesitar, neutralizar o inhibir una actividad biológica de hVEGF o hVEGFr no asociados, sean o no capaces los anticuerpos de unirse a hVEGF o hVEGFr no asociados.

Las células de hibridoma preparadas de este modo se siembran y se hacen crecer en un medio de cultivo apropiado que contiene preferiblemente una o más sustancias que inhiben el crecimiento o supervivencia de las células de mieloma no fusionadas parentales. Por ejemplo, si las células de mieloma parentales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforribosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas típicamente incluirá hipoxantina, aminopterina, y timidina (medio HAT), que evitan, dichas sustancias, el crecimiento de células deficientes en HGPRT.

Las células de mieloma preferidas son aquéllas que se fusionan de manera eficaz, mantienen un alto nivel de expresión estable del anticuerpo por las células que producen anticuerpo seleccionadas, y son sensibles a un medio tal como medio HAT. Entre otras, las líneas de células de mieloma preferidas son líneas de mieloma murinas, tales como las obtenidas de tumores de ratón MOPC-21 y MPC-11 disponibles del Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA, células SP-2 disponibles de la American Type Culture Collection, Manassas, Virginia USA, y células P3X63Ag8U.1 descritas por Yelton, et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 81:1 (1978). También se han descrito líneas celulares de mieloma humano y heteromieloma de ratón-humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos. Kozbor, J. Immunol. 133:3001 (1984); Brodeur, et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, páginas 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987).

El medio de cultivo en el que se hacen crecer las células de hibridoma se ensaya para la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos frente al antígeno. Preferiblemente, la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por células de hibridoma se determina por inmunoprecipitación o por un ensayo de unión in vitro, tal como radioinmunoensayo (RIA) o ensayo inmunoabsorbente de enzimas unidas (ELISA). Los anticuerpos monoclonales de la invención son aquéllos que inmunoprecipitan de manera preferente hVEGF, hVEGFr, o complejo hVEGF-hVEGFr, o que unen de manera preferente al menos uno de esos antígenos en un ensayo de unión, y que son capaces de inhibir una actividad biológica de hVEGF.

Después de identificar las células de hibridoma que producen anticuerpos antagonistas de la especificidad, afinidad, y actividad deseadas, los clones pueden subclonarse por procedimientos de dilución limitante y hacerse crecer por métodos convencionales. Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, páginas 59-104 (Academic Press, 1986). Los medios de cultivo apropiados para este propósito incluyen, por ejemplo, Medio de Eagle Modificado por Dulbecco o medio RPMI-1640. Además, las células de hibridoma pueden hacerse crecer in vivo como tumores ascíticos en un animal.

Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan apropiadamente del medio de cultivo, fluido ascítico, o suero por procedimientos de purificación de inmunoglobulinas convencionales tales como, por ejemplo, proteína A-Sepharose, cromatografía con hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis, o cromatografía de afini-
dad.

El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales de la invención se aísla fácilmente y se secuencia usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas oligonucleotídicas que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera de anticuerpos murinos). Las células de hibridoma de la invención sirven como fuente preferida de dicho ADN. Una vez aislado, el ADN se coloca en vectores de expresión, que después se transfectan en células hospedadoras tales como células COS de simio, células de ovario de Hámster Chino (CHO), o células de mieloma que no producen de otro modo proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células hospedadoras recombinantes.

El ADN opcionalmente puede modificarse para cambiar el carácter de la inmunoglobulina producida por su expresión. Por ejemplo, las formas humanizadas de anticuerpos murinos se producen sustituyendo una región determinante de complementariedad (CDR) del dominio variable del anticuerpo murino por la región correspondiente de un anticuerpo humano. En algunas realizaciones, los restos de aminoácidos de la región flanqueante (FR) seleccionados del anticuerpo murino también se sustituyen por los restos de aminoácidos correspondientes en el anticuerpo humano. Carter, et al., Proc. Nat. Sci. 89:4285 (1992); Carter, et al., BioTechnology 10:163 (1992). Las formas quiméricas de anticuerpos murinos también se producen sustituyendo la secuencia codificante para los dominios constantes de cadena pesada y ligera humanos seleccionados en lugar de las secuencias murinas homólogas. Cabilly, et al., Patente de Estados Unidos Nº 4.816.567; Morrison, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 81:6851 (1984).

Los anticuerpos humanizados particulares contemplados para su uso en la presente invención incluyen los anticuerpos anti-hVEGF humanizados y de afinidad madurada descritos en las solicitudes PCT publicadas WO 98/45331 (publicada el 15 de octubre de 1998) y WO 98/45332 (publicada el 15 de octubre de 1998). Dichos anticuerpos anti-VEGF humanizados o de afinidad madurada pueden prepararse o fabricarse usando métodos y técnicas descritos en el documento WO 98/45331 y el documento WO 98/45332. Preferiblemente, el anticuerpo anti-hVEGF comprende el F(ab) humanizado, denominado como F(ab)-12, o el anticuerpo de afinidad madurada, denominado como Y0317, en las solicitudes PCT mencionadas anteriormente. Las figuras 14A-B y 15A-B ilustran las secuencias de aminoácidos (cadenas ligera y pesada) para estos anticuerpos anti-VEGF, junto con otros anticuerpos anti-VEGF de afinidad madurada, denominados como Y0192; Y0238-3; Y0239-19; Y0313-2; Y0243-1; e Y0313-1. Todos estos anticuerpos anti-VEGF se contemplan para su uso en los métodos descritos en este documento. Como se describe en estas solicitudes PCT publicadas, se demostró que varios de los anticuerpos humanizados y de afinidad madurada reducían o inhibían la actividad VEGF en diferentes tipos de ensayos in vitro, y por tanto funcionan como antagonistas de VEGF.

Los anticuerpos incluidos en el alcance de la invención incluyen, por tanto, anticuerpos variantes, tales como anticuerpos quiméricos (incluyendo "humanizados") y anticuerpos híbridos que comprenden cadenas de inmunoglobulina capaces de unir hVEGF, hVEGFr, o complejo hVEGF-hVEGFr, y un epítopo no hVEGF.

Los anticuerpos de este documento incluyen todas las especies de origen, y clases (por ejemplo, IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM) y subclases de inmunoglobulina, así como fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, Fab, F(ab')_{2}, y Fv), mientras que sean capaces de unir hVEGF, hVEGFr, o complejo hVEGF-hVEGFr, y sean capaces de antagonizar una actividad biológica de hVEGF.

En una realización preferida de la invención, el anticuerpo tendrá una afinidad por el antígeno inmunizante de al menos aproximadamente 10^{9} litros/mol, como se determina, por ejemplo, por el análisis de Scatchard de Munson & Pollard, Anal. Biochem. 107:220 (1980). Además, el anticuerpo monoclonal típicamente inhibirá la actividad mitogénica o angiogénica de hVEGF al menos al 50%, preferiblemente más del 80%, y más preferiblemente más del 90%, como se determina, por ejemplo, por un ensayo de supervivencia o proliferación celular in vitro, tal como se describe en el Ejemplo 2 o como se describe en el documento WO 98/45331 y el documento WO 98/45332.

Para algunas aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico, es deseable que el anticuerpo monoclonal sea reactivo con no todas las diferentes formas moleculares de hVEGF. Por ejemplo, puede ser deseable tener un anticuerpo monoclonal que sea capaz de unirse específicamente a hVEGF de 165 aminoácidos de secuencia pero no a los polipéptidos hVEGF de 121 o 189 aminoácidos de secuencia. Dichos anticuerpos se identifican fácilmente por ensayos ELISA comparativos o inmunoprecipitación comparativa de los diferentes polipéptidos hVEGF.

Conjugados con Restos Citotóxicos

En algunas realizaciones es deseable proporcionar un resto citotóxico conjugado con un anticuerpo monoclonal específico de hVEGF o con hVEGFr. En estas realizaciones la citotoxina sirve para incapacitar o eliminar células que están expresando o uniendo hVEGF o su receptor. El conjugado se dirige a la célula por el dominio que es capaz de unirse a hVEGF, hVEGFr, o complejo hVEGF-hVEGFr. Por tanto, los anticuerpos monoclonales que son capaces de unir hVEGF, hVEGFr, o complejo hVEGF-hVEGFr se conjugan con citotoxinas. De manera similar, hVEGFr se conjuga con una citotoxina. Aunque los anticuerpos monoclonales son capaces de neutralizar de manera óptima la actividad de hVEGF solos (sin la citotoxina), no es necesario en esta realización que el anticuerpo monoclonal o receptor sea capaz de algo más que unirse a hVEGF, hVEGFr, o complejo hVEGF-hVEGFr.

Típicamente, la citotoxina es una citotoxina proteica, por ejemplo, la toxina de la difteria, ricino o de Pseudomonas, aunque en el caso de ciertas clases de inmunoglobulinas el dominio Fc del anticuerpo monoclonal en sí mismo puede servir para proporcionar la citotoxina (por ejemplo, en el caso de anticuerpos IgG2, que son capaces de fijar el complemento y participar en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC)). Sin embargo, la citotoxina no necesita ser proteica y puede incluir agentes quimioterapéuticos empleados hasta ahora, por ejemplo, para el tratamiento de tumores.

La citotoxina típicamente se une a un anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo mediante un enlace amida central en (o en lugar de parte o todo) el dominio Fc del anticuerpo. Cuando se proporciona la función diana por hVEGFr, el resto citotóxico se sustituye en cualquier dominio del receptor que no participe en la unión de hVEGF; preferiblemente, el resto se sustituye en lugar de o sobre los dominios transmembrana y/o citoplásmico del receptor. El sitio óptimo de sustitución se determinará por experimentación de rutina y pertenece a la especialidad de la técnica.

Los conjugados que son fusiones proteicas se fabrican fácilmente en cultivo de células recombinantes expresando un gen que codifica el conjugado. Como alternativa, los conjugados se fabrican entrecruzando de manera covalente el resto citotóxico con la cadena lateral de un resto de aminoácido o el carboxilo C-terminal del anticuerpo o el receptor, usando métodos conocidos per se tales como intercambio de disulfuro o unión a través de un enlace tioéster usando, por ejemplo, iminotiolato y metil-4-mercaptobutirimadato.

Conjugados con otros Restos

Los anticuerpos monoclonales y hVEGFr que son antagonistas de hVEGF también se pueden conjugar con sustancias que no se pueden clasificar fácilmente como citotoxinas en su propio sentido, pero que aumentan la actividad de las composiciones de este documento. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales o hVEGFr capaces de unirse a hVEGF, hVEGFr, o complejo hVEGF-hVEGFr se fusionan con polipéptidos heterólogos, tales como secuencias virales, con receptores celulares, con citoquinas tales como TNF, interferones, o interleuquinas, con polipéptidos que tienen actividad procoagulante, y con otros polipéptidos biológica o inmunológicamente activos. Dichas fusiones se hacen fácilmente por métodos recombinantes. Típicamente, el dominio o dominios constantes de un anticuerpo anti-hVEGF o complejo anti-hVEGF-hVEGFr, o el dominio transmembrana y/o intracelular de un hVEGFr se sustituyen por dichos polipéptidos de no inmunoglobulina. Como alternativa, se sustituye un dominio variable de un sitio de unión a antígeno de un anticuerpo anti-hVEGF descrito en este documento.

En realizaciones preferidas, dichos polipéptidos de no inmunoglobulina se unen a o se sustituyen en los dominios constantes de un anticuerpo descrito en este documento. Bennett, et al., J. Biol. Chem. 266:23060-23067 (1991). Como alternativa, se sustituye el Fv de un anticuerpo de este documento para crear un anticuerpo polivalente quimérico que comprende al menos un sitio de unión a antígeno restante que tiene especificidad por hVEGF, hVEGFr, o un complejo hVEGF-hVEGFr, y un sitio de unión a antígeno sustituto que tiene una función o especificidad distinta de la del anticuerpo de partida.

Anticuerpos Heteroespecíficos

Los anticuerpos monoclonales capaces de unirse a hVEGF, hVEGFr, o complejo hVEGF-hVEGFr sólo necesitan contener un único sitio de unión para los epítopos enumerados, típicamente un único complejo de cadena pesada-ligera o fragmento del mismo. Sin embargo, dichos anticuerpos opcionalmente también albergan dominios de unión a antígeno que son capaces de unir un epítopo no encontrado en ninguno cualquiera de hVEGF, hVEGFr, o complejo hVEGF-hVEGFr. Por ejemplo, sustituyendo la secuencia de aminoácidos o los restos de aminoácidos correspondientes de un anticuerpo anti-hVEGF, anti-hVEGFr, o anti-complejo hVEGF-hVEGFr nativo con los restos determinantes de complementariedad y, si es necesario, los flanqueantes, de un anticuerpo que tiene especificidad por un antígeno distinto de hVEGF, hVEGFr, o complejo hVEGF-hVEGFr se creará un anticuerpo poliespecífico que comprende un sitio de unión a antígeno que tiene especificidad por hVEGF, hVEGFr, o complejo hVEGF-hVEGFr, y otro sitio de unión a antígeno que tiene especificidad por el antígeno no hVEGF, hVEGFr, o complejo hVEGF-hVEGFr. Estos anticuerpos son al menos bivalentes, pero pueden ser polivalentes, dependiendo de la cantidad de sitios de unión a antígeno que tenga la clase de anticuerpo elegida. Por ejemplo, los anticuerpos de la clase IgM serán polivalentes.

En realizaciones preferidas de la invención dichos anticuerpos son capaces de unir un epítopo hVEGF o hVEGFr y (a) un polipéptido activo en la coagulación sanguínea, tal como proteína C o factor tisular, (b) una proteína citotóxica tal como factor de necrosis tumoral (TNF), o (c) un receptor de superficie celular no hVEGFr, tal como CD4, o receptor HER-2 (Maddon, et al., Cell 42:93 (1985); Coussens, et al., Science 230:1137 (1985)). Los anticuerpos heteroespecíficos multivalentes se fabrican adecuadamente cotransformando una célula hospedadora con ADN que codifica las cadenas pesada y ligera de ambos anticuerpos y recuperando después, por cromatografía de inmunoafinidad o similares, la proporción de anticuerpos expresados que tiene las propiedades de unión a antígeno deseadas. Como alternativa, dichos anticuerpos se fabrican por recombinación in vitro de anticuerpos monoespecíficos.

Anticuerpos Monovalentes

Los anticuerpos monovalentes capaces de unirse a hVEGFr o complejo hVEGF-hVEGFr son especialmente útiles como antagonistas de hVEGF. Sin limitar la invención a ningún mecanismo particular de actividad biológica, se cree que la activación de receptores de hVEGF celulares procede por un mecanismo donde la unión de hVEGF a receptores de hVEGF celulares induce la agregación de los receptores, y a su vez activa la actividad quinasa intracelular del receptor. Como los anticuerpos anti-receptor de hVEGF monovalentes no pueden inducir dicha agregación, y por lo tanto no pueden activar el receptor de hVEGF por ese mecanismo, son antagonistas ideales de hVEGF.

Debe apreciarse, sin embargo, que estos anticuerpos deben estar dirigidos frente al sitio de unión a hVEGF del receptor o deben ser capaces de impedir de otro modo la unión de hVEGF al receptor de hVEGF, tal como impidiendo estéricamente el acceso de hVEGF al receptor. Como se describe en otra parte en este documento, sin embargo, los anticuerpos anti-hVEGFr que no son capaces de impedir la unión de hVEGF son útiles cuando se conjugan con restos de no inmunoglobulina, por ejemplo, citotoxinas.

Los métodos para preparar anticuerpos monovalentes son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, un método implica la expresión recombinante de la cadena ligera y la cadena pesada modificada de inmunoglobulina. La cadena pesada generalmente está truncada en cualquier punto de la región Fc para evitar el entrecruzamiento de la cadena pesada. Como alternativa, los restos de cisteína relevantes se sustituyen con otro resto de aminoácido o se delecionan para evitar el entrecruzamiento. También son apropiados métodos in vitro para preparar anticuerpos monovalentes. Por ejemplo, se preparan fragmentos Fab por escisión enzimática de anticuerpo intacto.

Usos de Diagnóstico

Para aplicaciones de diagnóstico, los anticuerpos o hVEGFr de la invención se marcarán típicamente con un resto detectable. El resto detectable puede ser uno cualquiera que sea capaz de producir, directa o indirectamente, una señal detectable. Por ejemplo, el resto detectable puede ser un radioisótopo, tal como ^{3}H, ^{14}C, ^{32}P, ^{35}S, o ^{125}I, un compuesto fluorescente o quimioluminiscente, tal como isotiocianato de fluoresceína, rodamina, o luciferina; marcadores isotópicos radiactivos, tales como, por ejemplo, ^{125}I, ^{32}P, ^{14}C, o ^{3}H, o una enzima, tal como fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o peroxidasa de rábano rusticano.

Puede emplearse cualquier método conocido en la técnica para conjugar por separado el anticuerpo o hVEGFr al resto detectable, incluyendo los métodos descritos por Hunter, et al., Nature 144:945 (1962); David, et al., Biochemistry 13:1014 (1974); Pain, et al., J. Immunol. Meth. 40:219 (1981); y Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 30:407 (1982). Los anticuerpos y receptores de la presente invención pueden emplearse en cualquier método de ensayo conocido, tal como ensayos de unión competitiva, ensayos tipo sándwich directos o indirectos, y ensayos de inmunoprecipitación. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, páginas 147-158 (CRC Press, Inc., 1987).

Los ensayos de unión competitiva dependen de la capacidad del patrón marcado (que puede ser hVEGF o una porción inmunológicamente reactiva del mismo) de competir con el analito de muestra de ensayo (hVEGF) para la unión con una cantidad limitada de anticuerpo. La cantidad de hVEGF en la muestra de ensayo es inversamente proporcional a la cantidad de patrón que llega a unirse a los anticuerpos o receptores. Para facilitar la determinación de la cantidad de patrón que llega a unirse, los anticuerpos o receptores generalmente se insolubilizan antes o después de la competición, de modo que el patrón y el analito que se unen a los anticuerpos o receptores pueden separarse adecuadamente del patrón y el analito que permanecen sin unir.

Los ensayos tipo sándwich implican el uso de dos anticuerpos o receptores, cada uno capaz de unirse a una porción inmunogénica diferente, o epítopo, de la proteína a detectar. En un ensayo tipo sándwich, el analito de muestra de ensayo se une por un primer anticuerpo o receptor que está inmovilizado en un soporte sólido, y después un segundo anticuerpo se une al analito, formando de este modo un complejo tripartito insoluble. David & Greene, Patente de Estados Unidos Nº 4.376.110. El segundo anticuerpo o receptor puede, por sí mismo, estar marcado con un resto detectable (ensayos tipo sándwich directos) o pueden medirse usando un anticuerpo anti-inmunoglobulina que está marcado con un resto detectable (ensayo tipo sándwich indirecto). Por ejemplo, un tipo de ensayo tipo sándwich en un ensayo ELISA, en cuyo caso el resto detectable es una enzima.

Los anticuerpos o receptor de este documento también son útiles para formación de imágenes in vivo, donde un anticuerpo o hVEGFr marcado con un resto detectable se administra a un paciente, preferiblemente en el torrente sanguíneo, y se ensaya la presencia y localización del anticuerpo o receptor marcado en el paciente. Esta técnica de formación de imágenes es útil, por ejemplo, en la determinación de la fase o tratamiento de neoplasmas. El anticuerpo o hVEGFr se marca con cualquier resto que sea detectable en un mamífero, sea por resonancia magnética nuclear, radiología, u otro medio de detección conocido en la técnica.

Variantes Antagonistas de hVEGF

Además de los anticuerpos descritos en este documento, otros antagonistas útiles de hVEGF incluyen fragmentos y variantes de la secuencia de aminoácidos de hVEGF nativo que se unen al receptor de hVEGF pero que no muestran la actividad biológica de hVEGF nativo. Por ejemplo, dichos antagonistas incluyen fragmentos y variantes de la secuencia de aminoácidos que comprenden un dominio de unión al receptor de hVEGF, pero que carecen de un dominio que confiere actividad biológica, o que son deficientes de otro modo en la activación de los receptores de hVEGF celulares, tal como en el caso de un fragmento o una variante de la secuencia de aminoácidos que es deficiente en su capacidad para inducir la agregación o activación de receptores de hVEGF celulares. El término "dominio de unión al receptor" se refiere a las secuencias de aminoácidos en hVEGF que están implicadas en la unión al receptor de hVEGF. El término "dominio de actividad biológica" o "dominio que confiere actividad biológica" se refiere a una secuencia de aminoácidos en hVEGF que confiere actividad biológica particular del factor, tal como actividad mitogénica, angiogénica, o de permeabilidad vascular.

La observación de que hVEGF parece ser capaz de formar un complejo con dos o más moléculas hVEGFr en la superficie de un célula sugiere que hVEGF tiene al menos dos sitios discretos para la unión a hVEGFr y que se une a dichos receptores celulares de un modo secuencial, primero a un sitio y después al otro antes de que suceda la activación, del modo de la hormona de crecimiento, prolactina y similares (véase, por ejemplo, Cunningham, et al., Science 254:821 (1991); deVos, et al., Science 255:306 (1992); Fuh, et al., Science 256:1677 (1992)). Por consiguiente, se seleccionan variantes antagonistas de hVEGF en las que un sitio de unión al receptor de hVEGF (típicamente el sitio implicado en la unión inicial de hVEGF a hVEGFr) permanece sin modificar (o si se modifica se varía para potenciar la unión), mientras que típicamente se modifica un segundo sitio de unión al receptor de hVEGF por sustitución o sustituciones o deleción o deleciones de restos de aminoácidos conservativas para volver a ese sitio de unión inoperante.

Los dominios de unión al receptor en hVEGF y los dominios de unión a hVEGF en hVEGFr se determinan por métodos bien conocidos en la técnica, incluyendo estudios de rayos X, análisis mutacionales, y estudios de unión a anticuerpo. Los enfoques mutacionales incluyen las técnicas de mutagénesis por saturación aleatoria acopladas a selección de mutantes de escape, y mutagénesis por inserción. Otra estrategia apropiada para identificar los dominios de unión al receptor en ligandos es conocida como mutagénesis por exploración de alanina (Ala). Cunningham, et al., Science 244, 1081-1985 (1989). Este método implica la identificación de regiones que contienen cadenas laterales de aminoácidos cargados. Los restos cargados en cada región identificados (es decir, Arg, Asp, His, Lys, y Glu) se remplazan (una región por molécula mutante) con Ala y se ensaya la unión al receptor de los ligandos obtenidos, para evaluar la importancia de la región particular en la unión al receptor. Un método poderoso adicional para la localización de los dominios de unión al receptor es a través del uso de anticuerpos anti-hVEGF neutralizantes. Kim, et al., Growth Factors 7:53 (1992). Habitualmente se usa una combinación de estos y métodos similares para la localización de los dominios implicados en la unión al receptor.

El término "variante de secuencia de aminoácidos" usado con referencia a hVEGF se refiere a polipéptidos que tienen secuencias de aminoácidos que difieren hasta cierto punto de las secuencias de aminoácidos de las formas nativas de hVEGF. Habitualmente, las variantes de la secuencia de aminoácidos antagonistas tendrán al menos aproximadamente un 70% de homología con al menos un dominio de unión al receptor de un hVEGF nativo, y preferiblemente, serán al menos aproximadamente un 80%, más preferiblemente al menos aproximadamente un 90% homólogos con el dominio de unión al receptor de un hVEGF nativo. Las variantes de la secuencia de aminoácidos tienen sustituciones, deleciones, y/o inserciones en ciertas posiciones en la secuencia de aminoácidos de hVEGF nativo, de modo que las variantes mantengan la capacidad de unirse al receptor de hVEGF (y por tanto compiten con hVEGF nativo por la unión al receptor de hVEGF) pero no logran indicar uno o más de los efectos biológicos de hVEGF, tal como proliferación celular del endotelio, angiogénesis, o permeabilidad vascular.

"Homología" se define como el porcentaje de restos en la variante de la secuencia de aminoácidos que son idénticos a los restos en la secuencia de aminoácidos de un dominio de unión al receptor de un hVEGF nativo después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para conseguir el máximo porcentaje de homología y sin considerar ninguna sustitución conservativa como parte del porcentaje de homología de aminoácidos. Los métodos y programas informáticos para el alineamiento son bien conocidos en la técnica. Uno de dichos programas informáticos es "Align 2", creado por Genentech, Inc., que se presentó con la documentación del usuario en la United States Copyright Office, Washington, DC 20559, el 10 de diciembre de 1991. Los especialistas en la técnica pueden determinar, usando técnicas de rutina, parámetros apropiados para medir el alineamiento, incluyendo cualquier algoritmo necesario para conseguir el máximo alineamiento sobre la longitud de las secuencias que se están comparando.

Las variantes de sustitución son aquéllas que tienen al menos un resto de aminoácido en una secuencia nativa retirado y un aminoácido diferente insertado en su lugar en la misma posición. Las sustituciones pueden ser únicas, donde sólo un aminoácido en la molécula se ha sustituido, o pueden ser múltiples, donde dos o más aminoácidos se han sustituido en la misma molécula.

Las variantes de inserción son aquéllas con uno o más aminoácidos insertados inmediatamente adyacentes a un aminoácido en una posición particular en la secuencia nativa. Inmediatamente adyacente a un aminoácido significa que está conectado al grupo funcional \alpha-carboxi o \alpha-amino del aminoácido.

Las variantes de deleción son aquéllas con uno o más restos de aminoácido retirados en una secuencia nativa. Habitualmente, las variantes de deleción tendrán uno o dos restos de aminoácido delecionados en una región particular de la molécula.

Los fragmentos y variantes de la secuencia de aminoácidos de hVEGF se preparan fácilmente por métodos conocidos en la técnica, tal como por mutagénesis dirigida de sitio del ADN que codifica el factor nativo. El ADN mutado se inserta en un vector de expresión apropiado, y después se transfectan las células hospedadoras con el vector recombinante. Las células hospedadoras recombinantes se hacen crecer en un medio de cultivo apropiado, y el fragmento deseado o variante de la secuencia de aminoácidos expresado en las células hospedadoras se recupera después del cultivo celular recombinante por métodos cromatográficos u otros métodos de purificación.

Como alternativa, los fragmentos y variantes de aminoácidos de hVEGF se preparan in vitro, por ejemplo, por proteolisis de hVEGF nativo, o por síntesis usando procedimientos de síntesis peptídica en fase sólida convencional como se describe por Merrifield (J. Am. Chem. Soc. 85:2149 (1963)), aunque pueden usarse otras síntesis químicas equivalentes conocidas en la técnica. La síntesis en fase sólida se inicia a partir del extremo C-terminal del péptido acoplando un \alpha-aminoácido protegido a una resina apropiada. Los aminoácidos se acoplan a la cadena peptídica usando técnicas bien conocidas en la técnica para la formación de enlaces peptídicos.

Usos Terapéuticos

Los términos "tratar", "tratamiento", "terapia" y "terapéutico" como se usan en este documento se refieren a terapia curativa, terapia profiláctica y terapia preventiva.

Para aplicaciones terapéuticas, los antagonistas de la invención se administran a un mamífero, preferiblemente un ser humano, en una forma de dosificación aceptable, incluyendo las que pueden administrarse a un ser humano por vía intravenosa en forma de bolo o por infusión continua durante un periodo de tiempo, por vías intramuscular, intraperitoneal, intra-cerebroespinal, subcutánea, intra-articular, intrasinovial, intradural, intratecal, oral, tópica, o por inhalación. Los antagonistas también se administran apropiadamente por vías intratumoral, peritumoral, intralesional, o perilesional, para ejercer efectos terapéuticos locales así como sistémicos. Se espera que la vía intraperitoneal sea particularmente útil, por ejemplo, en el tratamiento de tumores de ovario. Se espera que la infusión intravenosa sea particularmente útil por ejemplo, en el tratamiento de edema cerebral.

Dichas formas de dosificación abarcan vehículos que son no tóxicos y no terapéuticos de manera inherente. Los ejemplos de dichos vehículos incluyen intercambiadores de iones, alúmina, estearato de aluminio, lecitina, proteínas séricas, tales como albúmina de suero humano, sustancias tamponantes tales como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato potásico, mezclas de glicéridos parciales de ácidos grasos vegetales saturados, agua, sales, o electrolitos tales como sulfato de protamina, hidrogenofosfato disódico, hidrogenofosfato potásico, cloruro sódico, sales de cinc, sílice coloidal, trisilicato de magnesio, polivinilpirrolidona, sustancias basadas en celulosa, y polietilenglicol. Los vehículos para formas tópicas o basadas en gel de antagonistas incluyen polisacáridos tales como carboximetilcelulosa sódica o metilcelulosa, polivinilpirrolidona, poliacrilatos, polímeros de bloque de polioxietileno-polioxipropileno, polietilenglicol, y ceras de alcohol de madera. Pueden usarse formas de almacenamiento convencionales. Dichas formas incluyen, por ejemplo, microcápsulas, nano-cápsulas, liposomas, parches, formas de inhalación, pulverizadores nasales, comprimidos sublinguales, y preparaciones de liberación sostenida. El antagonista típicamente se formulará en dichos vehículos a una concentración de aproximadamente 0,1 mg/ml a 100 mg/ml.

Los ejemplos apropiados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el antagonista, estando dichas matrices en forma de artículos con forma, por ejemplo, películas, o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidroexietil-metacrilato) como se describe por Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15:167 (1981) y Langer, Chem. Tech., 12:98-105 (1982), o poli(vinilalcohol), polilactidas (Patente de Estados Unidos Nº 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma etil-L-glutamato (Sidman et al., Biopolymers, 22:547 (1983), copolímeros de etileno-acetato de vinilo no degradables (Langer et al., supra), de ácido láctico-ácido glicólico degradables tales como Lupron Depot^{TM} (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida), y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Aunque los polímeros tales como etileno-acetato de vinilo y ácido láctico-ácido glicólico posibilitan la liberación de moléculas durante más de 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas durante periodos de tiempo más cortos. Cuando los antagonistas polipeptídicos encapsulados permanecen en el cuerpo durante un largo periodo de tiempo, pueden desnaturalizarse o agregarse como resultado de la exposición a humedad a 37ºC, dando como resultado una pérdida de actividad biológica y posibles cambios en la inmunogenicidad. Pueden idearse estrategias racionales para la estabilización dependiendo del mecanismo implicado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregación es la formación de enlaces S-S intermoleculares a través de intercambio tio-disulfuro, la estabilización puede conseguirse modificando los restos sulfhidrilo, liofilizando en soluciones ácidas, controlando el contenido de humedad, usando aditivos, y desarrollando composiciones de matriz polimérica específicas.

Las composiciones de antagonista de hVEGF de liberación sostenida también incluyen anticuerpos antagonistas o hVEGFr atrapados en forma de liposomas. Los liposomas que contienen los antagonistas se preparan por métodos conocidos en la técnica, tales como los descritos en Epstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688 (1985); Hwang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4030 (1980); Patente de Estados Unidos Nº 4.485.045; Patente de Estados Unidos Nº 4.544.545. Habitualmente, los liposomas son pequeños (aproximadamente 200-800 Angstroms) de tipo unilamelar en los que el contenido en lípidos es mayor del 30% en moles de colesterol, estando ajustada la proporción seleccionada para la terapia HRG óptima. Los liposomas con tiempo de circulación potenciado se describen en la Patente de Estados Unidos Nº 5.013.556.

Otro uso de la presente invención comprende incorporar un antagonista de hVEGF en artículos con forma. Dichos artículos pueden usarse, por ejemplo, en la modulación del crecimiento celular endotelial y angiogénesis. Además, la invasión tumoral y metástasis puede modularse con estos artículos.

Una dosificación apropiada y eficaz de antagonista dependerá del tipo de enfermedad o afección a tratar, como se define en este documento, la gravedad y curso de la enfermedad o afección, si los antagonistas se administran para propósitos preventivos o terapéuticos, terapia previa, la historia clínica del paciente y respuesta al antagonista, y la discreción del médico que está atendiendo. Una dosificación eficaz de antagonista será típicamente la cantidad de antagonista administrada para conseguir el máximo de cantidad deseada de inhibición de actividad biológica de VEGF. El antagonista se administra apropiadamente al paciente en una vez o durante una serie de tratamientos.

Los antagonistas de hVEGF son útiles en el tratamiento de edema asociado a diversas enfermedades y afecciones no neoplásicas.

Las afecciones no neoplásicas que con susceptibles de tratamiento incluyen artritis reumatoide, psoriasis, aterosclerosis, retinopatía diabética y otras retinopatías, fibroplasia retrolental, glaucoma neovascular, degeneración macular relacionada con la edad, hiperplasias de tiroides (incluyendo enfermedad de Grave), transplante de tejido corneal y transplantes de otros tejidos, inflamación crónica, inflamación pulmonar, síndrome nefrótico, preeclampsia, ascitis, efusión pericárdica (tal como la asociada con pericarditis), y efusión pleural.

La degeneración macular relacionada con la edad (AMD) es una causa principal de pérdida visual grave en la población anciana. La forma exudativa de AMD está caracterizada por neovascularización coroidal y desprendimiento de las células epiteliales del pigmento retinal. Como la neovascularización coroidal está asociada con un empeoramiento drástico en la prognosis, se espera que los antagonistas de VEGF de la presente invención sean especialmente útiles en la reducción de la gravedad de AMD.

En este documento, el término "edema" se usa en un sentido general e incluye afecciones en el cuerpo o que acompañan a apoplejía o lesión craneal caracterizadas por un aumento en el contenido acuoso tisular extravascular, debido sólo a niveles de agua extracelular aumentados, o en combinación con niveles de agua intracelular aumentados. El edema puede estar presente en diversos tejidos en el cuerpo. En particular, se contempla que los antagonistas de hVEGF pueden emplearse para tratar edema del sistema nervioso central (SNC), incluyendo edema cerebral, típicamente caracterizado por un aumento del volumen cerebral, así como edema de médula espinal o canal medular u otras afecciones que conducen a presión intracraneal aumentada (tal como lesión local de la médula espinal). Un aumento en el volumen cerebral puede ser, por ejemplo, el resultado de volumen de sangre cerebral aumentado y/o contenido en agua tisular aumentado. El término "edema" usado en este documento incluye las afecciones patológicas mencionadas en la técnica como edema vasogénico y edema citotóxico. Típicamente, la afección mencionada como edema vasogénico se ha caracterizado como asociada a la alteración de la barrera sangre-cerebro (BBB) mientras que el edema citotóxico se ha caracterizado como asociado a BBB intacta. El edema cerebral se describe en líneas generales en el artículo de revisión, Hariri, Neurosurgical Intensive Care 5:687 (1994).

El edema en un mamífero puede ser el resultado de o acompañar a una diversidad de afecciones patológicas o estímulos, incluyendo aunque sin limitación, hipertensión aguda, meningitis, encefalitis, abscesos, traumatismo (tal como lesión craneal), hemorragia, infección viral, malaria cerebral, apoplejía, radiación, esclerosis múltiple, post detención cardiaca, asfixia al nacer, toxicidad por glutamato, encefalopatía, hipoxia, isquemia y diálisis renal.

En particular, la invención contempla terapia que usa los antagonistas de hVEGF para tratar edema cerebral, incluyendo edema cerebral que acompaña a apoplejía. Se contempla que los antagonistas de hVEGF de la presente invención pueden administrarse solos o en combinación con otras terapias, para reducir o inhibir dicho edema en el cerebro.

También es habitual para los mamíferos que tienen o están experimentando apoplejía, desarrollar o sufrir edema cerebral. El término apoplejía en la presente solicitud se usa en un sentido general e incluye las afecciones clínicas conocidas por el especialista en la técnica como apoplejía isquémica y apoplejía hemorrágica. Se reconoce en la técnica que la apoplejía en un paciente puede caracterizarse o clasificarse como diversos tipos particulares de apoplejía, dependiendo por ejemplo, de la etiología o patología de la interrupción de flujo sanguíneo, los tipos de células o tejidos afectados, y la presencia de extravasación sanguínea en el tejido (tal como tejido cerebral). Los diferentes tipos de apoplejía que se han caracterizado clínicamente incluyen aunque sin limitación, apoplejía trombótica, apoplejía embólica, apoplejía hemodinámica, apoplejía lacunar, y apoplejías hemorrágicas derivadas o como resultado de hemorragia intracerebral, subaracnoidea, intraventricular, o subdural. El médico especialista apreciará fácilmente y entenderá la naturaleza de dichas afecciones de apoplejía, y será capaz de detectar y diagnosticar la presencia o síntomas de dichas afecciones en pacientes. Los métodos de la presente invención contemplan que las moléculas antagonistas de hVEGF pueden usarse en el tratamiento de todas dichas afecciones de apoplejía, particularmente para reducir o inhibir el edema y proteger frente al daño celular y tisular. Los antagonistas de hVEGF pueden administrarse en forma de un tratamiento agudo después de la aparición de apoplejía para reducir o inhibir por ejemplo, edema cerebral, potenciando de este modo la recuperación del mamífero de la apoplejía. El uso de los antagonistas de hVEGF es beneficioso en que el tratamiento puede prevenir o evitar tener que realizar cirugía (como una craneotomía) en el mamífero para reducir o aliviar la presión intracraneal debido al exceso de acumulación de agua en tejidos cerebrales. También se contempla que después de la reducción o prevención de dicho edema por los antagonistas de hVEGF, habrá una reducción (es decir, efecto protector) en la cantidad de cerebro y tejido neuronal que puede está típicamente dañado por la presión intracraneal o edema.

Dependiendo del tipo y gravedad de la enfermedad o afección que se está tratando, aproximadamente 1 \mug/kg a 15 mg/kg de antagonista es una dosificación candidata inicial para la administración al paciente, sea, por ejemplo, por una o más administraciones por separado, o por infusión continua. Una dosificación diaria típica podría variar de aproximadamente 1 \mug/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la afección, el tratamiento se repite hasta que suceda una supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Sin embargo, pueden ser útiles otros regímenes de dosificación. Por ejemplo, en los métodos de tratamiento de edema cerebral y apoplejía, puede ser deseable administrar el antagonista o antagonistas de hVEGF inmediatamente después de la detección o diagnóstico en el paciente, en varias horas de lesión o aparición de apoplejía, o en 1 a 4 días después de ello. El protocolo de administración deseado será típicamente de la discreción del médico. El progreso de la terapia con antagonista de hVEGF se controla fácilmente por técnicas y ensayos convencionales, incluyendo, por ejemplo, técnicas radiográficas (en particular, formación de imágenes por resonancia magnética, MRI) para afecciones neoplásicas y formación de edema asociada a traumatismo o apoplejía, o controlando la presión intracraneal para el edema cerebral.

De acuerdo con otra realización de la invención, la eficacia del antagonista en la prevención o tratamiento de un afección o enfermedad puede mejorarse administrando el antagonista de manera seriada o en combinación con otro agente que es eficaz para esos propósitos, tal como factor de necrosis tumoral (TNF), un anticuerpo capaz de inhibir o neutralizar la actividad angiogénica de factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) ácido o básico o factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), un anticuerpo capaz de inhibir o neutralizar las actividades anticoagulantes del factor tisular, proteína C, o proteína S (véase Esmon, et al., Publicación de Patente PCT Nº WO 91/01753, publicada el 21 de febrero de 1991), un anticuerpo capaz de unirse al receptor HER2 (véase Hudziak, et al., Publicación de Patente PCT Nº WO 89/06692, publicada el 27 de julio de 1989), o uno o más agentes terapéuticos convencionales tales como, por ejemplo, agentes de alquilación, antagonistas de ácido fólico, antimetabolitos del metabolismo de ácidos nucleicos, antibióticos, análogos de pirimidina, 5-fluorouracilo, cisplatino, nucleósidos de purina, aminas, aminoácidos, nucleósidos de triazol, o corticosteroides. Dichos agentes distintos pueden estar presentes en la composición que se está administrando o pueden administrarse por separado. Particularmente en el tratamiento de edema y apoplejía, el antagonista puede administrarse de manera seriada o en combinación con agentes tales como agentes antivirales, antifúngicos o antiparasitarios, antibióticos, agentes trombolíticos (tales como t-PA), agentes de terapia osmótica (por ejemplo, manitol), o esteroides (como Decadron o prednisona). El uso de dichos agentes en combinación con el antagonista está dentro de la experiencia habitual del médico, y por supuesto, la selección de dichos agentes dependería, por ejemplo, de la enfermedad o afección que se está tratando.

También se contempla que el antagonista de hVEGF puede administrarse de manera seriada con hVEGF, particularmente en el tratamiento de apoplejía. Después del diagnóstico o detección de apoplejía, el antagonista de hVEGF puede administrarse inmediatamente o en aproximadamente 1 a 4 días después de la aparición de apoplejía. Se cree que después de completar la administración del antagonista para reducir o inhibir la formación de edema, pude ser beneficioso administrar al paciente una cantidad de hVEGF suficiente para estimular o promover la re-vascularización. Preferiblemente, el hVEGF sería una forma recombinante de hVEGF y se administraría en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Otros Usos

Los anticuerpos anti-hVEGF de la invención también son útiles como agentes de purificación por afinidad. En este proceso, los anticuerpos frente a hVEGF se inmovilizan en un soporte apropiado, tal como una resina de Sephadex o papel de filtro, usando métodos bien conocidos en la técnica. El anticuerpo inmovilizado después se pone en contacto con una muestra que contiene el hVEGF a purificar, y después el soporte se lava con un disolvente apropiado que retirará sustancialmente todo el material en la muestra excepto el hVEGF, que está unido al anticuerpo inmovilizado. Finalmente, el soporte se lava con otro disolvente apropiado, tal como tampón glicina, pH 5,0, que liberará el hVEGF del anticuerpo.

Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustración sólo y no pretenden limitar la invención de ningún modo.

Ejemplos

Se usaron los reactivos disponibles en el mercado a los que se hace referencia en los ejemplos de acuerdo con las instrucciones del fabricante salvo que se indique otra cosa. La fuente de las células identificadas en los siguientes ejemplos, y durante toda la memoria descriptiva, por los números de acceso ATCC es la American Type Culture Collection, Manassas, Virginia.

Ejemplo 1 Preparación de Anticuerpos Monoclonales Anti-hVEGF

Para obtener hVEGF conjugado a hemocianina de lapa californiana (KLH) para inmunización, se mezcló hVEGF recombinante (165 aminoácidos), Leung, et al., Science 246:1306 (1989), con KLH a una proporción 4:1 en presencia de glutaraldehído al 0,05% y la mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 3 horas con agitación suave. La mezcla después se dializó frente a solución salina tamponada con fosfato (PBS) a 4ºC durante una noche.

Se inmunizaron ratones balb/c cuatro veces cada dos semanas por inyecciones intraperitoneales con 5 \mug de hVEGF conjugado con 20 \mug de KLH, y se estimularon con la misma dosis de hVEGF conjugado con KLH cuatro días antes de la fusión celular.

Se fusionaron células de bazo de los ratones inmunizados con células de mieloma P3X63Ag8U.1, Yelton, et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 81:1 (1978), usando polietilenglicol (PEG) al 35% como se describe. Yarmush, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 77:2899 (1980). Los hibridomas se seleccionaron en medio HAT.

Los sobrenadantes de los cultivos de células de hibridoma se exploraron para la producción de anticuerpo anti-hVEGF por un ensayo ELISA usando placas de microtitulación recubiertas con hVEGF. Se determinó el anticuerpo que se unió a hVEGF en cada uno de los pocillos usando inmunoglobulina de cabra anti-IgG de ratón conjugada con fosfatasa alcalina y el sustrato cromogénico fosfato de p-nitrofenilo. Harlow & Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, página 597 (Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Las células de hibridoma determinadas de este modo para producir anticuerpos anti-hVEGF se subclonaron por dilución limitante, y dos de esos clones, denominados A4.6.1 y B2.6.2, se eligieron para estudios adicionales.

Ejemplo 2 Caracterización de Anticuerpos Monoclonales Anti-hVEGF A. Especificidad de Antígeno

Las especificidades de unión de los anticuerpos monoclonales anti-hVEGF producidos por los hibridomas A4.6.1 y B2.6.2 se determinaron por ELISA. Los anticuerpos monoclonales se añadieron a los pocillos de placas de microtitulación que se habían recubierto previamente con hVEGF, FGF, HGF, o factor de crecimiento epidérmico (EGF). El anticuerpo unido se detectó con inmunoglobulinas de cabra anti-IgG de ratón conjugadas con peroxidasa. Los resultados de esos ensayos confirmaron que los anticuerpos monoclonales producidos por los hibridomas A4.6.1 y B2.6.2 se unen a hVEGF, pero de manera no detectable a los otros factores de crecimiento proteicos.

B. Mapeo de Epítopos

Se uso un ELISA de unión competitiva para determinar si los anticuerpos monoclonales producidos por los hibridomas A4.6.1 y B2.6.2 se unen al mismo o a diferentes epítopos (sitios) en hVEGF. Kim, et al., Infect. Immun. 57:944 (1989). Los anticuerpos monoclonales anti-hVEGF no marcados individuales (A4.6.1 y B2.6.2) o anticuerpo anti-HGF irrelevante (isotipo IgG1) se añadieron a los pocillos de placas de microtitulación que se habían recubierto previamente con hVEGF. Después se añadieron anticuerpos monoclonales anti-hVEGF biotinilados (BIO-A4.6.1 o BIO-B2.6.2). La proporción de anticuerpo biotinilado a anticuerpo no marcado fue 1:1000. La unión de los anticuerpos biotinilados se visualizó por la adición de peroxidasa conjugada con avidina, seguida de diclorhidrato de o-fenilendiamina y peróxido de hidrógeno. La reacción de color, que indica la cantidad de anticuerpo biotinilado unido, se determinó midiendo la densidad óptica (O.D) a longitud de onda de 495 nm.

Como se muestra en la Figura 1, en cada caso, la unión del anticuerpo anti-hVEGF biotinilado se inhibió por el correspondiente anticuerpo no marcado, pero no por el otro anticuerpo anti-hVEGF no marcado o el anticuerpo anti-HGF. Estos resultados indican que los anticuerpos monoclonales producidos por los hibridomas A4.6.1 y B2.6.2 se unen a diferentes epítopos en hVEGF.

C. Determinación de Isotipo

Los isotipos de los anticuerpos monoclonales anti-hVEGF producidos por los hibridomas A4.6.1 y B2.6.2 se determinaron por ELISA. Las muestras de medio de cultivo (sobrenadante) en el que se hicieron crecer los hibridomas se añadieron a los pocillos de placas de microtitulación que se habían recubierto previamente con hVEGF. Los anticuerpos monoclonales anti-hVEGF capturados se incubaron con diferentes anti-inmunoglobulinas de ratón, de cabra, conjugadas con fosfatasa alcalina específicas de isotipo, y se determinó la unión de los anticuerpos conjugados a los anticuerpos monoclonales anti-hVEGF por la adición de fosfato de p-nitrofenilo. La reacción de color se midió al 405 nm con un lector de placa ELISA.

Por ese método, se determinó que el isotipo de los anticuerpos monoclonales producidos por ambos hibridomas A4.6.1 y B2.6.2 es IgG1.

D. Afinidad de Unión

Las afinidades de los anticuerpos monoclonales anti-hVEGF producidos por los hibridomas A4.6.1 y B2.6.2 por hVEGF se determinaron por ensayos de unión competitiva. Se añadió una concentración por debajo de la óptima predeterminada de anticuerpo monoclonal a las muestras que contenían 20.000-40.000 cpm de ^{125}I-hVEGF (1-2 ng) y diversas cantidades conocidas de hVEGF no marcado (1-1000 ng). Después de 1 hora a temperatura ambiente, se añadieron 100 \mul de antisuero de cabra anti-Ig de ratón (Pel-Freez, Rogers, Ar USA), y se incubaron las mezclas otra hora a temperatura ambiente. Los complejos de anticuerpo y proteína unida (complejos inmunes) se hicieron precipitar por la adición de 500 \mul polietilenglicol al 6% (PEG, peso en moles 8000) a 4ºC, seguido por centrifugación a 2000 x G durante 20 min a 4ºC. La cantidad de ^{125}I-hVEGF unido al anticuerpo monoclonal anti-hVEGF en cada muestra se determinó contando el material sedimentado en un contador gamma.

Se calcularon las constantes de afinidad a partir de los datos por análisis de Scatchard. Se calculó que la afinidad del anticuerpo monoclonal anti-hVEGF producido por el hibridoma A4.6.1 es 1,2 x 10^{9} litros/mol. Se calculó que la afinidad del anticuerpo monoclonal anti-hVEGF producido por el hibridoma B2.6.2 es 2,5 x 10^{9} litros/
mol.

E. Inhibición de la Actividad Mitogénica de hVEGF

Se sembraron células del endotelio capilar de la corteza suprarrenal (ACE) bovinas, Ferrara, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 84:5773 (1987), a una densidad de 10^{4} células/ml en placas multipocillo de 12 pocillos, y se añadieron 2,5 ng/ml de hVEGF a cada pocillo en presencia o ausencia de diversas concentraciones de los anticuerpos monoclonales anti-hVEGF producidos por los hibridomas A4.6.1 o B2.6.2, o un anticuerpo monoclonal anti-HGF irrelevante. Después de cultivar 5 días, las células en cada pocillo se contaron en un contador Coulter. Como control, se cultivaron células ACE en ausencia de hVEGF añadido.

Como se muestra en la Figura 2, ambos anticuerpos monoclonales anti-hVEGF inhibieron la capacidad del hVEGF añadido de mantener el crecimiento o supervivencia de las células ACE bovinas. El anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma A4.6.1 inhibió completamente la actividad mitogénica de hVEGF (más de aproximadamente el 90% de inhibición), mientras que el anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma B2.6.2 inhibió sólo parcialmente la actividad mitogénica de hVEGF.

F. Inhibición de la Unión de hVEGF

Se sembraron células ACE bovinas a una densidad de 2,5 x 10^{4} células/0,5 ml/pocillo en placas de microtitulación de 24 pocillos en Medio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) que contenía suero de ternera al 10%, glutamina 2 mM, y 1 ng/ml de factor de crecimiento de fibroblastos básico. Después de cultivar durante una noche, las células se lavaron una vez en tampón de unión (volúmenes iguales de DMEM y medio F12 más HEPES 25 mM y albúmina de suero bovino al 1%) a 4ºC.

Se preincubaron 12.000 cpm de ^{125}I-hVEGF (aproximadamente 5 x 10^{4} cpm/ng/ml) durante 30 minutos con 5 \mug del anticuerpo monoclonal anti-hVEGF producido por el hibridoma A4.6.1, B2.6.2, o A2.6.1 (250 \mul de volumen total), y después las mezclas se añadieron a las células ACE bovinas en las placas de microtitulación. Después de incubar las células durante 3 horas a 4ºC, las células se lavaron 3 veces con tampón de unión a 4ºC, se solubilizaron por la adición de 0,5 ml de NaOH 0,2 N, y se contaron en un contador gamma.

Como se muestra en la Figura 3 (superior), los anticuerpos monoclonales anti-hVEGF producidos por los hibridomas A4.6.1 y B2.6.2 inhibieron la unión de hVEGF a las células ACE bovinas. En contraste, el anticuerpo monoclonal anti-hVEGF producido por el hibridoma A2.6.1 no tuvo efecto aparente sobre la unión de hVEGF a las células ACE bovinas. Consecuente con los resultados obtenidos en el ensayo de proliferación celular descrito anteriormente, el anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma A4.6.1 inhibió la unión de hVEGF a un mayor grado que el anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma B2.6.2.

Como se muestra en la Figura 3 (inferior), el anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma A4.6.1 inhibió completamente la unión de hVEGF a las células ACE bovinas a una proporción molar 1:250 de hVEGF a anticuerpo.

G. Reactividad cruzada con otras isoformas de VEGF

Para determinar si el anticuerpo monoclonal anti-hVEGF producido por el hibridoma A4.6.1 es reactivo con las formas de 121 y 189 aminoácidos de hVEGF, se ensayó el anticuerpo para su capacidad de inmunoprecipitar esos polipéptidos.

Se transfectaron células 293 humanas con vectores que comprenden la secuencia codificante de nucleótidos de los polipéptidos hVEGF de 121 y 189 aminoácidos, como se describe. Leung, et al., Science 246:1306 (1989). Dos días después de la transfección, se transfirieron las células a medio que carecía de cisteína y metionina. Las células se incubaron 30 minutos en ese medio, después se añadieron 100 \muCi/ml de cada ^{35}S-metionina y ^{35}-S-cisteína al medio, y las células se incubaron otras dos horas. El marcaje se fijó transfiriendo las células a medio libre de suero e incubando tres horas. Se recogieron los medios de cultivo celular, y se lisaron las células incubando durante 30 minutos en tampón de lisis (NaCl 150 mM, NP40 al 1%, desoxicolato al 0,5%, dodecilsulfato sódico al 0,1% (SDS), Tris 50 mM, pH 8,0). Los restos celulares se retiraron de los lisados por centrifugación a 200 x G durante 30 minutos.

Se incubaron muestras de 500 \mul de medios de cultivo celular y lisados celulares con 2 \mul de anticuerpo de hibridoma A4.6.1 (2,4 mg/ml) durante 1 hora a 4ºC, y después se incubaron con 5 \mul de inmunoglobulina de conejo anti-IgG de ratón durante 1 hora a 4ºC. Los complejos inmunes de hVEGF marcado con ^{35}S y anticuerpo monoclonal anti-hVEGF se hicieron precipitar con proteína A Sepharose (Pharmacia), después se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida al 12%-SDS en condiciones reductoras. El gel se expuso a una película de rayos x para el análisis de las proteínas radiomarcadas inmunoprecipitadas por autorradiografía.

Los resultados de ese análisis indicaron que el anticuerpo monoclonal anti-hVEGF producido por el hibridoma A4.6.1 tenía reacción cruzada con ambas formas de 121 y 189 aminoácidos de hVEGF.

Ejemplo 3 Preparación de Proteínas de Fusión Receptor de VEGF-IgG

A.

Las secuencias de nucleótidos y codificantes de aminoácidos del receptor de hVEGF flt se describen en Shibuya, et al., Oncogene 5:519-524 (1990). La secuencia codificante del dominio extracelular completo del receptor de hVEGF flt se fusionó a la secuencia codificante de la cadena pesada de IgG1 humana en un proceso de dos etapas.

Se usó mutagénesis dirigida de sitio para introducir un sitio de restricción BstBI en el ADN que codifica flt en un sitio 5' del codón para el aminoácido 759 de flt, y para convertir el único sitio de restricción BstEII en el plásmido pBSSK^{-} FC, Bennett, et al., J. Biol. Chem. 266:23060-23067 (1991), a un sitio BstBI. El plásmido modificado se digirió con EcoRI y BstBI y el fragmento grande resultante del ADN plasmídico se ligó junto con un fragmento EcoRI-BstBI del ADN de flt que codifica el dominio extracelular (aminoácidos 1-758) del receptor de hVEGF flt.

La construcción resultante se digirió con ClaI y NotI para generar un fragmento de aproximadamente 3,3 kb, que después se inserta en el sitio de clonación múltiple del vector de expresión de mamífero pHEBO2 (Leung, et al., Neuron 8:1045 (1992)) por ligamiento. Se modifican los extremos del fragmento de 3,3 kb, por ejemplo, por la adición de enlazadores, para obtener la inserción del fragmento en el vector en la orientación correcta para la expresión.

Se transfectan células hospedadoras de mamífero (por ejemplo, células CEN4 (Leung, et al. supra)) con el plásmido pHEBO2 que contienen el inserto de flt por electroporación. Las células transfectadas se cultivan en medio que contiene suero bovino fetal aproximadamente al 10%, glutamina 2 mM, y antibióticos, y se transfieren a una confluencia de aproximadamente el 75% a medio libre de suero. El medio se condiciona durante 3-4 días antes de la recogida, y la proteína de fusión flt-IgG se purifica del medio condicionado por cromatografía en una matriz de afinidad de proteína A esencialmente como se describe en Bennett, et al., J. Biol. Chem. 266:23060-23067 (1991).

B.

Se construyó un ADNc de flt-IgG humano (mencionado como hflt(1-3)-IgG) como se describe en Davis-Smyth et al., EMBO J. 15:4919-4927 (1996). Esta forma de receptor truncado incluía solo los primeros tres dominios tipo inmunoglobulina de flt humano fusionado a un Fc-IgG. Véase Ferrara et al., Nature Medicine 4:336 (1998).

Se construyó un flt-IgG murino (mencionado como mflt(1-3)-IgG) por amplificación por PCR del ADNc de embrión de 17 días de ratón (Clontech, Palo Alto, CA) usando cebadores descritos en Ferrara et al., supra. El diseño del cebador de PCR 3' aseguró que la expresión del mflt-1(1-3) estuviera en fase con un clon de Fc de IgG2b murino. El fragmento de 1 kb resultante primero se clonó en un vector de clonación TA (Invitrogen, San Diego, CA) como un fragmento ClaI-BstEII. Este fragmento se ligó al extremo 5' de Fc de IgG2b murino en un vector pRK. Este plásmido posibilitó la expresión de la proteína de fusión mflt(1-3)-IgG cuando se transfirió a células de mamífero.

Para la expresión en células CHO, los ADNc se subclonaron en un vector dicistrónico que une la expresión del marcador dihidrofolato reductasa a la expresión de la proteína de fusión obtenida de flt. Véase, Lucas et al., Nucleic Acid Res. 24:1774-1779 (1996). Los plásmidos se introdujeron en células DP12, un derivado de la línea celular CHO-K1DUXB11 desarrollada por L. Chasin (Columbia University, Nueva York) mediante lipofección y se seleccionaron para el crecimiento en medio libre de glicina-hipoxantina-timidina (G-H-T). Chisholm et al., DAN Cloning 4: A Practical Approach, Mammalian Systems (eds. Glover & Hames) páginas 1-39 (Oxford Press, 1995). Los clones de la primera ronda de selección se sembraron posteriormente en placas a concentraciones en aumento de metotrexato. Después los clones se exploraron para la producción por ELISA para el Fc humano y murino. Los clones que presentaron la producción más alta se adaptaron a cultivo en suspensión, y se recogieron los cultivos libres de suero y se purificaron por proteína A-Sepharose. Se determinaron las concentraciones de proteína por análisis de aminoácidos. El contenido de endotoxina del material purificado final no excedió de 0,5 eu/mg.

Como se describe en Ferrara et al., supra, tanto la proteína de fusión flt(1-3)-IgG murina como al proteína de fusión flt(1-3)-IgG humana fueron activas en la inhibición de la bioactividad de VEGF en el modelo de roedor ensaya-
do.

Ejemplo 4 Inhibición del Crecimiento Tumoral con Antagonistas de hVEGF

Se ensayaron diversas líneas de células tumorales que crecían en cultivo para la producción de hVEGF por ELISA. Se descubrió que las líneas de células tumorales de ovario, pulmón, colon, gástricas, de mama, y de cerebro producían hVEGF. Tres líneas celulares que producían hVEGF, NEG 55 (también mencionada como G55) (línea de células de glioma humano obtenida de Dr. M. Westphal, Department of Neurosurgery, University Hospital Eppendor, Hamburg, Alemania, también mencionada como G55), A-673 (línea de células de rabdomiosarcoma humano obtenida de la American Type Culture Collection (ATCC), como línea celular número CRL 1598), y SK-LMS-1 (línea celular de leiomiosarcoma obtenida de la ATCC como línea celular número HTB 88), se usaron para estudios adiciona-
les.

Se inyectaron por vía subcutánea ratones Beige/nude hembras de seis a diez semanas de edad (Charles River Laboratory, Wilmington, Massachussets USA) con 1-5 x 10^{6} células tumorales en 100-200 \mul de PBS. En diversos momentos después de que se estableciera el crecimiento tumoral, los ratones se inyectaron por vía intraperitoneal una o dos veces por semana con diversas dosis de anticuerpo monoclonal anti-hVEGF A4.6.1, un anticuerpo monoclonal anti-gp120 irrelevante (5B6), o PBS. El tamaño tumoral se midió cada semana, y al final del estudio, los tumores se extirparon y se pesaron.

Se muestra el efecto de diversas cantidades de anticuerpo monoclonal anti-hVEGF A4.6.1 sobre el crecimiento de tumores NEG 55 en ratones en las Figuras 4 y 5. La Figura 4 muestra que los ratones tratados con 25 \mug o 100 \mug de anticuerpo monoclonal anti-hVEGF A4.6.1 comenzando una semana después de la inoculación de células NEG 55 tuvieron una velocidad sustancialmente reducida de crecimiento tumoral en comparación con los ratones tratados con anticuerpo irrelevante o PBS. La Figura 5 muestra que cinco semanas después de la inoculación de las células NEG 55, el tamaño de los tumores en ratones tratados con anticuerpo anti-hVEGF A4.6.1 fue aproximadamente del 50% (en el caso de ratones tratados con dosificaciones de 25 \mug del anticuerpo) al 85% (en el caso de ratones tratados con dosificaciones de 100 \mug del anticuerpo) menor que el tamaño de los tumores en ratones tratados con anticuerpo irrelevante o PBS.

El efecto del tratamiento con anticuerpo monoclonal anti-hVEGF A4.6.1 sobre el crecimiento de tumores SK-LMS-1 en ratones se muestra en la Figura 6. Cinco semanas después de la inoculación de las células SK-LMS-1, el tamaño medio de los tumores en ratones tratados con el anticuerpo anti-hVEGF A4.6.1 fue aproximadamente un 75% menor que el tamaño de tumores en ratones tratados con anticuerpo irrelevante o PBS.

El efecto del tratamiento con anticuerpo monoclonal anti-hVEGF A4.6.1 sobre el crecimiento de tumores A673 en ratones se muestra en la Figura 7. Cuatro semanas después de la inoculación de las células A673, el tamaño medio de los tumores en ratones tratados con anticuerpo anti-hVEGF A4.6.1 fue aproximadamente del 60% (en el cado de ratones tratados con dosificaciones de 10 \mug del anticuerpo) a más del 90% (en el caso de ratones tratados con dosificaciones de 50-400 \mug del anticuerpo) menor que el tamaño de los tumores en ratones tratados con anticuerpo irrelevante o PBS.

Ejemplo 5 Análisis del Efecto Directo de Anticuerpo Anti-hVEGF en Células Tumorales que Crecen en Cultivo

Se sembraron células de glioblastoma humano NEG55 o células de rabdomiosarcoma A673 a una densidad de 7 x 10^{3} células/pocillo en placas multipocillo (12 pocillos/placa) en medio F12/DMEM que contenía suero de ternera fetal al 10%, glutamina 2 mM, y antibióticos. Después se añadió anticuerpo anti-hVEGF A4.6.1 a los cultivos celulares a una concentración final de 0-20,0 \mug anticuerpo/ml. Después de cinco días, las células que crecían en los pocillos se disociaron por exposición a tripsina y se contaron en un contador Coulter.

Las Figuras 8 y 9 muestran los resultados de esos estudios. Como es evidente, el anticuerpo anti-hVEGF A4.6.1 no tuvo ningún efecto significativo sobre el crecimiento de las células NEG55 o A673 en cultivo. Estos resultados indican que el anticuerpo anti-hVEGF A4.6.1 es no citotóxico, y sugiere fuertemente que los efectos antitumorales observados del anticuerpo se deben a su inhibición de neovascularización mediada por VEGF.

Ejemplo 6 Efecto de Anticuerpo Anti-hVEGF sobre la Quimiotaxis de Células Endoteliales

La quimiotaxis de células endoteliales y otras células, incluyendo monocitos y linfocitos, juega un papel importante en la patogénesis de artritis reumatoide. La migración de células endoteliales y la proliferación acompañan a la angiogénesis que sucede en el sinovio reumatoide. El tejido vascularizado (pannus) invade y destruye el cartílago articular.

Para determinar si los antagonistas de hVEGF impiden este proceso, se ensayó el efecto del anticuerpo anti-hVEGF A4.6.1 en la quimiotaxis de células endoteliales estimulada por el fluido sinovial de pacientes que tienen artritis reumatoide. Como control, también se ensayó el efecto del anticuerpo anti-hVEGF A4.6.1 en la quimiotaxis de células endoteliales estimulada por fluido sinovial de pacientes que tienen osteoartritis (la angiogénesis que sucede en artritis reumatoide no sucede en osteoartritis).

Se ensayó la quimiotaxis de células endoteliales usando cámaras de Boyden modificadas de acuerdo con procedimientos establecidos. Thompson, et al., Cancer Res. 51:2670 (1991); Phillips, et al., Proc. Exp. Biol. Med. 197:458 (1991). Se dejó que aproximadamente 10^{4} células endoteliales de la vena umbilical humana se adhirieran a filtros recubiertos con gelatina (tamaño de poro de 0,8 micrómetros) en microcámaras multipocillo de 48 pocillos en medio de cultivo que contenía suero bovino fetal al 0,1%. Después de aproximadamente dos horas, las cámaras se invirtieron y se añadieron las muestras de ensayo (fluido sinovial de artritis reumatoide, fluido sinovial de osteoartritis, FGF básico (bFGF) (a una concentración final de 1 \mug/ml), o PBS) y anticuerpo anti-hVEGF A4.6.1 (a una concentración final de 10 \mug/ml) a los pocillos. Después de dos a cuatro horas, las células que habían migrado se tiñeron y contaron.

La Figura 10 muestra resultados promedio de esos estudios. Los valores mostrados en la columna marcada "Fluido Sin." y mostrados en la parte inferior de la página para los controles son la cantidad media de células endoteliales que migraron en presencia de fluido sinovial, bFGF, o PBS solo. Los valores en la columna marcada "Fluido Sin. + mAB VEGF" son la cantidad media de células endoteliales que migraron en presencia de fluido sinovial más anticuerpo anti-hVEGF A4.6.1 añadido. Los valores en la columna marcada "% de Supresión" indican el porcentaje de reducción en la migración de células endoteliales inducida por fluido sinovial como resultado de la adición de anticuerpo anti-hVEGF. Como se ha indicado, en anticuerpo anti-hVEGF inhibió significativamente la capacidad del fluido sinovial de artritis reumatoide (porcentaje medio de inhibición del 53,40), pero no del fluido sinovial de osteoartritis (porcentaje medio de inhibición del 13,64), de inducir la migración de células endoteliales.

Ejemplo 7 Efecto de Antagonista de VEGF en Edema Cerebral

Se realizó un ensayo in vivo para determinar los efectos de un antagonista flt-IgG en edema cerebral. La pérdida de integridad de BBB y la formación de edema cerebral a menudo sucede en la patogénesis de infarto cerebral. Se cree que el fallo de la BBB en apoplejía isquémica sucede predominantemente después de las primeras 24 horas de la aparición de apoplejía. Además, se cree que los efectos beneficiosos de una rápida y adecuada restauración del flujo sanguíneo después de un suceso de isquemia agudo pueden minarse por lesión por reperfusión de la microvasculatura cerebral que comprende la BBB, contribuyendo a la formación de edema cerebral. Klatzo et al. Eds., Brain Edema, Tokio, Springer (1984), páginas 1-5. El ensayo in vivo descrito a continuación se diseñó para reflejar estos aspectos de la afección clínica.

Se indujo isquemia cortical focal en cerebro de ratón por la oclusión de la arteria cerebral media (MCA) usando técnicas descritas previamente por Chen et al., Stroke 17:738-743 (1986). Se anestesiaron los ratones (C57BL-6J; 18-25 gramos) con isofluorano al 1,5% en oxígeno. Se expuso la MCA derecha mediante craneotomía y se ligó con una sutura 11-0. La arteria carótida común ipsilateral también se ocluyó durante el periodo isquémico. Los vasos permanecieron ocluidos durante 45 minutos. Antes de la cirugía, los animales se dividieron aleatoriamente en dos grupos y se administró por vía intraperitoneal flt-IgG murino (como se describe en el Ejemplo 3B anterior; también descrito en Ferrara et al., Nature Medicine 4:336 (1998)) o un anticuerpo anti-GP120 murino de control irrelevante que pertenece al mismo isotipo que el Fc en flt-IgG [Ferrara et al., supra] a una dosis de 10 mg/kg a 12 horas antes de la cirugía, en el momento de la reperfusión y otra vez a 1 ó 2 días después de la cirugía. El grado de formación de edema se evaluó por formación de imágenes de MR ponderadas T2 24 horas después de la aparición de isquemia. El tamaño final del infarto se evaluó 8-12 semanas después usando MRI anatómica de alta resolución. Se tomó un subconjunto de animales (n=12) para la verificación del tamaño del infarto usando técnicas de histología convencionales.

Como se muestra en la Fig. 11, la administración de flt-Ig provocó una reducción significativa en el volumen del edema cerebral como se define por la región de hiperintensidad en la exploración de MRI ponderada T2 conseguida 1 día después de la aparición de isquemia (reducción del 27%, ensayo t de Student p=0,01, n=15 y 16 en los grupos de control y tratamiento, respectivamente). Las imágenes de MR ponderadas T2 representativas que muestran la aparición de edema cortical como una región de alta señal de intensidad en comparación con el lado contralateral se muestran en la Fig. 12. En este modelo, la progresión del daño isquémico conduce a la pérdida de tejido cortical y cavitación. El volumen del infarto final puede, por lo tanto, estimarse a partir de las imágenes anatómicas de alta resolución definiendo la cantidad de corteza no afectada y comparándola con el hemisferio contralateral. Como se muestra en la Fig. 13, el tamaño del infarto cortical se reduce significativamente por la administración de flt-IgG medido 8-12 semanas después (reducción del 26% en el tamaño del infarto, ensayo t de Student p=0,009, n=11 y 14 en los grupos de control y tratamiento, respectivamente). Hubo una buena correlación entre el volumen del infarto medido por MRI y el determinado usando histología convencional (R^{2}=0,633). Por consiguiente, los animales tratados mostraron una reducción en el desarrollo de edema cerebral, que puede proporcionar adicionalmente neuroprotección potenciada. Estos resultados indican que la inhibición de la actividad biológica de VEGF puede reducir la reperfusión isquémica relacionada con edema y lesión cerebral.

<110> Genentech, Inc.

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<120> Antagonistas del Factor de Crecimiento Celular del Endotelio Vascular y usos de los mismos

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<130> P1717-PCT

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<140> PCT/US99/29475

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<141> 09-12-1999

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<150> US 09/218.481

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<151> 22-12-1998

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<160> 16

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<210> 1

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<211> 110

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

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14

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<210> 2

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<211> 110

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

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15

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<210> 3

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<211> 110

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 3

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16

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<210> 4

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<211> 110

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 4

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17

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<210> 5

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<211> 110

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 5

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18

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<210> 6

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<211> 110

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 6

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19

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<210> 7

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<211> 110

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 7

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20

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<210> 8

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<211> 110

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 8

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21

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<210> 9

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<211> 118

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 9

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22

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<210> 10

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<211> 118

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 10

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23

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<210> 11

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<211> 118

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 11

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24

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<210> 12

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<211> 118

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 12

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25

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<210> 13

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<211> 118

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 13

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\hskip1.37cm

26

27

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<210> 14

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<211> 118

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 14

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28

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<210> 15

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<211> 121

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 15

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29

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<210> 16

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<211> 121

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 16

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30

Claims (20)

1. Uso de un antagonista de hVEGF en la fabricación de un medicamento para tratar a un mamífero que tiene edema asociado a una enfermedad o afección no neoplásica, o para prevenir el edema en un mamífero donde el edema está asociado a una enfermedad o afección no neoplásica.

2. Uso de acuerdo con reivindicación 1, donde el medicamento reduce o inhibe el edema.

3. Uso de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, donde el edema comprende edema del sistema nervioso central.

4. Uso de acuerdo con la reivindicación 3, donde el edema del sistema nervioso central comprende edema cerebral.

5. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde la enfermedad o afección no neoplásica comprende lesión craneal, lesión de la médula espinal, hipertensión aguda, meningitis, encefalitis, abscesos, hemorragia, infección viral, malaria cerebral, radiación, esclerosis múltiple, detención cardiaca, asfixia al nacer, toxicidad por glutamato, encefalopatía, hipoxia, isquemia, o diálisis renal.

6. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde la enfermedad o afección no neoplásica comprende apoplejía.

7. Uso de acuerdo con la reivindicación 6, donde la apoplejía es apoplejía isquémica.

8. Uso de acuerdo con la reivindicación 7, donde la apoplejía isquémica es apoplejía trombótica, apoplejía embólica, apoplejía hemodinámica, o apoplejía lacunar.

9. Uso de acuerdo con la reivindicación 6, donde la apoplejía es apoplejía hemorrágica.

10. Uso de acuerdo con la reivindicación 9, donde la apoplejía hemorrágica está asociada a hemorragia intracerebral, subaracnoidea, intraventricular, o subdural.

11. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6-10, donde el medicamento es para tratar al mamífero inmediatamente después de la detección o diagnóstico de la apoplejía.

12. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6-10, donde el medicamento es para tratar al mamífero en 1 a 4 días de la aparición de la apoplejía.

13. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, donde el mamífero es un ser humano.

14. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, donde el antagonista de hVEGF comprende un anticuerpo anti-hVEGF.

15. Uso de acuerdo con la reivindicación 14, donde el anticuerpo anti-hVEGF comprende un anticuerpo quimérico.

16. Uso de acuerdo con la reivindicación 14 ó 15, donde el anticuerpo anti-hVEGF comprende un anticuerpo humanizado.

17. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, donde dicho anticuerpo comprende un anticuerpo monoclonal.

18. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, donde el antagonista de hVEGF comprende una proteína de fusión del receptor de hVEGF.

19. Uso de acuerdo con la reivindicación 18, donde la proteína de fusión del receptor de hVEGF comprende una secuencia del dominio extracelular de un receptor de hVEGF fusionada a una inmunoglobulina.

20. Uso de acuerdo con la reivindicación 18 ó 19, donde la proteína de fusión del receptor de hVEGF comprende una proteína de fusión flt-IgG.