JPH07507328A - Ｔｃｆ変異体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＴＣＰ変異体 技術分野 本発明は、遺伝子操作により調製され、天然型ＴＣＰと比較してＮ−結合オリゴ 糖鎖の本数が異なり、さらに新規なアミノ酸配列を有するＴＣＰ変異体に関する 。本発明により得られるＴＣＰ変異体は生体内半減期が長く、肝臓実質細胞に対 する増殖活性及び腫瘍細胞の障害活性を有し、肝臓疾患の治療剤、抗腫瘍剤とし て有用である。 背景技術 ヒト細胞由来の線維芽細胞が生産するＵｇｋ細胞障害性因子ＴＣＰ−ＩＩは、こ れまで報告された抗腫瘍性蛋白質と全（異なる新規な抗ＩＩＩ瘍性物質である。 本発明者らは、さらにこの蛋白質のｃＤＮＡのクローニングに成功し、その全ア ミノ酸配列を推定するとともに、有用性を確認した。この新規な抗腫瘍性蛋白質 とその遺伝子はＷ０９０／１０６５１として開示されている。 この新規抗腫瘍性蛋白質はＴＣＰ−Ｉｔと命名されている。本発明においては上 記ＷＯ９０／１０６５１に開示されたアミノ酸配列を有する糖蛋白質をＴＣＰと 称する。ＴＣＦはＴＣＦ−ＩＩとして従来呼ばれていた物質の別称として使用さ れている。 このＴＣＰは強い抗腫瘍活性と正常細胞の増殖活性を合わせもち、さらに肝臓実 質細胞の増殖因子であるＨＧＦの多様なファミリーの一種であることが確認され た。ＴＣＦはＳＤＳ電気泳動による分子量測定では７８０００±２０００ダルト ンおよび／または７４０００±２０００ダルトンの分子量を示し、還元した場合 ５２００±２０００ダルトンの共通のバンドであるＡ鎖と３００００±２０００ ダルトンおよび／または２６０００±２０００ダルトンの２本のハンド（Ｂ鎖、 Ｃ鎖）を示す。 ＴＣＰは肝臓実質細胞の増殖因子であることから肝切除後の肝臓再生を目的とし た利用が検討されている。しかしその体内半減期が短いため、その体内半減期を 延長することによりより効果の高いＴＣＰを得る試みがなされてきた。 オリゴ糖鎖と血清半減期の関係については、エリスロポエチンなど一部の糖蛋白 質では研究がおこなわれ、同じ遺伝子からオリゴ糖鎖ｆｌ遣には微妙な差があり 、生物活性が異なる糖蛋白質が合成できることが知られている。またエリスロポ エチンではｗＭ鎖の有無によって生物活性が異なることが知られている。 しかしＴＣＦのオリゴ糖鎖と生物活性との関係についてはこれまで殆ど知られて いないのが現状である。 発明の開示 本発明者らは、ＴＣＦの有用性に注目し、肝臓疾患治療剤や抗ＩＩＩ瘍剤として の利用、疾病の診断のマーカーとしての利用を検討してきた。ＴＣＰはその生体 内半減期が約２分と極めて短い。このため、この生体内半減期を延長するために 、本発明者等はポリペプチド成分に遺伝子操作により変性したＴＣＰを種種作成 し検討を行ったが、変性したＴＣＦの殆どが生物活性を失うことが判明した。こ のため、ＴＣＦの生理活性蛋白質としての活性を失うことなく、生体内半減期を 延長するために、ＴＣＰに存在する４カ所のＮ結合オＩＪゴ垢鎖に注目し、１つ 以上の糖鎖を削除した新規なＴＣＰ変異体を作成することを試みた。 本発明は、天然型ＴＣＰに比べ異なるアミノ酸配列を有し、Ｎ結合オリゴＷ！鎖 の数が減少し、かつ生体内半減期の延長された新規なＴＣＰ変異体を提供するこ とを課題とする。 これらＴＣＰ変異体は、ＮｔＪ！鎖形成に関与するアミノ酸残基をコードするＴ ＣＦ　ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を変えることにより、および遺伝子的に変性 したＴＣＦ　ｃＤＮＡを発現させることにより得ることができる。 本発明により提供されるＴＣＰ変異体は、天然型のＴＣＦ中に存在する４カ所の Ｎ結合オリゴ糖鎖が、少なくとも１以上特異的に欠失している。これらは、天然 型ＴＣＰのアミノ酸残基を変異させることにより、生物活性を失うことなく生体 内半減期が延長したＴＣＰ変異体で初めて得たものである。 天然型ＴＣＦのｃＤＮＡから推定した全アミノ酸配列（配列番号１）を第１図に 示す。糖鎖結合に関与するアミノ酸は図中に下線を付した。このアミノ酸配列は 発現後、シグナル配列が除去され、３２番目のグルタミン残基がＴＣＰのＮ末端 アミノ酸となると推測されている。４本のＴＣＦのＮ結合オリゴ糖鎖はそのＮ末 端アミノ酸から２５８．３６６．５３０．６１７位のアスパラギンに結合してい る。これは第１回において、２８９．３９７．５６１．６４８位のアスパラギン に相当する。 またこのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列を第２図に示した。図中のＯ印 を付けたＡＴＧコドンからコーディング領域　′である。 Ｎ糖鎖形成に関与するアミノ酸残基は、Ａｓｎ−Ｘ−ＴｈｒまたはＡｓｎ−χ− ５ｅｒのアミノ酸配列を有している（なお、アミノ酸は三叉字表記法で示し、Ｘ は任意のアミノ酸を示す）、この配列においてＡｓｎ　Ｓｅｒ又はＴｈｒに相当 する塩基配列を他のアミノ酸をコードする塩基配列に置換するか、あるいは削除 した塩基配列を調製し、この塩基配列を真核細胞（特に好ましくは哺乳動物細胞 ）中で発現させることにより目的とする糖鎖の欠失したＴＣＰ変異体を調製する ことができる。糖鎖はＮグリコシド結合で上記位置のＡｓｎに結合するため、Ａ ｓｎをＧｉｎ等ＴＣＦの立体構造に影響を与えないアミノ酸に置換するようなコ ドンに置き換えることにより特定のオリゴｔＩＭ鎖の結合しないＴＣＰ変異体を 得ることができる。 ＾ｓｎの置換はＧｌｎが特に好ましいアミノ酸であるが、Ａｓｐ、Ｇｌｕ。 旧ｓ、　ＳｅｒまたはＴｈｒであっても良い、同様にＳｅｒをＡｌａなどのＴＣ Ｆの立体構造に影響を与えないアミノ酸に置換するようなコドンに置き換えるこ とにより特定のオリゴＩ！鎖の結合しないＴＣＰ変異体を得ることもできる。　 Ｓｅｒの置換はＡｌａが最も好ましいがＰｒｏ、Ｇｌｙ、またはＡｓｎであって も良い、また同様に、Ｔｈｒを他のアミノ酸で置換してもあるいは削除しても、 該当する部位にオリゴ糖鎖の結合しないＴＣＰ変異体を得ることができる。 Ｔｈｒの置換はＡｌａが好ましいがＶａｎ、ＨｉｓまたはＡｓｎであっても良い 。 ＴＣＦの一次構造におけるＮ糖鎖の結合位置を模式図により示した（第３図）。 糖鎖の結合位置はＮ末端側より、１．２．３．４の番号をつけこの番号でｖＭ鎖 を特定する。 この糖鎖結合に係わる部分のアミノ酸配列を糖鎖が結合しないように変更するた めには、ｃＤＮＡをＰＣＲ法（ポリメラーゼチェーンリアクノヨン法）により部 位特異的に変性させる。 反応は天然型ＴＣＰをコードするｃ　ＤＮＡを鋳型としておよび合成オリゴヌク レオチドをプライマーとして行う。プライマーの配列は上記したようにＤＮＡ配 列を削除するか、置換してデザインする。あるいは、他の変異導入方法であって もよい。 ＴＣＰ変異体を産生ずる細胞はこれら変性ｃＤＮＡを含む発現ベクターでホスト 細胞を形質転換することにより確立できる。 ＴＣＰ変異体は形質転換細胞の培養ブロスから回収できる。例えば、第１図にお いて、１番目のオリゴＰｉ鎖の結合位置である２８９位のＡｓｎを置換するため には、ｃＤＮＡをインビトロ突然変異導入法やＰＣＲ法により変性する。これら 変性方法は、鋳型としてＷｏ　９０／１０６５１に開示されている天然型ＴＣＰ をコードするｃＤＮＡおよびプライマーとして合成ヌクレオチドＴＣＰ−ＩＲ５ −ＴＣＡＧＴＧＴＣＣＴＧＣＡＴＡＧＴＡＴ−３’　を用いて行う。変性ｃＤＮ Ａを含む発現ベクターは哺乳動物細胞などの真核細胞をトランスフェクトでき、 ＴＣＰ変異体はトランスフェクトされた細胞培養上清から回収できる。 どのような真核細胞のホスト−ベクター系もＴＣＰ変異体の発現できる。最も好 ましいのくは、ＷＯ９２／１０５３に開示されたサイトメガロウィルスのプロモ ーターを用いたベクターとナマルバ細胞の組み合わせである。ＳＶ　４０プロモ ーター、ＤＨＦＲ遺伝子およびＣＩＯ細胞の組み合わせを用いる遺伝子増幅系あ るいはウシのパピローマウィルスの複製開始点とマウスＣ１２７細胞の組み合わ せを用いる発現系を含む一般的に用いられる系を例示できる。 ＴＣＰ変異体の精製には生理活性蛋白質の精製に一般的に用いられる方法であれ ばどのような方法でも使用することができる。 例えば、有Ｉ！溶媒によに沈澱法、塩析、ゲル濾過クロマト、モノクローナル抗 体を用いたアフィニティークロマト、電気泳動法などが挙げられる。 日本特許出願特願平３４７７２３６号に開示されている天然型ＴＣＦに対するモ ノクローナル抗体をＴＣＰ変異体のアフィニティークロマトグラフィーに用いる ことができる。 得られた精製ＴＣＰ変異体は、凍結乾燥若しくは凍結保存することができる。 オリゴ糖鎖の除去の組み合わせにより１５種類のＴＣＰ変異体が得られ、ＴＣＰ 変異体はオリゴ糖鎖の除去の数で特定できる。例えば、１番目のオリゴ糖鎖が欠 失した変異体はＴＣＰ−１と称する。また４本のオリゴ糖鎖が欠失したＴＣＰは ＴＣＰ−１２３４であり、２番目と３番めのオリゴ糖鎖が欠失したＴＣＰはＴＣ Ｐ−２３である。このようなＴＣＦの糖鎖結合の模式図を第４図に示す。それぞ れのＴＣＦは、オリゴ糖鎖の欠失にともなう分子量の変化が認められた。 図面の簡単な説明 第１図は、天然型ＴＣＦのｃＤＮＡから推定した全アミノ酸配列を示す。図中に 下線を付したアミノ酸部分がＮ−結合糖鎖の結合に関与している配列である。 第２図は、天然型ＴＣＦのｃＤＮＡ塩基配列を示す。本発明において変異を導入 するコドンに下線を付した。また図中の丸印を付したＡＴＧコドンからコーディ ング領域に相当する。 第３図は、天然型ＴＣＦの一次構造の模式図を示す。 丸印はＮ結合型糖鎖付加部位を、また矢印はα鎖、β鎖切断点を示す。 第４図は、ＴＣＰ及びＴＣＰ変異体におけるｔＩ！鎖の結合状態を示す。図中の 横線がポリペプチド、縦線がオリゴ糖鎖を示す模式図である。 第５図は、ＴＣＰ変異体のｃＤＮＡを含むプラスミドの構築を示す。 第６図は、ＴＣＰおよびＴＣＰ発現ベクターの構築を示す。 第７図は、代表的なＴＣＰ変異体のＳＤＳ電気泳動図を示ず。 第８図は、ＴＣＰ変異体の肝臓実質細胞増殖作用を示す。 各グラフはそれぞれ次のＴＣＰ変異体の活性を示す。 （１）　ＴＣＰ、ＴＣＰ−１，丁ＣＦ−２，ＴＣＰ−３，ＴＣＰ−４（２）　Ｔ ＣＰ−１２，ＴＣＰ−１３，ＴＣＰ−１４，ＴＣＰ−２３，ＴＣＰ−２４，ＴＣ Ｐ−３４（３）　ＴＣＰ−１２３，ＴＣＰ−１２４，ＴＣＰ−１２３４，ＴＣＰ −１３４，ＴＣＰ−２３４第９図は、ＴＣＰ変異体の腫瘍細胞障害効果を示す。 第１０閏は、ＴＣＰ変異体を静脈注射したラットの血液中の濃度変化を示す。 本発明の実施により新規なＴＣＰ変異体が提供される０本発明により提供される ＴＣＰ変異体は糖鎖結合の係わるアミノ酸をコードする塩基配列が、他のアミノ 酸に変換されるかもしくは削除されたｃＤＮＡの発現により調製される。ＴＣＰ 変異体はオリゴ糖鎖の結合部位および数を制御することにより、生体内半減期が 長くなる。 発明を実施するための最良の形態 以下に実施例を示しさらに本発明の詳細な説明する。 実施例Ｉ ＴＣＰ変異体の調製方法 ＤＮＡ取り扱いは基本的にＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｎｉｎｇ＋＾Ｌａｂｏ ｒａｔ。 ｒｙＭａｎｕａｌ、　５ｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ、　Ｊ、　Ｓａｍｂｒｏｏ ｋ＋　Ｅ、　Ｆ、　Ｆｒ１ｔｓｃｈ、　Ｔ。 Ｍａｎｉａｔｉｓ　＋ｄＡ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｅｒ　Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、　ＮｅｗＹｏｒｋ、　１９８９）に示されている 方法に従った。 ＩＴｃＦ　ｃＤＮＡのクローニング ＷＯ９２１０１０５３に開示された方法により得られたＴＣＰ発現プラスミド６ ．３　ｋｂ　（本発明においては以下、プラスミドｐｃＤＴＣＦ　ＩＩと称する ）を用いて、以下に示す方法により部位特異的突然変異を導入した。このプラス ミドを含む大腸菌は生命工学工業技術研究所にＦＥＲ？Ｉ　ＢＰ−３４７９とし て寄託されている。 ２　ｏ　亡　白、〜　法 】）方法１ ｕ−１１」二」Ｂ−Δｌ釦剋ｌこ」襄ロ辷ニョ乙久プラスミドｐｃＤＴＣＦ　Ｉ Ｉ　（６，３ｋｂ）は、制限酵素Ｂａ＋ａＨＩ　、Ｓｐｈ　Ｉ　（宝酒造：以下 制限酵素、使節酵素はすべて宝酒造社製のものを使用）で切断したプラスミドｐ ｃＤＮＡ　Ｉ　（インビトローゲン社製）にヒトＴＣＦｃＤＮＡのコーディング 領域を挿入することにより調製した。ｐｃＤＴｃＦ　Ｕは制限酵素ＢａｍＨＩ　 、Ｓｐｈ　Ｉを加え３７°Ｃで１時間反応させ、反応終了後ＤＮＡをエタノール 沈澱により回収し、１％アガロースゲル電気泳動を行い、２．３ｋｂのＴＣＦｃ ＤＮＡ断片をゲルからシーンクリーン（８２０１０１社）により精製した。 一方、ファージＤＮＡの複製型旧３ｓｐｌＢ（宝酒造）も同様に制限酵素Ｂａｍ ＨＩ　、　５ｐｂｌで断片した後エタノール沈澱を行い水に溶かし、ベクター溶 液とした。ベクター（ＩＮＡ溶液とＴＣＦｃＤＮＡを混合後、ライゲーションギ フト　（宝酒造）を用い反応させた。ライゲーション混合物の一部を大腸菌ＤＨ ５αの形質転換に供した。 この形質変換体と指示菌としての大腸菌ＮＭ５２２　（インビトローゲン社）を 混合して、１％ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅ＋　０．５％ｂａｃｔｏ−ｙｅａ ｓｔｅｘｔｒａｃｔ、　１％ＮａＣｊ！、１％ＩＰＴＧ　（ｉ　５ｏｐｒｏｐｙ ｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃＬ。 ｐｙｌａｎｏｓｉｄｅ、宝酒造社製）および１％Ｘｇａ＋（５−ｂｒｏ＋ａｏ− ４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙ　１−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ、 宝酒造社製）を含むＬＢ軟寒天プレート上に旺ぎプラークを形成させた。生じた 無色プラークから２本鎖ＤＮＡを調製し、また−末鎖ＤＮＡを調製して部位特異 的変異導入のだめの鋳型として用いた。 ｉｉ）部位特異的変異導入 Ｎ−糖鎖形成のコンセンサスアミノ酸配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒにおける第２８９ 位アミノ酸ＡｓｎコドンをＮ−１！鎖形成のコンセンサスアミノ酸配列を作らな いＧｌｎコドンに置き換えた。アミノ酸の番号は、天然型ＴＣＦのＮ末端アミノ 酸メチオニン残基を第１位とする。オリゴヌクレオチドＴＣＰ−ＩＲ５’−ＴＣ ＡＧＴＧＴＣＣＴＧＣＡＴＡＧＴＡＴ−３’をアブライドハイオシステムズ社製 ＤＮＡ合成装置を用いて合成したく以下断りの無い限り使用したオリゴヌクレオ チドは全て同社のＤＮＡ合成装置を用いて合成した）。 部位特異的変異導入は、オリゴヌクレオチド指向ｉｎ　ｖｉｔｒｏ変異導入シス テム（アマジャム社製）を用い、そ指示書によって行った。反応混合物で大腸菌 ＮＭ５２２を形質転換し、ＴＣＰ−１プライマーを用いてプラークバイブリダイ ゼーシラン技術によってスクリーニングした。 陽性プラークより１本ｌＤＮＡを得て、Ｓａｎｇｅｒらのｄｉｄｅｏｘｙ法（ｄ ｉｄｅｏｘｙ　ｃｈａｉｎ　ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ）により配 列の決定を行い、２８９位のＡｓｎコドン（ＡＡＴ）がＧｌｎゴドン（ＣＡＧ） に置換された変異部位の確認をした。この陽性クローンの二本鎖ＤＮＡより１． ４ｋｂ　Ｐｓｔｌ−）１ｉｎｄｌｌ＋断片を調製して、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ｓｓＫ”　（ストラタジーン社製）のＰｓｔｌ−Ｈｉｎｄｌｌ＋切断に挿入し、 プラスミドｐＳＫＴＣＦＰＨ−１を作った。 ２）方法２ 第３３９位、第５６３位及び第６５０位アミノ酸コドンへの部位特異的変異導入 はｐｏｌｙｓ＋ｅｒａｓｅｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　（ＰＣＲ）により行 った（Ｒ，）Ｉｉｇｕｃｈｉ、　ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ　Ｐ、１７７−１８ ３．　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ。 １９９０）。何れの部位も、Ａｓｎ−χ−３ｅｒのＮｉ１！鎖形成部位のコンセ ンサスアミノ酸のＳｅｒコドンを＾１ａコドンに置換する変異を導入した。 第３９９位への変異導入には、変異を持つプライマー（ミュータンドブライ？− ）　ＴＣＰ−２Ｒ５’−ＣＣＡＧＡＴＣＴＴＧＴＴＴＧＡＧＣＴＡＡＧＴＴＧＣ ＣＣ−３’および変異のないブライ？　−ＴＣＰ７０１Ｆ　５’−ＧＣＴＧＧＧ ＡＴＣＡＴＣＡＧＡＣＡＣＣＡＣ−３“、ポリメラーゼＡｍｐｉｉｔａｑ　（宝 酒造）および鋳型としてペラスミド匹ＤＴＣＦ　ＩＩ　４量ｇを用いて２５サイ クルのＰＣＢ反応をおこなった。セントリコン１００（アミコン社製）により反 応液がらプライマーを除去し、制限酵素Ｂｇｌ　ＩＩ　、　ＥｃｏＲＩ　（宝酒 造）で切断した後、あらかしめ用意しておいたプラスミドｐｓＫＴｃＦＰＨ（ｐ ＢｌυｅｓｃｒｉｐｔｓＫ”のＰｓｔｌ＋　Ｈｉｎｄ　ｍ切断部位にプラスミド ｐｃＤＴＣＦ　ＩＩをＰｓｔｌ。 Ｈｉｎｄｌ　［７で切断した１、４ｋｂの断片を挿入したもの）のＥｃｏＲＩ。 Ｂｇｌ　ＩＩ　４．１ｋｂ断片とライゲーションさせた。ライゲーション混合液 の一部を用い大腸菌ＤＨ５αの形質転換に供した。アンピシリン耐性形質転換株 からプラスミドＤＮＡを調製し、塩基配列を決定し第３９９位のＳｅｒコドン（ ＴＣＣ）がＡｌａコドン（ＧＣＴ）に置換した目的の変異を持つプラスミドρ５ ＫＴ（：ＦＰ）Ｉ−２を選びだした。同様にプラスミドｐＳＫＴＣＦＰＨ−１の Ｂｇｌ　ＩＩ、　ＥｃｏＲＩ　４．１ｋｂ断片と上記ＰＣＲ産物を結合してｐｓ ＫＴｃＦＰＨ−１２を選びだした。また、ＰＣＲ反応に由来する断片は全域にわ たって塩基配列を調べた。抗生物質アンピシリンはシグマ社製を用いた。 第５６３位のＳｅｔコドンへの変異導入には、ミュータンドプライマーＴＣＰ− ３１１５’−ＡＴＡＣＣＡＧＣＴＧＧＧＣＡＡＣＡＴＴＧＡＧＡＡＣ−３°およ びプライマーＴＣＦ１２０２Ｆ５’−ＧＧＣＡＡＣＴＴＡＴＣＣＣＡＡＡＣＡＡ ＧＡＴＣＴＧＧ−３°　を用い、プラスミドｐｃＤＴＣＰ　ｎ　４量ｇを鋳型と し、上記と同様にＰＣＲ反応をおこなった。セントリコン１００による精製しプ ライマーを除去したのち制限酵素Ｘｈｏｌ、　Ｐｖｕ　］ＩＩ断を行った。あら かじめ用意しておいたプラスミドｐＣＤＴＣＦΔＸｈｏ　（プラスミドｐｃＤＴ ＣＦ　Ｉｆから１．１ｋｂｘｈｏＩＵＴ片を除去したもの；　５．４ｋｂ）から Ｘｈｏｌ、５ｐｈｌ　４．８ｋｂ断片とＰｖｕ　ＩＩ　５ｐｈｌ　０．５ｋｂ断 片を精製しＰＣＲによって得られた上記断片とをライゲーションキ、トにより結 合させた。ライゲーション反応液を用い大腸菌ＭＣ１０６１／　Ｐ３　（インビ トローゲン社製）を形質転換した。 得られたアンピノリン　テトラサイクリン耐性株から、上記プラスミドｐｓＫＴ ｃＦ−２の際と同様の方法でプラスミドＤＮＡを調製して、第５６３位のＳｅｒ コドン（ＴＣＣ）がへｌａコドン（ＧＣＣ）に置換されたプラスミドｐｃＤＴＣ ＴΔＸｈｏＬ３を得た。抗生物質テトラサイクリンはシグマ社製を使用した。 第６５０位のＳｅｒコドンへの変異導入には、２段階のＰＣＲ反応を行う方法を 採用した。第１回のＰＣＩＩ反応にはミュータンドプライマーＴＣＰ−４Ｆ　５ ’−ＡＣＴＣＴＧＡＡＴＧＡＧＧＣＴＧＡＡＡＴＡＴＧＴＧ−３′とプライマー ＴＣＰ２２０３Ｒ５’−ＧＧＣＡＴＧＣＡＣＡＧＴＴＧＴＡＴＴＧＧＴＧＧＴＧ ＣＴＴＣＡＧ−３’を用いた反応および、ミュータンドプライマーＴＣＦ−４Ｒ ５°−ＣＡＣＡＴＡＴＴＴＣ＾ＧＣＣＴＣＡＴＴＣＡＧＡＧＴ−３’と天然型プ ライマーＴＣＦ１６８５Ｆ　５’−ＡＡＣＡＧＧＴＴＣＴＣＡＡＴＧＴＴＴＣＣ ＣＡＧ−３’の反応を行った。鋳型はどちらも４量ｇのプラスミド四〇ＴＣＦ　 ｎを用いた。得られたＰＣＲ産物をＤＥ８１ペーパー（ワットマン社）を用いて 精製し、１０分の１量ずつを取り第２回ＰＣ１１反応に供した。プライマーはｒ ｃＦ２２０３ＲとＴＣＦ１６８５Ｆを用いた。ＰＣＲ産物はアガロースゲル電気 泳動により分離し、ＤＥ８１ペーパーにより精製した。得られた断片を制限酵素 Ｂｇｌ　ＩＩおよび５ｐｈＴにより切断した。一方、匹り丁ＣＦΔＸｈｏｌおよ び匹ＤＴＣＦΔＸｈｏＬ３も制限酵素ＢｇｌＩｌと５ｐｈＩで切断して４．９ｋ ｂ断片を精製したのち、上記Ｂｇｌ　Ｅｌ−５ｐｈｌＰＣＲ断片とライゲーショ ンキットによりそれぞれ結合した。１量分の１量の反応液を用い、大腸菌ＭＣｌ ０６１／Ｐ３を形質転換した。得られたアンピシリン　テトラサイクリン耐性株 から、上記プラスミドｐＳＫＴＣＦ−２の場合と同様の方法でプラスミドｐｃＤ ＴＣＦΔＸｈｏｌ−４（第６５０位のＳｅｒコドンＴＣＴがへ１ａコドンＧＣＴ に置換されている）およびｐｃＤＴＣＦΔＸｈｏｌ−３４（第５６３位および第 ６５０位のＳｅｒコドンがそれぞれＡｈａコドンに置換されている）を得た。 □□□溌１ニジ浸≧シ（社）１束 １）トランジェント発現用ベクターの構築プラスミドｐｓＸＴｃＦＰＨ，ｐｓＫ ＴｃＦＰＨ−１、ｐＳＫＴＣＦＰＨ−２およびｐＳＫＴＣＦＰＨ−１２をそれぞ れ制限酵素Ｘｈｏｌで切断し１．１　ｋｂ　ＤＮＡ断片を精製した。プラスムド 、ｐｃＤＴＣＦΔＸｈｏｌ、ｐｃＤＴＣＦΔＸｈｏｌ−３、ｐｃＤＴＣＦΔＸｈ ｏ１−４、およびｐｃＤＴＣＦΔＸｈｏｌ−３４の４種のベクターも制限酵素Ｘ ｈｏｌで切断し、上記４種の１．１ｋｂ　ＤＮＡ断片とのライゲー７ジン反応に 供した。プラスミドｐＳＫ丁ＣＦＰ）Ｉの１．１ｋｂとｐｃＤＴＣＰΔＸｈｏｌ との組み合わせを除く合計１５種のライゲーション反応後、大腸菌ＭＣ１，０６ １／Ｐ３を形質転換し、１５種の発現ベクターｐｃＤＴＣＦ−１、ｐｃＤＴＣＦ −２、ｐｃＤＴＣＦ−３、ｐｃＤＴＣＦ−４、ｐｃＤＴＣＦ−１２、ｐｃＤＴＣ Ｆ−１３、ｐｃＤＴＣＦ−１４、ｐｃＤＴＣＦ−２３、ｐｃＤＴＣＦ−２４、ｐ ｃＤＴＣＦ−３４、ｐｃＤＴｃＦ−１２３、ｐｃＤＴＣＦ−１２４、ｐｃＤＴＣ Ｆ−１３４、ｐｃＤＴＣＦ−２３４およびｐｃＤＴＣＦ−１２３４を選びだした 。これらプラスミドベクターの構造は、制限酵素切断による解析でＩＩした。こ れらのプラスミドをＣＯ５細胞等の哺乳動物細胞に導入するとサイトメガロウィ ルス（ＣＭＶ）プロモータによりＴＣＦおよびＴＣＦ変異体の遺伝子の発現が検 出される。 これらのプラスミド構築法の概略を第５図に示す。 ２）　安定発現用ベクターの構築 プラスミドｐＨ５Ｇ３９６　（宝酒造）を制限酵素旧ｎｄＩ［で切断し末端をＤ ＮＡプランティングキント　（宝酒造）により平滑化し、シーンクリーンでＤＮ ＾を精製後、Ｎｏｔｌリンカ−８ｓ＋ｅｒ　５’−ＧＣＧＧＣＣＧＣ−３°（宝 酒造）を挿入し大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。クロラムフェニコール耐性形質 転換体よりプラスミドＤＮＡ５を調製し、ＨｉｎｄＩＩ＋切断部位が無く、Ｎｏ ｔｌ切断部位があるものを選びだし、ｐＨ５Ｇ　Ｎｏｔｌ　と命名した。このｐ Ｈ５Ｇ　Ｎｏｔｌの５ａｌｌ、５ｐｈｌ切断部位に５ａ１１．５ｐｈｌ制限酵素 切断部位にはさまれたＴＣＦ　ｃＤＮＡ　２．３ｋｂ　（全長）断片を挿入した 。コ（７）　ヘク９−ｐＨ３Ｇ　Ｎ−ＴＣＦから１．１ｋｂ　（７）Ｘｈｏｌ− Ｘｈｏ＋断片を欠失させｐｔｌｓＧＮ−ＴＣＦＩＩ　ΔＸと名づけだプラスミド を得た。プラスミドｐＨ５Ｇ　Ｎ−ＴＣＦΔＸを制限酵素ＢｓｔＰＩ、　５ｐｈ ｌで切断し２．３ｋｂのＤＮＡ断片を精製し、あらかじめ制限酵素ＢｓｔＰＩ。 ｓｐｈ＋で切断しておいた上記１５種のプラスミド（ｐｃＤＴＣＦ−１、Ｉ＋Ｃ Ｄ丁ＣＦ−２、ｐｃＤＴＣＦ−３、ｐｃＤＴＣＦ−４、ｐｃＤＴｃＦ−１２、ｐ ｃＤＴＣＦ−１３、ｐｃＤＴＣＦ−１４、ｐｃＤＴｃＦ−２３、ｐｃＤＴＣＦ− ２４、ｐｃＤＴＣＦ−３４、ｐｃＤＴＣＦ−１２３、ｐｃＤＴＣＦ−１２４、ｐ ｃＤＴＣＦ−１３４、ｐｃＤＴＣＦ−２３４およびｐｃＤＴｃＦ−１２３４）お よび同しく制限酵素ＢｓｔＰｌ、５ｐｈｌで消化しておいたｐｃＤＴＣＦ　（天 然型ＴＣＦｃＤＮＡを持つ）をＤＮＡ　ライゲーションキットによりライゲーシ ョンして大腸菌ＤＨ５αの形質転換に供した。得られたクロラムフェニコール耐 性形質変換体よりプラスミド［１ｌｌＡ　Ｗｔを調製し、プラスミドｐＨ５Ｇ　 Ｎｏｔ［ニ２．３ｋｂの天然型ＴＣＰまたは各変異体ＴＣＦｃＤＮＡ断片が挿入 された構造を持つプラスミド１６種（ｐＨ３ＧＮ−ＴＣＰ、ｐＨ５ＧＮ−ＴＣＦ −１、ｐＨ５ＧＮ−ＴＣＰ−２、ｐＨ５ＧＮ−ＴＣＦ−３、ｐＨ５ＧＮ−ＴＣＰ −４、ｐＨ５ＧＮ−ＴＣＰ−１２、ｐｉ（ＳＧＮ−ＴＣＰ−１３、ｐＨ５ＧＮ− ＴＣＰ−１４、ｐＨ５ＧＮ−ＴＣＦ−２３、ｐＨ５ＧＮ−ＴＣＦ−２４、ｐＨ５ ＧＮ−ＴＣＰ−３４、ｐＨ５ＧＮ−ＴＣＰ＝１２３、ｐＨ５ＧＮ−ＴＣＦ−１２ ４、ｐｉｆＳＧＮ−ＴＣＰ−１３４、ｐＨ３ＧＮ−ＴＣＰ−２３４、ｐＨ５ＧＮ −ＴＣＦ−１２３４と命名した）を選びだした。これら１６種のプラスミドを制 限酵素５ａｉｌ、Ｎｏｔｌで切断し、あらかしめ制限酵素Ｘｈｏｌ、　Ｎｏｔｌ で消化しておいた発現ヘク９−ＢＣＭＧＳｎｅｏ　（ウシパピローマウィルス複 製開始点およびサイトメガロウィルスプロモーターを持つ、大腸菌でも複製可能 なプラスミド；遺伝子工学ハンドブックｐ２９７−ｐ２９９羊土社１９９１；鳥 山−博士、現バーゼル免疫学研究所より供与）と混合しライゲーション反応に供 した０反応液で大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、得られたアンピシリン耐性株より ２．３ｋｂ各ＴＣＦｃＤＮＡ断片が８ＣＭＧＳｎｅｏに正しく挿入された、ＴＣ ＦおよびＴＣＦ変異恋発現ベクター１６種（ｐＢＰＶ−ＴＣＦ　、　ｐＢＰＶ− ＴＣＦ−１、ｐＢＰＶ−ＴＣＰ−２、ｐｇｐｖ−ＴＣＰ−３、ｐＢＰＶ−ＴＣＰ −４、ｐＢＰＶ−ＴＣＰ−１２、ｐＢＰＶ−ＴＣＰ−１３、ｐＢＰＶ−ＴＣＰ− １４、ｐＢＰＶ−ＴＣＰ−２３、ｐＢＰＶ−ＴＣＰ−２４、ｐＢＰＶ−ＴＣＰ− ３４、ｐＢＰＶ−ＴＣＰ＝１２３、ｐＢＰＶ−ＴＣＰ−１２４、ｐＢＰＶ−ＴＣ Ｐ−１３４、ｐＢＰＶ−ＴＣＰ−２３４、ｐＢＰＶ−ＴＣＦ４２３４と命名した ）を選びだした。抗生物質クロラムフェニコールはシグマ社製のものを用いた。 プラスミド構築の概略を図６に示した。これらの発現プラスミドのうちｐＢＰＶ −ＴＣＰ−３及びｐＨＰＶ−ＴＣＰ−１３の２種のプラスミドを含む大腸菌はそ れぞれ国立生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ　ＢＰ−４４５４及びＦＥＲＭ　 ＨＰ−４４５５として寄託した。 ■ＴＣＦまたはＴＣＦ変異体発現プラスミドの調製と精製上記の発現ベクター（ ｐＢＰＶ−ＴＣＦ、　ｐＢＰＶ−ＴＣＰ−１、ｐＢＰＶ−ＴＣＰ−２、ｐＢＰＶ −ＴＣＰ−３、ｐＢＰＶ−ＴＣＰ−４、ｐＢＰＶ−ＴＣＰ−１２、ｐＢＰＶ−Ｔ ＣＰ−１３、ｐＢＰＶ−ＴＣＰ−１４、ｐＢＰＶ−ＴＣＰ−２３、ｐＢＰＶ−Ｔ ＣＰ−２４、ｐＢＰＶ−ＴＣＰ−３４、ｐＢＰＶ−ＴＣＰ−１２３、ｐＢｐｖ− ｔｃｐ−１２４、ｐＢＰＶ−ＴＣＰ−１３４、ＰＢＰＶ−ＴＣＰ−２３４、ｐＢ ＰＶ−ＴＣＰ−１２３４）を持つ１６種類ノ大腸菌を５ｏｌＩｇ／Ｉ１１ノアン ヒシリン含！し培地（４００ｍｌ）　ヲ３１°ｃで培養ＬＯ，０，６００カ０． ８　トナツタトコろで、終４度が１７０μｇ／ｍｌとなるようにクロラムフェニ コールを添加し一晩培養した。Ｍａｎｉａｔｉｓ　（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　（： Ｉｏｎｉｎｇ　２ｎｄｅｄ、）の方法に従いアルカリＳＤＳ法によりプラスミド ｌＤＮＡを分離し塩化セシウム密度勾配遠心法により、発現プラスミド１６種を 精製した。 ■ＴＣＰおよびＴＣＰ変異体発現プラスミドの動物細胞への導入 動物細胞へのＤＮＡ　トランスフェクション用試薬トランスフェクタム（米国メ リーランド州ＩＢＦ社製）を用い以下に示す方法によりマウスＣ１２７細胞に１ ６種の発現プラスミドを導入した。トランスフェクション前日、２５ｃｍ”フラ スコ　（住友ベークライト社製、付着細胞用）に約１０６個のマウスＣ１２７細 胞をまいて、１゜％牛胎児血清を含むＤＭＥ培地（ＧＩＢＣＯ社製）中炭酸ガス インキュベ−９−（Ｃｏ□５〜７χ雰囲気、湿潤インキュベーター）中で３７° Ｃで一晩培養した。細胞を０ｐｔｉ、ＭＥＭｊ音地（Ｇ４ＢＣＯ社製）で２回洗 った（”ち２ｍｌの０ｐｔｉ、ＭＥＭ培地を加え、トランスフエフタム試薬添付 のプロトコールに従い１０μｇのプラスミドＤＮＡを用いトランスフェクション をおこなった。６時間の培養後、７．５　ｍｌのＤＭＥ培地を加えさらに二晩培 養を続けた。翌日培養上清を１０１の新しいＤＩ’ｌＥ？ｌ培地と交換しさらに 培養を続けた。細胞をトリプシン処理し、ＤＭＥ培地で一度洗った後１００　ｕ 　ｇ／ｍＩのＧ４１８　（Ｇ　ＩＢＣＯ社製）を含む叶ε培地５０ｍ１に懸濁し 平底の９６ウエルプレートに１００μ！／ウエルずつ添加し培養を続けた。１週 間後６４１８含有（１００μｇ／剛１）ＤＭＥ培地をさらに１００μｌ／ウエル ずつ添加し３７°Ｃで培養を続けた。１週間後ウェルあたり１００ｐｌずつ取り 、抗ＴＣＰモノクローナル抗体を用いたエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）　 （Ｎ、５ｈｉｓａ　ｅｔ、ａｌ、　Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｉａ　Ｊａ ｐｏｎｉｃａ　２６（４）４７７−４８２＋１９９１）の試料に供しＴＣＰおよ びＴＣＰ変異体の発現の有無を調べた。ＴＣＦまたはＴＣＦ変異体を発現する細 胞は、１２ウエルプレート、２５Ｃ＋Ｉｚフラスコ等を用い順次細胞数を増やし て培養した０以上の操作によりＴＣＰ変異体（全１５種ｆｉＴｃＦ−１、ＴＣＰ −２、ＴＣＰ−３、ＴＣＰ−４、ＴＣＰ−１２、ＴＣＰ−１３、ＴＣＰ−１４、 ＴＣＰ−２３、ＴＣＰ−２４、ＴＣＰ−３４、ＴＣＰ−１２３、ＴＣＰ〜１２４ 　、ＴＣＰ−１３４、ＴＣＰ−２３４及びＴＣＰ−１２３４と命名した）を発現 する細胞を得た。 ６ＴＣＦ　たはＴＣＦ　・　の　ｌ立 ７５ｃｍ　ｚフラスコ中でコンフルエントになったＴＣＰまたＴＣＰ変異体生産 細胞をトリプシン処理によりはがした後その細胞の一部を２２５ｃｍ２フラスコ ３枚に移し、１００ｍ１　ＤＭＥ培地を加え１３７°Ｃで培養した。４日後コン フルエントとなった細胞をトリプシン処理し、ＤＭＥ培地にＰ！濁し、懸濁液を Ｄ？ＩＥ培地で１０倍に希釈した（全量３Ｌ）。この希釈細胞懸濁液をの新しい ２２５ｃｍ”組織培養フラスコに接種した。細胞は３０個の２２５ｃｍ”組織培 養フラスコ中で３７°Ｃ１５日間培養し、培養上清（全量３　Ｌ）を集め、細胞 を６個のフラスコから回収した。つづいて、６個の２２５ｃ＋ａ”組織培養フラ スコに接種し、各フラスコに培地１００１を加え３７°Ｃで５日間培養した。培 養上清（全量６　Ｌ）を回収した。こうしてＴＣＰまたはＴＣＰ変異体を含む９ リツトルの培養上清を得た。 ７ＴＣＰおよびＴＣＰ　・　の　１■ 以下に示す３段階の方法で精製した。 （１）ヘパリン・セファロースＣＬ−６８各種ＴＣＰ変異体を含む培養上清９リ ツトルを、６．００Ｏｒｐｍ／３０ｗ１ｎの遠心で不溶物を除いた後、３００１ の平衡化緩衝液（０，５？ｌＮａＣ１と０．０１χＴｗｅｅｎ２０を含む１０ｍ Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ７，５）で平衡化させたヘノマリン−セファロース ＣＬ−６Ｂカラム（２，５Ｘ１２ｃｍＮファルマシア社製）に、約２００　ｍｌ ／ｈｒの流速で通液して、ＴＣＰ変異体をカラムに吸着させた。約７００ｍ１の 平衡化緩衝液で洗浄後、２Ｍ　ＮａＣ１と０．０１χＴｗｅｅｎ２０を含む１０ ｍＭ　Ｔｒｉｓ−）１ｃＩ、ｐＨ７，５で溶出させ、３１ずつフラクションコレ クターで分画し、Ｏ，０，２８０ｎｍに吸収をもつ画分をモニターし、ＴＣＦま たはＴＣＦ変異体を含む百分約１００ｍ１を得た。 （２）　Ｍｏｎｏ　Ｓ　ＦＰＬＣ ２Ｍ　ＮａＣ１で溶出させたＴＣＰまたはＴＣＰ変異体を含む溶出液を、０．１ ５ＭのＮａＣ１を含む１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ６，５で透析し、１２、００ Ｏｒｐｍ／９０ｍ１ｎの遠心で不溶物を除いた後、上清を約２０＋ａｌの０．１ ５門ＮａＣ］と０．０１χＴｗｅｅｎ２０を含む１０１リン酸緩衝液、ｐＨ７， ０（Ａ緩衝液）で平衡化させたＭｏｎｏ　Ｓカラム（０，５Ｘ５ｃｍ、ファルマ ノア、ＦＰＬＣ）に、１ｍｌ／１ｍ１ｎの流速で通液させ、カラムを約３０ｍ１ のへ緩衝液で洗浄後、０．５ｍｌ／ｖａｉｎの流速で、６０分間で直線的にＮａ Ｃ１の濃度を１．０Ｍまで高めることによりＴＣＰまたはＴＣＰ変異体を溶出さ せ、０．５ｍｌずつフラクションコレクターで分画し、０．７〜０．８門のＮａ Ｃ１で溶出されるＴＣＦまたはＴＣＦ変異体を含む画分約４ｍｌを得た。 （３）ヘパリン５−ＰＷ　ＦＰＬＣ ＴＣＰまたはＴＣＰ変異体を含む溶出液に０．０１χＴ讐ｅｅｎ２０を含む２倍 量の１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ７，５を加え、この希釈液を０．３ＭＮ ａＣ］　と０．０１χＴ＋ｖｅｅｎ２０を含む１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ４１ＣＩ、ｐ Ｈ７，５（Ｂ緩衝液）約２０＋＊　ｌで平衡化させたヘパリン５−ＰＷカラム（ ０，５Ｘ７．５ｃｍ、トーソー、ＦＰＬＣ）に１　ｍｌ／ｓｉｎの流速で通液さ せ、カラムを約３０＋ｍｌのＢ緩衝液で洗浄後、０．５　ｍｌ／ｗｉｎの流速で 、直線的にＮａＣｌの濃度を２．０Ｍまで高め、０．５１ずつに分画した。ＴＣ ＰまたはＴＣＰ変異体を含む両分（約１．３ＭのＮａＣｌで溶出され、全量的３ ｇ＋１）を得た。これら画分を脱イオン水に対し透析し、凍結乾燥後０．００１ χＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ　（リン酸緩衝液−生理食塩水）に溶解し最終精 製ＴＣＰ変異体の収量および収率は第１表に示した。 収量は後述のポリクローナルＥＩＡ法によりめた。 ［Ｆ］エエ」ＪＪＵｌｌ【隨ｑ定１ １）　ポリクロナル−の＝　１１（！ニー　の、量常法に従いＴＣＰで免疫した 兎から得た抗ＴＣＰ抗血清より、アフィゲルプロティンＡセファロース（バイオ ランド社製）を用いてマニュアルに従い精製１ｇＧを得た。これをＰＢＳで一晩 透析したのち、ＴＣＰをマニニアルに従いアフィゲル１０（バイオランド社製） に固定化したカラムに、０．５　ｍｌ／ｍｉｎの流速でチャージしたのちＰＢＳ で洗浄した。ついで０．１Ｍ　Ｇｌｙｃｉｎｅ、ＨＣＩ、ｐＨ２，５で熔出し、 溶出画分をＰＢＳで透析して抗ＴＣＦポリクロナル抗体を得た。抗体の酵素標識 は、石川らの方法（Ｉｓｈｉｋａｗａ、Ｅ　ｅｔ、ａｌ、。 Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、　ｖｏｌ、４，２０９−３２７．１９８３）に従 いペルオキシダーゼ標識した。 ２）　精製した各種ＴＣＰ変異体の定量抗ＴＣＦポリクロナル抗体を１０Ｍｇ／ ｍｌの濃度になるように０．１門重曹溶液に溶解し、９６六マイクロクイタープ レート　（ヌンク社製）に１００μｌ／ウェル分注し、室温で一晩放置し固相化 した。ついでブロックエース（７印乳業社製）を蒸留水で２倍に稀釈した溶液を ウェル（２００μｌ／１）にみたし室温で１時間装置し、プロ、キングした。ひ き続きプレートを０．１χＴｗｅｅｎ　２０を含むＰＢＳ　（洗浄バッファー） で３回洗浄した。各種ＴＣＰ変異体サンプルを１次バッファー（４０χブロツク エース、０．１ｚＴｗｅｅｎ２０を含む０．２Ｍ　Ｔｒｉｓ　ＨＣＩ、ｐＨ７， ４）で適当な量に稀釈し、ＴＣＰ変異体サンプルを調製した。スタンダードＴＣ Ｆｉ液は、１次緩衝液で１０Ｍｇ／ｍｌの濃度より段階稀釈したＴＣＰ溶液を用 いた。上記サンプルを１００μｍずつ各ウェルに加え、３７°Ｃで３時間放置し た後洗浄バッファーで３回洗浄した。ベルオキソダーゼ結合抗体？８液を２次バ ッファー（２０χブロツクエース、０．１χＴｗｅｅｎ２０．　Ｏｚ５ｍｇ／ｍ ｌ　マウスＩｇＧを含む０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ　ＨＣＩ、　ｐｔ＋　７．４）で４ ００倍稀釈し、１００μｍずつ各ウェルに加え、３７°Ｃで２時間放置した後洗 浄バッファーで３回洗浄した。ついで基！溶液（０，４Ｂ／ｍｌのオルトフェニ レンジアミンニ塩酸、０．００６χ過酸化水素を含む０．０１　クエン酸−リン 酸緩衝液、ｐ）Ｉ　４．５）を１００μｍ加え、３７°Ｃで３０分暗室に放置し た。６Ｎ硫酸を５０μｍ加え酵素反応を止めた後マイクロフォトメーター（コロ ナ社）で４９２　ｒ＋ｆｆｉの吸光度を測定した。 ９１１ＴＣＦの５Ｏ５−ポリアクリルアミド゛ル　′精製した各ＴＣＦ変異体５ μｇをＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。後述のごとく生体内半 減期が顕著に延長したＴＣＰ変異体であるＴＣＰ−３、ＴＣＰ−１３および天然 型ＴＣＰの電気泳動パターンを第７図に示した。 βメルカプトエタノール存在下（還元状態）及び非存在下（非還元状Ｂ）で泳動 した。第７図に示したように、ＴＣＰは非還元状態で７８，０００近傍および７ ４，０００近傍の近接した２つのバンドを示した。非還元状態ではＴＣＰ−３の ２つのハンドがＴＣＦのハンドより低分子側に移動していた。ＴＣＰ−１３のほ うがＴＣＰ−３よりもさらに低分子側に移動していた。還元状態では、ＴＣＰは ５２．０００近傍、３０，０００近傍および２６，０００近傍の３本のバンドを 示し、ＴＣＰ−３は５２，０００近傍、２６．０００近傍および２２，０００近 傍の３木の蛋白質のハンドを示した。同様にＴＣＰ−１３は、４８．０００近傍 、２６、０００近傍および２２．０００近傍の３木のハンドを示した。この結果 はオリゴ糖鎖除去による分子量の低下と推測され、所望の変異体が得られたと判 断した。また、ＴＣＰおよびＴＣＰ変異体の構造から推測されるハンド以外はな にも検出されなかった。 実施例２ ＴＣＦ　びＴＣＦ　・　のｉｎ　ｖｉｔｒｏ　；■）　肝細胞増殖活性 肝細胞増殖活性を以下の方法により測定した。セグレンの方法（門ｅｔｈｏｄｓ 　ｉｎ　ｃｅｌｌ　ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｖｏｌ、１３．　＋＋２９＋　１９７６、 　ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｒｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）に従い、ウィスター系 ラット　（体重的２００ｇ）より肝実質細胞を単離した。細胞の増殖には、基礎 培地、即ち１０％生胎児血清、１０μＨデキサメタシンを含むウィリアムスＥ（ フローラボラトリー社製）培地を使用した。細胞を１．０Ｘ１０’個１０．１ｍ ｌ／ウェルの濃度で９６ウエルプレート（ファルコン社製）に播き、３７℃で培 養した。２４時間後、ＴＣＰあるいはＴＣＰ変異体を含む基礎培地を各ウェルに １００μｌ添加し、さらに２２時間培養を続はコトチミジン（アマジャム社製） を１μＣｉ／ウエルとなるように添加し、さらに２時間培養をした。細胞を冷Ｐ ＢＳで２回洗ったのち０．５％トリプシン処理ではがし、セルハーベスタ−によ りガラスフィルターのシートに回収した。各ウェルの細胞に取り込まれた放射能 をマトリックス９６（パフカード社製）により測定しＤＮＡ合成量とした。結果 を第８図に示したように、すべてのＴＣＰ変異体が肝細胞増殖活性を保持してい たことが確認された。 ２）　腫瘍細胞障害活性 ＴＣＰ　、　ＴＣＰ−３、ＴＣＰ−１３の抗腫瘍細胞活性を測定した。 供試細胞としてＭｅｔｈ　Ａ　ｓａｒｃｏｍａを用いた。２　ＸＩＯ’　ｃｅｌ ｌｓ／ａｌｌとなるように１０％ＦＣ５含有ＲＰ旧培地（ＧＩＢＣＯ社製）で細 胞を懸濁し、９６穴平底マイクロクイタープレートの各ウェルに細胞懸濁液を５ ０μｍずつ添加した。　ＴＣＰ　、　ＴＣＰ−３、ＴＣＰ−１３各精製品をＲＰ 旧培地で最終濃度５０ｎｇ／＋１から段階希釈し、各希釈サンプルをウェルに５ ０μｍずつ添加した。炭酸ガス存在下３７°Ｃで５日間培養した後５０＋ｗｇ／ ｎｌ　となるようにＭＴＴを添加しさらに３７°Ｃで培養した。４時間後１０％ ＳＯＳ　、０．０１１Ｎ）１．ＣＩを含むｉ＠液１００μｍを添加し室温に一晩 放置した。翌日０．Ｄ、６２０ｎｗの吸収を測定し、生細胞数のパラメーターと した。測定結果を第９図に示した。 ＴＣＰ　−ＴＣＰ−３、ＴＣＰ−１３のいずれも用量依存的にＭｅｔｈ　Ａ細胞 障害活性を示した。 実施例３ ＴＣＦおよびＴＣＦ　・　の　′藍の゛抗ＴＣＦポリクロナル抗体をｌＯμｇ／ 纏ｌの濃度となるように０．１Ｍ重曹溶液に溶解し、９６六マイクロプレート　 （ヌンク社製）に１００μｌ／ウェル分注し、室温で一晩放置した。ついでブロ ックエースを蒸留水で希釈した５０χ溶液をウェルにみたし室温で１時間放置し た。ひき続きプレートを洗浄溶液（０，１％Ｔｗｅｅｎ　２０を含むＰＢＳ）で ３回洗浄した。ＴＣＰまたは各種ＴＣＰ変異体を静脈注射したラットから経時的 に採取された血漿サンプルを必要に応じ正常ラット血清で希釈した。スタンダー ドＴＣＰ溶液は、正常ラット血清で１０ｎｇ／ｍｌの濃度より段階希釈したＴＣ Ｆ溶液を用いた。これらのサンプル５０μｌと５０μｌの１次緩衝液（５０％ブ ｏ　７クエース、０．２ｆｆ　ＮａＣＩ、０．１％Ｔｗｅｅｎ　２０．０．２％ ＣＩ（ＡＰＳ、　２０ｍＭベンザミジン塩酸、１０＋ｓＭ　ＥＤＴＡを含む０． ２ＭＴｒｉｓＨＣ１，ｐ）１７．３１を混合して各ウェルに加え、３７°Ｃで３ 時間放置した後洗浄ハソフア−で３回洗浄した。１０％ブロックエース、０．１ ５Ｍ　ＮａＣ１，０，１％Ｔｗｅｅｎ　２０．４％ラット血清、０．５ｍｇ／ｍ ｌマウスＩｇＧを含む０．１門リン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で４００倍に希釈し たペルオキシダーゼ標識抗ＴＣＦ抗体溶液１００μｍを各ウェルに加え、３７° Ｃで２時間放置した後洗浄パンファーで３回洗浄した。ついで基質溶液（０，４ ＋ａｇ／ｍｌのオルトフェニレンジアミン塩酸、０．００．６％過酸化水素を含 む０．１Ｍ　クエン酸−リン酸緩衝液、ｐＨ４，５）を１００ｔＩｌ加え、３０ 分暗室に放置した。　６Ｎ硫酸を５０μｍ加え酵素反応を止めた後、イムノリー ダー（コロナ社）で４９２　ｎｍの吸光度を測定し血中濃度の変動を測定し、Ｔ ＣＦまたはＴＣＦ変異体のラント血清中の濃度を調べた。 ＴＣＰまたはＴＣＰ変異体を１回静脈注射した後のラットでＥＩＡ法で血漿レベ ルの経時変化を調べた。う・ノドは　体重２００ｇ前後のＷｉｓｔａｒ系雄ラッ トを用いた。ラットにＴＣＰを静脈注射後、血清レベルは、２−ｃｏｍｐａｒｔ ｍｅｎｔ　ｍｏｄｅｌによって示したとうに、２相性に衰滅した。５０Ｍｇ／ｋ ｇの投与量でＴＣＰ注射後のラットにおける急速相（ｒａｐｉｄ　ｐｈａｓｅ） と遅速相（ｓｌｏｗｅｒ　ｐｈａｓ）の血漿半減期は、それぞれ２．４±２．５ １ｌｉｎ、（ｔ’／ｚ　ａ”ｌ　と１５．６±４．６　ｍｉｎ、（ｔ’／ｌ　β ）であった、ＴＣＰ変異体の血漿レベルのプロフィールハ天然型ＴＣＰに似てい るが、同量で静脈注射した後の血漿レベルの減衰は天然ＴＣＰより遅い。 第２表に示すように、ＴＣＰ−３およびＴＣＰ−１３の血漿半減期は延長し、全 クリアランスは低下した。ＴＣＰ−３およびＴＣＰ−１３の血漿濃度一時間曲線 の面積（ＡＵＧ）は天然ＴＣＰに比べ大きい。 第２表 薬物動態学的パラメーター 試料　ｔｌ／□α　ｅｌ／□β （ｉｉｎ）　（ｉｉｒ＋） ＴＣＰ　２．４″：０．５　１５．６　’ニー　４．６７ＣＦ−１２，４土０． ３　１９．６　＝０．３ＴＣＰ−２２，２＝０．６　１８．２　＝＝　２．５丁 ＣＦ−３２，９立０．３　５４．２立８．３“。 ＴＣＦ−４２，７＋　０．１　２０．６　”−３，３ＴＣＦ−１２，２，７±０ ．３　１８．１−１：１．６ＴＣＰ−１３３，８＝０．５１“　２４．９　＝ｉ ＝　３．１”ＴＣＰ−１４１，９±０．４　１８．８±２．９丁ＣＦ−２３２， ４±０．５　１５．４土０．５７ＣＦ−２４２，３±０．１　１６．９土１．７ 丁ＣＦ−３４　２．２土０．５　１８．０　：！＝　２．１ＴＣＦ−１２３２， ２立０．１　１７．２±０．８７ＣＦ−１２４２，３立０．１　１５．７±２． ７ＴＣＰ−１３４２，３立０．４　１９．１±３．２７ＣＦ−２３４２，６±０ ．６　１６．８±１．６ＴＣＰ−１２３４２，９立０．１°　２４．　±５，５ ”平均値土還準偏差、”Ｐ＜０．０５、”Ｐ＜０．０１第３表 試Ｆ’ｌ　ＡＵＣＣＬ、。ｃ、Ｌ （Ｂ−ｗｉｎ／ｍｌ）（ｍｌ／ｓｉｎ／ｋｇ）ＴＣＦ　ＬＯ３０，０と２５７． ９　５１．５土１３．９ＴＣＦ−１８Ｌ１．６±１５８．３　６３．２±１２． ２７ＣＦ−２１１４３，７＝５５１．７　４９．８　±　１８．９ＴＣＰ−３２ ６７９，５立　２９２．１°“　１８．８　”＝　２．１　°”ＴＣＦ−４８９ ７，８土　２６３．５　５８．６　立　１４７ＴＣＰ−１２１２４６，４立２９ ０，８　４１．７　：　１０．６ＴＣＦ４３　８３０１．０　’＝　２７９．７ ”−６，０”−０，２“ＴＣＰ−１４９７２，５＝１＝　１６２．２　５２．５ 　＝　９．５ＴＣＰ−２３１２２３，０±３５６．７　４３．６　立１４．３Ｔ ＣＰ−２４１０１７，８’＝　２１０．０　５１．０　±　８．３ＴＣＰ−３４ ９８３，０±　６１．０　５１．Ｏｔｈ３．２ＴＣＰ−１２３９６３，８”：　 ６６．２　５２．０　立　３．５τＣＦ−１２４１１２６，３立２６５．０　４ ５．９　＋　９．５ＴＣＦ−Ｌ３４　９６０．９±２７９．７　５５．２　＋　 １６．７７ＣＦ−２３４８９２，９±１１９．７　５６．６土７．ＩＴＣＦ−１ ２３４１２６６，５±　７［１，９３９，６±　２．６平均ｇ１ｔｈ標１！偏差 、叩＜０．０５、°“Ｐ＜０．０１これらの結果から、ＴＣＰ−３およびＴＣＰ −１３は、天然型ＴＣＰに比べより遅い代謝速度とより大きい生物利用性を有す ることが判る。τＣＦ−３のアミノ酸配列は配列番号２に、ＴＣＰ−１３の配列 は配列番号３に示した。 本発明によるＴＣＰ変異体はより長い生体内半減期を有し、肝細胞の増殖活性お よび腫瘍細胞に対する細胞毒活性を有する。 従って、肝臓に対する治療剤または抗癌剤として作用である。 配列表 配列番号：１ 配列の長さニア２３ 配列の型２アミノ酸 配列の種類：タンパク質 配列 Ｍｅｔ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　 Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ｂｉｓ　Ｖａｌ　ＬｅｕＬｅｕ　Ｂｉｓ　Ｌ ｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｉｌｅ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　Ｔ ｙｒ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｇ１ｎＡｒｇ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｓ ｎ　丁ｈｒ　ＩＩｅ　Ｈｉｓ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ａｌ ａ　Ｌｙｓ　丁ｈｒＴｈｒ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　ＬｙＳＩｌｅ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　 Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｔｉｅ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｖａ１Ａ ｓｈ　Ｔｂｒ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｇｉｎ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ｃ ｙｓ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ａｓ！Ｉ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｌｅ■ Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　 Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｇｉｎ　ＣｙｓＬｅｕ　Ｔｒｐ　Ｐ ｈｅ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｍｅｔ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｖ ａｌ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｐｂｅｌｏｏ　１０５　１１０ ｃｒｙ旧ｓ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｌｙ ｓ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｔｌｅ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｃｙｓ１ｉｅ　Ｉｌｅ　Ｇａｙ 　Ｌｙｓ　Ｇａｙ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ 　Ｓｅｒ　Ｉｃｅ　Ｔｈｒ　ＬｙｓＳｅｒ　Ｇｌｙ　Ｔｉｅ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　 Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｍｅｔ　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　Ｈｉｓ　 Ｇｌｕ　Ｈ４５Ｓｅｒ　丁ｙｒ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｇ ｉｎ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　ＡｒｇＧａ ｙ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　Ｃｙｓ　Ｐｈｅ　Ｔｈ ｒ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｖａｔ　ＡｒｇＴｙｒ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ 　Ｃｙｓ　Ａｓｐ　ｌｉｅ　Ｐｒｏ　Ｇｌｎ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ 　Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　Ｍｅｔ　ＴｈｒＣｙｓ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　 Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｍｅｔ　Ａｓｐ　Ｈｉｓ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　 Ｓｅｒ　ＧａｙＬｙｓ　ｌｉｅ　Ｃｙｓ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ｔｒｐ　Ａｓｐ　Ｈ ｉｓ　Ｇｌｎ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｈｉｓ　Ａｒｇ　Ｈｉｓ　Ｌｙｓ　ＰｈｅＬｅ ｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｇａｙ　Ｐｈ ｅ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　ＡｒｇＡｓｎ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ 　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　Ｃｙｓ　丁ｙｒ　Ｔｂｒ 　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　ＨｉｓＴｈｒ　Ａｒｇ　Ｔｒｐ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　 Ｃｙｓ　Ａｈａ　ｌｉｅ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　 Ｔｈｒ　ＭｅｔＡｓｎ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｇ ｌｕ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　Ｉｌｅ　Ｇｉｎ　Ｇａｙ　Ｇ１ｎＧｌ ｙ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｔｈ ｒ　ｌｌｅ　Ｔｒｐ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｐｒ。 Ｃｙｓ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ｔｒｐ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　 Ｈｌｓ　Ｇｌｕ　）ｌｉｓ　Ａｓｐ　Ｍｅｔ　Ｔｈｒ　ＰｒB Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　 Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｐｒ。 Ａｓｐ　Ｇａｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　丁ｒｐ　Ｃｙｓ　Ｐｈｅ　 Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　ｌｉｅ　Ａｒｇ〜ａｌ　Ｇｌｙ　Ｔ ｙｒ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ｉｃｅ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｃｙｓ　Ａｓｐ　Ｍ ｅｔ　Ｓｅｒ　Ｈｉｓ　Ｇｌｙ　Ｇ１ｎＡｓｐ　Ｃｙｓ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ｇｌ ｙ　Ａｓｈ　Ｇａｙ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　丁ｙｒ　ｎｅｔ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｌｅ ｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌ。 Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　丁ｈｒ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｍｅｔ　 丁ｒｐ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｍｅｔ　Ｇｌｕ　ＡｓｐＬｅｕ　Ｈｉｓ　Ａ ｒｇ　Ｈｉｓ　ｌｉｅ　Ｐｈｅ　Ｔｒｐ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｓ ｅｒ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　ＧｌｕＡｓｎ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ａｒｇ　Ａｓ ｈ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｈｉｓ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｔｒ ｐ　Ｃｙｓ　ＴｙｒＴｈｒ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　１１ｅ　Ｐｒｏ 　Ｔｒｐ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｃｙｓ Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｔｂｒ　Ｐｒｏ　丁ｈｒ　Ｉｃｅ　Ｖａｌ　 Ａｓｏ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　［ｌｉｓ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　ｌ１■ ４６５　４７０　４’、５　４８０ Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　 Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｉｃｅ　Ｐｒｏ　ＴｂｒＡｒｇ　丁ｈｒ　Ａ ｓｎ　Ｉｃｅ　Ｇｌｙ　丁ｒｐ　ＦＩｅｔ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　 Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｈ４T １１ｅ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇａｙ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｔｌｅ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　 Ｓｅｒ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　丁ｈｒ　Ａｌａ　ＡｒｇＧｉｎ　Ｃｙｓ　Ｐ ｈｅ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｇ ｌｕ　Ａｌａ　Ｔｒｐ　Ｌｅｕ　ＧｌｙＩｃｅ　Ｂｉｓ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　ｔｌ ｉｓ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ｇ ｉｎ　Ｖａｌ　Ｌｅ■ Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　丁ｙｒ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　 Ｇｌｕ　Ｇａｙ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　ＬｅｕＭｅｔ　Ｌｙｓ　Ｌ ｅｕ　Ａｈａ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｐ ｈｅ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　１ｉｅＡｓｐ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｔｙ ｒ　Ｇａｙ　Ｃｙｓ　Ｔｂｒ　ｌｉｅ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｓｅ ｒ　Ｃｙｓ　ＳｅｒＶａｌ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　７ｒｐ　Ｇａｙ　Ｔｙｒ　丁ｈｒ 　Ｇａｙ　Ｌｅｕ　Ｊｌｅ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ　ｃｌｙ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ Ａｒｇ　ｌ’ａｌ　Ａｌａ　Ｈａｓ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　ＩＩｅ　Ｍｅｔ　Ｇｌｙ 　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　ＲＩ■ Ｈｉｓ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　丁ｈｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　 Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｉｃｅ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　ＡｌａＧｌｕ　Ｌｙｓ　Ｉ ｌｅ　Ｇａｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｔ ｙｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　ＬｅｕＶａｌ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　ＧＩｎ　Ｈｉ ｓ　Ｌｙｓ　Ｍｅｔ　Ａｒｇ　Ｍｅｔ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　ｌｉ ｅ　Ｖａｌ　Ｐｒ。 Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｇａｙ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　 Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｖａ＋Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｔ ｙｒ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｔｒｐ　ｌｉｅ　Ｂｉｓ　Ｌｙｓ　Ｉｃｅ　Ｉｃｅ　Ｌ ｅｕ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　Ｖａ１’ｒｏ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ 配列番号：２ 配列の長さニア２３ 配列の型二アミノ酸 配列の種類：タンパク質 配列 門ｅｔ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　 Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｈｉｓ　Ｖａｌ　Ｌｅｕｌ　５　１０　１５ Ｌｅａ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｉｌｅ　Ａｌａ　 Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｇ１ｎＡｒｇ　Ｌｙｓ　Ａ ｒｇ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　ｌｌｅ　Ｈｉｓ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｌ ｙｓ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ丁ｈｒ　Ｌｅｕ　７１ｅ　Ｌｙｓ　ｌｉ ｅ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ａｉａ　Ｌｔｕ　Ｌｙｓ　ＩＩｅ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｌｙ ｓ　Ｌｙｓ　Ｖａ１Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｇｌｎ　Ｃｙｓ　Ａｈａ 　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｇａｙ　Ｌｅｕ ６５　７０　７５　８Ｑ Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　 Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ａｈａ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｇｌｎ　Ｃｙｓ８５　９０　ｇ５ Ｌｅｕ　Ｔｒｐ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｍａｔ　Ｓｅｒ　 Ｓｅｒ　Ｇｌｙνａｌ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅｌｏｏ　１０５　１１ Ｏ Ｇａｙ　ｌ１ｉｓ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ 　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｉｃｅ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｃｙ■ １ｉｅ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　 Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　ＬｙｓＳｅｒ　Ｇｌｙ　Ｉ ｌｅ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｍｅｔ　ｌ ｉｅ　Ｐｒｏ　Ｈｉｓ　Ｇｌｕ　ＨｉｓＳｅｒ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｌｙ ｓ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｇｌ、ｕ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ａｒｇ　Ａ ｓｎ　Ｐｒｏ　Ａｒ■ Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｇｉｋｌ　Ｇａｙ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　Ｃｙｓ　Ｐｈｅ 　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ａｒ■ Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　ＧＩｎ　Ｃｙｓ　 Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　Ｍｅｔ　ＴｈｒＣｙｓ　Ａｓｎ　Ｇ ｌｙ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｍｅｔ　Ａｓｐ　Ｆ ｌｉｓ　７ｈｒ　Ｇ１１ｌ　Ｓｅｒ　Ｇ撃■ Ｌｙｓ　Ｊｌｅ　Ｃｙｓ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ｔｒｐ　Ａｓｐ　Ｈｉｓ　［ｉｌｎ 　丁ｈｒ　Ｐｒｏ　ｆｌｉｓ　Ａｒｇ　Ｈａｓ　Ｌｙｓ　Ｐ■■ Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌａ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｇａｙ　 Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　丁ｙｒ　Ｃｙｓ　ＡｒｇＡｓｎ　Ｐｒｏ　Ａ ｓｐ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　丁ｒｐ　Ｃｙｓ　Ｔｙｒ　丁 ｈｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｈｉｓ２６０　、　２６５　２７０ τｈｒ　Ａｒｇ　Ｔｒｐ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　ｌｉｅ　Ｌｙｓ　 Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｍｅｔ幻二１肛」上ＬＡｓ ｐ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　ｌｌ ｅ　Ｇｌｎ　Ｇａｙ　Ｇ１ｎＧｌｙ　Ｇｌｕ　Ｇａｙ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ 　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　ｌｉｅ　Ｔｒｐ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　ｌｉｅ 　Ｐｒ。 Ｃｙｓ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ｔｒｐ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　丁ｙｒ　Ｐｒｏ　 Ｂｉｓ　Ｇｌｕ　Ｂｉｓ　Ａｓｐ　Ｍｅｔ　Ｔｈｒ　Ｐｒ。 Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　 Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｐｒ。 ３４０　３４５　３５Ｄ Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　Ｃｙｓ　Ｐｈｅ　 Ｔｂｒ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　ＩＩｅ　Ａｒｇ３５５　３６０　３ ε５ Ｖａｌ　Ｇａｙ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　ｌｉｅ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　 Ｃｙｓ　Ａｓｐ　Ｍｅｔ　Ｓｅｒ　Ｈｒｓ　Ｇｌｙ　Ｇ１ｎＡｓｐ　Ｃｙｓ　Ｔ ｙｒ　Ａｒｇ　ｆ；Ｉｙ　Ａｓｎ　１ｉｌｙ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ｍｅｔ 　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　ＧPｎ Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｍｅｔ　 Ｔｒｐ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｍｅｔ　Ｇｌｕ　ＡｓｐＬｅｕ　ｔｌｉｓ　 ＡｒｇＨｉｓ　Ｉｃｅ　Ｐｂｅ　Ｔｒｐ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ａｈａ　Ｓ ｅｒ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　ＧｌｕＡｓｎ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　ＡｒｇＡｓｎ 　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｈｉｓ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ 　Ｃｙｓ　Ｔｙｒτｈｒ　Ｇａｙ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　ｌｌｅ　Ｐｒｏ　 Ｔｒｐ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｃｙ！＋　Ｐｒｏ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｃｙ■ Ｃ１ｕ　Ｇａｙ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｊｌｅ　Ｖａｌ　 Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｈｉｓ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｉ］ｅＳｅｒ　Ｃｙｓ　Ａ ｈａ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｌ霞　１’ａｌ　Ａ ｓｎ　Ｇａｙ　ＩＩｅ　Ｐｒｏ　ＴｈｒＡｒｇ　丁ｈｒ　Ａｓｎ　ｌｉｅ　Ｇｌ ｙ　Ｔｒｐ　Ｍｅｔ　Ｖａｔ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ａｓ ｎ　Ｌｙｓ　Ｈａｓ１１ｅ　Ｃｙｓ　Ｓｌｙ　Ｇａｙ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｉｃｅ 　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ａｒｇ Ｇｉｎ　Ｃｙｓ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　 Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｔｒｐ　Ｌｅｕ　ＧｌｙＩｃｅ　）ｌｉｓ　 Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｈｉｓ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　 Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　Ｌｅ■ Ａｓｎ　Ｖａｔ　Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　 Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｖａｔ　Ｌｅｕ月ｅｔ　Ｌｙｓ　Ｌ ｅｕ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｐ ｈｅ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　ｌ１ｅＡｓｐ　Ｌｅｕ　ＰｒＯＡｓｎ　丁ｙｒ 　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ｔｂｒ　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ 　Ｃｙｓ　５ｅｒＶａｌ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　７ｈｒ　 Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｉｃｅ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ　Ｇａｙ　Ｌｅｕ　ＬｅｕＡ ｒｇ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｆｌｉｓ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　ｌｉｅ　Ｍｅｔ　にｌｙ　 Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　ＧｌＩＩ　［T Ｈｉｓ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　 Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｔｈｅ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　ＡｌａＧｌｕ　’Ｌｙｓ　 ｌｉｅ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　 Ｔｙｒ　Ｇａｙ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｌｅ■ Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　Ｈｉｓ　Ｌｙｓ　？ｌｅｔ　Ａｒｇ　Ｍｅｔ 　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｉｌａ　”’　”−ＣＧｌｙ　Ａｒｇ　Ｇ ｌｙ　Ｃｙｓ　Ａｈａ　ＩＩｅＰｒｏ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｇａｙ　Ｉｃ ｅ　Ｐｈａ　Ｖａｔ　Ａｒｇ　Ｖａ１Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ｌｙｓ 　Ｔｒｐ　ｌｉｅ　Ｈｉｓ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　Ｔｉｅ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ 　Ｌｙｓ　ＶａｉＴＣ５−，１０７１５ Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ 配列番号：３ 配列の長さニア２３ 配列の型二アミノ酸 配列の種類：タンパク質 配列 Ｍｅｔ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　Ｔｂｒ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　 Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　）Ｉｉｓ　Ｖａｌ　Ｌｅ■ ］　５　１０　１５ Ｌｅｕ　ＨＳｓ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｉｃｅ　Ａｌａ　 Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｇ１ｎ２０　２５　’　３ ０ Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｈｉｓ　Ｇｌｕ　 Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｌｙ！＋　丁ｈ■ 丁ｂｒ　Ｌｅｕ　Ｔｈｅ　Ｌｙｓ　Ｉｃｅ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ａｈａ　Ｌｅｕ　 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フロントページの続き （５１）　ｒｏｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号／／Ａ６１Ｋ　３８１０ ０　ＡＤＵ （７２）発明者　津１）英資 栃木県下部賀郡石橋町石橋６６２　マロニエハイツ２１０ （７２）発明者　汗水　薄明 栃木県下部賀郡壬生町駅東町２５−９ （７２）発明者　高比良　玲子 栃木県河内郡河内町下岡本３７６９−１８Ｉ （７２）発明者　大垣　文子 栃木県宇都宮市大和１−８−１１ （７’２）発明者　上１）正次 埼玉県用越市今福１６７２−１　メゾンむさし野７１９ （７２）発明者　末尾　侃二 埼玉県川越市山田１７６９−１０

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. １．Ｎ結合オリゴ糖鎖に関与するアミノ酸残基を変異させ、Ｎ結合オリゴ糖鎖の 少なくとも１つをＴＣＦに結合させないことを特徴とするＴＣＦ変異体。
2. ２．配列表配列番号１記載のアミノ酸配列におけるＮ末端から、２８９，３９７ ，５６１及び／または６４８位のアスパラギンにオリゴ糖鎖が結合しないように Ｎ糖鎖形成関与残基の１つを他のアミノ酸残基で置換された請求項１記載のＴＣ Ｆ変異体。
3. ３．５６３位のセリンがアラニンに置換された請求項１記載のＴＣＦ変異体。
4. ４．２８９位のアスパラギンがクルタミン、５６３位のセリンがアラニンに置換 された請求項１記載のＴＣＦ変異体。
5. ５．配列表配列番号２記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡの発現した糖タン パク質であるＴＣＦ変異体。
6. ６．配列表配列番号３記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡの発現した糖タン パク質であるＴＣＦ変異体。