JP2001521496A

JP2001521496A - 高い結合活性の多価および多特異的試薬

Info

Publication number: JP2001521496A
Application number: JP54099398A
Authority: JP
Inventors: ジョンハドソン，ピーター; アンドリューコルト，アレックス; アレキサンダーアービング，ロバート; レズリーアトウェル，ジョン
Original assignee: コモンウェルスサイエンティフィックアンドインダストリアルリサーチオーガニゼーション
Priority date: 1997-03-27
Filing date: 1998-03-26
Publication date: 2001-11-06
Also published as: WO1998044001A1; AUPO591797A0; EP1005494B1; EP1005494A1; EP1997514A1; DE69840331D1; US20040071690A1; US20020018749A1; CA2285023A1; CA2285023C; EP1005494A4

Abstract

(57)【要約】本発明は、会合して３またはそれ以上の機能的標的結合領域（ＴＢＲｓ）を形成する３またはそれ以上のポリペプチドからなり、そして各個々のポリペプチドが一緒に共有結合している２またはそれ以上の免疫グロブリン様ドメインからなり、こうして単一のポリペプチド中の２つのＩｇ様ドメインは互いに会合してＴＢＲを形成しない、多価または多特異的タンパク質複合体に関する。３より少ないアミノ酸残基のリンカーペプチドを使用するすることによって、個々のポリペプチドの免疫グロブリン様ドメインの会合が防止され、こうしてポリペプチドの間の複合体形成が促進される。好ましくは、多価または多特異的タンパク質複合体は三量体または四量体である。本発明のタンパク質は、同一であるか、あるいは異なることができる特異性を有し、そして治療因子、診断因子または造影因子として使用するために適当である。

Description

【発明の詳細な説明】高い結合活性の多価および多特異的試薬本発明は、標的結合ポリペプチド、特に高い結合活性（avidity）および多特異性を有するポリペプチドに関する。特に、本発明は、多価および／または多特異的であり、そして特異性が好ましくは免疫グロブリン様ドメインの使用により提供される、タンパク質複合体に関する。１つの特定の態様において、タンパク質複合体は三価および／または三特異的である。発明の背景前以て決定した化学物質に特異的に結合する能力を有する試薬は診断剤として、あるいは化学療法剤をターゲッティングするために広く使用されている。抗体、特にモノクローナル抗体は、絶妙な特異性を有するために、化学的結合特異性源として非常に広く使用されてきている。モノクローナル抗体は分離された細胞系統、例えば、ハイブリドーマ細胞から誘導される；しかしながら、ハイブリドーマは費用がかかり、維持に時間がかかり、そして範囲が制限される。完全な範囲の標的抗原に対するモノクローナル抗体を生産することは不可能であり、適当なアフィニティーのモノクローナル抗体は非常に少ない。抗体の遺伝子またはそれらのフラグメントを生物学的に機能的な形態で大腸菌（E.coli）中でクローニングし、発現させることができる。また、組換えＤＮＡ技術により細菌または哺乳動物の細胞を使用して、抗体および抗体フラグメントを生産することができる。抗体のハプテン−または抗原−結合部位（本明細書において標的結合領域と呼ぶ）は、分子の末端において６までの可変表面ループにより提供されるアミノ酸残基から構成されている。外側ドメイン（Ｆｖ）中のこれらのループは相補性決定領域（ＣＤＲｓ）と命名され、そしてその抗原標的に対する抗体の結合の特異性を提供する。この結合機能は抗体分子の可変ドメインに局在化され、そしてこれらの可変ドメインは重鎖および軽鎖の双方のアミノ末端に位置する。これは第１図に図解されている。いくつか抗体の可変領域は、生来の抗体分子からタンパク質分解的に切断されてさえ、非共有結合的に会合(associate)したままであり（Ｖ_HＶ_Lドメイン、Ｆｖ領域と命名する）、そしてそれらの抗原認識能力および結合能力の大部分を保持する。一定領域を実質的に含まないＦ_V領域の製造方法は米国特許第４，６４２，３３４号に開示されている。組換えＦｖフラグメントは解離する傾向があり、したがって、幾人かの作業者は２つのドメインを共有結合してｓｃＦｖと表示する構築物を形成することを選択し、ここで結合ドメイン（通常抗体の重いおよび軽い可変領域）を有する２つの抗体は１つのドメインのＣ−末端を他のドメインのＮ−末端に接続するリンカーペプチドにより結合し、こうして抗原結合ドメインの相対位置はもとの抗体において見出される位置と一致する（第１図参照）。共有結合的に結合したＦｖフラグメントの製造方法は、米国特許第4,946,778 号および米国特許第5,132,405号に開示されている。二官能因子および多官能因子の製造により、それ以上の不均質性を達成することができる（Huston et al．、米国特許第5,091,513号、およびLadner et al．、米国特許第4,816,397号）。ｓｃＦｖライブラリーの構築は、例えば、欧州特許出願第239400 号および米国特許第4,946,778号に開示されている。しかしながら、ｓｃＦｖをコードする単一のＤＮＡ分子のクローニングにおいて固有の問題のために、一本鎖Ｆｖライブラリーは大きさが限定される。非ｓｃＦｖライブラリー、例えば、Ｖ_HまたはＦａｂライブラリーも知られており（LadnerおよびGuterman、WO90/02 809号）、そして表面の発現のためにファージ系とともに使用することができる（Ladner et al．、WO88/06630号およびBonnert et al.、WO92/01047号）。抗体療法において使用するために、モノクローナル抗体は、通常マウス由来であり、ヒトへ投与するとき抗原性応答を引き出すので、まず「ヒト化」しないかぎり、用途が制限される。抗体の可変ドメインは、抗体結合部位を形成する、６つの超可変領域（ＣＤＲｓ）を有するβ−シートのフレームワークから成る。ヒト化は、結合アフィニティーを提供するマウスの配列、特にＣＤＲループ配列をヒトの可変ドメイン構造の中に置換することを含んで成る。したがって、ネズミＣＤＲループ領域は必要な抗原に対する結合アフィニティーを提供する。ＣＤＲｓのグラフト化による組換え抗体の「ヒト化」は、Winter et al．（EP-239400 号）により開示された。発現／組合わせ系の使用による、多様な組換えヒト抗体の発現は記載された（ Marks et al.、1991）。フィラメント状ファージの表面上でペプチドおよびタンパク質を発現させる方法の最近の開発（McCafferty et al．、1991;Clackson et al．、1991）は、診断剤および治療剤としてこれらの試薬を選択し、改良し、そして開発する可能性を提供する。マウスおよびヒトの双方の起源のクローニングされた重鎖および軽鎖の遺伝子の発現、提示および対合のために、修飾されたバクテリオファージのゲノムを使用することは記載された（Hoogenboom et al．、1991;Marks et al．、前掲、およびBo nnert et al.、WPI Acc.No.92-056862/07）。レセプター分子を発現性微生物中でレセプター−コード遺伝子の結果として発現させ、また、同一の方法で表示させることができる（LernerおよびSorge、WO9 0/14430号）。細胞表面のタンパク質に融合した一本鎖抗体ドメインの細胞表面の発現は、Ladner et al．（WO88/06630号）により開示された。アフィニティー成熟は、抗体の結合特異性、アフィニティーまたは結合活性を修飾することができるプロセスである。抗原フラグメントの全体または選択された領域、例えば、ＣＤＲｓ上に、種々の突然変異の戦略の適用により、アミノ酸配列の多様性をつくる、多数の実験室的技術が案出されてきている。また、酵素の特異的活性を変化させる突然変異が報告された。ランダムまたは部位特異的突然変異誘発を達成し、そして所望の修飾を有する分子を選択する、種々の方法を当業者は知っているであろう。いわゆる「鎖シャフリング」(shuffling)技術、すなわち、１つの鎖の型、例えば、重鎖のライブラリーを固定された相補的鎖、例えば、軽鎖により再び類別する技術、によって、多様性を増加しかつ特異的抗体を選択するメカニズムは、また、記載された（Kang et al．、1991;Hoogenboo m et al.、1991;Marks et al．、1992）。本発明者らの初期の国際特許出願No.P CT/AU93/00491には、組換え構築物が記載されており、これらの構築物は安定なコアポリペプチド領域および少なくとも１つの標的結合領域を有する標的ポリペプチドをコードし、ここで１またはそれ以上の標的結合領域は安定なコアポリペプチド領域に共有結合で結合されており、そして必要に応じて成熟過程に付されて標的に対する結合の特異性、アフィニティーまたは結合活性が修飾された。ポリペプチドは自己会合して、安定な二量体、凝集物または配列を形成することができる。PCT/AU93/00491の全体の開示は、引用することによって本明細書の一部とされる。この明細書は、１つのＶドメインのＣ−末端が他のドメインのＮ−末端に結合されており、したがって外来リンカーポリペプチドを欠如するｓｃＦｖ−０構築物が三量体を形成するであろうことを予測しなかった。対照的に、この明細書はリンカーを組込んでいる構築物と同様に、それらが二量体を形成することを示唆した。トリ−マレイミド架橋因子（トリ−Ｆａｂと呼ぶ）を使用する化学的手段により形成された、三量体のＦａｂ’フラグメントが記載された（Schott et al ．、1993およびAntoniw et al.、1996）。これらのトリ−Ｆａｂ分子（また、ＴＭＦと呼ぶ）は結腸癌の放射線免疫療法のために潜在的因子として⁹⁰Ｙで標識化され、そして対応するＩｇＧに比較して、よりすぐれた治療効果を有し、副作用がより少ないことが示された。これは、多分単に低分子量よりむしろ架橋した抗体フラグメントの特質から生ずる、腫瘍の中へのいっそう急速な浸透およびいっそう急速な血液のクリアランスから生ずると考えられた（Antoniw et al.、1996 ）。しかしながら、これらの著者らは、ＩｇＧまたはＴＭＦ構築物のアフィニティーまたは結合活性を検査しなかった。２つの可変ドメインＶ_HおよびＶ_Lが柔軟なペプチドリンカーを介して共有結合されている、抗体の組換え一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）は、親Ｆａｂと同一のコンフォメーションでフォルドしていることが示された（Kortt et al.、 1994;Zdanov et al.、1994；第１９ａ図参照）。１２より多い残基のリンカーを有するｓｃＦｖは、安定なモノマーまたは二量体を形成し、通常モノマーの形態の親抗体と同一の結合の特異性およびアフィニティーを示し（WO31789/93、Bedz yk et al．、1990;Pantoliano et al.、1991）、そして共有結合により会合しない、Ｆｖフラグメントに比較して、改良された安定性を示し、そして低いタンパク質濃度において解離することができる（Glockshuber et al.、1990）。ｓｃＦｖフラグメントは、可溶性の、活性タンパク質として、大腸菌（E.coli）のペリプラスミック空間の中に分泌された（ Glockshuber et al.、1990;Anand et al．、1991）。二価または二重特異性のｓｃＦｖならびに二官能ｓｃＦｖ融合物を生産するために、種々のタンパク質を結合する戦略が使用されてきており、そしてこれらの試薬は臨床的診断および療法において多数の用途を有する（第１９ｂ図〜第１９ｄ図参照）。これらの結合戦略は、システイン残基をｓｃＦｖモノマーの中に導入し、次いでジサルファイド結合を導入して２つのｓｃＦｖを結合することを包含する（Cumber et al．、19 92;Adams et al．、1993;Kipriyanov et al.、1994;McCartney et al．、1995）。１対のｓｃＦｖ分子の間の結合は、また、第３ポリペプチドのリンカーを介して達成することができる（Gruber et al．、1994;Mack et al.、1995;Neri et a l.、1995；第１９ｂ図）。また、カッパ軽鎖の一定ドメイン（McGregor et al．、1994）、およびドメイン、例えば、ロイシンジッパーおよび４つのらせん束（ PackおよびPluckthun、1992;Pack et al.、1993、1995;MallenderおよびVoss、1 994；第１９ｃ図）の二量化性質を使用して、二重特異的または二価ｓｃＦｖ二量体が形成された。免疫グロブリンのドメインの会合のためのポリペプチドの三量体化もまた記載された（国際特許公開No.WO95/31540）。診断の用途のために分子のリガンド、例えば、ペプチドエピトープ（国際特許出願No.PCT/AU93/0022 8、Agen Limited;Lilley et al.、1994;Coia et al.、1996）、治療の用途のために酵素（Wels et al．、1992;Ducancel et al.、1993）、ストレプトアビジン（Dubel et al.、1995）、またはトキシン（Chaudhary et al.、1989、1990;Bat ra et al．、1992;Buchner et al．、19 92）を結合させることによって、二官能ｓｃＦｖ融合タンパク質が構築された。ｓｃＦｖの設計において、フォルドしかつ完全な結合部位を結合するドメインの能力に影響を与えないで、１つのドメインのカルボキシ末端と他のドメインのアミノ末端との間の３５Åの距離を架橋するように、ペプチドのリンカーは操作された（Bird et al．、1988;Huston et al.、1988）。種々のリンカーの長さおよび組成が研究され（Huston et al．、1991）そして１４〜２５残基のリンカーは３０を超える異なるｓｃＦｖ構築物において日常的に使用されてきている（WO 31789/93、Bird et al．、1988;Huston et al.、1988;WhitlowおよびFilpula、1 991;PCT/AU93/00491;Whitlow et al.、1993、1994）。最も頻繁に使用されているリンカーはHuston et al．（1988）により導入された１５残基のリンカー（Ｇｌｙ₄Ｓｅｒ）₃であり、セリン残基はペプチド主鎖の親水性を増強して溶媒分子への水素結合を可能とし、そしてグリシル残基はある範囲のコンフォメーションに適合する柔軟性をリンカーに提供する（Argos、1990）。また、これらの性質は、リンカーのペプチドと個々のドメインの疎水性界面との相互作用を防止する。Whitlow et al.（1993）は、１５残基より長いリンカーを有するｓｃＦｖがより高いアフィニティーを有することを示唆した。さらに、天然のリンカーのペプチドをベースとするリンカー、例えば、トリコデルマ・リーシエ（Trichoderma reesie）セロバイオヒドロラーゼＩの２８残基のドメイン間のペプチドは、Ｖ_H およびＶ_Lドメインを結合するために使用されてきている（Takkinen et al．、1 991）。Ｎ９ニューロアミニダーゼの優性エピトープ、すなわち、インフルエンザウイルスの表面糖タンパク質を認識する抗体ＮＣ１０のｓｃＦｖフラグメントが構築され、大腸菌（E.coli）中で発現された PCT/AU93/00491;Malby et al．、1993）。このｓｃＦｖにおいて、Ｖ_HおよびＶ_L ドメインは古典的１５残基のリンカー（Gly₄Ser）₃を使用して結合され、そしてこの構築物は同定およびアフィニティー精製のための標識としてＶ_L鎖のＣ−末端に結合された、親水性オクタペプチドを含有した（Hopp et al．、1988）。ｓｃＦｖ−１５は、高いタンパク質濃度で凍結したとき、比較的安定な二量体およびより高い分子量のマルチマーを形成するモノマーとして単離された。これらの二量体は活性であり、二価であることが示され（Kortt et al.、1994）、そして可溶性Ｎ９ニューロアミニダーゼの四量体と反応して、２つのニューロアミニダーゼ分子を架橋する４つのｓｃＦｖ二量体と一致する、約６００ｋＤａのＭｒを有する複合体を生ずる。NC10scFv-15モノマー−ニューロアミニダーゼ複合体に関する結晶学の研究において、非対称単位で２つのｓｃＦｖ−ニューロアミニダーゼ複合体が存在すること、そしてｓｃＦｖ分子の２つのＶ_HドメインのＣ−末端が密接に接触していることが示された（Kortt et al.、1994）。このパンキングが示すように、Ｖ_HおよびＶ_Lドメインはより短いリンカーと結合して、異なる分子からの対合するドメインを有する、安定な二量体構造を形成し、こうして二重特異的分子の構築のためのメカニズムを提供する（WO94/13804、PCT/AU93/004 91;Hudson et al.、1994、1995）。リンカーの長さを１２残基よりも短くすると、モノマーの立体配置を妨害し、２つのｓｃＦｖ分子を二量体のコンフォメーション（ダイアボディー（diabodie s）と命名する）にさせる（Holliger et al．、1993、1996;Hudson et al.、199 5;Atwell et al.、1996；第１９ｄ図）。これらの二価ｓｃＦｖ二量体のより高い結合活性は、腫瘍の造影、診断および治療のための利点を提供する（Wu et al ．、1996）。ビシストロンのベクターを使用して２つの異なるｓｃＦｖ分子、すなわち、Ｖ_HＡ−リンカー−Ｖ_LＢおよびＶ_HＢ−リンカー−Ｖ_LＡ、をin situで発現させることによって、二重特異的ダイアボディーが製造され、これらの分子は会合してＡおよびＢの親の特異性を形成する（WO94/13804;WO95/ 08577;Holliger et al．、1996;Carter、1996;Atwell et al.、1996）。これらの二重特異的ダイアボディーのいくつかにおける、５残基のリンカー配列、Gly₄ Ser、は、柔軟な、親水性リンカーを提供した。リンカーのポリペプチドを使用しないで、Ｖ_HのＣ−末端残基をＶ_LのＮ−末端残基に直接結合することによって、ｓｃＦｖ−０のＶ_H−Ｖ_L分子が設計された。 (Holliger et al，1993，McGuiness et al，1996)．これらのｓｃＦｖ−０構造物は従来二量体であると考えられてきた。我々は、今回、リンカーのポリペプチド中で直接一緒に結合するか、あるいは１つまたは２つ残基と結合された、Ｖ_HおよびＶ_Lドメインを有するNC10scFv分子を指令して、二量体より大きい多価分子を形成させ、そして好ましくは本発明の他の面において、三量体を形成させることができることを発見した。三量体は三価であり、３つの活性抗原結合部位（ＴＢＲｓ；標的結合領域）を有することを、我々は発見した。また、Ｖ_Hドメインに直接結合したＶ_Lドメインを有するNC10 scFv分子は、四価であり、４つの活性抗原結合部位（ＴＢＲｓ）を有する、四量体を形成できることを、我々は発見した。我々は、最初に、これらの三量体および四量体のコンフォメーションは、NC10 scFvに対してユニークであり、二量体の会合を妨害する、残基の間の立体のクラッシから生ずるであろうと考えた。しかしながら、モノクローナル抗イディオタイプ抗体11-1G10から構築された、直接結合したＶ_H−Ｖ_Lドメインを有する第２ｓｃＦｖが、また、三量体であり、三価であり、３つの活性ＴＢＲｓを有することを、我々は発見した。親抗体、ネズミ11-1G10、は、ネズミＮＣ４１抗体への結合について、もとの標的抗原、インフルエンザウイルスＮ９ニューロアミニダーゼ（ＮＡ）と競合する。我々は、また、直接結合したＶ_H−Ｖ_Lドメインを有する他のｓｃＦｖ（Ｃ２１５抗原に対して特異的なＣ２１５）も三量体であることを発見した。多価分子、特に三量体を形成する性向は、リンカーのポリペプチド中で直接一緒に結合するか、あるいは１つまたは２つ残基と結合された、Ｖ_HおよびＶ_Lドメインを有するｓｃＦｖの一般的性質であり、これは多分二量体の形成のためのＶ −ドメインの収縮に対して付与された拘束のためであることを、我々は、今回、提案する。当業者は認識するように、多価分子は三量体、四量体および高級のマルチマーとして容易に分離し、精製することができる。多数の抗原に対する多価の結合のために、三量体、四量体および高級のマルチマーは対応するモノマーまたは二量体の分子にわたって機能的アフィニティーの増加を示す。この改良された結合活性は、ポリマーのｓｃＦｖを治療および診断の試薬として特に魅力的なものとする。さらに、これらの分子の組換え生産のためにポリシストロンの発現ベクターを利用できることは、多特異的タンパク質の生産を可能とする。発明の要約本発明は、一般に、３またはそれ以上のポリペプチドが会合して３またはそれ以上の標的結合領域（ＴＢＲｓ）を形成する、多価または多特異的タンパク質複合体を提供する。タンパク質複合体は、非共有結合の相互作用を介するいくつかのポリペプチドの安定な会合として定義され、そして抗体のＦｖモジュールに典型的な、整列されたＶ−ドメインの表面を含むことができる（図１）。多価複合体を形成する個々のポリペプチドは同一であるか、あるいは異なることができ、好ましくは各々は免疫グロブリンのスーパーファミリーの任意のメンバーの少なくとも２つの免疫グロブリン様ドメインからなり、ここで免疫グロブリン様ドメインは、抗体、Ｔ細胞レセプターフラグメント、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８、またはＣＴＬＡ４を包含するが、これらに限定されない。明らかに理解されるように、各個々のポリペプチド分子上の免疫グロブリン様ドメインを結合するリンカーの長さは、一緒に会合してＦｖ、ＴＣＲまたはＣＤ８分子に類似する機能的標的結合領域（ＴＢＲ）を形成するのを防止するように選択される。リンカーの長さはまた、ダイアボディーの形成を防止するように選択される。その代わり、３またはそれ以上の別々のポリペプチド分子は一緒に会合して、３またはそれ以上の機能的標的結合領域を有する多価複合体を形成する。第１の面において、本発明は、３つの同一のポリペプチドからなる三量体タンパク質を提供し、ここでポリペプチドの各々は好ましくはポリペプチドのリンカーを使用しないで共有結合で結合された免疫グロブリンのＶ_HおよびＶ_Lドメインを含んでなり、ここでポリペプチドは会合して３つの活性ＴＢＲｓを有する三量体を形成し、三量体の各々は同一標的分子に対して特異的である。第２の面において、本発明は、３つの異なるポリペプチドを含んでなる三量体タンパク質を提供し、ここでポリペプチドの各々は好ましくはポリペプチドのリンカーを使用しないで共有結合で結合された、抗体のＶ_HおよびＶ_Lドメインまたは他の免疫グロブリンのドメインを含んでなり、ここでポリペプチドは会合して、３つの異なる標的に対して向けられた３つの活性ＴＢＲｓを有する三量体を形成する。第２面の１つの好ましい態様において、三量体は癌細胞表面の分子に対して向けられた１つのＴＢＲと、Ｔ細胞表面の分子に対して向けられた１つまたは２つＴＢＲｓとを含んでなる。第２の好ましい態様において、三量体は癌細胞表面の分子（三量体抗原）に対して向けられた１つのＴＢＲと、同一癌細胞上の異なる細胞表面の分子に対して向けられた第２ＴＢＲとを含んでなる。第３の好ましい態様において、三量体は同一の癌細胞表面の分子に対して向けられた２つのＴＢＲｓと、Ｔ細胞表面の分子に対して向けられた１つのＴＢＲとを含んでなる。第２の面の１つの好ましい態様において、三量体の１つのＴＢＲは、共同刺激性Ｔ細胞表面の分子、例えば、ＣＴＬＡ４、ＣＤ２８、ＣＤ８０およびＣＤ８６に対して向けることができる。本発明による特に好ましい三価または三特異的試薬は下記のものを包含する：１）３つの同一のＶ_H−Ｖ_L分子（ｓｃＦｖ×３）：これらはモノマーとして不活性であるが、３つの（同一の）抗原結合部位（ＴＢＲｓ）を有する活性三量体を形成する。２）３つの異なるＶ_H−Ｖ_L分子（ｓｃＦｖ×３）：これらはモノマーとして不活性であるが、３つの異なる抗原結合部位（ＴＢＲｓ）を有する活性三量体を形成する。第３の面において、本発明は、４つの同一のポリペプチドを含んでなる四量体タンパク質を提供し、ここでポリペプチドの各々は好ましくはポリペプチドのリンカーを使用しないで共有結合で結合された免疫グロブリンのＶ_HおよびＶ_Lドメインを含んでなり、ここでポリペプチドは会合して４つの活性ＴＢＲｓを有する四量体を形成し、四量体の各々は同一標的分子に対して特異的である。第４の面において、本発明は、４つの異なるポリペプチドを含んでなる四量体タンパク質を提供し、ここでポリペプチドの各々は好ましくはポリペプチドのリンカーを使用しないで共有結合で結合された、抗体のＶ_HおよびＶ_Lドメインまたは他の免疫グロブリンのドメインを含んでなり、ここでポリペプチドは会合して、４つの異なる標的に対して向けられた４つの活性ＴＢＲｓを有する四量体を形成する。第４面の１つの好ましい態様において、四量体は癌細胞表面の分子に対して向けられた１またはそれ以上のＴＢＲｓと、Ｔ細胞表面の分子に対して向けられた１またはそれ以上のＴＢＲｓとを含んでなる。第２の好ましい態様において、四量体は癌細胞表面の分子（三量体抗原）に対して向けられた１またはそれ以上のＴＢＲｓと、同一癌細胞上の異なる細胞表面の分子に対して向けられた１またはそれ以上のＴＢＲｓとを含んでなる。第４の面の１つの好ましい態様において、四量体の１つのＴＢＲは、共同刺激性Ｔ細胞表面の分子、例えば、ＣＴＬＡ４、ＣＤ２８、ＣＤ８０およびＣＤ８６に対して向けられる。明らかに理解されるように、本発明の多価または多特異的タンパク質を形成する分子は、任意の適当な方法により導入された修飾を含むことができる。例えば、１またはそれ以上のポリペプチドを生物学的に活性な物質、化学的因子、ペプチド、薬剤またはタンパク質に結合させる、あるいは部位特異的突然変異誘発またはランダム突然変異誘発により修飾して、分子または構築物の結合性質、安定性、生物学的活性または薬物速度論的性質を全体としてモジュレートすることができる。結合は任意の化学的手段により実施することができるか、あるいは本発明のタンパク質を他のタンパク質またはペプチドに結合すべき場合、これは適当な融合タンパク質を発現させる組換え手段により達成することができる。また、理解されるように、ドメイン間の架橋を実行する化学的修飾またはジサルファイド結合を導入して安定性を改良することができる。選択の戦略を使用して、このような修飾方法を使用して発生した望ましい変異型を同定することができる。例えば、ファージのディスプレイおよびアフィニティーの選択は非常によく知られており、この分野において広く使用されている。いわゆる「鎖シャフリング」技術、すなわち、１つの鎖の型、例えば、重鎖のライブラリーを固定された相補的鎖、例えば、軽鎖により再び類別する技術、によって、多様性を増加しかつ特異的抗体を選択するメカニズムは、また、記載された（Kang et al．、1991;Hoogenboom et al.、1991;Marks et al．、1992;Fig ini et al.、1994）。本発明の多価試薬を投与する被検者における免疫応答の発生を回避し、かつ反復治療を可能とするために、多価試薬構成する分子は治療すべき被検者と相同起源であるか、あるいは異種抗原をできるだけ除去するように修飾されていることが好ましい。したがって、レシピエントがヒトである場合、分子はヒト由来であるか、あるいはこのような分子のヒト化（ＣＤＲ−グラフト化）バージョンであろう。ＣＤＲｓのグラフト化による組換え抗体のヒト化はWinter et al．（EP-2 39400）により開示され、そして他の適当な方法、例えば、エピトープをインプリントした選択（Figini et al．、1994）もまたこの分野においてよく知られている。免疫グロブリン様ドメインを抗体から誘導する場合、ＴＢＲを任意の型の化学的実在物に対して向けることができる。例えば、それは小さい分子、例えば、農薬または薬剤、ホルモン、例えば、ステロイド、アミノ酸、ペプチドまたはポリペプチド；抗原、例えば、細菌、ウイルスまたは細胞表面の抗原；他の抗体または免疫グロブリンのスーパーファミリーの他のメンバー；腫瘍マーカー、成長因子およびその他に対して向けらることができる。当業者は、所望の目的に最も適当な抗原またはエピトープを容易に選択することができるであろう。第５の面によれば、本発明は、本発明による多価または多特異的試薬と、薬学上許容される担体とを含んでなる医薬組成物を提供する。第６の面によれば、本発明は、有効量の本発明による多特異的試薬を治療を必要とする患者に投与する過程を含んでなる、病理学的症状を治療する方法を提供し、ここで試薬の１つのＴＢＲはマーカーに対して向けられており、前記マーカーは、ａ）病理学的症状を引き起こす微生物の特徴を示すか、あるいはｂ）病理学的症状を発現する被検者の細胞の特徴を示し、そして前記試薬他のＴＢＲは病理学的症状の治療に適当な治療因子に特異的に結合する。好ましくは、試薬の２つの異なるＴＢＲｓが病理学的症状の特徴を示すマーカーに対して向けられており、そして第３が治療因子に対して向けられているか、あるいは試薬の１つのＴＢＲが病理学的症状のマーカーまたはその原因となる微生物に対して向けられており、そして試薬の２つの残りのＴＢＲｓが２つの異なる治療因子に対して向けられている。本発明の方法は腫瘍の治療に特に適当であり、この場合において適当な治療因子は細胞障害性因子、トキシン、および放射性同位元素を包含するが、これらに限定されない。本発明の第７の面によれば、本発明は、病理学的症状を患うことが疑われる被検者に多価または多特異的試薬を投与し、そして適当な検出方法を使用して多価または多特異的試薬の局在部位を同定する工程からなる、病理学的症状を診断する方法を提供する。本発明のこの診断法は、種々の治療、例えば、放射線造影および色素マーカー技術に適用することができ、そして癌、血液の凝固およびその他を検出または定位するために適する。本発明のこの面の他の好ましい態様において、下記の成分からなる造影試薬が提供される：ａ）三量体のすべての３つの成分（ＴＢＲｓ）が病理学的症状に対して特異的な分子のマーカーに対して向けられており、そして三量体が放射性同位元素で標識化されているか、あるいは適当な造影試薬に結合されている、本発明の三量体、ｂ）三量体のいずれか２つのＴＢＲｓが病理学的症状または部位に対して特異的な２つの異なるマーカーに対して向けられており、そして第３が適当な造影試薬に対して向けられている、本発明の三量体、ｃ）三量体の１つのＴＢＲが病理学的症状の特徴を示すマーカー、例えば、腫瘍マーカーに対して向けられており、第２ＴＢＲが病理学的症状の存在が推測される組織の部位に対して特異的なマーカーに対して向けられており、そして第３が適当な造影因子に対して向けられている、あるいはｄ）三量体の１つのＴＢＲが病理学的症状の特徴を示すマーカーに対して向けられており、そして残りの２つのＴＢＲが２つの異なる造影因子に対して向けられている。本発明の１つの好ましい態様において、多特異的分子の１成分は非抗体の免疫グロブリン様分子である。これらのＩｇ様分子は、細胞表面に対する結合および抗原提示細胞、Ｔ細胞、マクロファージまたはＮＫ細胞のレクルートメントに有用である。これらの用途のためのＩｇ様分子の範囲は、下記のものを包含する：ａ） CTLA4および誘導体のＩｇ様細胞外ドメイン（Linsley et al.、1995）。CTLA4は抗原提示細胞上のその同族レセプターＢ７−１およびＢ７−２に、モノマーとして（単一のＶ様ドメイン）または二量体としてまたは二量体の一本鎖誘導体として結合する。ｂ）Ｉｇの可変および一定のドメインに対する相同性を有する、Ｂ７−１およびＢ７−２のＩｇ様細胞外ドメイン（それぞれ、ＣＤ８０、ＣＤ８６；Peach et al.、1995、Linsley et al.、1994）。好ましい態様において、前述のＩｇ様ドメインは、それらの同族レセプターに対してより高い結合アフィニティーを有するように選択された、天然の哺乳動物の配列のアフィニティー成熟した類似体である。アフィニティー成熟の技術はこの分野において知られており、そしてＣＤＲ様ループ、フレームワークまたは表面領域の突然変異誘発、およびランダム突然変異誘発の戦略を包含する（Irving et al．、1996）。ファージのディスプレイを使用して、多数の突然変異体をスクリーニングすることができる（Irving et al．、1996）。増強された生物学的活性を有する（機能的アフィニティーの増加により）CTLA4およびｃ８０／８６誘導体は、移植片拒絶反応の防止および自己免疫疾患における関与における用途を有する。これらの分子は抗原提示細胞に対するＴ細胞の連絡を妨害し、そしてＴ細胞を活性化して抗癌試薬としての用途を有する増殖に導くか、あるいはＴ細胞の活性化を減少し、自己免疫疾患の治療および移植における用途を有する、耐性に導くことができる（Linsley et al. 、1995）。これらの分子は、また、いったん標的部位または細胞集団にレスキューされたとき、ＮＫ細胞およびマクロファージを活性化するために使用することができる。それ以上の好ましい態様において、三特異的試薬は、それ以上のアフィニティーの増強を生ずることが期待され、かつ前述したのと同様な治療上の用途を有する、CTLA4またはＣＤ８０／８６または各種の１つの分子の二量体のバージョンを含んでなる。それ以上の好ましい態様において、三特異的試薬の１つの成分は、Ｔ細胞およびＮＫ細胞の活性を操作するために、非Ｉｇ様ドメイン、例えば、ＣＤ４０からなることができる。図面の簡単な説明第１図は、いくつか多価および／または多特異的抗体タンパク質およびタンパク質複合体の概略的表示である。＊は設計をこの明細書に記載した立体配置を示す。卵形はＩｇのＶおよびＣドメインを表し、そしてＶ−ドメイン中の点はそのドメインのＮ−末端を表す。へり／へりに接触する卵形は単一のポリペプチドとして一緒に共有結合で結合されているが、互いの上にオーバーレイする卵形は非共有結合的に結合している。理解されるように、ドメインの別の向きおよび会合は可能である。第１図は、また、完全なＩｇＧ、並びにそのＦａｂおよびＦｖフラグメントの概略的表示を示し、これらは会合してＴＢＲを形成するＶ_HおよびＶ_Lドメインを含んでなる；完全なＩｇＧおよびＦａｂの双方について、Ｃ_H１およびＣ_Lドメインも一緒に会合する卵形として示されている。また、セルテクの（Celltech's）ＴＦＭ化学的架橋剤によるか、あるいは一緒に付着する両親媒性らせんへの融合により、Ｆａｂ分子が結合して多価試薬になることが示されている。Ｖ_HおよびＶ_Lドメインが少なくとも１２残基のリンカー（黒色線として示されている）により結合されている、モノマーのｓｃＦｖ分子が示されている。二量体は二価ｓｃＦｖ２（ダイアボディー）として示されており、２つの同一のＶ_H−Ｌ−Ｖ_L分子は会合して２つの同一のＴＢＲｓ（Ａ）を形成し、そして二重特異的ダイアボディーの構造物は２つの異なるＴＢＲｓ（Ａ、Ｂ）を形成する２つのＶ_H−Ｌ−Ｖ_L分子として示されており、ここでポリペプチドのリンカー（Ｌ）は少なくとも４残基の長さである。本発明の面１は三価ｓｃＦｖ₃（トリアボディー（triabody））として示されており、ここで３つの同一のＶ_H−Ｖ_L分子は会合して３つの同一のＴＢＲｓ（Ａ）を形成し、ここで好ましくはポリペプチドのリンカーの配列を使用しないで、Ｖ−ドメインは一緒に直接結合されている。本発明の面２は、３つのＶ_H−Ｖ_L分子が会合して３つの異なるＴＢＲｓ（Ａ、Ｂ、Ｃ）を形成する、三特異的トリアボディーとして描写されている。本発明の面３、４は四価ｓｃＦｖ₄四量体（テトラボディー（tetrabody））および四特異的テトラボディーとして示されており、４つの同一であるか、あるいは異なるｓｃＦｖ分子が、それぞれ、会合しており、ここで好ましくはポリペプチドのリンカーの配列を使用しないで、Ｖ−ドメインは一緒に直接結合されている。第２図は、円形の三重の対称で構築されたNC10scFv-0三量体のリボン構造のモデルを示す。三重の軸はページの中から外に出るように示されている。Ｖ_HおよびＶ_Lドメインは、それぞれ、ダークグレーおよびライトグレーで陰影をつけらている。ＣＤＲｓは黒色で示されており、そして各一本鎖でＶ_Hのカルボキシ末端をＶ_Lのアミノ末端に結合するペプチド結合（ゼロ残基のリンカー）は二重線で示されている。Ｖ_H（Ｈ）およびＶ_L（Ｌ）のアミノ（Ｎ）およびカルボキシ（Ｃ）末端は標識化されている。第３図は、ｓｃＦｖ発現ユニットの略線図を示し、NC10scFv構築物の各々において使用されたＶ_HドメインのＣ−末端（残基に下線が引かれている）、Ｖ_LドメインのＮ−末端（残基に下線が引かれている）およびリンカーペプチド（肉太）の配列を示す。第４図は、６Ｍのグアニジン塩酸塩で不溶性タンパク質凝集物を抽出することによって得られた、可溶化NC10scFv-0のセファデックス(Sephadex)G-100ゲル濾過の結果を示す。カラム（６０×２．５ｃｍ）をＰＢＳ、ｐＨ７．４、で平衡化し、４０ｍｌ／時の流速で展開した；１０ｍｌの画分を収集した。アリコートをＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のためにピーク１〜３を横切って採って、タンパク質染色（クーマッシー・ブリリアント・ブルーＧ−２５０）およびウェスタンブロット分析によりｓｃＦｖを捜し出した（第５図参照）。ピークをバーで示すようにプールした。第５図は、第４図に示すｓｃＦｖ−０のセファデックスＧ−１００ゲル濾過からの画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す。ピーク１〜３から分析した画分を示す；ａ）クーマッシー・ブリリアント・ブルーＧ−２５０で染色されたゲル；ｂ）抗ＦＬＡＧ^TMＭ２抗体を使用する同一画分のウェスタンブロット分析。第６図は、異なる長さのリンカーにより結合されたＶ_HおよびＶ_Lドメインを有する、アフィニティー精製されたNC10scFvからなるSDS-PAGEの結果を示す。ｓｃＦｖ−０は約１４ｋＤａおよび１５ｋＤａ（矢印で示す）の２つの低分子量バンドを示し、これらのバンドは、このテキストに記載したように、単離の間のｓｃＦｖのタンパク質分解的切断により生成されたＶ_HおよびＶ_Lドメインに対応する。遠い右のレーンは、ゲル濾過によりｓｃＦｖ−０調製物（左のレーン）から単離されたモノマーのピーク（Ｆｖ）を示す。第７図は、目盛定めされたスーパーデックス75HR10/30カラム（Pharmacia）上のアフィニティー精製されたNC10scFvのサイズ排除ＦＰＬＣの結果を示す。このカラムを以前に記載されたように目盛定めした（Kortt et al.、1994）。パネルが示すように、scFv-15はモノマー、二量体およびいくつかのより高いＭ_rのマルチマーを含有する。パネルｂは主として二量体を含有するscFv-10を示し、そしてパネルＣは約７０ｋＤａの単一のピークとして溶出するｓｃＦｖ−０を示す。このカラムをＰＢＳ（ｐＨ７．４）により平衡化し、０．５ｍｌ／分の流速で展開した。第８図は、下記の複合体およびその他を図解するダイヤグラムを示す：ａ）２つの四量体のニューロアミニダーゼと４つのｓｃＦｖドメインとの間の「サンドイッチ」複合体、ニューロアミニダーゼ−Ｆａｂ複合体（Tulip et a l.、1992;Malby et al．、1994)およびｓｃＦｖ−１５モノマー複合体（Kortt e t al.、1994）の結晶学的データをベースとする、ｂ）ｓｃＦｖ−５と抗イディオタイプ3-2G12Fab'との間の複合体、ｃ）ｓｃＦｖ−０三量体（第２図参照）、およびｄ）Ｍ_r２１２ｋＤａの複合体を形成する抗イディオタイプＦａｂ’フラグメント。第９図は、抗イディオタイプ3-2G12Fab'およびNC10scFv-15モノマー、scFv-5 二量体およびｓｃＦｖ−０三量体の複合体についての沈降平衡のデータを示す。０．０５Ｍのリン酸ナトリウム、０．１５ＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４、中のスペローズ（Superose）６上のサイズ排除クロマトグラフィーにより、複合体を単離した。二重セクターのセンターピースおよび１００μｌの試料を使用して、１９６０ｇ、２０℃において２４時間、実験を実施した。半径の関数として、２１４ｎｍにおける吸収を測定した。抗イディオタイプ3-2G12Fab'と、scFv-15モノマー（△）、scFv-5（）およびscFv-0（○）との複合体についてのデータを示す。第１０図は、各々１０μｇ／ｍｌの濃度における、固定化された抗イディオタイプ３−２Ｇ１２Ｆａｂ’（１０００ＲＵ）に対するNC10scFv-15モノマー、scF v-10二量体、scFv-5二量体およびscFv-0三量体の結合を証明する、BIAcore^TMバイオセンサーのセンサープログラムを示す。３０μｌの注入体積および５μｌ／分の流速を使用した。各結合実験後、１０μｌの１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ３．０、で表面を再生した。第１１図は、目盛定めしたセペローズ（Sperose）１２カラムＨＲ１０／３０（Pharmacia）上のアフィニティー精製されたNC10scFv-1、scFv-2、scFv-3およびscFv-4のサイズ排除ＦＰＬＣの結果を示す。２回の別々の実験の結果を重ねた。このカラムをＰＢＳ、ｐＨ７．４、と平衡化し、０．５ｍｌ／分の流速で展開した。第１２図は、11-1G10scFv-15および11-1G10scFv-0のSDS-PAGE分析および抗FLA G M2抗体を使用するウェスタン転移検出の結果を示す；クーマッシー染色したゲル上のレーン（ａ）BioRad低分子量標準、（ｂ）ｓｃＦｖ−０、（ｃ）ｓｃＦｖ −１５、および（ｄ）ｓｃＦｖ−０および（ｅ）ｓｃＦｖ−１５の対応するウェスタンブロット。ｓｃＦｖ−１５の理論的分子量は２８４２７Ｄａであり、そしてｓｃＦｖ−０のそれは２６４６６Ｄａである。第１３図は、目盛定めされたスーパーデックス75HR10/30カラム（Pharmacia）上のサイズ排除ＦＰＬＣの結果を示し、11-1G10scF v-15モノマーおよびｓｃＦｖ−０三量体のオーバーレイされたプロフィルを示し、ピークは、それぞれ、Ｍ_r約２７ｋＤａおよび約８５ｋＤａに対応する時間において溶出する。このカラムをＰＢＳ（ｐＨ７．４）と平衡化し、０．５ｍｌ／分の流速で展開した。第１４図は、目盛定めされたスペローズ12HR10/30カラム（Pharmacia）上のサイズ排除ＦＰＬＣの結果を示し、単離された11-1G10scFv-0三量体、１：３のモル比で前もって混合したscFv-0およびNC41Fabの相互作用で形成されたNC41FabおよびscFv/Fab複合体のオーバーレイされたプロフィルを示す。このカラムをＰＢＳ（ｐＨ７．４）と平衡化し、０．５ｍｌ／分の流速で展開した。第１５図は、各々２２２ｎＭの濃度における、固定化されたNC41Fabに対する1 1-1G10scFv-15モノマーおよびｓｃＦｖ−０三量体の会合および解離を示す、BIA core^TMバイオセンサーのセンサープログラムを示す。３０μｌの注入体積および５μｌ／分の流速を使用した。各結合実験後、１０μｌの１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ３．０、で表面を再生した。第１６図は、下記の電子顕微鏡写真から選択された粒子のギャラリーを示す：ａ）ブーメラン；NC10V_H-V_L scFv-5ダイアボディー／3-2G12Fab複合体、ｂ）Ｙ字形三脚；NC10V_H-V_L scFv-0トリアボディー／3-2G12Fab複合体、ｃ）Ｖ字形突起；NC10V_H-V_L scFv-0トリアボディー／3-2G12Fab複合体、およびｄ）Ｘ字形四量体；NC10V_H-V_L scFv-0トリアボディー／3-2G12Fab複合体。倍率のバー５０ｎｍ。第１７図は、スペローズ12 10/30HR（Pharmacia）カラム上のアフィニティー精製されたNC10scFv-0(V_L-V_H)の分析を示す。パネルａ）は、ＰＢＳ、ｐＨ７．４、中で平衡化し、０．５ｍｌ／分の流速で展開したスペローズ１２カラム上のアフィニティー精製されたｓｃＦｖについてのプロフィルを示す。ｓｃＦｖ−０は２つの成分を含有する。パネルｂ）は、直列に結合された２つのスペローズ１２カラム上でアフィニティー精製されたｓｃＦｖ−０調製物中の２つの成分を分離して、ｓｃＦｖ−０三量体（Ｍ_r約１０８ｋＤａ）およびｓｃＦｖ−０三量体（Ｍ_r約７８ｋＤａ）を生成することを示す。直列のカラムをＰＢＳ、ｐＨ７．４、中で平衡化し、０．３ｍｌ／分の流速で展開した。ＥＭ造影に使用する３− ２Ｇ１２抗体Ｆａｂ’との複合体を形成するために、バーで示すようにピークをプールした。パネルｃ）は、パネルｂにおいて使用した条件下に直列のセファローズカラム上で、パネルｂからの単離されたｓｃＦｖ−０三量体の再クロマトグラフィーについてのプロフィルを示す。第１８図は、ＰＢＳ、ｐＨ７．４、中で平衡化し、０．５ｍｌ／分の流速で展開した、スペローズ１２の10/30HRカラム（Pharmacia）上の、アフィニティー精製されたC215scFv-0（V_H-V_L）のサイズ排除ＦＰＬＣ分析を示す。第１９図は、先行技術のｓｃＦｖ型構築物の異なる型を図解する。Ａ：Ｖ_H−Ｌ−Ｖ_LからなるｓｃＦｖ、ここでＬはWhitlow et al.およびWO93 /31789;Ladner et al.、米国特許第4,946,778号およびWO88/06630；およびMcCaf ferty et al．（1991）およびMcCartney et al.（1995）に記載されているリンカーのポリペプチドである。Ｂ：単一のポリペプチドＶ_H−Ｌ１−Ｖ_L−Ｌ２−Ｖ_H−Ｌ３−Ｖ_L、これはリンカーのポリペプチドＬ２により結合された２つのｓｃＦｖモジュールを形成し、ここで各ｓｃＦｖモジュールのＶ_HおよびＶ_Lドメインは、それぞれ、ポリペプチドＬ１およびＬ３により結合される。この設計はChang、AU-640863により記載された。Ｃ：各々がＶ_H−Ｌ１−Ｖ_L−Ｌ２（ａ、ｂ）からなる２つのｓｃＦｖ分子、ここでＶ_HおよびＶ_LドメインはリンカーのポリペプチドＬ１により結合され、そして２つのｓｃＦｖドメインはＣ−末端の接着性リンカーＬ２ａおよびＬ２ｂにより一緒に結合されている。この設計はPack et al．、PI-93-258685により記載された。Ｄ： PCT/AU93/00491の設計、明らかに上記Ａ、ＢおよびＣと異なる。単一のｓｃＦｖ分子Ｖ_H−Ｌ−Ｖ_Lは短縮されたリンカーのポリペプチドＬを含み、このリンカーのポリペプチドＬはＡ、ＢまたはＣ型のｓｃＦｖの形成を特異的に防止し、その代わりに、２つのｓｃＦｖを自己会合させて、２つの抗原結合部位（標的結合領域；ＴＢＲ−Ａ）を有する二価ｓｃＦｖ二量体を形成させる。２つの異なるｓｃＦｖ分子の会合は、二重特異的ダイアボディー（ＴＢＲｓ−Ａ、Ｂ）を形成するであろう。発明の詳細な説明下記の非限定的実施例および図面のみ参照することによって、本発明を詳細に説明する。一般的材料および方法三つ組（ｔｅｒｎ）Ｎ９ニューロアミニダーゼおよび抗ニューロアミニダーゼ抗体ＮＣ４１および抗イディオタイプ抗体３−２Ｇ１２および１１−１Ｇ１０のＦａｂフラグメントの製造以前に記載されたように（McKimm-Breschkin et al．、1991）トリ（三つ組）インフルエンザウイルスをプロナーゼで処理することによって、Ｎ９ニューロアミニダーゼを単離し、ゲル濾過により精製した。モノクローナル抗イディオタイプ抗体３−２Ｇ１２および１１−１Ｇ１０を、ＣＡＦ１マウス中で、ＮＣ１０およびＮＣ４１抗ニューロアミニダーゼＢＡＬＢ／ｃモノクローナル抗体に対して調製した（ＭｅｔｚｇｅｒおよびWebster、199 0）。抗ニューロアミニダーゼ抗体ＮＣ４１および抗イディオタイプ抗体３−２Ｇ１２および１１−１Ｇ１０を、プロテインＡ−セファローズのクロマトグラフィー（Pharmacia Boitech）により、腹水から単離した。記載されているように（Gruen et al.、1993）、精製された抗体を０．０５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．０、に対して透析し、パパインで消化してＦ（ａｂ’ ）２を生成した。各抗体からのＦ（ａｂ’）２フラグメントをＦｃおよび未消化のＩｇＧからプロテインＡ−セファローズ上のクロマトグラフィーにより分離し、そして純粋なＦ（ａｂ’）２を０．０１Ｍのメルカプトエチルアミンで３７℃ において１時間還元し、そして反応をヨード酢酸でクエンチした。スーパーデックス７５カラム（ＨＲ１０／３０）上のゲル濾過によりＰＢＳ、７．４、中で、Ｆａｂ’を試薬および非還元Ｆ（ａｂ’）２から分離した。サイズ排除ＦＰＬＣクロマトグラフィーおよび質量分析の測定ＰＢＳ、ｐＨ７．４、中のスペローズ６および１２、またはスーパーデックス 75HR10/30（Pharmacia）カラム上のサイズ排除ＦＰＬＣにより、アフィニティー精製されたｓｃＦｖの分子の大きさおよび凝集状態を評価した。抗原および抗イディオタイプＦａｂ’フラグメントに対してｓｃＦｖ−０、ｓｃＦｖ−５およびｓｃＦｖ−１０が結合する能力、および形成した複合体の大きさを、また、ＰＢＳ、ｐＨ７．４、中のスペローズ６上のサイズ排除ＦＰＬＣにより評価した。以前に記載されたように（Kortt et al. 、1994）カラムを１組の標準的タンパク質と平衡化した。ｓｃＦｖ−０、ｓｃＦｖ−５およびｓｃＦｖ−１０の分子量、および抗原および抗イディオタイプ抗体のＦａｂ’フラグメントと各ｓｃＦｖとを使用して形成された複合体の分子量を、ベックマン（Bechman）XLA型超遠心分離機において０．０５Ｍのリン酸塩−０．１５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４、中で沈降平衡化により測定した。バイオセンサー結合分析ＢＩＡｃｏｒｅ^TMバイオセンサー（Pharmacia Biosensor AB、スイス国ウップサラ）（これは表面のプラズモン共鳴の検出を使用しそして２つの相互作用する種の実時間相互作用分析を可能とする）（Karlsson et al．、1991;Jonsson et al．、1993）を使用して、異なるNC10scFvの結合反応速度論を測定した。スーパーデックス７５またはスペローズ１２上のゲル濾過により、切断生成物または貯蔵時に形成することがある高分子量の凝集物を除去することによって、各実験のための試料を調製した。製造業者により供給される旧Aevaluation 2.1を使用して、反応速度論の定数ｋ_aおよびｋ_dを結合データについて評価し、ここで実験の設計はＢＩＡｃｏｒｅ^TM結合データの分析に使用される簡単な１：１相互作用型と相関した。電子顕微鏡検査２つの複合体の溶液：NC10scFv-5ダイアボディー／Ｆａｂ、NC10scFv-0トリアボディー／Ｆａｂ、およびまたNC10scFv-0トリアボディー／Ｆａｂと遊離３−Ｇ１２抗イディオタイプＦａｂとの混合物を電子顕微鏡検査により検査した。各場合において、タンパク質をリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で０．０１〜０．０３ｍｇ／ｍｌの程度の濃度に希釈した。希釈の前に、１０％グルタルアルデヒド（Fluka）をＰＢＳに添加して１％グルタルアルデヒドの最終濃度を達成した。この溶液の約３μｌの液体粒子を、窒素中で３０秒間グロー放電した７００メッシュの金格子上の薄い炭素フィルムに適用した。１分後、過剰のタンパク質溶液を吸引除去し、次いで４〜５滴のネガ染色液（２％ホスホタングステン酸カリウム、ＫＯＨでｐＨ６．０に調節した）を適用し、除去した。格子を空気乾燥し、次いでＪＥＯＬ１００Ｂ透過型電子顕微鏡で６０ｋＶにおいて１００，０００×の倍率で検査した。電子顕微鏡写真をコダック（Ｋｏｄａｋ）ＳＯ−１６３フィルム上に記録し、未希釈のコダックＤ１９現像液中で現像した。同一像形成条件下にＮＣ１０抗体（Ｆａｂ）とその抗原、インフルエンザウイルスのニューロアミニダーゼのヘッドとの複合体の単一分子の画像を記録することによって、電子−光学的倍率を目盛定めした。粒子の頂点の座標を記録するＳＰＩＤＥＲ画像プロセシングスイートの相互作用の設備を使用して、ディジタル化顕微鏡写真について粒子の寸法の測定を実施した。２２９のダイアボディーおよび１１４トリアボディーの座標から、粒子のアームの長さおよび相互のアームの角度を計算した。実施例１．０、５および１０残基のリンカーを有するＮＣ１０ｓｃＦｖ（Ｖ_H−Ｖ_L）の構築より短いリンカーの構築に、１５残基のリンカーを有するNC10scFv抗体遺伝子の構築物（Malby et al.、1993）を使用した。NCl0scFv-15をBstEII（New Engla nd Labs）およびＳａｃｌ（Pharmacia）で連続的に消化し、ポリペプチドのリンカーの配列を解放させた。NC10scFvのＤＮＡフラグメントを含有する残留プラスミドをアガロースゲル上で精製し、エタノールを使用する沈降によりＤＮＡを濃縮した。合成オリゴヌクレオチド（表１）を０．５単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Pharmacia）および１ｍＭのＡＴＰとOne-Phor-All緩衝液（Pharmacia ）中で３７℃において３０分間インキュベートすることによって、５’末端においてリン酸化した。相補的リン酸化オリゴヌクレオチドのプライマーの対（表１）を等モル比でプレミックスして、変更された長さの一本鎖リンカーをコードするＤＮＡ二本鎖を形成した。アマーシャム（Amersham）結合キットを使用して、これらの二本鎖をＢｓｔＥＩＩ−ＳａｃＩ制限ｐＰＯＷＮＣ１０ｓｃＦｖプラスミドの中に結合した。結合混合物をフェノール／クロロホルム抽出により精製し、通常の方法でエタノールで沈降させ、そして大腸菌（E.coli）DH5α（supE44、hsdR17、recAl、endAl 、gyrA96、thi-1、relA1）およびLE392（supE44、supF58、hsdR14、lacY1、galK 2、galT22、metB1、trpR55）の中に形質転換させた。ｐＰＯＷベクターのｐｅｌＢリーダーおよびＦＬＡＧ配列に対して向けられたオリゴヌクレオチドを使用するＰＣＲスクリーニングにより、組換えクローンを同定した。セクエナーゼ（Se quenase）２．０（ＵＳＢ）を使用して二本鎖ＤＮＡを配列決定することによって、短縮されたリンカー領域のＤＮＡ配列を確認した。Ｖ_HおよびＶ_Lドメインが１０（（Ｇｌｙ₄Ｓｅｒ）₂）、５（Ｇｌｙ₄Ｓｅｒ）およびゼロ残基のリンカーで結合されている、新しいＮＣ１０ｓｃＦｖ遺伝子構築物を第３図に示す。新しい構築物のＤＮＡ配列決定により、突然変異が存在しないこと、およびＶ_HおよびＶ_Lドメインが設計したより短い長さのリンカーにより結合されていることが確証された。これらの構築物を本明細書においてNC10sc Fv-10、ｓｃＦｖ−５およびｓｃＦｖ−０と表示し、ここで数字はリンカー中の残基の数を示す。実施例２．NC10scFv の発現および精製親ｓｃＦｖ−１５についてMalby et al.（1993）が記載したように、実施例１に記載した０、５および１０残基のリンカーを有する、pPOW NC10scFv構築物を発現させた。タンパク質は、NC10scFv-15について見出された（Kortt et al.、1 994）ように、細菌膜と会合した不溶性タンパク質凝集物として、周辺質の中に位置した。発現されたより短いリンカーを有するNC10scFvを６Ｍのグアニジン塩酸塩／０．１ＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．０、中で可溶化し、ＰＢＳ、ｐＨ７．４、に対して透析し、不溶性物質を遠心により除去した。可溶性画分を以前に記載されたように（Kortt et al.、1994）限外濾過（Amicon stirred cell、YM10膜）によりほぼ１０倍濃縮し、ＰＢＳ、ｐＨ７．４、と平衡化したセファデックスＧ−１００カラム（６０×２．５ｃｍ）に濃厚物を適用した；タンパク質を含有する画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、抗ＦＬＡＧ^TMＭ２抗体（Eastman Kodak、コネチカット州ニューヘブン）を使用するウェスタンブロット分析により、ｓｃＦｖを捜し出した。ｓｃＦｖを含有する画分をプールし、濃縮し、抗ＦＬＡＧ^TM Ｍ２抗体アフィニティー樹脂（Brizzard et al．、1994）を使用するアフィニティークロマトグラフィーにより、均質になるまで精製した。アフィニティー樹脂をＰＢＳ、ｐＨ７．４、中で平衡化し、結合したタンパク質を０．１Ｍのグリシン緩衝液、ｐＨ３．０、で溶離し、１ＭのＴｒｉｓ溶液で直ちに中和した。精製したｓｃＦｖを約１〜２ｍｇ／ｍｌに濃縮し、０．０２％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ、ｐＨ７．４、に対して透析し、凍結させて貯蔵した。以前に記載されたように（Kortt et al.、1994）ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析により、ｓｃＦｖの純度をモニターした。Ｇｉｌｌおよびvo n Hippel（1989）が記載したように、タンパク質配列から計算された、ｓｃＦｖ −１５について１．６９、ｓｃＦｖ−１０について１．７１、ｓｃＦｖ−５について１．７３およびｓｃＦｖ−０について１．７５の２８０ｎｍにおける吸光係数（ε^0.1％）についてのＶ_Lを使用して、ｓｃＦｖフラグメントの濃度を分光光度測定的に決定した。完全なｓｃＦｖ−０およびｓｃＦｖ−５および低分子量の切断生成物のＮ−末端配列を分析するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で得られたタンパク質のバンドをセレックス(Selex)20膜（Schleicher and Schuell GmbH、ドイツ国）上にブロットし、切除し、アプライド・バイオシステムス（Applied Biosystems）４７０Ａ型気相配列決定装置を使用して配列決定した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）膜の画分を６Ｍのグアニジン塩酸塩で抽出し、透析して変性物質を除去した後、、ゲル濾過およびアフィニティークロマトグラフィーを包含する２工程の手順を使用して、可溶性NC10scFv-10、ｓｃＦｖ−５およびｓｃＦｖ−０フラグメントの各々を精製した。得られた可溶化タンパク質をまずセファデックスＧ−１００ゲル濾過のクロマトグラフィーにかけて、広い低分子量のピークから３つのピーク（ピーク１〜３、第４図に示す）を分割した。ピーク１〜３を横切る画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析は、ピーク１および２（画分１９〜３０、第５図に示す）中のｓｃＦｖ−０の存在を示し、ｓｃＦｖの大部分はピーク２の中に存在した。対照的に、従来の報告において、NC10scFv-15の発現はｓｃＦｖ−１５の大部分を生じ、ｓｃＦｖ−１５はピーク３からモノマーとして回収された（Kortt et al.、1994）。第４図からのピーク２を抗ＦＬＡＧＭ２^TMセファローズカラムのアフィニティークロマトグラフィーにかけると、本質的に均質なｓｃＦｖ−０調製物が得られた；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、主要なタンパク質のバンドは約２７ｋＤａにおいて可視である；ＮＣ１０ｓｃＦｖ−１５、−１０、−５および−０構築物中のリンカーの大きさの減少はタンパク質のバンドの移動度から明らかである（第６図）。また、ｓｃＦｖ−５およびｓｃＦｖ−０はタンパク質の小さい成分を約１４および約１５ｋＤａにおいて二重項として含有し（第６図）、それらのうちの１４ｋＤａのバンドはウェスタンブロッティングで抗ＦＬＡＧＭ２抗体と反応し、Ｖ_HおよびＶ_Lドメインの間のリンカー領域におけるタンパク質分解と一致した。抗ＦＬＡＧ^TMＭ２抗体カラム上のNC10scFv-10およびｓｃＦｖ−５の第６図からのセファデックスＧ−１００のピーク１のアフィニティークロマトグラフィーはｓｃＦｖ調製物を生じ、これらは凝集した；凝集物をエチレングリコールでリフォルディングまたは解離させる試み（Kortt et al.、1994）は不成功に終わった。この物質は凝集しないばかりでなく、かつまたＮ９ニューロアミニダーゼまたは抗イディオタイプ３−２Ｇ１２Ｆａｂ’に対する結合活性を示さなかったので、多分ミスフォルドされた。すべての引き続く分析は、セファデックスＧ−１００のピーク２から単離されたｓｃＦｖについて実施された。実施例３．ＮＣ１０ｓｃＦｖの分子量アフィニティー精製されたｓｃＦｖの目盛定めされたスーパーデックス７５カラム上のゲル濾過は、NC10scFv-10（第７図）およびｓｃＦｖ−５は５２ｋＤａの見掛けの分子量で溶離されることを示し、これらの分子量の双方が発現された２７ｋＤａのＮＣ１０ｓｃＦｖ分子の非共有結合の二量体であることを示す。NC 10scFv-5およびNC10scFv-10は主として二量体を生じたが、第７図パネルｂに示すように、非常に少量のより高い分子量の成分が観測された。アフィニティー精製されたNC10scFv-0のゲル濾過はほぼ７０ｋＤａの見掛けの分子量を有する、単一の主要な対称ピークを生じた（第７図、表２）。ゲル濾過の挙動は分子の大きさおよび形状に依存するので、いっそう正確な値を得るために、ｓｃＦｖ−１０、ｓｃＦｖ−５、およびｓｃＦｖ−０の分子量を前述の沈降平衡化により測定した。アミノ酸組成からｓｃＦｖ−５およびｓｃＦｖ−０について、０．７１ｍｌ／ｇの部分的比体積が計算され、そして、ｓｃＦｖのアミノ酸組成およびニューロアミニダーゼのアミノ酸および炭水化物の組成（Ward et al．、1983）から、ｓｃＦｖ−ニューロアミニダーゼ複合体の０．７ｍｌ／ｇの部分的比体積が計算された。ｓｃＦｖ−抗イディオタイプ3-2G12Fab'複合体について、０．７３ｍｌ／ｇの部分的比体積が仮定された。結果を表２に要約する。分子量は、ベックマン（Beckman）ＸＬＡ型超遠心分離機により沈降平衡化分析において、０．０５Ｍのリン酸塩、０．１５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４、中で測定した。＃第９図中のデータを適合させ、単一の種を仮定することによって、見掛けの平均分子量を得た。＊スーパーデックス７５上のゲル濾過により０．０５Ｍのリン酸塩、０．１５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４、中で０．５ｍｌ／分の流速で２０℃において、分子量を推定した。Ｆａｂ’について５０，０００および三つ組Ｎ９ニューロアミニダーゼについて１９０，０００のＭｒを使用して、複合体の分子量を計算した。ｓｃＦｖ−１０およびｓｃＦｖ−５について、それぞれ、５４および５２．４ｋＤａの分子量は、それらが二量体であることを確証した。NC10scFv-0について測定された６９ｋＤａの分子量は、それが３つのｓｃＦｖ−０鎖から構成された三量体であることを示唆したが、この分子量はこのような三量体について期待された分子量（７８ｋＤａの計算Ｍｒ）より小さい。沈降データの分析は線形の１ｎｃ／ｒ²のプロットを与え（Van Holde、1975）、実験の条件下に、ｓｃＦｖ −５二量体およびｓｃＦｖ−０トリアボディーは解離しなかったことを示す。さらに。沈降平衡化の結果は、二量体種と三量体種との間の急速の平衡を示さず、 NC10scFv-0三量体について明らかに低い分子量を説明する。精製されたNC10scFv-5およびscFv-10二量体は、約１ｍｇ／ｍｌの濃度において４℃で高分子量の凝集物を形成する性向を示さず、凍結および融解させると、より高い分子量のマルチマーが形成した（データは示されていない）。疎水性相互作用を抑制する６０％のエチレングリコールの存在において、これらのマルチマーは急速に解離した。対照的に、NC10scFv-0は、比較的高いタンパク質濃度においてさえ、凍結および融解させるとき、凝集する性向を示さない。 NC10scFv-0の単離の間に生成したＦｖフラグメントからの２つのバンドのＮ− 末端の分析（第６図）は、また、１５ｋＤａのバンドがＶ_Hドメインであること、そして１４ｋＤａバンドがＶＳＤＩＥＬＴＱＴＴのＮ−末端の配列を有し、少量のタンパク質分解がＶ_HドメインのＣ−末端の配列中の終わりから２番目のバンド（Ｔ−Ｖ）において起こったことを示した（第３図）。実施例４．ＮＣ１０ｓｃＦｖ二量体および三量体および三つ組Ｎ９ニューロアミニダーゼおよび抗イディオタイプ３−２Ｇ１２Ｆａｂ’の間で形成された複合体インフルエンザウイルスのニューロアミニダーゼ、すなわち、表面糖タンパク質は、ウイルス表面上の脂質およびマトリックスのタンパク質にポリペプチドのストークを介して結合された４つの同一のサブユニットから構成された四量体タンパク質である（Colman、1989）。ストーク領域におけるタンパク質分解的切断により、完全なおよび活性なニューロアミニダーゼのヘッド（Ｍ_r１９０ｋＤａ）をウイルス表面から解放させる。酵素の活性部位およびＮＣ１０抗体が認識するエピトープのすべてが分子の上部表面（ウイルス表面から遠位の）上に位置するように、ニューロアミニダーゼの四量体中の４つのサブユニットを配置する。この構造的トポロジーは４つのNC10scFv -15または４つのＦａｂフラグメントの同一平面における結合を可能とし（Colma n et al．、1987;Tulip et al．、1992）、こうして、四量体の複合体は平坦化ボックスまたは倒立テーブルに類似し、ニューロアミニダーゼは上部に存在し、そして４つのＦａｂフラグメントは４５°の角度で平面から脚として突起する。これが示唆するように、二価分子は２つのニューロアミニダーゼの四量体を架橋して「サンドイッチ」型複合体を形成することができる（第８ａ図；Tulloch et al.、1989）。目盛定めされたスペローズ６カラム上のサイズ排除ＦＰＬＣは、ＮＣ１０ｓｃＦｖ−１０（第７図）およびNC10scFv-5決定の双方が可溶性ニューロアミニダーゼとほぼ６００ｋＤａの見掛けの分子量の安定な複合体を形成することを示した。ｓｃＦｖ−１０およびｓｃＦｖ−５−ニューロアミニダーゼ複合体について沈降平衡化分析により測定した、いっそう正確な分子量は５９６ｋＤａであった（表２）。この複合体のＭ_rは、第８ａ図に概略的に図解するように、「サンドイッチ」複合体で２つのニューロアミニダーゼ分子（各々１９０ｋＤａ）を架橋する４つのｓｃＦｖ二量体（各々５２ｋＤａ）と一致し、そしてｓｃＦｖ−１０およびｓｃＦｖ−５の二量体が二価であることを証明する。単離された６００ｋＤａのNC10scFv-10−ニューロアミニダーゼ複合体のゲル濾過は、それが希釈に対して極めて安定であり、複合体を２ｎＭの濃度でスペローズ６カラム上で展開するとき、少量の遊離のニューロアミニダーゼおよびNC10 scFv-10が出現することを示した。実施例３において証明された、沈降のデータの１ｎｃ／ｒ²のプロット（Van Holde、1975）の線形性は、双方の複合体が分子量に関して均質であることを示し、そして離散した、化学量論的複合体が形成することを示した。ｓｃＦｖ／ニューロアミニダーゼの分子比が異なる（１：４〜８：１）の複合体の形成は、６００ｋＤａの複合体のみを生じた。興味深いことには、１つのニューロアミニダーゼに結合する４つのｓｃＦｖ二量体との複合体（約４００ｋＤａ）または２より多いニューロアミニダーゼが架橋されている凝集した複合体は観測されなかった。スペローズ６上のサイズ排除ＦＰＬＣは、抗イディオタイプ3-2G12Fab'は、NC 10scFv-15モノマー、NC10scFv-5およびNC10scFv-0と安定な複合体を形成することを示した。単離された複合体の沈降平衡化分析は、表２および第９図に示すように、１つのＦａｂ’と結合するscFv-15、２つのＦａｂ’と結合するNC10scFv- 5、および３つのＦａｂ’分子と結合するNC10scFv-0と一致する分子量を与えた。沈降のデータの１ｎｃ／ｒ²のプロットの線形性（第９図）は、NC10scFv-15 モノマーおよびNC10scFv-5二量体との複合体が均質であること、および離散した、化学量論的複合体が形成することを示した。NC10scFv-0との複合体についての平衡のデータは、線形変換上の非常にわずかな曲率を示した（第９図）。データに対する適合は２１２，０００の平均Ｍ_rを生じ、これは３つのＦａｂ’の結合／NC10scFv-0の複合体について期待されたＭ_rに密接に対応する（表２）。変換されたデータのわずかの曲率は、実験条件下に複合体の小さい程度の解離を示すことがある。NC10scFv-5を使用する結果は、二量体が、第８ｂ図に図解するように、二価であること、そしてリンカーをもたないNC10scFv-0が、第８ｃ図および第８ｄ図に概略的に図解するように、３つの活性な抗原結合部位を有する三量体であることを確証した。理解されるように、第８図は複合体の概略的表示を表し、そしてｓｃＦｖを結合するリンカー領域において、描写することができない、かなりの柔軟性が存在する。しかしながら、線形構造よりむしろ、ブーメラン形の構造（第８ｂ図）は、ニューロアミニダーゼの平面からのｓｃＦｖの４５ °の突起角度を容易に収容することができ、ここでこの角度は、第８ａ図に示すように、４つの二量体が「サンドイッチ型」複合体で２つのニューロアミニダーゼ分子と同時に架橋するために必要である。異なるｓｃＦｖ−５二量体の同様な柔軟性は最近モデル化された（Holliger et al．、1996）が、従来証明されてきていない。２つの抗イディオタイプ３−２Ｇ１２Ｆａｂ分子と複合化したNC10sc Fv-5ダイアボディー（Ｍ_r約１５６ｋＤａ）の電子顕微鏡写真は、第１６図に示すように、２つのアームの間の角度が約６０°〜１８０°の範囲である、ブーメラン形突起を示した。平均の角度は１２２°であり、平均付近においてほぼ正常の角度の分布が存在した（表３）。各アームはＦａｂ分子に対応し（第１図および第８ｂ図）、そして、潜在的「Ｌ字形湾曲」にかかわらず、ＦｖおよびＣモジュールの間の柔軟性は、抗原結合部位から外方に延びる、比較的剛性の、線状分子のロッドとして出現する。現在の造影条件下のＦａｂアームの線形性は、トリアボディーと関連して造影された遊離３−２Ｇ１２抗イディオタイプＦａｂの出現により確証された。アームの間の角度の変動は、ダイアボディーにおいて２つのｓｃＦｖを結合するリンカー領域の中に、かなりの柔軟性が存在することを示す。アームの長さの測定を表３に要約する。３つの3-2G12Fab分子と複合化したNC10scFv-0トリアボディー（Ｍ_r約２１２ｋＤａ）の顕微鏡写真において、大部分の視野は主としてＹ字形およびＶ字形の突起の混合物を示した（第１６ａ図）。炭素フィルム上の染色剤の厚さに依存して、粒子の出現に多少の変動が存在した。Ｙ字形突起は三脚として解釈され（上から見て）、これらの三脚はすべての３つの脚（すなわち、３つのＦａｂ分子の遠位の端）が炭素フィルムと接触して存在する向きを取った。３つのＦａｂの脚は平均１３６°の２つの角度および平均８０°の１つの角度により分離されていた。しかしながら、角度の範囲は、粒子のほぼ１０％について、アームがすべて１２０°（＋／−５°）で均一に間隔を置いて位置するような範囲である。Ｙ字形突起は、必ずＦａｂ脚の１つが短縮された見えたので、平坦であると思われなかった。Ｖ字形突起は炭素フィルム上にそれらの側面で横たわる三脚（トリアボディーの複合体）として解釈され、２つのＦａｂ脚はＶを形成し、そして第３のＦａｂ脚は上方に、染色剤の中から外に延び、これはＶの接合部において時々観測される密度の増加を説明するであろう。Ｖ字形構造物は、Ｆａｂアームの間の角度および分子の中心における突起した密度の双方において、期待されるモデルと一致する（第１図）。それらの側面に横たわる三脚の解釈は、すべてのＦａｂ脚が同一方向を指している、わずかの突起の外観と一致する。トリアボディーは明らかに柔軟性の分子であり、ＮＣ１０トリアボディー／Ｆａｂ複合体におけるＦａｂアームの間で観測された角度が平均１３６°の２つおよび平均８０°の付近に分布しており、そして第１図に概略的に示すように剛性の分子ではない。実施例５．ＢＩＡｃｏｒｅ^TMで測定したNC10scFvの結合相互作用ａ）抗イディオタイプ3-2G12Fab'に対してNC10scFvの結合Ｉ系列の実験において、抗イディオタイプ3-2G12Fab'およびNC10scFv-15モノマー、ｓｃＦｖ−１０、ｓｃＦｖ−５およびｓｃＦｖ−０を、また、ｐＨ４．０においてそれらのアミン基を介して固定化した。ＨＢＳ緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．１５ＭのＮａＣｌ、３．４ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％の界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ７．４）中で５μｌ／分の一定の流速において、結合アッセイを実施した。結合活性を損失しないで、固定化された3-2G12Fab'を10μｌの０．０１Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ３．０、で再生することができた。NC10scFv-15モノマー、ｓｃＦｖ−１０およびｓｃＦｖ−５二量体、およびｓｃＦｖ−０三量体の結合を比較すると、モノマーは急速に解離し、速度反応式の単一の指数の形態を使用する、解離および会合相の非線形最小２乗分析は実験データに対するすぐれた適合を与えた。これらの結果を第１０図に示し、そして測定された速度定数を表４に記載する。固定化三つ組Ｎ９ニューロアミニダーゼおよび抗イディオタイプ3-2G12Fab'フラグメントに対するNC10scFv-15モノマーの結合についての、BIAcore^TMにおいて測定された、見掛けの反応速度論のデータを、この表に示す。BIAevaluation 2. 1に記載されている非線形適合手順を使用して、会合および解離の相から反応速度論定数を評価した。１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．１５ＮａＣｌ、３．４ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％の界面活性剤Ｐ２０，ｐＨ７．４、中で５μｌ／分の流速において、結合実験を実施した。標準的ＮＨＳ／ＥＤＣカップリング手順を使用して、アミン基を介して三つ組Ｎ９ニューロアミニダーゼ（１３６０ＲＵ）および3-2G12Fab'（１０００ＲＵ）を固定化した。 NC10scFv-10およびｓｃＦｖ−５二量体およびｓｃＦｖ−０三量体／抗イディオタイプ複合体は、第１０図に図解するように、明らかにより遅い解離を示し、多価の結合と一致し、そしてこの作用はＢＩＡｃｏｒｅ^TMデータの評価に使用した１：１相互作用モデルを無効にするので、反応速度論の分析は実施しなかった。この問題を解決するために、各ＮＣ１０ｓｃＦｖの固定化により、分析物として抗イディオタイプＦａｂ’を使用して、相互作用のフォーマットを逆にした。また、標準的ＮＨＳ／ＥＤＣカップリング手順を使用して、アミン基を介して、 NC10scFv-15モノマー（２０００ＲＵ）およびNC10scFv-1二量体（２００ＲＵ）、ｓｃＦｖ−１５二量体（２００ＲＵ）およびｓｃＦｖ−０三量体（４５０ＲＵ）を固定化した。試薬のこの向きは、速度定数の測定に必要な１：１相互作用モデルを実験的に達成する。試薬のこの方向が、速度定数の決定に必要な１：１相互作用モデルを実験的に達成する。固定化されたNC10scFv-15モノマー、NC10scF v-10二量体、NC10scFv-5二量体およびNC10scFv-0三量体に対する３−２Ｇ１２Ｆａｂの結合についての反応速度論的結合定数を表４に記載し、そしてBIAcore^TMにおける固定化されたＮＣ１０ｓｃＦｖの性質を下記の節ｂｉ）およびｉｉ）に表す。ｂ）固定化されたNC10scFv-15モノマー、NC10scFv-10二量体およびscFv-10 、ｓｃＦｖ−５およびｓｃＦｖ−０に対する抗イディオタイプ３−２Ｇｌ２Ｆａｂ’の結合ｉ） NC10scFv-15 モノマーｓｃＦｖ−１５モノマーは急速に固定化された（約２０００応答単位；ＲＵ）が、ＲＵの増加から計算して使用に結合することができる、抗イディオタイプＦａｂ’の全量により示されるように、タンパク質の１０％より小が活性であった。解離相の対数変換は、線形性からの有意な偏りを示し、結合定数の近似値の推定を可能とした（表４）。ｉｉ）ｓｃＦｖ−１０、ｓｃＦｖ−５およびｓｃＦｖ−０対照的に、より短いリンカーを有する３つのNC10scFvはアミン基を介して容易に固定化されなかった。なぜなら、２μｌ／分の流速においてタンパク質を数回注入した後、２００〜５５０ＲＵのみのタンパク質を固定化することができたのみであるからである。抗イディオタイプ3-2G12Fab'を使用する結合実験において、合計の結合したＲＵ応答から計算して、固定化されたｓｃＦｖ−１０、ｓｃＦｖ−５およびｓｃＦｖ−０のほぼ３０〜５０％が活性であることが示された。結果を表４に示す。固定化されたNC10scFv-15モノマーに関して、データを分析すると、解離のデータの対数変換上の線形性から偏りが示され、そしてデータを非線形回帰により分析したとき、劣った適合が示された。BIAcore^TM結合データに関連する、これらの非理想的な効果は、反応速度の定数に寄与する表面に対する分子の拡散速度（質量転移効果）（Glaser、1993;Karlsson et al. 、1994）から、あるいは使用する非特異的固定化分子の結合の不均質性から、または双方から生ずることがある。これらの効果は測定した速度定数の低下に寄与し、そして推定された結合定数に影響を与える。３−２Ｇ１２Ｆａｂの結合についての速度定数を４つの固定化NC10scFvと比較すると、表４に示すように、各ｓｃＦｖとの3-2G12Fabの相互作用に対する見掛けのアフィニティーは類似することが示される。したがって、固定化３−２Ｇ１２Ｆａｂに対する二量体または三量体のｓｃＦｖの結合について、第１０図に示すアフィニティーの増加は、BIAc oreバイオセンサーまたはＥＬＩＳＡアフィニティー測定において二量体または三量体を分析物として使用するとき、多価の結合（結合活性効果）から生ずる。実施例６．１、２、３および４残基のリンカーを有するNC10scFvの構築、発現および活性短いリンカーを有するｓｃＦｖの構築のための出発鋳型は、Ｖ_L配列の５’末端がＶ_H配列の３’末端に直接結合している、実施例１に記載するベクターｐＰＯＷ中のゼロのリンカーを有するNC10scFv-0遺伝子構築物である。Ｖ_H配列の３ ’末端とＶ_L配列の５’末端との間の１、２、３または４つのグリシン残基炭素フィルムヌクレオチドを付加するように、構築物を設計した。 QuikChange^TM部位特異的突然変異誘発手順（Stratagene Cloning Systems、カリフォルニア州ラジョラ）を使用して、表５に示す４組の相補的オリゴヌクレオチドのプライマーを合成して、Ｖ_H配列とＶ_L配列との間に余分のコドンを付加した。キットに供給された５μｌの反応緩衝液、２０ｐｍｏｌの相補的オリゴヌクレオチドのプライマー、２．５ｎｍｏｌの各ｄＮＴＰ、および２．５単位のＰｆｕＤＮＡポリメラーゼを含有する５０μｌの反応体積において、１５ｎｇのNC10 scFv-0DNAをＰＣＲに付した。熱的サイクル条件は次の通りであった：（９５℃ 、３０秒）１サイクル；（９５℃、３０秒；５５℃、１分；６８℃、１２分）１８サイクル。１μｌのＤｐｎＩ制限酵素（１０Ｕ／μｌ）を各試料に添加し、３７℃において９０分間インキュベートして、ｄａｍメチル化、非突然変異の親ＤＮＡを消化した。２μｌの各反応混合物を使用して、エレクトロコンピテントXL 1-Blue細胞（recA endA 1gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac［f'proAB lac I^qZ△M15Tn10(tet^r)］）（１×１０⁹ｃｆｕ／μｇ）を形質転換し、それらのアリコートをＹＴ−ａｍｐ₁₀₀プレート上で３０℃において一夜インキュベートした。セクエナーゼ(Sequenase)ver2.0(US Biochemicals)およびオリゴヌクレオチドのプライマーＴＡＣＡＴＧＣＡＧＣＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＣ（配列識別ＮＯ：１７）を使用して、突然変異についてターゲットする領域を横切って、多数の個々のコロニーからのプラスミドＤＮＡをＤＮＡ配列決定することによって、正しいヌクレオチドの挿入を含有する突然変異体を選択した。正しい突然変異を有するクローンをMalby et al.(1993)に記載されているように５ｍｌの２ＹＴ／ａｍｐ₂₀₀中で小規模の発現に付して、構築物が全長のインフレームの産物を産生できることを確証した。抗ＦＬＡＧタンブロットにより分析した。選択の基準は正しい移動位置において陽性の反応であった。４つの構築物の各々について、１つの陽性のクローンをこのスクリーンから選択した。実施例２に記載するように、しかしセファデックスＧ−１００上のクロマトグラフィー工程を省略して、NC10scFv-1、ｓｃＦｖ−２、ｓｃＦｖ−３およびｓｃＦｖ−４の大規模の発現および精製を実施した。固定化抗ＦＬＡＧ上のアフィニティークロマトグラフィーからの結合した画分のＳＤＳＰＡＧＥおよびウェスタンブロットは、それらが主としてＮＣ１０ｓｃＦｖを含有することを明らかにした。 NC10scFv-1、ｓｃＦｖ−２、ｓｃＦｖ−３およびｓｃＦｖ−４の分子量の推定アフィニティー精製されたNC10scFv-1、ｓｃＦｖ−２、ｓｃＦｖ−３、ｓｃＦｖ−４のアリコートを、目盛定めされたスペローズ１２カラム上のＦＰＬＣにより、個々に分析した。溶離のプロフィルを第１１図に示す。NC10scFv-1およびｓｃＦｖ−２は、ｓｃＦｖ−０について記載したものに類似する、三量体の位置において溶離する主要なピークを生じた。ｓｃＦｖ−３およびｓｃＦｖ−４の主要な溶離するピークの位置は、ｓｃＦｖ−５について見られるように、二量体について観測された位置と同一であった。これらの結果が示すように、ＮＣ１０のＶ_H およびＶ_Lドメインの間の２から３へのグリシン残基のリンカーのエクステンションは、ｓｃＦｖの好ましいマルチマー化の状態を三量体（ｓｃＦｖ−０を使用して見られるように）から二量体（ｓｃＦｖ−５を使用して見られるように）に変化させるために十分である。ＴＢＲｓの活性 − 3-2G12Fab'との複合体の形成およびＥＭ造影ｓｃＦｖ−０およびｓｃＦｖ−５（実施例４）について記載したように、3-2G 12Fab'とアフィニティー精製されたNC10scFv-2およびｓｃＦｖ−３との間で複合体を形成し、スペローズ６上のＦＰＬＣにより単離し、また、ｓｃＦｖ−０およびｓｃＦｖ−５について記載したように、ＥＭ造影に使用した。過剰のＦａｂ’の存在において複合体を形成した後、ＦＰＬＣプロフィルの中に遊離のｓｃＦｖピークが存在しないことは、ｓｃＦｖ−２およびｓｃＦｖ−３の双方が完全に活性であることを示した。ｓｃＦｖ−２／Ｆａｂ複合体についての溶離時間は、ｓｃＦｖ−０／Ｆａｂ複合体について以前に見出されたそれと同一であり、そして三量体であるｓｃＦｖ−２と一致する。scFv-3/Fab複合体は、 scFv-5/Fab複合体について以前に見出されたそれと同一でである溶離時間を有し、そして二量体であるｓｃＦｖ−３と一致する。 scFv-2/FabおよびscFv-3/Fabの複合体のＥＭ造影は、NC10scFv-2がｓｃＦｖ− ０に類似する安定な三量体であり、そしてｓｃＦｖ−３がｓｃＦｖ−５に類似する安定な二量体であるという、我々の以前の観察と一致する結果を示した。これらの画像は、第１６図に示すｓｃＦｖ−５二量体の複合体またはｓｃＦｖ−０三量体の複合体と同一であるように見える。実施例７．11-1G10scFv-0 の構築および合成親１１−１Ｇ１０ハイブリドーマからＰＣＲにより、Ｖ_HおよびＶ_L遺伝子を増幅し、そしてＰＣＲオーバーラップ−エクステンションにより、Ｃ−末端のＶ_H −Ｓｅｒ¹¹³およびＮ−末端のＶ_L−Ｇｌｎ¹についてのコドンの間の結合により、ｓｃＦｖ−０遺伝子の中に結合した。１１−１Ｇ１０について、ゼロ−リンカーのｓｃＦｖはＶ_H−Ｓｅｒ¹¹³からＶ_L−Ｇｌｎ¹への直接結合として定義される。Ｎ−末端のｐｅｌＢリーダー配列およびＣ−末端のＦＬＡＧオクタペプチドの標識テイルを提供する発現ベクターｐＧＣのＳｆｉｌ−Ｎｏｔｌ部位の中に、ｓｃＦｖ−０遺伝子をクローニングした（Coia et al．、1996）。アルカリ性溶解により精製したＤＮＡを使用し、かつＰＲＩＳＭサイクル配列決定キット（ＡＢＩ）を使用して実施する配列決定反応を使用して、クローニングされたｓｃＦｖ−０インサートの全体のＤＮＡ配列を決定した。これにより、11-1G10scFv-0遺伝子は、Ｃ−末端のＶ_H−ｓｅｒ¹¹³ およびＮ−末端のＶ_L−Ｇｌｎ¹のためのコドンの間の直接結合から構成されていることが確証された。ｐＧＣの中にｓｃＦｖ−０遺伝子を含有するＨＢ１０１大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび１％のグルコースを補充した２×ＹＴ中で３７℃において一夜成長させ、次いでグルコースの非存在において０．１のＡ₆₀₀において継代培養し、Ａ₆₀₀が１．０になるまで２１℃において成長させた。ＩＰＴＧを１ｍＭに添加することによって、発現を誘発し、多分細胞溶解により、ペリプラスミック空間の内容物を培養上清の中に解放させる条件下に、細胞を２１℃において１６時間培養して、可溶性の生物学的に活性なｓｃＦｖを生成させた（Coia et al．、1996）。細胞および培養上清を遠心により分離し、細胞のペレットおよび上清の試料を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分析し、次いでＭ２抗ＦＬＡＧ抗体（Kortt et al.、1994）およびヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）^HPR （BioRad）を第２抗体として使用して発現された生成物を可視化するウェスタンブロット分析により分析した。発現されたｓｃＦｖ−０を、上清から、２１℃において７０％の飽和までの硫酸アンモニウムで沈降させ、次いで１００００ｇにおいて１５分間遠心することによって精製した。水性相を廃棄し、ペレットを再懸濁させ、４℃においてＰＢＳ中で一夜透析した。不溶性物質を７０，０００ｇにおける遠心により除去し、上清を０．２２μｍの膜を通して濾過し、Ｍ２抗ＦＬＡＧ抗体のアフィニティーカラム（Brizzard et al．、1994）またはＮＣ４１Ｆａｂセファローズ４Ｂアフィニティーカラムによりアフィニティー精製した。アフィニティー樹脂をＴＢＳ（０．０２５ＭのＴｒｉｓ緩衝化生理食塩水、ｐＨ７．４）中で平衡化し、そして結合したタンパク質をおだやかな溶離緩衝液（Pierce）で溶離した。ｓｃＦｖ −０を約１ｍｇ／ｍｌに濃縮し、ＴＢＳに対して透析し、４℃において貯蔵した。アフィニティー精製したｓｃＦｖ−０のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、ウェスタン分析で抗ＦＬＡＧＭ２抗体と反応する、２７ｋＤａの単一のタンパク質のバンドを明らかにした（第１２図）。２７ｋＤａのタンパク質のＮ−末端の配列の分析は、１１−１Ｇ１０のＶ_HドメインのＮ−末端について期待された配列を与え、そしてｐｅ１Ｂリーダー配列が正しく切断されたことを確証した。実施例８．１１−１Ｇ１０ｓｃＦｖフラグメントのサイズ排除ＦＰＬＣクロマトグラフィー、分子量の測定および結合活性アフィニティー精製された11-1G10scFv-0は、実施例５に記載されている通りであった。この実施例に記載する他のタンパク質について、上記実施例５に記載するｓｃＦｖ−０に類似する条件下に、11-1G10scFv-15（向きＶ_H−（Ｇｌｙ₄Ｓｅｒ）₃−Ｖ_Lの１５残基のリンカーからなる）を合成した。11-1G10scFv-15はゲル濾過により２７ｋＤａのモノマーとして単離され、そして、異なるｓｃＦｖ− １５のフラグメントを使用する前の研究と同様に、４℃において数週間安定であることが示された。この明細書において前述したように、親のハイブリドーマＩｇＧからタンパク質分解によりＮＣ４１および１１−１Ｇ１０のＦａｂフラグメントを調製した。ＰＢＳ中のスーパーデックス75HR10/30カラムまたはスペローズ12HR10 /30カラム（Pharmacia）のサイズ排除ＦＰＬＣにより、11-1G10scFv-0およびｓｃＦｖ−１５を分画して、分子の大きさおよび凝集状態を測定した。 11-1G10scFvとＮＣ４１Ｆａｂとの間で形成された複合体を、ＰＢＳ中のスペローズ１２カラムのサイズ排除ＦＰＬＣ（流速０．５ｍｌ／分）により分析し、単離した。記載されたように（Kortt et al.、1994）、ＦＰＬＣカラムを標準のタンパク質で目盛定めした。アミノ酸組成から計算された部分的比体積を使用して、以前に記載されたように（Kortt et al.、1994）ベックマン(Beckman)XLA型遠心機の沈降平衡化により、各単離された複合体の分子量を測定した。記載されているように（Kortt et al.、1994）改善されたファーマシアBIAcore^TM１０００を使用して、固定化ＮＣ４１Ｆａｂに対するモノマーの11-1G10scFv-15および三量体の１１−１Ｇ１０ｓｃＦｖ−０の結合を分析した。得られる結合曲線をBI Aevaluation 2.1ソフトウェア（Pharmacia Biosensor）で分析して、見掛けの解離速度定数の値を得た。アフィニティー精製されたｓｃＦｖ−０をスーパーデックス７５カラム（第１３図）またはスペローズ１２カラム（第１４図）のＦＰＬＣによりゲル濾過すると、三量体の計算された分子量（計算されたＭｒ７９．４ｋＤａ）と一致する、Ｍｒ約８５ｋＤａの単一のピークが明らかにされた。ｓｃＦｖ−０調製物のゲル濾過は、モノマーおよび二量体の証拠を示さず、そして単一のＶドメインへのタンパク質分解的分解の証拠を示さなかった。沈降平衡化分析において、ｓｃＦｖ−０はＭｒ抗体８５ｋＤａを有する独特な種として移動することが示され（表６）、三量体のコンフォメーションと一致し、そして三量体の種と急速に平衡化して存在することがある二量体の種についての証拠は存在しなかった。ＮＣ４１ＦａｂとｓｃＦｖ−１５モノマーまたはｓｃＦｖ−０三量体との複合体をサイズ排除ＦＰＬＣクロマトグラフィーにより単離し、ベックマンＸＬＡ型超遠心分離機中の沈降平衡化により分析した。Kortt et al.、1994が記載する方法により、分子量を２０℃において実験的に測定した。ＮＣ４１Ｆａｂの計算した分子量は４７２７３Ｄａであり、ｓｃＦｖ−１５は２８４２７Ｄａであり、そしてｓｃＦｖ−０は２６４６６Ｄａである。比較において、また、ｐＧＣベクターをＨＢ２１５１大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞中で使用して、１１−１Ｇ１０のｓｃＦｖ−１５フラグメント（向きＶ_H− （Ｇｌｙ₄Ｓｅｒ）₃−Ｖ_Lにおける１５残基のリンカーからなる）を合成し、次いでゲル濾過および沈降平衡化により測定されたＭｒ約２７ｋＤａを有する安定なモノマーとして精製された（第１３図）。前の実施例はＮＣ１０ｓｃＦｖフラグメントのゲル濾過および沈降平衡化の研究を示し、これらの研究において、ｓｃＦｖ−１５モノマーはＭｒ約２７ｋＤａを有し、ｓｃＦｖ−５二量体はＭｒ約５４ｋＤａを有し、そしてｓｃＦｖ−０三量体はＭｒ約７０ｋＤａを有することが明らかにされた。したがって、１１−１Ｇ１０およびＮＣ１０の双方の抗体からから誘導されるモノマーのｓｃＦｖ−１５についての約２７ｋＤａの計算したおよび実験のＭｒはほとんど同一であるが、１１−１Ｇ１０からのｓｃＦｖ−０は三量体について予測されたＭｒ（７９ｋＤａ）よりもわずかに大きいＭｒ約８５ｋＤａを示し、そしてＮＣ１０からのｓｃＦｖ−０は三量体よりもわずかに小さいＭｒ約７０ｋＤａを有した。スペローズ１２カラム上のＦＰＬＣによりゲル濾過分析により、すべてのｓｃＦｖ−０はNC41Fabと相互作用して、Ｍｒ約２４５ｋＤａの安定な複合体を形成した（第１４図）が、ｓｃＦｖ−１５モノマーはＮＣ４１Ｆａｂと相互作用して、Ｍｒ約７９ｋＤａの安定な複合体を形成した８（示されていない）。これらの複合体の分子量は沈降平衡化分析により、それぞれ、２６２ｋＤａおよび７８．６ｋＤａであると測定された（表６）。さらに、双方の単離された複合体は希釈および凍結に対して安定であった（データは示されていない）。これらのデータは３つのＦａｂ分子と結合する三量体のｓｃＦｖ−０と一致するが、モノマーのｓｃＦｖ−１５はＦａｂと１：１１：１複合体を形成した。固定化されたＮＣ４１Ｆａｂに対するｓｃＦｖ−１５モノマーおよびｓｃＦｖ−０三量体の結合をＢＩＡｃｏｒｅ^TMにより比較すると（第１５図）ｓｃＦｖ−０三量体／NC41Fab複合体の見掛けの解離速度（ｋ_d約８．２×１０^-5／秒）は、ｓｃＦｖ−１５モノマー／NC41Fab複合体についてのそれ（ｋ_d，約３．２×１０^-4／秒）よりもほぼ４倍遅いことが示された。11-1G10scFv-0三量体についての４倍減少した見掛けの解離速度は、NC10scFv-0三量体についての前の実施例５に類似し、そして双方ｓｃＦｖ−０三量体についての機能的アフィニティーを増加させる、多価の結合に帰属させることができる。実施例９．（Ｖ_L−Ｖ_H）の向きを有するＮＣ１０ｓｃＦｖ−０の設計および合成、サイズ排除ＦＰＬＣクロマトグラフィー NC10scFv-0(V_L-V_H)遺伝子は、Ｖ_L遺伝子のＤＩＥＬのＮ−末端の残基の直前のｐｅｌＢリーダー配列をコードした。Ｖ_L遺伝子のＣ−末端は残基KLEIR¹⁰⁷（ここでＲはＶ_Lについて異常である）。Ｖ_HのＮ−末端（残基ＱＶＱＬ）は直後に存在して、リンカーを含まない構築物を形成した。Ｖ_HのＣ−末端は残基ＶＴＳ¹¹² で終結し、その直後に、アフィニティー精製のためのＣ−末端のＦＬＡＧ^TM配列が存在した。次いで、NC10scFv-0V_L-V_H遺伝子をサブクローニングし、Kortt et al.、1994および上の実施例１〜４に記載されている方法に従い、熱誘導可能な発現ベクターｐＰＯＷ中で発現させた。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞のペレットからのNC10scFv-0(V_L-V_H)の単離は、抽出および６ＭのＧｕＨＣｌを使用する可溶化、セファデックスＧ−１００カラムを使用する予備的精製、および抗ＦＬＡＧＭ２アフィニティーカラムを使用し、Kortt et al.、1994に記載されている方法を使用するアフィニティー精製を必要とした。精製されたNC10scFv-0(V_L-V_H)のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析は、約３０ｋＤａに主要なタンパク質のバンドを与えた。０．５ｍｌ／分の流速で展開したスペローズ12HR10/30カラム（Pharmacia）上の精製されたscFv-( V_L-V_H)のＦＰＬＣ分析は、２２．０１分において溶出する主要なタンパク質のピークを与え、明確な肩はピークの後縁に位置した（第１７図）。NC10scFv-0(V_L- V_H)三量体は、このカラム上で２３．１９分において溶出した。直列に結合された２つのスペローズ12HR10/30カラム上のＦＰＬＣ分析において、アフィニティー精製されたNC10scFv-0(V_L -V_H)から２つのタンパク質のピークが分離され、見掛けの分子量は１０８ｋＤａおよび７８ｋＤａであった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析の双方において、これらのピークは抗体３０ｋＤａにおけるバンドを生じた。２つのスペローズカラムを使用するＦＰＬＣ分析において、NC10scFv-0(V_L-V_H)は三量体（Ｍｒ約７８ｋＤａ）および四量体（１０８ｋＤａ）の双方を形成し、これらは安定であり、そしてゲル濾過により単離することができる。精製されたNC10scFv-0(V_L-V_H)四量体およびNC10scFv-0(V_L-V_H)三量体は、抗イディオタイプ3-2G12Fabと反応して、４Ｆａｂ／四量体および３Ｆａｂ／三量体の複合体を生じ、２つのNC10scFv-0(V_L-V_H)分子の四価および三価の特質を証明した。3-2G12Fab'抗イディオタイプＦａｂと複合化した、単離されたNC10scFv-0 V_L-V_Hの三量体および四量体の複合体のＥＭ分析は、第１６ｃ図および第１６ｄ図に示すように、三脚および十字形の画像を示し、これらは３官能ＴＢＲｓを有する三量体および４活性ＴＢＲｓを有する四量体と一致する。実施例１０．C215scFv-0 の設計および合成ゼローリンカーのC215scFv遺伝子構築物を構築する戦略は実施例７に記載されており、ここでＶ_L配列の５’末端（Ｇｌｕ¹）はＶ_H配列の３’末端（Ｓｅｒ¹¹³ ）に直接結合されている。Ｃ２１５のＶ_HおよびＶ_L遺伝子（Forsberg et al．、 1997）を親のＦａｂコーディング領域からＰＣＲにより増幅し、そしてＰＣＲオーバーラップー発現によりｓｃＦｖ−０遺伝子の中に結合した。ｓｃＦｖ−０遺伝子を発現ベクターpGCのSfil-Notl部位の中にクローニングした。発現ベクターｐＧＣはＮ−末端のｐｅｌＢリーダー配列およびＣ−末端のＦＬＡＧオクタペプチド標識テイルを提供する（Coia et al．、 1996）。Ｖ_LのＣ−末端は残基ＥＬＫ¹⁰⁷で終結し、その直後に、アフィニティー精製のためのＣ−末端のＦＬＡＧ^TM配列が存在した。また、ｓｃＦｖ−０−リンカー遺伝子を、細胞質発現べクターである発現ベクターpRSET^TMのＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＩ部位の中にクローニングした。ｐＲＳＥＴの中にクローニングするための正しい制限部位を有するＣ２１５を増幅するために使用したオリゴヌクレオチドは、次の通りである：前方向：ＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＣＡＧＧＴＣＣＡＡＣＴＧＣＡＧＣＡＧ（配列識別ＮＯ：１８）後方向：ＡＴＴＡＧＧＣＧＧＧＣＴＧＡＡＴＴＣＴＴＡＴＴＴＡＴＣＡＴＣ（配列識別ＮＯ：１９）アルカリ性溶解により精製されたＤＮＡを使用して、クローニングされたｓｃＦｖ−０インサートの全体のＤＮＡ配列を決定し、そしてＰＲＩＳＭサイクル配列決定キット（ＡＢＩ）を使用して、配列決定反応を実施した。これにより、C2 15scFv-0遺伝子はＣ−末端のＶ_H−ｓｅｒ¹²¹およびＮ−末端のＶ_L−Ｇｌｕ¹のコドンの間の直接結合を含むことが確証された。実施例７に詳述されているように、C215scFv-0のＨＢ１０１大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の発現を実施した。C215scFv-0を約１ｍｇ／ｍｌに濃縮し、ＴＢＳに対して透析し、４℃において貯蔵した。アフィニティー精製されたｓｃＦｖ−０のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析はＭｒ約２８ｋＤａの単一のタンパク質のバンドを明らかにし、これはウェスタン分析すると、抗ＦＬＡＧＭ２抗体と反応した。Ｍｒ約２８ｋＤａのタンパク質のＮ−末端の配列の分析は、Ｃ２１５Ｖ_HドメインのＮ− 末端について期待された配列を与え、そしてｐｅｌＢリーダー配列が正しく切断されたことを確証した。実施例１１．C215scFv-0 のサイズ排除ＦＰＬＣクロマトグラフィーアフィニティー精製されたC215scFv-0は実施例１０に記載する通りであった。目盛定めされたスペローズ１２カラム（ＨＲ１０／３０）のＦＰＬＣによるアフィニティー精製されたC215scFv-0のゲル濾過は、第１８図に示すように、２０．２０分の保持時間を有するＭｒ約８５ｋＤａ（見掛けの三量体）の主要なピークを明らかにした。ｓｃＦｖ−０調製物のＳＤＳ−ＰＡＧＥは、単一のＶ−ドメインへのタンパク質分解的分解の証拠を示さなかった。C215scFv-5は二量体として展開する（示されていない）。実施例１２．Ｉｇ様Ｖドメインの三特異的トリアボディーの設計および構築３つの異なる結合特異性を有する三量体に集合させるように設計された、３つの離散した二特異的Ｉｇ様Ｖドメインの構築：ＣＴＬＡ−４−０をＣＤ８６に結合させ、ＣＴＬＡ−４−０をＵＶ−３ＶＬに結合させ、そしてＵＶ−３ＶＨ −０をＣＤ８６に結合させた。表６に列挙する、適当なオリゴヌクレオチドの対を有する親のコーディング領域からＰＣＲにより、Ｉｇ様Ｖドメインを別々に増幅した：それぞれ、#4474/#4 475(UV-3 VH)、#4480/4481(UV-3 VL)、#4470/#4471(ヒトCTLA-4)(Dariavach 198 8)、#4472/#4473(CD86V ドメイン）。オリゴヌクレオチド＃４４７０及び＃４４７３を使用する結合ＰＣＲにより、ヒトＣＴＬＡ−４およびＣＤ８６（AruffoおよびSeed 1987）を０−リンカー遺伝子構築物の中に結合した。オリゴヌクレオチド＃４４７８及び＃４４７１を使用する結合ＰＣＲにより、ヒトＣＴＬＡ−４およびＵＶ−３ＶＬを０−リンカー遺伝子構築物の中に結合し、そしてオリゴヌクレオチド＃４４７４及び＃４４７７を使用する結合ＰＣＲにより、ＵＶ−３ＶＨおよびヒトＣＤ８６を０−リンカー遺伝子構築物の中に結合した。これはＣ−末端のＵＶ−３Ｖ_H−Ａｌａ¹¹⁴ およびＮ−末端のＣＤ８６−Ａｌａ¹のためのコドンの間の結合をＰＣＲオーバーラップ−発現により生成した。Ｉｇ様Ｖドメイン０−リンカー遺伝子構築物を発現ベクターｐＧＣのＳｆｉｌ−Ｎｏｔｌ部位の中にクローニングした。発現ベクターｐＧＣはＮ−末端のｐｅｌＢリーダー配列およびＣ−末端のＦＬＡＧオクタペプチド標識テイルを提供する（Coia et al．、1996）。Ｃ−末端のCTLA-4-A la¹¹²およびＮ−末端のＣＤ８６−Ａｌａ¹のコドンの間のＰＣＲオーバーラップ −発現による結合は、Ｉｇ様Ｖドメイン０−リンカー遺伝子構築物を生成し、この構築物を発現ベクターｐＧＣのＳｆｉｌ−Ｎｏｔｌ部位の中にクローニングした。Ｃ−末端のCTLA-4-Ala¹¹²およびＮ−末端のUV-3-VL-Glu¹のコドンの間のＰＣＲオーバーラップ−発現による結合を使用して、Ｉｇ様Ｖドメイン０−リンカー遺伝子構築物を生成し、この構築物を発現ベクターｐＧＣのＳｆｉｌ−Ｎｏｔｌ部位の中にクローニングした。Ｖ_LのＣ−末端の直後に、アフィニティー精製のためのFLAG^TM配列が存在した。アルカリ性溶解により精製したＤＮＡを使用して、０−リンカーを有するクローニングされたＩｇ様Ｖドメインの全体のＤＮＡ配列を決定し、そしてＰＲＩＳＭサイクル配列決定キット（ＡＢＩ）を使用して、配列決定反応を実施した。これにより、Ｉｇ様Ｖドメイン０−リンカー遺伝子構築物がドメインの各々のコドンの間の直接結合を含むことが確証された。発現は実施例５に記載されている通りであった。アフィニティー精製された CTLA-4-0-CD86、CTLA-4-0-UV-3 VLまたはUV-3 VH-0-CD86を目盛定めされたスペローズ１２カラム上のＦＰＬＣによりゲル濾過すると、各構築物について約２０．００分における主要なピークが明らかにされ（示されていない）、これは三量体の保持時間と一致した。８Ｍの尿素および他の離解試薬を使用して、ホモ三量体を解離し、ホモ三量体の形成を防止する。精製されたＣＴＬＡ−４−０−ＣＤ８６、ＣＴＬＡ−４−０−ＵＶ−３ＶＬおよびＵＶ−３ＶＨ−０−ＣＤ８６のＩｇ様Ｖドメインを混合し、そしてゲル濾過および透析により離解試薬を除去すると、三特異的三量体が形成する。論考外来の柔軟性リンカーのポリペプチドを欠如するｓｃＦｖ−０分子の設計Ｖ_H−Ｖ_LおよびＶ_L−Ｖ_Hの結合の設計は、まずNC10scFv-15の結晶構造からのＮ−末端の残基とＣ−末端の残基との間の正確な距離にに基づく（Kortt et al. 、1994）。以前の研究はＶ_HおよびＶ_Lドメインを結合してｓｃＦｖを生成するための柔軟性リンカーのポリペプチドの設計（Huston et al．、1991;RaggおよびW hitlow、1995）、およびｓｃＦｖの溶液の性質に対するリンカーの構造の効果（ Holliger et al．、1993;Desplarlcq et al．、1994;Whitlow et al．、1994;Al fthan et al．、1995;SolarおよびGershoni、1995）を研究した。Huston et al ．（1989、1991）が記載した古典的１５残基のリンカー、（Ｇｌｙ₄Ｓｅｒ）₃を有するｓｃＦｖは、モノマー、二量体およびより高い分子量のマルチマーとして存在することができる（Holliger et al．、1993;Whitlow et al．、1994;Kortt et al．、1994）。Whitlow et al.（1994）はｓｃＦｖの二量体化するこの性向を利用して、２つの異なる抗体（４−４−２０およびＣＣ４９）のＶ_HおよびＶ_Lドメインを結合して混合ｓｃＦｖを形成し、次いで２０％のエタノール、０．５Ｍのグアニジン塩酸塩の存在において２つのｓｃＦｖの混合物をリフォルディングして活性ヘテロダイマーを形成することによって、二特異的二量体を作った。１５残基またはそれより長いリンカーを有する、このアプローチの主要な欠点は、異なるＶ_HおよびＶ_Lの対合が異なる二量体化および解離速度を示すことである。種々のｓｃＦｖ型構築物は第２１図に図解されている。４つの型は同定される：Ａ：Ｖ_H−Ｌ −Ｖ_LからなるｓｃＦｖ、ここでＬはWhitlow et al.およびWO93/31789;Ladner e t al.、米国特許第4,946,778号およびWO88/06630；およびMcCafferty et al．およびMcCafferty et al．に記載されているリンカーポリペプチドである。Ｂ：単一のポリペプチドＶ_H−Ｌ１−Ｖ_L−Ｌ２−Ｖ_H−Ｌ３−Ｖ_L、これはリンカーのポリペプチドＬ２により結合された２つのｓｃＦｖモジュールを形成し、ここで各ｓｃＦｖモジュールのＶ_HおよびＶ_Lドメインは、それぞれ、ポリペプチドＬ１およびＬ３により結合される。この設計はChang、AU-640863およびGeorge et al．により記載された。Ｃ：各々がＶ_H−Ｌ１−Ｖ_L−Ｌ２（ａ、ｂ）からなる２つのｓｃＦｖ分子、ここでＶ_HおよびＶ_LドメインはリンカーのポリペプチドＬ１により結合され、そして２つのｓｃＦｖドメインはＣ−末端の接着性リンカーＬ２ａおよびＬ２ｂにより一緒に結合されている。この設計はPack et al．、PI-93-258685により記載された。Ｄ：PCT/AU93/00491の設計、明らかに上記Ａ、ＢおよびＣと異なる。単一のｓｃＦｖ分子Ｖ_H−Ｌ−Ｖ_Lは短縮されたリンカーのポリペプチドＬを含み、このリンカーのポリペプチドＬはＡ、ＢまたはＣ型のｓｃＦｖの形成を特異的に防止し、その代わりに、２つのｓｃＦｖを自己会合させて、２つの抗原結合部位（標的結合領域；ＴＢＲ−Ａ）を有する二価ｓｃＦｖ二量体を形成させる。２つの異なるｓｃＦｖ分子の会合は、二重特異的ダイアボディー（ＴＢＲｓ−Ａ、Ｂ）を形成するであろう。１２残基より少ないリンカーは同一鎖上のＶ_HおよびＶ_Lドメインの間の対合を可能とするためには短か過ぎ、そしてドメインをダイアボディーと呼ぶ二量体への分子間の対合を可能とするために使用されてきている（Holliger et al．、19 93、1996;Zhu et al．、1996;PCT/AU93/00491;WO94/13804およびWO95/08577）。 Holliger etal.、1993;WO94/13804およびWO95/08577は背合せで結合したＶ_Hドメインを有するｓｃＦｖダイアボディーのモデルを記載し、そしてこれらの構造物が少なくとも１つまたは２つ残基のリンカーを必要とすることを示唆した。このモデルは５残基のダイアボディーの結晶構造において確証された（Perisic et a l.、1994）が、ｓｃＦｖ−０は、Ｖ_Hドメインの高度の回転を使用してさえ、このコンフォメーションに適合させることができないことが認められた。Desplanc q et al.（1994）は、１０、５およびゼロ残基のリンカーを有する１系列のｓｃＦｖを記載し、そしてＦＰＬＣ分析に基づいて、これらのｓｃＦｖが主として少量のモノマーを有する二量体であると結論した。Alfthan et al.（1995）は、また、長さが２残基まで、小さいリンカーを有するｓｃＦｖが二量体を形成したことを報告した。McGuinness et al．（1996）は、二特異的ｓｃＦｖ−０分子がダイアボディーであり、それらをバクテリオファージのライブラリーから表示し、選択できることを主張した。しかしながら、これらの研究のいずれも、二量体が実際に形成されたかどうかを確証するために、発現された可溶性生成物について正確な分子大きさの測定を実施しなかった。ｓｃＦｖ三量体我々は、今回、NC10scFv-0がＦＰＬＣおよび沈降平衡化分析で７０ｋＤａの分子量を生じ、これは二量体について期待される分子量（５２ｋＤａ）よりも有意に高く、そして三量体の分子量（７８．５ｋＤａ）よりも小さいことを発見した（表２）。抗イディオタイプ3-2G12Fab'を使用する結合実験は、ｓｃＦｖ−０が、３Ｆａｂ’フラグメント結合／ｓｃＦｖ−０と一致する、Ｍｒ２１２ｋＤａの複合体を形成することを示した。この結果が確証するように、７０ｋＤａのNC10 scFv-0は三量体であり、そして３対のＶ_HおよびＶ_Lは相互作用して３つの抗原結合部位（ＴＢＲｓ）を形成する。このｓｃＦｖ−０構造は、より高い分子量のマルチマーを形成する性向を示さなかった。NC10scFv-0三量体もまたニューロアミニダーゼに結合したが、抗原結合部位の配置は、NC10scFv-0上の第２抗原結合部位が、第８図にｓｃＦｖ−１０およびｓｃＦｖ−５二量体について示すように、「サンドイッチ」にニューロアミニダーゼの四量体と架橋することができないようなものである。また、11-1G10scFv-0はもっぱら三量体を形成し、これらの三量体は溶液中の複合体の形成によりＦａｂ結合について三価であることが示された（表４）。NC10scFv-0(V_L-V_H)も三量体を形成した（第１７図）。 NC10scFv座標をベースとして、「Ｏ」分子グラフィックスパッケージを有する円形の３倍の対称（Jones et al.、1991）を使用して、プロテイン・データベース・エントリー１ＮＭＢ（Malby et al. 、1994）およびMOLSCRIPT(Kraulis、1991)におけるNC10scFvドメインの座標から、ゼロ残基結合ｓｃＦｖ三量体のコンピューターグラフィックのモデル（第２図に示す）を構築した。Ｖ_HドメインのＣ−末端残基のＳｅｒ１１２を、Ｖ_LドメインのＮ−末端残基のＡｓｐ１に、単一のペプチド結合により結合した。Ｖ_HおよびＶ_Lドメインはペプチド結合の回りに回転して、ドメインの間の立体的クラッシを最小にした。コンフォメーションおよびＣＤＲ位置は、分子プロセシングの三価のアフィニティーと一致した。Ｖ_H−Ｖ_L界面を横切るＦｖモジュール間の小さい接触面積は、NC10scFv-5二量体に比較してNC10scFv-0三量体のタンパク質分解感受性のわずかの増加を説明することができる。タンパク質の化学的データは対称および非対称の三量体を区別することができないが、このモデルはゼロリンカーのｓｃＦｖがドメイン間の立体的拘束なしに三量体を形成できることを証明した。 NC10scFv-0三量体のこれらのモデル（第２図および第８図）、およびＥＭ造影（第１６図）において、３つのＦａｂ’分子に対するＴＢＲｓは平面でないように見えるが、三脚の脚におけるように１つの方向を指している。明らかなように、いくつかの立体配置をモデル化し、Ｆｖ分子の柔軟性および３つの結合抗原の近接性の双方を制限する立体的拘束により誘導することができる。対照的に、Ｖ_HドメインのみがＦｖ分子の間で接触している、二量体の構造がｓｃＦｖ−０について提案された（Perisic et al.、1994）。リンカーが３残基より小さい長さであるとき、これらの二量体の構造は重大な立体的拘束を付与する。我々のデータは、三量体がNC10scFv-0および11scFv-0の双方について二量体よりも独占的に好適であることを示す。立体的拘束は二量体の形成を多分防止し、ｓｃＦｖ−０分子のために一般に好ましいコンフォメーションとして三量体の立体配置を生ずる。ｓｃＦｖの結合アフィニティー BIAcore^TMバイオセンサーを使用する結合の研究は、試験したすべてのｓｃＦｖが固定化抗イディオタイプ3-2G12Fab'に結合することを示した。二量体および三量体を分析物として使用する場合において、多価の結合が結合活性効果を生じ、反応速度論的相互作用のモデルを無効にしたので、反応速度の定数を評価しなかった。固定化NC10scFv-0を使用する実験は、抗イディオタイプ３−２Ｇ１２Ｆａｂ’についての各抗原結合部位（ＴＢＲ）のアフィニティーが本質的に同一であること（表４）、および第１０図に示すアフィニティーの増加が明らかに結合活性効果のためであることを示した。溶液中の複合体形成のデータは、ｓｃＦｖが抗原に化学量論的に結合するという結論を支持した。多価の結合によるアフィニティーの増加（結合活性）は、これらのマルチマーを治療試薬および診断試薬として魅力的とする。さらに、トリシストロンの発現ベクターの構築は三特異的ｓｃＦｖ−０試薬の製造を可能とする。結論すると、この明細書は、ＮＣ１０Ｖ_HおよびＶ_Lドメインを結合する１０または５残基のリンカーが二価の二量体をもっぱら形成することを示す。異なる分子からのＶ_HおよびＶ_Lドメインの対合は、非共有結合的に架橋したダイアボディーを生ずる。ｓｃＦｖ−５およびｓｃＦｖ−１０構築物について、モノマーは形成せず、そして観測されたモノマー種がタンパク質分解的に生成されたＦｖフラグメントである。ｓｃＦｖ−０としてＮＣ１０Ｖ_HおよびＶ_Lドメインの直接結合は、抗原と結合することができる３つの抗原結合部位（ＴＢＲｓ）を有する三量体を生成した。以前のｓｃＦｖ− ０構築物は二量体であると報告され、それらの構築物中のＣ−末端およびＮ−末端の残基が多少の柔軟性を有し、そして短いリンカーとして作用することができることを示唆する（Holliger et al．、1993）。事実、５残基のリンカーを含むダイアボディーのＦｖ分子間の許された柔軟性が最近モデル化され（Holliger e t al．、1996）、そして多分５残基より小さいリンカーはこの柔軟性をひどく拘束するであろう。三量体のコンフォメーションがNC10scFv-0に対して独特であり、多分Ｖドメインの間の立体的クラッシのためであり、これは二量体の解離を妨害すると、我々は最初に考えた。しかしながら、この明細書において我々が示すように、Ｖドメインの間の２までの柔軟性残基で結合されたNC10scFv分子もまた三量体を形成する。また、我々が示すように、NC10scFv-0V_L-V_Hについて、逆向きは三量体であるが、また、四量体であることができる。さらに、我々が示すように、抗イディオタイプ１１−１Ｇ１０抗体から構築された、Ｖ_H−Ｖ_Lの向きの第２ｓｃＦｖ− ０は、三量体であることができ、そして三価の特異性を有する。また、我々が示すように、Ｃ２１５抗体から構築された、Ｖ_H−Ｖ_Lの向きの第３ｓｃＦｖ−０もまた三量体を形成することができる。この明細書において、２つの免疫グロブリン様ドメインの直接結合により構築された三量体のｓｃＦｖ−０分子を製造する方法を記載し、このような分子はＶ_H −Ｖ_LおよびＶ_L−Ｖ_Hの向きのｓｃＦｖ−０分子を包含するが、これらに限定されず、そして多特異的試薬の設計を教示する。三量体を形成するｓｃＦｖ−０と同等の構築物において、リンカーを使用しないで、非抗体由来のＩｇ様Ｖドメインがまた結合され、そして我々はここにおいてＣＤ８６（Ｉｇ様Ｖドメイン）のＣＴＬＡ−４（Ｉｇ様Ｖドメイン）への結合、ならびにこれらの各々の、それぞれ、ＵＶ−３ＶＨおよびＵＶ−３ＶＬへの結合を示した。これらの構築物の各々により三量体の形成が教示するように、多特異的、この場合において、三特異的の三量体は、第１図の面ＩＩに示すように、形成することができ、ここでＵＶ− ３のＶＨおよびＶＬは非共有結合に会合し、ＣＤ８６Ｉｇ様Ｖドメインは非共有結合に会合し、そして２つのＣＴＬＡ−４Ｉｇ様ドメインは非共有結合に会合する。多価試薬の設計三量体のNC10scFv-0の設計において、残基Ｓｅｒ¹¹²およびＡｓｐ¹をドメインの直接融合物として結合し、そして、多分、柔軟性リンカーの非存在は二量体の立体配置を妨害する。柔軟性ヒンジ領域の開始前のＶ_Hドメインのフレームワークへの水素結合により拘束される最後の残基に直ぐに隣接する残基として、Ｃ− 末端の残基Ｓｅｒ¹¹²を結晶学的分析により得られた正確な構造のデータ（Malby etal．、1994）から選択した。同様に、Ｖ_LのＡｓｐ¹はＶドメインのフレームワークに水素結合することが知られており、そして抗原結合部位に密接したが、抗原の結合に関係しなかった。同様な原理的説明を使用して、NC10scFv-0V_L-V_H 分子をＮ−末端のＶ_H残基Ｇｌｎ¹へのＣ−末端のＶ_L残基Ａｒｇ¹⁰⁷の直接結合として合成し（残基はMalby et al.、1994、から採用した）、そしてこれらの分子はＦＰＬＣ分析により安定な三量体に会合することが示された（第１７図）。１１−１Ｇ１０についての構造のデータは存在しないので、Ｖドメインのフレームワークからの末端のβ−鎖のアンフォルディングが存在しなかぎり、Ｖ_L− Ｇｌｎ¹へのＶ_H−Ｓｅｒ¹¹³の直接結合は柔軟性リンカーの形成を同様に妨害すると、我々は構造の相同性から仮定した。11-1G10scFv-0は三量体をもっぱら形成し（第１３図）、これらの三量体は溶液中の複合体の形成によるＦａｂの結合に対して完全に活性でありかつ三価であることが示された（第１４図）。対照的に、１１−１Ｇ１０ｓｃＦｖ−１５は小さい百分率の二量体を含むモノマーを優先的に形成し、最も以前のｓｃＦｖ− １５構造の観測と一致した。計算した分子量とゲル濾過および沈降平衡化により測定した実験の分子量との間のわずかの差は、これらの分析方法の通常誤差の範囲内である（表５）。期待されるように、BIAcoreバイオセンサーによる固定化ＮＣ４１Ｆａｂを使用する結合実験において、三量体はモノマーに比較して、遅い解離速度を有し、これは多価の結合の結合活性の増加に帰属させることができる（第１５図）。総合すると、ｓｃＦｖ−０分子の我々の例が証明するように、直接的結合したＶ_H−Ｖ_LまたはＶ_L−Ｖ_Hドメインは三量体のｓｃＦｖ−０分子を形成し、ある場合において、四量体をドメインする。Ｖ_H−Ｖ_LまたはＶ_L−Ｖ_Hの結合のために選択される残基はＶドメインのフレームワークに対して密接すべきであり、そして実験的に決定することができるか、あるいは既知のＦｖ構造に対する相同性により予測することができる（Malby et al.、1994）。多分、より柔軟性のリンカーを形成する追加の残基は、ダイアボディーの形成を可能とするであろう（Hollig er et al．、1993;PCT/AU93/00491;WO94/13804;WO95/08577）。ｓｃＦｖ−０分子は、ドメイン間の立体的拘束なしに、対称の三量体のコンフォメーションに容易にモデル化することができる（第２図）。NC10scFv-0のこのモデルにおいて、三量体／Ｆａｂ複合体のＦａｂのアームは平らな立体配置において拡張されないが、１つの方向に一緒に角度をもたせ、三脚の脚として出現する。明らかなように、別の立体配置をモデル化し、Ｆｖモジュールの柔軟性および３つの結合抗原の近接性の双方を制限する立体的拘束により誘導することができる。不都合なことには、タンパク質の化学的データ単独では対称または非対称の三量体の立体配置を区別することができない。当業者は認識するように、Ｖドメインの向きの効果および柔軟性リンカー中の２つまでの残基の要件は他のｓｃＦｖ分子について異なることがあるが、好ましいリンカーの長さおよびＶドメインの向きは、この明細書に記載されている設計された相互作用的変更を使用して、容易に決定することができる。用途この明細書において予測されるように、ポリマーの立体配置、特に三量体および四量体は、多数の他のｓｃＦｖ−０分子における好ましい安定な立体配置である。モノマーを超えた二価のｓｃＦｖ二量体について報告された腫瘍／血液の比の増加（Wu et al．、1996）は、多分より高い結合活性およびクリアランス速度の減少から生じ、造影、診断および療法のための利点を提供する。結合活性によるアフィニティーのそれ以上の増加は、ダイアボディー（Wu et al．、1996）および多価の化学的複合体（Antoniuw et al．、1996、Casey et al.、1996;Adams et al．、1993;McCartney et al．、1995）に対する別の試薬としてｉｎｖｉｖｏ造影および腫瘍浸透のために三量体および四量体のｓｃＦｖを魅力的とする。二価のダイアボディーの設計は、２つの異なるｓｃＦｖ分子、Ｖ_HＡ−リンカー−Ｖ_LＢおよびＶ_HＢ−リンカー−Ｖ_LＡ、をin situで発現するジシストロンのベクターを使用する二特異的ダイアボディーの設計に直接的に導き、これらは会合して親の抗体ＡおよびＢの特異性を有するＴＢＲｓを形成し、これらからＶ遺伝子が単離された（Holliger et al ．、1993、1996;WO94/13804;WO95/08577）。これらの二特異的ダイアボディーのために選択したリンカー配列、Gly₄Ser、は、柔軟な親水性ヒンジを提供した。同様な方法において、この明細書に記載されている本発明の工程を使用して、トリシストロンのベクターを設計して、３つの異なるｓｃＦｖ−０分子、Ｖ_HＡ −Ｖ_LＢ、Ｖ_HＢ−Ｖ_LＣ、およびＶ_HＣ−Ｖ_LＡ、をin situで発現させることができ、これらは親の抗体Ａ、Ｂ、Ｃと同等のＴＢＲｓを有する三特異的三量体を形成し、これからＶ遺伝子が得られた。３つのＶ_H−Ｖ_LｓｃＦｖ−０分子は、第２図に示すそれに類似する概略的立体配置で三特異的三量体に会合することができる。容易に理解されるように、三特異的分子を均質に精製することは、３つの活性ＴＢＲｓについて選択するために、あるいは個々のエピトープ標識分子について選択するために、それらの順次のアフィニティーカラムを必要とするであろう。当業者は理解するように、逆向きＶ_L−Ｖ_Hは適当な別の立体配置である。トリシストロンの発現ベクターの構築は三特異的ｓｃＦｖ−０試薬の製造を可能とし、このような試薬はＴ細胞の漸増および活性化を包含するが、これらに限定されない用途を有する。同様に、４つの活性ＴＢＲｓを有する四量体は４つのｓｃＦｖの同一の分子の会合により形成可能であり、そして四特異的テトラボディーは、好ましくはテトラシストロンのベクターから同時に発現される、４つの異なるｓｃＦｖ分子の会合により形成可能である。当業者にとって明らかなように、明瞭さおよび理解を目的として、本発明を多少詳細に説明したが、この明細書に開示された本発明の概念の範囲から逸脱しないで、本明細書において記載する態様および方法に対する種々の変更および変化が可能である。本明細書において引用した参考文献を次のページに列挙し、引用することによって本明細書の一部とされる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者アービング，ロバートアレキサンダーオーストラリア国，ビクトリア 3170，ムルグレイブ，ハニーサックルアベニュ１ (72)発明者アトウェル，ジョンレズリーオーストラリア国，ビクトリア 3133，バーモントサウス，グレンウェリコート７

Claims

【特許請求の範囲】１．会合して３またはそれより多くの機能的標的結合領域（ＴＢＲｓ）を形成する３またはそれより多くのポリペプチドを含んでなり、そして各個々のポリペプチドが一緒に共有結合している２またはそれより多くの免疫グロブリン様ドメインを含んでなり、こうして単一のポリペプチド中の２つのＩｇ様ドメインは互いに会合してＴＢＲを形成しない、多価または多特異的タンパク質複合体。２．免疫グロブリン様ドメインが３より少ないアミノ酸残基のペプチドにより結合されている、請求項１に記載の多価または多特異的タンパク質複合体。３．免疫グロブリン様ドメインがリンカーペプチドを使用しないで共有結合されている、請求項２に記載の多価または多特異的タンパク質複合体。４．各ポリペプチドが２またはそれより多くの免疫グロブリン様ドメインを含んでなり、そしてドメインが外来リンカーポリペプチドを必要としないで共有結合されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の多価または多特異的タンパク質複合体。５．ポリペプチドが免疫グロブリンのスーパーファミリーの任意のメンバーの免疫グロブリン様ドメインを含んでなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の多価または多特異的タンパク質複合体。６．免疫グロブリン様ドメインが、抗体、Ｔ細胞レセプターフラグメント、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８、またはＣＴＬＡ４に由来する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の多価または多特異的タンパク質複合体。７．異なるポリペプチドを含んでなり、それらの各々が抗体のＶ_HおよびＶ_Lドメインおよび他の免疫グロブリンのドメインを含んでなり、前記ドメインが好ましくはポリペプチドリンカーを使用しないで共有結合されており、そしてポリペプチドが会合して異なる標的分子に対して向けられた活性ＴＢＲｓを形成している、請求項１〜６のいずれか一項に記載の多価または多特異的タンパク質複合体。８．癌細胞の表面分子に対して向けられた１つのＴＢＲと、Ｔ細胞の表面分子に対して向けられた１またはそれより多くのＴＢＲｓとを含んでなる、請求項７に記載の多価または多特異的タンパク質複合体。９．癌細胞の表面分子に対して向けられた１つのＴＢＲと、同一癌細胞上の異なる細胞の表面分子に対して向けられた第２ＴＢＲとを含んでなる、請求項７に記載の多価または多特異的タンパク質複合体。１０．同一であるか、あるいは異なることができる２つのポリペプチドを含んでなり、各ポリペプチドが２またはそれより多くの免疫グロブリン様ドメインを含んでなり、ここでポリペプチドは会合して異なる分子に対して向けられた３またはそれ以上の活性ＴＢＲｓを有する三量体を形成している、請求項１〜６のいずれか一項に記載の多価または多特異的タンパク質複合体。１１．ＣＴＬＡ４、ＣＤ２８、ＣＤ８０およびＣＤ８６から成る群より選択される共同刺激因子のＴ細胞の表面分子に対して向けられた、１つのＴＢＲを含んでなる、請求項８に記載の多価または多特異的タンパク質複合体。１２．ポリペプチドの１つが非抗体の免疫グロブリン様分子である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の多価または多特異的タンパク質複合体。１３．免疫グロブリン様分子がＣＴＬＡ４またはＣＤ２８の免疫グロブリン様分子の細胞外ドメイン、またはその誘導体、またはＢ７−１またはＢ７−２の免疫グロブリン様細胞外ドメインである、請求項１２に記載の多価または多特異的タンパク質複合体。１４．免疫グロブリン様ドメインが、生来の配列のそれよりも高い結合アフィニティーを同族レセプターに対してを有するように選択された、前記ドメインの自然の哺乳動物の配列のアフィニティー成熟類似体である、請求項１２または１３に記載の多価または多特異的タンパク質複合体。１５．非免疫グロブリン様ドメインを含んでなる、請求項１に記載の多価または多特異的タンパク質複合体。１６．モノマーのポリペプチドの各々のＴＢＲｓが、それぞれ、３つの別々の標的に対して向けられており、これにより前記複合体が複数の別々の特異性を有する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の多価または多特異的タンパク質複合体。１７．同一のポリペプチドを含んでなり、それらの各々が免疫グロブリンのＶ_H およびＶ_Lドメインを含んでなり、前記ドメインが好ましくはポリペプチドリンカーを使用しないで共有結合されており、そしてポリペプチドが会合して同一の標的分子に対して特異的な活性ＴＢＲｓを形成している、請求項１〜６のいずれか一項に記載の多価または多特異的タンパク質複合体。１８．モノマーとして不活性であるが、前記複合体の中で活性な、同一の抗原結合部位を形成する、同一のｓｃＦｖ分子を含んでなる、請求項１７に記載の多価または多特異的タンパク質複合体。１９．モノマーとして不活性であるが、前記複合体の中で活性な、同一の抗原結合部位を形成する、異なるｓｃＦｖ分子からなる、請求項１６に記載の多価または多特異的タンパク質複合体。２０．三量体である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の多価または多特異的タンパク質複合体。２１．四量体である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の多価または多特異的タンパク質複合体。２２．ポリペプチドの１またはそれ以上が生物学的に活性な物質、化学的因子、ペプチド、タンパク質または薬剤に結合している、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の多価または多特異的タンパク質複合体。２３．ポリペプチドのいずれかが化学的方法を使用して結合されている、請求項２２に記載の多価または多特異的タンパク質複合体。２４．ポリペプチドのいずれかが組換え法を使用して結合されている、請求項２２に記載の多価または多特異的タンパク質複合体。２５．請求項１〜２４のいずれか一項に記載の多価または多特異的タンパク質複合体と、薬学上許容される担体とを含んでなる医薬組成物。２６．有効量の請求項１〜２４のいずれか一項に記載の多価または多特異的タンパク質複合体を投与する工程からなり、前記タンパク質の１または２以上のＴＢＲｓはマーカーに対して向けられており、前記マーカーは、ａ）病理学的症状を引き起こす微生物の特徴を示すか、あるいはｂ）病理学的症状を発現する被検者の細胞の特徴を示し、そして前記タンパク質の他のＴＢＲは病理学的症状の治療に適当な治療因子に特異的に結合する、病理学的症状を治療する方法。２７．前記タンパク質の異なる２つのＴＢＲｓが病理学的症状の特徴を示すマーカーに対して向けられており、そして第３が治療因子に対して向けられている、請求項２６に記載の方法。２８．前記タンパク質の１つのＴＢＲが病理学的症状のマーカーまたはその原因となる微生物に対して向けられており、そして前記三量体の残りのＴＢＲｓが異なる治療因子に対して向けられている、請求項２６に記載の方法。２９．前記治療因子が細胞障害性因子、トキシン、または放射性同位元素である、腫瘍を治療するための請求項２６〜２８のいずれか一項に記載の方法。３０．病理学的症状を患うことが疑われる被検者に請求項１〜２４のいずれか一項に記載の多価または多特異的タンパク質複合体を投与し、そして適当な検出方法を使用して多価または多特異的タンパク質複合体の局在部位を同定する工程からなる、病理学的症状を診断する方法。３１．癌または血液の凝固を検出または定位する、請求項３０に記載の方法。３２．請求項１〜２４のいずれか一項に記載の多価または多特異的タンパク質複合体を含んでなる造影試薬。３３．多価または多特異的タンパク質複合体のすべてのＴＢＲｓが病理学的症状に対して特異的な分子のマーカーに対して向けられており、そして前記タンパク質が放射性同位元素で標識化されているか、あるいは適当な造影試薬に複合化されている、請求項３２記載の造影試薬。３４．多価または多特異的タンパク質複合体の異なる２つのＴＢＲｓが病理学的症状に対して特異的な２つの異なるマーカーに対して向けられており、そして第３が適当な造影試薬に対して向けられている、請求項３２に記載の造影試薬。３５．多価または多特異的タンパク質複合体の１つのＴＢＲが病理学的症状の特徴を示すマーカーに対して向けられており、第２ＴＢＲが病理学的症状が存在することが疑われる組織の部位に対して向けられており、そして第３のＴＢＲが適当な造影試薬に対して向けられている、請求項３２に記載の造影試薬。３６．前記タンパク質の１つのＴＢＲが病理学的症状の特徴を示すマーカーに対して向けられており、そして残りのＴＢＲｓが異なる造影試薬に対して向けられている、請求項３２に記載の造影試薬。３７．多価または多特異的タンパク質複合体が三量体または四量体である、請求項３２〜３６のいずれか一項に記載の造影試薬。３８．前記分子のマーカーが腫瘍に対して特異的である、請求項３２〜３７のいずれか一項に記載の造影試薬。