JP2002529100A - 組換えヒトエリスロポイエチンを発現する宿主細胞 - Google Patents
組換えヒトエリスロポイエチンを発現する宿主細胞Info
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Abstract
Description
)コードするヌクレオチド配列を含むベクターに関連する。特に、発現ベクター
は、EPOの発現を制御するプロモーターを1つのみ含む。本発明はまた、EP
Oを産生する方法およびそれにしたがって産生されたEPOに関連する。
循環赤血球の数を増加させる。ヒトにおける赤血球の平均寿命は120日であり
、そのためヒトは毎日1/120の赤血球を失う。この損失は、適正なレベルの
赤血球を維持するために、連続的に回復させなければならない。
eissmanおよびErslevによって明確に立証された。Carnotら
、C.R.Acad.Sci.(France)143:384−386(19
06);Carnotら、C.R.Acad.Sci.(France),14
3:432−435(1906);Carnotら、C.R.Soc.Biol
.,111:344−346(1906);Carnot、C.R.Soc.B
iol.,111:463−465(1906);Reissman、Bloo
d 5:372−380(1950)およびErslev、Blood,8:3
49−357(1953)を参照のこと。ReissmanおよびErslev
の実験は、他の研究者によって即座に確認された。Hodgsonら、Bloo
d,9:299−309(1954);Gordonら、Proc.Soc.E
xp.Biol.Med.,86:255−258(1954);およびBor
sookら、Blood,9:734−742(1954)を参照のこと。
って、腎臓を主要な器官として、そして管周囲の間細胞を合成部位として同定し
た。Jacobsonら、Nature,179:633−634(1957)
;Kuratowskaら、Blood,18:527−534(1961);
Fisher、Acta Hematol.,26:224−32(1961)
;Fisherら、Nature,205:611−612(1965);Fr
enkelら、Ann.N.Y.Acad.Sci.,149:292−293
(1968);Busuttilら、Proc.Soc.Exp.Biol.M
ed.,137:327−330(1971);Busuttil、Acta
Haematol.,(Switzerland),47:238−242(1
972);Erslev、Blood,44:77−85(1974);Kaz
al、Ann.Clin.Lab.Sci.,5:98−109(1975);
Sherwoodら、Endocrinology,99:504−510(1
976);Fisher、Ann.Rev.Pharmacol.Toxico
l.,28:101−122(1988);Jelkmannら、Exp.He
matol.,11:581−588(1983);Kurtzら、Proc.
Natl.Acad.Sci.(USA),80:4008−4011(198
3);Caroら、J.Lab.Clin.Med.,103:922−931
(1984);Caroら,Exp.Hematol.,12:357(198
4);Schusterら、Blood,70:316−318(1986);
Bondurantら、Mol.Cell.Biol.,6:2731−273
3(1986);Schusterら、Blood,71:524−527(1
988);Kouryら、Blood,71:524−527(1988);L
acombeら、J.Clin.Invest.,81:620−623(19
88);Kouryら、Blood,74:645−651(1989)を参照
のこと。
る。Naughtonら、J.Surg.Oncol.,12:227−242
(1979);Liuら、J.Surg.Oncol.,15:121−132
(1980);Dornfestら、Ann.Clin.Lab.Sci.,1
1:37−46(1981);Dinkelaarら、Exp.Hematol
.,9:796−803(1981);Caroら、Am.J.Physiol
.,244:5(1983);Dornfestら、J.Lab.Clin.M
ed.,102:274−285(1983);Naughtonら、Ann.
Clin.Lab.Sci.,13:432−438(1983);Jacob
sら、Nature,313:806−810(1985);Erslevら、
Med.Oncol.Tumor.Pharmacother.,3:159−
164(1986)を参照のこと。その産生されたEPOは、組織の低酸素およ
びEPO産生細胞数の増加によって起こるその発現の程度に正比例する。
示した。Eschbachら、N.England J.of Med.,31
6:73−78(1987);Krane、Henry Ford Hosp.
Med.J.,31:177−181(1983)を参照のこと。しかし、大量
に産生する方法が利用できないために、その治療的な有用性は制限されてきた。
公知の抽出システムによって得られるEPOの量および質は不充分であった。最
近、組換えDNA技術の使用によって大量のタンパク質を得る事が可能となった
。これらの技術の真核生物細胞への応用は、大規模なEPOの産生を可能にした
。米国特許第5,688,679号(Powell)、同第5,547,933
号(Lin)、同第5,756,349号(Lin)、同第4,703,008
号(Lin)、および同第4,677,195(Hewickら)を参照のこと
。
らの技術は、DNAフラグメントおよび酵素のような遺伝的エレメントの、組換
えタンパク質の産生のための遺伝構築物を集合および伝達するための使用を含む
。また、組換えDNA技術は生物学的機構の研究を容易にする。Frank−K
amenetskii、「Unraveling DNA」[Samaia G
lavnaia Molekula](Addison Wesley Lon
gman Inc.,Reading,Massachusetts,1997
);Brown、「Gene Cloning」(Chapman&Hall,
London,England,1995);Watsonら、「Recomb
inantDNA」,第二版(Scientific American Bo
oks,New York,New York,1992);Albertsら
、「Molecular Biology of the Cell」(Gar
land Publishing Inc.New York,New Yor
k,1990);Innisら編、「PCR Protocols.A Gui
de to Methods and Applications」(Acad
emic Press Inc.,San Diego,California
,1990);Ehrlich編、「PCR Technology.Prin
ciples and Applications for DNA Ampl
ification」(Stockton Press,New York,N
ew York,1989);Sambrookら、「Molecular C
loning.A Laboratory Manual」(Cold Spr
ing Harbor Laboratory Press,1989);Bi
shopら、「Nucleic Acid and Protein Sequ
ence.A Practical Approach」(IRL Press
1987);Reznikoff編、「Maximizing Gene E
xpression」(Butterworths Publishers,S
toneham,Massachusetts,1987);Davisら、「
Basic Methods in Molecular Biology」(
Elsevier Science Publishing Co.,New
York,New York,1986);Watson、「The Doub
le Helix」(Penguin Books USA Inc.,New
York,New York,1969)を参照のこと。
トランスフェクションの手段により得られた、組換えヒトEPOを生産する真核
生物細胞株を含む。このベクターは発現制御エレメントとして固有のプロモータ
ーおよびターミネーターをさらに含む。配列番号(SEQ ID NO:)1は
、使用された遺伝子によって体系化されたEPOアミノ酸配列を同定する。
ィルスターミネーター、からなるエリスロポイエチンポリペプチドをコードする
ヌクレオチド配列を含むベクターを含む宿主細胞を提供する。
記宿主細胞を培養する工程を包含する、EPOポリペプチドを産生するための方
法をさらに提供する。
’領域の非コードフラグメントを含まないことである。しかし、本願発明の系は
、予想外に大量のEPOを産生する。
含む発現ベクターの使用である。本願発明の方法を利用することにより、一日当
たりの1リットルの細胞培養物当たり50mgより多くのEPOを得ることが可
能であり、すなわち、従来報告された1つのプロモーターを利用する最良の方法
よりも、本願発明のEPO産生レベルは5倍を超える。
との組み合わせは、驚くべきことに、効果的に動作し、安定なEPO産生細胞を
生じることを示した。遺伝子構築物を操作することはより複雑かつ困難であるが
、より適切な理論において使用することが報告されたそれらと匹敵して、または
それよりもかなり高く、トランスフェクトされた細胞は、大量のEPOを生じた
。
トランスフェクションであり、このように、同時トランスフェクトされたEPO
産生細胞の選択、遺伝的増幅および維持を単純化し、そして促進する。
伝物質である。4つの異なるヌクレオチドのポリマー鎖が、DNAを形成し、そ
れらの各々はデオキシリボース(desoxyribose)に結合したプリン
、またはピリミジンである。糖部分が、その後リン酸基に結合される。これら4
つのヌクレオチドは、以下である:アデニン(A)、シトシン(C)、グアニン
(G)およびチミン(T)。
で1つのヌクレオチドのデオキシリボースの5’位のリン酸塩は、前のヌクレオ
チドのデオキシリボースの3’位に結合される。インビボでの合成は、5’から
3’に生じ、これはDNA配列を記載するために採用される従来の方向である。
の鎖のAおよびCと、相補鎖のTおよびGとの、それぞれの間で形成される水素
結合により共に保持される。これが、それらが「塩基対」といわれる理由である
。
他方の3’末端に一致する: 5’−TACGTAC−3’ 3’−ATGCATC−5’ タンパク質合成が生じるために特定のDNAコード領域が、最初にメッセンジ
ャーRNA(mRNA)に転写される。このmRNAは、その後、タンパク質に
翻訳される。各DNAコード領域は、遺伝子と呼ばれる。
定の遺伝子領域の転写を含む。従って、DNAテンプレートに相補的な逆平行R
NA鎖が得られる。DNAの各AはRNAのUに、各CはGに、各GはCに、お
よび各TはAに対応する。RNA分子はまた、DNAより安定でないという理由
で特徴づけられる。さらに、DNAにあるようなデオキシリボースに代わり、R
NAの糖部分はリボースである。RNAはさらに、チミン(T)に代わるウラシ
ル(U)の置換によってDNAと区別される。
シング)され成熟mRNAを生じる。細菌において、このプロセシングは確認さ
れない。
、このプロセスにおいて、トランスファーRNA(tRNA、アミノ酸を運び、
そしてそれらを特異的に整列し、タンパク質を形成する短いRNA鎖)およびリ
ボソームが主な関与物である。3つのmRNA塩基(トリプレットまたはコドン
)は各アミノ酸をコードする。例えば、mRNAのAUG配列は、アミノ酸メチ
オニンをコードする。従って、mRNA鎖は、特定のペプチド配列に翻訳され、
このペプチド配列は最終的に活性なタンパク質に折りたたまれる。タンパク質合
成は、「発現」と呼ばれる。
る特定のDNA領域の存在に依存し、プロモーターは発現プロセスが生じる割合
に影響する。さらに、転写の終結を示すDNA配列(ターミネーター)、および
翻訳の終止を示すコドン(停止コドン)が存在する。
び細胞(すなわち、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞および哺乳動物細胞)にEP
Oのような異種タンパク質の生成を可能にさせるための、DNAフラグメントの
細胞への挿入を含む。組換えDNA技術により得られるタンパク質は、組換えタ
ンパク質と呼ばれる。
多細胞生物(すなわち植物、昆虫、哺乳動物および魚類)にもまた、取り込まれ
得るからである。
を使用して得られ得る; ・ゲノムDNAライブラリーからの単離。 ・DNA鎖のインビトロ合成。比較的短いDNA鎖を合成する市販の装置は存在
し、これはインビトロでの遺伝子合成を可能にする。 ・増幅。遺伝子のようなDNAフラグメントを数倍に複製することを可能にする
技術。 ・その他、すなわち、mRNAから合成されるcDNAライブラリーより得られ
るようなもの。 ・目的の細胞においてタンパク質を発現するための活性なプロモーター ・転写が正確に終結されるような適切なターミネーター ・ベクター。プロモーターおよびターミネーターを有する遺伝子を、染色体中ま
たは染色体外のいずれかにこの遺伝子を取り込む目的の細胞の内側領域へ、指向
するプラスミドまたはウィルスのような遺伝子構造物。特定の場合において、こ
の取り込まれた遺伝子は、細胞内に無限大に残存し得、そしてその子孫に伝達さ
れ得るか、または比較的短期間で消失され得る。プラスミドおよび天然ウィルス
または改変されたウィルスのような多数のベクター系がある。細胞または核への
微量注入のようなDNA導入の物理的手段を使用することもまた可能である。ウ
ィルスおよびプラスミドは天然より得られ、そして所望する特性を達成するよう
にインビトロで遺伝子改変される。 ・その他。さらに、他の遺伝エレメントが、遺伝子を受け取る細胞の選択を改善
するために(すなわち、抗生物質に対する耐性を与える別の遺伝子)、または各
細胞における遺伝子のコピー数を増幅(遺伝子増幅)するために必要であり得る
。
可能な限り単純であるべきである。基礎的な考察では、遺伝子の単純性は、生成
されるタンパク質産物の生産性または質を軽視すべきでない。
ベクターによって宿主細胞中にトランスフェクトされる。トランスフェクトは、
利用可能な他の技術の中でもエレクトロポレーション、リン酸カルシウムでの沈
殿、およびリポソームの使用のような、異なる技術によってなされ得る。
in))に対する、または毒物(例えば、メトトレキサート(MTX))に対す
る耐性を付与することが既知の他の遺伝子に結合し得る。すなわち、この結合は
、安定な様式によりトランスフェクトされた細胞の選択を可能にし、選択された
細胞は、目的の遺伝子を子孫へ複製および伝達することが可能である。結合はま
た、目的のタンパク質の最も高い発現レベルを示している組換え細胞を選択する
ことを可能にする。
その分子量、アミノ酸配列および生物学的活性により同定される。
は、70年代初期に最初に発達し、そして後に、強烈および広範に利用された。
さらに詳細には、EPO産生のためにここで利用したこの遺伝子工学技術は以下
を含む。 1.非コード領域のフラグメントを含むEPO遺伝子の使用は、最初の翻訳AT
Gの5’およびこの遺伝子の終止コドンの3’に位置している。この遺伝子の非
コード領域中に位置している発現制御エレメントの存在は、EPOの高産生を達
成するために必要であると従来考えられている。米国特許第5,688,679
号(Powell)を参照のこと。 2.異種プロモーターを有する発現ベクターの使用は、プロモーターの組み合わ
せがより高いEPO産生を誘導するという仮定に基づいた。現在まで、ベクター
に含まれる1つのみのプロモーターの使用は、低いレベルのタンパク質の発現を
生じてきた。米国特許第4,703,008号(Lin)、米国特許第4,67
7,195号(Hewickら)、および米国特許第5,688,679号(P
owell)を参照のこと。1つのみのプロモーターを使用するEPOの平均的
な産生は、200μg/l/日である。1つのみのプロモーターを使用して報告
されたEPOの最大の産生は、10mg/l/日である。 3.遺伝子系の潜在的な不安定性は、利用した遺伝子の構築物の複雑性に起因す
る。
NAをヒト白血球から抽出する。EPOコード遺伝子は、単離したゲノムDNA
から得られる。これを達成するために、この遺伝子は、EPO遺伝子の5’およ
び3’非コード領域の存在を妨げるために適切なプライマーを使用して増幅され
る。これらのプライマーは、さらにクローニングを容易にするために単離した遺
伝子の両方の末端に残存する、プライマーの5’末端に制限部位を含む。
れる。一旦、得られた配列が確認されれば、この遺伝子をSV40初期プロモー
ターおよびそれのターミネーターのみを保持している真核生物細胞のための発現
ベクターのXhoI−HindIII部位へクローン化した。このベクターは、
ジェネチシンおよびアンピシリンに対する耐性を付与する。
のEPO発現ベクターおよび2)メトトレキサートに対する耐性を付与するベク
ター。安定にトランスフェクトされたEPO産生細胞は、ジェネチシンに対する
それらの耐性により選択される。EPO発現のレベルは、メトトレキサートの増
加する濃度に耐性である増幅した細胞の選択によりモニターされる。
ルにより選択される。最も産生力を有するクローンの培養上清を使用し、SDS
−PAGE、ウエスタンブロット、グリカナーゼ処理後のSDS−PAGE、等
電点電気泳動法および完全なタンパク質配列分析により産生したEPOの同一性
を試験する。産生したEPOのインビボでの生物学的活性は、EPO基準のため
の国際基準を参照して、ex−hypoxic polycythemicマウ
スアッセイにより決定される。
遺伝的に加工された宿主細胞、および組換え技術によるEPOポリペプチドまた
はその一部分の産生に関する。
ン、伝播媒介、接合、エレクトロポレーションおよび形質転換)を使用して宿主
細胞へ導入され得る。例えば、このベクターは、ファージベクター、プラスミド
ベクター、ウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターであり得る。
に連結され得る。一般に、プラスミドベクターは、沈降物(例えば、リン酸カル
シウム沈降物)の状態、または荷電脂質との複合体の状態で導入される。このベ
クターがウイルスである場合、それは、インビトロで適当なパッケージング細胞
株を使用してパッケージされ得、次いで宿主細胞へ形質導入され得る。
適当なトランス作用性因子は、宿主への導入の際に宿主によって供給され得るか
、補足しているベクターにより供給され得るか、またはベクターそれ自体により
供給され得る。
現のために提供され、この発現は、誘導可能および/または細胞型特異的であり
得る。特に、このようなベクターのうち好ましいのは、操作(例えば、温度およ
び栄養添加剤)することが容易である、環境因子により誘導可能なベクターであ
る。
クター、エピソーム誘導ベクター、およびウイルス誘導ベクター(例えば、細菌
プラスミド、バクテリオファージ、酵母エピソーム、酵母染色体エレメント、ウ
イルス(例えば、バキュロウイルス、パポバウイルス、ワクシニアウイルス、ア
デノウイルス、禽痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルス)由来ベク
ター、およびそれらの組み合わせ由来ベクター(例えば、コスミドおよびファー
ジミド))。
ァージλPLプロモーター、E.coli lac,trpおよびtacプロモ
ーター、SV40初期および後期プロモーターならびにレトロウイルスLTRの
プロモーター)へ作動可能に連結されるはずである。他の安定なプロモーターは
、当業者に公知である。発現構築物はさらに、転写開始部位、終止部位および転
写領域中に翻訳のためのリボソーム結合部位を含み得る。この構築物によって発
現された成熟転写物のコード部分は、始めに翻訳開始コドン(AUGまたはGU
G)および翻訳されるべきポリペプチドの末端に適切に位置付けられた終止コド
ンを含む。
マーカーを含む。より好ましくは、2つの発現ベクターは全部で2つのマーカー
を含む。このようなマーカーは、メトトレキサート、ジヒドロ葉酸還元酵素また
はネオマイシン耐性を含む。好ましいベクターは、メトトレキサートおよびネオ
マイシン誘導抗生物質(例えば、ジェネチシン)に対して耐性を付与する。
eLaを含む哺乳動物細胞である。好ましい宿主細胞は、CHO細胞である。上
記宿主細胞について適切な培養培地および条件は、当該分野で公知である。
で培養することである。詳細には、そのような培養は、本発明の宿主細胞から、
EPOおよびインスリンを含む上清を分離し、その上清を濃縮し、そしてその濃
縮した産物を凍結することを含む。好ましくは、培養培地は、培養培地1リット
ル当たり0.5mgと20mgとの間のインスリンを含む。
能なpWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1およびpSG;なら
びにPharmaciaから入手可能なpSVK3、pBPV、pMSGおよび
pSVLである。他の適切なベクターは、当業者に容易に明らかである。
クターは、マウスのジヒドロ葉酸レダクターゼ(dehydrofolate
reductase)(DHFR)をコードするDNAを含み、そのDNAの発
現は、SV40ウイルスの初期プロモーター、およびそのポリアデニル化シグナ
ルによって制御される。pVex1−EPOベクターは、配列番号1のEPOポ
リペプチドをコードするDNA、ネオマイシン誘導体化抗生物質に対する耐性を
付与する因子、SV40ウイルスの初期プロモーターおよびSV40ウイルスの
ポリアデニル化シグナルを含む。
期プロモーター、HSVチミジンキナーゼプロモーター、初期SV40プロモー
ターおよび後期SV40プロモーター、レトロウイスルLTRのプロモーター(
例えば、ラウス肉腫ウイルス(RSV)のプロモーター、およびメタロチオネイ
ンプロモーター(例えば、マウスメタロチオネインIプロモーター)を含む。特
に好ましいプロモーターは、ウイルス性SV40初期プロモーターである。
AE−デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフ
ェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染または他の方法によって
もたらされ得る。そのような方法は、多くの標準的な実験室マニュアル(例えば
、Davisら「Basic Methods in Molecular B
iology」(1986))に記載されている。
シウムトランスフェクションによる方法である。
クターにエンハンサーを挿入することにより増加し得る。エンハンサーは、通常
、10から300bpの範囲の大きさのDNAのシス作用エレメントであり、こ
れは、所定の宿主細胞型において、プロモーターの転写活性を増加するために作
用する。エンハンサーの例としては、bp100〜270で複製開始点の後期側
に位置するSV40エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエン
ハンサー、複製開始点の後期側にあるポリオーマエンハンサー、およびアデノウ
イルスエンハンサーを含む。
ク質の分泌のために、適切な分泌シグナルが、発現されるポリペプチドの中に組
込まれ得る。このシグナルは、ポリペプチドに対して内因性であり得るかまたは
、このシグナルは異種シグナルであり得る。
得、そして分泌シグナルだけでなく、さらなる異種機能的領域もまた含み得る。
従って、例えば、さらなるアミノ酸(特に荷電アミノ酸)の領域が、ポリペプチ
ドのN末端に付加され、精製、または引き続く操作および保存のいずれかの間の
、宿主細胞における安定性および持続性を改善し得る。ペプチド部分はまた、精
製を容易にするためにポリペプチドに付加され得る。
、陰イオン交換クロマトグラフィーまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホ
スホセルロースクロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、アフ
ィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、
およびレクチンクロマトグラフィーを含む周知の方法によって、組換え細胞培養
物から回収および精製され得る。
下の工程の組合わせによってEPOを含む細胞培養上清を処理することを包含す
る:(a)示差的沈殿、(b)疎水的相互作用クロマトグラフィー、(c)ダイ
アフィルトレーション、(d)陰イオン交換クロマトグラフィー、(e)陽イオ
ン交換クロマトグラフィーおよび(f)分子排除クロマトグラフィー。好ましく
は、これらの工程は以下の順番で行われる:(a)、(b)、(c)、(d)、
(e)、および(f)。
のために、ヒトに注射するのに適切な形態への凍結乾燥を含む。詳細には、好ま
しい凍結乾燥手順は、以下を包含する:薬学的組成物中にEPOを置く工程、第
1のEPO組成物を容器中にロードする工程であって、ここでこの容器は−30
℃またはそれ未満の温度である、工程;大気圧下で4時間またはそれより長い時
間、このEPO組成物を−30℃またはそれ未満の温度でインキュベートする工
程;この組成物を、30絶対ミクロンかまたはそれ未満の圧力で、一時間かそれ
より長い時間インキュベートする工程;および、圧力値を5絶対ミクロンかそれ
未満に保ちつつ、少なくとも25℃に達するまで、一時間当たり3℃かそれ未満
の温度を上昇させる工程。
ミンを含む。凍結乾燥のために特に好ましい組成物は、EPO、マンニトール、
NaCl、NaH2PO4およびNa2HPO4・12H2Oを含む。
ng Erythropoietins」、米国特許第4,703,008号(
本明細書中に参考として援用される)からのEPO核酸分子、およびその改変体
を含むベクターを含み得る。改変体は、天然の対立遺伝子改変体のように天然に
存在し得る。「対立遺伝子改変体」は、生物の染色体上の所定の遺伝子座を占め
る遺伝子の、いくつかの改変形態の1つを意図する。Genes II、Lew
in、編。天然に存在しない改変体は、当該分野で公知の変異誘発技術を用いて
産生され得る。
るものを含む。置換、欠失または付加は、1以上のヌクレオチドを含み得る。改
変体は、コード化領域または非コード化領域あるいはその両方で変えられ得る。
コード化領域内での変更は、保存的または非保存的なアミノ酸置換、アミノ酸欠
失またはアミノ酸付加を産生し得る。これらの中で特に好ましいのは、サイレン
ト(silent)置換、付加および欠失であり、これは、EPOタンパク質ま
たはその一部の特性および活性を変えない。この点に関して特に好ましいのはま
た、保存的置換である。最も非常に好ましいのは、配列番号1に示されるアミノ
酸配列を有するEPOタンパク質をコードする核酸分子である。
EPOポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または(b)(a)中のヌ
クレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列に、少なくとも90%同一性、より
好ましくは、少なくとも95%、97%、98%または99%同一性のヌクレオ
チド配列を有するポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を含む。
プチドをコードする核酸配列に少なくとも90%、95%、97%、98%、ま
たは99%同一である配列を有する多くの核酸分子は、「EPOタンパク質活性
を有する」ポリペプチドをコードすることを認識する。実際に、これらのヌクレ
オチド配列の全ての各々の改変体およびあらゆる縮重改変体が同一のポリペプチ
ドをコードするので、これは当業者には明らかである。当該分野において、縮重
改変体ではないこのような核酸分子について、妥当な数もまたEPO活性を有す
るポリペプチドをコードすることがさらに認識され得る。これは、当業者が、タ
ンパク質機能にほとんど有意には影響しそうにないまたは全く有意には影響しそ
うにないアミノ酸置換(例えば、1つの脂肪性アミノ酸と第二の脂肪性アミノ酸
との置換)に十分気づくからである。
導が、Bowie,J.U.ら「Deciphering the Messa
ge in Protein Sequences:Tolerance to
Amino Acid Substitutions」、Science 2
47:1306−1310(1990)に提供され、ここで、著者は、アミノ酸
配列の寛容性を変化する研究に関する2つの主要なアプローチが存在することを
示す。第一の方法は、変異が天然の選択によって受け入れられるか拒絶されるか
のいずれかである進化のプロセスに依存する。第二のアプローチは、クローン化
した遺伝子の特定の位置におけるアミノ酸変化を導入する遺伝子工学を用い、そ
して機能性を保存する配列を同定するために選択またはスクリーニングする。著
者が述べるには、これらの研究は、タンパク質がアミノ酸置換に意外にも寛容性
であることを明らかにした。著者はさらに、アミノ酸変化がタンパク質の特定の
位置において許容性であるようであることを示す。例えば、ほとんどの埋没アミ
ノ酸残基が非極性の側鎖を必要とするのに対して、表面側鎖のわずかな特徴が、
一般的に補存される。他のこのような表現型的にサイレントな置換は、Bowi
e,J.U.、前出、およびその中に引用される参考文献に記載される。
0mM EDTA(pH8)を含む試験管に加えた。この血液を、5mlのアリ
コートで、0.3M サッカロース、10mM Tris−HCl(pH7.5
)、5mM MgCl2および1% Triton X 100を含む45ml
の溶液を加えた2つの50ml 試験管へ移した。
0 gで10分間遠心分離した。上清を捨て、そしてペレットを0.025M
EDTA(pH8)を含む0.075M NaCl溶液で数回リンスし、続いて
4℃で1,000 gで10分間遠心分離した。
(pH8)、400mM NaCl、2mM EDTA(pH8)溶液中に再懸
濁した。次いで、200μlの10% SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)およ
び500μl Kプロテイナーゼ(1% SDSおよび2mM EDTA pH
8中に1mg/ml)を加え、そしてこの溶液を37℃で一晩インキュベートし
た。各々の試験管への1mlのNaCl飽和溶液の添加後、ゲノムDNAを含む
溶液を、2,500 gで15分間遠心分離した。
。この試験管を転倒混和によって静かに混合し、DNA沈殿が形成されるまで室
温で保存した。次いでゲノムDNAをカギ端のパスツール(hook−end
Pasteur)ガラスピペットを用いて回収した。
、上清を捨て、そして沈殿を乾燥した。乾燥後、沈殿を500μlのTE緩衝液
(10mM Tris−HCl pH8−1mM EDTA)中に溶解した。
することによって計算した。50μgのゲノムDNAが1ODユニットに等価で
あると仮定した。1μlのTE緩衝液あたり500μgのゲノムDNAを含む溶
液を調製した。
ら調製した。以下のものを、0.5mlの試験管に置かれた、実施例1に由来す
る1μlの溶液に添加した:400ngのEPO1プライマーおよびEPO2プ
ライマーの各々、2.5mMの各々のデオキシヌクレオチド(dATP、dCT
P、dGTPおよびdTTP)水溶液、ならびに、製造業者によって推奨される
緩衝液を用いた100lの最終容量における、2.5ユニットのTaq DNA
ポリメラーゼ(Perkin Elmer)。熱サイクラーを用いて、そして、
30サイクル:93℃で1分間、55℃で1分間、および72℃で3分間にプロ
グラムした。この反応から、EPO遺伝子を含む約2,170塩基対のDNAフ
ラグメントを得た。
G3’(配列番号2)。このプライマーは、最初の塩基に対応し、そしてこの塩
基は、XhoI酵素の認識部位、および5’末端のEcoRI酵素の別の認識部
位とともに、EPO遺伝子から翻訳された。これらの部位を、引き続くクローニ
ング工程に用いた。
’(配列番号3)。このプライマーは、EPO遺伝子の最後に翻訳された塩基、
および停止コドンに対して相補的である。HindIII酵素の認識部位を、プ
ライマーの3’末端に付加した。この部位を、引き続くクローニング工程に用い
た。
。クローニングに利用した制限部位の配列を、太字のイタリックで示す。1つを
超えるコドンが、同一のアミノ酸をコードし得、そして結果として、EPOタン
パク質は、異なるmRNA鋳型(異なるヌクレオチド配列を有するが、それにも
かかわらず、EPOをコードする)から翻訳され得たことに注意しなければなら
ない。
した。DNA末端を、標準的な分子生物学技術に従って、DNAポリメラーゼク
レノウフラグメントを用いた処理によって平滑末端化し、そしてM13mp18
ベクターのSmaI部位にクローニングした。得られた組み換えプラスミドを、
XhoI酵素およびHindIII酵素を用いて切断した。挿入物の存在を、臭
化エチジウムを用いて染色した0.8%アガロースゲル中の制限フラグメントの
電気泳動により、確認した。陽性のクローン(2つのバンド、一方は約2,20
0塩基対を有し、そしてもう一方は、線状化されたベクターに対応する)を、選
択した。挿入されたEPO遺伝子を、T7配列決定キット(Pharmacia
)を用いて、Sangerの技術に従って、配列決定した。EPO遺伝子のいく
つかの領域を、自動370A Applied Biosystems Int
ernational配列決定装置を用いて、さらに配列決定した。各々の配列
決定システムについては、製造業者に推奨されるプロトコルに従った。
は、以下から構成される: a. E.coliにおけるベクターの増幅および選択のために、細菌の複製
起点を有し、そして、アンピシリンに対する耐性を与える、細菌性pBR322
ベクターのフラグメント。
は、このエレメントから3’にクローニングされた遺伝子の発現を可能にした。
ローニング部位が続き、これは、発現されるべき遺伝子の挿入を可能にした。
、これは、c)においてクローニングされた遺伝子の特異的な転写物の適切なポ
リアデニル化を可能にした。
ナルを有するネオマイシンホスホトランスフェラーゼをコードする遺伝子が続く
。これらのエレメントは、ネオマイシンおよびネオマイシンから誘導された抗生
物質(例えば、ジェネティシン)の使用を通して、安定にトランスフェクトされ
た細胞の選択を可能にした。e)の3’末端を、a)の5’末端に連結する。
Sammlung von Mikroorganismen und Ze
llkulturen GmbH,Mascheroder Weg1b,D−
38124 Braunschweig,Germanyに寄託し、そして登録
番号DSM12776が与えられた。
性を与える。このベクターは、マウスジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)を
コードするcDNAを包含し、このDHFRの発現レベルは、SV40ウイルス
初期プロモーターおよびそのポリアデニル化シグナルによって制御される。pV
ex1−EPO(実施例5を参照のこと)ベクターを用いて獲得されたEPO発
現レベルは、増加した濃度のメトトレキセート(MTX)を含む培養培地中での
、DHFRおよびEPO遺伝子の増幅によって、数倍に増強される。
he Sammlung von Mikroorganismen und
Zellkulturen GmbH,Mascheroder Weg1b,
D−38124 Braunschweig,Germanyに寄託し、そして
登録番号DSM12777が与えられた。
p18クローンを、Xho I−Hind III酵素で切断した。このように
して得られた、約2.2Kbのフラグメントを単離し、そしてpVex Iベク
ターの同じ制限部位を使用して、再びクローン化した。ポジティブなpVex−
EPOクローンを単離し、そして分析して、このEPOコード配列配列番号4は
クローン化する手順の間変化しないことが示された。
ene Cloning」、(Chapman & Hall,London,
England,1995);Watsonら、「Recombinant D
NA,第2版」、(Scientific American Books,N
ew York,New York,1992);Sambrookら、「Mo
lecular Cloning.A Laboratory Manual」
、(Cold Spring Harbor Laboratory Pres
s、1989);Bishopら、「Nucleic Acid and Pr
otein Sequence.A Practical Approach」
、(IRL Press,1987);Davisら、「Basic Meth
ods in Molecular Biology」、(Elsevier
Science Publishing Co.,New York,New
York,1986)を参照のこと。
(チャイニーズハムスター卵巣)細胞株を、MTXを用いた遺伝子の増幅を促進
するために使用した。全プロセスの間、細胞を、37℃、5%のCO2雰囲気中
で、増殖させた。
用いて、同時トランスフェクトした。これは以下の通りであった: (1)培養培地(10%のウシ胎仔血清を伴う、α−MEM)をトランスフェ
クションの4〜8時間前に新しい培地と置換した。
のNaClの500μL、35mMのNa2HPO4の10μlおよび35mMの
NaH2PO4溶液の10μlを5mlの試験管へ加えた。
μgの各々のトランスフェクトされるDNAベクター(pVex−EPOおよび
pDHFR)を有する溶液を加えた。500μlの最終の容量に到達するまで、
水を加えた。実施例2に記載のpDHFRプラスミドは、アンピシリン耐性であ
る、pBR322プラスミドに基づく。pDHFRプラスミドは、E.Coli
中で複製され得、そしてSV40の初期プロモーターとそのターミネーターとの
間でクローン化されたDHFR遺伝子を有する。pDHFRプラスミドは、CH
O細胞におけるDHFRタンパク質の発現を、コードする。このタンパク質は、
メトトレキセートに対する抵抗性を与え、それゆえ、高いエリスロポイエチン生
産性を示す細胞を選択するように使用され得る。
気泡を泡立てながら一滴ずつ加えて迅速な混合を得、そして局部濃度を最小にし
た。この方法は、この細胞によってより効果的に組み込まれる、DNAおよびリ
ン酸カルシウムを含む非常に小さな粒子の形成を促進した。
えた。
37℃、5%CO2雰囲気下、インキュベーター中で一晩放置した。
のNa2HPO4、0.24gのNaH2PO4、1リットルになるように水を加え
、そしてpHをHClで7.4へ調整した)で2回リンスした。新しい培養培地
を次いで加えた。
を用いた選択を、トランスフェクションの後、24時間で始めた。pVex−E
POプラスミドを組み込んだ細胞は、この抗生物質に抵抗し得、一方で、他の全
ては、25日後に死亡した。抵抗性コロニーを選択し、そしてそれらの生産性を
アッセイした。最も生産的な3つのクローンを、単離されたクローンから選択し
た。
0-6Mおよび10-5Mの濃度で、第2の選択試薬としてMTXを使用して、選択
を3つのクローンの各々に対して実行した。その目的のために、培養培地をヌク
レオチドを伴わない、10%の透析したウシ胎仔血清を補充したα−MEMに交
換した。以下のプロトコルに従って透析プロセスを実行することが必須である:
100mlの血清を3,000Daカットオフ(より高いカットオフを用いると
、増殖因子が失われ得、そしてこの細胞が増殖および繁殖し得ない)を有する透
析バッグ中に入れ、このバッグを密閉して閉じ、5リットルの2回蒸留した水を
有する容器中に完全に浸し、そして4℃で、12時間撹拌しないで放置した。こ
の工程の後、この水を捨て、そして交換し、このバッグを4℃でさらに12時間
放置した。次いでこの透析バッグを取り出し、そしてこの血清を回収した。より
短い期間の、より少ない容量を用いるまたは水の交換を伴わない透析は効果的で
ない。なぜなら、この血清中の任意のわずかなヌクレオチドが、MTX選択に悪
影響を与えるからである。他方では、より長い期間の透析もまた効果的でない。
なぜなら、細胞の増殖に必要ないくつかのタンパク質が沈降して、細胞の成熟を
妨げ得るからである。
クレオチドを伴わない、10%の透析したウシ胎仔血清を補充した新しいα−M
EM中で増殖させた。一旦増殖したら、培養の上清みを、EPOの生成および分
泌についてアッセイした。その目的のために、特異的イノムアッセイを使用した
。
培地のリットルを生成する、組換え宿主細胞のクローンの選択で、終了した。
Deutsche Sammlung von Mikroorganisme
nund Zellkulturen GmbH,Mascheroder W
eg 1b,D−38124 Braunschweig,Germanyに寄
託され、受託番号DSM ACC2397が与えられた。
した。得られたタンパク質の配列を、実施例9に記載の手順に従って同定した。
の検証) (1.細胞からのRNAの調製) 全RNAを、以下のプロトコルに従って、EPO産出細胞から調製した: コンフルエントの細胞を含む直径90mmのペトリ皿を、10mlのPBS緩
衝液で2回洗浄した。次いで、2mlのGTC緩衝液を添加し、そしてこの皿一
面に均等に分布させた。このGTC緩衝液は:50gのグアニジニウムチオシア
ネート;0.5gのN−ラウロイルサルコシン、2.5mlの1Mクエン酸ナト
リウム(pH7)、0.7mlのβ−メルカプトエタノール、0.33mlの3
0%消泡材(SIGMA)および100mlにするに足る水(pH7.0)、か
ら構成される。
5mlの試験管に移し、そして上記の工程を2mlのGTC緩衝液を使用しても
う1度繰り返した。
いで塩化セシウム勾配を行った。この目的のために、4mlの、CsClを含む
溶液(95.97gのCsClおよび2.5mlの1M酢酸ナトリウム、(pH
5.4)、そして体積が100mlに達するまで水を加えた)を超遠心分離試験
管に加えた。次いでこの溶液の上に、混合することなく、細胞のGTC懸濁液を
加えた。この試験管を次に、GTC緩衝液で満たし、そして20℃で20時間、
31,000rpmで超遠心分離した。
られたDNAは塩化セシウム勾配の中央にバンドを示した。上清を、DNAを完
全に除去するために廃棄した。RNA含有ペレットを5分間乾燥させ、次いで2
00μlの水に溶解し、そして1.5mlの試験管に移した。次いで200μl
の0.4M酢酸ナトリウム、(pH4.8)および2倍の体積のエタノールを加
え、この生じた溶液を完全に混合し、そして−80℃で30分間静置した。次い
でこの溶液を14,000rpmにて15分間微小遠心分離機で遠心分離し、上
清を廃棄し、そして沈殿を1mlの80%エタノールですすいだ。このペレット
を乾燥し、100μlの水に再溶解した。このRNA溶液の1:100希釈溶液
の濃度を、260nmで測定した(1OD単位が約40μgのRNAに相当する
)。使用された全ての溶液および要素にはRNaseが無かった。
た(cDNA Synthesis System Plus,Amersha
m−cat.RPN1256)。EPO 2が使用したプライマーであった。
クレオチドをそれぞれ400ng、適切な緩衝溶液中のデオキシヌクレオチドを
それぞれ2.5mM、および2.5単位のTaq DNAポリメラーゼを、全体
積100μlで使用して、増幅した。35回の増幅サイクルを、以下のように行
った:93℃で1分間、55℃で1分間そして72℃で1分間。
そしてその配列
の認識のための1つの部位である。Eco RI酵素認識部位を、次のクローニ
ング工程を容易にするために付加した。
mpI9ベクター中にクローニングした。Sangerの配列決定方法を使用し
て、完全な配列を得るために両方向で、インサートを配列決定した。
多くの非常に不明瞭な圧縮を生じる)のために、Taq DNAポリメラーゼを
使用する配列決定キットおよび修飾塩基を使用した。低い品質結果が得られたが
、圧縮は分離された。使用したキットは、Pharmacia−LKB Bio
technologyのGene aTaqであった。
、EPOのコードを示した。結果として、細胞においてクローニングされた遺伝
子およびその転写産物は、完全であり、その配列はEPOについて正確であるこ
とを見出した。
EPOを、種々の品質および同定アッセイを行うためにさらに精製した。
EPOは、30kDaを越える分子量の広いバンドとして同定された。図1を参
照のこと。このバンドは、EPOについて予想されたように、「ウェスタンブロ
ット」アッセイにおいて、ヒトEPOに対するモノクローナル抗体およびポリク
ローナル抗体によって認識された。図2を参照のこと。グリカナーゼによる処理
は、EPOについて予想されたように、範囲およびサイズにおいてグリコシド鎖
の存在を証明した。図3を参照のこと。産生されたEPOは、EPOについて予
想されたように、3.0から4.5の等電点の範囲の種のシリーズから構成され
ることが示された。図4を参照のこと。
ク質の完全なアミノ酸配列は、天然ヒトエリスロポイエチンと全くの相同性を示
した。天然ヒトエリスロポイエチンの165のアミノ酸配列は、以下の通り(配
列番号1)である:
水素構造、ならびに特に、EPOに特徴的なシアリン酸末端残基の存在が、証明
された。これらの結果は、産生されたタンパク質の生物学的活性アッセイ、国際
EPO標準と完全な一致を示した低酸素性多血症マウス試験によって、さらに支
持された。
たり培養培地1lにつき50mgEPOであった。
される。
が、本発明および添付の特許請求の範囲の真の範囲から逸脱することなく、形式
および詳細における多様な変化がなされ得るということが、本開示を読むことに
より当業者に理解される。
あるいは出願の放棄(lapsing)、拒絶あるいは取り下げ前において、発
明に対し利害関係を有さない当業者である対象者(skilled addre
ssee)に対してのみ行われる旨を、告知するものである(オーストラリア国
特許法第3.25(3)号規定)。
または放棄されて回復され得なくなるかもしくは取り下げられるまでは、特許庁
長官(Commissioner of Patents)により指名された独
立の専門家に対してのみ出願中で言及された寄託済みの生物学的材料のサンプル
の供与を許可する旨を請求する。
あるいは公開を経ずにデンマーク特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、デンマーク特許法第22条および第33条(3)に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりデンマーク特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、デンマーク特許庁により作成された公認専門家のリスト(list of
recognized experts)に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
Board of Patents and Registrations)に
より)公開に付されるかあるいは公開を経ずに特許および登録委員会による決定
を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を
、請求する。この旨の請求は、優先日から16ヶ月が経過するよりも前に、出願
人により国際事務局に対してなされるものとする(好ましくはPCT Appl
icant’s GuideのVolume Iのannex Zに複製された
書式PCT/RO/134による)。そのような請求が出願人によりなされた場
合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門
家を表示するものとする。専門家は、特許および登録委員会により作成された公
認専門家のリスト(list of recognized experts)
に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認され
た任意の者であり得る。
dic Patent Office)により)公開に付されるかあるいは公開
を経ずにアイスランド特許庁により最終的に決定を受けるまでは、サンプルの供
与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。
り下げあるいは放棄(lapsed)される日までは、特許法31F(1)の規
定に基づき、微生物は専門家へのサンプル供与の形でのみ行われる旨を、請求す
る。この旨の請求は、オランダ王国特許法の第22C条または第25条に基づき
出願が公に利用可能にされる日のうちいずれか早い方の日付よりも前に、出願人
によりオランダ工業所有権局に対して提出されるものとする。
あるいは公開を経ずにノルウェー特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、ノルウェー特許法第22条および第33条(3)に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりノルウェー特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、ノルウェー特許庁により作成された公認専門家のリスト(list of
recognized experts)に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
能にされる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための技術上の
準備が完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない
。
かあるいは公開を経ずにスウェーデン特許庁により最終的に決定を受けるまでは
、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。こ
の旨の請求は、優先日から16ヶ月が経過するよりも前に、出願人により国際事
務局に対してなされるものとする(好ましくはPCT Applicant’s
GuideのVolume Iのannex Zに複製された書式PCT/R
O/134による)。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者に
よるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するも
のとする。専門家は、スウェーデン特許庁により作成された公認専門家のリスト
(list of recognized experts)に記載された任意
の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり
得る。
能にされる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための技術上の
準備が完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない
。
あるいは出願の放棄(lapsing)、拒絶あるいは取り下げ前において、発
明に対し利害関係を有さない当業者である対象者(skilled addre
ssee)に対してのみ行われる旨を、告知するものである(オーストラリア国
特許法第3.25(3)号規定)。
または放棄されて回復され得なくなるかもしくは取り下げられるまでは、特許庁
長官(Commissioner of Patents)により指名された独
立の専門家に対してのみ出願中で言及された寄託済みの生物学的材料のサンプル
の供与を許可する旨を請求する。
あるいは公開を経ずにデンマーク特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、デンマーク特許法第22条および第33条(3)に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりデンマーク特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、デンマーク特許庁により作成された公認専門家のリスト(list of
recognized experts)に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
Board of Patents and Registrations)に
より)公開に付されるかあるいは公開を経ずに特許および登録委員会による決定
を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を
、請求する。この旨の請求は、優先日から16ヶ月が経過するよりも前に、出願
人により国際事務局に対してなされるものとする(好ましくはPCT Appl
icant’s GuideのVolume Iのannex Zに複製された
書式PCT/RO/134による)。そのような請求が出願人によりなされた場
合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門
家を表示するものとする。専門家は、特許および登録委員会により作成された公
認専門家のリスト(list of recognized experts)
に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認され
た任意の者であり得る。
dic Patent Office)により)公開に付されるかあるいは公開
を経ずにアイスランド特許庁により最終的に決定を受けるまでは、サンプルの供
与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。
り下げあるいは放棄(lapsed)される日までは、特許法31F(1)の規
定に基づき、微生物は専門家へのサンプル供与の形でのみ行われる旨を、請求す
る。この旨の請求は、オランダ王国特許法の第22C条または第25条に基づき
出願が公に利用可能にされる日のうちいずれか早い方の日付よりも前に、出願人
によりオランダ工業所有権局に対して提出されるものとする。
あるいは公開を経ずにノルウェー特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、ノルウェー特許法第22条および第33条(3)に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりノルウェー特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、ノルウェー特許庁により作成された公認専門家のリスト(list of
recognized experts)に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
能にされる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための技術上の
準備が完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない
。
かあるいは公開を経ずにスウェーデン特許庁により最終的に決定を受けるまでは
、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。こ
の旨の請求は、優先日から16ヶ月が経過するよりも前に、出願人により国際事
務局に対してなされるものとする(好ましくはPCT Applicant’s
GuideのVolume Iのannex Zに複製された書式PCT/R
O/134による)。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者に
よるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するも
のとする。専門家は、スウェーデン特許庁により作成された公認専門家のリスト
(list of recognized experts)に記載された任意
の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり
得る。
能にされる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための技術上の
準備が完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない
。
あるいは出願の放棄(lapsing)、拒絶あるいは取り下げ前において、発
明に対し利害関係を有さない当業者である対象者(skilled addre
ssee)に対してのみ行われる旨を、告知するものである(オーストラリア国
特許法第3.25(3)号規定)。
または放棄されて回復され得なくなるかもしくは取り下げられるまでは、特許庁
長官(Commissioner of Patents)により指名された独
立の専門家に対してのみ出願中で言及された寄託済みの生物学的材料のサンプル
の供与を許可する旨を請求する。
あるいは公開を経ずにデンマーク特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、デンマーク特許法第22条および第33条(3)に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりデンマーク特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、デンマーク特許庁により作成された公認専門家のリスト(list of
recognized experts)に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
Board of Patents and Registrations)に
より)公開に付されるかあるいは公開を経ずに特許および登録委員会による決定
を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を
、請求する。この旨の請求は、優先日から16ヶ月が経過するよりも前に、出願
人により国際事務局に対してなされるものとする(好ましくはPCT Appl
icant’s GuideのVolume Iのannex Zに複製された
書式PCT/RO/134による)。そのような請求が出願人によりなされた場
合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門
家を表示するものとする。専門家は、特許および登録委員会により作成された公
認専門家のリスト(list of recognized experts)
に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認され
た任意の者であり得る。
dic Patent Office)により)公開に付されるかあるいは公開
を経ずにアイスランド特許庁により最終的に決定を受けるまでは、サンプルの供
与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。
り下げあるいは放棄(lapsed)される日までは、特許法31F(1)の規
定に基づき、微生物は専門家へのサンプル供与の形でのみ行われる旨を、請求す
る。この旨の請求は、オランダ王国特許法の第22C条または第25条に基づき
出願が公に利用可能にされる日のうちいずれか早い方の日付よりも前に、出願人
によりオランダ工業所有権局に対して提出されるものとする。
あるいは公開を経ずにノルウェー特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、ノルウェー特許法第22条および第33条(3)に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりノルウェー特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、ノルウェー特許庁により作成された公認専門家のリスト(list of
recognized experts)に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
能にされる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための技術上の
準備が完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない
。
かあるいは公開を経ずにスウェーデン特許庁により最終的に決定を受けるまでは
、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。こ
の旨の請求は、優先日から16ヶ月が経過するよりも前に、出願人により国際事
務局に対してなされるものとする(好ましくはPCT Applicant’s
GuideのVolume Iのannex Zに複製された書式PCT/R
O/134による)。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者に
よるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するも
のとする。専門家は、スウェーデン特許庁により作成された公認専門家のリスト
(list of recognized experts)に記載された任意
の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり
得る。
能にされる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための技術上の
準備が完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない
。
リルアミドゲル(SDS−PAGE)分析を図示する。レーン1、4、および7
には、分子量マーカーがロードされた。レーン2、3、5および6には、本願発
明の手順に従って得られた、異なる量の純粋なEPOが電気泳動された。得られ
た生成物の純度および30kDaを超える見かけの分子量は、はっきりと観測さ
れ得るように、尿中のヒトEPOについて報告されたものと同時に起こる。
ト分析を図示する。産生されたEPOの同一性は、ヒトEPOに対するモノクロ
ナール抗体によってそれが認識されたことによって評価された。レーン1および
2には、それぞれ標準ヒトEPOおよび分子量マーカーがロードされた。本願発
明の方法に従って得られたEPOサンプルは、レーン3〜5にロードされた。
にグリカナーゼ(glycanase)で処理した純粋なEPOサンプルのSD
S−PAGE分析を示す。分子量マーカーがレーン1、4および8にロードされ
た。レーン2および7は未処理EPOに対応する。レーン3には、O−グリカナ
ーゼ処理されたEPOがロードされ;O−グリコシル化部位の存在が検証された
。レーン5には、部分的にがN−グリカナーゼで消化されたEPOがロードされ
た。EPOと予想された分子量を有する3つのN−グリコシル化された分子の存
在が検証され得る。レーン6には、Nーグリカナーゼで消化されたEPOがロー
ドされ、そして全てが脱グリコシル化されたタンパク質と予想される分子量が観
察された。
電点の調査を図示する。EPOサンプルはレーン2、3および4で、等電点マー
カーはレーン1および5で電気泳動された。EPOに対応するイソ型の存在が検
証され、3.0から4.5の範囲の等電点を示す。
Claims (14)
- 【請求項1】 ベクターを含む宿主細胞であって、該ベクターは、以下: (a) 配列番号1のアミノ酸配列からなる、エリスロポイエチンポリペプチド
をコードする、ヌクレオチド配列 (b) ウィルスプロモーター;および (c) ウィルスターミネーター を含む、宿主細胞。 - 【請求項2】 DSM ACC2397として寄託される、宿主細胞。
- 【請求項3】 前記ウィルスプロモーターおよびウィルスターミネーターが
SV40ウィルスの初期プロモーターおよびターミネーターを含む、請求項1に
記載の宿主細胞。 - 【請求項4】 前記ベクターがpVex1を含む、請求項1に記載の宿主細
胞。 - 【請求項5】 pDHFRベクターをさらに含む、請求項1に記載の宿主細
胞。 - 【請求項6】 前記宿主細胞がネオマイシン誘導抗体およびメトトレキサー
トに対して耐性である、請求項4に記載の宿主細胞。 - 【請求項7】 前記宿主細胞が哺乳動物細胞である、請求項1に記載の宿主
細胞。 - 【請求項8】 前記哺乳動物細胞がCHO、COS、BHK、Namalw
a、HeLa、Hep3B、Heo−G2または他の哺乳動物細胞を含む群から
選択される、請求項7に記載の宿主細胞。 - 【請求項9】 前記宿主細胞がCHOまたはCOS細胞を含む、請求項1に
記載の宿主細胞。 - 【請求項10】 前記宿主細胞がCHO細胞を含む、請求項1に記載の宿主
細胞。 - 【請求項11】 EPOポリペプチドを生産するための方法であって、該ポ
リペプチドが発現かつ回収される条件下で請求項1に記載の宿主細胞を培養する
工程を包含する方法。 - 【請求項12】 前記条件がメトトレキサートへの曝露を含む、請求項11
に記載の方法。 - 【請求項13】 前記培養が一日当たりの培養培地1リットル当たり50m
gより多くのEPOを生産する、請求項9に記載の方法。 - 【請求項14】 前記ヌクレオチド配列がヒト白血球から得られる、請求項
1に記載の宿主細胞。
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