JP2002302500A - 新規蛋白質及びこれを使用した薬剤の製法 - Google Patents

新規蛋白質及びこれを使用した薬剤の製法

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JP2002302500A JP2002013319A JP2002013319A JP2002302500A JP 2002302500 A JP2002302500 A JP 2002302500A JP 2002013319 A JP2002013319 A JP 2002013319A JP 2002013319 A JP2002013319 A JP 2002013319A JP 2002302500 A JP2002302500 A JP 2002302500A
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Thomas Subkowski
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 ＴＮＦαの作用を中和することのできる蛋白
質の提供 【解決手段】 最初のグリコシル化された形で分子量約
４２０００ダルトンを有し、Ｎ−末端にアミノ酸配列； Ｘａａ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇ
ｌｕ Ｐｒｏ ＧｌｙＳｅｒ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ａｒｇ
Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｇｌｕ ［式中、Ｘａａは、水素原子、フェニルアラニン基（Ｐ
ｈｅ）又はアミノ酸配列；Ａｌａ Ｐｈｅ、Ｖａｌ Ａ
ｌａ Ｐｈｅ、Ｇｌｎ Ｖａｌ Ａｌａ Ｐｈｅ、Ａｌ
ａ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ａｌａ Ｐｈｅ、Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｇｌｎ ＶａｌＡｌａ Ｐｈｅ又はＬｅｕ Ｐｒｏ
Ａｌａ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ａｌａ Ｐｈｅを表す］を有
する蛋白質、及びこの蛋白質の作用を強く低下させるこ
となく、アミノ酸又はペプチドの好適な置換、欠失又は
付加により又はグリコシド基を変化させることにより得
られるムテインにより解決する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、新規の蛋白質及び
その製造に関する。
【０００２】
【従来の技術】ＴＮＦα(Tumor-Nekrose-Factor)は、生
物学的活性において広いスペクトルを有する公知の蛋白
質である。これは、種々の悪性及び非悪性の細胞種に影
響を与え、敗血症ショック及び組織損傷並びに腎剥離、
移植、ショック肺及び脳性マラリアでは、重要な役割を
果たす（Lymphokines １９８７ Vol.１４；Pharmaceuti
cal Res.５，１２９（１９８８）；Science ２３４，４
７０（１９８６）；Nature ３３０，６６２（１９８
７）；J．Exp.Med．1６６，１１３２（１９８７）；Sci
ence ２３７，１２１０（１９８７）；J.Exp．Med．１
６６，１２８０（１９８７））。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】抗体を用いてＴＮＦα
の作用を中和させることができることは、公知である
（欧州特許第２６０６１０号明細書）。しかしながらこ
の抗体は、人特有の物質ではないので、人への使用の際
に免疫反応を引き起こしうる。
【０００４】
【課題を解決するための手段】ところで、人に起因し、
ＴＮＦαの作用を中和することのできる蛋白質が発見さ
れた。
【０００５】本発明の目的は、分子量約４２０００ダル
トン及びＮ−末端にアミノ酸配列； Ｘａａ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇ
ｌｕ Ｐｒｏ ＧｌｙＳｅｒ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ａｒｇ
Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｇｌｕ ［式中、Ｘは、水素原子、フェニルアラニン基（Ｐｈ
ｅ）又はアミノ酸配列；Ａｌａ Ｐｈｅ、Ｖａｌ Ａｌ
ａ Ｐｈｅ、Ｇｌｎ Ｖａｌ Ａｌａ Ｐｈｅ、Ａｌａ
Ｇｌｎ Ｖａｌ Ａｌａ Ｐｈｅ、Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｇｌｎ Ｖａｌ Ａｌａ Ｐｈｅ又はＬｅｕ Ｐｒｏ
Ａｌａ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ａｌａ Ｐｈｅを表す］を有
する蛋白質及びそのムテイン(Muteine)である。
【０００６】ムテインとは、プロテイン鎖中のアミノ酸
又はペプチドの好適な交換、欠失又は添加により得ら
れ、これらの処置により新規の蛋白質の作用が著しく弱
められることはない蛋白質である。ムテインは、グリコ
シド基の変形によっても得ることができる。
【０００７】ここに記載の新規蛋白質は酸性特性を有
し、その等電点は、ｐＨ２〜５である。これは、特異的
にＴＮＦαと結合し、トリプシンによる消化は、困難で
あるか又は不可能である。
【０００８】新規蛋白質は、例えば熱のある、即ち体温
が約３８℃以上の患者の尿から単離することができる。
このために尿を先ず濃縮し、これは、例えば逆浸透又は
限外濾過により行うことができる。このようにして得ら
れた透析残分を、引き続いてイオン交換−及び親和性ク
ロマトグラフィーにより精製する。
【０００９】この蛋白質は、卵巣癌の患者の人間の腹水
液からも得られる。
【００１０】蛋白質の精製は公知法、例えば親和性−又
はイオン交換クロマトグラフィーにより行うことができ
る。
【００１１】そうして得られた蛋白質は、アミノ酸配列
中のＮ−末端で不均一である。アミノ酸は７個まで欠け
ていて良い。そのような不均一性は、身体特有の蛋白質
の場合には異例ではなく、例えばγ−インターフェロン
の場合にも現われる。
【００１２】エンドグリコシダーゼを用いての処理によ
り、この蛋白質は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動でのその走行特性を変え、このことは、糖基の離
脱に起因する。
【００１３】前記蛋白質は、尿及び腹水液中に１〜１０
０μｇ／ｌの濃度で存在する。この蛋白質を、薬学上の
目的のために大量に提供するために、公知の遺伝子工学
的方法(Maniatis,T.et al:Molecular Cloning:A Labora
tory Manual,Cold Spring Harbor Press,N.Y.,1982参
照)を利用した。この目的のためには、先ず新規蛋白質
に関する遺伝情報を確認し、相応する核酸を単離すべき
である。そのために、純粋蛋白質をジチオトレイトール
で還元し、ついで遊離のＳＨ−基の誘導化のためにヨー
ドアセトアミドを添加し、引き続きそうして処理された
蛋白質をブロムシアン、続いてトリプシンを用いて小さ
いペプチドに開裂させる。ペプチドの分離は、逆相クロ
マトグラフィーにより行う。この精製されたペプチドの
うちの１個のＮ−末端シークエンシングは、配列：Ｖａ
ｌ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ｌｙｓを示した。更にこ
の蛋白質は、次の３個の他のペプチド配列を有する：Ｇ
ｌｙＶａｌ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｓｅｒ、Ｉｌｅ Ｃｙｓ
Ｔｈｒ Ｃｙｓ ＡｒｇＰｒｏ Ｇｌｙ Ｔｙｒ及び
Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａ
ｓｐ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｃｙ
ｓ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｓｅｒ
Ｘａｂ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｓｐ
Ｉｌｅ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ｐｒｏ（ここでＸａｂは、お
そらくグリコシル化されている、未知のアミノ酸であ
る）。
【００１４】存在するペプチド配列は、相応するオリゴ
ヌクレオチドの合成により、人間のゲノムからの又は相
応するｃ−ＤＮＡ−バンク（Bank）からの遺伝子の明白
な同定を、配列特異的なフィルターハイブリッド形成に
より可能とする。
【００１５】次いでそうして得られた蛋白質に関する遺
伝情報は、表現のために、公知法により種々の宿主細
胞、例えば真核細胞、酵母、枯草菌又は大腸菌中にもた
らされ、かつそのようにして蛋白質を得ることができ
る。その際、真核細胞中にグリコシル化された形の蛋白
質が生じる。
【００１６】アミノ酸又はペプチドの交換、欠失又は添
加により新規蛋白質から誘導されるムテインは、有利に
遺伝子工学的方法により製造される。
【００１７】新規蛋白質は、良好なＴＮＦα−抑制作用
を示し、従って体液中のＴＮＦα濃度が高まる疾病、例
えば敗血症ショックの治療のために使用することができ
る。更にこれらは、次の疾病に使用できる：アレルギ
ー、自己免疫病、リュウマチ性疾患、ショック肺、炎症
性の骨疾病、血液凝固障害、火傷並びに移植後の合併
症。
【００１８】
【実施例】例１ ＴＮＦα−抑制作用の測定 ＴＮＦαの生物学的活性をマウス細胞系Ｌ９２９(J.Bio
l.Chem.２６０，２３４５（１９８５））及び人間細胞
系ＭＣＦ７の溶解(Lyse)により測定した。ＴＮＦα抑制
作用の測定の実験の際に、ＴＮＦαの濃度を、細胞の少
なくとも５０％が溶解するように選択した。
【００１９】ＴＮＦα結合蛋白質を有する上澄を、１：
２ステップ(Schritt)で、微量滴定プレート中で希釈し
た。この溶液（０．０５ｍｌ）に人間−もしくはマウス
−ＴＮＦα（１２０ｐｇ／ｍｌ）各々０．０５ｍｌを添
加した。引き続いてアクチノマイシンＤ ２μｇ／ｍｌ
を含有する媒体０．１ｍｌ中のＬ９２９−細胞 ５００
００の添加を行った。ふ化器中で３７℃で２０〜２４時
間のインキュベーションの後に、細胞を固定し、クリス
タルヴァイオレットで着色した。ＴＮＦα−結合蛋白質
の不在下で、ＴＮＦα及びＬＴ（リンフォトキシン）
は、細胞を溶かした。これらは着色の間にすすぎ落し
た。ＴＮＦα−結合蛋白質を有する上澄の保護効果は、
残存する完全な細胞の着色性により示された。
【００２０】細胞毒性作用の抑制は、人間−ＴＮＦαに
たいしても、少々弱いが人間−ＬＴにたいしてもみられ
るが、マウス−ＴＮＦαではみられなかった。
【００２１】例２ 尿からの蛋白質単離 熱（≧３８℃）のある患者から集めた尿４０ｌを、透析
残分流の容量が２．５ｌに濃縮されるまで、ヘモフロウ
Ｆ６０瀘筒(Hemoflow（Ｒ） F60 Patrone；Fa.Fresen
ius)を通して濾過させた。
【００２２】引き続いてこの透析残分に、洗浄のために
２０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）各々２．
５ｌを４回添加し、かつ濾過を各々出発容量の２．５ｌ
になるまで続けた。
【００２３】そうして得られた一連の蛋白質、茶色に着
色された透析残分を、ファルマツィア社のＳ−セファロ
ース(S-Sepharose（Ｒ）；Fa.Pharmacia:カラム：φ＝
５ｃｍ、ｌ＝１７ｃｍ)を介してクロマトグラフィーに
かけた。カラムは、装入の前に、２０ｍＭ燐酸ナトリウ
ム緩衝液、ｐＨ５．５（＝緩衝液Ｉ）１０カラム容量
（ＳＶ）で平衡させ、透析残分を装入した。緩衝液Ｉ
３ＳＶで後洗浄し、２０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液、ｐ
Ｈ６．５（＝緩衝液II）３ＳＶで溶出させると、有価生
成物が得られた。
【００２４】更に精製するために、このフラクション
を、緩衝液III（２０ｍＭ燐酸ナトリウム、１４０ｍＭ
ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）１０ＳＶで平衡させたＴＮＦ−
親和性カラム（例４、φ＝１．５ｃｍ、ｌ＝１０ｃｍ）
上に注いだ。装入後に緩衝液III ３ＳＶで後洗浄し、
カラムでの溶出によるＴＮＦ−結合蛋白質フラクション
を、０．５８％酢酸及び１４０ｍＭＮａＣｌからなる緩
衝液IV４０ｍｌで洗浄した。
【００２５】純粋蛋白質の単離のために、ＴＮＦ−親和
性カラムの溶出液をモノ Ｑ−カラム ＨＲ５／５(MON
O Q-Saeule HR5/5；Fa.Pharmacia)で分離した。そのた
めに先ず溶出液を０．１ｎＮａＯＨでｐＨ１２．０に調
節した。
【００２６】カラムを２０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液、
ｐＨ１２．０（緩衝液Ｖ）１１ＳＶで平衡させた。ｐＨ
を調整したＴＮＦ−親和性カラム溶出液１０ｍｌを装入
し、緩衝液Ｖ ４．４ＳＶで洗浄した。引き続き２０ｍ
Ｍ燐酸ナトリウム、ｐＨ７．５で溶出させた。
【００２７】不純物を更に除去するために、０．１ＮＨ
ＣｌでｐＨ２．０に調節された２０ｍＭ酢酸緩衝液（緩
衝液VI） ７ＳＶでモノ Ｑ−カラムを洗浄した。
【００２８】その後、カラムを２０ｍＭ酢酸５〜６Ｓ
Ｖ、２０ｍＭＮＨ４Ｃｌ−緩衝液、ｐＨ２．０（０．１
ｎＨＣｌで調整、緩衝液VII）で更に溶出させた。１〜
２ＳＶにより不純物を含有する２８０ｎｍでＵＶ−活性
なバンド(Band)を溶出させ、更に１〜２ＳＶにより新規
蛋白質を溶出させた。純粋蛋白質の更なる量は、１００
ｍＭＮａＣｌに調整された緩衝液VII１〜２ＳＶの後溶
出により達成されうる。
【００２９】蛋白質は、そうしてゲル電気泳動の純度＞
９０％で得られた。尿１ｌから蛋白質約１〜１０μｇを
得ることができる。
【００３０】例３ 人間の腹水液からの蛋白質単離 卵巣癌の患者の穿刺液として得られる、少し混濁した稀
液性の腹水液２．５ｌを３０００ｇで３０分間遠心分離
機にかけた。上澄を１０％燐酸でｐＨ７．２に調整し、
グルタルジアルデヒドで架橋されたＴＮＦ−セファロー
ス(Sepharose（ Ｒ）)−カラム（φ＝１．５ｃｍ、ｌ＝
３ｃｍ；例４参照）上に添加した。このカラムを緩衝液
III５０ｍｌで平衡させ、かつ装入後、緩衝液III１５０
ｍｌで後洗浄した。ＴＮＦ−結合蛋白質を緩衝液IV３０
ｍｌで溶出させた。
【００３１】更に精製するために、溶出液を１０％ＨＣ
ｌでｐＨ３．０に調整し、２０ｍＭ酢酸（ｐＨ３．０）
で平衡させたクロマトグラフィーカラム(Mono S HR 5/
5,Fa.Pharmacia)上に注いだ。装入後、２０ｍＭ酢酸
（ｐＨ３．０）１０ｍｌで後洗浄し、引き続いてＴＮＦ
−結合蛋白質を２０ｍＭ酢酸（ｐＨ３．０）６部及び５
０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）４部からな
る緩衝液混合物４ｍｌを用いる溶出により溶出させた。
溶出液のｐＨ値を制御し、場合によってはｐＨ６．５に
後調整した。
【００３２】この溶出液を燐酸ナトリウム緩衝液ｐＨ
６．０（緩衝液VIII）で平衡させたクロマトグラフィー
カラムモノ Ｑ ＨＲ ５／５上に注いだ。各々緩衝液
VIII６ｍｌ及び２０ｍＭ酢酸、５ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ
２．２ ６ｍｌで洗浄後に、２０ｍＭ酢酸、１５０ｍＭ
ＮａＣｌ、ｐＨ２．０（緩衝液IX）６ｍｌを用いて蛋
白質をカラムから溶出させた。
【００３３】この溶出液の同定により、これが、（Ｎ−
末端配列の不均一を除き）例２により得られた蛋白質と
同じものであることが判明した。
【００３４】例４ ＴＮＦ−親和性カラムの製造 ａ）ＢｒＣＮ−セファロースでのＴＮＦのカップリング ＢｒＣＮ−セファロース（BrCN-Sepharose（Ｒ）；Fa.P
harmacia)７．５ｇを水３０ｍｌ中に懸濁させた。膨潤
時間３０分後にＢｒＣＮ−セファロース（BrCN-Sepharo
se（Ｒ）)−ゲル懸濁液を先ず１ｍＭＨＣｌ−溶液５０
０ｍｌで、次いで０．１ＭＮａＨＣＯ３、０．５ＭＮａ
Ｃｌ、ｐＨ８．３で洗浄した。
【００３５】緩衝液（０．１ＭＮａＨＣＯ３、０．５Ｍ
ＮａＣｌ、ｐＨ８．３）４１ｍｌ中に溶かされたＴＮＦ
１３６ｍｇを、このゲル懸濁液に添加した。反応バッチ
を室温で２時間振り混ぜ、かつＴＮＦ−セファロース
（TNF-Sepharose（Ｒ）)を３０００Ｕ／分で遠心分離し
た。ゲル物質を緩衝液４０ｍｌで洗浄した。
【００３６】上澄の蛋白質測定からカップリング収率＞
９０％が得られた。
【００３７】ＢｒＣＮ−セファロース（BrCN-Sepharose
（Ｒ）)の過剰の活性基のブロッキングのために、ゲル
懸濁液に緩衝液（０．１ＭＮａＨＣＯ３、０．５ＭＮａ
Ｃｌ、１Ｍエタノールアミン、ｐＨ８．３）４０ｍｌを
添加し、引き続いて室温で１時間振り混ぜ、次いでエタ
ノールアミンを緩衝液（０．１ＭＮａＨＣＯ３、０．５
ＭＮａＣｌ、ｐＨ８．３）３×４０ｍｌを用いて洗い流
した。
【００３８】ｂ）グルタルジアルデヒドを用いるＴＮＦ
−セファロース（TNF-Sepharose（ Ｒ）)の架橋 ａ）により製造されたＴＮＦ−セファロース（TNF-Seph
arose（Ｒ）)ゲル懸濁液２０ｍｌを緩衝液（２０ｍＭ燐
酸ナトリウム、１４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ８．０）２５
ｍｌで２度洗浄した。この懸濁液を同じ緩衝液４０ｍｌ
中に入れ、２５％グルタルジアルデヒド溶液１．６ｍｌ
を添加した。室温で１時間振り混ぜた後に、懸濁液を遠
心分離させ、緩衝液（２０ｍＭ燐酸ナトリウム、１４０
ｍＭＮａＣｌ、１Ｍエタノールアミン、ｐＨ８．０）２
５ｍｌを添加した。再び１時間振り混ぜ、引き続いてＴ
ＮＦ−セファロース（TNF-Sepharose（Ｒ）)懸濁液をク
ロマトグラフィーカラム（φ＝１．５ｃｍ、ｌ＝１０ｃ
ｍ）中に充填した。
【００３９】このカラムは、緩衝液（２０ｍＭ燐酸ナト
リウム、１４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．２）１００ｍｌ
及び０．５８％酢酸＋１４０ｍＭＮａＣｌ ５０ｍｌで
洗浄後に親和性クロマトグラフィーのために使用可能で
あった。
【００４０】例５ 蛋白質の同定 ａ）分子量及び純度 分子量及び純度の測定のために、例２もしくは３により
得られた蛋白質２μｇに、還元性及び非還元性条件下
で、１５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を
施した(Nature 227,680(1970))。公知の一連の標準蛋白
質との比較により、両方の方法による新規蛋白質が、ク
マシーブルーでの着色後に、分子量約４２０００ダルト
ンの均一なバンドであることが判明した。
【００４１】他のバンドを認識することはできなかっ
た。従ってこの蛋白質の純度は、≧９０％でありうる。
【００４２】この蛋白質は、明白な青−紫に着色された
バンドとして確認される。
【００４３】ｂ）Ｎ−末端シークエンシング 例２により得られた蛋白質１０μｇ（≒２５０ｐＭｏ
ｌ）を気相シーケンサーを用いてＮ−末端で数回シーク
エンシングした。
【００４４】Ｎ−末端配列分析は、同類の副配列の出現
に基づき、Ｎ−末端アミノ酸配列の不均一性を示唆し
た。次の主配列を確認した： 配列１ａ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇ
ｌｕ Ｐｒｏ ＧｌｙＳｅｒ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ａｒｇ
Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｇｌｕ。
【００４５】その他に、気相シークエンシングではＮ−
末端でアミノ酸６個が延長された 配列２ａ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ａｌａ Ｐ
ｈｅ Ｔｈｒ ＰｒｏＴｙｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｕ
Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｔｈｒ ＣｙｓＡｒｇ Ｌ
ｅｕ Ａｒｇ Ｇｌｕ及びＮ−末端でアミノ酸１個が減
少された 配列３ａ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｐ
ｒｏ Ｇｌｙ ＳｅｒＴｈｒ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ｌｅｕ
Ａｒｇ Ｇｌｕが確認された。
【００４６】同様に例３の蛋白質中では次の主配列が確
認された： 配列１ｂ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ａｌａ Ｐ
ｈｅ Ｔｈｒ ＰｒｏＴｙｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｕ
Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｔｈｒ ＣｙｓＡｒｇ Ｌ
ｅｕ Ａｒｇ Ｇｌｕ（約１０％） 配列２ｂ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｔ
ｈｒ Ｐｒｏ ＴｙｒＡｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｐｒｏ
Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｃｙｓ ＡｒｇＬｅｕ Ａ
ｒｇ Ｇｌｕ（約４５％） 配列３ｂ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｐ
ｒｏ Ｔｙｒ ＡｌａＰｒｏ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ
Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ａｒｇ ＬｅｕＡｒｇ Ｇ
ｌｕ（約４５％）。
【００４７】ｄ）トリプシンでの処理 新規蛋白質２０μｇをｐＨ８．５で次のように処理し
た：１．０．１ＭＮａＨＣＯ３−緩衝液ｐＨ８．５中に
溶かしたトリプシン０．５μｇの添加；３７℃で１６時
間のインキュベーション２．０．１％ＳＤＳ−０．１Ｍ
ＮａＨＣＯ３−緩衝液ｐＨ８．５中に溶かしたトリプシ
ン０．５μｇの添加；ＳＤＳ−含有率０．１％まで溶液
を調整；３７℃で１６時間のインキュベーション。
【００４８】このように処理された蛋白質を、１５％Ｓ
ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動で、出発蛋白質と比
較して分析した。蛋白質の減成は、確認できなかった。
【００４９】例６ 脱グリコシル化 例２により得られたモノＱ−溶出液（≒０．１ｍｇ／蛋
白質ｍｌ）０．１ｍｌを１ＭＮａＯＨでｐＨ７．２に調
整した。引き続いてグリコペプチダーゼ Ｆ(Fa.Boehri
nger Mannheim)１０単位を添加した。３７℃で６時間の
インキュベーション後に、更に酵素１０単位を添加し
た。更に反応時間１６時間後にバッチ５０μｌを凍結乾
燥させ、１５％ＳＤＳ−ゲル中で未処理の蛋白質と比較
して分析した。酵素で処理された蛋白質は、未処理の試
料と比較すると、約３ｋＤ小さい分子量を示した。更に
バッチ２５μｌを、例１に記載のように、ＴＮＦα抑制
作用に関して検査した。ＴＮＦα抑制作用は、糖分の脱
離後にも完全に保持されていた。
【００５０】例７ 抗体製造 例２及び３で単離された蛋白質を、ポリクロナール抗体
の製造のためにイエウサギに注射した。抗体の反応性及
び特異性をＥＬＩＳＡを用いて検査した。そのためにＥ
ＬＩＳＡ−プレート(ELISA-Platte；Fa.Costar)を、抑
制剤−もしくは対照蛋白質１μｇ／０．０５Ｍ炭酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ９．６） ｍｌの溶液で被覆し、非
特異性結合を１％ＢＳＡ／ＰＢＳで飽和させ、かつ種々
の希釈血清と共にインキュベートした。結合された抗体
の検査をビオチニル化された抗−ウサギ−ＩｇＧ及びス
トレプトアビジン−ペルオキシダーゼ並びにＴＭＢ−基
質を用いて行った。個々のインキュベーションの間に各
々０．０５％トゥイーン( （Ｒ）Tween)−２０／ＰＢＳ
で３回洗浄した。２ＭＨ２ＳＯ４を用いる停止の後に、
４５０ｎｍにおける光学密度を測定した。
【００５１】例８ 体液中の蛋白質検出 種々の体液中のＴＮＦα結合蛋白質の検出のために、サ
ンドイッチ−ＥＬＩＳＡ(sandwich-ELISA)を使用した。
そのためにＥＬＩＳＡ−プレート(ELISA-Platte；Fa.Co
star)をＴＮＦ（５μｇ／０．０５Ｍ炭酸ナトリウム緩
衝液 ｐＨ９．６ ｍｌ）で被覆した。１％ＢＳＡ／Ｐ
ＢＳで飽和させた後、検査すべき試料、例えばリウマチ
患者の髄液と共にインキュベートした。検出を、例７に
記載の抗−抑制剤−抗体及びビオチニル化された抗−ウ
サギ−ＩｇＧ／ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ
／ＴＭＢ−基質を用いて行った。個々のインキュベーシ
ョンの間に各々０．０５％トゥイーン(（Ｒ）Tween)−
２０／ＰＢＳで３回洗浄した。２ＭＨ２ＳＯ４の添加後
に、４５０ｎｍにおける吸光を測定した。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１４年２月２１日（２００２．２．２
１）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 29/00 １０１ Ａ６１Ｐ 31/04 31/04 37/02 37/02 37/08 37/08 43/00 １１１ 43/00 １１１ Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者 ハインツ ヒレン ドイツ連邦共和国 デー−6733 ハスロッ ホ マックス−プランク−シュトラーセ 17 (72)発明者 アッヒム メラー アメリカ合衆国 マサチューセッツ 01890 ウィンチェスター キャリッジ レイン ３ (72)発明者 ロタール ダウム ドイツ連邦共和国 デー−6701 オッター シュタット ライアーシュトラーセ 25 (72)発明者 トーマス デルパー ドイツ連邦共和国 デー−6719 ビッサー スハイム ルイトポルトシュトラーセ ３ (72)発明者 トーマス ズプコフスキ ドイツ連邦共和国 デー−6704 ムッター シュタット ルッフハイマー シュトラー セ １ Ｆターム(参考） 4C084 AA02 AA07 AA17 BA44 CA18 CA53 NA14 ZA532 ZA592 ZA962 ZB112 ZB132 ZB152 ZB352 ZC412 4H045 AA10 AA30 BA10 CA40 EA20 EA22 EA24 FA16 FA71 GA10 GA22 GA26 HA05

Claims (5)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 最初のグリコシル化された形で分子量約
    ４２０００ダルトンを有し、Ｎ−末端にアミノ酸配列； Ｘａａ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇ
    ｌｕ Ｐｒｏ ＧｌｙＳｅｒ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ａｒｇ
    Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｇｌｕ ［式中、Ｘａａは、水素原子、フェニルアラニン基（Ｐ
    ｈｅ）又はアミノ酸配列；Ａｌａ Ｐｈｅ、Ｖａｌ Ａ
    ｌａ Ｐｈｅ、Ｇｌｎ Ｖａｌ Ａｌａ Ｐｈｅ、Ａｌ
    ａ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ａｌａ Ｐｈｅ、Ｐｒｏ Ａｌａ
    Ｇｌｎ ＶａｌＡｌａ Ｐｈｅ又はＬｅｕ Ｐｒｏ
    Ａｌａ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ａｌａ Ｐｈｅを表す］を有
    する蛋白質、及びこの蛋白質の作用を強く低下させるこ
    となく、アミノ酸又はペプチドの好適な置換、欠失又は
    付加により又はグリコシド基を変化させることにより得
    られるムテイン。
  2. 【請求項２】 脱グリコシル化された形の請求項１記載
    の蛋白質。
  3. 【請求項３】 ＴＮＦα−抑制作用を有する請求項１又
    は２記載の蛋白質。
  4. 【請求項４】 請求項１から３までのいずれか１項記載
    の蛋白質を使用することを特徴とする、体液中のＴＮＦ
    α−の濃度が上昇している疾患を治療するための薬剤の
    製法。
  5. 【請求項５】 疾患がアレルギー、自己免疫病、リュウ
    マチ性疾患、ショック肺、炎症性の骨疾病、血液凝固障
    害、又は移植後の合併症である請求項４記載の製法。
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