JPH0231950B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は食菌から得られるアミノペプチダーゼ
およびその製造法に関し、さらに詳しくはシメジ
として知られるヒラタケ（pleurotus ostreatus
（Fr.）Que′l）子実体から抽出して得られるアミ
ノペプチダーゼに関する。

従来、特異的なアミノペプチダーゼとしては、
アミノ末端がアルギニンまたはリジンであるペプ
チドを特異的に分解するアミノペプチダーゼＢ、
アミノ末端がアシルアミノ酸であるペプチドを特
異的に分解する哺乳動物臓器由来のアシルアミノ
酸遊離酵素、アミノ末端がピログルタミン酸であ
るペプチドを特異的に分解するピロリドニルペプ
チダーゼ、その他作用に多少の差はあるもののア
ミノ末端が任意のアミノ酸であるペプチドを分解
する動物由来あるいは微生物由来の各種アミノペ
プチダーゼが知られている。

本発明者らはヒラタケ子実体に存在するアミノ
ペプチダーゼについて鋭意研究を行なつた結果、
アミノ末端が、フエニルアラニン、チロシン、ト
リプトフアンなどの芳香族アミノ酸であるペプチ
ドを特異的に分解するアミノペプチダーゼを見出
し、本発明を完成するに至つた。

本発明の目的は、従来みられなかつた芳香族ア
ミノ酸をアミノ末端とするペプチドに特異的に作
用するアミノペプチダーゼを提供することにあ
り、本目的は本発明のアミノペプチダーゼA₁に
よつて達することができる。

本発明のアミノペプチダーゼA₁は、次に示す
酵素化学的性質を有するものである。

１ 分子量：76000（ゲルろ過法） ２ 安定PH（４℃に５時間に保つたとき活性残存
率100％のPH範囲）：7.2〜8.7 ３ 作用至適PH：7.4 ４ 熱安定性：20ｍＭトリス・塩酸緩衝液（PH
7.4）に溶解し各温度に10分保持したとき 活性が100％残存する限界温度 45℃ 活性が０となる温度 70℃ ５ 作用至適温度：40℃ ６ 等電点：4.41 ７ 金属イオンの影響： Cu²⁺（１ｍＭ）96％阻害 Zn²⁺（１ｍＭ）98％ 〃 Hg²⁺（１ｍＭ）72％ 〃 Co²⁺（１ｍＭ）24％ 〃 ８ 阻害剤：エチレンジアミンテトラアセテート
（EDTA）、ｐ−クロロメルキユリベンゾエー
ト（PCMB）等による阻害うけない。

９ 基質特異性：0.2M燐酸塩緩衝液（PH7.4）に
基質（5.0ｍＭ）を溶解した基質溶液に酵素液
を加え、37℃に保持し、Phe−βNAの分解率を
100％としたときの各基質の分解率 基 質 分解率（％） Phe βNA 100 Tyr βNA 64.7 Try βNA 21.6 Leu βNA 15.0 Leu pNA 13.9 Met βNA 6.4 Pro βNA 0.9 Ala pNA 0.2 Ile βNA 0.1 Val βNA 0.1 His βNA ＜0.1 Arg βNA ０ Lys βNA ０ Ser βNA ０ Cys di βNA ０ Glu pNA ０ Gly pNA ０ 但し、βNAはβ−Naphthylamide pNAはｐ−Nitroanilide を表わす。

本発明のペプチダーゼA₁の製造法は、ヒラタ
ケ子実体又は菌体から、中性附近の塩溶液を用い
て抽出を行ない、得られる抽出液を精製すること
を特徴とするもので、さらに詳しくは、ヒラタケ
子実体を細断したもの又は菌体から中性附近の塩
溶液を用いて抽出を行ない、例えば、得られる抽
出液に硫酸アンモニウムを加え、生じた沈殿を分
取し、さらに水を溶解した後、硫酸アンモニウム
を除去し、陰イオン交換セルロースクロマトグラ
フイ、ゲルろ過法、電気泳動法などによつて分
離、精製して得られるものである。

本発明において用いるヒラタケは、自家で、酵
母エキス、麦芽エキス、ブドウ糖を含む通常の培
地（PH５〜６）を用いて20〜25℃で培養したヒラ
タケ菌体を用いてもよいが、シメジの名で汎く市
販されているヒラタケやタモギタケの菌体を用い
てもよい。自家培養を行なう場合には、静置培養
法、振とう培養法いずれによつてもよいが、前者
の場合には通常20〜25℃で14日間、後者の場合に
は通常、同温度範囲で10〜14日間培養を行なう。

入手した市販ヒラタケは菌柄に附着している菌
子塊などを除去したのち、細断する。次の抽出工
程の工率を考慮すると可成り細かくすることが望
ましい。

細断したヒラタケ子実体又は菌体に中性附近に
PHを有する塩溶液を加え、ブレンダーで処理し、
直ちに遠心分離して抽出し液を得る。抽出に用い
る溶液の塩濃度は0.05〜0.5Mの範囲にある。
0.05M以下の濃度では抽出が不充分となり、収量
が低下するおそれがあり、0.5Mを超える濃度で
は装出効果に有意がみられないので、特に高濃度
に対する必要はない。また塩溶液に替えて水を用
いても抽出することはできるが、収量が悪く、ま
た酵素の安定性の面からみてあまり好ましくな
い。

このようにして得られた抽出液に硫酸アンモニ
ウムを加え、0.45飽和で生じた沈殿を除去し、更
に硫酸アンモニウムを加えて0.75飽和とし、生じ
た沈殿を分取する。本硫酸アンモニウム処理は４
℃以下の低温下で行なうのが望ましい。

得られた沈殿は溶解し、透析など通常の手段に
よつて硫酸アンモニウムを除去し、陰イオン交換
セルロース、例えばジエチルアミノエチルセルロ
ース（以下DEAE−セルロースと略記する）カラ
ムに負荷し、溶離液に添加する中性塩の濃度を直
線的に高めながら溶出を行なつて、溶出液中にア
ミノペプチダーゼ画分を得る。当該画分について
中性塩を除去後、再度同様に処理する。溶離液は
PHが中性である緩衝液であれば何れを用いること
もでき、その濃度は0.1M好ましくは0.05M以下
が望ましい。添加する中性塩は特に制約されるも
のではないが塩化カリウム、塩化ナトリウムなど
で充分であり、その濃度は０から0.7Mまで直線
的に高められる。イオン交換クロマトグラフイに
よつて得られるアミノペプチダーゼ画分について
ゲルろ過を行ない、さらに精製を行なう。この場
合に用いる溶媒は、PHが中性附近にある緩衝液で
あれば何れを用いても差し支えなく、その濃度は
0.5M以下が好ましく、このような緩衝液に前記
のような中性塩を加えたものである。

ゲルろ過によつて得られるアミノペプチダーゼ
画分は、通常の調製用電気泳動を行ない、当該画
分に相当する部分について緩衝液を用いて抽出を
行ない、アミノペプチダーゼを得る。抽出に用い
る緩衝液はPHが中性、濃度0.5M以下のものであ
れば何れをも用いることができる。

かくして、本発明のアミノペプチダーゼA₁を
得ることができる。

本発明のアミノペプチダーゼA₁は、アミノ末
端が芳香族アミノ酸であるペプチド以外には、ア
ミノ末端がロイシン、メチオニン、プロリンなど
であるペプチドをも分解するが、その分解の程度
はフエニルアニランの場の約1/10以下と極めて低
く、その他のアミノ酸がアミノ末端であるペプチ
ドは僅かに分解するかあるいは全く分解しない。
本発明のアミノペプチダーゼA₁のように芳香族
アミノ酸をアミノ末端とするペプチドに特異的に
作用するアミノペプチダーゼは従来は全く知られ
ておらず、このような特異性を有する本発明のア
ミノペプチダーゼA₁は全く新規なものである。

本発明のアミノペプチダーゼA₁は、蛋白質の
構造解析に有用であるばかりでなく、蛋白質の修
飾にも有用であり、これらによつて蛋白質性ある
いはペプチド性医薬品、食品の安全性を増加せし
める可能性を有する。

次に実施例によつて本発明をさらに詳細に説明
するが、本発明はその要旨を超えない限りこれら
によつて限定されるものではない。

実施例 １ 菌柄に附着している菌糸塊、他を除去して細断
した市販ヒラタケの生子実体500ｇに、0.1M塩化
カリウムを含む20ｍＭトリス塩酸緩衝液（PH7.2）
500mlを加え、ブレンダーで10分間処理し、１〜
２℃下において9000rpm、30分間遠心分離し、上
清に抽出液を得た。沈殿に再度同量の同緩衝液を
加え、同様に処理して得た上清を抽出液と混合し
てヒラタケ子実体抽出液1200mlを得た。

該抽出液1200mlに0.45飽和になるように硫酸ア
ンモニウムを加えて溶かし、４℃に３時間保つた
後、9000rpm、30分間遠心分離し、得られた上清
液にさらに0.75飽和になるように硫酸アンモニウ
ムを加えて溶かし、４℃に一夜放置し、
9000rpm、30分間遠心分離して生じた沈殿を分取
し、抽出液の約1/10容の20ｍＭトリス塩酸緩衝液
（PH7.2）に溶解し、同緩衝液に対して透析を行な
い、9000rpm、30分間遠心分離して上清に粗酵素
液を得た。予め20ｍＭトリス塩酸緩衝液（PH7.2）
を用いて緩衝化したDEAEセルロース（米国、ブ
ラウン社製）カラム（４×25cm）に粗酵素液を負
荷し、同緩衝液で洗浄後、同緩衝液中の塩化カリ
ウム濃度を０から0.7Mまで直線的に高めながら
流速240ml／hrで溶出を行ない、溶出液第2260〜
2440mlの画分200mlに粗アミノペプチダーゼ液を
得た。該液のアミノペプチダーゼは全活性1402単
位、比活性7.01単位であつた。

次いで、透析したアミノペプチダーゼ液を予め
同緩衝液用いて緩衝化したDEAEセルロースカラ
ム（2.5×15cm）に粗アミノペプチダーゼ液を負
荷し、同緩衝液で洗浄後、同緩衝液中の塩化カリ
ウム濃度を０から0.7Mまで直線的に高めながら
流速150ml／hrで溶出を行ない、溶出液第800〜
950mlの画分150mlをダイアフロー（Diaflow）
PM−10（米国、アミコン・フアーイースト・リ
ミテツド社製）を用いて濃縮し、5.5mlのアミノ
ペプチダーゼ液を得た。該液のアミノペプチダー
ゼは全活性450単位、比活性9.0単位であつた。

該酵素液を、予め0.1M塩化カリウムを含む20
ｍＭトリス・塩酸緩衝液（PH7.2）を用いて緩衝
化したセフアデツクス（スエーデン国、フアルマ
シヤ・フアイン・ケミカルズ社製）Ｇ−150カラ
ム（2.5×80cm）の下端より負荷し、同液を流速
15ml／hrで流して上昇法によるゲルろ過を行な
い、溶出液第190〜218mlの画分28mlにアミノペプ
チダーゼ液を得た。該液のアミノペプチダーゼは
全活性351単位、比活性9.0単位であつた。

アミノペプチダーゼ液（28ml）を1.2mlに濃縮
し、7.5％ポリアクリルアミドゲル（2.0×20cm、
PH9.3）に負荷し、４℃において85V、48時間電
気泳動を行ない、支持体第９〜9.75cmの部分
（2.0×0.75cm）を分取し、20ｍＭトリス・塩酸緩
衝液（PH7.2）６mlを加え、４℃に12時間保つて
抽出を行ない、さらに同様な抽出操作を３回行な
い、全抽出液を合して精製アミノペプチダーゼ
A₁溶液26mlを得た。該液のアミノペプチダーゼ
は全活性170単位、比活性17.0単位であり、同電
気泳動を行なつた後クマージーブリリアントブル
ー（Coomassie Brilliant Blue）による蛋白質
染色によつて単一バンドを示した。

アミノペプチダーゼの活性は0.5ｍＭの基質
（Phe−βNA）を含む0.2M燐酸塩緩衝液（PH7.4）
60μに酵素液240μを加え、37℃に保つて測定
した。このとき、１分間に1μmoleのβ−
naphthylamideを遊離する酵素量を１単位とし
た。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 次の酵素化学的性質を有するアミノペプチダ
   ーゼA₁ 分子量：76000（ゲルろ過法） 安定PH（４℃に５時間保つたとき活性残存率100
   ％のPH範囲）：7.2〜8.7 作用至適PH：7.4 熱安定性：20ｍＭトリス・塩酸緩衝液（PH7.4）
   に溶解し各温度に10分保持したとき 活性が100％残存する限界温度 45℃ 活性が０となる温度 70℃ 作用至適温度：40℃ 等電点：4.41 金属イオンの影響： Cu²⁺（１ｍＭ）96％阻害 Zn²⁺（１ｍＭ）98％ 〃 Hg²⁺（１ｍＭ）72％ 〃 Co²⁺（１ｍＭ）24％阻害 阻害剤：エチレンジアミンテトラアセテート
   （EDTA）、ｐ−クロロメルキユリベンゾエー
   ト（PCMB）等による阻害うけない。 基質特異性：0.2M燐酸塩緩衝液（PH7.4）に基質
   （5.0ｍＭ）を溶解した基質溶液に酵素液を加
   え、37℃に保持し、Phe−βNAの分解率を100
   ％としたときの各基質の分解率 基 質 分解率（％） Phe βNA 100 Tyr βNA 64.7 Try βNA 21.6 Leu βNA 15.0 Leu pNA 13.9 Met βNA 6.4 Pro βNA 0.9 Ala pNA 0.2 Ile βNA 0.1 Val βNA 0.1 His βNA ＜0.1 Arg βNA ０ Lys βNA ０ Ser βNA ０ Cys di βNA ０ Glu pNA ０ 但し、βNAはβ−Naphthylamide pNAはｐ−Nitroanilide を表わす。 ２ ヒラタケ子実体又は菌体から、中性附近の塩
   溶液を用いて抽出を行ない、得られる抽出液を精
   製することを特徴とする特許請求の範囲第１項に
   記載されたペプチダーゼA₁の製造法。