JP2002302500A - 新規蛋白質及びこれを使用した薬剤の製法 - Google Patents
新規蛋白質及びこれを使用した薬剤の製法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 TNFαの作用を中和することのできる蛋白
質の提供 【解決手段】 最初のグリコシル化された形で分子量約
42000ダルトンを有し、N−末端にアミノ酸配列; Xaa Thr Pro Tyr Ala Pro G
lu Pro GlySer Thr Cys Arg
Leu Arg Glu [式中、Xaaは、水素原子、フェニルアラニン基(P
he)又はアミノ酸配列;Ala Phe、Val A
la Phe、Gln Val Ala Phe、Al
a Gln Val Ala Phe、Pro Ala
Gln ValAla Phe又はLeu Pro
Ala Gln Val Ala Pheを表す]を有
する蛋白質、及びこの蛋白質の作用を強く低下させるこ
となく、アミノ酸又はペプチドの好適な置換、欠失又は
付加により又はグリコシド基を変化させることにより得
られるムテインにより解決する。
質の提供 【解決手段】 最初のグリコシル化された形で分子量約
42000ダルトンを有し、N−末端にアミノ酸配列; Xaa Thr Pro Tyr Ala Pro G
lu Pro GlySer Thr Cys Arg
Leu Arg Glu [式中、Xaaは、水素原子、フェニルアラニン基(P
he)又はアミノ酸配列;Ala Phe、Val A
la Phe、Gln Val Ala Phe、Al
a Gln Val Ala Phe、Pro Ala
Gln ValAla Phe又はLeu Pro
Ala Gln Val Ala Pheを表す]を有
する蛋白質、及びこの蛋白質の作用を強く低下させるこ
となく、アミノ酸又はペプチドの好適な置換、欠失又は
付加により又はグリコシド基を変化させることにより得
られるムテインにより解決する。
Description
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、新規の蛋白質及び
その製造に関する。
その製造に関する。
【0002】
【従来の技術】TNFα(Tumor-Nekrose-Factor)は、生
物学的活性において広いスペクトルを有する公知の蛋白
質である。これは、種々の悪性及び非悪性の細胞種に影
響を与え、敗血症ショック及び組織損傷並びに腎剥離、
移植、ショック肺及び脳性マラリアでは、重要な役割を
果たす(Lymphokines 1987 Vol.14;Pharmaceuti
cal Res.5,129(1988);Science 234,4
70(1986);Nature 330,662(198
7);J.Exp.Med.166,1132(1987);Sci
ence 237,1210(1987);J.Exp.Med.1
66,1280(1987))。
物学的活性において広いスペクトルを有する公知の蛋白
質である。これは、種々の悪性及び非悪性の細胞種に影
響を与え、敗血症ショック及び組織損傷並びに腎剥離、
移植、ショック肺及び脳性マラリアでは、重要な役割を
果たす(Lymphokines 1987 Vol.14;Pharmaceuti
cal Res.5,129(1988);Science 234,4
70(1986);Nature 330,662(198
7);J.Exp.Med.166,1132(1987);Sci
ence 237,1210(1987);J.Exp.Med.1
66,1280(1987))。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】抗体を用いてTNFα
の作用を中和させることができることは、公知である
(欧州特許第260610号明細書)。しかしながらこ
の抗体は、人特有の物質ではないので、人への使用の際
に免疫反応を引き起こしうる。
の作用を中和させることができることは、公知である
(欧州特許第260610号明細書)。しかしながらこ
の抗体は、人特有の物質ではないので、人への使用の際
に免疫反応を引き起こしうる。
【0004】
【課題を解決するための手段】ところで、人に起因し、
TNFαの作用を中和することのできる蛋白質が発見さ
れた。
TNFαの作用を中和することのできる蛋白質が発見さ
れた。
【0005】本発明の目的は、分子量約42000ダル
トン及びN−末端にアミノ酸配列; Xaa Thr Pro Tyr Ala Pro G
lu Pro GlySer Thr Cys Arg
Leu Arg Glu [式中、Xは、水素原子、フェニルアラニン基(Ph
e)又はアミノ酸配列;Ala Phe、Val Al
a Phe、Gln Val Ala Phe、Ala
Gln Val Ala Phe、Pro Ala
Gln Val Ala Phe又はLeu Pro
Ala Gln Val Ala Pheを表す]を有
する蛋白質及びそのムテイン(Muteine)である。
トン及びN−末端にアミノ酸配列; Xaa Thr Pro Tyr Ala Pro G
lu Pro GlySer Thr Cys Arg
Leu Arg Glu [式中、Xは、水素原子、フェニルアラニン基(Ph
e)又はアミノ酸配列;Ala Phe、Val Al
a Phe、Gln Val Ala Phe、Ala
Gln Val Ala Phe、Pro Ala
Gln Val Ala Phe又はLeu Pro
Ala Gln Val Ala Pheを表す]を有
する蛋白質及びそのムテイン(Muteine)である。
【0006】ムテインとは、プロテイン鎖中のアミノ酸
又はペプチドの好適な交換、欠失又は添加により得ら
れ、これらの処置により新規の蛋白質の作用が著しく弱
められることはない蛋白質である。ムテインは、グリコ
シド基の変形によっても得ることができる。
又はペプチドの好適な交換、欠失又は添加により得ら
れ、これらの処置により新規の蛋白質の作用が著しく弱
められることはない蛋白質である。ムテインは、グリコ
シド基の変形によっても得ることができる。
【0007】ここに記載の新規蛋白質は酸性特性を有
し、その等電点は、pH2〜5である。これは、特異的
にTNFαと結合し、トリプシンによる消化は、困難で
あるか又は不可能である。
し、その等電点は、pH2〜5である。これは、特異的
にTNFαと結合し、トリプシンによる消化は、困難で
あるか又は不可能である。
【0008】新規蛋白質は、例えば熱のある、即ち体温
が約38℃以上の患者の尿から単離することができる。
このために尿を先ず濃縮し、これは、例えば逆浸透又は
限外濾過により行うことができる。このようにして得ら
れた透析残分を、引き続いてイオン交換−及び親和性ク
ロマトグラフィーにより精製する。
が約38℃以上の患者の尿から単離することができる。
このために尿を先ず濃縮し、これは、例えば逆浸透又は
限外濾過により行うことができる。このようにして得ら
れた透析残分を、引き続いてイオン交換−及び親和性ク
ロマトグラフィーにより精製する。
【0009】この蛋白質は、卵巣癌の患者の人間の腹水
液からも得られる。
液からも得られる。
【0010】蛋白質の精製は公知法、例えば親和性−又
はイオン交換クロマトグラフィーにより行うことができ
る。
はイオン交換クロマトグラフィーにより行うことができ
る。
【0011】そうして得られた蛋白質は、アミノ酸配列
中のN−末端で不均一である。アミノ酸は7個まで欠け
ていて良い。そのような不均一性は、身体特有の蛋白質
の場合には異例ではなく、例えばγ−インターフェロン
の場合にも現われる。
中のN−末端で不均一である。アミノ酸は7個まで欠け
ていて良い。そのような不均一性は、身体特有の蛋白質
の場合には異例ではなく、例えばγ−インターフェロン
の場合にも現われる。
【0012】エンドグリコシダーゼを用いての処理によ
り、この蛋白質は、SDS−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動でのその走行特性を変え、このことは、糖基の離
脱に起因する。
り、この蛋白質は、SDS−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動でのその走行特性を変え、このことは、糖基の離
脱に起因する。
【0013】前記蛋白質は、尿及び腹水液中に1〜10
0μg/lの濃度で存在する。この蛋白質を、薬学上の
目的のために大量に提供するために、公知の遺伝子工学
的方法(Maniatis,T.et al:Molecular Cloning:A Labora
tory Manual,Cold Spring Harbor Press,N.Y.,1982参
照)を利用した。この目的のためには、先ず新規蛋白質
に関する遺伝情報を確認し、相応する核酸を単離すべき
である。そのために、純粋蛋白質をジチオトレイトール
で還元し、ついで遊離のSH−基の誘導化のためにヨー
ドアセトアミドを添加し、引き続きそうして処理された
蛋白質をブロムシアン、続いてトリプシンを用いて小さ
いペプチドに開裂させる。ペプチドの分離は、逆相クロ
マトグラフィーにより行う。この精製されたペプチドの
うちの1個のN−末端シークエンシングは、配列:Va
l Phe Cys Thr Lysを示した。更にこ
の蛋白質は、次の3個の他のペプチド配列を有する:G
lyVal Tyr Thr Ser、Ile Cys
Thr Cys ArgPro Gly Tyr及び
Pro Gly Thr Glu Thr Ser A
sp Val Val Cys Lys Pro Cy
s Ala Pro Gly Thr Phe Ser
Xab Thr Thr Ser Ser Asp
Ile Cys Arg Pro(ここでXabは、お
そらくグリコシル化されている、未知のアミノ酸であ
る)。
0μg/lの濃度で存在する。この蛋白質を、薬学上の
目的のために大量に提供するために、公知の遺伝子工学
的方法(Maniatis,T.et al:Molecular Cloning:A Labora
tory Manual,Cold Spring Harbor Press,N.Y.,1982参
照)を利用した。この目的のためには、先ず新規蛋白質
に関する遺伝情報を確認し、相応する核酸を単離すべき
である。そのために、純粋蛋白質をジチオトレイトール
で還元し、ついで遊離のSH−基の誘導化のためにヨー
ドアセトアミドを添加し、引き続きそうして処理された
蛋白質をブロムシアン、続いてトリプシンを用いて小さ
いペプチドに開裂させる。ペプチドの分離は、逆相クロ
マトグラフィーにより行う。この精製されたペプチドの
うちの1個のN−末端シークエンシングは、配列:Va
l Phe Cys Thr Lysを示した。更にこ
の蛋白質は、次の3個の他のペプチド配列を有する:G
lyVal Tyr Thr Ser、Ile Cys
Thr Cys ArgPro Gly Tyr及び
Pro Gly Thr Glu Thr Ser A
sp Val Val Cys Lys Pro Cy
s Ala Pro Gly Thr Phe Ser
Xab Thr Thr Ser Ser Asp
Ile Cys Arg Pro(ここでXabは、お
そらくグリコシル化されている、未知のアミノ酸であ
る)。
【0014】存在するペプチド配列は、相応するオリゴ
ヌクレオチドの合成により、人間のゲノムからの又は相
応するc−DNA−バンク(Bank)からの遺伝子の明白
な同定を、配列特異的なフィルターハイブリッド形成に
より可能とする。
ヌクレオチドの合成により、人間のゲノムからの又は相
応するc−DNA−バンク(Bank)からの遺伝子の明白
な同定を、配列特異的なフィルターハイブリッド形成に
より可能とする。
【0015】次いでそうして得られた蛋白質に関する遺
伝情報は、表現のために、公知法により種々の宿主細
胞、例えば真核細胞、酵母、枯草菌又は大腸菌中にもた
らされ、かつそのようにして蛋白質を得ることができ
る。その際、真核細胞中にグリコシル化された形の蛋白
質が生じる。
伝情報は、表現のために、公知法により種々の宿主細
胞、例えば真核細胞、酵母、枯草菌又は大腸菌中にもた
らされ、かつそのようにして蛋白質を得ることができ
る。その際、真核細胞中にグリコシル化された形の蛋白
質が生じる。
【0016】アミノ酸又はペプチドの交換、欠失又は添
加により新規蛋白質から誘導されるムテインは、有利に
遺伝子工学的方法により製造される。
加により新規蛋白質から誘導されるムテインは、有利に
遺伝子工学的方法により製造される。
【0017】新規蛋白質は、良好なTNFα−抑制作用
を示し、従って体液中のTNFα濃度が高まる疾病、例
えば敗血症ショックの治療のために使用することができ
る。更にこれらは、次の疾病に使用できる:アレルギ
ー、自己免疫病、リュウマチ性疾患、ショック肺、炎症
性の骨疾病、血液凝固障害、火傷並びに移植後の合併
症。
を示し、従って体液中のTNFα濃度が高まる疾病、例
えば敗血症ショックの治療のために使用することができ
る。更にこれらは、次の疾病に使用できる:アレルギ
ー、自己免疫病、リュウマチ性疾患、ショック肺、炎症
性の骨疾病、血液凝固障害、火傷並びに移植後の合併
症。
【0018】
【実施例】例1 TNFα−抑制作用の測定 TNFαの生物学的活性をマウス細胞系L929(J.Bio
l.Chem.260,2345(1985))及び人間細胞
系MCF7の溶解(Lyse)により測定した。TNFα抑制
作用の測定の実験の際に、TNFαの濃度を、細胞の少
なくとも50%が溶解するように選択した。
l.Chem.260,2345(1985))及び人間細胞
系MCF7の溶解(Lyse)により測定した。TNFα抑制
作用の測定の実験の際に、TNFαの濃度を、細胞の少
なくとも50%が溶解するように選択した。
【0019】TNFα結合蛋白質を有する上澄を、1:
2ステップ(Schritt)で、微量滴定プレート中で希釈し
た。この溶液(0.05ml)に人間−もしくはマウス
−TNFα(120pg/ml)各々0.05mlを添
加した。引き続いてアクチノマイシンD 2μg/ml
を含有する媒体0.1ml中のL929−細胞 500
00の添加を行った。ふ化器中で37℃で20〜24時
間のインキュベーションの後に、細胞を固定し、クリス
タルヴァイオレットで着色した。TNFα−結合蛋白質
の不在下で、TNFα及びLT(リンフォトキシン)
は、細胞を溶かした。これらは着色の間にすすぎ落し
た。TNFα−結合蛋白質を有する上澄の保護効果は、
残存する完全な細胞の着色性により示された。
2ステップ(Schritt)で、微量滴定プレート中で希釈し
た。この溶液(0.05ml)に人間−もしくはマウス
−TNFα(120pg/ml)各々0.05mlを添
加した。引き続いてアクチノマイシンD 2μg/ml
を含有する媒体0.1ml中のL929−細胞 500
00の添加を行った。ふ化器中で37℃で20〜24時
間のインキュベーションの後に、細胞を固定し、クリス
タルヴァイオレットで着色した。TNFα−結合蛋白質
の不在下で、TNFα及びLT(リンフォトキシン)
は、細胞を溶かした。これらは着色の間にすすぎ落し
た。TNFα−結合蛋白質を有する上澄の保護効果は、
残存する完全な細胞の着色性により示された。
【0020】細胞毒性作用の抑制は、人間−TNFαに
たいしても、少々弱いが人間−LTにたいしてもみられ
るが、マウス−TNFαではみられなかった。
たいしても、少々弱いが人間−LTにたいしてもみられ
るが、マウス−TNFαではみられなかった。
【0021】例2 尿からの蛋白質単離 熱(≧38℃)のある患者から集めた尿40lを、透析
残分流の容量が2.5lに濃縮されるまで、ヘモフロウ
F60瀘筒(Hemoflow(R) F60 Patrone;Fa.Fresen
ius)を通して濾過させた。
残分流の容量が2.5lに濃縮されるまで、ヘモフロウ
F60瀘筒(Hemoflow(R) F60 Patrone;Fa.Fresen
ius)を通して濾過させた。
【0022】引き続いてこの透析残分に、洗浄のために
20mM燐酸ナトリウム緩衝液(pH4.0)各々2.
5lを4回添加し、かつ濾過を各々出発容量の2.5l
になるまで続けた。
20mM燐酸ナトリウム緩衝液(pH4.0)各々2.
5lを4回添加し、かつ濾過を各々出発容量の2.5l
になるまで続けた。
【0023】そうして得られた一連の蛋白質、茶色に着
色された透析残分を、ファルマツィア社のS−セファロ
ース(S-Sepharose(R);Fa.Pharmacia:カラム:φ=
5cm、l=17cm)を介してクロマトグラフィーに
かけた。カラムは、装入の前に、20mM燐酸ナトリウ
ム緩衝液、pH5.5(=緩衝液I)10カラム容量
(SV)で平衡させ、透析残分を装入した。緩衝液I
3SVで後洗浄し、20mM燐酸ナトリウム緩衝液、p
H6.5(=緩衝液II)3SVで溶出させると、有価生
成物が得られた。
色された透析残分を、ファルマツィア社のS−セファロ
ース(S-Sepharose(R);Fa.Pharmacia:カラム:φ=
5cm、l=17cm)を介してクロマトグラフィーに
かけた。カラムは、装入の前に、20mM燐酸ナトリウ
ム緩衝液、pH5.5(=緩衝液I)10カラム容量
(SV)で平衡させ、透析残分を装入した。緩衝液I
3SVで後洗浄し、20mM燐酸ナトリウム緩衝液、p
H6.5(=緩衝液II)3SVで溶出させると、有価生
成物が得られた。
【0024】更に精製するために、このフラクション
を、緩衝液III(20mM燐酸ナトリウム、140mM
NaCl、pH7.2)10SVで平衡させたTNF−
親和性カラム(例4、φ=1.5cm、l=10cm)
上に注いだ。装入後に緩衝液III 3SVで後洗浄し、
カラムでの溶出によるTNF−結合蛋白質フラクション
を、0.58%酢酸及び140mMNaClからなる緩
衝液IV40mlで洗浄した。
を、緩衝液III(20mM燐酸ナトリウム、140mM
NaCl、pH7.2)10SVで平衡させたTNF−
親和性カラム(例4、φ=1.5cm、l=10cm)
上に注いだ。装入後に緩衝液III 3SVで後洗浄し、
カラムでの溶出によるTNF−結合蛋白質フラクション
を、0.58%酢酸及び140mMNaClからなる緩
衝液IV40mlで洗浄した。
【0025】純粋蛋白質の単離のために、TNF−親和
性カラムの溶出液をモノ Q−カラム HR5/5(MON
O Q-Saeule HR5/5;Fa.Pharmacia)で分離した。そのた
めに先ず溶出液を0.1nNaOHでpH12.0に調
節した。
性カラムの溶出液をモノ Q−カラム HR5/5(MON
O Q-Saeule HR5/5;Fa.Pharmacia)で分離した。そのた
めに先ず溶出液を0.1nNaOHでpH12.0に調
節した。
【0026】カラムを20mM燐酸ナトリウム緩衝液、
pH12.0(緩衝液V)11SVで平衡させた。pH
を調整したTNF−親和性カラム溶出液10mlを装入
し、緩衝液V 4.4SVで洗浄した。引き続き20m
M燐酸ナトリウム、pH7.5で溶出させた。
pH12.0(緩衝液V)11SVで平衡させた。pH
を調整したTNF−親和性カラム溶出液10mlを装入
し、緩衝液V 4.4SVで洗浄した。引き続き20m
M燐酸ナトリウム、pH7.5で溶出させた。
【0027】不純物を更に除去するために、0.1NH
ClでpH2.0に調節された20mM酢酸緩衝液(緩
衝液VI) 7SVでモノ Q−カラムを洗浄した。
ClでpH2.0に調節された20mM酢酸緩衝液(緩
衝液VI) 7SVでモノ Q−カラムを洗浄した。
【0028】その後、カラムを20mM酢酸5〜6S
V、20mMNH4Cl−緩衝液、pH2.0(0.1
nHClで調整、緩衝液VII)で更に溶出させた。1〜
2SVにより不純物を含有する280nmでUV−活性
なバンド(Band)を溶出させ、更に1〜2SVにより新規
蛋白質を溶出させた。純粋蛋白質の更なる量は、100
mMNaClに調整された緩衝液VII1〜2SVの後溶
出により達成されうる。
V、20mMNH4Cl−緩衝液、pH2.0(0.1
nHClで調整、緩衝液VII)で更に溶出させた。1〜
2SVにより不純物を含有する280nmでUV−活性
なバンド(Band)を溶出させ、更に1〜2SVにより新規
蛋白質を溶出させた。純粋蛋白質の更なる量は、100
mMNaClに調整された緩衝液VII1〜2SVの後溶
出により達成されうる。
【0029】蛋白質は、そうしてゲル電気泳動の純度>
90%で得られた。尿1lから蛋白質約1〜10μgを
得ることができる。
90%で得られた。尿1lから蛋白質約1〜10μgを
得ることができる。
【0030】例3 人間の腹水液からの蛋白質単離 卵巣癌の患者の穿刺液として得られる、少し混濁した稀
液性の腹水液2.5lを3000gで30分間遠心分離
機にかけた。上澄を10%燐酸でpH7.2に調整し、
グルタルジアルデヒドで架橋されたTNF−セファロー
ス(Sepharose( R))−カラム(φ=1.5cm、l=
3cm;例4参照)上に添加した。このカラムを緩衝液
III50mlで平衡させ、かつ装入後、緩衝液III150
mlで後洗浄した。TNF−結合蛋白質を緩衝液IV30
mlで溶出させた。
液性の腹水液2.5lを3000gで30分間遠心分離
機にかけた。上澄を10%燐酸でpH7.2に調整し、
グルタルジアルデヒドで架橋されたTNF−セファロー
ス(Sepharose( R))−カラム(φ=1.5cm、l=
3cm;例4参照)上に添加した。このカラムを緩衝液
III50mlで平衡させ、かつ装入後、緩衝液III150
mlで後洗浄した。TNF−結合蛋白質を緩衝液IV30
mlで溶出させた。
【0031】更に精製するために、溶出液を10%HC
lでpH3.0に調整し、20mM酢酸(pH3.0)
で平衡させたクロマトグラフィーカラム(Mono S HR 5/
5,Fa.Pharmacia)上に注いだ。装入後、20mM酢酸
(pH3.0)10mlで後洗浄し、引き続いてTNF
−結合蛋白質を20mM酢酸(pH3.0)6部及び5
0mM燐酸ナトリウム緩衝液(pH9.0)4部からな
る緩衝液混合物4mlを用いる溶出により溶出させた。
溶出液のpH値を制御し、場合によってはpH6.5に
後調整した。
lでpH3.0に調整し、20mM酢酸(pH3.0)
で平衡させたクロマトグラフィーカラム(Mono S HR 5/
5,Fa.Pharmacia)上に注いだ。装入後、20mM酢酸
(pH3.0)10mlで後洗浄し、引き続いてTNF
−結合蛋白質を20mM酢酸(pH3.0)6部及び5
0mM燐酸ナトリウム緩衝液(pH9.0)4部からな
る緩衝液混合物4mlを用いる溶出により溶出させた。
溶出液のpH値を制御し、場合によってはpH6.5に
後調整した。
【0032】この溶出液を燐酸ナトリウム緩衝液pH
6.0(緩衝液VIII)で平衡させたクロマトグラフィー
カラムモノ Q HR 5/5上に注いだ。各々緩衝液
VIII6ml及び20mM酢酸、5mMNaCl、pH
2.2 6mlで洗浄後に、20mM酢酸、150mM
NaCl、pH2.0(緩衝液IX)6mlを用いて蛋
白質をカラムから溶出させた。
6.0(緩衝液VIII)で平衡させたクロマトグラフィー
カラムモノ Q HR 5/5上に注いだ。各々緩衝液
VIII6ml及び20mM酢酸、5mMNaCl、pH
2.2 6mlで洗浄後に、20mM酢酸、150mM
NaCl、pH2.0(緩衝液IX)6mlを用いて蛋
白質をカラムから溶出させた。
【0033】この溶出液の同定により、これが、(N−
末端配列の不均一を除き)例2により得られた蛋白質と
同じものであることが判明した。
末端配列の不均一を除き)例2により得られた蛋白質と
同じものであることが判明した。
【0034】例4 TNF−親和性カラムの製造 a)BrCN−セファロースでのTNFのカップリング BrCN−セファロース(BrCN-Sepharose(R);Fa.P
harmacia)7.5gを水30ml中に懸濁させた。膨潤
時間30分後にBrCN−セファロース(BrCN-Sepharo
se(R))−ゲル懸濁液を先ず1mMHCl−溶液50
0mlで、次いで0.1MNaHCO3、0.5MNa
Cl、pH8.3で洗浄した。
harmacia)7.5gを水30ml中に懸濁させた。膨潤
時間30分後にBrCN−セファロース(BrCN-Sepharo
se(R))−ゲル懸濁液を先ず1mMHCl−溶液50
0mlで、次いで0.1MNaHCO3、0.5MNa
Cl、pH8.3で洗浄した。
【0035】緩衝液(0.1MNaHCO3、0.5M
NaCl、pH8.3)41ml中に溶かされたTNF
136mgを、このゲル懸濁液に添加した。反応バッチ
を室温で2時間振り混ぜ、かつTNF−セファロース
(TNF-Sepharose(R))を3000U/分で遠心分離し
た。ゲル物質を緩衝液40mlで洗浄した。
NaCl、pH8.3)41ml中に溶かされたTNF
136mgを、このゲル懸濁液に添加した。反応バッチ
を室温で2時間振り混ぜ、かつTNF−セファロース
(TNF-Sepharose(R))を3000U/分で遠心分離し
た。ゲル物質を緩衝液40mlで洗浄した。
【0036】上澄の蛋白質測定からカップリング収率>
90%が得られた。
90%が得られた。
【0037】BrCN−セファロース(BrCN-Sepharose
(R))の過剰の活性基のブロッキングのために、ゲル
懸濁液に緩衝液(0.1MNaHCO3、0.5MNa
Cl、1Mエタノールアミン、pH8.3)40mlを
添加し、引き続いて室温で1時間振り混ぜ、次いでエタ
ノールアミンを緩衝液(0.1MNaHCO3、0.5
MNaCl、pH8.3)3×40mlを用いて洗い流
した。
(R))の過剰の活性基のブロッキングのために、ゲル
懸濁液に緩衝液(0.1MNaHCO3、0.5MNa
Cl、1Mエタノールアミン、pH8.3)40mlを
添加し、引き続いて室温で1時間振り混ぜ、次いでエタ
ノールアミンを緩衝液(0.1MNaHCO3、0.5
MNaCl、pH8.3)3×40mlを用いて洗い流
した。
【0038】b)グルタルジアルデヒドを用いるTNF
−セファロース(TNF-Sepharose( R))の架橋 a)により製造されたTNF−セファロース(TNF-Seph
arose(R))ゲル懸濁液20mlを緩衝液(20mM燐
酸ナトリウム、140mMNaCl、pH8.0)25
mlで2度洗浄した。この懸濁液を同じ緩衝液40ml
中に入れ、25%グルタルジアルデヒド溶液1.6ml
を添加した。室温で1時間振り混ぜた後に、懸濁液を遠
心分離させ、緩衝液(20mM燐酸ナトリウム、140
mMNaCl、1Mエタノールアミン、pH8.0)2
5mlを添加した。再び1時間振り混ぜ、引き続いてT
NF−セファロース(TNF-Sepharose(R))懸濁液をク
ロマトグラフィーカラム(φ=1.5cm、l=10c
m)中に充填した。
−セファロース(TNF-Sepharose( R))の架橋 a)により製造されたTNF−セファロース(TNF-Seph
arose(R))ゲル懸濁液20mlを緩衝液(20mM燐
酸ナトリウム、140mMNaCl、pH8.0)25
mlで2度洗浄した。この懸濁液を同じ緩衝液40ml
中に入れ、25%グルタルジアルデヒド溶液1.6ml
を添加した。室温で1時間振り混ぜた後に、懸濁液を遠
心分離させ、緩衝液(20mM燐酸ナトリウム、140
mMNaCl、1Mエタノールアミン、pH8.0)2
5mlを添加した。再び1時間振り混ぜ、引き続いてT
NF−セファロース(TNF-Sepharose(R))懸濁液をク
ロマトグラフィーカラム(φ=1.5cm、l=10c
m)中に充填した。
【0039】このカラムは、緩衝液(20mM燐酸ナト
リウム、140mMNaCl、pH7.2)100ml
及び0.58%酢酸+140mMNaCl 50mlで
洗浄後に親和性クロマトグラフィーのために使用可能で
あった。
リウム、140mMNaCl、pH7.2)100ml
及び0.58%酢酸+140mMNaCl 50mlで
洗浄後に親和性クロマトグラフィーのために使用可能で
あった。
【0040】例5 蛋白質の同定 a)分子量及び純度 分子量及び純度の測定のために、例2もしくは3により
得られた蛋白質2μgに、還元性及び非還元性条件下
で、15%SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を
施した(Nature 227,680(1970))。公知の一連の標準蛋白
質との比較により、両方の方法による新規蛋白質が、ク
マシーブルーでの着色後に、分子量約42000ダルト
ンの均一なバンドであることが判明した。
得られた蛋白質2μgに、還元性及び非還元性条件下
で、15%SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を
施した(Nature 227,680(1970))。公知の一連の標準蛋白
質との比較により、両方の方法による新規蛋白質が、ク
マシーブルーでの着色後に、分子量約42000ダルト
ンの均一なバンドであることが判明した。
【0041】他のバンドを認識することはできなかっ
た。従ってこの蛋白質の純度は、≧90%でありうる。
た。従ってこの蛋白質の純度は、≧90%でありうる。
【0042】この蛋白質は、明白な青−紫に着色された
バンドとして確認される。
バンドとして確認される。
【0043】b)N−末端シークエンシング 例2により得られた蛋白質10μg(≒250pMo
l)を気相シーケンサーを用いてN−末端で数回シーク
エンシングした。
l)を気相シーケンサーを用いてN−末端で数回シーク
エンシングした。
【0044】N−末端配列分析は、同類の副配列の出現
に基づき、N−末端アミノ酸配列の不均一性を示唆し
た。次の主配列を確認した: 配列1a Phe Thr Pro Tyr Ala Pro G
lu Pro GlySer Thr Cys Arg
Leu Arg Glu。
に基づき、N−末端アミノ酸配列の不均一性を示唆し
た。次の主配列を確認した: 配列1a Phe Thr Pro Tyr Ala Pro G
lu Pro GlySer Thr Cys Arg
Leu Arg Glu。
【0045】その他に、気相シークエンシングではN−
末端でアミノ酸6個が延長された 配列2a Leu Pro Ala Gln Val Ala P
he Thr ProTyr Ala Pro Glu
Pro Gly Ser Thr CysArg L
eu Arg Glu及びN−末端でアミノ酸1個が減
少された 配列3a Thr Pro Tyr Ala Pro Glu P
ro Gly SerThr Cys Arg Leu
Arg Gluが確認された。
末端でアミノ酸6個が延長された 配列2a Leu Pro Ala Gln Val Ala P
he Thr ProTyr Ala Pro Glu
Pro Gly Ser Thr CysArg L
eu Arg Glu及びN−末端でアミノ酸1個が減
少された 配列3a Thr Pro Tyr Ala Pro Glu P
ro Gly SerThr Cys Arg Leu
Arg Gluが確認された。
【0046】同様に例3の蛋白質中では次の主配列が確
認された: 配列1b Leu Pro Ala Gln Val Ala P
he Thr ProTyr Ala Pro Glu
Pro Gly Ser Thr CysArg L
eu Arg Glu(約10%) 配列2b Pro Ala Gln Val Ala Phe T
hr Pro TyrAla Pro Glu Pro
Gly Ser Thr Cys ArgLeu A
rg Glu(約45%) 配列3b Ala Gln Val Ala Phe Thr P
ro Tyr AlaPro Glu Pro Gly
Ser Thr Cys Arg LeuArg G
lu(約45%)。
認された: 配列1b Leu Pro Ala Gln Val Ala P
he Thr ProTyr Ala Pro Glu
Pro Gly Ser Thr CysArg L
eu Arg Glu(約10%) 配列2b Pro Ala Gln Val Ala Phe T
hr Pro TyrAla Pro Glu Pro
Gly Ser Thr Cys ArgLeu A
rg Glu(約45%) 配列3b Ala Gln Val Ala Phe Thr P
ro Tyr AlaPro Glu Pro Gly
Ser Thr Cys Arg LeuArg G
lu(約45%)。
【0047】d)トリプシンでの処理 新規蛋白質20μgをpH8.5で次のように処理し
た:1.0.1MNaHCO3−緩衝液pH8.5中に
溶かしたトリプシン0.5μgの添加;37℃で16時
間のインキュベーション2.0.1%SDS−0.1M
NaHCO3−緩衝液pH8.5中に溶かしたトリプシ
ン0.5μgの添加;SDS−含有率0.1%まで溶液
を調整;37℃で16時間のインキュベーション。
た:1.0.1MNaHCO3−緩衝液pH8.5中に
溶かしたトリプシン0.5μgの添加;37℃で16時
間のインキュベーション2.0.1%SDS−0.1M
NaHCO3−緩衝液pH8.5中に溶かしたトリプシ
ン0.5μgの添加;SDS−含有率0.1%まで溶液
を調整;37℃で16時間のインキュベーション。
【0048】このように処理された蛋白質を、15%S
DS−ポリアクリルアミド電気泳動で、出発蛋白質と比
較して分析した。蛋白質の減成は、確認できなかった。
DS−ポリアクリルアミド電気泳動で、出発蛋白質と比
較して分析した。蛋白質の減成は、確認できなかった。
【0049】例6 脱グリコシル化 例2により得られたモノQ−溶出液(≒0.1mg/蛋
白質ml)0.1mlを1MNaOHでpH7.2に調
整した。引き続いてグリコペプチダーゼ F(Fa.Boehri
nger Mannheim)10単位を添加した。37℃で6時間の
インキュベーション後に、更に酵素10単位を添加し
た。更に反応時間16時間後にバッチ50μlを凍結乾
燥させ、15%SDS−ゲル中で未処理の蛋白質と比較
して分析した。酵素で処理された蛋白質は、未処理の試
料と比較すると、約3kD小さい分子量を示した。更に
バッチ25μlを、例1に記載のように、TNFα抑制
作用に関して検査した。TNFα抑制作用は、糖分の脱
離後にも完全に保持されていた。
白質ml)0.1mlを1MNaOHでpH7.2に調
整した。引き続いてグリコペプチダーゼ F(Fa.Boehri
nger Mannheim)10単位を添加した。37℃で6時間の
インキュベーション後に、更に酵素10単位を添加し
た。更に反応時間16時間後にバッチ50μlを凍結乾
燥させ、15%SDS−ゲル中で未処理の蛋白質と比較
して分析した。酵素で処理された蛋白質は、未処理の試
料と比較すると、約3kD小さい分子量を示した。更に
バッチ25μlを、例1に記載のように、TNFα抑制
作用に関して検査した。TNFα抑制作用は、糖分の脱
離後にも完全に保持されていた。
【0050】例7 抗体製造 例2及び3で単離された蛋白質を、ポリクロナール抗体
の製造のためにイエウサギに注射した。抗体の反応性及
び特異性をELISAを用いて検査した。そのためにE
LISA−プレート(ELISA-Platte;Fa.Costar)を、抑
制剤−もしくは対照蛋白質1μg/0.05M炭酸ナト
リウム緩衝液(pH9.6) mlの溶液で被覆し、非
特異性結合を1%BSA/PBSで飽和させ、かつ種々
の希釈血清と共にインキュベートした。結合された抗体
の検査をビオチニル化された抗−ウサギ−IgG及びス
トレプトアビジン−ペルオキシダーゼ並びにTMB−基
質を用いて行った。個々のインキュベーションの間に各
々0.05%トゥイーン( (R)Tween)−20/PBS
で3回洗浄した。2MH2SO4を用いる停止の後に、
450nmにおける光学密度を測定した。
の製造のためにイエウサギに注射した。抗体の反応性及
び特異性をELISAを用いて検査した。そのためにE
LISA−プレート(ELISA-Platte;Fa.Costar)を、抑
制剤−もしくは対照蛋白質1μg/0.05M炭酸ナト
リウム緩衝液(pH9.6) mlの溶液で被覆し、非
特異性結合を1%BSA/PBSで飽和させ、かつ種々
の希釈血清と共にインキュベートした。結合された抗体
の検査をビオチニル化された抗−ウサギ−IgG及びス
トレプトアビジン−ペルオキシダーゼ並びにTMB−基
質を用いて行った。個々のインキュベーションの間に各
々0.05%トゥイーン( (R)Tween)−20/PBS
で3回洗浄した。2MH2SO4を用いる停止の後に、
450nmにおける光学密度を測定した。
【0051】例8 体液中の蛋白質検出 種々の体液中のTNFα結合蛋白質の検出のために、サ
ンドイッチ−ELISA(sandwich-ELISA)を使用した。
そのためにELISA−プレート(ELISA-Platte;Fa.Co
star)をTNF(5μg/0.05M炭酸ナトリウム緩
衝液 pH9.6 ml)で被覆した。1%BSA/P
BSで飽和させた後、検査すべき試料、例えばリウマチ
患者の髄液と共にインキュベートした。検出を、例7に
記載の抗−抑制剤−抗体及びビオチニル化された抗−ウ
サギ−IgG/ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ
/TMB−基質を用いて行った。個々のインキュベーシ
ョンの間に各々0.05%トゥイーン((R)Tween)−
20/PBSで3回洗浄した。2MH2SO4の添加後
に、450nmにおける吸光を測定した。
ンドイッチ−ELISA(sandwich-ELISA)を使用した。
そのためにELISA−プレート(ELISA-Platte;Fa.Co
star)をTNF(5μg/0.05M炭酸ナトリウム緩
衝液 pH9.6 ml)で被覆した。1%BSA/P
BSで飽和させた後、検査すべき試料、例えばリウマチ
患者の髄液と共にインキュベートした。検出を、例7に
記載の抗−抑制剤−抗体及びビオチニル化された抗−ウ
サギ−IgG/ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ
/TMB−基質を用いて行った。個々のインキュベーシ
ョンの間に各々0.05%トゥイーン((R)Tween)−
20/PBSで3回洗浄した。2MH2SO4の添加後
に、450nmにおける吸光を測定した。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成14年2月21日(2002.2.2
1)
1)
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) A61P 29/00 101 A61P 31/04 31/04 37/02 37/02 37/08 37/08 43/00 111 43/00 111 A61K 37/02 (72)発明者 ハインツ ヒレン ドイツ連邦共和国 デー−6733 ハスロッ ホ マックス−プランク−シュトラーセ 17 (72)発明者 アッヒム メラー アメリカ合衆国 マサチューセッツ 01890 ウィンチェスター キャリッジ レイン 3 (72)発明者 ロタール ダウム ドイツ連邦共和国 デー−6701 オッター シュタット ライアーシュトラーセ 25 (72)発明者 トーマス デルパー ドイツ連邦共和国 デー−6719 ビッサー スハイム ルイトポルトシュトラーセ 3 (72)発明者 トーマス ズプコフスキ ドイツ連邦共和国 デー−6704 ムッター シュタット ルッフハイマー シュトラー セ 1 Fターム(参考) 4C084 AA02 AA07 AA17 BA44 CA18 CA53 NA14 ZA532 ZA592 ZA962 ZB112 ZB132 ZB152 ZB352 ZC412 4H045 AA10 AA30 BA10 CA40 EA20 EA22 EA24 FA16 FA71 GA10 GA22 GA26 HA05
Claims (5)
- 【請求項1】 最初のグリコシル化された形で分子量約
42000ダルトンを有し、N−末端にアミノ酸配列; Xaa Thr Pro Tyr Ala Pro G
lu Pro GlySer Thr Cys Arg
Leu Arg Glu [式中、Xaaは、水素原子、フェニルアラニン基(P
he)又はアミノ酸配列;Ala Phe、Val A
la Phe、Gln Val Ala Phe、Al
a Gln Val Ala Phe、Pro Ala
Gln ValAla Phe又はLeu Pro
Ala Gln Val Ala Pheを表す]を有
する蛋白質、及びこの蛋白質の作用を強く低下させるこ
となく、アミノ酸又はペプチドの好適な置換、欠失又は
付加により又はグリコシド基を変化させることにより得
られるムテイン。 - 【請求項2】 脱グリコシル化された形の請求項1記載
の蛋白質。 - 【請求項3】 TNFα−抑制作用を有する請求項1又
は2記載の蛋白質。 - 【請求項4】 請求項1から3までのいずれか1項記載
の蛋白質を使用することを特徴とする、体液中のTNF
α−の濃度が上昇している疾患を治療するための薬剤の
製法。 - 【請求項5】 疾患がアレルギー、自己免疫病、リュウ
マチ性疾患、ショック肺、炎症性の骨疾病、血液凝固障
害、又は移植後の合併症である請求項4記載の製法。
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DE3915072 | 1989-05-09 | ||
DE3922089A DE3922089A1 (de) | 1989-05-09 | 1989-07-05 | Neue proteine und ihre herstellung |
DE3922089.3 | 1989-07-05 | ||
DE3915072.0 | 1989-07-05 |
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---|---|
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