JPS62501010A - エリトロポエチンの生産方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 αｅ　前記１１ｉｆｆ　！Ａ動物細胞はＣＩＯ細胞である請求の範囲第１５項記 載の細胞株。

ｔ１７）請求の範囲第１５項記載の細胞株の制御されたｉｎ　ｖｉｔｒｃ＋増殖 により生産された生物学的に活性なヒトエリトロポエチン。

α急　実質的に第３表に示すアミノ酸配列１−１６６をコードするＤＮＡ　配列 を含むＱ　ＤＮＡ配列。

ａｌ　実質的に第３表に示すアミノ酸リーダー配列ＭＥＴ　ＧＬＹ・・・・・Ｌ ＥＵ　ＧＬＹ　ｔ−コードするＤＮＡ配列をさらに含む請求の範囲第１８項記載 のｃＤＮＡ配列。

■　異種プロモーターおよび請求の範囲第１８項１たは第１９項記載のｃＤＮＡ 配列を含む組換えＤＮＡベクター。

（２、特許請求の範囲＠２０項記載のベクターで形質転換された微生物ま九は細 胞株。

の　大腸菌（Ｅ、　ｃｏ１１人酵母、哺乳動物細胞または昆虫細胞から選択され る請求の範囲第２１項記載の微生物または細胞株。

（至）前記呵乳動物細胞は３Ｔ３．０１２７　またはＣＨＯ細胞である請求の範 囲第２２項記載の微生物または細胞株。

（２）ウシ乳頭腫ウィルスＤＮＡおよびＥＰＯをコードするＤＮＡ配列を含む哺 乳動物細胞。

０つ　前記細胞は０１２７′ｔたは３Ｔ３細胞である請求の範囲第２４項記載の 細胞。

Ｉ２０　前記ＥＰＯＤＮＡはマウスメタロチオネインプロモーターの転写制御下 にある請求の範囲第２５項記載の細胞。

（５）前記細胞はｐａＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ　（３４２−１２）由来のＤＮＡを 含むプラスミドを有する請求の範囲第２５項記載の細胞。

＠　約２０ＱＯＯＯ単位／■（タンパク質）以上の比活性を有する請求の範囲第 ３項または第４項記載の方法により生産されたエリトロポエチン。

■　約２７”ｈｏｏＯ単位／ｍｙ（タンパク質）以上の比活性を有する請求の範 囲第２８項記載のエリトロポエチン。

（７）約２７へ０００〜３ｆ３ＱＯＯＯ単位／■（タンパク質）の範囲の比活性 を有する請求の範囲第３項または第４項記載の方法によシ生産されたエリトロポ エチン。

Ｃ３１）　Ｏ−結合グリコシル化の存在によりさらに特徴づけられる請求の範囲 第２８．２９または３０項記載のエリトロポエチンＯ ０り　培地が胎児血清を含んでいることを特徴とする請求の範囲第２または３項 記載の方法。

（至）宿主細胞が哺乳動物細胞であることを特徴とする請求の範囲第３２項記載 の方法。

０・Ｉ）哺乳動物宿主細胞がＣＯ８，ＣＨＯ，Ｃ１２７または３Ｔ３　細胞であ ることを特徴とする請求の範囲第３３項記載の方法。

Ｃ３５１請求の範囲第３２〜３４項記載の方法で製造された生物学的に活性なエ リトロポエチン。

明　細　書 エリトロポエチンの生産方法 発明の分野 本発明は１幅りほど高い発現レベルを示すヒトエＩＪ　ｌ−０ポエチンのクロー ン化遺伝子、その遺伝子の発現、および活性ヒトエリトロポエチンのｉｎ　ｖｉ ｔｒｏ生産に関する。

発明の背景 工１月・ロポエチ／（以後ＥＰＯと略す）は高等動物における赤血球の形成を促 進する循環性糖タンパク質である。例えば、を参照されたい。それゆえ、ＥＰＯ は赤血球形成促進因子とも呼ばルている。

ヒト赤血球の寿命は約１２０日間である。従って、全赤血球の約／１□０は細網 内皮系で毎日破壊される。同時に、比較的一定数の赤血球が常時赤血球レベルを 維持するために毎日生産さ１）、　５６−６０　、　Ｗ、Ｂ、５ａｕｎｄｅｒｓ 　Ｃｏ、、　フィラデルフィア（１９７６）を参照〕。

赤血球は骨髄中で赤芽球の成熟および分化によシ生産され。

ＥＰＯは比較的未分化の細胞に作用してそれらの細胞の赤血球への分化を誘起す る因子である（ガイトンの上記文献参照）。

ＥＰＯは貧血、特に腎性貧血の臨床治療のだめの有望な治療薬剤である。あいに （ＥＰＯの使用はその低い手に入れにくい利用可能性ゆえに実際上の医療面にお いてまだ普及していない。

ＥＰＯを治療薬剤として使用するためには、起こりうる抗原性の問題を考茗しな ければならないだろう。従って、ＥＰＯはヒト由来の原料から生産されるのが好 ましい。例えば、再生不良性貧血または同様の症状をもつ似者（大量のＥＰＯを 排出する）からのヒト血液もしくは尿が使用される。しかしながら、これらの原 料の供給は限られている。例えば、ホワイトＥＰＯ産物は一般に高いＥＰＯレベ ルを示す似者（例えば、再生不良性貧血や同様の症状をもつ似者）からの尿を濃 縮およびＨｌｌｌすることによシ製造される。例えば、米国特許第４３９７８４ ０号；同第４３０３６５０号；および同第れた供給量はＥＰＯの実際上の使用を 制限しておシ、こうして健康なヒトの尿からもＥＰＯ産物を得ることが非常に望 まれる。

健康なヒトから採取した尿を使用する際の１つの問題点は、その尿中のＥＰＯ含 有量が貧血、Ｉｌ！、者のそれと比較し２て低いということである。さらに、健 康なヒトの尿は赤血球形成に対して作用するいくつかの阻害因子を十分高濃度で 含んでいるために、満足のゆく治療効果は高度精製後に得られるＥＰＯに限られ るだろう。

ＥＰＯはまたヒツジの血漿から回収することができ、この種の血漿からのＥＰｏ を分離することにより満足すべき効力と安定な水溶性製剤が得られる。ゴールド バッサ−（Ｇｏｌｄｗａｓ日ｏｒ）しかしながら、ヒツジＥＰＯはヒトに対して 抗原性があると予測されるだろう。

こうして、ＥＰＯは有望な治療薬剤であるにもかかわらず、天然供給源に対して 使用される通常の単離／精製技術はこの化合物の大量生産にとって不十分なもの である。

スギモト（Ｓｕｇｉｍｏｔｏ　）らの米国特許第４３７７５１．３号明細書は、 Ｎａｍａｌｗａ　、ＢＡＬＬ−１，ＮＡＬＬ−１，’ＴＡＬＬ−１およびＪＢＬ を含めたヒトリンパ芽球細胞のｉｎ　ＶｉＶＯ増殖操作によるＥＰＯの大量生産 方法を開示している。

その他にも遺伝子工学技術を用いるＥＰＯの生産に関する報告が公表されている 。しかし、その生産技術詳細や、その生産物の化学的性質も未だに発表されてい ない。これとは対照的に、本発明はヒ）ＥＰＯの生物学的性質を示すタンパク質 の大量生産を可能にする技術を提供する。また、この種の技術により、オーセン ティックヒトＥＰＯと化学的に異なるかも知れないが類似の（いくつかの場合に は改良された）性質を示すタンパク質を生産することが可能となる。便宜上、ヒ ）ＥＰＯの生物学的性質を示すこの種のタンパク質は全て、たとえヒ）　Ｉｌｉ ：ＰＯと化学的に同一でなくても、以後ＥＰｏと呼ぶことにする。

発明の概要 本発明は、驚くほど高いレベルのヒ）　ＥＰＯを発現する遺伝子のクローニング 、その発現、およびそれからの活性ヒ）ＥＰＯのｉｎ　ｖｉｔｒｏ大量生産に関 する。ＥＰＯ生産用の適当な発現ベクター、発現細胞、精製法および関連方法も また開示される。

以下でより詳細に説明するように、ＥＰＯは部分精製された形で得られ、それを 均一になるまでさらに精製し、トリプシンで消化して特定の７２グメントを得た 。これらのフラグメントはＷＩ＃してそのアミノ酸配列を決定した。これらの配 列に基づいてＥＰＯオリゴヌクレオチドが考案され、そして合成された。

これらのオリゴを使用してヒトゲノムライブラリーをスクリーニングし、そのラ イブラリーからＥＰＯ遺伝子を単離した。

ＥＰＯ遺伝子はアミノ酸配列が決定されたトリプシン消化タンパク質フラグメン トの多くに対応するそのＤＮＡ配列に基づいて証明された。その後、ゲノムクロ ーンの一断片を使用して、ハイブリダイゼーションによシヒト胎児（２０週目） 　ｍＲＮＡ中のＥＰＯｍＲＮＡを検出できることが立証された。ヒト胎児肝臓ｃ ＤＮＡライブラリーを作成してスクリーニングした。３個のＥＰＯｃＤＮＡクロ ーンが７５ＱＯＯＯ以上の組換え体をスクリーニングした後に得られた。これら のクローンのうち２つが、完全なコーディング配列および実質的な５−プライム および３−プライム非翻訳配列から判断して全長であると決定された。

これらのｃＤＮＡは５Ｖ−４０ウィルスで形質転換したサル細胞（ＣＯ８−１細 胞株；グラズーｒ　７　（Ｇｌｕｚｍａｎ）　、　Ｃｅｘｘ　２３　：１７５− １８２（１９８１）　を参照〕およびチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ 細胞株；アーラウプ（Ｕｒｘａｕｂ、Ｇ、）　およびカーシン（Ｃｈａｓｉｎ、 Ｌ、Ａ、）のＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａａ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７７　：４２１ ６−４２８０（１９８０）を参照〕の両細胞内で発現させた。ＣＯ８細胞から生 産されたＥＰＯはｉｎ　ｖｉｔｒｏおよび１ｎｖ１四において生物学的に活性な ＥＰＯである。ＣＨＯ細胞から生産されたｇｐｏもまたｉｎ　ｖｉｔｒｏおよび ｉｎ　ｖｉｖｏにおいて生物学的に活性である。

Ｆｌ：ＰＯｃＤＮＡクローンはコーディング領域の２０〜３０ヌクレオチド上流 にイニシエーターおよびターミネータ−を有する１４〜１５アミノ酸の興味ある オープン・リーディング・フレームを有する。クローン化ＥＰＯ遺伝子でトラン スフェクションされた代表的な太ノ腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）サンプルはメリーラン ド州ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託され、 寄託番号ＡＴＣＣ４０１５３のもとに入手可能である。

図面の簡単な説明 第１表はと）ＥＰＯ遺伝子の８７塩基対のエクソンの塩基配列であり： 第１図はヒト胎児肝臓ｍ　ＲＮＡ中のＥＰＯｍＲＮＡの検出を示し；第２表はラ ムダ−ＨＥＰＯＦＬ　１３のヌクレオチド配列から推定されたＥＰＯタンパク質 のアミノ酸配列を示し；１ｉＩＥ　３表ハ５　ムｆ　−ＨＥＥＰＯＦ’Ｌ１３　 中ノＥＰＯｃＤＮＡノヌクレオｆド配列（第２図に模式的に示されている）およ びそれから推定されるアミノ酸配列を示し； 第３図は４個の独立したヒ）ＥＰＯゲノムクローンのＤＮＡ挿入物の相対位置を 示し； 第４図はヒトＥＰＯ遺伝子の想定上のイントロンおよびエクソン構造の地図を示 し； 第４表は第４Ｂ図に示すＥＰＯ遺伝子のＤＮＡ　配列を示し；第５Ａ、５Ｂおよ び５０図はベクター９１０２３（至）の作成を示し； 第６図は天然ＥＰＯと比較したときのｃｏｓ−１細胞で生産されたＥＰＯの５Ｄ Ｓ４リアクリルアミドゲル分析を示し：第５表はＥＰＯクローン、ラムダ−１（ ＥＰＯＦＬ　６のヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示し； 第６表はＥＰＯり日−ン、ラムダ−ＨＥＰＯＦＬ　８のヌクレオチド配列とアミ ノ酸配列を示し； 第７表はＥＰＯクローン、ラムダ−ＨＥＰＯＦＬ１３　のヌクレオチド配列とア ミノ酸配列を示し； 第７因はシラスミドｐＲＫニー４の模式図であシ；そして第８図はプラスミドｐ ｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ　（３４２−１２）模式図本発明はＥＰＯ遺伝子のクロ ーニングおよびそれらの遺伝子のｉｎ　ＶｉｔｒＯ発現によるＥＰＯの生産に関 する。

特許および科学文献は組換え産物の生産に有用であると報告された多くの方法を 包含している。一般に、これらの技術は目的とする遺伝子配列の単離または合成 、ならびに原核細胞または真核細胞内でのその遺伝子配列の発現（習熟した技術 者に通常利用可能な技法を使用する）をともなう。ひとたび所定の遺伝子が単離 され、精製され、トランスファーベクター内に挿入される（すなわちクローン化 される）と、実質的な量の入手可能性が保証される。そのクローン化遺伝子を有 するベクターは適当な微生物または細胞株、例えば細菌、酵母、　Ｃ０８−１（ サル腎臓）やＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）のような咄乳動物細胞、昆 虫細胞株などに移入され、その場合微生物や細胞株が増殖するにつれてベクター が複製し、それらの微生物や細胞株から慣用方法でベクターを単離することがで きる。従って、その後の遺伝子操作、修飾および他のベクターまたは同じベクタ ー内の別の位置への導入のだめの連続的に再生しうる遺伝子源が提供される。

たいていの場合発現はクローン化された遺伝子を方向およびリーディングフレー ムを正しく合わせて発現ベクターの適当な部位に挿入して行なわれる。原核生物 あるいは真核生物の遺伝子の翻訳工程を経てクローン化された遺伝子にメチオニ ンがついた蛋白前７更体とか原核生物遺伝子おるいは真核生物遺伝子のアミノ末 端配列を有する蛋白前駆体が合成される。他の場合には、転写および翻訳開始の だめのシグナルがクローン化遺伝子の適当なゲノムフラグメントにより供給され る。タンパク質前駆体が生産される場合には、いろいろな特異的タンパク質切断 技法を用いてそのタンパク質前駆体を意図する箇所で切断し、それにより目的の アミノ酸配列を放出させ、その後それを慣用方法で精製することができる。いく つかの場合には、目的のアミノ酸配列を含むタンパク質を特異的切断技法を必要 とせずに生産させ、さらに細胞から細胞外の増殖培地中へ放出させることもでき る。

ヒ）ＥＰＯは以下で説明するように再生不良性貧血に悩むＷ者の尿から均一に精 製された。この精！！ＥＰＯをタンパク質分解酵素トリプシンで完全消化してフ ラグメントを得、これらのフラグメントを逆相晶性能液体り［１マドグラフイー で分離し、勾配画分から回収し、そして微量アミノ酸配列分析法にかけた。

トリプシン消化フラグメントのアミノ酸配列は第２表および第３表において下線 が施されており、以下でさらに詳しく論じる。

オリゴヌクレオチドプローブのデザイン用に２つのアミノ酸配列、すなわちＶａ ｌ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−ＬｙｓおよびＶａｌ−Ｔｙｒ− ３ｏｒ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ＝Ａｒｇが選ばれた（前者ノドリゾシン消化フ ラグメントからは１７ヌクレオチド長の３２種類のオリゴヌクレオチドプールと １８ヌクレオチド長の１２８種類のオリゴヌクレオチドプール、および後者のト リプシン消化フラグメントからは１４ヌクレオチド長の各々４８種類の２つのプ ールがそれぞれ得られた）。３２種類の１７　ｍａｒプールを使用１、、てＣｈ ４Ａベクター（２２中のヒトゲノムＤＮＡ　ライブラリーをスクリーニングし、 スクリーニング用のフィルターを調製する際にはウー（Ｗｏｏ）およびオマレー （０’Ｍａｌ’１ｅｙ）のｉｎ　Ｌ３ｉｔｕ増暢法（４７）の変法を使用した。

ここで使用する（１１から同までの括弧内のアラビア数字は、本明細書の終わり に番号順に掲載した刊行物を意味する。

１７　ｍａｒとハイブリダイズするファージを採取し、小さなグループにプール レ、そしてプローブとして７４　ｍａｒ　および１８ｍａｒプールを使用してさ らに検索した。１７　Ｉｏｏｒ、および１４ｍθｒゾールとハイブリダイズする ファージをプラーク精製し、フラグメントはサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）およびク ールソ７　（Ｃｏｕｌｓｏｎ）のジデオキシ・チェイン・ターミネークヨン法＊ ３）（ｔｃ＋７７）Ｋよる塩基配列決定のために１．１１１３ベクター内でサブ クローニングした。３２種類の１７ｍθｒとハイブリダイズする１つのクローン 中の領域の塩基配列を第１表に示す。このＤＮＡ配列は。

オープン・リーディング・フレーム内に１７ｍａｒプールのオリゴヌクレオチド を推論するのに使用したトリプシン消化フラグメントを正確にコードレうるヌク レオチドを含んでいた。さらに、このＤＮＡ配列の分析は、１７ｍａｒとハイブ リダイズする領域がスズライス受容部位と供与部位によって境界される８　７　 ｂｐのエクンン内に含まれることを示した。

これらの２つのクローン（本明細書中ではラムダ−Ｈｇｐｏ　１およびラムダ− ＨＥＰＯ２と呼ぶ）がＥＰＯゲノムクローンであるというポジティブな確認は、 その他のトリプシン消化フラグメントのコーディング情報を含む別のエクンンの 塩基配列を決定することによシ得られた。

ＥＰＯｃＤＮＡクローンの単離 ヒト胎児（２０週目）肝臓ｍＲＮＡのノザン分析印は、第１表に示す８７ｂｐ工 クソン部分を含むＭ１３クローンから調製した９５ヌクレオチド一本領ゾロープ を用いて行った。第１図に示すように、強いシグナルが胎児肝臓ｍＲＮＡ中に検 出された。

このバンドがＥＰＯｍＲＮＡであるという正確な同定は、同じプローブを使って 胎児肝ＨｍＲＮＡのバクテリオファージラムダｃＤＮＡライズラリ−をスクリー ニングすることによシ達成されたＱツ。スクリーニングした２５ＱＯＯＯ個の組 換え体当たシ約１個の陽性クローンの頻度で、数個のハイブリダイズするクロー ンが得られた。これらのクローン（ラムダ−ＨＥＰＯＦ’Ｌ１３　およびラムダ −ＨＥＰＯＦＬｓ　）の完全なヌクレオチド配列および推定上のアミノ酸配列は 第５表と第６表に示す。ＥＰＯコーディング情報は非常に疎水性の２７個のアミ ノ酸からなるリーダーと１６６個のアミノ酸からなる成熟タンパク質を含むｃＤ ＮＡの５−プライム側半分の５９４ヌクレオチド内に含まれる。

成熟タンパク質のＮ末端の同定は、ゴールドバッサ−（Ｇｏｌｄｗａｓｓｅｒ） 　（２Ｇ＋、スー（Ｓｕｅ）およびシトコフス午−（ＳｙｔｋＯＷ８ｋｉ　）　 ＠　、およびヤナガワ（Ｙａｎａｇａｗａ）　（２υによシ発表された、または 本明細書（第１表）に示された再生不良性貧血似者の尿中に***されたタンパク 質のＮ末端配列に基づいた。

このＮ末端（Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ　”りが循環中のＥＰＯに見られ る実際のＮ末端であるのかどうか、または腎臓や尿中でいくつかの切断が起こる のかどうか今のところ不明である。

第２表および第３表で下線を施したアミノ酸配列は、タンパク質配列情報が得ら れたトリプシン消化フラグメントまたはＮ末端の部分を示す。推定されたアミノ 酸配列はアミノ酸配列が決定されたトリプシン消化７ラダメントと正確に一致し 、単離された遺伝子はヒトＥＰ○をコードすることが確かめられた。

ヒ）ＥＰＯ遺伝子の構造および塩基配列４つの独立したヒ）ＥＰＯゲノムクロー ンのＤＮＡ挿入物の相対位置を第３図に示す。オリゴヌクレオチドプローブおよ び２種類のＥＰＯｃＤＮＡクローンから調製された種々のプローブを用いて行な ったこれらのクローン化ＤＮＡ　のハイズリダイゼーション分析は、第３図に黒 い線で示される約３．３　ｋ’ｂ領域内にＥＰＯ遺伝子が存在することを示した 。この領域の完全な塩基配列分析（実施例４を参照）およびＣＤＮＡクローンと の比較から、第４図にボされるＥＰＯ遺伝子のイントロンおよびエクソン構造の 地図を描くことができた。ＥＰＯ遺伝子は５個のエクソンに分割される。エクソ ンＩの一部、エクソン■、■および■の全部、およびエクソン■の一部がタンパ ク質コーディング情報を含む。エクソンＬおよびＶの残部はそれぞれ５−プライ ムおよび３−プライム非翻訳配列をコードする。

ＣＯ８細胞によるＥＰＯの一時的発現 生物学的に活性なＥＰＯをｉｎ　ｖｉｔｒｏ　細胞培養系において発現し得るこ とを立証するために、　ＣＯ３細胞の形質発現実験を行った６急。一時的発現実 験に使用したベクターｐ９１０２３（ト）は実施例５に示される。このベクター はアデノウィルレス主要後期プＯモー１−１Ｓｖ４０ボＩＪＡ付加配列、ＳＶ４ ０複製開始点、′５ｖ４Ｑエンノーンサー、およびアデノウィルスＶＡ遺伝子を 含む。ラムダ−ＨＥＰＯＦ’ＬＩ　３　（第６表を参照）中のｃＤＮＡ挿入物は アデノウィルス主要後期プロモーターの下に連結されｐ９１０２３（Ｂ）−’フ タ−内に挿入された。この新しいベクターはｐＰＴＦ’Ｌ１３として同定した。

こうして構築されたベクターでＣＯ３−１細胞のＭｏ株〔ホロビッツ（Ｈｏｒｏ ｗｌｔｚ）らのＪ、Ｍｏ１．Ａｐｐｌ、Ｇｏｎｅｔ、２　：　１４７−１４９（ ’１９８３）　を参照〕をトランスフェクションし、２４時間後に細胞を洗浄し 、無血清培地に変え、そして４８時間後に培養上清を集めた。その後、培養上清 中に放出されたＥＰＯＯ量をＥＰＯに関する定量的ラジオイムノアッセイを用い て試験したＬ５Ｓ、第８表（実施例６）に示すように、免疫学的に反応性のＥＰ Ｏが発現された。Ｃ０８−１細胞から生産されたＥＰＯの生物学的活性も試験さ れた。別の実験において、ラムダーＨＥＰＯＦＬ１３からのＥＰＯｃＤＮＡを含 むベクターでｃｏｓ−１細胞をトランスフェクションし、上記のようにして培地 を回収した。

その後、培地中のＥＰＯは２つのｉｎ　ｖｉｔｒｏバイオアッセイ（３Ｈ−チミ ジンおよびｃｙｕ−ａ（１２、２９）　）および２つのｉｎ　ｖｉｖｏアッセイ 〔低酸素性マウスおよび飢餓ラット（３ｏ。

３１）〕によシ定量化した（実施例７の第９表を参照）。これらの結果は、生物 学的に活性なＥＰＯがＣ０８−１細胞で生産されたことを示している。ポリクロ ーナル抗ＥＰ○抗体を使用するウエスターンズロッティング（Ｗｅｓｔｅｒｎ　 ｂｌｏｔｔｉｎｇ）にょシ、ＣＯ８細胞で生産されたＥＰＯはヒト尿から得られ た天然ＥＰＯと同じＳＤＳ　−ポリアクリルアミドゲル上での移動度を有してい る（実施例８を参照）。従って、ｃｏｓ−１細胞で生産されたＥＰＯのグリコジ ル化の程度は天然ＥＰＯのそれと同様でありうる。

また、他のプロモーターｔ−含む異なるベクターもＣＯ８細胞もしくは他の哺乳 動物または真核生物の細胞において使用することができる。本発明の実施に有用 なこの種の他のプロモーターの例には５ｖ４０初期しよび後期プロモーター、マ ウスメタロチオネイン遺伝子プロモーター、トリまたは師乳動物レトロウィルス の長い末端繰返し配列中に見出されるプロモーター、バキュロウィルスポリヘド ロン遺伝子プロモーターおよびその他のものが含まれる。本発明の実施に際して 有用な他の細胞型の例には大腸菌；酵母：ＣＨ○（チャイニーズハムスター卵巣 ）。

０１２７（サル上皮）？　３Ｔ３（マウス線維芽細胞）、ＣＶ−１（アフリカン ・グリーン・モンキー腎臓）のような哺乳動物細胞；およびスボドプテラ・フル ギベルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｒａ　ｆ戊ｇｉｐｅ飾）やドロンフィラーメタノガス ター（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ　ｍｅｔａｎｏｇａｓｔｅｒ）のような昆虫細胞が 含まれる。これらの別個のプロモーターおよび／または細胞型はＥＰＯの発現タ イミングや発現レベルの調節、細胞に特異的な型のＥＰＯの生産、または比較的 費用がかからず容易に制御できる条件下でのＥＰＯ生産細胞の大量増殖を可能に しうる。

哺乳動物発現の利点全保持し、しかも高レベル発現の細胞株をつくるのにそれほ ど時間を必要としない発現系は、昆虫細胞株とその細胞株の中で複製するＤＮＡ ウィルスから成る。そのウィルスは核多角体病ウィルス（ｎｕｃｌｅａｒ　ｐｏ ’１ｙｈｅｄｒｏＢｉｓｖｉｒｕｓ）である。それは１２８ｋｌ：＋の二本鎖環 状ＤＮＡゲノムを有する。ヌクレオキャプシドは棒状であシ、そして２つの形体 、すなわち非閉塞形（膜通過ウィルス）と閉塞形　（感染細胞核内のタンパク質 結晶中に包封されたもの）で見出される。これらのウィルスは一般にｉｎ　Ｖｉ ｔｒＯ昆虫培養細胞中で増殖でき、そして全ての慣用の動物ウィルス学的方法を 適用できる。

細胞培養培地は一般に栄養素塩類静夜と１０％ウシ胎児血清である。

ｉｎ　ｖｉｔｒｏウィルス増殖は非閉塞ウィルス（Ｎ（Ｗ）が細胞に入って複製 箇所の核へ移動するときに始まる。複製は核で行われる。ウィルス感染の初期相 （感染後８〜１８時間）の間、ヌクレオキャプシドは核内に集まシ、続いてＮＯ Ｖとして原形質膜を通過して細胞培養中に感染を広める。さらに、ヌクレオキャ プシドのいくつかはその後（感染後１８時間以上ン核内にとどまシ、多角形封入 体（Ｐより）として知られるタンパク質マトリックス内に閉塞される。この形体 は細胞培養物中で伝染しない。タンパク質マトリックスはポリヘトリン（ｐｏ　 １ｙｈｅｄｒｉｎ）として知られる分子ｊＬ３３ｋａのタンパク質から成る。各 ＰＩＢ　は直径が約ＩＷｒＩｎであり、１個の核あた５ｉｏｏ個程度のＰＩＢが 存在しうる。感染サイクルの後期には非常に多くのポリへドリノが産生され、そ れは全細胞タンパク質の２５％にも達する。

Ｐよりはｉｎ　ｖｉｔｒｏ複製サイクルにおいてなんの役割も演じないので、ｉ ｎ　ｖｉｔｒｏ生存能カに影響を及ぼすことなくウィルス染色体からポリヘトリ ン遺伝子を欠失させることができる。

発現ベクターとしてこのウィルスを使用するとき、本発明者らはポリヘトリン遺 伝子コーディング領域を発現しようとする外来ＤＮＡと置き換えて、それをポリ ヘトリンプロモーターの制御下に置いた。これは非Ｐより形成ウィルス表現型を もたらす。

この系は数人の研究者によって利用され、はノック（Ｐｅｎｎｏｃｋ）らとスミ ス（Ｓｍｔｔｈ）らが最も著名である。ペノラックらはポリへドリノプロモータ ーの制御下に置いたときの、細菌タンパク質であるβ−ガラクトシダーゼの高レ ベル発現について報告した（グレー１＋）　−り、ベノック、チャールズ・シュ ーメーカーおよびロイスに、ミラーのＭｏ１ｅｃｕ１ａｒ　ａｎｄ　ＣｏｌＩＢ ｉｏｌｏｇｙ　３：８４．３９９−４０６を参照）。

もう１つの核多角体病ウィルス−誘導発現ベクターはスミスらによって提供され た（ゲールＥ、スミス、マックスＤ、サマー５月１６日、１９８３．２１５６− ２１６５を参照）。彼等はヒトβ−インターフェロンの発現を介してそれらのベ クターの有効性を立証した。合成産物は予期されたようにグリコジル化されて昆 虫細胞から分泌されることが見出された。実施例１４では、オートグラファ・カ リフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体病ウィ ルス（ＡｃＮＰＶ）ポリへド０７遺伝子を含むプラスミドへの修飾が述べられて おシ、その修飾はそのシラスミド内へのＥＰＯ遺伝子の挿入を容易にし、それに よりＥＰＯ遺伝子がポリヘトリンプロモーターの転写制御下に置かれるものであ る。得られたＤＮＡは野性型ＡｃＮＰＶ由来の完全な染色体ＤＮＡと共に昆虫細 胞を同時トランスフェクションする。遺伝子組換え現象がＡｃＮＰＶ　ｙＩ−′ ＋）ヘトリン遺伝子領域とプラスミド由来のＤＮＡとの置換をもたらす。得られ た組換えウィルスはＥＰＯ遺伝子のＤＮＡ配列の所有によシそのウィルス子孫の 中から同定し得る。この組換えウィルスは昆虫細胞に再感染させると、ＥＰＯを 生産することが期待される。

ＣＨＯ，Ｃ１２７および３Ｔ３．ならびに昆虫細胞によるＥＰＯ発現（７）例は 実施例１０と１１（ＣＨＯ）、１３（Ｃ１２７（！：３Ｔ３）　および１４（昆 虫細胞）に示される。

実施例１１のようにＣＨＯ細胞により生産された組換えＥＰＯは慣用のカラムク ロマトグラフィー法によシ精製した。糖タンパク質中に存在する糖の相対量は％ ２つの独立した方法〔（ｌ）レインホールド（Ｒｅｉｎｈｏｌｄ）　、Ｍｅｔｈ ｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　５０　：２４４−２４９（メタツリシス）お よびｆｉｌ）　タケモト（ＴａｋｅｍｔＯｙＨ，）らのＡｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅ ＋ｎ、１４５：　２４５（１９８５）（独立したシアル酸測定を伴うピリジルア ミノ化）〕で分析された。これらの方法のそれぞれによって得られた結果は申し 分なく一致した。こうして、いくつかの測定が行われて次の平均値を得た（この 場合比較目的のために、Ｎ−アセチルグルコサミンをＩＮ−アセチルグルコサミ ン　ｌ ヘキンース肩：１．４ ガラクトース　０．９ マンノース　０．５ Ｎ−アセチルノイラミン酸　１ ７コース　０．２ Ｎ−アセチルガラクトサミン　０．１ 両方の独立した糖分析法によって有意量のフコースとＮ−７セチルガラクトサミ ンが再現可能に観察されたことは注目に値する。Ｎ−アセチルガラクトサミンの 存在はタンパク質における〇−結合グリコシル化の存在を示す。〇−結合グリコ シル化の存在はさらに種々の組合せのグリコシド酵素による糖タンパク質の消化 後の５Ｄ３−ＰＡＧＥ分析によっても示された。特に、酵素はプチドエンドＦＮ −グリコシダーゼを使用して糖タンパク質の全てのＮ−結合炭水化物を酵素的に 除去した後、そのタンパク質の分子量はその後のノイラミニダーゼ消化の際に　 ３Ｄ３−ＰＡＧＥ分析で測定したときさらに減少した。

精製された組換えＥＰＯのｉｎ　ｖｉｔｒｏ生物学的活性は、アミノ酸組成のデ ータに基づいて計算されたタンパク質定量値を使用するクリスタル（Ｇ、Ｋｒｙ ｓｔａｌ）のＥｚｐ、ＨｅｍａｔＯ’１．、１１　：６４９（１９８３）　に記 載の方法（牌臓細胞増殖バイオアッセイ）により検定した。複数の測定において 、精製組換えＥＰＯのｉｎ　ＶｉｔｒＯ比活性は２０ＱＯＯＯ単位／ｍｇタンパ ク質以上であると計算された。平均値は約２７！％０００〜３０ＱＯＯＯ単位／ クタンパク質の範囲であった。さらに、３００，０００以上の値も観察された。

この組換え物質に対して観察されたｉｎ　ｖｉｖ。

〔赤血球増加マウス検定；カザール（Ｋａｚａｌ）およびアースレプ（Ｅｒａｌ ｅｖ）のＡｍ、Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｌａ’ｂ、Ｓｃｉ　、　、Ｖａｌ、Ｂ、ｐ　 ９１　（１９７５）を参照）　／　ｉｎ　ｖ’１ｔｒｏ活性比は０．７〜１．３ であった。

先に示した糖タンパク質の特性と、国際特許出願発行ＷＯ３５１０２６１０（１ ９８５年６月２０日付）に報告された組換えＣＨＯ生産ＥＰＯ物質の特性とを比 較することは興味のあることである。上記出願明細書の６５４−ジに記載される 対応する糖の比較分析は、フコースおよびＮ−アセチルガラクトサミンに対して ゼロの値を、そしてヘキンース類対Ｎ−アセチルガラクト丈ミンの比１５．０９ ：１を報告した。Ｎ−アセチルガラクトサミンの不在は以前に報告された環タレ ・ξり質中に〇−結合グリコシル化が存在しないことを示す。この物質と対照的 に、本発明の５１換えＣＨＯ生産ＥＰＯは先に性状決定がなされたように、再現 可能に観察しうる有意量のフコースとＮ−アセチルガラクトサミンの双方を含み 、ヘキンール類の相対量のン□。以下を含み、そして〇−結合グリコシル化の存 在によって特徴づけられる。さらに、本発明の上記ＣＨＯＭ胞由来組換えＥＰＯ の高い比活性はその特徴的なグリコジル化パターンと直接関連し本発明のクロー ン化ＥＰＯ遺伝子の原核細胞または真核細胞発現により生産された生物学的に活 性なＥＰＯは、医師や獣医師による哨乳動物種のｉｎ　ｖｉｖｏ治療に使用でき る。活性成分の量はもちろん治療しようとする症状の程度、選ばれた投与経路、 および活性ＥＰＯの比活性に依るであろうが、最終的には主治医や獣医により決 定されるだろう。主治医によって決定された活性ＥＰＯのこのような量はまた本 明細書中で“ＥＰＯ治療有効１量と呼ばれる。例えば、ヒツジにおける慢性腎不 全を伴う誘発された増殖低下性貧血の治療において、ａｐｏの一日の有効量は１ ５〜４０日の間１０単位／ｋｙであることがわかった。

（１９８４）を参照されたい。

活性ＥＰＯは治療しようとする症状に適する経路で投与される。好ましくは、Ｅ ＰＯは治療されるべき浦乳動物の血流中に注射される。好適な投与経路は治療し ようとする症状ごとに変化することを当業者は容易に理解するであろう。

活性ＥＰＯは純粋な又は実質的に純粋な化合物として投与することができるが、 医薬配合物または医薬製剤としてそれを提供することが好ましい。

動物およびヒト用の不発明配合物は、上記のような活性ＥＰＯタンパク質のほか に、１種または２種以上の薬学的に受容される担体と任意に他の治療成分を含有 する。担体は配合物の他０戊分と適合性であシ且つそれを投与される者に有害で ないという意味で瞬受容される１ものでなければならない。望ましくは、配合物 は酸化剤やベゾチドと不適合性であることが仰られている他の物質を含まないべ きである。配合物は簡便には単位投与形体（ｕｎｉｔ　ｄｏｓａｇθｆｏｒ＋ｎ ）で提供され、薬学の分野でよく仰られた方法によシ調製される。全ての方法は 活性成分と１種または２種以上の補助成分を含む担体とを混合する工程をざむ。

一般に、配合物は活性成分と液体担体または微細な固体担ｆドまたはその両者と を均一にかつ緊密に混合し、その後必要ｉＣＧじてその生成物を所望配合物へ成 形することにより作られる。

非経口投与に適する配合物は簡便には活性成分の滅菌水溶液からなシ、その際そ の溶液は受容者の血液と等張であるのが好ましい。この種の配合物は固体活性成 分を水に溶解して水溶液をつくり、その水溶液を滅菌することによシ有利に調製 さｔｌ。

そして例えば密封アンプルやバイアルのような単位用丑容器１たは多用量容器で 提供される。

ここで使用されるＥＰＯ／ｃＤＮＡにはＡＴＧコト１ンによって先行される成熟 ＥＰＯ／ｃＤＮＡ遺伝子、およびＥＰＯタンパク質の対立遺伝子変異体をコード するＥＰＯ／ｃＤＮＡが含まれる。１つの対立遺伝子は第２表及び第３表に示さ れる。ＥＰＯタンパク質にはＥＰＯタンパク質の１−メチオニン誇導体（Ｍθｔ −ＥＰＯ）およびＥＰＯタンパク質の対立遺伝子変異体が含まれる。成熟ＥＰＯ タンパク質は第２表の配列Ａ１ａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ　＝から始まる配列 （最初のアミノ酸残基には番号１（第２表）が付されている）によって示される ａＭθｔ−ＥＰＯは配列Ｍｅｔ−Ａ１ａ　−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ・・・から 始まるだろう。

次の実施例は本発明を理解しやすくするためのものであり、本発明の真の範囲は 梢求の範囲によって説明される。ここに記載の方法において多くの修飾が本発明 の精神から逸脱することなくなされ得ることを理解すべきでちる。全ての温度は ℃で表わされ未補正である。マイクロリッター、マイクロモル等に於けるマイク ロの略号として巳α」を用い、それぞれ「μｐ」。

ｒ”ｍＪとして表わす。

ＥＰＯは再生不良性貧血患者の尿から本質的に以前述べた方法〔ミャケ（Ｍｉｙ ａｋｅ）らのＪ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２５２　：　５５５８（１９７７）を 参照〕で精製したが、フェノール処理を省略しその代ワりに８０℃で５分の熱処 理を行ってメイラミニグーゼを失活させた。精製の最終工程は０．１　％　トＩ Ｊ　フルオル酢酸（ＴＦ”Ａ）を含む０〜９５％アセトニトリル勾配を使用する とＣ−４Ｖｙｄａｃ　ＨＰＬＣカラム（Ｔｈｅ　５ｅｐａｒａｔｉｏｎｓ　Ｇｒ ｏｕｐ）による１００分間の分画化であった。上記勾配中のＥＰＯの位置は、主 要ピークのゲル電気泳動およびＮ末端アミノ酸配列分１斤（２１，２６゜２７） により測定した。ＥＰＯは約５３％°アセトニトリルで溶離され、逆相ＨＰ　Ｌ 　Ｃにかけたタンパク質の約４０チに相当した。ＥＰＯを含む両分は１００μρ になるまで蒸発さぜ、重炭酸アンモニウムでｐＨ７，０に調節し、２チＴＰＣＫ 　ＩＡ理ヒトリプシンＷｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）により３７℃で１８時間完全消 化した。その後、トリプシン消化物を上記のような逆相ＨＰＬＣにがけた。

２８０ｎｍおよび２１４　ｎｍでの光学密度を監視した。十分に分離したピーク は乾固状態近くにまで蒸発させ、ＡｐｐｌｉθｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｅ　４８０ 　Ａ型気相シークエネーターを使って直接Ｎ末端アミノ酸配列分析Ｏ■にかけた 。得られたアミノ酸配列は第２表および第３表において下線が施されている。先 に述べたように、これらのトリプンン消化フラグメントのうち２つがヌクレオチ ドプローズの合成用に選ばれた。配列：　Ｍａｌ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ａ ｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ　（第２表および第３表のアミノ酸４６〜５２）からは、 ３２種類（縮重）のｌ　７　ｍａｒＡＡ ＴＴＣＣＡＮＧＣＧＴＡＧＡＡＧＴＴ および１２８種類（縮重）の１８　ｍａｒＡＡ ＣＣＡＮＧＣＧＴＡＧＡＡＧＴＴＮＡＣが合成された。配列Ｈｖａｌ−Ｔｙｒ− ８ｅｒ−Ａａｎ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（第２表および第３表のアミノ酸１４ ４〜１５０）がらｉｄ、ロイシンコドンの第１位で異なるそれぞれ４８種類（縮 重）の２が合成された。これらのオリゴヌクｌ／オチドはポリヌクレオチドキナ ーゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）およびフｆ　／７３２Ｐ−Ａ ＴＰ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎａ　Ｎｕｃｌａａｒ）　を用いて３２ｐで５−プラ イム末端を標識した。オリコ゛ヌクレオチドの比活性はオリゴヌクレオチド１ミ リモル当！＋１０００〜３０００　Ｃ１であった。ノζクテリオファージラムダ 中のヒトゲノムＤＮＡ　ライブラリー（ローン（Ｌａ、ｗｎ　）ら、２２）はウ ー（Ｗｏｏ）ら、（４つ（１９７８）によって初めて開示されたｉｎ　Ｂｉｔｕ 増ＩＩ法の変法を用いてスクリーニングした。

約３．５Ｘ１０５フアージを１５０咽ベトリ皿（ＮＺＣＹＭ培地）当たり６００ ０フアージの密度でまいて、肉眼で見える小さな（約０．５　ｒｔｃｍ　）プラ ークが形成されるまで３７℃でインキュベートした。４℃で１時間冷却後、プラ ークパターンの２通りのレプリカをナイロン膜（Ｎｅｖ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕ ｃｌｅａｒ）　に移行させ、新しいＮＺＣＹＭ平板上３７℃で一晩インキユベー トした。その後、フィルターはそれぞれ０．５　Ｎ　Ｎａ０Ｈ−Ｉ　Ｍ　Ｎａ、 ＣＱおよび０、５　Ｍ　）リス（ｐＨ８）　−１Ｍ　Ｈａ（Ｊ！の薄膜上で１０ 分間ずつ処理することにより変性および中和した。８０℃で２時間真空ベーキン グした後、フィルターを５　Ｘ　ＳＳＣ，０，５チＳＤＳで１時間洗い、フィル ター表面の細胞破砕物を湿ったティッシュで穏やかにかき取ることにより除去し た。このかき取りはグローブのフィルターへのバックグラウンド結合を減少させ た。次に、フィルターはＨ２０ですすぎ、３Ｍ塩化テトラメチルアンモニウム、 １０　ｍＭ　ＮａＰＯ４（ｐＨ６，８）、５　Ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ　、　 ０．５　％ＳＤＳおよびＩ　Ｑ　ｍＭ　ｇＤＴＡ中４８℃で４〜８時間プレハイ ズリダイゼーションを行った。その後、３２ｐ−標識１７　ｍｅｒを０．１　ｐ ｍｏ（！／／Ｉｌ　の濃度で加えて４８℃で７２時間ハイブリダイゼーション金 行った。ハイブリダイゼーション後、フィルターｆｉ″２ｘＳＳＣ（０，３Ｍ　 ＮａＣ，ｆ！−０，０３Ｍクエン酸Ｎａ　＋　ｐ　Ｈ７）で室温にて十分に洗浄 し、さらに３　Ｍ　ＴＭＡＣＱ−１，０ｍＭ　ＮａＰＯ４（ｐＨ６，８）で室温 にて１時間次にハイブリダイゼーション温度で５〜１５分間洗浄した。増感板を 使用した２日間のオートラジオグラフィー後、約１２０の強い２通りのレプリカ されたシグナルが検出された。陽性ファージを拾って８プールに分け、再度７ア ージプラークを形成させ、２枚のフィルターの各々に対しては１４ｍａｒプール の半分を使用し、３枚目のフィルターに対しては１７　ｍａｒを使用して３通シ の再スクリーニングを行った。プラーク形成およびハイブリダイゼーシヨ／の条 件は先に述べた通りでちるが、１４ｍｏｒについてのハイブリダイズーどヨンは ３７℃で行った。オートラジオグラフィー後、室温にて２０分間５０チホルムア ミド中で１７　ｍθｒフィルターからブロースを除去し、そのフィルターｆ、５ ２℃”Ｃ１８ｍθｒフｏ−フと再度ハイブリダイズさせた。２つの独立ファージ が３種のプローズ全部とハイブリダイズした。これらのファージの１つ（本明細 書ではラムグーＨＥＰＯｌと呼ぶ）からのＩＭＡを５ａｕ３Ａで完全消化し、サ ンガーおよびクールンン、ＣＩ！３）（１９７７）のジデオキシ・チェイン・タ ーミネーション法によるＤＮＡ配列分析のためにＭ２Ｓ内でサブクローニングし た。ＥＰＯ）リプシン消化７ラグメント（下線領域）をコードするオープン・リ ーディング・フレームのヌクレオチビ配列および推定上のアミノ酸配列を本明細 ・書中に示す。イントロン配列は小文字で表わされ、エクンン配列＜８７ｉクレ オチド）は大文字で表わされる。コンセンｇｘｘプライス受容部位（ａ）および 供与部位（１））と一致する配列には下線が施されている。（第４表を参照）実 施例２：　ヒト胎児肝ＭＥ　ｍＲＮＡのノザン分析　・５μ９のヒト胎児肝１ｉ 　ｍＲＮＡ（２０週目の胎児肝臓から調製したもの）および成人肝ｉｌｌ　ｍＲ ＮＡは０．８％アガロースホルムアルデヒドゲルｉｃよる’；ｌ気泳動を行い、 ３グー−ｒン（Ｄｅｒｍａｎ）らのＣｅ’ｌｌ、２３　ニア３１（１９８１）に 記載の方法を用いてニトロ、セルロースに移行させた。次に、第１表に示す挿入 物を含むＭ１３テンプレートから一本鎖プロープを作成した。プライマーは初め の１７　ｍａｒゾロープと同じトリプシン消化７ラグメントから誘導された２　 ０　ｍａｒ　であった。プローブはアンダーン７　（Ａｎｄｅｒａｏｎ）らのＰ ＱＡＳ、５（１（Ｉ９８４）、に記載されるようにして作成したが、ＳｍａＩ消 化（７４ヌクレオチドのコーディング配列を含む９５ヌクレオチド長の目的プロ ーブをもたらす）後、Ｑ、　Ｉ　Ｍ　ＮａＯＨ−０，２Ｍ　ＮａＣｎ　中セファ Ｏ−スＣ１４Ｂカラムでのクロマトグラフィーによシその小さな７ラグメントを Ｍ　１３テンプレートから精製した。フィルターは約５Ｘ１０　’ｃｐｍのこの プローブと６８℃で１２時間ハイブリダイズさせ、６８℃にて２ｘＳＳＣで洗浄 し、増感板を用いて６日間感光させた。

１２００ヌクレオチドの単一のマーカーｍＲＮＡ　（矢印で示す〕は隣接レーン で泳動させた。（第１図） 実施例３：　胎児肝臓ｃＤＮＡ 実施例２に記載のプローブと同じプローブを作成し、標準ゾラークスクリーニン グ〔ベントン−デービス（Ｂθｎｔｏｎ　Ｄａｖｉｓ）を参照〕中に作られた胎 児肝臓ｃＤＮＡライブラリーをスクリ一二ンＩするためにそのプローブを使用し た。１×１０６ゾラークのスクリーニング後に３つの独立陽性クローン〔本明細 書ではラムダ−ＨＥＰＯＦ’Ｌ　６　（１３５０ｂｐ）、ラムダ−ＨＥＰＯＦ’ Ｌ　８　Ｃ７００ｂｐ）およびラムダ−ＨＥＰＯＦＬｔ３（１４００ｂｐ）と呼 ぶ）を単離した。ラムダ−ＨＥＰＯＦＬ　１３　およびラムダ〜ＦｍＰＯＦＬ　 ６の完全挿入物はＭ１３でのサックローユング後に塩基配列を決定した（それぞ れ第７表および第５表を参照）。ラムダ−ＨＥＰＯＦＬ８は部分的に塩基配列が 決定され、残りの部分は他の２つのクローンと同じであると思われた（第６表参 照）。５−プライムおよび３−プライム非翻訳配列は小文字で表わされる。コー ディング領域は大文字で表わされる。

ＣＴＣＴｒＣＣＧＡ　ＧＴＣＴＡＣＴＣＣＡＡＴ　ＴＴＣＣＴＣｇＣＬｆ：　ｇ Ｌ（ＪＣＣａ　ＣｎＣＣＣ１：（−（：ＣＣＣＩＪＣＣｃｌＣ仁ｃｅ仁ｃｃａｅ Ｂｇａｃａｃ　ｔｃｃｆ１ｇ仁ｇＣＣｎ　９ＣｎＯ＊［１ｕＣｎｔ：しＣ虹ａａ ｇｇａｔｇ　、ｔｃ１ｃｎ３１；ｇｃｃ　ＪＩＩＩＣｔｔｌｆｌｌＪ［；８ｇ　 ８０８ｇ”　１＞　ＣＣｆｌＬｇ　Ｃ”ｇ９ｇｃｌａ　ｇｎＣｇ　ＣＣＣｇｎ８ 仁Ｊｌ：：ａｇｇｃｇ４１　仁仁しａｃｅ仁ｇむし　仁ＣＣｇｃａｃｃ仁８ｃｔ Ｂｔｇ口ｃＬ：ｔｃ　Ｌ、ｃｃ８Ｈｔｃ虹ｅ　ｎｃ３興ｃｎＬ：Ｈｇｇｌ：ｇｇ ｇｎａｃｃｕ　ｍｇａａｇａｃａｇｇ　ｎ仁ｇｇｇＨｇｃに１１１１ＣＣｔＣｉ ｉしし１１　１′ＩＣ８Ｑｇｎ　ａＣ仁ｇ　ｎｆ１４１ｃｃｎｃｃ！Ｉｎ読Ｓ） ｔｇ仁ＣＣｎＣＣＬ’、ｌ；　ｇ’ｆ、Ｃｎヒフ！ｌ：Ｃｃａｌ　ＣＣｎＣＣ仁 ｅｃｃ仁　ｃａｃｃｎｒｓｃｕＬ：ｔｇｎ８ＣＣＣＣ３ＬＣｇ”ｇＬｇｇＣｅＣ 仁　Ｃ”ｇＣ”ＣｎｇＣｇ　ＣｎＣＣＣ１ｇ仁ＣｃｔｅａｇＢＢｅｃ　ｎＢｎＢ ｇａａｅしＢ　ｔｅｃａｇａｇａｇｃ　ａａｃｔｅｔｇａＨｉｉＣＣＣｎ　合ｎ ｌ；Ｃ；Ｊｌ：　ｇａａｇＣＱｅｒＣｕ　ｇａｇＱｇＣｎｇＣ仁　仁虹ａａａＣ ＬＣｉ１ｇＣ仁ＣａＣ仁Ｃ９８ＣＪＩＣＣＣ弗Ｃａａｆｌ　ａヒｍｅｇａ仁ｇＣ ＣｎｇｇａＣｌｌＣｇＣＬ：ＣＣｎＬＣａＣ８ｇｎ　Ｃ８ｇｇ（ｌｅｇａＣＣし Ｂｇａｇｎｉｃし仁　ＯＨ仁ｇｇｃａａｇｉＣａＣＬＣＣＣｔ、Ｌ　ｇｇｌｌ： ｇｇＣＱａ　ｇｎ　ｇＣＣＣＣＱＬ仁ｇｉ　ｃｎｃｃｇｇｇｇｔｇｇＣ（：ｌ： Ｃｔｇｌ；ＣＬ　ＣｔＣＪｌｌ：ｇ８ｇｇ仁　ｃｃａａＢ仁仁しｔｇ　ｅｇｔａ ｅｔ’ｃｅｔｃｎＱａＪ’ｌｎａｎａｎａＨａ 第２表および第３表に関して、ヌクレオチド配列の上に示される推定上のアミノ 酸配列は成熟タンノξり質の第１番目のアミノ酸を１として番号が付けられてい る。推定上のリーダーベゾチドはアミノ酸の略号が大文字で示される。成熟タン パク質中のシスティン残基はさらにＳ）Ｉで示され、また起こりうるＮ−結合グ リコシル化部位は星印で示される。下線が施されているアミノ酸は、Ｎ末端タン パク質配列決定または実施例１で述べたようなＴ２ｐｏのトリプシン消化７ラグ メントの配列決定により同定されたアミノ酸残基金示す。点蔵は明確に決定し得 なかったトリプシン消化フラグメントの７ミノ酵配列中の残基を示す。ｃＤＮＡ クローンのラムダ−ＨＥＰＯＦＬ　５、ラムダ−ＨＥＰＯＦＬ８およびラムダ− ＨＥＰＯＦ’Ｌ　１３はメリーランド州ロックビルのアメリカン・タイプ・カル チャー・コレクションに寄託され、それぞれ寄託番号ＡＴＣＣ４０１５６、ＡＴ ＣＣ４０１５２およびＡＴＣＣ４０１５３として入手可能である。

実施例、ｉ：ＥＰｏ遺伝子のゲノム構造Ｈａｅｌ／Ａ１ｕｌ　ライブラリーから の４個の独立したゲノムクローン（ラムダ−ＨＥＰＯＩ、　２．３および６）の 相対的な大きさおよび位置は、第３図において重複する線によって示される。

太くて濃い線がＥＰ○遺伝子の部分である。既知制限エンドヌクＶアーゼ切断部 位の位置とスケール（ｋｂ）が示される。ＥＰＯ遺伝子を含む領域は、この領域 の一連の欠失を生じさせる特異的エキソヌクレアーゼ■を使用して、画鋲から完 全に塩基配列式図を第４図に示す。エクソンＩの正確な５−プライム境界は今の ところ不明である。それぞれのエクソンのタンパク質コーディング部分は黒くな っている。この領域の完全なヌクレオチド配列を第４表に示す。各エクソンの既 知範囲はかぎ付きの垂直線で示される。ゲノムクローンのラムダ−ＨＥＰＯＩ、 ラムグーＨＥＰＯ２，ラムグーｌＰＯ３およびラムダ−ＨＥＰＯ６は　メリーラ ンド州ロックビルのアメリカン・り・ｆノ・カルチャー・コレクションに寄託さ れ、それぞれ寄託番号ＡＴＣＣ４０１５４，ＡＴＣＣ４０１！５５．　ＡＴＣＣ ４０１５０およびＡＴＣＣ４０１５１として入手可能である。

（３）であった。このベクターの構造は第５Ａ図に示す。簡単（ｌζ述べれば、 このプラスミドはアデノウィルス（Ａａ２）主要後期プロセーターの転写制御下 にあるマウスジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦ″Ｒ）ｃＤＮＡ遺伝子を含む。５− プライムスプライス部位はアデノウィルスＤＮＡ中に示され、３−プライムスプ ライス部位（免疫グロブリン遺伝子から誘導される）はＡａ２主要後期プロモー ターとＤＨＦＲコーディング配列の間に存在する。５ｖ４ｏ初期ポＩＪ　Ａ部位 はＤＨＰＲコーディング配列から下流に存在スル。ｐＡａＤ　２６ＳＶｐＡ（３ １ｃＤ原核生’ｈ由来部分ハｐｓＶＯａ〔メロン（Ｍｅｌｌｏｎ）らのＣｅ１ｌ 　２７：２７９（１９８１）を参照〕から由来し、哺乳動物細胞内で複製を阻害 することが知られているｐＢＲ３２２配列を含まない〔ラスキー（Ｌｕｓ、ｋｙ ）らのｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡ（３Ｊハ第５Ａ図に示すようにシラスミドｐＣｖＳ ｖＬ２へ変換した。ｐＡａＤ２６ｓＶｐＡ（３１ハソ（Ｄ中ｃＤ　２（１ｆｆｉ ノＰＩｌｌｔ１部位の一方を欠失させることによりシラスミドｐＡｄＤ２６ＳＶ ｐＡ　（３１Ｆｄｌに変換した。これは１個のＰｓｔ１部位のみが切断された線 状プラスミドのサブ集団を得るために酵素活性を弱めたＰａｔｌで部分消化し、 続いてフレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）で処理し、連結して環状化し、そして５ｖ４Ｑ のポＩＪ　Ａ配列の３−プライム側に位置するＰａｔ）部位の欠失についてスク リーニングすることにより達成された。

アデノウィルス３分節系（ｔｒｉｐａｒｔｉｔθ）リーダーおよびウィルス関連 遺伝子（ＶＡＪ伝子）が第５Ａ図に示すようにｐＡａＤ２６ｓＶｐＡ（３１（ｄ ）Ｋ挿入すｈｆｃ。ｊｌＪＫ、ｐＡｄＤ２６３ＶｐＡ　（３Ｊ（ｄ）をＰｖｕｌ ｌで切断して、３分節系リーダーからなる３つの要素の３−プライム部分内で開 環した線状分子を作った。次に、　ｐＪＡＷ参照〕をＸｈｏｌで消化し、フレノ ウで処理し、ＰｖＪで消化し、そして第３番目のリーダーの第２部分を含む１４ ０　ｂｐ　７ラグメントをアクリルアミドゲル（トリス−ホウ酸緩衝液中６％； マニアテスらの上記文献参照）による電気泳動により単離した。

その後、この１４０　ｂｐ　フラグメントをＰｖｕｌｌ消化ｐＡａＤ２５ＳＶｐ Ａ　（３）（ｄ）へ連結した。この連結生成物を用いて大腸菌をテトラサイクリ ン耐性へと形質転換し、１４０１）ｐフラグメントとハイブリダイズする３２ｐ 標識プローブを使用するグルンスタイン（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ）−ホグネス（Ｈ ｏｇｎθθθ）法によシコロニーを選択した。ポジティブにハイブリダイズする コロニーからＤＮＡを調製して、再構成された’９ｖｕＵ部位が第２および第３ アデノウィルス後期リーダーに特異的な１４０　ｂｐ　ＤＮＡ挿入物の５−プラ イム側にあるかあるいは３−プライム側にあるかについて試験した。正しい向き のＰ、ｖｕ■部位は１４０ｂｐ挿入物の５−プライム側に存在する。このシラス ミドは第５Ａ図に１）ＴＰＬ　、！：　Ｉ。

て示される。

ｓｖ４　Ｑエンハンサ−を含む５Ｖ４ＱのＡｖａ［Ｄフラグメントは、５ｖ４０ 　ＤＮＡをＡＶＩＬＩＩで消化し、　Ｐｏ１１のフレノウフラグメントで両末端 を平滑にし、これらのフラグメントにＸｈｏｌリンカ−を連結し、Ｘｈｏ；Ｉで 消化してＸｈｏ　１部位を開き、そしてゲル電気泳動で４番目に大きい（Ｄ）フ ラグメントを単離することにより得られた。次に１、この７ラグメントをＸｈｏ ）消化ｐＴＰＬＫ連Ｍ　ジチア’ラスミｈ”ｐｃｖｓｖＩ、２−　ＴＰＬ　’ｃ 得ｆｃ。ｐｃＶｓＶＬ２−ＴＰＬ中の５ｖ４０　Ｄフラグメントの向きは、５ｖ ４０後期プロモーターがアデノウィルス主要後期プロモーターと同じ向きで存在 するものであった。

ｐｃｖｓｎ、２−ＴＰＬ内にアデノウィルス関連（ＶＡ）　遺伝子を導入するた めに、最初にアデノウィルス２型Ｈ１ｎｄｌｌ　Ｂフラグメントを含むシラスミ ）’ｐＢＲ３２２を作成した。アデノウィルス２型ＤＮＡ　ｆ　Ｈｌｎｄｌｎで 消化して、Ｂフラグメントをゲル電気泳動によシ単離した。このフラグメントを あらかじめＨｌｎｄＩ［ｌで消化したＰＢＲ３２２の中に挿入した。大腸菌をア ンピシリン耐性へと形質転換した後、形質転換体をＨｌｎｄ［ｌ　Ｂフラグメン トの挿入についてスクリーニングし、挿入された向きを制限酵素消化によシ調べ た。Ｉ）ＢＲ３２’２−Ａ（Ｌ　Ｈｌｎｄ［［ｌ　Ｂは第５Ｂ図に示す向きでア デノウィルス２型Ｈ１ｎｄｌ　Ｂフラグメントを含む。

第５Ｂ図に示すように、ＶＡ遺伝子はシラスミドｐＢＲ３２２−Ａａ　Ｈｉｎａ ｌＩＩ　ＢをＨｐａｌで消化し、Ｅｃ　ｏＲｌ　リンカ−を付加してＥｃｏＲｌ で消化し、続いて１．４ｋｌ）フラグメントを回収することにより慣用に得られ る。ＥＯＱＲＴ接着末端をもつフラグメントは次に前もってＥｃｏＲＴで消化し たｐＣＶＳＶＬ２−ＴＰＬのＥｃｏＲ１部位に連結した。大腸菌ＨＢ１０１　ｆ 、形質転換してテトラサイクリン耐性について選別した後、ＶＡ遺伝子に特異的 なりＮＡに対するフィルターハイズリグイゼーションによシコロニーをスフＩｊ 　−ユングした。ポジティブにハイブリダイズするクローンからＤＮＡを調製し 、制限エンドヌクレアーゼ消化により同定した。

得られたプラスミドはｐ９１０２３と命名した。

第５Ｃ図に示すように、ｐ９１０２３　に存在する２個のＥｃｏＲｉ部位は、ｐ ９１０２３をＥｃｏＲ７で完全消化して２つのＤＮＡ　フラグメント（一方は約 ７ｋｂであシ、他方は約１．３　ｋｂである）を生成させることにより除いた。

後者の約１．３　ｋｂフラグメントがＶＡ遺伝子を含んでいた。両フラグメント の末端をＰｏ１ｌのフレノウフラグメントを用いて修復し、次にその２つの７ラ グメントを連結した。ＭＡ遺伝子を含み、ｐ９１０２３に類似するが２個のＥｃ ｏＲ１部位を欠失したプラスミドｐ　ｇ　１０２３　（Ａ）は、ＭＡ遺伝子７ラ グメントを使用するグルンスタインーホグネススクリーニングにより、または慣 用の制限部位分析によシ同定した。

ｐ　９１０２３　（Ａ）中の単一のＰｓｔｌ　部位を除き、その代わりにＥｃｏ Ｒ１部位を入れた。ｐ９ｔｏｚ３（Ａ）をＰｓｔＩで完全消化し、Ｐｏ１ｌのフ レノウフラグメントで処理して平滑末端を生成させた。ｐ　９１０２３　（Ａ） のその平滑末端化ｐｅｔ１　部位にＥｃｏＲｌ　リンカ−を連結した。平滑末端 化Ｐｓｔ４部位にＦ：ｃｏＲｌ　リンカ−を連結させた線状ｐ９ｉｏ２３（Ａ） を非連結リンカ−から分離し。

ＥｃｏＲｌで完全消化して再び連帖させた。第５Ｃ図に示すプラスミド１）　９ １０２３（Ｂ）を回収し、ｐ９１０２３（Ａ）に類似するがＰｓｔ１部位の代わ りにＥｃｏＲＩ部位を有するものを同定した。シラスミドＩ）　９１０２３　（ Ｂ）はメリーランド州ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ ョンに寄託され、寄託番号ＡＴＣＣ３９７５４として入手可能である。

実施例６： ＣＭＡクローン（ラムダ−ＥＰＯＦＬ６およびラムダ−ＥＰＯＦ’Ｌ１３；実施 例３参照）ｔ−シラスミドｐ９１０２３（Ｂ）に挿入して、それぞれｐＰＴＦＬ ５およびｐＰＴＦ’Ｌ１３を作成した。その後、それぞれの精ｆＡＤＮＡ８μ９ を用いて５Ｘ１０６個のＣＯＳ　細胞をＤＥＡＥ−デキストラン法（以下参照） によシトランスフエクションした。１２時間後、細胞を洗浄し、クロロキン（０ ，１ｍＭ）で２時間処理し、再び洗浄し、そして１０％ウシ胎児血清を含む培地 １ｏｍｌに２４時間さらした。その培地を無血清培地４ｍｌに変えて４８時間後 に収穫した。

免疫学的に活性なＥＰＯ・の生産は、シェアウラ）’　（Ｓｈｅｒｗｏｏｄ）お よびゴールドバッサ−ｆｆｉＧｏｘａｗａθ５ｅｒ）（５５１によシ示されるラ ジオイムノアッセイにより定量化した。抗体はシュディス・シェアウッド博士（ Ｄｒ、Ｊｕａｔｔｈ　Ｓｈｅｒｗｏｏｄ）により提供された・ヨウ素化トレーサ ーは実施例１に記載の均一なｇＰＯから製造した。検定の感度は大体１ｎ９／ｒ ｎｌである。結果を下記の第８培地中に放出された ベクター　ＥＰＯの量（ｎ　’Ｊ／ｍ１）ｐＰＴＦ″Ｌ１３　３３０ ｐＰＴ＋！’Ｌ　６　３　１ ｐＰＴＦＬＩ３１’ｊ：メリーランド州ロックビルのアメリカン・タイプ・カル チャー・コレクショ／に寄託され、寄託番号ＡＴＣＣ３９９９０のもとに入手可 能である。

実施例７： ＥＰＯｃＤＮＡ（ラム！ｆ　−ＨＥＰＯＦ’Ｌ１３）　ｋ　ｐ９１０２３　中） ｌＫ挿入シ、ＣＯ３−１細胞をトランスフェクションして上記（実施例６）のよ うに収穫した。ただしクロロキン処理を省いた。

ｉｎ　ｖｉｔｒｏで生物学的に活性なｇｐｏは、ＣＦ’Ｕ−Ｅ源としてマウス胎 児肝臓細胞を用いるコロニー形成検定またはフェニルヒドラジン注射マウスから の牌臓細胞を用いる　Ｈ−チミジン取込み検定により測定した。これらの検定の 感度は大体２５ｍＵ／ｒ！ｇ　である。ｉｎ　ｖｉｖｏで生物学的に活性なＥＰ Ｏは低酸素性マウス法′または飢餓ラット法によシ測定した。これらの検定の感 度は大体１００　ｍＵ７４Ｊである。コントロール実験で得られた培地（ｍｏｃ ｋ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ　ｍｅｄｉｕｎ）からの検定では活性が全く検出されな かった。クローンＥＰＯＦ”Ｌｉ２　によって発現されたＥＰＯの結果は下記の 第９表に示す〔活性は単位／−で表わし、標準として市販の定量化ＥｐＯ（Ｔｏ ｙｏｂｏ社！りを使用した〕。

第９表 ＣＦ’Ｕ　−Ｅ　２±０．５Ｕ／ｍｅ ３ｕ−’ｒｈｙ３．１　％＝　１．８　Ｕ／ｒｓｌ低酸素性マウス　Ｉ　０７ｍ ７！ 飢餓ラツト　２　ＵＡｔｅ ＥＰＯｃＤＮＡ　（ラムダ−ＨＥＰＯＦＬ１３）ｆ含むベクｐ−９ｘｏ２ａ（Ｉ ３）でトランスフェクションされたＣＯＳ細胞から培地に分泌されたＥＰＯ１８ ０ｎ９　ｅｌ　Ｏ％ＳＤＳ　Ｌａｏｍ１１１Ｊリアクリルアミドゲルによる電気 泳動にかけ、ニトロセルロース紙に電気移行させた〔トービン（Ｔｏｗｂｉｎ） らのＰｒｏｃ、　Ｎａｔ］−、Ａｃｏａ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７６　：　４３５０　（１９７９）を参照〕。こｄフ・イル ターは第８表に記載されるような抗ＥＰＯ抗体を用いて検索し７、洗浄し、そし て１２５ニ一黄色ブドウ球菌Ａプロティンを用いて再度検索した。その後２日間 オー・トラジオグラフィーを行った。

天然の均−ＥＰＯは実施例１に記載され、ヨウ素化前（レーンＢ）またはヨウ素 化後（レーンＣ）に電気泳動を行った（第６図参照）。使用したマーカーは３５ ３メチオニン標識された血清アルブミン（６ａＯ００ｄ）　および卵白アルブミ ン（４５，０００ｄ）であった。

実施例９　：　ＲＫＩ−４の作成 マウスジヒドロ葉酸還元酵ｙ＜　（ＤＨＦＲ）遺伝子に隣接する５ｖ４Ｑ初期領 域プロモーター、５ｖ４０エンハンサ−１小さなｔ抗原イントロン、および５ｖ ４ＱポリＡ配列を含むプラスミド−Ｐｖ　ｕ　■フラグメントを単離した（フラ グメントＡ）。残りのフラグメントは次のようにしてベクターｐ９１０２３（Ａ ）（上記参照）から得られた：　ｐ９１０２３（Ａｌｔ−アデノウィルスプロモ ーターの近くの単一のＰｓｔ　１部位でＰｓｔＩにより消化してこのプラスミド ヲ線伏化し、次に合成Ｐｓ　ｔ　Ｉ−Ｅｃ　ｏＲｌ　コンバーターに連結して再 環状化する〔もとのＰｓｔｉ部位にＰｓｔ４−ＥｃｏＲｉ−Ｐｅｔ１部位を作る ；９１０２３（Ｂ’））か、あるいはＤＮＡポリメラーゼＩの大フラグメントで 処理してＰ日ｔ１部位を破壊し、合成ＥＣ０ＲＴ　！ｊンカーに連結して再環状 化した〔もとのＰｓｔ　１部位にＥｃｏＲ１部位を作る；ｃｎｏｚ３（１１）。

得られた２つのプラスミド９１０２３（Ｂ）と９１０２３ＣＢ’）の各々１Ｘｂ ａｌおよびＥｃｏＲｌ　で消化して２つのフラグメント（Ｆ’およびＧ）ｔ−得 た。ｐ９１０２３（Ｂｌからの７ラグメントＦと１１）９１０２３（Ｂ’）から のフラグメントＧおよびｐ９１０２３（Ｅ９からの７ラグメントＧとｐ９１０２ ３　（Ｂ’）からのフラグメントＰｉ連結することにより、もとのＰｅｔ１部位 にＥｃｏＲＩ−Ｐｓｔ　１部位またはＰｓ　ｔ　ｌ　−ＥｃｏＲ１部位のいずれ かを含む２つの新しいプラスミドを作成した。

Ｐｓｔｌ−ＥｃｏＲ１部位を含むプラスミド（Ｐｓｔｉ部位がアデノウィルス主 要後期プロモーターに最も接近している）ｔ″ｐ９１０２３（Ｃ１と命名した。

ベクターｐ９１０２３（Ｃ）全Ｘｈｏ■で完全消化し、接着末端をもつ得られた 腺状プラスミドは大腸菌のＤＮＡ　ポリメラ、−ゼ■大フラグメントを用いる末 端修復反応により平滑末端とした。このＤＮＡ　Ｋ、次のようにして作成したＳ Ｖ４　ｏ　エンハンサ−含有の３４０　ｂｐ　Ｈｉｎｄｌｌｌ−ＢｅｏＲｌ　７ ラグ、＋’　ンｌ−ｆ、　連結シタ：５ｖ４Ｑ　からのＳＶ４０　’５２開始点 ３よびエンハンサ−を含むＨｌｎｄｌＩＩ−Ｐｖｕ■　フラグメントをシラスミ ドＣ１ａｃ　（リトル（Ｌｉｔｔｌｓ　）らのＭｏ：ｈ、　Ｂｉｏｌ、　Ｍｅｄ 、＋　１　：　４７３−４８８　（１９８３）を参照〕Ｖ・二挿入した。ｃ　ｌ ａｃベクターはｃ　ｌａｃ　ＤＮＡをＢ、ＩＩ］Ｈ１で消化し、接着末端をＤＮ ＡボリメラーぜＩ大フラグメントで修復し、そのＤＮＡ　ｆ、Ｈｌｎｄｌｌ　で 消化することにより調製した。得らね、たシラスミド’（ｃ　５ＶＨＰ１ａｃ） 　はＰｖｕｌ　平滑末端に連結することによりＢａＩＩＪ（１部位を生成した。

ｃ　５ＶＨＰｌａｃからＥｃｏＲｌ−Ｈ１ｎｄｌｌｌフラグメントを作り、プラ スミどの複製開始点を含むｐｓＶＯａ　（メロンらの上記文献参照ンのＥｃｏＲ ｌ−Ｈｉｎｄｌｌフラグメントに連結し、得られたプラスミドｐ　Ｓ　Ｖ　ＨＰ 　Ｏａ全選択した。その後、ｓｖ、Ｈ）複製開始点／エンハンサ−を含むｐｓＶ ＨＰＯａの３４０　ｂｐ　ＢｅｏＲｌ−Ｈ１ｎｄｌｌｌフラグメントを作り、両 末Ｄｊ４ｉＤＮＡ　ｒｆリメラーゼＩ大フラグメントで平滑末端とし、そして上 記のＸｈｏ■消化し、平滑末端化Ｉ）９１０２３（Ｃ）ベクターに連結した。Ｈ ｉｎｄｌｌ−ＥｃｏＲ１フラグメント中のＢａｍＨ１部位が■Ａ遺伝子に最も接 近するような向きをもつ得られたプラスミド（ｐ９ｘｏｚ３（Ｃ１／Ｘｈｏｌ／ 平滑末端プラスＥｃｏＲ７／Ｉ（ｉｎｄｌｌｌ／平滑末端５ｖ４０複製開始点プ ラスエンノ・ンサー）はｐＥｓ１０５　と命名した。このプラスミドｐＥｓ　１ ０５をＢａｍＨ７とＰｖｕ■で、またはＰｖｕ■だけで消化して、アゾンウィル ス主要後期プロモーターを含むＢａｍＨ■−Ｐｖｕ■７ラグメント（フラグメン トＢ）および耐性遺伝子（テトラサイクリン耐性）と他の配列との間にそのシラ スミドを含むＰｖｕｌ１７ラグメント（フラグメントＣ）を単離した。フラグメ ントＡ、ＢおよびＣを連結し、第７図に示すシラスミドを単離してＲＫＩ−４と 命名した。プラスミド”ＲＫ　１−４　はメリーランド州ロックビルのアメリカ ン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託され、寄託番号ＡＴＣＣ３９９４ ０のもとに入手可能である。

実施例１０：ＣＨ○細胞によるＥＰＯの発現一方法ｒ上記のプラスミド１）ＰＴ Ｆ’ＬＬ３からのＤＮＡ（２０μｇ）を制限エンドヌクレアーゼＣＩＩＬＩで消 化して線状化し、そしてプラスミ）’ｐＡａＤ２６ＳＶｐ（Ａ）１からのＣ１ａ 　ｌ消化ＤＮＡ（２μ９）（アデノウィルス主要後期プロモーターにより制御さ れる完全なジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）　を含む〕に連結した〔カク７７ ン（Ｋａｕｆｍａｎ）およびシャープ（Ｓｈａｒｐ）のＭｏ１．　ａｎｄ　Ｃｅ １１Ｂｉｏ１．２：　１３０４−１３１９（１９８２）　を参照〕。この連結Ｄ ＮＡ　を使ってＤＨＦＲ−ネＮ　ティア”ＣＨＯ細胞（ＤＵＫＸ−ＢＩＩ。

カー７：／　（Ｃｈａｓｉｎ　Ｌ、Ａ−）およびアーラウプ（Ｕｒｌａｕｂ　Ｇ 、）のＰＮＡＳ　７７　：　４２１６−４２２０　（１９８０）を参照〕をトラ ンスフェクションし、２日間増殖後、少なくとも１つのＤＨＦＲ遺伝子を組み込 んだ細胞をアルファ培地（ヌクレオチドを欠き、１０チ透析ウシ胎児血清を補充 したもの）で選択した。選択培地で２週間増殖後、コロニーをもとの平板から採 取し、１プール当り１０〜１００個のコロニーから成るグループに分け、再度ヌ クレオチド欠損培地で培地上全面に増殖するまで培養した。

増殖プールからの培地上清をメトトレキセート選択に先立ってＲ工ＡでＥＰＯに ついて検定した。陽性のＥＰＯ生産を示したプールはメトトレキセー）　（０， ０２μＭ）の存在で増殖させ、サブクローニングして再度検定した。ＥＰＯＣ１ ａ　４α４，０２　プールからサブクローニングされた単一のＥＰＯＣ’ｌａ　 ４α４．０２−７は０．０２μＭ　ＭＴＸ　ｆ：含む培地中に４６０　ｎ９／ａ ｌのｇｐｏを放出した（第１０表参照）。ＥＰＯＣ１ａ　４　ａ４．ｏ　２−７ はＥＰＯ生産用に選ばれた則胞株であり、アメリカン・タイプ・カルチャー・コ レクションに寄託番号Ａ’ｆ’ＣＣＣＲＬ８６９５　として寄託された。一般に 、このクローンは次第に増加する濃度のＭＴＸ中で段階的選択にかけると、さら に高レベルのＥＰＯを生産する細胞を生成するであろう、Ｒ工Ａで陰性であった プールについては、メトトレキセート（０，０２μＭ）の存在下で増殖した相対 培養物からのメトトレキセート耐性コロニーＩＲ工ＡでＥＰＯについてプールご とに再び検定しｔ０陽性でなかったこれらの培養物をサブ、クローニングし、さ らに増加する濃度のメトトレキセート中で増殖させた。

段階的メトトレキセー）　（ＭＴＸ）選択は、次第に増加する濃度のメ））レキ セードの存在下で細胞を培養して生存細胞を選択するというサイクルを繰シ返す ことにより達成された。各回ごとに培養上清中のＥＰＯをＲ工Ａおよびｉｎ　ｖ ｉｔｒｏ生物活性により測定した。各段階的増幅において使用されたメトトレキ セートの量は０，０２μＭ、０．１μＭおよび３．５μＭであった。

第１０表に示すように、０．０２μＭのＭ’Ｌ’Ｘ　による１回の選択後に有意 介のＥＥＰＯが培地中に放出された。

アルファ培地中０．０２ ４α４プール　Ｒ工Ａ　１７　ｎ　９／ｒ：ｉｌ　５０　ｎ　９ｉａｌｐｏ−： 、ｔう１．、ダーＨＥＰＯＦＬＩ　３からのＤＮＡをＥｃＯＲ７で消化し、ＥＰ ○遺伝子を含む小さなＲＩ　フラグメントをプラスミドＲＫＩ−４（実施例１０ 参照）のＢｃｏＲ１部位内でサブクローニングした。次に、このＤＮＡ　（ＲＫ ＦＬ　１３　）を用いてＤＨ１ｉ’Ｒ−ネガティブＣＨＯ細胞を直接（消化せず に）トランスフェクションし、そして上記の実施例１０のようにして選択および 増幅を行った。

また、ＲＫＦ’Ｌ　１３　ＤＮＡはプロトプラスト融合および微量注射法によＪ ＣＨＯ細胞に挿入した。プラスミドＲＫＦ’Ｌ　１３はメリーランド州ロックビ ルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託され、寄託番号ＡＴ ＣＣ３９９８９のもとに入手可能である。

第１１表 アルファ培地　アルファ培地中０．０２μＭ３Ｈ−Ｔｈｙ　−−１，５Ｕ／ｒａ ｇ 単一：Ｉ　ｏ　＝　−Ｒ工Ａ　９０　ｎ　９／Ｉｌｌ好Ａな単一コロニークロー ンはメリーランド州ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ ンに寄託され、寄託番号ＡＴＣＣＣＲＬ　８６９５のもとに入手可能である。

ＥＰＯゲノムクローンの発現のために使用したベクターはｐｓＶＯｄ　（メロン らの上記文献参照）である。ｐｓＶＯａからの　ｌＤＮＡはＨｉ　ｎｄＩ［ｌで 完全消化し、ＤＮＡポリメラーゼＩ犬フラグメントで平滑末端とした。ＥＰＯゲ ノムクローンのラムダ−、Ｈｌｉ：ＰＯ３はＢｃｏＲｌとＨｌｎｄｌｌｌで完全 消化し、ｇｐｏ　遺伝子を含む４．０ｋｂフラグメントを単離して上記のように 平滑末端とした。Ｈｌｎｄ［１部位からポリＡシグナルをちょうど越えた領域ま でのこのフラグメントのヌクレオチド配列は第４図および第４表に示す。ＥＰＯ 遺伝子フラグメントをｐｓＶＯｄシラスミドフラグメント内に挿入し、そして両 方の向きの正しく構築された組換え体を単離して確かめた。シラスミド’ＣＺ２ −１は１８貫の向き（すなわちＥＰＯの５′末端が５Ｖ４Ｑ開始点に最も接近す る）でＥＰＯ遺伝子を有し、プラスミド’ｃｚｌ−３はそれと反対の向き（すな わちｌｂ−の向き）である。

シラスミドＣＺ１−３　およびｃｚ２−１は実施例７のようにしてＣ０８−１細 胞をトランスフェクションし、培地を収獲して免疫学的に反応性のＥＰＯについ て検定した。ｃｚ２−１からは培養上清中に約３１ｎし宏のＥＰＯが検出され、 ＣＺＩ−３からは１６〜３１　ｎｇ／ｎｌのＥＰＯが検出さｈ　た。

ゲノムクローンＨＥＰＯ１，ＨＥＰＯ２およびＨＦＥＰＯ６は類似の方法でＣＯ ８細胞に挿入し且つ発現させることができる。

マウスメタロチオネインプロモーターの転写制御下にあり且つ完全ウシ乳頭腫ウ ィルスＤＮＡに結合されたＥＰＯｃＤＮＡ配列を含むプラスミドは次のようにし て作成された：ｐＥＰＯ４９ｆ プラスミド５Ｐ６１５をＰｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃから購入した。このシラ スミドをＥｃｏＲＩで完全消化し、ラムダ−ＨＥＰＯＦＬ　１３からの１３４０ ｂｐ　ＥｃｏＲｌ　７ラグメントをＤＮＡ　リガーゼによシ挿入した。ＥＰＯ遺 阪子の５′末端がＳＰ６プロモーターに最も接近している（ＢｇｌＩおよびＨ１ ｎｄｌ消化で測定ン得られたシラスミドを１）ＥＰＯ４９５と命名した。この方 向性において、ｐＳＰ６１５ポＩＪ　ｌ）フカ−中のＢａｍＨ工部位上部位Ｏ遺 伝子の５′末端に直接に隣接している〇 ｐＭＭＴｎｅｏΔＢＦＶ 第８図に示すシラスミドｐｄＢＰＶ−１ｉ４ＭＴｎｏｏ　（３４２−１２）　Ｃ ロー（Ｌａｗ）　らの）Ａｏｌ、ａｎｄ、Ｃｏ１コ　Ｂｉｏｌ、３：２１１０− ２１１５（１９８３）’を参照、１１　ｋ　Ｂａｕ＋Ｈ７で完全消化して、ＢＰ Ｖ　ゲノムを含む約８ｋＬ＋の太き・ｔフラグメントと、ｐＭＬ２複製開始点お よびアンピシリン耐性遺伝子、メタロチオネインプロモーター、ネオマイ７ン耐 性遺伝子およびＳ■４０４？すＡシグナルを含む約６．５　ｋｂの小さなフラグ メントの両フラグメントを得た。

消化したＤＮＡ　−１ＤＮＡ　リガーゼで再び環状化し％６．８ｋｂフラグメン トのみを含むプラスミド１ＥｃｏＲ１とＢａｍＨｌ　制限エンドヌクレアーゼ消 化により同定した。この種のプラスミドをｐＭＭＴｎｅｏ　ＪＢＰＶ　ト命名シ ；’ｃ。

ｐＦＪＰｏ　１５　ａ ｐＭＭＴ　ｎ　ｅ　ｏΔＢＰＶ　２　Ｂｇ１■で完全消化した。ｐＥＰ０４ｇ５ をＢａｍＨｌとＢｇｌ［で完全消化して、全ＥＰＯコーディング領域を含む約７ ００　ｂｐフラグメントをゲル電気泳動により単離した。Ｂｇｘｌ［消化ｐＭＭ ＴｎｅＯΔＢＰＶと７００　ｂｐ　ＢａｍＨ７／Ｂｇ１１１ＥＰＯフラグメント とを連結し、　ＥＰＯｃＤＮＡ　ｔ−含む得られたプラスミドはＢＰＯ遺伝子に 特異的なオリゴヌクレオチドプローブａ（ＧＧＴＣＡＴＣＴＧＴＣＣＣＣＴＧＴ ＣＣ）　ｆ使用−ｊ　ル”　Ｏ二−ハイブリダイゼーションによシ同定した。ハ イズリダイゼーシコン分析で陽性であったシラスミドのうち％ＥＰＯｃＤＮＡの ５′末端がメタロチオネインプロモーターに最も接近する方向性のＥＰＯｃＤＮ Ａをもつ１つのプラスミド（ｐＥＰＯ１５ａ）がＥｃｏＲｌおよびＫｐｎ　ｌ消 化によシ同定された。

ｐＢＰＶＪＰ○ プラスミド″’　ｐＥＪη１５ａをＢａｍＨｉで完全消化して線状化した。

シラスミドｐｄ１３ｐｖ−ＭＭＴｎｅ　ｏ　（３４２−１２）もまたＢａｍＨｌ 　で完全消化して、６．５ｋｂと８ｋｂの２つのフラグメントを得た。

全ウシ乳頭腫ウィルスゲノムを含む３に’ｔ）フラグメントをゲル電気泳動によ り単離した。ｐＥＰｏ　１５　ａ　／　ＢａｍＨｌと８　ｋｂ　ＢａｍＨｉフラ グメントとを一緒に連結し、ＢＰＶフラグメントを含むシラスミＩ−″’　（ｐ ＢＰＶ−′Ｆ２Ｐ○）は、　ＢＰＶゲノムに特異的なオリゴヌクｖオｆ　ｋ”フ ｏ−フａ（Ｐ−ＣＣＡＣＡＣＣＣＧＧＴＡＣＡＣＡ−ＯＨ）ヲ使用−Ｊ−ルコロ ニーハイプリダイゼーションによシ同定した。ｐＢＰＶ−ＥＰＯＤＮＡのＨｉｎ ｄｌｌ消化は、ＢＰＶゲノムの転写方向がメタロチオネインゾ０モｐ　（第８図 のｐａＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（３４２−１２）を参照）の転写方向と同じである ことを示した。プラスミドｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（３４２−１２）はメリー ランド州ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレク／ヨンから寄託 番号ＡＴＣＣ３７２２４のもとに入手可能である。

発現 ＥＰＯを発現させるために次の方法を使用した。

方法ｌ ２９１−２９８（１９７８）を参照）ＣＨＯ細胞全標準的なリン酸カルシウム沈 殿法〔ゲノム（Ｇｒａｈｍ）らのＶｉｒｏｌｏｇｙ＋５２：４５６−４６７（１ ９７３）を参照〕によりトランスフェクションした。トランスフェクションの５ 時間後、トランスフェクション用培地を除き、グリセロールンヨツク（ｇｌｙｃ ｅｒｏｌｓｈｏｃｋ）　を行い、洗浄し、そして１０％ウシ胎児血漬を含む新し いアルファ培地を加えた。・１８時間後、細胆全トリプシン処理り、テ５００　 ｆ’９／ｍｅ　ノＧ　４１８　ｋ含ムＤＭＥ　ｔＢＪｌｔｘ中Ｋ　１　：　１０ の比で分散させ〔サザ７　（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）らのＭｏｌ、　Ａｐｐｌ、　Ｇ ｅｎｏＬ＋１：３２７−３４１（１９８２）を６照〕、それらの細胞ｆ：２−３ 週間インキュベートした。次いで、Ｇ４１８　耐性コロニーをミクロタイターウ ェル（ｍｉｃｒｏｔｉｔｏｒ　ｗθ１１）内に個々に単離し、Ｇ４１８の存在下 で培地全面がやや密集フるまで増殖させた。

その後、細胞を洗浄し、１０チウシ胎児血１？Ｆ　′（ｆ−’＠む新しい培地を 加えて２４時間後に培地を収獲した。その調整培地を試験し、ラジオイムノアッ セイおよびｉｎ　ｖｉｔｒｏバイオアッセイによりＥＰＯについて陽性であるこ とがわかった。

方法■ Ｃ１２７または３Ｔ３．細１１！１ｋ、方法ｌで述べたように、２５　／’９の ｐＢＰＶ−ＥＰＯと２μ９　（７）　ｐｓｖ２．ｎｅｏ　（ｆヂンら）上記文献 参照）を用いて同時トランスフェクションした。これは大体１０倍モル過刺のｐ ＢＰＶＬＥＰＯを使用する。トランスフェクション後の手法は方法Ｉと同じであ る。

方法用 方法Ｉで述べたように、Ｃ１２７細胞を３０μ９のｐＢＰＶ−ＥＰＯでトランス フェクションした。ｌ・ランスフエクションおよび分散（１：１０）の後、３日 おきに新しい培地と取り換えた。

約２週間後にＢＰＶ形質転換細胞の巣が出現しまた。個々の巣をミクロタイター 皿の１θｍウェル内に別々に採ｔ？ｌ　シｓ　やや密集した単層になるまで増殖 させ、調整培地のＥＰＯ活性または抗原性について検定した。

プラスミドベクターｐＩ’／ＥＶはメリーランド州ロックビルのアメリカン・タ イプ・カルチャー・コレクションから寄託番号ＡＴＣＣ３９９９１のもとに入手 可能である。このベクターを次のように修飾した： ｐＩＶＥＶＮ工 ｐＩＶＥＶ　ｔ−ＥｃｏＲＩ　テ消化しテｉｌｌ状化Ｌ、ＤＮＡ　ｙＮリメ９− セエ犬フラグメントにより平滑末端とし、そして単一のＮｏ　ｔ、ＩすＣＣＧＣ ＣＧＧＣＧＧ を平滑末端連結反応により挿入した。得られたプラスミドは、ＩＶＥＶＮ工と命 名した。

ｐＩＶＥＶｓ工 ｐＩＶＥＶ　ｆ　Ｓｍａ工で消化してこのプラスミドを線状化し、そして単一の ５ｆｉＩ　リンカ− を平滑末端連結反応により挿入した。得られたシラスミドはｐ工■ｆｆｓ工と命 名した。

プラスミ）”　ｐＩＶＥＶｓ工をＫｐｎＩで消化して線状体し、二本鎖エキソヌ クレアーゼＢａ１．３１で消化することにより各末端から大体Ｏ〜１００　ｂｐ を除去した。完全に平滑化されていない末端ｌＤＮＡ＋Ｆ？リメラーゼエ大フラ グメントで平滑末端とし、ポを平滑末端連結反応により挿入した。ポリリンカー は両、々の方向に挿入された。ポリリンカー中のＢｇ’ｌ１１部位がポリヘドロ ン遺伝子プロモーターに最も接近する向きでポリリンカーを含むシラスミドを、 工ｖＦＪＶＳよりｇＫｐと命名した。ポリリンカー中のＫｐｎ工部位カＩリヘド ロン遺伝子プロモーターに最も接近するプラスミドはｐ工ＶＥＶＳＩＫｐＢｇと 名づけられた。ｐ工ＶＥＶＳ　１中のもとのＫｐｎＩ部位とポリへドロン遺伝子 プロモーターとの間で欠失された塩基対の数は測定しなかった。ｐＩ■■Ｓより ｇＫｐはメリーランド州ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレク ションに寄託され、寄託番号ＡＴＣＣ３９９８８のもとに入手可能である。

、：ｆｆＥＶＳＩＢｇＫｐＮＩ ｐ工■■Ｎ工をＫｐｎＩとＰｓｔＩで完全消化して２つの７ラグメントを得た゛ 。このプラスミドの複製開始点およびポリヘドロン遺伝子の３′末端を含む大き い方のフラグメント′（フラグメントＡ５をゲル電気泳動によシ単離した。ｐ工 ＶＥＶＳ工Ｉ３ｇＫｐをＰｓｔＩとＫｐｎＩで完全消化して２つのフラグメント を得、ポリヘドロン遺伝子プロモーターおよびポリリンカーを含む小さい方のフ ラグメント（７ラグメントＢ）’ｔ−ゲル電気泳動によシ単離した。その後、７ ラグメントＡおよびＢをＤＮＡ　リガーゼにより連結して、ポリリンカーが挿入 された部分欠損ポリへドロン遺伝子を含みさらにそのポリへドロン遺伝子領域の 両側に存在するＮｏｔ工部位（破壊されたＫｃＯＲＩ部位に代わるもの）とＳｆ ｉ工部位を含む新しいシラスミドｐＩＶＥＶＳＩＢｇＫｐＮＩを作、工ＶＥＶＳ ＩＢｇＫｐＮＩ　ｆ　ＥｃｏＲＩで完全消化してこのプラスミドｋｍ状化し、５ ムｌ’　−ＨＥＰＯＦＬＩ　３カラノ１３４０　ｂｐ　ＫｃｏＲＩフラグメント を挿入した。ＥＰＱｔ伝子の５′末端がポリヘドロン遺伝子プロモーターおよび ポリヘドロ遺伝子の３′末端に最も接近するような向きでＥＰＯ遺伝子を含むシ ラスミドはＢｇ１１１消化により同定した。上記の方向性をもつこれらのシラス ミドの１つはｐ工ｖｐｐｏと命名された。

多量のｐ工ＶＥＰＯプラスミドは大腸菌株ＪＭＩＯＩ−ｔｇｌを形質転換するこ とによシ調、製した。このプラスミドＤＮＡ　ｆ、澄明溶菌法（ｃｌｅａｒｅｄ 　１ｙｓａｔｅ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ；　マニアチス（Ｍａｎｉａｔｌｓ）およ びフリツシュ（Ｆ’ｒｉｔθａｈ）のコールド・スプリング・ハーバ−・マニュ アルを参照〕により単離し、　ＣｅＣ１遠心によシさらに精製した。野性型オー トグラファ・カリフオルニカ（ＡｕｔＯｇｒａｐｈａ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ）　多角体病ウィルス（ＡｃＮＰＶ）株Ｌ−ＩＤＮＡはウィルス粒子のフェノー ル抽出、続いて行われるウィルスＤＮＡのＣａＣｊｌ　Ｗｔ製によシ調製した。

これらの２つのＤＮＡはリン酸カルシウムトランスフェクション法〔ボッター（ Ｐｏｔｔｅｒ）およびミラー（Ｍｉｌ−１ｅｒ）’　。

１９７７参照〕によりスポビプテラ・フルギベルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒ ｕｇｉｐａｒｄａ）細胞工ＰＬＢ−３Ｆ−２１（ポーン（Ｖａｕｇｈｎ）らｃＤ ＩｎＶ４ｔｒｏ　Ｖｏｌ、Ｌ　２１３〜２１７（１９７７）を参照〕に同時トラ ンスフェクションした。同時トランスフェクションされる細胞の各平板に対して １μ９の野性型ＡｃＮＰＶ　ＤＮＡと１０μ９のｐ工■ＴＯを使用した。平板は ２７℃で５日間インキュベートした。その後、上清を回収して、上清中のＥＰＯ 発現をラジオイムノアッセイおよびｉｎ　Ｖｉｔｒｏバイオアッセイによシ確か めた。

実施例１５：ＥＰｏの精製 ＥＰ　Ｏ濃度力２００　μｇ／　Ｒ，以下（Ｄ、　ＣＯ８１ｌＪＪ胞ＦＡＭ培地 （１２ｆｆｉ　）は０．４６５ｍ２（５平方フイート）の膜を備えたミリポア・ はリカン（Ｍｉ’１１．１ｐｏｒｅ　Ｐｅ’１ｌｉｃａｎ）のようなｉｏ、ｏｏ ｏ　分子量の切断限外濾過（ｃｕｔ　ｏｆｆ　ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ）膜を使用して、６００　ｍｌＫ濃縮した。検定は実施例６のようにしてＲＩＡ で行った。限外濾過からの保持物はｐ　Ｈ７，０に緩衝化した１０ｍＭリン酸す ）　ＩＪウム４ｆｉに対して透析した。濃縮および透析した調整培地は全タンパ ク質３８０■中Ｆ２ＰＯ２，５ｍｇを含んでいた。

このＥＰＯ溶液をさらに１８６ｍＪＫ濃縮し、沈殿したタンパク質を１１０，０ ００Ｘ９　で３０分間遠心することにより除諭た。

ＥＰＯ（ｚ、ｏη）を含む上清は５０チ酢酸でｐＨ５，５に調節し、４℃で３０ 分攪拌し、沈殿物を１３０’０ＯＸ９で３０分間遠心することによシ除いた。

カルボニルメチルセファロースクロマトグラフィーＥＰＯ２００μｇ　（全タン パク質ｚ４ｍｙ＞を含む遠心からの上ｇ（２０ｍ／）は、１０ｍＭ酢酸ナトリウ ム（ｐＨ５，５）中で平衡化したＣＭ−セファロース（２０ゴ）を充填したカラ ムに加え、同じ緩衝Ｗ　４０　ｍｌで洗浄した。ＣＭ−セファロースに結合（、 ＊ＥＰＯは１．０　ｍＭ　リン酸ナトリウム（ｐ）（５，５）中のＮａＵ（０− １）の勾装置００ｍ１で溶離した。ＥＰＯ含有画分（全タンパク質２η中全部で ５０μｇ）を集め、アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）ＹＭＩ　Ｑ限外濾過膜を使って２ ａｌＶＣ濃縮した。

逆相ＨＰＬＣ ＣＭ−セファロースからのＥＰＯを含む濃縮画分は、バイダック（Ｖｙｄａｃ　 ）　Ｃ−４カラムを使用する逆相ＨＰＬＣによりさらに精製した。１０％溶剤Ｂ （溶剤Ａは０．１チＣＦ３ＣＯ２Ｈ／Ｈ２０であシ；溶剤Ｂは０１チＣＦ’３Ｃ Ｏ２Ｈ／Ｃ］’３ＯＮである）で平衡化したカラムに１ｒｕｌ１分の流量でＥＰ Ｏｔ−加えた。このカラムラ１０チ溶剤Ｂで１０分間洗浄し、ＥＰＯを溶剤Ｂの 直線濃度勾配（１ｉｎｅｒ　ｇｒａｄｉｅｎｔ）　（６０分で１０−７０％）で 溶離した。

ＥＰＯ含有画分（全タンパク質１２０μ９中ＥＰＯ約４０μｇ）を集めて凍結乾 燥した。凍結乾燥ＥＰＯは０．１５　Ｍ　ＮａＣ４ｊを含む０．１　Ｍ　）リス −Ｉ（Ｃ意（ｐＨ７，５）中で再調製し、逆相ＨＰＬＣによシ再びクロマトグラ フ処理を行った。ＥＰＯ含有画分を集め、ＳＤＳ　−ポリアクリルアミ）’（１ ０％）ゲル電気泳動によシ分析した〔ラメリ（Ｌａｍｅｌｉ　＊　Ｕ、に、）、 　Ｎａｔｕｒｅを参照〕。集めたＥＰＯ画分は全タンパク質２５μ９　中ＥＦ’ Ｏ１５，５μｇを含んでいた。

本発明はその好適な実施態様を含めて詳しい説明がなされた。

しかしながら、本明細、！Ｆおよび添付の図面を考慮する１９に、当業者は請求 の範囲に記４市の本発明の精神および範囲を逸脱することなく修飾および改良が 可能であることｋｒめるであろう。

文　献 １９）Ａｎａｇｎｏｓ仁ｏｕ、　Ａ＋、　Ｂａｒｏｎｅ、　Ｊ、、　Ｖｅｄｏ、 　Ａ、、およびＦｒ１ｅｄ、　Ｗ。

３７１　Ｓｙ仁ｋｏｗｓｋｉ、Ａ、Ｂｉｏ、Ｂｉｏ　、Ｒｅｓ、Ｃｏｒｎｍ、９ ６：１４３−１４９　（１９８０１３８）　Ｍｕｒｐｈｙ、　Ｍ、および　Ｍｉ ｙａｋｅ、Ｔ、Ａｃ仁Ｂ、　Ｈａｅｍａ仁ｏＩ　Ｊｎ。

４６：１３８０−１３９６　（１９８３）３９１　Ｗａｇｈ、　Ｐ、　Ｖ、およ び　ＢａｈＬ、　Ｏ，Ｐ、　ＣＲＣＣｒｉ仁１ｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　ｉｎＢ ｉｏｃｈｅｍｉｓ仁ｒｙ　３０７−３７７　（１９８１）４０）　Ｗａｎｇ、　 Ｆ、　Ｆ、、　Ｋｕｎｇ、　Ｃ，Ｋ、−Ｈ，およびＧｏｌｄｗａｓｓｅｒ、　Ｅ 、　Ｆｅｄ。

Ｐｒｏｃ、Ｆｅｄ、Ａｍ、Ｓａｃ、Ｅｘ　、Ｂｉｏｌ、４２：１８７１　（ａｂ ｓｔｒｌ　（１９８３）４１１　Ｌｏｗｙ、　Ｐ、、　Ｋｅｉｇｈｌｅｙ、　Ｇ 、およびＢｏｒｓｏｏｋ、　Ｈ，Ｎａｔｕｒｅ　１８５：４２）ＶａｎＬｅｍ： ｅｎ、　Ｌ、およびＡｓｈｗｅｌｌ、　Ｇ、　Ｊ、　ＢｉｏＬ、　Ｃｈｅｍ。

２４７：４６３３−４６４０　（１９７２）４３１　Ｌｅｅ−Ｈｕａｎｇ、　Ｓ 、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ１−’Ｉ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８１：２７ ０８−２７１２　ｆ１９８４） ４４）　Ｆｙｈｒｑｕｉｓｔ、　Ｆ、、　Ｒｏｓｅｎｌｏｆ、　Ｋ、、　Ｇｒｏ ｎｈａｇｅｎ−Ｒｌｓｋａ、　Ｃ，。

Ｈｏｒ仁１１ｎｇ、　Ｌ、およびＴｉｋｋａｎｅｎ、　１．　Ｎａｔｕｒｅ　３ ０８：６４９−５６２４５１０ｈｋｕｂｏ、　Ｈ，、Ｋａｇｅｙａｍａ、　Ｒ， 、Ｖｊｉｈａｒａ、　Ｍ、、　Ｈｌｒｏｓｅ、　Ｔ、。

４６１　Ｓｕｇｇｓ、　Ｓ、Ｖ、、し７ａｌｌａｃｅ、　Ｒ，Ｂ、、　Ｈｌｒｏ ｓｅ、　Ｔ、、　Ｋａｗａｓｈｉｍａ、　Ｅ、Ｈ。

および１仁ａｋｕｒａ、に、Ｐｒｏｃ、Ｎａ仁’Ｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ 、Ａ。

７８：６６１３−６６１７　（１９８１）４７１　Ｗｏｏ、　Ｓ、　Ｌ、　Ｃ， 、Ｄｕｇａｉｃｚｙｋ、　Ａ、、　Ｔｓａｉ、　Ｍ、　−Ｊ、、　Ｌａｉ、　Ｅ 、Ｃ，。

Ｓｏｃ、Ｕ、Ｓ、Ａ、７０：２９８−３０２　（１９７３）５１）　ＵＬｌｒｉ ｃｈ、　Ａ、、　Ｃｏｕｓｓｅｎｓ、　Ｌ、、　Ｈａｙｆｌｉｃｋ、、　Ｊ、　 Ｓ、　Ｄｕｌｌ、　Ｔ、　Ｊ、。

Ｇｒａｙ、　Ａ、、　Ｔａｎ、　Ａ、　Ｗ、、　Ｌｅｅ、　Ｊ、、　Ｙａｒｄｅ ｎ、　Ｙ、、　Ｌｉｂｅｒｍａｎｎ。

Ｔ、　Ａ、、　ＳｃｈＬｅｓｓｉｎｇｅｒ、　Ｊ、’、　Ｄｏｗｎｗａｒｄ、　 Ｊ、、　Ｍａｙｅｓ、　Ｅ、　Ｌ。

Ｖ、、　Ｗｈｉｔｅｌｅ、　Ｈ，、Ｗａｅｅｒｆｉｅｌｄ、　Ｍ、Ｄ、　オヨヒ Ｓｅｅｂｕｒｇ、　ｐ、　Ｈ。

Ｎａｅｕｒｅ　３０９：　４１８−４２５　（１９８４）５２１　Ｆｉｓｈｅｒ 、Ｊ、Ｐｒｏｃ、Ｓｏｃ、Ｅｘ　仁Ｌ　Ｈｌａｌ、ａｎｄ　Ｍｅｄ、１７３：２ ８９−３０５５３）　Ｋｏｚａｋ、　Ｍ、　Ｎｕｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、　１２ ：８５７−８７２　（１９８４１５４１Ｂｗｎｒｏｎ、　Ｑ、Ｓ、およびＤａｖ ｉｓ、　Ｒ，Ｗ、　５ｃｉｅｎｃｅ　１９６：１８０−１８２５６１　Ｄｅｒｍ ａｎ、Ｅ、、Ｋｒａｕｅｅｒ、Ｋ、、Ｗａｌｌｉｎｇ、Ｌ、、Ｗｅｉｎｂｅｒｇ ｅｒ。

Ｃ，、Ｒａｙ、　Ｍ、、およびＤａｒｎｅｌｌ、Ｊ、　Ｔ、、　Ｃｅ旦２３　： 　７３１−５８）　Ｈｅｗｉｃｋ、　Ｒ，Ｍ、、　Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ、　 Ｍ、　Ｅ、、　Ｈｏｏｄ、　Ｌ、　Ｅ、、および６０）　Ｃａｒｎｏ仁ｔ、ｐ、 、ＤｅＦｌａｎｄｒｅ、Ｃ，Ｃ，Ｒ，Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｐａｒｉｓ１４３：４ ３２−　（１９６０） ２７ａａ　１６６（１（１ リーフ’Ｍ、熟さし４ガｙ ｐ９１０２３　（Ａ　） Ｘｈｏｒ 国際調査報告

Claims (35)

【特許請求の範囲】
1. （１）生物学的に活性なエリトロポエチンを発現するヒトｃＤＮＡクローンの作 成方法であって、 （ａ）精製したエリトロポエチンタンパク質をトリプシンで消化し； （ｂ）工程（ａ）で得られたトリプシンフラグメントのアミノ酸配列に基づいて オリゴヌクレオチドプローブのプールを作製し； （ｃ）工程（ｂ）のオリゴヌクレオチドプローブを用いてヒトゲノムＤＮＡライ ブラリーをスクリーニングし；（ｄ）そのプローブとハイブリダイズするクロー ンを選択し、そのクローンの塩基配列を決定してそれらがエリトロポエチンクロ ーンであるかどうかを調べ； （ｅ）工程（ｄ）からのエリトロポエチンクローンを同定し；（ｆ）工程（ｅ） からのクローンを使用してヒト胎児肝臓から作成したｃＤＮＡライブラリーをス クリーニングし；そして（ｇ）工程（ｆ）の胎児肝臓ｃＤＮＡライブラリーから エリトロポエチンクローンを選択する； 各工程から成る上記方法。
2. （２）発現制御配列に適切につながれた実質的に第３表に示すＤＮＡ配列を含む 宿主細胞を適当な培地で培養し、斯く生産されたエリトロポエチンを細胞および 培地から分離することから成るエリトロポエチンの生産方法。
3. （３）発現制御配列に適切につながれた実質的に第４表に示すＤＮＡ配列を含む 真核生物宿主細胞を適当な培地で培養し、斯く生産されたエリトロポエチンを細 胞および培地から分離することから成るエリトロポエチンの生産方法。
4. （４）宿主細胞は哺乳動物細胞である請求の範囲第２項または第３項に記載の方 法。
5. （５）哺乳動物細胞は３Ｔ３細胞である請求の範囲第４項記載の方法。
6. （６）哺乳動物細胞はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である請求の 範囲第４項記載の方法。
7. （７）前記ＤＮＡ配列はウシ乳頭腫ウイルスＤＮＡをさらに含むベクター内に挿 入される請求の範囲第４項記載の方法。
8. （８）薬学的に受容されるビヒクル中に請求の範囲第２〜７項に記載の方法によ り生産された治療上有効な量のエリトロポエチンを含有してなる医薬組成物。
9. （９）ｃＤＮＡクローンのラムダ−ＨＥＰＯＦＬ１３を含む組換えＤＮＡプラス ミドベクター。
10. （１０）請求の範囲第９項記載のトランスフアーベクターで形質転換された微生 物または細胞株。
11. （１１）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、酵母、哺乳動物細胞または昆虫細胞から選択 される請求の範囲第１０項記載の微生物または細胞株。
12. （１２）前記哺乳動物細胞は３Ｔ３、Ｃ１２７またはＣＨＯ細胞である請求の範 囲第１１項記載の微生物または細胞株。
13. （１３）請求の範囲第１１項記載の微生物または細胞株の制御されたｉｎ　ｖｉ ｔｒｏ増殖により生産された生物学的に活性なヒトエリトロポエチン。
14. （１４）実質的に第４表に示すヌクレオチド配列を有するゲノムＤＮＡクローン を含む組換えＤＮＡベクター。
15. （１５）請求の範囲第１４項記載のベクターで形質転換された哺乳動物細胞株。
16. （１６）前記哺乳動物細胞はＣＨＯ細胞である請求の範囲第１５項記載の細胞株 。
17. （１７）請求の範囲第１５項記載の細胞株の制御されたｉｎ　ｖｉｔｒｏ増殖に より生産された生物学的に活性なヒトエリトロポエチン。
18. （１８）実質的に第３表に示すアミノ酸配列１−１６６をコードするＤＮＡ配列 を含むｃＤＮＡ配列。
19. （１９）実質的に第３表に示すアミノ酸リーダー配列ＭＥＴ　ＧＬＹ……ＬＥＵ 　ＧＬＹをコードするＤＮＡ配列をさらに含む請求の範囲第１８項記載のｃＤＮ Ａ配列。
20. （２０）異種プロモーターおよび請求の範囲第１８項または第１９項記載のｃＤ ＮＡ配列を含む組換えＤＮＡベクター。
21. （２１）請求の範囲第２０項記載のベクターで形質転換された微生物または細胞 株。
22. （２２）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、酵母、哺乳動物細胞または昆虫細胞から選択 される請求の範囲第２１項記載の微生物または細胞株。
23. （２３）前記哺乳動物細胞は３Ｔ３、Ｃ１２７またはＣＨＯ細胞である請求の範 囲第２２項記載の微生物または細胞株。
24. （２４）ウシ乳頭腫ウイルスＤＮＡおよびＥＰＯをコードするＤＮＡ配列を含む 哺乳動物細胞。
25. （２５）前記細胞はＣ１２７または３Ｔ３細胞である請求の範囲第２４項記載の 細胞。
26. （２６）前記ＥＰＯ　ＤＮＡはマウスメタロチオネインプロモーターの転写制御 下にある請求の範囲第２５項記載の細胞。
27. （２７）前記細胞はｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（３４２ー１２）由来のＤＮＡを 含むプラスミドを有する請求の範囲第２５項記載の細胞。
28. （２８）約２００，０００単位／ｍｇ（タンパク質）以上の比活性を有する請求 の範囲第３項または第４項記載の方法により生産されたエリトロポエチン。
29. （２９）約２７５，０００単位／ｍｇ（タンパク質）以上の比活性を有する請求 の範囲第２８項記載のエリトロポエチン。
30. （３０）約２７５，０００〜３００，０００単位／ｍｇ（タンパク質）の範囲の 比活性を有する請求の範囲第３項または第４項記載の方法により生産されたエリ トロポエチン。
31. （３１）０一結合グリコシル化の存在によりさらに特徴づけられる請求の範囲第 ２８，２９または３０項記載のエリトロポエチン。
32. （３２）培地が胎児血清を含んでいることを特徴とする請求の範囲第２または３ 項記載の方法。
33. （３３）宿主細胞が哺乳動物細胞であることを特徴とする請求の範囲第３２項記 載の方法。
34. （３４）哺乳動物宿主細胞がＣＯＳ，ＣＨＯ，Ｃ１２７または３Ｔ３細胞である ことを特徴とする請求の範囲第３３項記載の方法。
35. （３５）請求の範囲第３２〜３４項記載の方法で製造された生物学的に活性なエ リトロポエチン。