JPH07507328A - Tcf変異体 - Google Patents
Tcf変異体Info
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- JPH07507328A JPH07507328A JP6515016A JP51501694A JPH07507328A JP H07507328 A JPH07507328 A JP H07507328A JP 6515016 A JP6515016 A JP 6515016A JP 51501694 A JP51501694 A JP 51501694A JP H07507328 A JPH07507328 A JP H07507328A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
TCP変異体
技術分野
本発明は、遺伝子操作により調製され、天然型TCPと比較してN−結合オリゴ
糖鎖の本数が異なり、さらに新規なアミノ酸配列を有するTCP変異体に関する
。本発明により得られるTCP変異体は生体内半減期が長く、肝臓実質細胞に対
する増殖活性及び腫瘍細胞の障害活性を有し、肝臓疾患の治療剤、抗腫瘍剤とし
て有用である。
背景技術
ヒト細胞由来の線維芽細胞が生産するUgk細胞障害性因子TCP−IIは、こ
れまで報告された抗腫瘍性蛋白質と全(異なる新規な抗III瘍性物質である。
本発明者らは、さらにこの蛋白質のcDNAのクローニングに成功し、その全ア
ミノ酸配列を推定するとともに、有用性を確認した。この新規な抗腫瘍性蛋白質
とその遺伝子はW090/10651として開示されている。
この新規抗腫瘍性蛋白質はTCP−Itと命名されている。本発明においては上
記WO90/10651に開示されたアミノ酸配列を有する糖蛋白質をTCPと
称する。TCFはTCF−IIとして従来呼ばれていた物質の別称として使用さ
れている。
このTCPは強い抗腫瘍活性と正常細胞の増殖活性を合わせもち、さらに肝臓実
質細胞の増殖因子であるHGFの多様なファミリーの一種であることが確認され
た。TCFはSDS電気泳動による分子量測定では78000±2000ダルト
ンおよび/または74000±2000ダルトンの分子量を示し、還元した場合
5200±2000ダルトンの共通のバンドであるA鎖と30000±2000
ダルトンおよび/または26000±2000ダルトンの2本のハンド(B鎖、
C鎖)を示す。
TCPは肝臓実質細胞の増殖因子であることから肝切除後の肝臓再生を目的とし
た利用が検討されている。しかしその体内半減期が短いため、その体内半減期を
延長することによりより効果の高いTCPを得る試みがなされてきた。
オリゴ糖鎖と血清半減期の関係については、エリスロポエチンなど一部の糖蛋白
質では研究がおこなわれ、同じ遺伝子からオリゴ糖鎖fl遣には微妙な差があり
、生物活性が異なる糖蛋白質が合成できることが知られている。またエリスロポ
エチンではwM鎖の有無によって生物活性が異なることが知られている。
しかしTCFのオリゴ糖鎖と生物活性との関係についてはこれまで殆ど知られて
いないのが現状である。
発明の開示
本発明者らは、TCFの有用性に注目し、肝臓疾患治療剤や抗III瘍剤として
の利用、疾病の診断のマーカーとしての利用を検討してきた。TCPはその生体
内半減期が約2分と極めて短い。このため、この生体内半減期を延長するために
、本発明者等はポリペプチド成分に遺伝子操作により変性したTCPを種種作成
し検討を行ったが、変性したTCFの殆どが生物活性を失うことが判明した。こ
のため、TCFの生理活性蛋白質としての活性を失うことなく、生体内半減期を
延長するために、TCPに存在する4カ所のN結合オIJゴ垢鎖に注目し、1つ
以上の糖鎖を削除した新規なTCP変異体を作成することを試みた。
本発明は、天然型TCPに比べ異なるアミノ酸配列を有し、N結合オリゴW!鎖
の数が減少し、かつ生体内半減期の延長された新規なTCP変異体を提供するこ
とを課題とする。
これらTCP変異体は、NtJ!鎖形成に関与するアミノ酸残基をコードするT
CF cDNAのヌクレオチド配列を変えることにより、および遺伝子的に変性
したTCF cDNAを発現させることにより得ることができる。
本発明により提供されるTCP変異体は、天然型のTCF中に存在する4カ所の
N結合オリゴ糖鎖が、少なくとも1以上特異的に欠失している。これらは、天然
型TCPのアミノ酸残基を変異させることにより、生物活性を失うことなく生体
内半減期が延長したTCP変異体で初めて得たものである。
天然型TCFのcDNAから推定した全アミノ酸配列(配列番号1)を第1図に
示す。糖鎖結合に関与するアミノ酸は図中に下線を付した。このアミノ酸配列は
発現後、シグナル配列が除去され、32番目のグルタミン残基がTCPのN末端
アミノ酸となると推測されている。4本のTCFのN結合オリゴ糖鎖はそのN末
端アミノ酸から258.366.530.617位のアスパラギンに結合してい
る。これは第1回において、289.397.561.648位のアスパラギン
に相当する。
またこのアミノ酸配列をコードするcDNA配列を第2図に示した。図中のO印
を付けたATGコドンからコーディング領域 ′である。
N糖鎖形成に関与するアミノ酸残基は、Asn−X−ThrまたはAsn−χ−
5erのアミノ酸配列を有している(なお、アミノ酸は三叉字表記法で示し、X
は任意のアミノ酸を示す)、この配列においてAsn Ser又はThrに相当
する塩基配列を他のアミノ酸をコードする塩基配列に置換するか、あるいは削除
した塩基配列を調製し、この塩基配列を真核細胞(特に好ましくは哺乳動物細胞
)中で発現させることにより目的とする糖鎖の欠失したTCP変異体を調製する
ことができる。糖鎖はNグリコシド結合で上記位置のAsnに結合するため、A
snをGin等TCFの立体構造に影響を与えないアミノ酸に置換するようなコ
ドンに置き換えることにより特定のオリゴtIM鎖の結合しないTCP変異体を
得ることができる。
^snの置換はGlnが特に好ましいアミノ酸であるが、Asp、Glu。
旧s、 SerまたはThrであっても良い、同様にSerをAlaなどのTC
Fの立体構造に影響を与えないアミノ酸に置換するようなコドンに置き換えるこ
とにより特定のオリゴI!鎖の結合しないTCP変異体を得ることもできる。
Serの置換はAlaが最も好ましいがPro、Gly、またはAsnであって
も良い、また同様に、Thrを他のアミノ酸で置換してもあるいは削除しても、
該当する部位にオリゴ糖鎖の結合しないTCP変異体を得ることができる。
Thrの置換はAlaが好ましいがVan、HisまたはAsnであっても良い
。
TCFの一次構造におけるN糖鎖の結合位置を模式図により示した(第3図)。
糖鎖の結合位置はN末端側より、1.2.3.4の番号をつけこの番号でvM鎖
を特定する。
この糖鎖結合に係わる部分のアミノ酸配列を糖鎖が結合しないように変更するた
めには、cDNAをPCR法(ポリメラーゼチェーンリアクノヨン法)により部
位特異的に変性させる。
反応は天然型TCPをコードするc DNAを鋳型としておよび合成オリゴヌク
レオチドをプライマーとして行う。プライマーの配列は上記したようにDNA配
列を削除するか、置換してデザインする。あるいは、他の変異導入方法であって
もよい。
TCP変異体を産生ずる細胞はこれら変性cDNAを含む発現ベクターでホスト
細胞を形質転換することにより確立できる。
TCP変異体は形質転換細胞の培養ブロスから回収できる。例えば、第1図にお
いて、1番目のオリゴPi鎖の結合位置である289位のAsnを置換するため
には、cDNAをインビトロ突然変異導入法やPCR法により変性する。これら
変性方法は、鋳型としてWo 90/10651に開示されている天然型TCP
をコードするcDNAおよびプライマーとして合成ヌクレオチドTCP−IR5
−TCAGTGTCCTGCATAGTAT−3’ を用いて行う。変性cDN
Aを含む発現ベクターは哺乳動物細胞などの真核細胞をトランスフェクトでき、
TCP変異体はトランスフェクトされた細胞培養上清から回収できる。
どのような真核細胞のホスト−ベクター系もTCP変異体の発現できる。最も好
ましいのくは、WO92/1053に開示されたサイトメガロウィルスのプロモ
ーターを用いたベクターとナマルバ細胞の組み合わせである。SV 40プロモ
ーター、DHFR遺伝子およびCIO細胞の組み合わせを用いる遺伝子増幅系あ
るいはウシのパピローマウィルスの複製開始点とマウスC127細胞の組み合わ
せを用いる発現系を含む一般的に用いられる系を例示できる。
TCP変異体の精製には生理活性蛋白質の精製に一般的に用いられる方法であれ
ばどのような方法でも使用することができる。
例えば、有I!溶媒によに沈澱法、塩析、ゲル濾過クロマト、モノクローナル抗
体を用いたアフィニティークロマト、電気泳動法などが挙げられる。
日本特許出願特願平3477236号に開示されている天然型TCFに対するモ
ノクローナル抗体をTCP変異体のアフィニティークロマトグラフィーに用いる
ことができる。
得られた精製TCP変異体は、凍結乾燥若しくは凍結保存することができる。
オリゴ糖鎖の除去の組み合わせにより15種類のTCP変異体が得られ、TCP
変異体はオリゴ糖鎖の除去の数で特定できる。例えば、1番目のオリゴ糖鎖が欠
失した変異体はTCP−1と称する。また4本のオリゴ糖鎖が欠失したTCPは
TCP−1234であり、2番目と3番めのオリゴ糖鎖が欠失したTCPはTC
P−23である。このようなTCFの糖鎖結合の模式図を第4図に示す。それぞ
れのTCFは、オリゴ糖鎖の欠失にともなう分子量の変化が認められた。
図面の簡単な説明
第1図は、天然型TCFのcDNAから推定した全アミノ酸配列を示す。図中に
下線を付したアミノ酸部分がN−結合糖鎖の結合に関与している配列である。
第2図は、天然型TCFのcDNA塩基配列を示す。本発明において変異を導入
するコドンに下線を付した。また図中の丸印を付したATGコドンからコーディ
ング領域に相当する。
第3図は、天然型TCFの一次構造の模式図を示す。
丸印はN結合型糖鎖付加部位を、また矢印はα鎖、β鎖切断点を示す。
第4図は、TCP及びTCP変異体におけるtI!鎖の結合状態を示す。図中の
横線がポリペプチド、縦線がオリゴ糖鎖を示す模式図である。
第5図は、TCP変異体のcDNAを含むプラスミドの構築を示す。
第6図は、TCPおよびTCP発現ベクターの構築を示す。
第7図は、代表的なTCP変異体のSDS電気泳動図を示ず。
第8図は、TCP変異体の肝臓実質細胞増殖作用を示す。
各グラフはそれぞれ次のTCP変異体の活性を示す。
(1) TCP、TCP−1,丁CF−2,TCP−3,TCP−4(2) T
CP−12,TCP−13,TCP−14,TCP−23,TCP−24,TC
P−34(3) TCP−123,TCP−124,TCP−1234,TCP
−134,TCP−234第9図は、TCP変異体の腫瘍細胞障害効果を示す。
第10閏は、TCP変異体を静脈注射したラットの血液中の濃度変化を示す。
本発明の実施により新規なTCP変異体が提供される0本発明により提供される
TCP変異体は糖鎖結合の係わるアミノ酸をコードする塩基配列が、他のアミノ
酸に変換されるかもしくは削除されたcDNAの発現により調製される。TCP
変異体はオリゴ糖鎖の結合部位および数を制御することにより、生体内半減期が
長くなる。
発明を実施するための最良の形態
以下に実施例を示しさらに本発明の詳細な説明する。
実施例I
TCP変異体の調製方法
DNA取り扱いは基本的にMo1ecular Clonning+^Labo
rat。
ryManual、 5econd Edition、 J、 Sambroo
k+ E、 F、 Fr1tsch、 T。
Maniatis +dA、 Co1d Spring Harber Lab
oratory Press、 NewYork、 1989)に示されている
方法に従った。
ITcF cDNAのクローニング
WO92101053に開示された方法により得られたTCP発現プラスミド6
.3 kb (本発明においては以下、プラスミドpcDTCF IIと称する
)を用いて、以下に示す方法により部位特異的突然変異を導入した。このプラス
ミドを含む大腸菌は生命工学工業技術研究所にFER?I BP−3479とし
て寄託されている。
2 o 亡 白、〜 法
】)方法1
u−11」二」B−Δl釦剋lこ」襄ロ辷ニョ乙久プラスミドpcDTCF I
I (6,3kb)は、制限酵素Ba+aHI 、Sph I (宝酒造:以下
制限酵素、使節酵素はすべて宝酒造社製のものを使用)で切断したプラスミドp
cDNA I (インビトローゲン社製)にヒトTCFcDNAのコーディング
領域を挿入することにより調製した。pcDTcF Uは制限酵素BamHI
、Sph Iを加え37°Cで1時間反応させ、反応終了後DNAをエタノール
沈澱により回収し、1%アガロースゲル電気泳動を行い、2.3kbのTCFc
DNA断片をゲルからシーンクリーン(820101社)により精製した。
一方、ファージDNAの複製型旧3splB(宝酒造)も同様に制限酵素Bam
HI 、 5pblで断片した後エタノール沈澱を行い水に溶かし、ベクター溶
液とした。ベクター(INA溶液とTCFcDNAを混合後、ライゲーションギ
フト (宝酒造)を用い反応させた。ライゲーション混合物の一部を大腸菌DH
5αの形質転換に供した。
この形質変換体と指示菌としての大腸菌NM522 (インビトローゲン社)を
混合して、1%bacto−tryptone+ 0.5%bacto−yea
stextract、 1%NaCj!、1%IPTG (i 5opropy
l−β−D−thiogalacL。
pylanoside、宝酒造社製)および1%Xga+(5−bro+ao−
4−chloro−3−indoly 1−β−D−galactoside、
宝酒造社製)を含むLB軟寒天プレート上に旺ぎプラークを形成させた。生じた
無色プラークから2本鎖DNAを調製し、また−末鎖DNAを調製して部位特異
的変異導入のだめの鋳型として用いた。
ii)部位特異的変異導入
N−糖鎖形成のコンセンサスアミノ酸配列Asn−X−Thrにおける第289
位アミノ酸AsnコドンをN−1!鎖形成のコンセンサスアミノ酸配列を作らな
いGlnコドンに置き換えた。アミノ酸の番号は、天然型TCFのN末端アミノ
酸メチオニン残基を第1位とする。オリゴヌクレオチドTCP−IR5’−TC
AGTGTCCTGCATAGTAT−3’をアブライドハイオシステムズ社製
DNA合成装置を用いて合成したく以下断りの無い限り使用したオリゴヌクレオ
チドは全て同社のDNA合成装置を用いて合成した)。
部位特異的変異導入は、オリゴヌクレオチド指向in vitro変異導入シス
テム(アマジャム社製)を用い、そ指示書によって行った。反応混合物で大腸菌
NM522を形質転換し、TCP−1プライマーを用いてプラークバイブリダイ
ゼーシラン技術によってスクリーニングした。
陽性プラークより1本lDNAを得て、Sangerらのdideoxy法(d
ideoxy chain termination method)により配
列の決定を行い、289位のAsnコドン(AAT)がGlnゴドン(CAG)
に置換された変異部位の確認をした。この陽性クローンの二本鎖DNAより1.
4kb Pstl−)1indll+断片を調製して、pBluescript
ssK” (ストラタジーン社製)のPstl−Hindll+切断に挿入し、
プラスミドpSKTCFPH−1を作った。
2)方法2
第339位、第563位及び第650位アミノ酸コドンへの部位特異的変異導入
はpolys+erasechain reaction (PCR)により行
った(R,)Iiguchi、 PCRProtocols P、177−18
3. Academic Press。
1990)。何れの部位も、Asn−χ−3erのNi1!鎖形成部位のコンセ
ンサスアミノ酸のSerコドンを^1aコドンに置換する変異を導入した。
第399位への変異導入には、変異を持つプライマー(ミュータンドブライ?−
) TCP−2R5’−CCAGATCTTGTTTGAGCTAAGTTGC
CC−3’および変異のないブライ? −TCP701F 5’−GCTGGG
ATCATCAGACACCAC−3“、ポリメラーゼAmpiitaq (宝
酒造)および鋳型としてペラスミド匹DTCF II 4量gを用いて25サイ
クルのPCB反応をおこなった。セントリコン100(アミコン社製)により反
応液がらプライマーを除去し、制限酵素Bgl II 、 EcoRI (宝酒
造)で切断した後、あらかしめ用意しておいたプラスミドpsKTcFPH(p
BlυescriptsK”のPstl+ Hind m切断部位にプラスミド
pcDTCF IIをPstl。
Hindl [7で切断した1、4kbの断片を挿入したもの)のEcoRI。
Bgl II 4.1kb断片とライゲーションさせた。ライゲーション混合液
の一部を用い大腸菌DH5αの形質転換に供した。アンピシリン耐性形質転換株
からプラスミドDNAを調製し、塩基配列を決定し第399位のSerコドン(
TCC)がAlaコドン(GCT)に置換した目的の変異を持つプラスミドρ5
KT(:FP)I−2を選びだした。同様にプラスミドpSKTCFPH−1の
Bgl II、 EcoRI 4.1kb断片と上記PCR産物を結合してps
KTcFPH−12を選びだした。また、PCR反応に由来する断片は全域にわ
たって塩基配列を調べた。抗生物質アンピシリンはシグマ社製を用いた。
第563位のSetコドンへの変異導入には、ミュータンドプライマーTCP−
3115’−ATACCAGCTGGGCAACATTGAGAAC−3°およ
びプライマーTCF1202F5’−GGCAACTTATCCCAAACAA
GATCTGG−3° を用い、プラスミドpcDTCP n 4量gを鋳型と
し、上記と同様にPCR反応をおこなった。セントリコン100による精製しプ
ライマーを除去したのち制限酵素Xhol、 Pvu ]II断を行った。あら
かじめ用意しておいたプラスミドpCDTCFΔXho (プラスミドpcDT
CF Ifから1.1kbxhoIUT片を除去したもの; 5.4kb)から
Xhol、5phl 4.8kb断片とPvu II 5phl 0.5kb断
片を精製しPCRによって得られた上記断片とをライゲーションキ、トにより結
合させた。ライゲーション反応液を用い大腸菌MC1061/ P3 (インビ
トローゲン社製)を形質転換した。
得られたアンピノリン テトラサイクリン耐性株から、上記プラスミドpsKT
cF−2の際と同様の方法でプラスミドDNAを調製して、第563位のSer
コドン(TCC)がへlaコドン(GCC)に置換されたプラスミドpcDTC
TΔXhoL3を得た。抗生物質テトラサイクリンはシグマ社製を使用した。
第650位のSerコドンへの変異導入には、2段階のPCR反応を行う方法を
採用した。第1回のPCII反応にはミュータンドプライマーTCP−4F 5
’−ACTCTGAATGAGGCTGAAATATGTG−3′とプライマー
TCP2203R5’−GGCATGCACAGTTGTATTGGTGGTG
CTTCAG−3’を用いた反応および、ミュータンドプライマーTCF−4R
5°−CACATATTTC^GCCTCATTCAGAGT−3’と天然型プ
ライマーTCF1685F 5’−AACAGGTTCTCAATGTTTCC
CAG−3’の反応を行った。鋳型はどちらも4量gのプラスミド四〇TCF
nを用いた。得られたPCR産物をDE81ペーパー(ワットマン社)を用いて
精製し、10分の1量ずつを取り第2回PC11反応に供した。プライマーはr
cF2203RとTCF1685Fを用いた。PCR産物はアガロースゲル電気
泳動により分離し、DE81ペーパーにより精製した。得られた断片を制限酵素
Bgl IIおよび5phTにより切断した。一方、匹り丁CFΔXholおよ
び匹DTCFΔXhoL3も制限酵素BglIlと5phIで切断して4.9k
b断片を精製したのち、上記Bgl El−5phlPCR断片とライゲーショ
ンキットによりそれぞれ結合した。1量分の1量の反応液を用い、大腸菌MCl
061/P3を形質転換した。得られたアンピシリン テトラサイクリン耐性株
から、上記プラスミドpSKTCF−2の場合と同様の方法でプラスミドpcD
TCFΔXhol−4(第650位のSerコドンTCTがへ1aコドンGCT
に置換されている)およびpcDTCFΔXhol−34(第563位および第
650位のSerコドンがそれぞれAhaコドンに置換されている)を得た。
□□□溌1ニジ浸≧シ(社)1束
1)トランジェント発現用ベクターの構築プラスミドpsXTcFPH,psK
TcFPH−1、pSKTCFPH−2およびpSKTCFPH−12をそれぞ
れ制限酵素Xholで切断し1.1 kb DNA断片を精製した。プラスムド
、pcDTCFΔXhol、pcDTCFΔXhol−3、pcDTCFΔXh
o1−4、およびpcDTCFΔXhol−34の4種のベクターも制限酵素X
holで切断し、上記4種の1.1kb DNA断片とのライゲー7ジン反応に
供した。プラスミドpSK丁CFP)Iの1.1kbとpcDTCPΔXhol
との組み合わせを除く合計15種のライゲーション反応後、大腸菌MC1,06
1/P3を形質転換し、15種の発現ベクターpcDTCF−1、pcDTCF
−2、pcDTCF−3、pcDTCF−4、pcDTCF−12、pcDTC
F−13、pcDTCF−14、pcDTCF−23、pcDTCF−24、p
cDTCF−34、pcDTcF−123、pcDTCF−124、pcDTC
F−134、pcDTCF−234およびpcDTCF−1234を選びだした
。これらプラスミドベクターの構造は、制限酵素切断による解析でIIした。こ
れらのプラスミドをCO5細胞等の哺乳動物細胞に導入するとサイトメガロウィ
ルス(CMV)プロモータによりTCFおよびTCF変異体の遺伝子の発現が検
出される。
これらのプラスミド構築法の概略を第5図に示す。
2) 安定発現用ベクターの構築
プラスミドpH5G396 (宝酒造)を制限酵素旧ndI[で切断し末端をD
NAプランティングキント (宝酒造)により平滑化し、シーンクリーンでDN
^を精製後、Notlリンカ−8s+er 5’−GCGGCCGC−3°(宝
酒造)を挿入し大腸菌DH5αを形質転換した。クロラムフェニコール耐性形質
転換体よりプラスミドDNA5を調製し、HindII+切断部位が無く、No
tl切断部位があるものを選びだし、pH5G Notl と命名した。このp
H5G Notlの5all、5phl切断部位に5a11.5phl制限酵素
切断部位にはさまれたTCF cDNA 2.3kb (全長)断片を挿入した
。コ(7) ヘク9−pH3G N−TCFから1.1kb (7)Xhol−
Xho+断片を欠失させptlsGN−TCFII ΔXと名づけだプラスミド
を得た。プラスミドpH5G N−TCFΔXを制限酵素BstPI、 5ph
lで切断し2.3kbのDNA断片を精製し、あらかじめ制限酵素BstPI。
sph+で切断しておいた上記15種のプラスミド(pcDTCF−1、I+C
D丁CF−2、pcDTCF−3、pcDTCF−4、pcDTcF−12、p
cDTCF−13、pcDTCF−14、pcDTcF−23、pcDTCF−
24、pcDTCF−34、pcDTCF−123、pcDTCF−124、p
cDTCF−134、pcDTCF−234およびpcDTcF−1234)お
よび同しく制限酵素BstPl、5phlで消化しておいたpcDTCF (天
然型TCFcDNAを持つ)をDNA ライゲーションキットによりライゲーシ
ョンして大腸菌DH5αの形質転換に供した。得られたクロラムフェニコール耐
性形質変換体よりプラスミド[1llA Wtを調製し、プラスミドpH5G
Not[ニ2.3kbの天然型TCPまたは各変異体TCFcDNA断片が挿入
された構造を持つプラスミド16種(pH3GN−TCP、pH5GN−TCF
−1、pH5GN−TCP−2、pH5GN−TCF−3、pH5GN−TCP
−4、pH5GN−TCP−12、pi(SGN−TCP−13、pH5GN−
TCP−14、pH5GN−TCF−23、pH5GN−TCF−24、pH5
GN−TCP−34、pH5GN−TCP=123、pH5GN−TCF−12
4、pifSGN−TCP−134、pH3GN−TCP−234、pH5GN
−TCF−1234と命名した)を選びだした。これら16種のプラスミドを制
限酵素5ail、Notlで切断し、あらかしめ制限酵素Xhol、 Notl
で消化しておいた発現ヘク9−BCMGSneo (ウシパピローマウィルス複
製開始点およびサイトメガロウィルスプロモーターを持つ、大腸菌でも複製可能
なプラスミド;遺伝子工学ハンドブックp297−p299羊土社1991;鳥
山−博士、現バーゼル免疫学研究所より供与)と混合しライゲーション反応に供
した0反応液で大腸菌DH5αを形質転換し、得られたアンピシリン耐性株より
2.3kb各TCFcDNA断片が8CMGSneoに正しく挿入された、TC
FおよびTCF変異恋発現ベクター16種(pBPV−TCF 、 pBPV−
TCF−1、pBPV−TCP−2、pgpv−TCP−3、pBPV−TCP
−4、pBPV−TCP−12、pBPV−TCP−13、pBPV−TCP−
14、pBPV−TCP−23、pBPV−TCP−24、pBPV−TCP−
34、pBPV−TCP=123、pBPV−TCP−124、pBPV−TC
P−134、pBPV−TCP−234、pBPV−TCF4234と命名した
)を選びだした。抗生物質クロラムフェニコールはシグマ社製のものを用いた。
プラスミド構築の概略を図6に示した。これらの発現プラスミドのうちpBPV
−TCP−3及びpHPV−TCP−13の2種のプラスミドを含む大腸菌はそ
れぞれ国立生命工学工業技術研究所にFERM BP−4454及びFERM
HP−4455として寄託した。
■TCFまたはTCF変異体発現プラスミドの調製と精製上記の発現ベクター(
pBPV−TCF、 pBPV−TCP−1、pBPV−TCP−2、pBPV
−TCP−3、pBPV−TCP−4、pBPV−TCP−12、pBPV−T
CP−13、pBPV−TCP−14、pBPV−TCP−23、pBPV−T
CP−24、pBPV−TCP−34、pBPV−TCP−123、pBpv−
tcp−124、pBPV−TCP−134、PBPV−TCP−234、pB
PV−TCP−1234)を持つ16種類ノ大腸菌を5olIg/I11ノアン
ヒシリン含!し培地(400ml) ヲ31°cで培養LO,0,600カ0.
8 トナツタトコろで、終4度が170μg/mlとなるようにクロラムフェニ
コールを添加し一晩培養した。Maniatis (Mo1ecular (:
Ioning 2nded、)の方法に従いアルカリSDS法によりプラスミド
lDNAを分離し塩化セシウム密度勾配遠心法により、発現プラスミド16種を
精製した。
■TCPおよびTCP変異体発現プラスミドの動物細胞への導入
動物細胞へのDNA トランスフェクション用試薬トランスフェクタム(米国メ
リーランド州IBF社製)を用い以下に示す方法によりマウスC127細胞に1
6種の発現プラスミドを導入した。トランスフェクション前日、25cm”フラ
スコ (住友ベークライト社製、付着細胞用)に約106個のマウスC127細
胞をまいて、1゜%牛胎児血清を含むDME培地(GIBCO社製)中炭酸ガス
インキュベ−9−(Co□5〜7χ雰囲気、湿潤インキュベーター)中で37°
Cで一晩培養した。細胞を0pti、MEMj音地(G4BCO社製)で2回洗
った(”ち2mlの0pti、MEM培地を加え、トランスフエフタム試薬添付
のプロトコールに従い10μgのプラスミドDNAを用いトランスフェクション
をおこなった。6時間の培養後、7.5 mlのDME培地を加えさらに二晩培
養を続けた。翌日培養上清を101の新しいDI’lE?l培地と交換しさらに
培養を続けた。細胞をトリプシン処理し、DME培地で一度洗った後100 u
g/mIのG418 (G IBCO社製)を含む叶ε培地50m1に懸濁し
平底の96ウエルプレートに100μ!/ウエルずつ添加し培養を続けた。1週
間後6418含有(100μg/剛1)DME培地をさらに100μl/ウエル
ずつ添加し37°Cで培養を続けた。1週間後ウェルあたり100plずつ取り
、抗TCPモノクローナル抗体を用いたエンザイムイムノアッセイ(EIA)
(N、5hisa et、al、 Gastroenterologia Ja
ponica 26(4)477−482+1991)の試料に供しTCPおよ
びTCP変異体の発現の有無を調べた。TCFまたはTCF変異体を発現する細
胞は、12ウエルプレート、25C+Izフラスコ等を用い順次細胞数を増やし
て培養した0以上の操作によりTCP変異体(全15種fiTcF−1、TCP
−2、TCP−3、TCP−4、TCP−12、TCP−13、TCP−14、
TCP−23、TCP−24、TCP−34、TCP−123、TCP〜124
、TCP−134、TCP−234及びTCP−1234と命名した)を発現
する細胞を得た。
6TCF たはTCF ・ の l立
75cm zフラスコ中でコンフルエントになったTCPまたTCP変異体生産
細胞をトリプシン処理によりはがした後その細胞の一部を225cm2フラスコ
3枚に移し、100m1 DME培地を加え137°Cで培養した。4日後コン
フルエントとなった細胞をトリプシン処理し、DME培地にP!濁し、懸濁液を
D?IE培地で10倍に希釈した(全量3L)。この希釈細胞懸濁液をの新しい
225cm”組織培養フラスコに接種した。細胞は30個の225cm”組織培
養フラスコ中で37°C15日間培養し、培養上清(全量3 L)を集め、細胞
を6個のフラスコから回収した。つづいて、6個の225c+a”組織培養フラ
スコに接種し、各フラスコに培地1001を加え37°Cで5日間培養した。培
養上清(全量6 L)を回収した。こうしてTCPまたはTCP変異体を含む9
リツトルの培養上清を得た。
7TCPおよびTCP ・ の 1■
以下に示す3段階の方法で精製した。
(1)ヘパリン・セファロースCL−68各種TCP変異体を含む培養上清9リ
ツトルを、6.00Orpm/30w1nの遠心で不溶物を除いた後、3001
の平衡化緩衝液(0,5?lNaC1と0.01χTween20を含む10m
M Tris−HCI、pH7,5)で平衡化させたヘノマリン−セファロース
CL−6Bカラム(2,5X12cmNファルマシア社製)に、約200 ml
/hrの流速で通液して、TCP変異体をカラムに吸着させた。約700m1の
平衡化緩衝液で洗浄後、2M NaC1と0.01χTween20を含む10
mM Tris−)1cI、pH7,5で溶出させ、31ずつフラクションコレ
クターで分画し、O,0,280nmに吸収をもつ画分をモニターし、TCFま
たはTCF変異体を含む百分約100m1を得た。
(2) Mono S FPLC
2M NaC1で溶出させたTCPまたはTCP変異体を含む溶出液を、0.1
5MのNaC1を含む10mMリン酸緩衝液、pH6,5で透析し、12、00
Orpm/90m1nの遠心で不溶物を除いた後、上清を約20+alの0.1
5門NaC]と0.01χTween20を含む101リン酸緩衝液、pH7,
0(A緩衝液)で平衡化させたMono Sカラム(0,5X5cm、ファルマ
ノア、FPLC)に、1ml/1m1nの流速で通液させ、カラムを約30m1
のへ緩衝液で洗浄後、0.5ml/vainの流速で、60分間で直線的にNa
C1の濃度を1.0Mまで高めることによりTCPまたはTCP変異体を溶出さ
せ、0.5mlずつフラクションコレクターで分画し、0.7〜0.8門のNa
C1で溶出されるTCFまたはTCF変異体を含む画分約4mlを得た。
(3)ヘパリン5−PW FPLC
TCPまたはTCP変異体を含む溶出液に0.01χT讐een20を含む2倍
量の10mM Tris−HCI、pH7,5を加え、この希釈液を0.3MN
aC] と0.01χT+veen20を含む10mM Tris41CI、p
H7,5(B緩衝液)約20+* lで平衡化させたヘパリン5−PWカラム(
0,5X7.5cm、トーソー、FPLC)に1 ml/sinの流速で通液さ
せ、カラムを約30+mlのB緩衝液で洗浄後、0.5 ml/winの流速で
、直線的にNaClの濃度を2.0Mまで高め、0.51ずつに分画した。TC
PまたはTCP変異体を含む両分(約1.3MのNaClで溶出され、全量的3
g+1)を得た。これら画分を脱イオン水に対し透析し、凍結乾燥後0.001
χTween20を含むPBS (リン酸緩衝液−生理食塩水)に溶解し最終精
製TCP変異体の収量および収率は第1表に示した。
収量は後述のポリクローナルEIA法によりめた。
[F]エエ」JJUll【隨q定1
1) ポリクロナル−の= 11(!ニー の、量常法に従いTCPで免疫した
兎から得た抗TCP抗血清より、アフィゲルプロティンAセファロース(バイオ
ランド社製)を用いてマニュアルに従い精製1gGを得た。これをPBSで一晩
透析したのち、TCPをマニニアルに従いアフィゲル10(バイオランド社製)
に固定化したカラムに、0.5 ml/minの流速でチャージしたのちPBS
で洗浄した。ついで0.1M Glycine、HCI、pH2,5で熔出し、
溶出画分をPBSで透析して抗TCFポリクロナル抗体を得た。抗体の酵素標識
は、石川らの方法(Ishikawa、E et、al、。
J、Immunoassay、 vol、4,209−327.1983)に従
いペルオキシダーゼ標識した。
2) 精製した各種TCP変異体の定量抗TCFポリクロナル抗体を10Mg/
mlの濃度になるように0.1門重曹溶液に溶解し、96六マイクロクイタープ
レート (ヌンク社製)に100μl/ウェル分注し、室温で一晩放置し固相化
した。ついでブロックエース(7印乳業社製)を蒸留水で2倍に稀釈した溶液を
ウェル(200μl/1)にみたし室温で1時間装置し、プロ、キングした。ひ
き続きプレートを0.1χTween 20を含むPBS (洗浄バッファー)
で3回洗浄した。各種TCP変異体サンプルを1次バッファー(40χブロツク
エース、0.1zTween20を含む0.2M Tris HCI、pH7,
4)で適当な量に稀釈し、TCP変異体サンプルを調製した。スタンダードTC
Fi液は、1次緩衝液で10Mg/mlの濃度より段階稀釈したTCP溶液を用
いた。上記サンプルを100μmずつ各ウェルに加え、37°Cで3時間放置し
た後洗浄バッファーで3回洗浄した。ベルオキソダーゼ結合抗体?8液を2次バ
ッファー(20χブロツクエース、0.1χTween20. Oz5mg/m
l マウスIgGを含む0.1M Tris HCI、 pt+ 7.4)で4
00倍稀釈し、100μmずつ各ウェルに加え、37°Cで2時間放置した後洗
浄バッファーで3回洗浄した。ついで基!溶液(0,4B/mlのオルトフェニ
レンジアミンニ塩酸、0.006χ過酸化水素を含む0.01 クエン酸−リン
酸緩衝液、p)I 4.5)を100μm加え、37°Cで30分暗室に放置し
た。6N硫酸を50μm加え酵素反応を止めた後マイクロフォトメーター(コロ
ナ社)で492 r+ffiの吸光度を測定した。
911TCFの5O5−ポリアクリルアミド゛ル ′精製した各TCF変異体5
μgをSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。後述のごとく生体内半
減期が顕著に延長したTCP変異体であるTCP−3、TCP−13および天然
型TCPの電気泳動パターンを第7図に示した。
βメルカプトエタノール存在下(還元状態)及び非存在下(非還元状B)で泳動
した。第7図に示したように、TCPは非還元状態で78,000近傍および7
4,000近傍の近接した2つのバンドを示した。非還元状態ではTCP−3の
2つのハンドがTCFのハンドより低分子側に移動していた。TCP−13のほ
うがTCP−3よりもさらに低分子側に移動していた。還元状態では、TCPは
52.000近傍、30,000近傍および26,000近傍の3本のバンドを
示し、TCP−3は52,000近傍、26.000近傍および22,000近
傍の3木の蛋白質のハンドを示した。同様にTCP−13は、48.000近傍
、26、000近傍および22.000近傍の3木のハンドを示した。この結果
はオリゴ糖鎖除去による分子量の低下と推測され、所望の変異体が得られたと判
断した。また、TCPおよびTCP変異体の構造から推測されるハンド以外はな
にも検出されなかった。
実施例2
TCF びTCF ・ のin vitro ;■) 肝細胞増殖活性
肝細胞増殖活性を以下の方法により測定した。セグレンの方法(門ethods
in cell biology Vol、13. ++29+ 1976、
AcademicPrerss、 New York)に従い、ウィスター系
ラット (体重的200g)より肝実質細胞を単離した。細胞の増殖には、基礎
培地、即ち10%生胎児血清、10μHデキサメタシンを含むウィリアムスE(
フローラボラトリー社製)培地を使用した。細胞を1.0X10’個10.1m
l/ウェルの濃度で96ウエルプレート(ファルコン社製)に播き、37℃で培
養した。24時間後、TCPあるいはTCP変異体を含む基礎培地を各ウェルに
100μl添加し、さらに22時間培養を続はコトチミジン(アマジャム社製)
を1μCi/ウエルとなるように添加し、さらに2時間培養をした。細胞を冷P
BSで2回洗ったのち0.5%トリプシン処理ではがし、セルハーベスタ−によ
りガラスフィルターのシートに回収した。各ウェルの細胞に取り込まれた放射能
をマトリックス96(パフカード社製)により測定しDNA合成量とした。結果
を第8図に示したように、すべてのTCP変異体が肝細胞増殖活性を保持してい
たことが確認された。
2) 腫瘍細胞障害活性
TCP 、 TCP−3、TCP−13の抗腫瘍細胞活性を測定した。
供試細胞としてMeth A sarcomaを用いた。2 XIO’ cel
ls/allとなるように10%FC5含有RP旧培地(GIBCO社製)で細
胞を懸濁し、96穴平底マイクロクイタープレートの各ウェルに細胞懸濁液を5
0μmずつ添加した。 TCP 、 TCP−3、TCP−13各精製品をRP
旧培地で最終濃度50ng/+1から段階希釈し、各希釈サンプルをウェルに5
0μmずつ添加した。炭酸ガス存在下37°Cで5日間培養した後50+wg/
nl となるようにMTTを添加しさらに37°Cで培養した。4時間後10%
SOS 、0.011N)1.CIを含むi@液100μmを添加し室温に一晩
放置した。翌日0.D、620nwの吸収を測定し、生細胞数のパラメーターと
した。測定結果を第9図に示した。
TCP −TCP−3、TCP−13のいずれも用量依存的にMeth A細胞
障害活性を示した。
実施例3
TCFおよびTCF ・ の ′藍の゛抗TCFポリクロナル抗体をlOμg/
纏lの濃度となるように0.1M重曹溶液に溶解し、96六マイクロプレート
(ヌンク社製)に100μl/ウェル分注し、室温で一晩放置した。ついでブロ
ックエースを蒸留水で希釈した50χ溶液をウェルにみたし室温で1時間放置し
た。ひき続きプレートを洗浄溶液(0,1%Tween 20を含むPBS)で
3回洗浄した。TCPまたは各種TCP変異体を静脈注射したラットから経時的
に採取された血漿サンプルを必要に応じ正常ラット血清で希釈した。スタンダー
ドTCP溶液は、正常ラット血清で10ng/mlの濃度より段階希釈したTC
F溶液を用いた。これらのサンプル50μlと50μlの1次緩衝液(50%ブ
o 7クエース、0.2ff NaCI、0.1%Tween 20.0.2%
CI(APS、 20mMベンザミジン塩酸、10+sM EDTAを含む0.
2MTrisHC1,p)17.31を混合して各ウェルに加え、37°Cで3
時間放置した後洗浄ハソフア−で3回洗浄した。10%ブロックエース、0.1
5M NaC1,0,1%Tween 20.4%ラット血清、0.5mg/m
lマウスIgGを含む0.1門リン酸緩衝液(pH7,0)で400倍に希釈し
たペルオキシダーゼ標識抗TCF抗体溶液100μmを各ウェルに加え、37°
Cで2時間放置した後洗浄パンファーで3回洗浄した。ついで基質溶液(0,4
+ag/mlのオルトフェニレンジアミン塩酸、0.00.6%過酸化水素を含
む0.1M クエン酸−リン酸緩衝液、pH4,5)を100tIl加え、30
分暗室に放置した。 6N硫酸を50μm加え酵素反応を止めた後、イムノリー
ダー(コロナ社)で492 nmの吸光度を測定し血中濃度の変動を測定し、T
CFまたはTCF変異体のラント血清中の濃度を調べた。
TCPまたはTCP変異体を1回静脈注射した後のラットでEIA法で血漿レベ
ルの経時変化を調べた。う・ノドは 体重200g前後のWistar系雄ラッ
トを用いた。ラットにTCPを静脈注射後、血清レベルは、2−compart
ment modelによって示したとうに、2相性に衰滅した。50Mg/k
gの投与量でTCP注射後のラットにおける急速相(rapid phase)
と遅速相(slower phas)の血漿半減期は、それぞれ2.4±2.5
1lin、(t’/z a”l と15.6±4.6 min、(t’/l β
)であった、TCP変異体の血漿レベルのプロフィールハ天然型TCPに似てい
るが、同量で静脈注射した後の血漿レベルの減衰は天然TCPより遅い。
第2表に示すように、TCP−3およびTCP−13の血漿半減期は延長し、全
クリアランスは低下した。TCP−3およびTCP−13の血漿濃度一時間曲線
の面積(AUG)は天然TCPに比べ大きい。
第2表
薬物動態学的パラメーター
試料 tl/□α el/□β
(iin) (iir+)
TCP 2.4″:0.5 15.6 ’ニー 4.67CF−12,4土0.
3 19.6 =0.3TCP−22,2=0.6 18.2 == 2.5丁
CF−32,9立0.3 54.2立8.3“。
TCF−42,7+ 0.1 20.6 ”−3,3TCF−12,2,7±0
.3 18.1−1:1.6TCP−133,8=0.51“ 24.9 =i
= 3.1”TCP−141,9±0.4 18.8±2.9丁CF−232,
4±0.5 15.4土0.57CF−242,3±0.1 16.9土1.7
丁CF−34 2.2土0.5 18.0 :!= 2.1TCF−1232,
2立0.1 17.2±0.87CF−1242,3立0.1 15.7±2.
7TCP−1342,3立0.4 19.1±3.27CF−2342,6±0
.6 16.8±1.6TCP−12342,9立0.1° 24. ±5,5
”平均値土還準偏差、”P<0.05、”P<0.01第3表
試F’l AUCCL、。c、L
(B−win/ml)(ml/sin/kg)TCF LO30,0と257.
9 51.5土13.9TCF−18L1.6±158.3 63.2±12.
27CF−21143,7=551.7 49.8 ± 18.9TCP−32
679,5立 292.1°“ 18.8 ”= 2.1 °”TCF−489
7,8土 263.5 58.6 立 147TCP−121246,4立29
0,8 41.7 : 10.6TCF43 8301.0 ’= 279.7
”−6,0”−0,2“TCP−14972,5=1= 162.2 52.5
= 9.5TCP−231223,0±356.7 43.6 立14.3T
CP−241017,8’= 210.0 51.0 ± 8.3TCP−34
983,0± 61.0 51.Oth3.2TCP−123963,8”:
66.2 52.0 立 3.5τCF−1241126,3立265.0 4
5.9 + 9.5TCF−L34 960.9±279.7 55.2 +
16.77CF−234892,9±119.7 56.6土7.ITCF−1
2341266,5± 7[1,939,6± 2.6平均g1th標1!偏差
、叩<0.05、°“P<0.01これらの結果から、TCP−3およびTCP
−13は、天然型TCPに比べより遅い代謝速度とより大きい生物利用性を有す
ることが判る。τCF−3のアミノ酸配列は配列番号2に、TCP−13の配列
は配列番号3に示した。
本発明によるTCP変異体はより長い生体内半減期を有し、肝細胞の増殖活性お
よび腫瘍細胞に対する細胞毒活性を有する。
従って、肝臓に対する治療剤または抗癌剤として作用である。
配列表
配列番号:1
配列の長さニア23
配列の型2アミノ酸
配列の種類:タンパク質
配列
Met Trp Val Thr Lys Leu Leu Pro Ala
Leu Leu Leu Gln Bis Val LeuLeu Bis L
eu Leu Leu Leu Pro Ile Ala Ile Pro T
yr Ala Glu Gly G1nArg Lys Arg Arg As
n 丁hr IIe His Glu Phe Lys Lys Ser Al
a Lys 丁hrThr Leu Ile LySIle Asp Pro
Ala Leu Lys Tie Lys Thr Lys Lys Va1A
sh Tbr Ala Asp Gin Cys Ala Asn Arg C
ys Thr Arg As!I Lys Gly Le■
Pro Phe Thr Cys Lys Ala Phe Val Phe
Asp Lys Ala Arg Lys Gin CysLeu Trp P
he Pro Phe Asn Ser Met Ser Ser Gly V
al Lys Lys Glu Pbeloo 105 110
cry旧s Glu Phe Asp Leu Tyr Glu Asn Ly
s Asp Tyr Tle Arg Asn Cys1ie Ile Gay
Lys Gay Arg Ser Tyr Lys Gly Thr Val
Ser Ice Thr LysSer Gly Tie Lys Cys
Gin Pro Trp Ser Ser Met Ile Pro His
Glu H45Ser 丁yr Arg Gly Lys Asp Leu G
in Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro ArgGa
y Glu Glu Gly Gly Pro Trp Cys Phe Th
r Ser Asn Pro Glu Vat ArgTyr Glu Val
Cys Asp lie Pro Gln Cys Ser Glu Val
Glu Cys Met ThrCys Asn Gly Glu Ser
Tyr Arg Gly Leu Met Asp His Thr Glu
Ser GayLys lie Cys Gin Arg Trp Asp H
is Gln Thr Pro His Arg His Lys PheLe
u Pro Glu Arg Tyr Pro Asp Lys Gay Ph
e Asp Asp Asn Tyr Cys ArgAsn Pro Asp
Gly Gin Pro Arg Pro Trp Cys 丁yr Tbr
Leu Asp Pro HisThr Arg Trp Glu Tyr
Cys Aha lie Lys Thr Cys Ala Asp Asn
Thr MetAsn Asp Thr Asp Val Pro Leu G
lu Thr Thr Glu Cys Ile Gin Gay G1nGl
y Glu Gly Tyr Arg Gly Thr Val Asn Th
r lle Trp Asn Gly Ile Pr。
Cys Gin Arg Trp Asp Ser Gln Tyr Pro
Hls Glu )lis Asp Met Thr PrB
Glu Asn Phe Lys Cys Lys Asp Leu Arg
Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pr。
Asp Gay Ser Glu Ser Pro 丁rp Cys Phe
Thr Thr Asp Pro Asn lie Arg〜al Gly T
yr Cys Ser Gin Ice Pro Asn Cys Asp M
et Ser His Gly G1nAsp Cys Tyr Arg Gl
y Ash Gay Lys Asn 丁yr net Gly Asn Le
u Ser Gl。
Thr Arg Ser Gly Leu 丁hr Cys Ser Met
丁rp Asp Lys Asn Met Glu AspLeu His A
rg His lie Phe Trp Glu Pro Asp Ala S
er Lys Leu Asn GluAsn Tyr Cys Arg As
h Pro Asp Asp Asp Ala His Gly Pro Tr
p Cys TyrThr Gly Asn Pro Leu 11e Pro
Trp Asp Tyr Cys Pro Ile Ser Arg Cys
Glu Gly Asp Thr Tbr Pro 丁hr Ice Val
Aso Leu Asp [lis Pro Val l1■
465 470 4’、5 480
Ser Cys Ala Lys Thr Lys Gln Leu Arg
Val Val Asn Gly Ice Pro TbrArg 丁hr A
sn Ice Gly 丁rp FIet Val Ser Leu Arg
Tyr Arg Asn Lys H4T
11e Cys Gly Gay Ser Leu Tle Lys Glu
Ser Trp Val Leu 丁hr Ala ArgGin Cys P
he Pro Ser Arg Asp Leu Lys Asp Tyr G
lu Ala Trp Leu GlyIce Bis Asp Val tl
is Gly Arg Gly Asp Glu Lys Cys Lys G
in Val Le■
Asn Val Ser Gin Leu Val 丁yr Gly Pro
Glu Gay Ser Asp Leu Val LeuMet Lys L
eu Aha Arg Pro Ala Val Leu Asp Asp P
he Val Ser Thr 1ieAsp Leu Pro Asn Ty
r Gay Cys Tbr lie Pro Glu Lys Thr Se
r Cys SerVal Tyr Gly 7rp Gay Tyr 丁hr
Gay Leu Jle Asn Tyr Asp cly Leu Leu
Arg l’al Ala Has Leu Tyr IIe Met Gly
Asn Glu Lys Cys Ser Gin RI■
His Arg Gly Lys Val 丁hr Leu Asn Glu
Ser Glu Ice Cys Ala Gly AlaGlu Lys I
le Gay Ser Gly Pro Cys Glu Gly Asp T
yr Gly Gly Pro LeuVal Cys Glu GIn Hi
s Lys Met Arg Met Val Leu Gly Val li
e Val Pr。
Gly Arg Gay Cys Ala Ile Pro Asn Arg
Pro Gly Ile Phe Val Arg Va+Ala Tyr T
yr Ala Lys Trp lie Bis Lys Ice Ice L
eu Thr Tyr Lys Va1’ro Gin Ser
配列番号:2
配列の長さニア23
配列の型二アミノ酸
配列の種類:タンパク質
配列
門et Trp Val Thr Lys Leu Leu Pro Ala
Leu Leu Leu Gin His Val Leul 5 10 15
Lea His Leu Leu Leu Leu Pro Ile Ala
Ile Pro Tyr Ala Glu Gly G1nArg Lys A
rg Arg Asn Thr lle His Glu Phe Lys L
ys Ser Ala Lys Thr丁hr Leu 71e Lys li
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ATATCCCCACAAI;GCC丁TTGATCATAATTATTGCC
GCAATCCCCATGCCCAGCCCACGCC^↑GGTGCT^丁^
CTCTTGACCCTCACACCCl;CTCGGAGTACTC丁GCA
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CTCA7(;TTCCTTTGGAAACAACTGtJTGC^TCCAA
GCTCA^l;CAGAACGCTACAGGGGCACTCTC^^TAC
CATTTGG^^丁GG^^TTCC^TCTCAGCC丁Tl;GCATT
CTCACTATCCTCACCAGC^τCACATCACTCCTCAAA
ATTTC^^CTCC^^Gf,ACC TACGAG^^^^TTACTG
CCGA AATCCAI;ATC GGTCTG^^TC ACCCTCGs
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TTTA(CACTI; ATCCAAACAT CC[;AGTTCGC T
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GGACT^^CATI,TTCAA丁GTGGGACAAC^^CATGC^
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[;A丁1,As
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CCACTCA TTCCTTCGGA TTATTGCCbT
^TTTCTCCT丁GTG^^GCTCATACCACACC丁^CAATA
GTCAATT丁^GACCATCCCCTAAτ^TCTTGTI,CC^^
AACG^^^C^^TTCCGACTTGTAAA丁GGG^丁TCC^^C
ACG^^C^^^CAT^GGATGGATGGTTAGTTTGACATA
CAG^^^T^^^CATATCTGCGCAGCATC^丁TGATAAA
GCACAGTTGCG TTCTTACTGC ACGACAGTCT TT
CCCTTCTC GAGACTTG^^^GATTATG^O
CCTTCCCTTGCAA了TCATGA丁GTCCACGCAAGAII,
CAGATGAGAAATGCAAACACGTTCTC^^TGTTTCCC
AGCTCGTA丁ATGI,CCCTCAAGCATCAGATCTGI;T
丁丁TAATGAAGCTTGCC^GGCCTGCTGTCCTGGATGA
丁TTTI:TTACTACGATTCA丁丁TACCTAATTATGCAT
GCACAATTC(TGAAAAGACCAGTTGCAI:TGTTTA7
肛εTGGGL.CTACACTCr.AT丁CATCAACTA丁GATCG
CCTATTACCAGT[,GCACATCTCTATATAATGCGAA
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TGACTCTG^^TCAGIfiCAAA丁ATCτGCTGGGGC丁C
人AAAGATTCGAT[^GGACCATGTGACGI:I,GAT丁A
丁1;[:TCCCCCACTTGTT丁GTGAGCA^CATAAAATG
AG`
ATGGTTCTTCCTCTCATTCT丁CCTGGTCGTGCATCT
GCCATTCC^AATCGTCCTGGTATTTTTI;?CCGAGT
AGCATATTA丁CCAAAATGGATACACAAAATTATTTT
^ACATATAAGGTACCAC.lCTCATACCTCA.IGTAA
GTf,TGTCTCAACCACCCACC.4ATACAACTCTjシ4
匹訂
o1igasaccharide chain + 2 3 4TCF−134
−一一」一一一
TCF−シ ー一一比−一一一
TCF−IZ34−一−一−一−一一一一一一−一一一一一−−一−−一−−一
−一一一一−一一一−一一一一−−−−ー3略6図
NOtl
Tig7図
TCITCFTII−コTCF−37CF−137CF−131014cul!
jla!S(nσコー鷹uc工’9++1on−=龜duc二n91+non−
rsdu口!J’191−龜rkw露! rmueiI′Ig l i ffi
dueLng l [rmudng +鳥ζ8図
TCP(ng/m I)
TcF(ng/mll
第9図
TCP(ng/ml )
一一一シーー TCF−+23
Tirne (min)
フロントページの続き
(51) rot、 C1,6識別記号 庁内整理番号//A61K 3810
0 ADU
(72)発明者 津1)英資
栃木県下部賀郡石橋町石橋662 マロニエハイツ210
(72)発明者 汗水 薄明
栃木県下部賀郡壬生町駅東町25−9
(72)発明者 高比良 玲子
栃木県河内郡河内町下岡本3769−18I
(72)発明者 大垣 文子
栃木県宇都宮市大和1−8−11
(7’2)発明者 上1)正次
埼玉県用越市今福1672−1 メゾンむさし野719
(72)発明者 末尾 侃二
埼玉県川越市山田1769−10
Claims (6)
- 1.N結合オリゴ糖鎖に関与するアミノ酸残基を変異させ、N結合オリゴ糖鎖の 少なくとも1つをTCFに結合させないことを特徴とするTCF変異体。
- 2.配列表配列番号1記載のアミノ酸配列におけるN末端から、289,397 ,561及び/または648位のアスパラギンにオリゴ糖鎖が結合しないように N糖鎖形成関与残基の1つを他のアミノ酸残基で置換された請求項1記載のTC F変異体。
- 3.563位のセリンがアラニンに置換された請求項1記載のTCF変異体。
- 4.289位のアスパラギンがクルタミン、563位のセリンがアラニンに置換 された請求項1記載のTCF変異体。
- 5.配列表配列番号2記載のアミノ酸配列をコードするDNAの発現した糖タン パク質であるTCF変異体。
- 6.配列表配列番号3記載のアミノ酸配列をコードするDNAの発現した糖タン パク質であるTCF変異体。
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