JP3547021B2 - 新規アスパルチック・プロティナーゼ - Google Patents
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Description
【産業上の利用分野】
本発明は、リゾプス・ハンショウ (Rhizopus hangchow) が産生するアスパルチック・プロティナーゼに関する。
【0002】
【従来の技術】
アスパルチック・プロティナーゼは、作用至適pHが酸性側にあり活性部位にアスパラギン酸残基を有するプロティナーゼの総称で、消化薬や麹の補助剤あるいは代替品として用いられたり、調味液やペプチドなどを製造する際に用いられたりしている。このアスパルチック・プロティナーゼの起源としては、動物の胃液中のペプシンや仔牛胃のレンニンなどが広く知られている。また、アスペルギルス(Aspergillus) 属、ペニシリウム(Penicillium) 属、リゾプス(Rhizopus)属、ムコール(Mucor) 属、サッカロミセス(Saccharomyces) 属などの微生物もアスパルチック・プロティナーゼの起源として知られている。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、微生物を起源とする種々の酵素について鋭意研究を行っていたところ、リゾプス・ハンショウ (Rhizopus hangchow) がアスパルチック・プロティナーゼを産生することを見出し、本発明をなすに至った。したがって、本発明は、リゾプス・ハンショウ (Rhizopus hangchow) が産生するアスパルチック・プロティナーゼを提供することを課題とする。
【0004】
【課題を解決するための手段】
本発明は、アスパルチック・プロティナーゼ産生能を有するリゾプス・ハンショウ (Rhizopus hangchow) を培養し、菌体中にアスパルチック・プロティナーゼを生成、蓄積させた後、分離、精製することにより得られるアスパルチック・プロティナーゼであり、分子量約37,600(SDS−PAGE)を有し、次のN末端アミノ酸配列を有する。
Ser−Gly−Ser−Gly−Val−Val−Phe−Met−Thr−Asp−Tyr−Glu−Tyr−Asp−Ile−Glu−Tyr−Tyr−Gly−
【0005】
次に、本発明のアスパルチック・プロティナーゼの製造法について説明する。本発明のアスパルチック・プロティナーゼの製造に用いるリゾプス・ハンショウ (Rhizopus hangchow) は、本発明のアスパルチック・プロティナーゼを産生するものであればいずれの菌株でも良く、例えばその菌株として、リゾプス・ハンショウ (Rhizopus hangchow) IFO−4749株を挙げることができる。このIFO−4749株は財団法人発酵研究所(Institute for Fermentation, Osaka) で何らの制限を受けること無く入手することができる。
【0006】
本発明のアスパルチック・プロティナーゼを製造する際に行うリゾプス・ハンショウ (Rhizopus hangchow) の培養に用いる培地は、通常のリゾプス・ハンショウ (Rhizopus hangchow) の培養に用いる培地であれば良く、液体培地を用いることもできるし、固体培地を用いることもできる。また、本発明のアスパルチック・プロティナーゼを産生させるための誘導物質は特に必要としない。なお、培養温度は25℃前後が好ましく、培養時間は4日程度で良い。
【0007】
このようにリゾプス・ハンショウ (Rhizopus hangchow) の菌体中に生成、蓄積させたアスパルチック・プロティナーゼの精製は、酵素の精製に通常用いられる方法を適宜組み合わせることにより行われる。例えば、液体培養においては、濾過や遠心分離などの処理により培養物から菌体を分離した後、酵素処理や物理的処理により菌体を破砕し、アスパルチック・プロティナーゼを溶出させて粗酵素画分を得る。また、固体培養においては、緩衝液などの溶媒を用いてアスパルチック・プロティナーゼの粗酵素画分を抽出する。そして、この粗酵素画分は、硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなどの処理により精製される。
【0008】
次に、本発明のアスパルチック・プロティナーゼの理化学的性質を示す。
(1) 分子量:SDS−PAGEで37,600であり、Superoseを用いたファースト・プロテイン・リキッド・クロマトグラフ(FPLC)で36,000である。
(2) 等電点:等電点電気泳動で 4.5である。
(3) 基質特異性:インシュリンB鎖中の Leu15−Tyr16及び Tyr16−Leu17の二つのペプチド結合を初期に切断し、さらに、 Leu11−Val12、 Ala14−Leu15及び Phe24−Phe25を切断する。また、トリプシノーゲンをpH2〜5の領域で活性化する。
(4) 至適pH:pH3〜4である(図1参照)。
(5) 熱安定性:pH 3.0で45℃、5分間の処理により酵素活性は減少し、pH 3.0で50℃、5分間の処理により酵素活性は完全に消失する。
(6) pH安定性:pH2〜7で極めて安定である(図2参照)。また、pH 9.0で、5℃、一夜の処理により酵素活性の約50%が減少する。
(7) 阻害剤:1μM のペプスタチンAにより酵素活性は完全に消失し、14℃、40分間のN−ジアゾアセチルノルロイシンメチル エステル(N−diazoacetylnorleucinemethyl ester)(DAN)処理により酵素活性の約56%が減少する。(8) N末端アミノ酸配列:Ser−Gly−Ser−Gly−Val−Val−Phe−Met−Thr−Asp−Tyr−Glu−Tyr−Asp−Ile−Glu−Tyr−Tyr−Gly−
(9) 構造:円偏光二色性スペクトルの測定(図3参照)により、約90%のβ−構造を有する。
【0009】
なお、アスパルチック・プロティナーゼ活性は、以下のようにして測定した。0.1Mクエン酸緩衝液(pH 3.0)で希釈した酵素液1mlに2%ミルクカゼイン溶液1mlを加え、30℃で10分間反応させた。0.4Mトリクロロ酢酸2mlを加えて反応を停止させた後、20分間以上放置し、トーヨー濾紙 NO.2 で濾過した。この濾液1mlに0.4M炭酸ナトリウム5mlを加えて充分撹拌した後、6倍希釈 Folin−Ciocalteu試薬1mlを加えて30℃で30分間放置し、吸光度 660nmを測定した。これとは別に予め失活させておいた酵素液を用い盲検を行った。酵素活性は、30℃、pH 3.0で2%ミルクカゼイン水溶液を基質として酵素反応を行った際に、1秒間にチロシン1mole相当の 280nmの吸光度と同等のトリクロロ酢酸可溶性分解物を遊離させる酵素量を1katal とした。また、酵素蛋白質1kg当たりの katal数で比活性を示した。
【0010】
以下、実施例により、本発明をさらに詳細に説明する。
【実施例1】
粗酵素の調製
小麦ふすま1,800gに水 1,500mlを加えて殺菌した後、リゾプス・ハンショウ (Rhizopus hangchow) IFO−4749株を接種し、25℃で4日間培養した。培養後、得られた麹に20mMリン酸緩衝液(pH7.0) 10,000mlを加え、低温室にて一夜抽出を行い、粗酵素液 7,350mlを得た。この粗酵素液を遠心分離した後、ホローファイバー(AIL−1010、旭化成社製) を用いて濃縮し、凍結乾燥して粗酵素粉末 15.5gを得た。このアスパルチック・プロティナーゼ粗酵素粉末の比活性は 7.9×10−3katal/kg蛋白質であった。また、アスパルチック・プロティナーゼ活性の収率は68%であった。
【0011】
アスパルチック・プロティナーゼの精製
上記のようにして得られた粗酵素粉末 10gを2mM酢酸カルシウム含有10mMクエン酸緩衝液(pH 5.2) 100mlに懸濁し、2時間撹拌して溶解した後、遠心分離 (15,000×g、20分) し、得られた上清を同緩衝液に対して透析した。透析後、遠心分離 (15,000×g、20分) し、その上清を粗酵素液とした。
この上清に35%濃度となるよう硫安を穏やかに加え、遠心分離 (10,000×g、20分) し、その上清を35%硫安画分上清とした。比活性は 8.7×10−3katal/kg蛋白質であった。
【0012】
この35%硫安画分上清を予め35%硫安濃度の2mM酢酸カルシウム含有10mMクエン酸緩衝液(pH 5.2)で平衡化したButyl−TOYOPEARL 650M (東ソー株式会社製) に供した。そして、35〜0%硫安濃度直線濃度勾配により活性画分を溶出し、その溶出液をButyl−TOYOPEARL 650M溶出活性画分とした。比活性は 9.1×10−3katal/kg蛋白質であった。
【0013】
このButyl−TOYOPEARL 650M溶出活性画分を2mM酢酸カルシウム含有10mMクエン酸緩衝液(pH 5.0)に対して充分透析した後、同緩衝液で平衡化したDEAE−TOYOPEARL 650S(東ソー株式会社製) に供した。そして、0〜0.5M塩化ナトリウム直線濃度勾配により活性画分を溶出し、その溶出液をDEAE−TOYOPEARL 650S 溶出活性画分とした。比活性は15.8×10−3katal/kg蛋白質であった。
【0014】
このDEAE−TOYOPEARL 650S 溶出活性画分を2mM酢酸カルシウム含有10mMクエン酸緩衝液(pH 3.0)に対して十分透析した後、同緩衝液で平衡化したSP−TOYOPEARL650M(東ソー株式会社製) に供した。そして、0〜0.75M 塩化ナトリウム直線濃度勾配により活性画分を溶出し、その溶出液をSP−TOYOPEARL 650M 溶出活性画分とした。
【0015】
このSP−TOYOPEARL 650M 溶出活性画分をミリQ水に対して十分透析し、凍結乾燥して精製アスパルチック・プロティナーゼ 212mgを得た。このようにして得られた精製アスパルチック・プロティナーゼは、電気泳動的に単一であり、比活性は11×10−3katal/kg蛋白質であった。また、アスパルチック・プロティナーゼ活性の収率は8%であった。
【0016】
【試験例1】
実施例1で得られたアスパルチック・プロティナーゼのトリプシノーゲン活性化反応を調べた。 2.5mM塩酸に0.5mg/ml濃度となるようトリプシノーゲンを溶解した溶液25μl 、10mMクエン酸ナトリウム緩衝液(pH 3.0)50μl 、酵素液25μl を混合し、30℃で活性化反応を行った後、0.3Mトリス−塩酸緩衝液(pH 8.3) 0.5ml、水 0.9mlを加えて反応を停止した。そして、この溶液に10mM Bz−Arg−MCA 5μl を加えて30℃で反応させた後、Fluorescence Spectrophotometer F−3000(株式会社日立製作所製) を用いて励起波長 360nm、蛍光波長 440nmにて蛍光強度を測定した。この条件において、1秒間にトリプシノーゲン1moleを活性化するのに必要な酵素量を1katal とした。その結果、本発明のアスパルチック・プロティナーゼのトリプシノーゲン活性化反応における比活性は13.9×10−3katal/kg蛋白質であった。
【0017】
【試験例2】
実施例1で得られたアスパルチック・プロティナーゼのアレルゲン蛋白質に対する分解能を調べた。2%αS −カゼイン(pH 3.0)5μl 及び2%β−ラクトグロブリン(pH 3.0)5μl を基質とし、酵素溶液(pH 3.0)5μl をそれぞれ加え30℃で反応させた後、0.8Mトリクロロ酢酸5μl を加えることにより反応を停止させた。この反応液を30℃で20分間以上放置した後、遠心分離 (15,000×g、20分) して沈澱物を得た。そして、この沈澱物を SDS化した後、SDS−PAGEに供して分解の様子を見た。
その結果を図4に示す。本発明のアスパルチック・プロティナーゼは、αS −カゼインは分解するが、β−ラクトグロブリンは分解しないことが判った。
【0018】
【試験例3】
実施例1で得られたアスパルチック・プロティナーゼの酸化インシュリンB鎖に対する基質特異性を調べた。酸化インシュリンB鎖 (シグマ社製) を HPLC TSK−gel ODS−120Tに供して精製したものを基質として用い、30℃、pH 3.0で酵素反応を行った。25%アンモニア水を1/10量加えることによって反応を停止した後、減圧乾固し 0.1%TFA に溶解して試料とした。この試料を HPLC TSK−gel ODS−120Tに供してピークを分取し、各ピークのアミノ酸配列をペプチドシークェンサー(Applied Biosystems 477A Protein sequencer;アプライド・バイオシステムズ社製) で分析して、切断点及び切断の順序を決定した。
本発明のアスパルチック・プロティナーゼは、 Leu15−Tyr16及び Tyr16−Leu17の二つのペプチド結合を初期に切断し、さらに、 Leu11−Val12、 Ala14−Leu15及び Phe24−Phe25を切断することが判った。
【0019】
【試験例4】
実施例1で得られたアスパルチック・プロティナーゼの凝乳活性を調べた。1レーン当たり 0.1μg 、 0.5μg 、 1.0μg となるよう酵素を供し、15V/cmで2時間、アガロース電気泳動を行った。泳動後、ゲルを 0.15M酢酸緩衝液(pH 5.3)に浸漬し、30分間、室温に放置した後、スキムミルク−アガロースプレートに載せた。37℃で2時間反応させた後、0.02% amido blackを加えて20分間染色し、水洗した後、5% glycerol を含む 0.01M酢酸緩衝液(pH 5.8)で脱色した。また、比較例として、アスペルギルス・サイトイ(Aspergillus saitoi) 由来のアスパルチック・プロティナーゼについても同様の試験を行った。
その結果を図5に示す。本発明のアスパルチック・プロティナーゼは、アスペルギルス・サイトイ(Aspergillus saitoi) 由来のアスパルチック・プロティナーゼよりも強い凝乳活性を有することが判った。
【0020】
【発明の効果】
本発明のアスパルチック・プロティナーゼは、pH2〜7で安定であり、酸性領域で蛋白質を良好に分解することから、胃液で分泌されるペプシンの代替品として有用であると共に、pH3〜4で膵臓由来のトリプシノーゲンを活性化することから、十二指腸で分泌されるエンテロキナーゼの代替品としても有用である。
また、本発明のアスパルチック・プロティナーゼは、ペプシンとエンテロキナーゼの二つの機能を有する消化酵素であり、αS −カゼインの分解能を有するので、消化管が未成熟な新生児のための消化剤として用いることにより、新生児にとって問題となる乳や卵などのアレルギーを予防することが可能となる。
さらに、本発明のアスパルチック・プロティナーゼは、雑菌に汚染され難い酸性領域で高い活性を示すので、調味料や低アレルゲン化食品などの食品素材を製造する際に用いる蛋白質分解酵素としても最適である。
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明のアスパルチック・プロティナーゼのトリプシノーゲン活性化に対するpHの影響を示す。
【図2】本発明のアスパルチック・プロティナーゼのトリプシノーゲン活性化に対するpHの安定性を示す。
【図3】本発明のアスパルチック・プロティナーゼの円偏光二色性スペクトルの測定結果を示す。
【図4】本発明のアスパルチック・プロティナーゼによるアレルゲン蛋白質(αs −カゼイン、β−ラクトグロブリン)の加水分解を示す。
【符号の説明】L−L 1 , 6 :マーカー蛋白質L−L 2 , 3 , 4 :αs −カゼインL−L 7 , 8 , 9 ,10 :β−ラクトグロブリン
【図5】本発明のアスパルチック・プロティナーゼ及びアスペルギルス・サイトイ(Aspergillus Saitoi) から得られるアスパルチック・プロティナーゼの凝乳活性を示す。
【符号の説明】
L−L 1 , 2 , 3 :本発明のアスパルチック・プロティナーゼの凝乳活性
L−L 4 , 5 , 6 :アスペルギルス・サイトイのアスパルチック・プロティナーゼの凝乳活性
Claims (2)
- リゾプス・ハンショウ (Rhizopus hangchow) IFO-4749 株が産生し、分子量約37,600(SDS-PAGE)を有し、次のN末端アミノ酸配列を有するアスパルチック・プロティナーゼ。
Ser-Gly-Ser-Gly-Val-Val-Phe-Met-Thr-Asp-Tyr-Glu-Tyr-Asp-Ile-Glu-Tyr-Tyr-Gly- - 以下の性状をもつ請求項1記載のアスパルチック・プロティナーゼ。
1) 至適 pH は pH3 〜 4 である。
2) pH2 〜 7 で pH 安定性があり、酸性領域でタンパク質を良好に分解する。
3) αs - カゼインを分解する。
4) pH3 〜 4 でトリプシノーゲンを活性化する。
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JP26166194A JP3547021B2 (ja) | 1994-09-30 | 1994-09-30 | 新規アスパルチック・プロティナーゼ |
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JPH0898685A JPH0898685A (ja) | 1996-04-16 |
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1994
- 1994-09-30 JP JP26166194A patent/JP3547021B2/ja not_active Expired - Fee Related
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