CN116284375A - 非pH依赖性长效型抗血清白蛋白纳米抗体及其应用 - Google Patents
非pH依赖性长效型抗血清白蛋白纳米抗体及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116284375A CN116284375A CN202310346381.8A CN202310346381A CN116284375A CN 116284375 A CN116284375 A CN 116284375A CN 202310346381 A CN202310346381 A CN 202310346381A CN 116284375 A CN116284375 A CN 116284375A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- seq
- nanobody
- serum albumin
- antibody
- albumin
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 title claims abstract description 98
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 title claims abstract description 98
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 claims abstract description 48
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 claims abstract description 48
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 40
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 30
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 16
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 41
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 40
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 40
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 claims description 32
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 32
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 31
- 238000009739 binding Methods 0.000 claims description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 20
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 19
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 19
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 19
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 17
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 17
- 230000006870 function Effects 0.000 claims description 15
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 8
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 30
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 19
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 abstract description 15
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 abstract description 10
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 8
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 abstract description 5
- 238000012827 research and development Methods 0.000 abstract description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 29
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 27
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 20
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 17
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 16
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 15
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 15
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 14
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 14
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 13
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 13
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 13
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 13
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 13
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 12
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 12
- 101001033312 Homo sapiens Interleukin-4 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 12
- 102100039078 Interleukin-4 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 11
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 10
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 10
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 10
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 9
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 9
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 7
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 7
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 7
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 7
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 7
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 6
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 6
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 5
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 5
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 5
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 5
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 5
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 102000004960 NAD(P)H dehydrogenase (quinone) Human genes 0.000 description 4
- 108020000284 NAD(P)H dehydrogenase (quinone) Proteins 0.000 description 4
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101710130607 Valacyclovir hydrolase Proteins 0.000 description 4
- 102100025139 Valacyclovir hydrolase Human genes 0.000 description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 238000002591 computed tomography Methods 0.000 description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 238000002595 magnetic resonance imaging Methods 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 4
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108050003558 Interleukin-17 Proteins 0.000 description 3
- 102000013691 Interleukin-17 Human genes 0.000 description 3
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000002585 base Substances 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 3
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 3
- 239000002073 nanorod Substances 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 3
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- BGFTWECWAICPDG-UHFFFAOYSA-N 2-[bis(4-chlorophenyl)methyl]-4-n-[3-[bis(4-chlorophenyl)methyl]-4-(dimethylamino)phenyl]-1-n,1-n-dimethylbenzene-1,4-diamine Chemical compound C1=C(C(C=2C=CC(Cl)=CC=2)C=2C=CC(Cl)=CC=2)C(N(C)C)=CC=C1NC(C=1)=CC=C(N(C)C)C=1C(C=1C=CC(Cl)=CC=1)C1=CC=C(Cl)C=C1 BGFTWECWAICPDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100033400 4F2 cell-surface antigen heavy chain Human genes 0.000 description 2
- 102100023990 60S ribosomal protein L17 Human genes 0.000 description 2
- 102100031585 ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Human genes 0.000 description 2
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 2
- 108010008014 B-Cell Maturation Antigen Proteins 0.000 description 2
- 102000006942 B-Cell Maturation Antigen Human genes 0.000 description 2
- 102100038080 B-cell receptor CD22 Human genes 0.000 description 2
- 108010074708 B7-H1 Antigen Proteins 0.000 description 2
- 241000282836 Camelus dromedarius Species 0.000 description 2
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 description 2
- 102100039498 Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Human genes 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710198884 GATA-type zinc finger protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 102100025101 GATA-type zinc finger protein 1 Human genes 0.000 description 2
- DTHNMHAUYICORS-KTKZVXAJSA-N Glucagon-like peptide 1 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC=1N=CNC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 DTHNMHAUYICORS-KTKZVXAJSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 102100034458 Hepatitis A virus cellular receptor 2 Human genes 0.000 description 2
- 101000800023 Homo sapiens 4F2 cell-surface antigen heavy chain Proteins 0.000 description 2
- 101000777636 Homo sapiens ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Proteins 0.000 description 2
- 101000884305 Homo sapiens B-cell receptor CD22 Proteins 0.000 description 2
- 101000889276 Homo sapiens Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Proteins 0.000 description 2
- 101001068133 Homo sapiens Hepatitis A virus cellular receptor 2 Proteins 0.000 description 2
- 101000868279 Homo sapiens Leukocyte surface antigen CD47 Proteins 0.000 description 2
- 101000831007 Homo sapiens T-cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains Proteins 0.000 description 2
- 101000845170 Homo sapiens Thymic stromal lymphopoietin Proteins 0.000 description 2
- 101000851370 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 9 Proteins 0.000 description 2
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 2
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 2
- 102000000743 Interleukin-5 Human genes 0.000 description 2
- 102100032913 Leukocyte surface antigen CD47 Human genes 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 102100024216 Programmed cell death 1 ligand 1 Human genes 0.000 description 2
- 101710089372 Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102100024834 T-cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains Human genes 0.000 description 2
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 2
- 102100031294 Thymic stromal lymphopoietin Human genes 0.000 description 2
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 2
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 2
- 102100036856 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 9 Human genes 0.000 description 2
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 2
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 2
- 229940125644 antibody drug Drugs 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 239000002872 contrast media Substances 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 229940051026 immunotoxin Drugs 0.000 description 2
- 230000002637 immunotoxin Effects 0.000 description 2
- 239000002596 immunotoxin Substances 0.000 description 2
- 231100000608 immunotoxin Toxicity 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108040006852 interleukin-4 receptor activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000012743 protein tagging Effects 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- -1 trop2 Proteins 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- AUXMWYRZQPIXCC-KNIFDHDWSA-N (2s)-2-amino-4-methylpentanoic acid;(2s)-2-aminopropanoic acid Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O.CC(C)C[C@H](N)C(O)=O AUXMWYRZQPIXCC-KNIFDHDWSA-N 0.000 description 1
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 1
- FSWYUDLVKBSHDX-UHFFFAOYSA-N 1,4,5,8-tetrahydronaphthalene Chemical compound C1C=CCC2=C1CC=CC2 FSWYUDLVKBSHDX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GOZMBJCYMQQACI-UHFFFAOYSA-N 6,7-dimethyl-3-[[methyl-[2-[methyl-[[1-[3-(trifluoromethyl)phenyl]indol-3-yl]methyl]amino]ethyl]amino]methyl]chromen-4-one;dihydrochloride Chemical compound Cl.Cl.C=1OC2=CC(C)=C(C)C=C2C(=O)C=1CN(C)CCN(C)CC(C1=CC=CC=C11)=CN1C1=CC=CC(C(F)(F)F)=C1 GOZMBJCYMQQACI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQVFQXXBNHHPLX-ZKWXMUAHSA-N Ala-Ala-His Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(O)=O WQVFQXXBNHHPLX-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- YYSWCHMLFJLLBJ-ZLUOBGJFSA-N Ala-Ala-Ser Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YYSWCHMLFJLLBJ-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- PTVGLOCPAVYPFG-CIUDSAMLSA-N Arg-Gln-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O PTVGLOCPAVYPFG-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- PTNFNTOBUDWHNZ-GUBZILKMSA-N Asn-Arg-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O PTNFNTOBUDWHNZ-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- LJUOLNXOWSWGKF-ACZMJKKPSA-N Asn-Asn-Glu Chemical compound C(CC(=O)O)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N LJUOLNXOWSWGKF-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- KHCNTVRVAYCPQE-CIUDSAMLSA-N Asn-Lys-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O KHCNTVRVAYCPQE-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- FANQWNCPNFEPGZ-WHFBIAKZSA-N Asp-Asp-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O FANQWNCPNFEPGZ-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 102000055006 Calcitonin Human genes 0.000 description 1
- 108060001064 Calcitonin Proteins 0.000 description 1
- 241000282832 Camelidae Species 0.000 description 1
- 241000282828 Camelus bactrianus Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 1
- 101150050927 Fcgrt gene Proteins 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- NUSWUSKZRCGFEX-FXQIFTODSA-N Glu-Glu-Cys Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O NUSWUSKZRCGFEX-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 1
- 101000998151 Homo sapiens Interleukin-17F Proteins 0.000 description 1
- IOVUXUSIGXCREV-DKIMLUQUSA-N Ile-Leu-Phe Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 IOVUXUSIGXCREV-DKIMLUQUSA-N 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102100033454 Interleukin-17F Human genes 0.000 description 1
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 102100037792 Interleukin-6 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 101000928455 Macaca fascicularis Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- WEMYTDDMDBLPMI-DKIMLUQUSA-N Phe-Ile-Lys Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=CC=C1)N WEMYTDDMDBLPMI-DKIMLUQUSA-N 0.000 description 1
- YTILBRIUASDGBL-BZSNNMDCSA-N Phe-Leu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 YTILBRIUASDGBL-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- KIQUCMUULDXTAZ-HJOGWXRNSA-N Phe-Tyr-Tyr Chemical compound N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](Cc1ccc(O)cc1)C(=O)N[C@@H](Cc1ccc(O)cc1)C(O)=O KIQUCMUULDXTAZ-HJOGWXRNSA-N 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 108010025832 RANK Ligand Proteins 0.000 description 1
- 102000014128 RANK Ligand Human genes 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 101100221606 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) COS7 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- QMCDMHWAKMUGJE-IHRRRGAJSA-N Ser-Phe-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O QMCDMHWAKMUGJE-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- FZXOPYUEQGDGMS-ACZMJKKPSA-N Ser-Ser-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O FZXOPYUEQGDGMS-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- DKGRNFUXVTYRAS-UBHSHLNASA-N Ser-Ser-Trp Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(O)=O DKGRNFUXVTYRAS-UBHSHLNASA-N 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101710142969 Somatoliberin Proteins 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- COYHRQWNJDJCNA-NUJDXYNKSA-N Thr-Thr-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O COYHRQWNJDJCNA-NUJDXYNKSA-N 0.000 description 1
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 1
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 1
- ARJASMXQBRNAGI-YESZJQIVSA-N Tyr-Leu-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)N ARJASMXQBRNAGI-YESZJQIVSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000008365 aqueous carrier Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 108010083912 bleomycin N-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N calcitonin Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(N)=O)C(C)C)C(=O)[C@@H]1CSSC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1 BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N 0.000 description 1
- 229960004015 calcitonin Drugs 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L cisplatin Chemical compound N[Pt](N)(Cl)Cl DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229960004316 cisplatin Drugs 0.000 description 1
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 230000000857 drug effect Effects 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 102000054663 human IL4R Human genes 0.000 description 1
- 230000014726 immortalization of host cell Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 108040006858 interleukin-6 receptor activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000010297 mechanical methods and process Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 239000003761 preservation solution Substances 0.000 description 1
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
- C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/22—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from camelids, e.g. camel, llama or dromedary
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/567—Framework region [FR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
- C07K2317/626—Diabody or triabody
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了非pH依赖性长效型抗血清白蛋白纳米抗体及其应用。具体地,本发明提供了非pH依赖性长效型抗血清白蛋白纳米抗体的VHH链框架区FR和互补决定区CDR的氨基酸序列。本发明还提供了编码上述纳米抗体的核苷酸序列。本发明提供的抗血清白蛋白纳米抗体在不同pH条件下均能结合人、小鼠、大鼠、食蟹猴血清白蛋白;且能够显著延长蛋白药物半衰期,为长效蛋白药物开发提供了研发基础。
Description
本申请是申请日为2020年8月14日、申请号为202010820234.6、发明名称为“非pH依赖性长效型抗血清白蛋白纳米抗体及其应用”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及生物医学或生物制药技术领域,更具体地涉及一种非pH依赖性长效型抗血清白蛋白纳米抗体及其应用。
背景技术
作为药代动力学的一个重要参数,抗体的半衰期综合体现了抗体在体内吸收、分布的过程。提高半衰期可以有效提高抗体的药效,减少给药剂量与频率,降低可能的副作用,降低病人的治疗负担。所以如何改变抗体药物半衰期一直以来都是抗体工程领域的一个重要研究方向。影响抗体药物半衰期的各种因素,包括:分子量、FcRn结合、等电点、糖基化、靶点介导的清除、抗药物抗体等。目前抗体药物延长半衰期的实现策略包括糖基化改造、聚乙二醇化、白蛋白融合、转铁蛋白融合、Fc融合、惰性蛋白融合、负电蛋白融合等。
人血清白蛋白是人体血浆中含量最丰富的可溶性蛋白,也是许多内源因子和外源药物的载体。人血清白蛋白由585个氨基酸构成,相对分子质量约为66.5kDa。由于正常情况下不易透过肾小球,人血清白蛋白在血浆中的半衰期较长(可达14~20天,平均约为19天),没有酶学和免疫学活性,安全无毒,生物相容性好,而且体内分布极广,是理想的药物载体。各种基于人血清白蛋白的药物长效化技术得到了广泛的应用和发展,目前主要包括构建人血清白蛋白融合蛋白、通过共价化学键与人血清白蛋白偶联、通过非共价键与人血清白蛋白可逆性结合等。
纳米抗体(nanobody,Nb),即重链单域抗体VHH(variable domain of heavychainof heavy-chain antibody)—骆驼体内存在着天然缺失轻链的重链抗体(heavy-chainantibody,HCAb)。克隆其可变区而得到的只由一个重链可变区组成的单域抗体,是目前可以得到的具有完整功能的稳定的可结合抗原的最小单位。纳米抗体具有稳定性高、水溶性好、人源化简单、靶向性高、穿透性强等特点,在免疫实验、诊断与治疗中,发挥着超乎想象的巨大功能。Ablynx公司作为全球纳米抗体领域的领军企业,是最早将纳米抗体用于治疗型抗体开发的企业,其已经拥有超过45种专有和合作的纳米抗体,其中有多款产品是用以抗人血清白蛋白为长效因子而构建的融合蛋白,例如靶点为IL-6R、TNF-α、RANKL或IL-17A/IL17F的产品等。
尽管现有技术中已有多篇专利文献报道了针对人血清白蛋白的纳米抗体,但现有的纳米抗体在应用上还有一些不足,本领域还需要开发新的具有更好功能的纳米抗体。
发明内容
本发明的目的在于提供一种非pH依赖性长效型抗血清白蛋白纳米抗体及其应用。
具体地,本发明提供了4株特异性结合血清白蛋白的纳米抗体,同时提供纳米抗体的编码序列、制备方法以及应用。
在本发明的第一方面,提供了一种抗血清白蛋白纳米抗体,所述纳米抗体能够特异性结合血清白蛋白,且所述纳米抗体的VHH链的互补决定区CDR为选自下组的一种或多种:
(1)SEQ ID NO:1所示的CDR1、SEQ ID NO:2所示的CDR2、和SEQ ID NO:3所示的CDR3;
(2)SEQ ID NO:10所示的CDR1、SEQ ID NO:11所示的CDR2、和SEQ ID NO:12所示的CDR3;
(3)SEQ ID NO:19所示的CDR1、SEQ ID NO:20所示的CDR2、和SEQ ID NO:21所示的CDR3;和
(4)SEQ ID NO:28所示的CDR1、SEQ ID NO:29所示的CDR2、和SEQ ID NO:30所示的CDR3。
在另一优选例中,所述的抗血清白蛋白纳米抗体为非pH依赖性长效型抗血清白蛋白纳米抗体。
在另一优选例中,所述抗血清白蛋白纳米抗体包含一个特异性结合血清白蛋白的免疫球蛋白单一可变结构域。
在另一优选例中,所述抗血清白蛋白纳米抗体包含两个或更多个特异性结合血清白蛋白的免疫球蛋白单一可变结构域。
在另一优选例中,所述免疫球蛋白单一可变结构域包含选自下组的CDR1、CDR2和CDR3:
(1)SEQ ID NO:1所示的CDR1、SEQ ID NO:2所示的CDR2、和SEQ ID NO:3所示的CDR3;
(2)SEQ ID NO:10所示的CDR1、SEQ ID NO:11所示的CDR2、和SEQ ID NO:12所示的CDR3;
(3)SEQ ID NO:19所示的CDR1、SEQ ID NO:20所示的CDR2、和SEQ ID NO:21所示的CDR3;和
(4)SEQ ID NO:28所示的CDR1、SEQ ID NO:29所示的CDR2、和SEQ ID NO:30所示的CDR3。
在另一优选例中,上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个(如1-3个,较佳地1-2个,更佳地1个)氨基酸并能保留与血清白蛋白非pH依赖性特异性结合能力的衍生序列。
在另一优选例中,所述的CDR1、CDR2和CDR3由VHH链的框架区FR1、FR2、FR3和FR4所隔开。
在另一优选例中,所述血清白蛋白为人或非人哺乳动物的血清白蛋白。
在另一优选例中,所述血清白蛋白为人、小鼠、大鼠或食蟹猴血清白蛋白。
在另一优选例中,所述抗血清白蛋白纳米抗体具有非pH依赖性。
在另一优选例中,所述抗血清白蛋白纳米抗体在不同pH条件下均能结合血清白蛋白。
在另一优选例中,所述抗血清白蛋白纳米抗体在pH3.0-10.0,较佳地pH4.0-9.0,更佳地pH5.0-8.0的条件下能结合血清白蛋白。
在另一优选例中,所述单克隆抗体在约pH≥7.4(优选地≥7.8,更优选地≥8.0;并且pH≤8.5)的条件下与血清白蛋白的结合活性为A1;所述单克隆抗体在约pH≤5.0(优选地≤4.8,更优选地≤4.5;并且pH≥4.0)的条件下与血清白蛋白的结合活性为A2;则0.5≤A1/A2≤2,优选地0.7≤A1/A2≤1.5,更优选地0.8≤A1/A2≤1.2。
在另一优选例中,所述纳米抗体的框架区包含选自下组的FRl、FR2、FR3和FR4:
(1)SEQ ID NO:4所示的FR1、SEQ ID NO:5所示的FR2、SEQ ID NO:6所示的FR3、和SEQ ID NO:7所示的FR4;
(2)SEQ ID NO:13所示的FR1、SEQ ID NO:14所示的FR2、SEQ ID NO:15所示的FR3、和SEQ ID NO:16所示的FR4;
(3)SEQ ID NO:22所示的FR1、SEQ ID NO:23所示的FR2、SEQ ID NO:24所示的FR3、和SEQ ID NO:25所示的FR4;
(4)SEQ ID NO:31所示的FR1、SEQ ID NO:32所示的FR2、SEQ ID NO:33所示的FR3、和SEQ ID NO:34所示的FR4;
(5)SEQ ID NO:37所示的FR1、SEQ ID NO:38所示的FR2、SEQ ID NO:39所示的FR3、和SEQ ID NO:40所示的FR4;
(6)SEQ ID NO:43所示的FR1、SEQ ID NO:44所示的FR2、SEQ ID NO:45所示的FR3、和SEQ ID NO:46所示的FR4;
(7)SEQ ID NO:49所示的FR1、SEQ ID NO:50所示的FR2、SEQ ID NO:51所示的FR3、和SEQ ID NO:52所示的FR4;和
(8)SEQ ID NO:55所示的FR1、SEQ ID NO:56所示的FR2、SEQ ID NO:57所示的FR3、和SEQ ID NO:58所示的FR4。
在另一优选例中,所述抗体中的VHH链的氨基酸序列选自下组:SEQ ID NO:8、SEQID NO:17、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:53、SEQID NO:59、或其组合。
在另一优选例中,所述抗体中的VHH链的氨基酸序列选自下组:SEQ ID NO:41、SEQID NO:47、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:59、或其组合。
在另一优选例中,所述的纳米抗体包括人源化抗体、骆驼源抗体、嵌合抗体。
在另一优选例中,本发明的血清白蛋白特异性纳米抗体还涵盖能够与由SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:47、SEQ IDNO:53或SEQ ID NO:59中任一的氨基酸序列组成的VHH结合人血清白蛋白的抗血清白蛋白抗体分子。
在本发明的第二方面,提供了一种抗血清白蛋白抗体,所述的抗体包括一个或多个本发明第一方面所述的纳米抗体的VHH链。
在另一优选例中,所述的抗血清白蛋白抗体可以为单体、二价抗体、和/或多价抗体。
在本发明的第三方面,提供了一种分离的多核苷酸,所述多核苷酸编码本发明第一方面所述的抗血清白蛋白纳米抗体或本发明第二方面所述的抗血清白蛋白抗体。
在另一优选例中,所述多核苷酸为组合形式。
在另一优选例中,所述多核苷酸的序列选自下组:SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:60、或其组合。
在另一优选例中,本发明涉及编码本发明的抗血清白蛋白纳米抗体的核酸分子。本发明的核酸可为RNA、DNA或cDNA。
在本发明的第四方面,提供了一种表达载体,所述表达载体表达本发明第三方面的多核苷酸。
在另一优选例中,所述的表达载体选自下组:DNA、RNA、病毒载体、质粒、转座子、其他基因转移***、或其组合。
在另一优选例中,所述病毒载体包括慢病毒载体、腺病毒载体、AAV病毒载体、逆转录病毒载体、或其组合。
在本发明的第五方面,提供了一种宿主细胞,所述宿主细胞含有本发明第四方面所述的表达载体,或其基因组中整合有本发明第三方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中,所述的宿主细胞包括原核细胞或真核细胞。
在另一优选例中,所述的宿主细胞选自下组:大肠杆菌、酵母细胞、哺乳动物细胞。
在本发明的第六方面,提供了一种产生抗血清白蛋白纳米抗体的方法,包括步骤:
(a)在适合产生纳米抗体的条件下,培养本发明第五方面所述的宿主细胞,从而获得含所述抗血清白蛋白纳米抗体的培养物;以及
(b)从所述培养物中分离或回收所述的抗血清白蛋白纳米抗体;及任选的
(c)纯化和/或修饰步骤(b)所获得的抗血清白蛋白纳米抗体。
在另一优选例中,所述的抗血清白蛋白纳米抗体具有如SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:53或SEQ IDNO:59所示的氨基酸序列。
在本发明的第七方面,提供了一种免疫偶联物,所述免疫偶联物含有:
(a)如本发明第一方面所述的抗血清白蛋白纳米抗体,或如本发明第二发明所述的抗血清白蛋白抗体;和
(b)选自下组的偶联部分:可检测标记物、药物、细胞因子、放射性核素、酶、金纳米颗粒/纳米棒、纳米磁粒、病毒外壳蛋白或VLP,或其组合。
在另一优选例中,所述的组分(a)和(b)可操作性连接。
在另一优选例中,所述的偶联部分为化学标记和生物标记。
在另一优选例中,所述化学标记为同位素、免疫毒素和/或化学药物。
在另一优选例中,所述生物标记为生物素、亲和素或酶标记。
在另一优选例中,所述的放射性核素包括:
(i)诊断用同位素,所述的诊断用同位素选自下组:Tc-99m、Ga-68、F-18、I-123、I-125、I-131、In-111、Ga-67、Cu-64、Zr-89、C-11、Lu-177、Re-188,或其组合;和/或
(ii)治疗用同位素,所述的治疗用同位素选自下组:Lu-177、Y-90、Ac-225、As-211、Bi-212、Bi-213、Cs-137、Cr-51、Co-60、Dy-165、Er-169、Fm-255、Au-198、Ho-166、I-125、I-131、Ir-192、Fe-59、Pb-212、Mo-99、Pd-103、P-32、K-42、Re-186、Re-188、Sm-153、Ra223、Ru-106、Na24、Sr89、Tb-149、Th-227、Xe-133、Yb-169、Yb-177,或其组合。
在另一优选例中,所述偶联部分为可检测标记物。
在另一优选例中,所述偶联部分选自下组:荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂,或能够产生可检测产物的酶、放射性核素、生物毒素、细胞因子(如IL-2等)、抗体、抗体Fc片段、抗体scFv片段、金纳米颗粒/纳米棒、病毒颗粒、脂质体、纳米磁粒、前药激活酶(例如,DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))或任何形式的纳米颗粒。
在本发明的第八方面,提供了一种结合物,所述结合物含有:
(a)如本发明第一方面所述的抗血清白蛋白纳米抗体,或如本发明第二发明所述的抗血清白蛋白抗体;和可操作性连接的
(b)选自下组的修饰标记:化学标记和生物标记。
在另一优选例中,所述化学标记为同位素、免疫毒素和/或化学药物。
在另一优选例中,所述生物标记为生物素、亲和素或酶标记。
在本发明的第九方面,提供了一种多特异性抗体,所述的多特异性抗体包含:如本发明第一方面所述的抗血清白蛋白纳米抗体,或如本发明第二发明所述的抗血清白蛋白抗体。
在另一优选例中,多特异性抗体还包括靶向选自下组的靶点的第二抗原结合区:IL-4R、IL-4Rα、TNF-α、VEGF、PD-1、PD-L1、4-1BB、CD47、TIM3、CTLA4、IL-17A、CD19、CD22、CD38、IL-5、TSLP、BCMA、GLP-1、Trop2、TIGIT、或其组合。
在另一优选例中,所述的第二抗原结合区为纳米抗体。
在另一优选例中,所述多特异性抗体包括一个或多个第二抗原结合区。
在另一优选例中,所述多特异性抗体还包含抗体的Fc段。
在另一优选例中,所述多特异性抗体为靶向血清白蛋白和IL4R的双特异性抗体。
在另一优选例中,所述多特异性抗体包含一个抗血清白蛋白纳米抗体和两个抗IL4R纳米抗体。
在另一优选例中,所述多特异性抗体为三价抗体。
在另一优选例中,所述双特异性抗体具有式I所示的结构:
I-I-B式I
其中,
“-”为肽键;
I为抗IL4R纳米抗体;
B为如本发明第一方面所述的抗血清白蛋白纳米抗体。
在本发明的第十方面,提供了一种融合蛋白,所述的融合蛋白包含:
(i)如本发明第一方面所述的抗血清白蛋白纳米抗体,或如本发明第二发明所述的抗血清白蛋白抗体;
(ii)任选的具有治疗功能的多肽分子或片段。
在另一优选例中,所述具有治疗功能的多肽分子或片段包括但不限于:靶向IL-4R、IL-4Rα、TNF-α、VEGF、PD-1、PD-L1、4-1BB、CD47、TIM3、CTLA4、IL-17A、CD19、CD22、CD38、IL-5、TSLP、BCMA、GLP-1、Trop2或TIGIT的多肽分子或片段。
在另一优选例中,所述具有治疗功能的多肽分子或片段包括但不限于:胰岛素、IL-2、干扰素、降钙素、GHRH肽、肠肽类似物、白蛋白、抗体片段、细胞因子。
在另一优选例中,所述具有治疗功能的多肽分子或片段包括单链抗体(scFv)、双链抗体、单克隆抗体、或嵌合抗体。
在另一优选例中,所述融合蛋白还包含协助表达和/或纯化的标签序列。
在另一优选例中,所述的标签序列选自下组:6His标签、GGGS序列、FLAG标签。
在另一优选例中,所述的融合蛋白包括双特异性抗体、嵌合抗体。
在本发明的第十一方面,提供了一种药物组合物,所述的药物组合物包含:
(i)如本发明第一方面所述的抗血清白蛋白纳米抗体、如本发明第二发明所述的抗血清白蛋白抗体、如本发明第七方面所述的免疫偶联物、如本发明第八方面所述的结合物、如本发明第九方面的多特异性抗体或如本发明第十方面所述的融合蛋白;
(ii)药学上可接受的载体。
在另一优选例中,所述的药物组合物还包含其他生物活性物质,如***的药物。
在本发明的第十二方面,提供了一种活性成分的用途,所述的活性成分选自下组:如本发明第一方面所述的抗血清白蛋白纳米抗体、如本发明第二发明所述的抗血清白蛋白抗体、如本发明第七方面所述的免疫偶联物、如本发明第八方面所述的结合物、如本发明第九方面的多特异性抗体、如本发明第十方面所述的融合蛋白、或其组合,用于制备长效蛋白药物。
在本发明的第十三方面,提供了如本发明第一方面所述的抗血清白蛋白纳米抗体、如本发明第二发明所述的抗血清白蛋白抗体、或如本发明第七方面所述的免疫偶联物的用途:(a)用于制备检测血清白蛋白的试剂、检测板或试剂盒;(b)用于制备结合血清白蛋白的药剂(长效蛋白药物)。
在另一优选例中,所示试剂为诊断试剂。
在另一优选例中,所述试剂用于检测样品中的血清白蛋白或其片段。
在另一优选例中,所述的药剂包括如本发明第七方面所述的免疫偶联物、如本发明第八方面所述的结合物、如本发明第九方面的多特异性抗体或如本发明第十方面所述的融合蛋白。
在本发明的第十四方面,提供了一种用于纯化血清白蛋白的免疫吸附材料,其中,所述免疫吸附材料包含如第一方面或第二方面所述的抗血清白蛋白纳米抗体、如本发明第一方面或第二方面所述的抗血清白蛋白纳米抗体的VHH链。
在另一优选例中,所述的免疫吸附材料还包括载体。
在另一优选例中,所述载体包括但不限于:磁珠、琼脂糖凝胶、硅胶微球、多孔材料。
在本发明的第十五方面,提供了一种体外检测样品中血清白蛋白或其片段的方法,所述方法包括步骤:
(1)在体外,将所述样品与如本发明第一方面所述的抗血清白蛋白纳米抗体、如本发明第二发明所述的抗血清白蛋白抗体、或如本发明第七方面所述的免疫偶联物接触;
(2)检测是否形成抗原-抗体复合物,其中形成复合物就表示样品中存在血清白蛋白或其片段。
在另一优选例中,所述的检测包括诊断性的或非诊断性的。
本发明的第十六方面,提供了一种重组多肽的制备方法,该方法包含:
(a)在适合表达的条件下,培养本发明第五面所述的宿主细胞;
(b)从培养物中分离出重组多肽,所述的重组多肽包括如本发明第一方面所述的抗血清白蛋白纳米抗体、如本发明第二发明所述的抗血清白蛋白抗体、如本发明第九方面的多特异性抗体、如本发明第十方面所述的融合蛋白。
应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在此不再一一累述。
附图说明
图1A显示了白蛋白纳米抗体Nb1-15在不同pH条件下与人、小鼠、大鼠、食蟹猴血清白蛋白的结合活性。
图1B显示了白蛋白纳米抗体Nb1-60在不同pH条件下与人、小鼠、大鼠、食蟹猴血清白蛋白的结合活性。
图1C显示了白蛋白纳米抗体Nb1-83在不同pH条件下与人、小鼠、大鼠、食蟹猴血清白蛋白的结合活性。
图1D显示了白蛋白纳米抗体Nb3-24在不同pH条件下与人、小鼠、大鼠、食蟹猴血清白蛋白的结合活性。
图2A显示了IL4R纳米抗体融合人源化白蛋白纳米抗体HuNb1-15后,在不同pH条件下与人、小鼠、大鼠、食蟹猴血清白蛋白的结合活性。
图2B显示了IL4R纳米抗体融合人源化白蛋白纳米抗体HuNb1-60后,在不同pH条件下与人、小鼠、大鼠、食蟹猴血清白蛋白的结合活性。
图2C显示了IL4R纳米抗体融合人源化白蛋白纳米抗体HuNb1-83后,在不同pH条件下与人、小鼠、大鼠、食蟹猴血清白蛋白的结合活性。
图2D显示了IL4R纳米抗体融合人源化白蛋白纳米抗体HuNb3-24后,在不同pH条件下与人、小鼠、大鼠、食蟹猴血清白蛋白的结合活性。
图3显示了IL4R-HSA三价抗体在小鼠体内的半衰期检测结果。
图4显示了IL4R-HSA三价抗体在大鼠体内的半衰期检测结果。
图5显示了IL4R-HSA三价抗体在食蟹猴体内的半衰期检测结果。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究,经过大量的筛选,成功获得一组抗血清白蛋白纳米抗体,实验结果表明,本发明获得的4株抗血清白蛋白纳米抗体能够有效地与血清白蛋白结合。在此基础上完成了本发明。
具体地,本发明利用人源的血清白蛋白胞外段抗原蛋白免疫骆驼,获得高质量的免疫纳米抗体基因文库。然后将血清白蛋白分子偶联在酶标板上,展示血清白蛋白的正确空间结构,以此形式的抗原利用噬菌体展示技术筛选免疫纳米抗体基因库(骆驼重链抗体噬菌体展示基因库),从而获得了血清白蛋白特异性的纳米抗体基因。
如本文所用,术语“本发明纳米抗体”、“本发明的抗血清白蛋白纳米抗体”、“本发明抗血清白蛋白纳米抗体”、可互换使用,均指特异性识别和结合于血清白蛋白(包括人血清白蛋白)的纳米抗体。特别优选的是VHH链的氨基酸序列如SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:53或SEQ ID NO:59所示的纳米抗体。
如本文所用,术语“抗体”或“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白,其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连,而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH),其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL),另一端有恒定区;轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对,轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。
如本文所用,术语“单域抗体(single domain antibody,sdAb,或VHH)”、“纳米抗体”(nanobody)具有相同的含义,指克隆抗体重链的可变区,构建仅由一个重链可变区组成的纳米抗体,它是具有完整功能的最小的抗原结合片段。通常先获得天然缺失轻链和重链恒定区1(CH1)的抗体后,再克隆抗体重链的可变区,构建仅由一个重链可变区组成的纳米抗体(VHH)。
纳米抗体/单域抗体(Nanobody)作为一种新型的小分子抗体片段,由驼类天然的重链抗体重链可变区(VHH)克隆获得。Nanobody(Nb)具有优良的生物学特性,分子量12-15kDa,是完整抗体的十分之一,具有很好的组织穿透性,特异性高,水溶性好。因其特殊的结构性质,兼具了传统抗体与小分子药物的优势,几乎完美克服了传统抗体的开发周期长,稳定性较低,保存条件苛刻等缺陷,逐渐成为新一代抗体治疗中的新兴力量,在免疫诊断和治疗中显示出广阔的应用前景。
如本文所用,术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同,它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而,可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区,它们大致上呈β-折叠构型,由形成连接环的三个CDR相连,在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等,NIH Publ.No.91-3242,卷I,647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合,但是它们表现出不同的效应功能,例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。
如本领域技术人员所知,免疫偶联物及融合表达产物包括:药物、毒素、细胞因子(cytokine)、放射性核素、酶和其他诊断或治疗分子与本发明的抗体或其片段结合而形成的偶联物。本发明还包括与所述的抗血清白蛋白抗体或其片段结合的细胞表面标记物或抗原。
如本文所用,术语“重链可变区”与“VH”可互换使用。
如本文所用,术语“可变区”与“互补决定区(complementarity determiningregion,CDR)”可互换使用。
在本发明的一个优选的实施方式中,所述抗体的重链可变区包括三个互补决定区CDR1、CDR2、和CDR3。
在本发明的一个优选的实施方式中,所述抗体的重链包括上述重链可变区和重链恒定区。
在本发明中,术语“本发明抗体”、“本发明蛋白”、或“本发明多肽”可互换使用,都指特异性结合血清白蛋白的多肽,例如具有重链可变区的蛋白或多肽。它们可含有或不含起始甲硫氨酸。
本发明还提供了具有本发明抗体的其他蛋白质或融合表达产物。具体地,本发明包括具有含可变区的重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物),只要该可变区与本发明抗体的重链可变区相同或至少90%同源性,较佳地至少95%同源性。
一般,抗体的抗原结合特性可由位于重链可变区的3个特定区域来描述,称为可变区域(CDR),将该段间隔成4个框架区域(FR),4个FR的氨基酸序列相对比较保守,不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构,通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近,重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。
本发明抗体的重链的可变区特别令人感兴趣,因为它们中至少部分涉及结合抗原。因此,本发明包括那些具有带CDR的抗体重链可变区的分子,只要其CDR与此处鉴定的CDR具有90%以上(较佳地95%以上,最佳地98%以上)的同源性。
本发明不仅包括完整的抗体,还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此,本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。
如本文所用,术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明抗体相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽,而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的,或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽,或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物,例如聚乙二醇)融合所形成的多肽,或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列,或与6His标签形成的融合蛋白)。根据本文的教导,这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
本发明抗体指具有血清白蛋白结合活性的、包括上述CDR区的多肽。该术语还包括具有与本发明抗体相同功能的、包含上述CDR区的多肽的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于):一个或多个(通常为1-50个,较佳地1-30个,更佳地1-20个,最佳地1-10个)氨基酸的缺失、***和/或取代,以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内,较佳地为10个以内,更佳地为5个以内)氨基酸。例如,在本领域中,用性能相近或相似的氨基酸进行取代时,通常不会改变蛋白质的功能。又比如,在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括本发明抗体的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括:同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与本发明抗体的编码DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗本发明抗体的抗血清获得的多肽或蛋白。
本发明还提供了其他多肽,如包含纳米抗体或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外,本发明还包括了本发明纳米抗体的片段。通常,该片段具有本发明抗体的至少约50个连续氨基酸,较佳地至少约50个连续氨基酸,更佳地至少约80个连续氨基酸,最佳地至少约100个连续氨基酸。
在本发明中,“本发明抗体的保守性变异体”指与本发明抗体的氨基酸序列相比,有至多10个,较佳地至多8个,更佳地至多5个,最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
表1
最初的残基 | 代表性的取代 | 优选的取代 |
Ala(A) | Val;Leu;Ile | Val |
Arg(R) | Lys;Gln;Asn | Lys |
Asn(N) | Gln;His;Lys;Arg | Gln |
Asp(D) | Glu | Glu |
Cys(C) | Ser | Ser |
Gln(Q) | Asn | Asn |
Glu(E) | Asp | Asp |
Gly(G) | Pro;Ala | Ala |
His(H) | Asn;Gln;Lys;Arg | Arg |
Ile(I) | Leu;Val;Met;Ala;Phe | Leu |
Leu(L) | Ile;Val;Met;Ala;Phe | Ile |
Lys(K) | Arg;Gln;Asn | Arg |
Met(M) | Leu;Phe;Ile | Leu |
Phe(F) | Leu;Val;Ile;Ala;Tyr | Leu |
Pro(P) | Ala | Ala |
Ser(S) | Thr | Thr |
Thr(T) | Ser | Ser |
Trp(W) | Tyr;Phe | Tyr |
Tyr(Y) | Trp;Phe;Thr;Ser | Phe |
Val(V) | Ile;Leu;Met;Phe;Ala | Leu |
本发明还提供了编码上述抗体或其片段或其融合蛋白的多核苷酸分子。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。
编码本发明的成熟多肽的多核苷酸包括:只编码成熟多肽的编码序列;成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列;成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸,也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50%,较佳地至少70%,更佳地至少80%相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中,“严格条件”是指:(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱,如0.2×SSC,0.1%SDS,60℃;或(2)杂交时加有变性剂,如50%(v/v)甲酰胺,0.1%小牛血清/0.1% Ficoll,42℃等;或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90%以上,更好是95%以上时才发生杂交。并且,可杂交的多核苷酸编码的多肽与成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明的抗体的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列,尤其是片段长度较短时。通常,通过先合成多个小片段,然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外,还可将重链的编码序列和表达标签(如6His)融合在一起,形成融合蛋白。
一旦获得了有关的序列,就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体,再转入细胞,然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。本发明所涉及的生物分子(核酸、蛋白等)包括以分离的形式存在的生物分子。
目前,已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段,或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外,还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞,以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞,如细菌细胞;或是低等真核细胞,如酵母细胞;或是高等真核细胞,如哺乳动物细胞。代表性例子有:大肠杆菌,链霉菌属;鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞;真菌细胞如酵母;果蝇S2或Sf9的昆虫细胞;CHO、COS7、293细胞的动物细胞等。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时,能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获,用CaCl2法处理,所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要,转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物,可选用如下的DNA转染方法:磷酸钙共沉淀法,常规机械方法如显微注射、电穿孔,脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养,表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞,培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后,用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子,将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要,可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于:常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
本发明的抗体可以单独使用,也可与可检测标记物(为诊断目的)、治疗剂、PK(蛋白激酶)修饰部分或任何以上这些物质的组合结合或偶联。
用于诊断目的可检测标记物包括但不限于:荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶。
可与本发明抗体结合或偶联的治疗剂包括但不限于:1.放射性核素;2.生物毒;3.细胞因子如IL-2等;4.金纳米颗粒/纳米棒;5.病毒颗粒;6.脂质体;7.纳米磁粒;8.药激活酶(例如,DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL));9.疗剂(例如,顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。
药物组合物
本发明还提供了一种组合物。优选地,所述的组合物是药物组合物,它含有上述的抗体或其活性片段或其融合蛋白,以及药学上可接受的载体或赋形剂,以及任选的其他生物活性物质。通常,可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中,其中pH通常约为5-8,较佳地pH约为6-8,尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药,其中包括(但并不限于):腹膜内、静脉内、或局部给药。
本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt%,较佳地0.01-90wt%,更佳地0.1-80wt%)的本发明上述的抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于):盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式,例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量,例如每天约10微克/千克体重-约50毫克/千克体重。此外,本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时,是将安全有效量的免疫偶联物施用于哺乳动物,其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重,而且在大多数情况下不超过约50毫克/千克体重,较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约10毫克/千克体重。当然,具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素,这些都是熟练医师技能范围之内的。
检测方法
本发明还涉及检测血清白蛋白的方法。该方法步骤大致如下:获得细胞和/或组织样本;将样本溶解在介质中;检测在所述溶解的样本中血清白蛋白蛋白的水平。
在本发明的检测方法中,所使用的样本没有特别限制,代表性的例子是存在于细胞保存液中的含细胞的样本。
试剂盒
本发明还提供了一种含有本发明的抗体(或其片段)或检测板的试剂盒,在本发明的一个优选例中,所述的试剂盒还包括容器、使用说明书、缓冲剂等。
本发明还提供了用于检测血清白蛋白水平的检测试剂盒,该试剂盒包括识别血清白蛋白的抗体,用于溶解样本的裂解介质,检测所需的通用试剂和缓冲液,如各种缓冲液、检测标记、检测底物等。该检测试剂盒可以是体外诊断装置。
应用
如上所述,本发明的纳米抗体有广泛生物应用价值和临床应用价值,其应用涉及到抗血清白蛋白纳米抗体用于制备长效蛋白药物,为长效性蛋白药物开发提供了研发基础。
本发明的主要优点包括:
(a)本发明纳米抗体在不同pH条件下均能结合人、小鼠、大鼠、食蟹猴血清白蛋白。
(b)本发明纳米抗体能够显著延长蛋白药物半衰期,为长效蛋白药物开发提供了研发基础。
(c)本发明纳米抗体适合于原核表达和真核表达,具有可溶性极高,不易聚集,能耐高温、强酸、强碱等致变性条件的优点,适用于实验室及工业开发。
(d)利用本发明的纳米抗体制备蛋白药物,不会影响药物的靶向性和活性。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例1:抗血清白蛋白纳米抗体的筛选及表达
将人血清白蛋白蛋白免疫1只新疆双峰驼,7次免疫结束后从骆驼外周血中分离total RNA,经反转录和PCR扩增出VHH基因,再将VHH基因克隆至噬菌体载体pMECS上,转化至TG1宿主细胞中构建成噬菌体展示文库。随后利用噬菌体展示技术进行文库筛选,经4轮“吸附-洗涤-富集”的筛选过程最终获得含抗体基因的噬菌体富集30倍。从以上富集的噬菌体克隆中随机挑选400颗进行PE-ELISA鉴定,将获得的阳性克隆全部进行测序鉴定,将所有序列不同的抗体均作为候选对象,利用大肠杆菌表达纯化出各种抗体用于后续鉴定。
实施例2:抗血清白蛋白纳米抗体在不同PH条件下与白蛋白的结合
将小鼠、大鼠、食蟹猴血清及人血清白蛋白用pH8.2 NaHCO3稀释至10ug/mL包被至酶标版,4℃过夜放置;PBST洗涤酶标板,每孔加入300uL的1%脱脂牛奶室温封闭2小时;PBST洗涤酶标板,加入100uL梯度稀释好的待测抗体(每个抗体分别用pH5.0和pH7.4 PBS溶液稀释,从300ug/mL起始3倍梯度稀释),37℃孵育1小时;PBST洗涤酶标板,加入100uL稀释好的Goat pAb to Nanobody(HRP)(用PBS按1:1000的比例稀释),37℃孵育1小时;PBST洗涤酶标板,加100uL TMB显色液,室温避光反应5分钟,然后加入50uL 2M硫酸终止显色,酶标仪450nm波长下读取吸收值。结果如图1A-图1D所示:四株抗血清白蛋白纳米抗体可同时结合人、小鼠、大鼠、食蟹猴血清白蛋白,且在不同pH条件下(pH5.0和pH7.4)均能结合各种属血清白蛋白。数值统计如表2。
表2抗血清白蛋白纳米抗体与不同种属白蛋白的结合
实施例3:抗血清白蛋白纳米抗体的人源化
将以上4株纳米抗体的氨基酸序列置于结构数据库中进行同源结构的搜索,抗体序列见表3。
表3抗血清白蛋白纳米抗体序列编号
抗体编号 | Nb1-15 | Nb1-60 | Nb1-83 | Nb3-24 |
CDR1 | SEQ ID NO.1 | SEQ ID NO.10 | SEQ ID NO.19 | SEQ ID NO.28 |
CDR2 | SEQ ID NO.2 | SEQ ID NO.11 | SEQ ID NO.20 | SEQ ID NO.29 |
CDR3 | SEQ ID NO.3 | SEQ ID NO.12 | SEQ ID NO.21 | SEQ ID NO.30 |
FR1 | SEQ ID NO.4 | SEQ ID NO.13 | SEQ ID NO.22 | SEQ ID NO.31 |
FR2 | SEQ ID NO.5 | SEQ ID NO.14 | SEQ ID NO.23 | SEQ ID NO.32 |
FR3 | SEQ ID NO.6 | SEQ ID NO.15 | SEQ ID NO.24 | SEQ ID NO.33 |
FR4 | SEQ ID NO.7 | SEQ ID NO.16 | SEQ ID NO.25 | SEQ ID NO.34 |
全长氨基酸序列 | SEQ ID NO.8 | SEQ ID NO.17 | SEQ ID NO.26 | SEQ ID NO.35 |
全长碱基序列 | SEQ ID NO.9 | SEQ ID NO.18 | SEQ ID NO.27 | SEQ ID NO.36 |
取其中序列等源性较高的结构,对这些结构进行比对,并依据晶体结构分辨率大小和构建的进化树,最终选取包括3dwt在内的蛋白,进行目标纳米抗体序列的多模板同源模建,再依据打分函数的高低排序,选取molpdf最低的结构;然后对模建的最优结构,利用ProtSA服务器计算残基的溶剂可接触性,对模建的最优结构和DP-47进行序列比对,替换相应的暴露于溶剂的残基。最终确定出一种人源化抗血清白蛋白纳米抗体,人源化后抗体序列对应如下表4:
表4人源化抗血清白蛋白纳米抗体序列编号
实施例4:HSA-IL4R三价纳米抗体的构建及表达
选择IL4R纳米抗体作为代表与人源化白蛋白纳米抗体构建长效蛋白药物,以验证人源化白蛋白纳米抗体延长蛋白质体内半衰期的功能。将以上候选的4株人源化白蛋白纳米抗体分别于IL4R纳米抗体(序列源自专利CN2019110547879)串联形成三价纳米抗体,其结构序列如下表5:
表5多价抗体结构及序列
抗体编号 | 结构 | 氨基酸序列 | 碱基序列 |
MY8154 | IL4R Nb103-Nb103-HSA HuNb1-15 | SEQ ID NO.61 | SEQ ID NO.62 |
MY8267 | IL4R Nb103-Nb103-HSA HuNb1-60 | SEQ ID NO.63 | SEQ ID NO.64 |
MY8162 | IL4R Nb103-Nb103-HSA HuNb1-83 | SEQ ID NO.65 | SEQ ID NO.66 |
MY8268 | IL4R Nb103-Nb103-HSA HuNb3-24 | SEQ ID NO.67 | SEQ ID NO.68 |
MY8171 | IL4R Nb103-Nb103 | SEQ ID NO.69 | SEQ ID NO.70 |
将以上多价抗体利用毕赤酵母进行表达。简要地,表达方法如下:(1)将SEQ IDNO.62、SEQ ID NO.64、SEQ ID NO.66、SEQ ID NO.68、SEQ ID NO.70所示的纳米抗体序列碱基构建至pPICZaA载体;(2)用Sac I限制性内切酶线性化后电转化至X-33感受态细胞中;(3)将电转的样品分别涂布在含有不同浓度博来霉素抗性的YPD平板培养基上,置于30℃培养箱中培养3天,具体实施方案可参见Invitrogen公司提供的pPICZaA载体说明书;(4)待平板培养基上长出单克隆后,挑取单克隆置于BMGY培养基中,当BMGY培养液OD值达到20左右,收集菌体后更换至BMMY培养基中,28℃250rpm培养;(5)之后每24h补加终体积为1%的甲醇;连续诱导5天,结束培养;(6)将取到的上清液用阳离子层析纯化目的抗体。
将以上表达纯化的抗体置于不同pH条件下检测其与各种属白蛋白的结合。检测方法与实施例2相同,结果如图2A-图2D所示:与人IL4R纳米抗体融合后的人源化三价抗体仍然可与不同种属血清白蛋白结合,且不依赖于pH变化而改变其结合活性。数值统计如表6。
表6人源化三价抗体与不同种属血清白蛋白的结合
实施例5:抗血清白蛋白纳米抗体在小鼠体内的半衰期
分别将100ug酵母细胞表达的多价抗体静脉注射至小鼠体内,给药后以5min、3h、8h、24h、48h、96h、144h分别取眼眶血,离心后分离血浆。其中对照抗体MY8171给药后的采血时间点为5min、15min、30min、1.5h和3h。然后利用ELISA检测进行PK分析。将1ug/mL hIL4R蛋白以100uL/孔包被酶标版过夜;PBST洗板5次,加入300uL 0.3%Casein室温封闭2小时;PBST洗板5次,将稀释的血清样品加入相应孔中37℃孵育1小时;PBST洗板5次,以100uL/孔加入Goat1 pAb to Nanobody-HRP(1:1000稀释)37℃孵育1小时;PBST洗板5次,加入TMB显色液室温静置显色5分钟,加入2M硫酸终止反应,酶标仪450nm波长下读取吸收值。将检测结果依据标准曲线进行换算,获得时间-药物浓度关系图,结果如图3所示:不含有白蛋白纳米抗体的二价抗体MY8171在小鼠体内的半衰期只有约1.86小时,而带有抗血清白蛋白纳米抗体的三价抗体其在小鼠体内的半衰期均有显著的延长(如表7所示),最高可延长约22倍。
表7不同抗血清白蛋白纳米抗体在小鼠体内的半衰期
抗体编号 | MY8171 | MY8154 | MY8267 | MY8162 | MY8268 |
T1/2(hours) | 1.86 | 16.50 | 30.35 | 8.98 | 40.99 |
实施例6:抗血清白蛋白纳米抗体在大鼠体内的半衰期
分别将400ug酵母细胞表达的多价抗体静脉注射至大鼠体内,给药后以5min、3h、8h、24h、48h、96h、144h分别取眼眶血,离心后分离血浆。其中对照抗体MY8171给药后的采血时间点为5min、15min、30min、1.5h和3h。然后利用ELISA检测进行PK分析。检测方法同实施例5。将检测结果依据标准曲线进行换算,获得时间-药物浓度关系图,结果如图4所示:不含有白蛋白纳米抗体的二价抗体MY8171在大鼠体内的半衰期只有约0.82小时,而带有抗血清白蛋白纳米抗体的三价抗体其在小鼠体内的半衰期均有显著的延长(如表8所示),最高可延长约63倍。
表8不同抗血清白蛋白纳米抗体在大鼠体内的半衰期
抗体编号 | MY8171 | MY8154 | MY8267 | MY8268 |
T1/2(hours) | 0.82 | 41.63 | 51.96 | 51.42 |
实施例7:抗血清白蛋白纳米抗体在食蟹猴体内的半衰期
将MY8267和MY8268两个抗体以2mg/kg剂量分别静脉注射食蟹猴左前肢,给药后按5min、20min、1h、2h、4h、8h、16h、1day、2days、4days、6days、8days、11days、14days、17days、20days、23days、26days、29days、32days、35days分别从右前肢取血,离心后分离血浆。然后利用ELISA检测进行PK分析。检测方法同实施例5。将检测结果依据标准曲线进行换算,获得时间-药物浓度关系图,结果如图5所示:带有抗血清白蛋白纳米抗体的三价抗体在食蟹猴体内的半衰期均可达到约9-15天(表9)。
表9不同抗血清白蛋白纳米抗体在食蟹猴体内的半衰期
抗体编号 | MY8267 | MY8268 |
T1/2(days) | 9.53 | 14.21 |
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种抗血清白蛋白纳米抗体,其特征在于,所述纳米抗体能够特异性结合血清白蛋白,且所述纳米抗体的VHH链具有如下的互补决定区CDR:
SEQ ID NO:28所示的CDR1、SEQ ID NO:29所示的CDR2、和SEQ ID NO:30所示的CDR3。
2.如权利要求1所述的纳米抗体,其特征在于,所述纳米抗体的VHH链还包括框架区FR,所述的框架区FR选自下组:
(1)SEQ ID NO:31所示的FR1、SEQ ID NO:32所示的FR2、SEQ ID NO:33所示的FR3、和SEQ ID NO:34所示的FR4;和
(2)SEQ ID NO:55所示的FR1、SEQ ID NO:56所示的FR2、SEQ ID NO:57所示的FR3、和SEQ ID NO:58所示的FR4。
3.如权利要求1所述的纳米抗体,其特征在于,所述纳米抗体的VHH链的氨基酸序列选自下组:SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:59。
4.一种抗血清白蛋白抗体,所述的抗体包括如权利要求1所述的纳米抗体的VHH链。
5.一种多核苷酸,其特征在于,所述多核苷酸编码选自下组的蛋白质:权利要求1所述的纳米抗体或权利要求4所述的抗体。
6.如权利要求5所述的多核苷酸,其特征在于,所述多核苷酸的核苷酸序列选自下组:SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:60。
7.一种表达载体,其特征在于,所述表达载体含有权利要求5所述的多核苷酸。
8.一种宿主细胞,其特征在于,所述宿主细胞含有权利要求7所述的表达载体,或其基因组中整合有权利要求5所述的多核苷酸。
9.一种产生抗血清白蛋白纳米抗体的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(a)在适合产生纳米抗体的条件下,培养权利要求8所述的宿主细胞,从而获得含抗血清白蛋白纳米抗体的培养物;
(b)从所述培养物中分离和/或回收所述的抗血清白蛋白纳米抗体;和
(c)任选地,纯化和/或修饰步骤(b)所获得的抗血清白蛋白纳米抗体。
10.一种融合蛋白,其特征在于,所述的融合蛋白具有:
(i)权利要求1所述纳米抗体;
(ii)任选的具有治疗功能的多肽分子或片段。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202310346381.8A CN116284375A (zh) | 2020-08-14 | 2020-08-14 | 非pH依赖性长效型抗血清白蛋白纳米抗体及其应用 |
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202310346381.8A CN116284375A (zh) | 2020-08-14 | 2020-08-14 | 非pH依赖性长效型抗血清白蛋白纳米抗体及其应用 |
CN202010820234.6A CN114075279B (zh) | 2020-08-14 | 2020-08-14 | 非pH依赖性长效型抗血清白蛋白纳米抗体及其应用 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202010820234.6A Division CN114075279B (zh) | 2020-08-14 | 2020-08-14 | 非pH依赖性长效型抗血清白蛋白纳米抗体及其应用 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN116284375A true CN116284375A (zh) | 2023-06-23 |
Family
ID=80280119
Family Applications (4)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202010820234.6A Active CN114075279B (zh) | 2020-08-14 | 2020-08-14 | 非pH依赖性长效型抗血清白蛋白纳米抗体及其应用 |
CN202310346381.8A Pending CN116284375A (zh) | 2020-08-14 | 2020-08-14 | 非pH依赖性长效型抗血清白蛋白纳米抗体及其应用 |
CN202310346308.0A Pending CN116284373A (zh) | 2020-08-14 | 2020-08-14 | 非pH依赖性长效型抗血清白蛋白纳米抗体及其应用 |
CN202310346361.0A Pending CN116284374A (zh) | 2020-08-14 | 2020-08-14 | 非pH依赖性长效型抗血清白蛋白纳米抗体及其应用 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202010820234.6A Active CN114075279B (zh) | 2020-08-14 | 2020-08-14 | 非pH依赖性长效型抗血清白蛋白纳米抗体及其应用 |
Family Applications After (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202310346308.0A Pending CN116284373A (zh) | 2020-08-14 | 2020-08-14 | 非pH依赖性长效型抗血清白蛋白纳米抗体及其应用 |
CN202310346361.0A Pending CN116284374A (zh) | 2020-08-14 | 2020-08-14 | 非pH依赖性长效型抗血清白蛋白纳米抗体及其应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (4) | CN114075279B (zh) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN114656557B (zh) * | 2022-03-23 | 2023-05-12 | 南开大学 | 一种血清铁蛋白特异性纳米抗体及其elisa方法 |
CN117088975B (zh) * | 2022-05-11 | 2024-06-25 | 东莞市朋志生物科技有限公司 | 抗白蛋白抗体、检测白蛋白的试剂和试剂盒 |
CN117164708A (zh) * | 2022-05-26 | 2023-12-05 | 上海洛启生物医药技术有限公司 | 长效il5纳米抗体及用途 |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2752426A1 (en) * | 2013-01-03 | 2014-07-09 | Covagen AG | Human serum albumin binding compounds and fusion proteins thereof |
CN111138537B (zh) * | 2018-11-06 | 2021-07-09 | 瑞阳(苏州)生物科技有限公司 | 一种抗人血清白蛋白抗体片段、制备方法和应用 |
CN111138536B (zh) * | 2018-11-06 | 2021-07-09 | 瑞阳(苏州)生物科技有限公司 | 抗人血清白蛋白单域抗体的制备及其应用 |
-
2020
- 2020-08-14 CN CN202010820234.6A patent/CN114075279B/zh active Active
- 2020-08-14 CN CN202310346381.8A patent/CN116284375A/zh active Pending
- 2020-08-14 CN CN202310346308.0A patent/CN116284373A/zh active Pending
- 2020-08-14 CN CN202310346361.0A patent/CN116284374A/zh active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN116284373A (zh) | 2023-06-23 |
CN114075279A (zh) | 2022-02-22 |
CN116284374A (zh) | 2023-06-23 |
CN114075279B (zh) | 2023-05-05 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN110144009B (zh) | Cd47单域抗体及其用途 | |
US11466085B2 (en) | Anti-PD-L1 nanobody, coding sequence and use thereof | |
CN109096395B (zh) | 阻断型cd47纳米抗体及其用途 | |
CN110452297B (zh) | 抗vegf单域抗体及其应用 | |
KR20180069931A (ko) | 항 pd-l1 나노 항체 및 이의 응용 | |
CN112500480B (zh) | 针对新型冠状病毒的纳米抗体及其应用 | |
CN114075279B (zh) | 非pH依赖性长效型抗血清白蛋白纳米抗体及其应用 | |
CN111518212B (zh) | 抗Trop2纳米抗体及其应用 | |
CN113214394B (zh) | 抗il5纳米抗体及其应用 | |
CN111718415A (zh) | 一种抗tigit纳米抗体及其应用 | |
CN114106190A (zh) | 一种抗vegf/pd-l1双特异性抗体及其用途 | |
EP4257605A1 (en) | Anti-tslp nanobody and use thereof | |
CN115124621B (zh) | 靶向pd-l1的纳米抗体及其制备方法和应用 | |
CN114380907B (zh) | 靶向cmtm6的纳米抗体及其制备方法和应用 | |
CN117980341A (zh) | 抗trop2单域抗体及其应用 | |
WO2021047386A1 (zh) | 靶向caix抗原的纳米抗体及其应用 | |
CN115873113B (zh) | 靶向CaSR的纳米抗体及其制备方法和应用 | |
WO2024099310A1 (zh) | 抗il-13长效纳米抗体序列及其应用 | |
CN116333121A (zh) | 一种新型靶向cd33单域抗体的开发 | |
CN118139893A (zh) | 抗ptk7单域抗体及其应用 | |
CN118324913A (zh) | 一种抗pd-l1纳米抗体及其制备方法和应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |