ES2264223T3

ES2264223T3 - Procedimiento de extraccion y uso de fluido de incubacion de salmon del atlantico.

Info

Publication number: ES2264223T3
Application number: ES98962724T
Authority: ES
Inventors: Bernt Th. Walther; Chunjun J. Rong
Original assignee: Aqua Bio Technology ASA
Current assignee: Aqua Bio Technology ASA
Priority date: 1997-12-11
Filing date: 1998-12-11
Publication date: 2006-12-16
Anticipated expiration: 2018-12-11
Also published as: WO1999029836A1; NO314594B1; EP1036166B1; JP4378052B2; NO975826D0; CY1105206T1; EP1036166A1; NZ504865A; NO975826L; US6346245B1; AU1789499A; HK1030968A1; AU761292B2; DK1036166T3; CA2314608A1; DE69834742D1; CA2314608C; DE69834742T2; ATE328072T1; JP2001526026A

Abstract

Una preparación que contiene una enzima, denominada zonasa, en la que dicha preparación presenta una banda de proteína en análisis de SDS-PAGE, con un peso molecular de alrededor de 28 kDa, obtenible por un método que comprende las etapas de: a) suspender huevos de salmón en un volumen mínimo de agua, b) inducir incubación rápida, sincronizada, de dichos huevos de salmón; c) filtrar los huevos de salmón incubados para obtener fluido de incubación; d) añadir urea sólida a dicho fluido de incubación para permitir la disociación de fragmentos de cáscara de huevo de salmón y someter dicho fluido a centrifugación a baja velocidad, e) purificar adicionalmente dicha zonasa sometiendo el sobrenadante de centrifugación a filtración en gel; y f) purificar adicionalmente dicha zonasa por cromatografía de afinidad en una columna de Superose 6B modificada con benzamidina, en la que dicha cromatografía de afinidad se realiza efectuando lavados de sal concentrada seguidos por elución con dioxano, en solución de sal concentrada, para extraer zonasas unidas a la matriz de cromatografía o a estructuras macromoleculares; en el que dicha zonasa tiene las siguientes propiedades: a) divide cromozima X; b) es inhibida por benzamidina; c) divide enlaces péptido con arginina; d) permanece activa en presencia de urea 8 M, concentraciones molares de sal, agua destilada y disolventes orgánicos, preferiblemente dioxano o propanol; y e) retiene actividad enzimática en solución a temperatura ambiente durante 50 días.

Description

Procedimiento de extracción y uso de fluido de incubación de salmón del Atlántico.

La presente invención se refiere a un procedimiento para extraer enzimas de incubación endoproteolíticas (zonasas) en agua residual de piscifactorías que producen larvas de salmón del Atlántico y, además, establece un procedimiento simple para obtener hasta pureza de calidad de secuencia de estas endoproteasas especiales, que resultan para poseer características proteolíticas bastante únicas.

Las proteasas en estados purificados se usan crecientemente en investigación, en laboratorio y análisis clínicos, y en procedimientos de producción de alimentos. La demanda es creciente, especialmente para enzimas con propiedades que corresponden a aplicaciones específicas. Esto ha estimulado búsquedas de nuevas fuentes de proteasas que permitan modos de producción seguros, sostenibles y económicos.

Aquí se explota una nueva fuente rica de endoproteasas conectada a la acuicultura de salmón del Atlántico. Un aspecto esencial de esta industria es la producción en piscifactoría de huevos en desarrollo, que se incuban para producir larvas. La incubación se consigue por embriones que producen endoproteasas, que, cuando se segregan, resquebrajan abriendo eficaz y específicamente las cáscaras de huevos para permitir salir nadando a las larvas y comenzar su propia vida (Refs.: Yamagami 1988; Walther 1993).

Las enzimas críticas detrás de la incubación de peces se han caracterizado sólo en unos pocos peces y, en casi todos los casos, se han interpretado que estas zonasas son metaloproteasas (Refs.: Hagenmaier 1974; Ohzu & Kasuya 1979; Schoots & Denucé 1981; DiMichele et al. 1981; Yasumasu et al. 1989 a,b; Araki & Onozato 1990; Hung et al. 1997). Se ha dispuesto sólo recientemente de la estructura génica de algunas enzimas de tipo zonasa (Ref.: Yasumasu et al. 1992). Luberda et al. (1994, Arch. Hydrobiol., 131 (4), págs. 505-511) describen la purificación parcial de una metaloproteasa de fluido de incubación de varias especies de salmónidos. Rong y Walther (1994, 3rd International Marine Biotechnology Conference: Program, Abstracts and list of participants, Endoproteolytic Hatching Enzyme from Atlantic salmon (Salmo salar) Embryos'; University of Tromsoe, Noruega, pág. 127) describen la purificación de coriolisina de 20 kDa de fluido de incubación de salmón sin incubación sincronizada. Araki et al. (1996, Can. J. Fish. Aquat. Sci., 53, págs. 509-512) describen el aislamiento de una enzima de incubación de tipo coriolisina de fluido de incubación de salmón masu recogida sin incubación sincronizada.

Se ha informado también de enzimas de incubación putativas en invertebrados, donde de nuevo muchas de tales enzimas se ha interpretado que son metaloproteasas (por ejemplo, Barrett & Edward 1976; Lepage & Gache 1989; Roe & Lennarz 1990). Sin embargo, se ha informado de unos pocos casos firmes de zonasas de tipo serina proteasa (por ejemplo, Post et al. 1988). A la inversa, entre vertebrados superiores al pez, se ha informado también de enzimas de incubación putativas. Por ejemplo, Urch & Hedrick (1981; concerniente a anfibios) y Yamazaki et al. (1994; concerniente al ratón) indicaban zonasas que parecían ser serina proteasas. No se comprende por completo actualmente la razón fundamental biológica y bioquímica detrás de dos tipos diferentes de zonasas entre animales de incubación.

En salmón del Atlántico, se ha encontrado que las zonasas predominantes son serina proteasas. Están presentes en grandes cantidades en las aguas residuales y fluidos de incubación de huevos de salmón. En este estado acuoso crudo, las zonasas de salmón pueden prepararse eficazmente para purificación por técnicas convencionales. Esta fuente de zonasas ofrece una gran ventaja en comparación con el aislamiento de enzimas de embriones completos, porque evita eficazmente complicaciones de biomaterial extraño (cáscaras de huevos, embriones y larvas). Así, resulta simplificada en gran medida la purificación de enzimas.

Una ventaja adicional es que los huevos de salmón situados en desarrollo pueden transferirse a volúmenes mínimos de agua antes de incubar. Cuando se induce una incubación altamente síncrona por temperaturas elevadas (ambiente), o por desoxigenación (Oppen-Bernsten et al. 1990), esto produce un pequeño volumen de preparación de zonasas crudas altamente concentrada.

Un aspecto esencial adicional de este procedimiento es que, a pesar de la concentración creciente de las zonasas proteolíticas, se observó que permanecía intacta la estabilidad de las zonasas residentes. Además, es importante señalar que este procedimiento produce enzima zonasa en un medio de agua casi pura, que contiene como mucho NaCl
1 mM, pero en el que no obstante las zonasas poseen y conservan integridad enzimática total durante el tiempo. Esta preparación es por tanto un material de partida valioso para preparaciones subsiguientes de zonasas proteolíticas en diversos grados de purificación, hasta pureza de calidad de secuencia.

La presente invención se refiere a una preparación que contiene una enzima, denominada zonasa, en la que dicha preparación presenta una banda de proteína en análisis de SDS-PAGB, con un peso molecular de alrededor de 28 kDa, obtenible por un método que comprende las etapas de:

a): suspender huevos de salmón en un volumen mínimo de agua,

b): inducir incubación rápida, sincronizada, de dichos huevos de salmón;

c): filtrar los huevos de salmón incubados para obtener fluido de incubación;

d): añadir urea sólida a dicho fluido de incubación para permitir la disociación de fragmentos de cáscara de huevo de salmón y someter dicho fluido a centrifugación a baja velocidad,

e): purificar adicionalmente dicha zonasa sometiendo el sobrenadante de centrifugación a filtración en gel; y

f): purificar adicionalmente dicha zonasa por cromatografía de afinidad en una columna de Superose 6B® modificada con benzamidina, en la que dicha cromatografía de afinidad se realiza efectuando lavados de sal concentrada seguidos por elución con dioxano, en solución de sal concentrada, para extraer zonasas unidas a la matriz de cromatografía o a estructuras macromoleculares;

en el que dicha zonasa tiene las siguientes propiedades:

a): divide cromozima X;

b): es inhibida por benzamidina;

c): divide enlaces péptido con arginina;

d): permanece activa en presencia de urea 8 M, concentraciones molares de sal, agua destilada y disolventes orgánicos, preferiblemente dioxano o propanol; y

e): retiene actividad enzimática en solución a temperatura ambiente durante 50 días.

La presente invención proporciona también un método para preparar una preparación que contiene una enzima, denominada zonasa, que comprende las etapas de:

a): suspender huevos de salmón en un volumen mínimo de agua,

b): inducir incubación rápida, sincronizada, de dichos huevos de salmón;

d): añadir urea sólida a dicho fluido de incubación para permitir la disociación de fragmentos de cáscara de huevos de salmón y someter dicho fluido a centrifugación a baja velocidad;

e): purificar adicionalmente dicha zonasa sometiendo al sobrenadante de centrifugción a filtración en gel; y

f): purificar adicionalmente dicha zonasa por cromatografía de afinidad, en la que dicha cromatografía de afinidad se realiza efectuando lavados de sal concentrada seguidos por elución con disolventes orgánicos, en solución de sal concentrada, para extraer zonasas unidas a la matriz de cromatografía o a estructuras macromoleculares.

Son realizaciones preferidas de tales preparaciones y métodos como se describe en las reivindicaciones.

La invención proporciona además un método para inhibir proteólisis por una zonasa de salmón en una preparación de la invención, que comprende el uso de pequeñas cantidades de \beta-mercaptoetanol y la separación del inhibidor por evaporación. En un aspecto adicional todavía, la presente invención proporciona el uso de una preparación de la invención para proteólisis o proteólisis inversa (síntesis) de proteínas en agua pura o disolventes orgánicos no acuosos.

Ejemplo 1 Preparación concentrada de zonasa cruda de salmón del Atlántico

La purificación inicial de zonasas implica sólo filtración de huevos de salmón incubados a través de gasa rectilínea. Tal filtrado puede congelarse durante años sin degradación de zonasa significativa, antes de descongelarse y emplearse para purificación de zonasa adicional. Este hecho simplifica en gran medida la producción de material de partida para purificar zonasas de salmón.

La siguiente etapa implica ajustar la "zonasa cruda" a usualmente urea 4 M, que disocia fragmentos de la cáscara de huevos de salmón y permite su separación junto con residuos extraños por centrifugación a baja velocidad (15.000 g; 2 x 15 min). Este material no muestra signos de columnas de obstrucción, que es característico de materiales crudos preparados de modo diferente del que se ha descrito antes. Una preparación de "zonasa cruda" adecuada para purificación por técnicas cromatográficas convencionales está así disponible. Es notable que las zonasas de salmón sean estables y activas catalíticamente en urea 4 o incluso 8 M. Además, esta preparación de zonasa de salmón es inhibida eficazmente sólo por inhibidores de tipo serina proteasa de proteasas.

Ejemplo 2 Zonasas purificadas de salmón del Atlántico

El producto extraído de la preparación de "zonasa cruda" puede escogerse en diferentes fases de purificación. No obstante, ya después de una ronda de filtración en gel, se separan zonasas de los mayores componentes moleculares en el filtrado con una purificación de 12 veces y un rendimiento mejor del 50%. Los componentes mayores presentes en la "zonasa cruda" parecen ser en su mayor parte fragmentos solubles de la cáscara de huevos, a los que se unen estrechamente algunas zonasas. Es esencial desechar los contaminantes de alto peso molecular en esta fase temprana de purificación, porque su presencia por lo demás interferirá con, y bloqueará, el éxito de etapas de purificación subsiguientes. En otras palabras, la secuencia con la que se emprendan los métodos de purificación convencionales es un aspecto esencial del procedimiento.

La matriz utilizada puede variar, pero la elección habitual de los inventores es Sephacryl SR-200®. El tapón fue Tris-HCl pH 8,0 o pH 8,5 (0,05 M) o Tris-Acetato (0,025 M, iguales pHs). Las zonasas obtenidas después de los procedimientos de filtración en gel totalizan los restos de zonasa predominantes en la "zonasa cruda", y la actividad enzimática era inhibida catalíticamente por benzamidina.

En términos de proteínas, las zonasas totalizan aproximadamente el 10% del material ya en esta fase. Esta zonasa de salmón parcialmente purificada es nuevamente inhibida sólo por inhibidores de tipo serina proteasa.

Ejemplo 3 Zonasa como un producto proteínico homogéneo

Debido a la inhibición de zonasa por benzamidina, las fracciones de enzima retardadas en columnas de filtración en gel pueden fácilmente purificarse adicionalmente por cromatografía de afinidad en columnas de Benzamidine
Sepharose 6B® disponibles comercialmente. Esta etapa permite una purificación de 7,5 veces para una purificación total de 94 veces global sobre la "zonasa cruda", con un rendimiento del 37% de actividad.

Las condiciones específicas utilizadas (con columnas de volúmenes de 25 o 125 ml) fueron nuevamente un tampón de Tris-HCl 0,05 M (pH 8 u 8,5), que, para separar material unido no específicamente en las columnas, se ajustó a NaCl 1 M. No se separan zonasas por esta etapa, porque permanecen unidas estrechamente a la columna. El éxito de esta etapa es debido críticamente a la elución de zonasas de la columna usando un gradiente del 10-33% de dioxano en NaCl 1 M en el mismo tampón de Tris-HCl. Este procedimiento depende de la estabilidad inusual de zonasas de salmón en disolventes orgánicos.

Tras purificación por afinidad, la preparación de zonasa presenta una banda de proteína en análisis de SDS-PAGE, con un peso molecular de alrededor de 28 kDa. Este resto de zonasa era fuertemente antígeno, permitiendo la producción de anticuerpos policlonales que reconocen específicamente zonasas de salmón, pero no otras serina proteasas de salmón tales como tripsinas de salmón. Inversamente, anticuerpos policlonales para tripsinas de salmón no reconocen zonasas de salmón, estableciendo zonasa de salmón como un producto distinto de salmón embriónico. Sin embargo, este producto de zonasa no es de pureza de calidad secuencia, como se revela por procedimientos de Edman para su secuencia N-terminal. No obstante, más allá de la docena inicial de etapas de determinación de secuencia N-terminal, se mostró que la secuencia de aminoácidos total de esta proteína era similar a zonasas puras. Esta preparación de zonasa de salmón altamente purificada es también inhibida específicamente sólo por inhibidores de tipo serina proteasa.

Ejemplo 4 Zonasa preparada con pureza de calidad secuencia

Las zonasas de salmón purificadas por filtración en gel más purificadas por afinidad pueden purificarse adicionalmente a pureza de calidad secuencia por un procedimiento cromatográfico final. Este procedimiento emplea una columna PBE94®, con un tampón de Tris-Acetato (10 mM, pH 9,0), donde la elución subsiguiente fue con un gradiente de sal (hasta sal NaCl 1 M) en este tampón. Esta etapa aumenta por si misma la actividad catalítica de las zonasas en 7,6 veces más, para una purificación total de 714 veces, y con un rendimiento del 28% a partir del material de partida.

Esta etapa de purificación deja la identidad proteínica de las zonasas intacta como un resto de 28 kDa. Por ello, esta etapa no separa contaminantes proteínicos principales no relacionados de la preparación de zonasa, como es acostumbrado para la purificación de proteínas, como se ilustra también en los Ejemplos 2 & 3. El peso molecular de zonasas purificadas es el mismo observado por técnica de manchas de Western para restos de zonasa presentes en el fluido de incubación y en la "zonasa cruda".

Lo que aparentemente tiene lugar en el tercero y final procedimiento cromatográfico es que se separan pequeños péptidos contaminantes. Estos péptidos parecen ser oligopéptidos con alrededor de una docena de residuos, que se originan más probablemente de la cáscara del huevo y/o del embrión de salmón. Estos contaminantes péptidos parecen ejercer efectos inhibidores sobre la catálisis de zonasa, porque su separación aumenta la actividad catalítica de zonasa. También, su presencia interfiere con las primeras etapas en la determinación de secuencia de Edman de este producto de zonasa. Las dos formas de zonasas vistas en esta tercera etapa de purificación se unen de manera algo diferente a la matriz de la columna. Sin embargo, ambas formas tienen secuencias de aminoácidos similares en sus porciones N-terminales.

Las secuencias de aminoácidos parciales de péptidos generados por CNBr establecieron las zonasas como proteínas distintas. El análisis estructural produjo indicaciones de que las zonasas pueden tener dominios catalíticos y de unión a sustrato distintos, lo que puede justificar su sensibilidad a agentes de quelación de calcio cuando actúan en sustratos macromoleculares (fisiológicos) (la unión es inhibida, por lo que la catálisis es inhibida indirectamente), y también sensibilidad a inhibidores de serina proteasa cuando actúan en sustratos pequeños (la catálisis es inhibida directamente).

Ejemplo 5 Propiedades químicas de zonasas de salmón

La acción catalítica de zonasas no es afectada por la presencia de sal en concentración molar, siendo casi tan eficaz en agua destilada como en sal 6 M. La enzima es esencialmente igualmente activa entre pH 7 y 9. Sin embargo, la zonasa es inactivada por debajo de pH 4 y sólo débilmente activa a pH 6. La zonasa no es afectada por la presencia de urea 8 M. La zonasa puede guardarse a temperatura ambiente (con y sin urea) durante cincuenta días con sólo una pérdida mínima de actividad enzimática. La actividad enzimática tampoco es dificultada por incluso 40% (v/v) de disolventes orgánicos tales como dioxano o propanol. Como contraste, la enzima es inactivada fácilmente por 10% (v/v) de 2-mercaptoetanol, que puede separarse seguidamente por evaporación a 50ºC. La catálisis es máxima a 42ºC (usando el sustrato comercial cromozima X (de Boehringer)), observándose poca pero significativa acción catalítica por encima de 65ºC, o después de calentar hasta 90ºC durante 5 min, y enfriar y ensayar seguidamente a temperatura ambiente.

Ejemplo 6 Características catalíticas de zonasas de salmón

Las zonasas de salmón en cuestión dividirán una serie completa de sustratos de cromozima, mostrándose una avidez máxima para enlaces péptido con aminoácidos básicos (preferiblemente arginina). Con estos pequeños sustratos artificiales, las zonasas son tan activas como otras serina proteasas, pero la K_{M} = 14 \muM, es más baja. La Vmax es igual a 1,3 \muM/min y la Kcat/\muM es 57 (/mM s), en comparación con un valor de aproximadamente 1 para tripsinas de bovino y porcino (catiónicas). El alto grado de especificidad en términos de división de enlaces péptido en comparación con otras serina proteasas tales como tripsina, es mostrado mediante el uso de zr-proteínas de cáscara de huevo (Véase: Walther 1993) como sustrato: la tripsina dividirá estas proteínas en muchos fragmentos pequeños, mientras que se observa que las zonasas degradan difícilmente lo que es su sustrato fisiológico.

La especificidad observada de la acción de zonasa de salmón refleja por supuesto exactamente lo que se requiere de una zonasa: tales enzimas deben destruir rápidamente la integridad mecánica, pero no la química, de las proteínas de la cáscara del huevo, de modo que el embrión pueda salir del huevo. Para hacer esto de manera rápida en presencia de cantidades extraordinariamente altas del sustrato de cáscara de huevo, se requiere que sólo un número mínimo de enlaces péptido se ataquen específicamente. Sin embargo, por exposición prolongada a su sustrato, las zonasas dividirán también eventualmente otros enlaces péptido. Se ha observado esta especificidad de secuencia en términos de proteólisis, pero no se ha delineado todavía con detalle químico. No obstante, las zonasas parecen poseer excelentes perspectivas en términos de conseguir divisiones específicas en diversas proteínas candidatas, como no se ha conseguido hasta ahora usando preparaciones de enzimas comerciales que poseen (otras) propiedades específicas para el lugar, por ejemplo, los productos de Boehringer Asp-N y Glu-C. Así, las zonasas se clasifican al lado de enzimas comerciales que han encontrado uso en trabajo analítico preparatorio de determinación de secuencia de proteínas, produciendo péptidos definidos de las proteínas grandes de secuencia a determinar. Así, este rasgo de la enzimología de zonasas de salmón puras es valioso comercialmente.

Referencias a trabajo relacionado (Categoría A)

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Barrett, D. \textamp Edward, DF	(1976) Methods. Enzymol.	45: 354-373
DiMichele, L. et al.	(1981) J. Exp. Zool.	216 (1): 133-140
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Hung, C-H et al.	(1997) J. Biol. Chem.	272(21): 772-13778
Lepage, T. \textamp Gache, C.	(1989) J. Biol. Chem.	264(9): 4787-4793
Ohzu, E. \textamp Kasuya, H.	(1979) Annot Zool. Japón	52(2): 125-132
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Post, LL et al.	(1988) Biochem. Cell Biol.	66 (11): 1200-1209
Roe, JL \textamp Lennarz, WJ	(1990) J. Biol. Chem	265(15): 8704-8711

Schoots, AF \textamp Denucé, M.	(1981) Int J. Biochem	13: 591-602
Urch, UA \textamp Hedricic, J.	(1981) Arch. Biochem. Biophys.	206: 424-431
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Yamagami, K.	(1988) en: Fish Physiol. vol. 11: págs. 447-499 San Diego
Yamazala, K. et al.	(1994) Devel., Growth \textamp Differ.	36 (2): 149-154
Yasumasu, S. et al.	(1989a) J. of Biochem.	105 (2): 204-21
Yasumasu, S. et al.	(1989b) J. of Biochem.	105 (2): 212-218
Yasumasu, S. et al.	(1992) Devel. Biology	153 (29): 150-258

Claims

1. Una preparación que contiene una enzima, denominada zonasa, en la que dicha preparación presenta una banda de proteína en análisis de SDS-PAGE, con un peso molecular de alrededor de 28 kDa,

obtenible por un método que comprende las etapas de

a): suspender huevos de salmón en un volumen mínimo de agua,

b): inducir incubación rápida, sincronizada, de dichos huevos de salmón;

en el que dicha zonasa tiene las siguientes propiedades:

a): divide cromozima X;

b): es inhibida por benzamidina;

c): divide enlaces péptido con arginina;

2. Una preparación según la reivindicación 1ª, en la que dicha filtración en gel se realiza en Sephacryl SR-200®.

3. Una preparación según las reivindicaciones 1ª o 2ª, en la que dicho método comprende adicionalmente la etapa de cromatografía de intercambio iónico y dicha preparación es de pureza de calidad secuencia.

4. Una preparación según la reivindicación 3ª, en la que dicha cromatografía de intercambio iónico se realiza en una columna de PBE94®.

5. Una preparación según una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 4ª, en la que dicho fluido de incubación se guarda a -80ºC durante años, o a temperatura ambiente durante meses, antes de usar.

6. Un método para preparar una preparación que contiene una enzima, denominada zonasa, que comprende las etapas de:

a): suspender huevos de salmón en un volumen mínimo de agua,

b): inducir incubación rápida, sincronizada, de dichos huevos de salmón;

7. Un método según la reivindicación 6ª, en el que dicha cromatografía de afinidad se realiza en una columna de Superose 6B® modificada con benzamidina.

8. Un método según las reivindicaciones 6ª o 7ª, en el que dicho disolvente orgánico es dioxano.

9. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 6ª a 8ª, en el que dicha filtración se realiza en Sephacryl SR-200®.

10. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 7ª a 9ª, en el que dicho método comprende adicionalmente la etapa de cromatografía de intercambio iónico.

11. Un método según la reivindicación 10ª, en el que dicha cromatografía de intercambio iónico se realiza en una columna de PBE94®.

12. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 6ª a 11ª, en el que dicho fluido de incubación se guarda a -80ºC durante años, o a temperatura ambiente durante meses, antes de usar.

13. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 6ª a 12ª, en el que dicha preparación de zonasa presenta una banda de proteína en SDS-PAGE, con un peso molecular de alrededor de 28 kDa, y dicha zonasa tiene las propiedades como se ha definido en la reivindicación 1ª.

14. Un método para inhibir proteólisis por una zonasa de salmón en una preparación como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 5ª, que comprende el uso de pequeñas cantidades de \beta-mercaptoetanol y separación del inhibidor por evaporación.

15. El uso de una preparación según una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 5ª, para proteólisis o proteólisis inversa (síntesis) de proteínas en agua pura o disolventes orgánicos no acuosos.