JP2001526026A - タイセイヨウサケ由来の孵化液の抽出方法および使用 - Google Patents
タイセイヨウサケ由来の孵化液の抽出方法および使用Info
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Abstract
(57)【要約】
孵化場で産生されたタイセイヨウサケ卵から有用性のあるエンドプロテアーゼ（すなわちゾナーゼ）を得るための方法が記載されている。例えば昇温により同期化された孵化に、チーズクロスを通してのろ過が続く。ろ液（孵化液）は、活性の損失なしに、（条件に依存して）何ヶ月もまたは何年も、保存され得る。無関係の物質は、尿素（２もしくは４Ｍ、またはそれ以上）の添加後、遠心分離（１６，０００ｇ、２×１５分）により除去される。高純度のゾナーゼが、簡単なクロマトグラフィー工程（ゲルろ過、アフィニティークロマトグラフィー、等電点電気泳動）により得られ、３つの工程すべてが順に行われると、シークエンスグレードの純度が得られる。すべてのサケゾナーゼの調製物は、タンパク質分解に関して、触媒作用および安定性の両方の点で、有益な酵素特性を示す。
Description
【０００１】 本発明は、タイセイヨウサケ（Ａｔｌａｎｔｉｃ ｓａｌｍｏｎ）幼生を生産
する孵化場からの排水中のエンドタンパク質分解性（ｅｎｄｏｐｒｏｔｅｏｌｙ
ｔｉｃ）孵化酵素（ゾナーゼ（ｚｏｎａｓｅ））を抽出するための方法に関し、
そしてさらに、本発明は、シークエンスグレード（ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｇｒａｄ
ｅ）の純度までのこの特殊なエンドプロテアーゼを得るための簡単な方法を確立
するが、このエンドプロテアーゼは、かなり独特のタンパク質分解特性を有する
ことが分かっている。
する孵化場からの排水中のエンドタンパク質分解性（ｅｎｄｏｐｒｏｔｅｏｌｙ
ｔｉｃ）孵化酵素（ゾナーゼ（ｚｏｎａｓｅ））を抽出するための方法に関し、
そしてさらに、本発明は、シークエンスグレード（ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｇｒａｄ
ｅ）の純度までのこの特殊なエンドプロテアーゼを得るための簡単な方法を確立
するが、このエンドプロテアーゼは、かなり独特のタンパク質分解特性を有する
ことが分かっている。
【０００２】 精製した状態のプロテアーゼは、研究において、実験室および臨床の分析にお
いて、ならびに食品製造工程において、使用されることが多くなってきている。
特に、特定の用途に釣り合う特性を有する酵素に対する要求は増加している。こ
のことは、安全で、継続的で、そして経済的な様式の産生を可能にする、新規な
プロテアーゼ源への探求を刺激している。
いて、ならびに食品製造工程において、使用されることが多くなってきている。
特に、特定の用途に釣り合う特性を有する酵素に対する要求は増加している。こ
のことは、安全で、継続的で、そして経済的な様式の産生を可能にする、新規な
プロテアーゼ源への探求を刺激している。
【０００３】 本明細書で、本発明者らは、タイセイヨウサケの水産養殖に関連したエンドプ
ロテアーゼの新規で豊富な供給源を開拓する。この産業の必須の局面は、発生過
程の卵（これが孵化して幼生を生じる）を孵化場で生産することである。孵化は
、胚がエンドプロテアーゼを産生し、このエンドプロテアーゼが分泌されると、
幼生が泳ぎ出て自分自身で生活を始め得るように、卵殻を効果的におよび特異的
に裂けて開くことによって、達成される（参考文献：Ｙａｍａｇａｍｉ １９８
８；Ｗａｌｔｈｅｒ １９９３）。
ロテアーゼの新規で豊富な供給源を開拓する。この産業の必須の局面は、発生過
程の卵（これが孵化して幼生を生じる）を孵化場で生産することである。孵化は
、胚がエンドプロテアーゼを産生し、このエンドプロテアーゼが分泌されると、
幼生が泳ぎ出て自分自身で生活を始め得るように、卵殻を効果的におよび特異的
に裂けて開くことによって、達成される（参考文献：Ｙａｍａｇａｍｉ １９８
８；Ｗａｌｔｈｅｒ １９９３）。
【０００４】 魚類の孵化の背後にあるこの決定的な酵素は、数種の魚類において特徴がわか
っているのみであり、そしてほとんど全ての場合、これらのゾナーゼは、メタロ
プロテアーゼであると解釈されている（参考文献：Ｈａｇｅｎｍａｉｅｒ １９
７４；ＯｈｚｕおよびＫａｓｕｙａ １９７９；ＳｃｈｏｏｔｓおよびＤｅｎｕ
ｃｅ １９８１；ＤｉＭｉｃｈｅｌｅら １９８１；Ｙａｓｕｍａｓｕら １９
８９ａ，ｂ；ＡｒａｋｉおよびＯｎｏｚａｔｏ １９９０；Ｈｕｎｇら １９９
７）。いくつかのゾナーゼ型酵素の遺伝子構造が、ほんの最近わかっただけであ
る（参考文献：Ｙａｓｕｍａｓｕら １９９２）。
っているのみであり、そしてほとんど全ての場合、これらのゾナーゼは、メタロ
プロテアーゼであると解釈されている（参考文献：Ｈａｇｅｎｍａｉｅｒ １９
７４；ＯｈｚｕおよびＫａｓｕｙａ １９７９；ＳｃｈｏｏｔｓおよびＤｅｎｕ
ｃｅ １９８１；ＤｉＭｉｃｈｅｌｅら １９８１；Ｙａｓｕｍａｓｕら １９
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７）。いくつかのゾナーゼ型酵素の遺伝子構造が、ほんの最近わかっただけであ
る（参考文献：Ｙａｓｕｍａｓｕら １９９２）。
【０００５】 孵化酵素と推定される酵素はまた、無脊椎動物において報告されており、ここ
でもまた、ほとんどのこのような酵素はメタロプロテアーゼであると解釈されて
いる（例えば、ＢａｒｒｅｔｔおよびＥｄｗａｒｄ １９７６；Ｌｅｐａｇｅお
よびＧａｃｈｅ １９８９；ＲｏｅおよびＬｅｎｎａｒｚ １９９０）。しかし
、セリンプロテアーゼ様ゾナーゼと思われる確実な事例が二、三報告されている
（例えば、Ｐｏｓｔら １９８８）。逆に、魚類よりも高等な脊椎動物間でも、
孵化酵素と推定される酵素はまた報告されている。例えば、ＵｒｃｈおよびＨｅ
ｄｒｉｃｋ（１９８１；両生類に関する）ならびにＹａｍａｚａｋｉら（１９９
４；マウスに関する）の両方は、セリンプロテアーゼであると思われるゾナーゼ
を報告した。孵化動物間にみられる２つの異なる型のゾナーゼの背後にある生物
学的および生化学的理論付けは、現在のところ完全には理解されていない。
でもまた、ほとんどのこのような酵素はメタロプロテアーゼであると解釈されて
いる（例えば、ＢａｒｒｅｔｔおよびＥｄｗａｒｄ １９７６；Ｌｅｐａｇｅお
よびＧａｃｈｅ １９８９；ＲｏｅおよびＬｅｎｎａｒｚ １９９０）。しかし
、セリンプロテアーゼ様ゾナーゼと思われる確実な事例が二、三報告されている
（例えば、Ｐｏｓｔら １９８８）。逆に、魚類よりも高等な脊椎動物間でも、
孵化酵素と推定される酵素はまた報告されている。例えば、ＵｒｃｈおよびＨｅ
ｄｒｉｃｋ（１９８１；両生類に関する）ならびにＹａｍａｚａｋｉら（１９９
４；マウスに関する）の両方は、セリンプロテアーゼであると思われるゾナーゼ
を報告した。孵化動物間にみられる２つの異なる型のゾナーゼの背後にある生物
学的および生化学的理論付けは、現在のところ完全には理解されていない。
【０００６】 タイセイヨウサケにおいて、本発明者らは、主なゾナーゼがセリンプロテアー
ゼであることを見出した。これは、サケ卵の排水および孵化液（ｈａｔｃｈｉｎ
ｇ ｆｌｕｉｄ）中に大量に存在する。この粗水性状態においては、従来の技術
を用いて精製するために、サケゾナーゼを、効果的に準備することができる。ゾ
ナーゼのこの供給源は、全胚からの酵素の単離に比較して大きな利点を提供する
。なぜならば、無関係の生体物質（卵殻、胚、および幼生）由来の複合物を効果
的に除去するからである。従って、酵素精製は非常に簡単になる。
ゼであることを見出した。これは、サケ卵の排水および孵化液（ｈａｔｃｈｉｎ
ｇ ｆｌｕｉｄ）中に大量に存在する。この粗水性状態においては、従来の技術
を用いて精製するために、サケゾナーゼを、効果的に準備することができる。ゾ
ナーゼのこの供給源は、全胚からの酵素の単離に比較して大きな利点を提供する
。なぜならば、無関係の生体物質（卵殻、胚、および幼生）由来の複合物を効果
的に除去するからである。従って、酵素精製は非常に簡単になる。
【０００７】 さらなる利点は、発生段階のサケ卵が孵化前に最少容量の水に移され得ること
である。昇温（または室温）により、または脱酸素化（Ｏｐｐｅｎ−Ｂｅｒｎｔ
ｓｅｎら １９９０）により、高度に同期化した孵化が誘導される場合、これに
よって、粗ゾナーゼの少量の高度に濃縮された調製物を作ることができる。
である。昇温（または室温）により、または脱酸素化（Ｏｐｐｅｎ−Ｂｅｒｎｔ
ｓｅｎら １９９０）により、高度に同期化した孵化が誘導される場合、これに
よって、粗ゾナーゼの少量の高度に濃縮された調製物を作ることができる。
【０００８】 この方法のさらにきわめて重要な局面は、タンパク質分解性ゾナーゼの濃度の
増加にもかかわらず、その内在するゾナーゼの安定性は損なわれないままである
ことが観察されたことである。さらに、この方法では、ほぼ純粋な水の媒体（多
くて１ｍＭのＮａＣｌを含む）中でゾナーゼ酵素を得るが、それにもかかわらず
、この媒体中で、ゾナーゼは、長時間にわたり酵素的に完全な状態にあって、そ
の状態が維持されるということは重要な事である。この調製物は、それゆえ、引
き続いて様々な程度に精製した（シークエンスグレードの純度まで）タンパク質
分解性ゾナーゼを調製するための、有益な出発物質なのである。
増加にもかかわらず、その内在するゾナーゼの安定性は損なわれないままである
ことが観察されたことである。さらに、この方法では、ほぼ純粋な水の媒体（多
くて１ｍＭのＮａＣｌを含む）中でゾナーゼ酵素を得るが、それにもかかわらず
、この媒体中で、ゾナーゼは、長時間にわたり酵素的に完全な状態にあって、そ
の状態が維持されるということは重要な事である。この調製物は、それゆえ、引
き続いて様々な程度に精製した（シークエンスグレードの純度まで）タンパク質
分解性ゾナーゼを調製するための、有益な出発物質なのである。
【０００９】 （実施例１：タイセイヨウサケからの粗ゾナーゼの濃縮調製物） ゾナーゼの最初の精製は、チーズクロスを通しての孵化したサケ卵のろ過のみ
である。そのようなろ液は、顕著なゾナーゼ分解なしに何年間も冷凍され得、そ
の後解凍され、そしてさらなるゾナーゼ精製に用いられる。この事実は、サケゾ
ナーゼを精製するための出発材料の生産を非常に簡単にする。
である。そのようなろ液は、顕著なゾナーゼ分解なしに何年間も冷凍され得、そ
の後解凍され、そしてさらなるゾナーゼ精製に用いられる。この事実は、サケゾ
ナーゼを精製するための出発材料の生産を非常に簡単にする。
【００１０】 次の工程は、「ゾナーゼ粗製物」を通常４Ｍの尿素濃度に調節する工程を含み
、この工程は、サケ卵殻の断片を解離させ、そして、低速遠心分離（１５，００
０ｇ；２×１５分）により、無関係な破片と共にサケ卵殻の断片を除去すること
を可能にする。この材料は、カラムを詰まらせる兆候を示さないが、カラムが詰
まることが、上記とは違う方法で調製した粗材料の特徴である。従って、従来の
クロマトグラフィー技術による精製に適切な「ゾナーゼ粗製物」が、入手できた
ことになる。サケゾナーゼが４Ｍの尿素濃度、または８Ｍの尿素濃度においてさ
え、安定であり、そして触媒的に活性であることには注目すべきである。さらに
、サケゾナーゼのこの調製物は、セリンプロテアーゼ型のプロテアーゼのインヒ
ビターによってのみ効果的に阻害される。
、この工程は、サケ卵殻の断片を解離させ、そして、低速遠心分離（１５，００
０ｇ；２×１５分）により、無関係な破片と共にサケ卵殻の断片を除去すること
を可能にする。この材料は、カラムを詰まらせる兆候を示さないが、カラムが詰
まることが、上記とは違う方法で調製した粗材料の特徴である。従って、従来の
クロマトグラフィー技術による精製に適切な「ゾナーゼ粗製物」が、入手できた
ことになる。サケゾナーゼが４Ｍの尿素濃度、または８Ｍの尿素濃度においてさ
え、安定であり、そして触媒的に活性であることには注目すべきである。さらに
、サケゾナーゼのこの調製物は、セリンプロテアーゼ型のプロテアーゼのインヒ
ビターによってのみ効果的に阻害される。
【００１１】 （実施例２：タイセイヨウサケからの精製ゾナーゼ） 「ゾナーゼ粗製物」から抽出した産物は、いろいろな精製段階で選択してもよ
い。しかし、すでに１回のゲルろ過の後、ゾナーゼは、ろ液中のより大きな分子
成分から分離され、１２倍に精製され、５０％より良好な収率で得られる。「ゾ
ナーゼ粗製物」に存在するより大きな成分は、そのほとんどの部分が卵殻の可溶
性断片であるようであり、この断片にいくらかのゾナーゼがしっかりと結合され
ている。高分子量混入物は精製のこの初期段階で捨てる必要がある。なぜならば
、さもなければ、その存在は、引き続く精製工程の成功に悪影響を与え、そして
妨害するからである。言い換えれば、従来の精製法を行う一連の手順が、本プロ
セスの必須の局面である。
い。しかし、すでに１回のゲルろ過の後、ゾナーゼは、ろ液中のより大きな分子
成分から分離され、１２倍に精製され、５０％より良好な収率で得られる。「ゾ
ナーゼ粗製物」に存在するより大きな成分は、そのほとんどの部分が卵殻の可溶
性断片であるようであり、この断片にいくらかのゾナーゼがしっかりと結合され
ている。高分子量混入物は精製のこの初期段階で捨てる必要がある。なぜならば
、さもなければ、その存在は、引き続く精製工程の成功に悪影響を与え、そして
妨害するからである。言い換えれば、従来の精製法を行う一連の手順が、本プロ
セスの必須の局面である。
【００１２】 利用されるマトリクスは様々であり得るが、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ ＳＲ−２０
０を通常選択する。緩衝液は、トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０もしくはｐＨ８．５
（０．０５Ｍ））またはトリス−酢酸（０．０２５Ｍ、同様のｐＨ）であった。
ゲルろ過法の後で得られるゾナーゼは、「ゾナーゼ粗製物」中の主なゾナーゼ部
分を占め、そしてその酵素活性はベンズアミジンによって触媒的に阻害された。
０を通常選択する。緩衝液は、トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０もしくはｐＨ８．５
（０．０５Ｍ））またはトリス−酢酸（０．０２５Ｍ、同様のｐＨ）であった。
ゲルろ過法の後で得られるゾナーゼは、「ゾナーゼ粗製物」中の主なゾナーゼ部
分を占め、そしてその酵素活性はベンズアミジンによって触媒的に阻害された。
【００１３】 タンパク質の点では、ゾナーゼは、すでにこの段階で、材料の約１０％を占め
る。この部分的に精製されたサケゾナーゼは、ここでもセリンプロテアーゼ型イ
ンヒビターによってのみ阻害される。
る。この部分的に精製されたサケゾナーゼは、ここでもセリンプロテアーゼ型イ
ンヒビターによってのみ阻害される。
【００１４】 （実施例３：均一なタンパク質産物としてのゾナーゼ） ベンズアミジンによるゾナーゼ阻害により、ゲルろ過カラムに留まる酵素画分
は、さらに市販のベンズアミジンＳｅｐｈａｒｏｓｅ ６Ｂ−カラムでのアフィ
ニティークロマトグラフィーによって、容易に精製され得る。この工程により、
７．５倍に精製され、「ゾナーゼ粗製物」に対して総精製工程では全体として９
４倍に精製され、活性の収率は３７％である。
は、さらに市販のベンズアミジンＳｅｐｈａｒｏｓｅ ６Ｂ−カラムでのアフィ
ニティークロマトグラフィーによって、容易に精製され得る。この工程により、
７．５倍に精製され、「ゾナーゼ粗製物」に対して総精製工程では全体として９
４倍に精製され、活性の収率は３７％である。
【００１５】 （２５または１２５ｍｌ容量のカラムで）用いた特定の条件は、再び、０．０
５Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８または８．５）であり、これは、カラムに非
特異的に結合した物質を除去するために、１Ｍ ＮａＣｌに調整された。ゾナー
ゼはカラムにしっかりと結合されたままであるので、この工程によっては除去さ
れない。この工程は、同様のトリス−ＨＣｌ緩衝液において、１Ｍ ＮａＣｌ中
１０〜３３％のジオキサン勾配を用いて、カラムからゾナーゼを溶出することで
決定的に成功するのである。この方法は、有機溶媒中でサケゾナーゼが特異な安
定性を持つことによっている。
５Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８または８．５）であり、これは、カラムに非
特異的に結合した物質を除去するために、１Ｍ ＮａＣｌに調整された。ゾナー
ゼはカラムにしっかりと結合されたままであるので、この工程によっては除去さ
れない。この工程は、同様のトリス−ＨＣｌ緩衝液において、１Ｍ ＮａＣｌ中
１０〜３３％のジオキサン勾配を用いて、カラムからゾナーゼを溶出することで
決定的に成功するのである。この方法は、有機溶媒中でサケゾナーゼが特異な安
定性を持つことによっている。
【００１６】 アフィニティー精製後、ゾナーゼ調製物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析において、
約２８ｋＤａの分子量を有する１つのタンパク質バンドを示す。ゾナーゼのこの
部分は、抗原性が高く、サケゾナーゼを特異的に認識するがサケトリプシン等の
他のサケセリンプロテアーゼは認識しないポリクローナル抗体の産生を可能にす
る。逆に、サケトリプシンに対するポリクローナル抗体は、サケゾナーゼを認識
せず、このことは、胚のサケの別個の産物としてサケゾナーゼを確立させる。し
かし、このゾナーゼ産物は、Ｅｄｍａｎ法によりそのＮ末端配列が明らかにされ
るように、シークエンスグレードの純度を有さない。しかし、最初の１２個のＮ
末端の配列決定の工程を超えると、このタンパク質の全体のアミノ酸配列は、純
粋なゾナーゼと類似していることが示された。この高度に精製されたサケゾナー
ゼ調製物はまた、セリンプロテアーゼ型インヒビターによってのみ、特異的に阻
害される。
約２８ｋＤａの分子量を有する１つのタンパク質バンドを示す。ゾナーゼのこの
部分は、抗原性が高く、サケゾナーゼを特異的に認識するがサケトリプシン等の
他のサケセリンプロテアーゼは認識しないポリクローナル抗体の産生を可能にす
る。逆に、サケトリプシンに対するポリクローナル抗体は、サケゾナーゼを認識
せず、このことは、胚のサケの別個の産物としてサケゾナーゼを確立させる。し
かし、このゾナーゼ産物は、Ｅｄｍａｎ法によりそのＮ末端配列が明らかにされ
るように、シークエンスグレードの純度を有さない。しかし、最初の１２個のＮ
末端の配列決定の工程を超えると、このタンパク質の全体のアミノ酸配列は、純
粋なゾナーゼと類似していることが示された。この高度に精製されたサケゾナー
ゼ調製物はまた、セリンプロテアーゼ型インヒビターによってのみ、特異的に阻
害される。
【００１７】 （実施例４：シークエンスグレードの純度を有して調製されたゾナーゼ） ゲルろ過精製しかつアフィニティー精製したサケゾナーゼは、１つの最終クロ
マトグラフィー工程により、シークエンスグレードの純度まで、さらに精製され
得る。この工程は、トリス−酢酸緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ９．０）とともに、Ｐ
ＢＥ９４カラムを用い、ここで、引き続く溶出には、この緩衝液中、塩勾配（１
Ｍ ＮａＣｌ塩まで）を用いた。この工程自体は、ゾナーゼの触媒活性を、さら
に７．６倍増加し、精製工程全体では７１４倍に精製し、そして出発物質からの
収率は２８％である。この精製工程では、ゾナーゼのタンパク質の正体は２８ｋ
Ｄａ部分のままである。よって、この工程では、実施例２および３に示されるよ
うに、タンパク質精製に慣例であるようには、無関係な主要なタンパク質混入物
はゾナーゼ調製物から除去されない。精製したゾナーゼの分子量は、孵化液およ
び「ゾナーゼ粗製物」に存在するゾナーゼ部分に対するウエスタンブロッティン
グ法によって観察されるものと同一である。
マトグラフィー工程により、シークエンスグレードの純度まで、さらに精製され
得る。この工程は、トリス−酢酸緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ９．０）とともに、Ｐ
ＢＥ９４カラムを用い、ここで、引き続く溶出には、この緩衝液中、塩勾配（１
Ｍ ＮａＣｌ塩まで）を用いた。この工程自体は、ゾナーゼの触媒活性を、さら
に７．６倍増加し、精製工程全体では７１４倍に精製し、そして出発物質からの
収率は２８％である。この精製工程では、ゾナーゼのタンパク質の正体は２８ｋ
Ｄａ部分のままである。よって、この工程では、実施例２および３に示されるよ
うに、タンパク質精製に慣例であるようには、無関係な主要なタンパク質混入物
はゾナーゼ調製物から除去されない。精製したゾナーゼの分子量は、孵化液およ
び「ゾナーゼ粗製物」に存在するゾナーゼ部分に対するウエスタンブロッティン
グ法によって観察されるものと同一である。
【００１８】 第３および最終クロマトグラフィー工程において起こっているらしいことは、
混入している小さなペプチドの除去である。これらのペプチドは、卵殻および／
またはサケ胚に由来する可能性が最も高い、約１２残基を有するオリゴペプチド
であると思われる。これらのペプチド混入物は、除去するとゾナーゼの触媒活性
が増強されるので、ゾナーゼ触媒に対して阻害効果を発揮すると思われる。また
、これらのペプチドの存在は、このゾナーゼ産物のＥｄｍａｎ配列決定における
第１工程に干渉する。この第３の精製工程において見られるゾナーゼの２つの形
態は、カラムマトリクスにいくらか異なって結合する。しかし、両方の形態は、
そのＮ末端部分において類似のアミノ酸配列を有する。
混入している小さなペプチドの除去である。これらのペプチドは、卵殻および／
またはサケ胚に由来する可能性が最も高い、約１２残基を有するオリゴペプチド
であると思われる。これらのペプチド混入物は、除去するとゾナーゼの触媒活性
が増強されるので、ゾナーゼ触媒に対して阻害効果を発揮すると思われる。また
、これらのペプチドの存在は、このゾナーゼ産物のＥｄｍａｎ配列決定における
第１工程に干渉する。この第３の精製工程において見られるゾナーゼの２つの形
態は、カラムマトリクスにいくらか異なって結合する。しかし、両方の形態は、
そのＮ末端部分において類似のアミノ酸配列を有する。
【００１９】 ＣＮＢｒ産生ペプチド由来の部分アミノ酸配列は、ゾナーゼを別個のタンパク
質として確立させた。ゾナーゼが別個の触媒ドメインおよび基質結合ドメインを
有し得、このことが、巨大分子（生理学的）基質に作用する（結合は阻害され、
よって、触媒作用が間接的に阻害される）場合のカルシウムキレート剤に対する
その感受性、また小さな基質に作用する（触媒作用が直接阻害される）場合のセ
リンプロテアーゼインヒビターに対する感受性を説明し得るという示唆が構造分
析によって得られた。
質として確立させた。ゾナーゼが別個の触媒ドメインおよび基質結合ドメインを
有し得、このことが、巨大分子（生理学的）基質に作用する（結合は阻害され、
よって、触媒作用が間接的に阻害される）場合のカルシウムキレート剤に対する
その感受性、また小さな基質に作用する（触媒作用が直接阻害される）場合のセ
リンプロテアーゼインヒビターに対する感受性を説明し得るという示唆が構造分
析によって得られた。
【００２０】 （実施例５：サケゾナーゼの化学特性） ゾナーゼの触媒作用は、モル濃度の塩の存在により影響されない（６Ｍの塩に
おいても蒸留水中でもほぼ同程度に効果的である）。この酵素は、ｐＨ７とｐＨ
９との間で実質的に等しく活性である。しかし、ゾナーゼは、ｐＨ４未満で不活
化され、そしてｐＨ６では弱い活性しかない。ゾナーゼは、８Ｍの尿素の存在に
より影響されない。ゾナーゼは室温で、（尿素ありおよび尿素なしで）、最小の
酵素活性の損失のみで、５０日間保存され得る。酵素活性はまた、４０％（ｖ／
ｖ）の有機溶媒（ジオキサンまたはプロパノール等）によってさえ、妨害されな
い。反対に、この酵素は、１０％（ｖ／ｖ）の２−メルカプトエタノールによっ
て容易に不活化される（２−メルカプトエタノールは引き続いて、５０℃でのエ
バポレーションによって除去され得る）。触媒作用は４２℃で最大であり（市販
の基質ｃｈｒｏｍｏｚｙｍ Ｘ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒから）を使用して）、わ
ずかだが有意な触媒作用が、６５℃を超えて、または５分間９０℃まで加熱した
後、引き続いて冷却し、室温でアッセイしたときに観察された。
おいても蒸留水中でもほぼ同程度に効果的である）。この酵素は、ｐＨ７とｐＨ
９との間で実質的に等しく活性である。しかし、ゾナーゼは、ｐＨ４未満で不活
化され、そしてｐＨ６では弱い活性しかない。ゾナーゼは、８Ｍの尿素の存在に
より影響されない。ゾナーゼは室温で、（尿素ありおよび尿素なしで）、最小の
酵素活性の損失のみで、５０日間保存され得る。酵素活性はまた、４０％（ｖ／
ｖ）の有機溶媒（ジオキサンまたはプロパノール等）によってさえ、妨害されな
い。反対に、この酵素は、１０％（ｖ／ｖ）の２−メルカプトエタノールによっ
て容易に不活化される（２−メルカプトエタノールは引き続いて、５０℃でのエ
バポレーションによって除去され得る）。触媒作用は４２℃で最大であり（市販
の基質ｃｈｒｏｍｏｚｙｍ Ｘ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒから）を使用して）、わ
ずかだが有意な触媒作用が、６５℃を超えて、または５分間９０℃まで加熱した
後、引き続いて冷却し、室温でアッセイしたときに観察された。
【００２１】 （実施例６：サケゾナーゼの触媒特性） 問題のサケゾナーゼは、ｃｈｒｏｍｏｚｙｍ基質全シリーズを切断し、塩基性
アミノ酸（好ましくはアルギニン）とのペプチド結合で、最大親和力を示す。こ
れらの小さな人工基質の場合、ゾナーゼは、他のセリンプロテアーゼと同程度に
活性であるが、ＫM＝１４μＭはそれらより低い。Ｖｍａｘは１．３μＭ／分に 等しく、そしてウシおよびブタ（カチオン性）トリプシンの場合の約１の値と比
較して、５７（／ｍＭ秒）のＫｃａｔ／ＫMである。トリプシン等の他のセリン プロテアーゼと比較した、ペプチド結合の切断に関する高度の特異性が、基質と
して卵殻ｚｒタンパク質（Ｗａｌｔｈｅｒ １９９３を参照のこと）を用いて示
される。トリプシンは、これらのタンパク質を多くの小さな断片に切断し、一方
、ゾナーゼは、その生理学的基質であるものをほとんど分解しないことが観察さ
れている。
アミノ酸（好ましくはアルギニン）とのペプチド結合で、最大親和力を示す。こ
れらの小さな人工基質の場合、ゾナーゼは、他のセリンプロテアーゼと同程度に
活性であるが、ＫM＝１４μＭはそれらより低い。Ｖｍａｘは１．３μＭ／分に 等しく、そしてウシおよびブタ（カチオン性）トリプシンの場合の約１の値と比
較して、５７（／ｍＭ秒）のＫｃａｔ／ＫMである。トリプシン等の他のセリン プロテアーゼと比較した、ペプチド結合の切断に関する高度の特異性が、基質と
して卵殻ｚｒタンパク質（Ｗａｌｔｈｅｒ １９９３を参照のこと）を用いて示
される。トリプシンは、これらのタンパク質を多くの小さな断片に切断し、一方
、ゾナーゼは、その生理学的基質であるものをほとんど分解しないことが観察さ
れている。
【００２２】 サケゾナーゼ作用の観察された特異性は、もちろん、ゾナーゼの必要とするも
のを正確に反映する。このような酵素は、胚が卵から出ることができるように、
卵殻タンパク質の機械的に完全な状態を迅速に破壊しなければならないが、その
化学的に完全な状態は破壊してはならない。非常に大量の卵殻基質の存在下で迅
速にそうするためには、最小数のペプチド結合のみを特異的に攻撃する必要があ
る。しかし、その基質に長時間さらされると、ゾナーゼは、他のペプチド結合も
また最終的に切断する。タンパク質分解におけるこの配列特異性は観察はされた
が、まだ化学的に詳細には説明されていない。しかし、ゾナーゼは、（他の）部
位特異的特性を有する酵素の市販の酵素調製物（例えば、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
の製品、Ａｓｐ−ＮおよびＧｌｕ−Ｃ）を使用して現在達成されるような、特異
的切断を様々な候補タンパク質において達成するという点で、優れた見込みを有
するようである。従って、ゾナーゼは、配列決定されるべき大きなタンパク質か
ら定義されたペプチドを産生するということで、タンパク質の配列決定（ｓｅｑ
ｕｅｎａｔｉｏｎ）の分析学的研究の準備に用いられている市販の酵素と並んで
格付けされる。従って、純粋なサケゾナーゼの酵素学的なこの特性は、商業的に
有益である。
のを正確に反映する。このような酵素は、胚が卵から出ることができるように、
卵殻タンパク質の機械的に完全な状態を迅速に破壊しなければならないが、その
化学的に完全な状態は破壊してはならない。非常に大量の卵殻基質の存在下で迅
速にそうするためには、最小数のペプチド結合のみを特異的に攻撃する必要があ
る。しかし、その基質に長時間さらされると、ゾナーゼは、他のペプチド結合も
また最終的に切断する。タンパク質分解におけるこの配列特異性は観察はされた
が、まだ化学的に詳細には説明されていない。しかし、ゾナーゼは、（他の）部
位特異的特性を有する酵素の市販の酵素調製物（例えば、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
の製品、Ａｓｐ−ＮおよびＧｌｕ−Ｃ）を使用して現在達成されるような、特異
的切断を様々な候補タンパク質において達成するという点で、優れた見込みを有
するようである。従って、ゾナーゼは、配列決定されるべき大きなタンパク質か
ら定義されたペプチドを産生するということで、タンパク質の配列決定（ｓｅｑ
ｕｅｎａｔｉｏｎ）の分析学的研究の準備に用いられている市販の酵素と並んで
格付けされる。従って、純粋なサケゾナーゼの酵素学的なこの特性は、商業的に
有益である。
【００２３】
【表１】
【手続補正書】特許協力条約第１９条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１１年５月１１日（１９９９．５．１１）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１０】 サケゾナーゼによるタンパク質分解を阻害するための技術
方法であって、弱酸（例えばｐＨ５）、中程度の熱（例えば６５℃）または少量
の２−メルカプトエタノールの使用と、エバポレーションによる後者のインヒビ
ターの除去とを含む、方法。
方法であって、弱酸（例えばｐＨ５）、中程度の熱（例えば６５℃）または少量
の２−メルカプトエタノールの使用と、エバポレーションによる後者のインヒビ
ターの除去とを含む、方法。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１１年１２月２７日（１９９９．１２．２７）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ， ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，Ｌ Ｕ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ， ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，Ｕ Ｇ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B050 DD11 FF02C FF05C FF11C FF12C FF14C FF20C LL02 LL03
Claims (12)
- 【請求項１】 サケ卵産生由来の、そのタンパク質分解酵素の含有量を特徴
とする、孵化液からの成分の抽出および使用。 - 【請求項２】 請求項１に記載の、サケ卵の孵化液からサケゾナーゼを抽出
する方法であって、 最少容量の水に懸濁したサケ卵の同期化した迅速な孵化を誘導することを特徴と
する方法。 - 【請求項３】 請求項１に記載の、サケ卵の孵化液からサケゾナーゼを抽出
する方法であって、 孵化場の流出水から、孵化液を、高性能半透膜を通して該液体をポンピングする
ことにより、回収し濃縮することを特徴とする方法。 - 【請求項４】 請求項１に記載の、濃縮した孵化液中のサケゾナーゼへのア
クセスであって、 −８０℃で何年もの間、または周囲温度もしくは室温で何ヶ月もの間、該液を保
存することを特徴とするアクセス。 - 【請求項５】 請求項１に記載の、さらなる精製に有用な粗サケゾナーゼの
調製であって、 ２Ｍ、４Ｍ、または８Ｍの濃度までの固体尿素を添加して前記孵化液を処理し、
その混合物を１６，０００ｇで２×１５分の遠心分離に供することを特徴とする
調製。 - 【請求項６】 サケゾナーゼ精製のためのクロマトグラフィーの使用であっ
て、 部分的に精製されたサケゾナーゼを得るために用いる、ゲルろ過、ベンズアミジ
ン−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６Ｂでのアフィニティークロマトグラフィー、および
イオン交換クロマトグラフィーを特徴とする、使用。 - 【請求項７】 サケゾナーゼ精製のための、一連のクロマトグラフィー工程
の請求項６に記載の使用であって、 最初に部分的に純粋なサケゾナーゼ、引き続いて均一なサケゾナーゼ、および最
終的にシークエンスグレードで純粋な（ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｐｕｒｅ）サケゾナ
ーゼをそれぞれ得るために、最初に（例えば、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ ＳＲ−２０
０での）ゲルろ過を用い、引き続いて（例えば、ベンズアミジン修飾Ｓｕｐｅｒ
ｏｓｅ ６Ｂカラムでの）アフィニティークロマトグラフィーを用い、最終的に
（例えば、ＰＢＥ９４カラムでの）イオン交換クロマトグラフィーを用いること
を特徴とする使用。 - 【請求項８】 サケゾナーゼのための特定の溶出条件の使用であって、 マトリクスまたは巨大分子構造に結合したゾナーゼを抽出するために、濃縮塩洗
浄、続いて、濃縮塩溶液中の有機溶媒（例えば、３３％ジオキサン）での溶出を
組み合わせることを特徴とする使用。 - 【請求項９】 純粋なもしくは純粋でないタンパク質産物をより小さな産物
に切断する、その固有の能力を特徴とする、精製したゾナーゼ、部分的に精製し
たゾナーゼ、または粗サケ孵化液の使用。 - 【請求項１０】 純水条件下、または低水性もしくは非水性有機溶媒中で、
加水分解を達成するかまたは逆加水分解（ｒｅｖｅｒｓｅ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉ
ｓ）（合成）を達成する能力を特徴とする、純粋なまたは部分的に精製した状態
のサケゾナーゼの使用。 - 【請求項１１】 サケゾナーゼによるタンパク質分解を阻害するための技術
の使用であって、 弱酸（例えばｐＨ５）、中程度の熱（例えば６５℃）、または少量の２−メルカ
プトエタノールの使用、およびエバポレーションによる後者のインヒビターの除
去を特徴とする使用。 - 【請求項１２】 タンパク質中の特定のペプチド結合を切断する能力を特徴
とする、純粋なまたは部分的に精製したサケゾナーゼの使用であって、 得られるペプチドをそのアミノ酸に関して配列決定するための使用。
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