CN117751144A

CN117751144A - 抗cd38抗体、抗cd3抗体和双特异性抗体以及它们的用途

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Publication number: CN117751144A
Application number: CN202280053639.9A
Authority: CN
Inventors: M·邱; M-C·冯; M·托尔内塔; B·惠特克; 濮瀑; 靳英; 陈鹏; K·C·权; 俞澳; G·M·安德森
Original assignee: Hangzhou Younuojian Biotechnology Co ltd
Current assignee: Hangzhou Younuojian Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-08-02
Filing date: 2022-08-02
Publication date: 2024-03-22
Also published as: AU2022323166A1; CA3226428A1; EP4380977A2; WO2023015170A2; WO2023015170A3; KR20240042009A; IL310024A

Abstract

本公开涉及抗CD3和抗CD38抗体或其抗原结合片段。本公开还涉及靶向CD3和CD38两者的双特异性抗体。为了扩大治疗指数，双特异性抗体可以含有掩蔽域以最小化全身毒性。屏蔽的双特异性抗体的解掩蔽主要通过肿瘤微环境或疾病组织中的蛋白酶和酶发生。本公开还提供了采用与抗体的铰链区连接的人VHO单域分子的独特设计，其可以允许比常规抗体更好的组织渗透。

Description

抗CD38抗体、抗CD3抗体和双特异性抗体以及它们的用途

相关申请的交叉引用

本申请要求于2021年8月2日提交的美国临时申请No.63/228,195的优先权，其全部内容据此以引用方式并入。

序列表

本申请包含以ST.26格式电子提交的序列表，并且据此全文以引用方式并入。

发明领域

本公开涉及生物医学，特别是针对CD3和CD38的抗体和双特异性抗体、编码此类抗体的核酸、用于制备此类抗体的方法，以及用于治疗癌症的方法。

发明背景

基于抗体的治疗剂已成功地治疗多种疾病，包括多种癌症。然而，仍然需要对这类药物作出改善，特别是在增强其临床功效和安全性方面。正在探索的一种途径是使额外和新型的抗原结合位点工程化到基于抗体的药物中，使得单一免疫球蛋白分子共同接合两种不同的抗原。

CD38(也称为环状ADP核糖水解酶)是一种具有长C端细胞外域和短N端胞质域的II型跨膜糖蛋白(Guedes,Dileepan等人,2020,Kar,Mehrotra等人,2020)。CD38是存在于多种免疫细胞的表面上的糖蛋白，包括CD4+、CD8+、B淋巴细胞，以及自然杀伤细胞(Orciani,Trubiani等人,2008,van de Donk和Usmani 2018)。然而CD38不仅仅是细胞类型的标记，其还是B细胞和T细胞的活化剂。CD38具有多种功能，包括胞外酶活性以及受体介导的细胞粘附和信号转导的调节，如图1所显示(Malavasi,Funaro等人,1994,Mehta,Shahid等人,1996,Deaglio,Mehta等人,2001)。CD38也是负责两种新型钙信使分子代谢的信号传导酶：CD38的酶活性介导钙释放第二信使环状ADP核糖(cADPR)和烟酸腺嘌呤二核苷酸磷酸(NAADP)的合成(Quarona,Zaccarello等人,2013)。在造血细胞中，CD38可以介导信号传导，包括淋巴细胞增殖、细胞因子释放、B细胞和骨髓细胞发育和存活的调节，以及树突状细胞成熟的诱导。

作为受体，CD38可以连接到T细胞表面的CD31上，由此激活那些细胞产生多种细胞因子(Nooka,Kaufman等人,2019)。CD31也称为PECAM1(血小板内皮细胞粘附分子-1(Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule-1))，是免疫球蛋白超家族的130kDa成员，在循环血小板、中性粒细胞、单核细胞和幼稚B淋巴细胞的表面上表达。在功能上，CD31被认为具有粘附分子的功能。例如，内皮细胞CD38与CD31在自然杀伤细胞上结合，以使那些细胞附着到内皮上(Glaria和Valledor 2020,Zambello,Barila等人,2020)。白细胞上的CD38可以与内皮细胞上的CD31连接，以允许白细胞与血管壁结合以及白细胞穿过血管壁(Quarona,Zaccarello等人,2013)。CD38与CD31的这种相互作用可能在促进白血病细胞的存活方面起作用。

CD38作为细胞表面抗原在包括多发性骨髓瘤(MM)在内的数种恶性血液病中高度表达，并已被证明是用于某些疾病免疫疗法的良好靶标，如图2所显示(Quarona,Zaccarello等人,2013)。CD38在衍生自各种造血***恶性肿瘤的细胞系中上调，包括非霍奇金淋巴瘤(NHL)、伯基特淋巴瘤(BL)、多发性骨髓瘤(MM)、慢性B淋巴细胞性白血病(B-CLL)、急性B和T淋巴细胞性白血病(ALL)、T细胞淋巴瘤(TCL)、急性髓系白血病(AML)、毛细胞白血病(HCL)、霍奇金淋巴瘤(HL)，以及慢性髓系白血病(CML)。而且，造血***的大多数原始多能干细胞是CD38+。

CD38的表达提高是慢性淋巴细胞性白血病(CLL)中的诊断标记，并且与疾病进展的增加相关联(Burgler 2015,Burgler,Gimeno等人,2015)。CD38是急性髓系白血病(Zeijlemaker,Grob等人,2019)、慢性淋巴细胞性白血病(Damle,Wasil等人,1999,Malavasi,Deaglio等人,2011)、***癌(Zhang,Yang等人,2019)、胰腺癌(Liu,Grogan等人,2016,Stone 2017)、急性B淋巴母细胞性白血病(Jiang,Wu等人,2016)、肺癌(Xu,Chen等人,2015)、肝细胞癌(Lam,Ng等人,2019)，以及三阴性乳腺癌(Yeong,Lim等人,2018)的预后因子。CD38也在结直肠癌(CRC)(Perenkov,Novikov等人,2012)中异质性表达，但不取决于肿瘤定位、肿瘤分级、或转移的存在。CD38也是人鼻咽癌细胞系中侧群细胞的推定功能标记(Zheng,Liao等人,2016)，并且可能通过影响能量代谢而在鼻咽癌细胞中发挥致癌作用(Ge,Long等人,2019)。

由于CD38表达在恶性淋巴癌上较高且一致，而在正常淋巴和骨髓细胞以及非造血组织上较低，开发了几种生物制剂疗法(Morandi,Airoldi等人,2019)。在慢性淋巴细胞性白血病中，CD38表达较高，并且在单一疗法或联合疗法中使用达雷木单抗(daratumumab)的临床前研究已展示出相当大的功效。CD38靶向被用于治疗多发性骨髓瘤(MM)和慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。靶向CD38的单克隆抗体，如达雷木单抗单独地(Usmani,Weiss等人,2016)以及联合其他标准护理方案两者(Dimopoulos,Oriol等人,2016,Palumbo,Chanan-Khan等人,2016)均显示出在MM中良好的治疗功效。这样的治疗方法进一步延长了MM患者的5-10年生存率。

然而，许多患者最终由于耐药机制而复发，包括可结晶片段γ受体(FcγR)依赖性下调肿瘤细胞上的CD38，以及补体依赖性细胞毒性、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性和抗体依赖性细胞吞噬作用的抑制，如图4所显示(van de Donk and Usmani 2018)。因此，迫切需要新型治疗方法。

同样，在其他淋巴增生性病症中，临床前和临床数据并不那么令人信服。在这些情况下，CD38过表达可能有助于对检查点抑制剂的抗性，从而促使在霍奇金和非霍奇金淋巴瘤中进行大量临床试验，以探索阻断CD38是否增强检查点抑制剂的功效。在缺氧肿瘤微环境中，NAD+由补救途径释放并被CD38水解形成ADP核糖。它通过CD38-CD203a-CD73途径进一步降解为AMP。在此之后，CD73使AMP去磷酸化为腺苷。然后，积聚的细胞外腺苷与一系列免疫细胞上的受体结合，阻碍它们的浸润和活化。该途径形成了PD-1/PD-L1途径的替代免疫抑制机制，并且腺苷途径的抑制已显示出降低肿瘤微环境中的免疫抑制(Ma,Deng等人,2017,Boison和Yegutkin 2019)。

CD38-NAD⁺信号传导途径似乎在抑制性肿瘤微环境的形成中具有相关作用，并促进抑制性细胞类型，如MDSC、Treg、Breg以及NK细胞的某些亚型的活性。另外，它是PD-1/PD-L1检查点抑制剂抗性的重要驱动因素。因此，CD38细胞毒性抗体可以表现出直接的肿瘤上(on-tumor)活性以及间接的免疫调节抗肿瘤效应。它们用于以相当大的功效和易控制的毒性特征来治疗CD38阳性肿瘤，特别是MM。大量临床前证据支持它们也可以作为单一疗法以及与某些试剂(如BTK抑制剂)的联合疗法用于CLL。相反，其他淋巴***恶性肿瘤似乎对抗CD38抗体不太敏感，有证据表明单药达雷木单抗在各种类型的NHL中有适度活性。达雷木单抗和新开发的抗CD38抗体(如艾萨妥昔单抗(isatuximab))可以与标准方案联合应用以增强细胞毒性响应，或者与检查点抑制剂联合应用以克服获得性耐药性。此外，抗CD38抗体尚未在T细胞淋巴瘤中进行探索(Calabretta和Carlo-Stella 2020)。因此，需要一种能够以更好的功效和安全特性用于此类适应症的更强和选择性的CD38治疗剂。

在***癌中，CD38通过减少细胞NAD+库来抑制肿瘤代谢和增殖(Chmielewski,Bowlby等人,2018)。CD38在***细胞中高度表达，并且通过影响线粒体功能来增强***细胞的增殖并抑制其凋亡(Liao,Xiao等人,2014)。CD38的高表达预测了食管鳞状细胞癌患者的预后(Liao,Xiao等人,2017)。CD38表达或缺乏显示出对肺癌的预后价值(Karimi-Busheri,Zadorozhny等人,2011)。CD38敲除抑制小鼠中的肿瘤发生以及人肺癌细胞的克隆性生长(Bu,Kato等人,2018)。因此，得出的结论是，抗CD38治疗可对肺癌具有治疗潜能(Bu,Kato等人,2018)。

除了作为白血病、骨髓瘤和实体瘤中细胞活化的标记之外，CD38还与HIV感染、II型糖尿病、骨代谢，以及一些遗传决定的病况有关(Marlein,Piddock等人,2019)。在动物模型的HIV感染中，CD38过表达显示出有利于CD4 T细胞消减(Rodríguez-Alba等人,2019)。CD38催化活性的增加可减少CD4 T细胞的胞质烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)，从而引起慢性“瓦博格效应”。这然后会降低线粒体功能。同时，CD38的关键催化产物ADPR和cADPR可以被携带至细胞质，其中它们可活化钙通道并增加胞质Ca²⁺浓度，从而进一步改变线粒体完整性。这些机制会降低CD4 T细胞的活力和再生能力。因此，CD38活性的切断可以改善CD4 T细胞活性。

总体而言，作为替代方案，识别不同的非重叠CD38表位的两种抗体(Ab)的组合可以介导有力的补体依赖性细胞毒性(CDC)，这与仅具有较弱CDC能力的Ab单一疗法形成对照(Schutze,Petry等人,2018)。相似地，将达雷木单抗与识别非重叠表位的这些Ab之一联合导致了显著增强的CDC。另外，将E345R HexaBody突变引入CH3域强烈增强了这些抗体对表达CD38的细胞的CDC效力。

为了实现更强的患者响应，T细胞重定向杀伤是许多治疗领域期望的作用模式。在临床前和临床探索两者中，各种双特异性抗体形式显示出介导T细胞重定向(May,Sapra等人,2012,Franke和Baeuerle 2013)。这些包括串联的scFv片段和基于双抗体的形式，其中仅有少数基于Fc的双特异性抗体形式的实例被报道(Moore,Bautista等人,2011,May,Sapra等人,2012,Frankel和Baeuerle 2013)。涵盖人Fc区的双特异性形式具有更长的循环半衰期，这可导致增强的功效和/或较小频率的给药方案。在可能的基于Fc的双特异性形式中，一种重定向T细胞杀伤的优选形式是所谓的重链异质二聚体形式。这种形式特别令人关注，因为其不允许人CD3分子的多个拷贝在T细胞表面处聚集，由此防止了任何T细胞失活(Klein,Sustmann等人,2012)。

双特异性T细胞接合(BiTE)抗体属于一类新免疫治疗剂，其能够一方面识别靶细胞表面上的特定抗原(即，肿瘤抗原)，且另一方面识别T淋巴细胞上的CD3ε链(Fumey,Koenigsdorf等人,2017)。通过经由CD3复合物活化T细胞并使它们募集到靶细胞附近，BiTE抗体高效地诱导T细胞介导的细胞毒性(Brischwein,Schlereth等人,2006)。在MM中，识别B细胞成熟抗原或FcRH5(CD307)的双特异性抗体已显示消除临床前模型中的肿瘤浆细胞(Hipp,Tai等人,2017,Li,Stagg等人,2017,Seckinger,Delgado等人,2017)。然而，FcRH5表达并不限于肿瘤浆细胞，并且B细胞成熟抗原在MM患者中大量地分泌(Sanchez,Li等人,2012)。CD38 x CD3双特异性BiTE(Bi38-3)正在临床试验中进行测试，它由衍生自小鼠杂交瘤的两个单链可变片段组成，从而靶向人CD38和CD3e(Fayon,Martinez-Cingolani等人,2021)。

存在两种其他CD38 x CD3 BsAb，即，用于MM和实体癌的AMG424和GBR1342(Jiao,Yi等人,2020)。目前，它们均基于Fab-Fc(G1)x scFv-Fc(G1)的结构，具有缺乏FcγR受体和补体结合的异源Fc域(Drent,Groen等人,2016)。修饰的Fc域导致了经典的Fc依赖性免疫效应机制的缺陷。如果BsAb的Fc区与T细胞上的FcγR结合，则可能发生抗原非依赖性细胞因子释放综合征(CRS)，这可能引起T细胞的非特异性活化(Chatenoud,Ferran等人,1990)。这两种特征可能限制这些同源双特异性抗体在体内的特异性或效率。

为了防止脱靶毒性，向双特异性T细胞结合物中添加Fc域突变，以改善T细胞运输和抗肿瘤效力(Wang,Hoseini等人,2019)。最近，抗CD38双特异性抗体AMG424显示出消除临床前模型中的MM细胞，而且还在体外引发了对B、T和NK细胞的“肿瘤外”T细胞毒性(Munoz,Mittelbrunn等人,2008,Zuch de Zafra,Fajardo等人,2019)。因此，开发出高效且更安全的双特异性抗体可有助于改善MM和其他癌症的治疗。为了最小化在靶毒性，BsAbFc介导的免疫功能是不希望的。为了避免或减少由CD3和Fcγ受体交联继之以免疫细胞非特异性活化所致的抗原非依赖性细胞因子释放综合征(CRS)，将突变引入到Fc域中以消除FcγR结合。

Amgen的CD38 x CD3 BsAb还展示出CD3亲和力与细胞因子释放综合征(CRS)之间呈正相关。在Amgen的案例中，三种BsAb：XmAb4、AMG424和XmAb5被构建成对CD38具有相同的亲和力，但对CD3具有不同的解离常数Kd值，其中Kd水平分别为4.4、34和150-230nM。将CRS副作用在食蟹猴中进行了比较研究，以进行先导物选择。XmAb4和XmAb5在猴中耐受不良，因为给药这两种mAb导致了高水平的CRS效应。因此，选择对CD3具有中等亲和力的AMG424用于进一步临床开发，强调了平衡这些类别分子的功效和安全性的重要性。

关于CD3+T细胞重定向抗肿瘤功效的局限性的大量报道指出了反作用的CD3+T细胞亚群的募集、剂量限制性细胞因子风暴、免疫抑制性肿瘤微环境(TME)的存在、由免疫检查点分子表达所致的T细胞功能障碍和衰竭、肿瘤抗原逃逸、靶向肿瘤外毒性，以及次优效力。2021年5月，Pfizer对MM的埃纳妥单抗(elranatamab)(BCMAx CD3)关键临床试验因多例严重周围神经病变被临床搁置(Biopharmadive.com 2021)。事实上，安全性而非功效通常是T细胞重定向的关键问题，如由卡妥索单抗(Catumaxomab)(2013年在US且2017年在EU自愿退出市场)和博纳吐单抗(Blinatumomab)(尽管自2014年已获注册审批，但2020年全球销量仅为379MM USD)相对有限的商业成功所反映(Amgen 2021,Wikipedia 2021)。因此，增加T细胞重定向的治疗指数以最大化临床潜能是尚未满足的医疗需求并且是高度期望的。因此，通过减弱CD3靶向结合亲和力来调节T细胞活化，且同时维持抗肿瘤活性是改善T细胞接合物BsAb治疗窗口的有前景的方法。

与双特异性T细胞接合物一样，嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(CAR-T)可以将细胞毒性T细胞引导至表达特定抗原的恶性细胞，随后这些T细胞活化、增殖，并释放细胞因子以裂解肿瘤细胞(Wang,Kaur等人,2019)。随着CAR-T技术的快速发展以及达雷木单抗和艾萨妥昔单抗在临床中的有效结局，CD38已成为针对MM的嵌合抗原受体重定向T细胞(CAR-T细胞)的靶标(Wu,Zhang等人,2019)。CD38-CAR-T细胞的临床前数据显示了对于在体外和体内消除MM细胞以及在体外消除从MM患者分离的原代恶性细胞的显著效应。令人感兴趣地，用CD38-CAR-T细胞处理后，初始CD38表达消失(Drent,Groen等人,2016)。一些研究揭示，高亲和力CD38-CAR-T细胞不仅对骨髓瘤细胞，而且对表达CD38的正常造血细胞均产生了强杀伤效应(Chmielewski,Hombach等人,2004,Drent,Themeli等人,2017)。为了减少肿瘤外CAR响应，必须最优化CD38-CAR-T细胞的结合亲和力(Drent,Themeli等人,2017,Yu,Yi等人,2019)。由于在正常细胞(如NK细胞、活化T细胞和B细胞)上存在CD38，CD38特异性CAR-T细胞使用的局限性可表现为这种方法的可能毒性。另一个局限性表现为癌细胞上CD38的可变表达。此外，具有现成药物来增加T细胞疗法的可获得性是更可取和方便的。

虽然由抗体片段生成的BsAb遭受生物物理和药代动力学障碍，但用全长抗体样形式构建的那些的缺点在于，它们在不存在主要靶抗原的情况下多价接合共同靶抗原，导致非特异性活化和潜在毒性。本公开提供了抗CD38和抗CD3抗体，包括针对CD3和CD38的双特异性抗体，以解决现有疗法的一个或多个缺点。

发明内容

在一个方面，本公开提供了抗CD38抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，本公开提供了抗CD38抗体或其抗原结合部分，该抗CD38抗体或其抗原结合部分包含含有命名为HCDR1、HCDR2和HCDR3的三个互补决定区(CDR)的重链可变区，其中HCDR1、HCDR2和HCDR3分别选自：

SEQ ID NO:64、65和66；

SEQ ID NO:64、83和84；

SEQ ID NO:64、65和85；以及

SEQ ID NO:64、65和86。

在一些实施方案中，本公开提供了抗CD38抗体或其抗原结合部分，该抗CD38抗体或其抗原结合部分包含含有命名为LCDR1、LCDR2和LCDR3的三个CDR的轻链可变区，其中LCDR1、LCDR2和LCDR3分别选自：

SEQ ID NO:61、62和63；

SEQ ID NO:76、77和78；

SEQ ID NO:79、80和81；以及

SEQ ID NO:82、62和78。

在一些实施方案中，本公开提供了抗CD38抗体或其抗原结合片段，该抗CD38抗体或其抗原结合片段包含含有与SEQ ID NO:12-16中任一者具有至少85％同一性的氨基酸序列或其抗原结合部分的重链序列，以及含有与SEQ ID NO:7-11中任一者具有至少85％同一性的氨基酸序列或其抗原结合部分的轻链序列。

在一些实施方案中，本公开提供了抗CD38抗体或其抗原结合片段，该抗CD38抗体或其抗原结合片段包含分别含有以下项的轻链序列和重链序列：SEQ ID NO:2和3；SEQ IDNO:7和12；SEQ ID NO:7和13；SEQ ID NO:7和14；SEQ ID NO:7和15；SEQ ID NO:7和16；SEQID NO:8和12；SEQ ID NO:8和13；SEQ ID NO:8和14；SEQ ID NO:8和15；SEQ ID NO:8和16；SEQ ID NO:9和12；SEQ ID NO:9和13；SEQ ID NO:9和14；SEQ ID NO:9和15；SEQ ID NO:9和16；SEQ ID NO:10和12；SEQ ID NO:10和13；SEQ ID NO:10和14；SEQ ID NO:10和15；SEQ IDNO:10和16；SEQ ID NO:11和12；SEQ ID NO:11和13；SEQ ID NO:11和14；SEQ ID NO:11和15；或SEQ ID NO:11和16。

在一些实施方案中，本公开提供了抗CD38抗体或其抗原结合部分，该抗CD38抗体或其抗原结合部分包含至少一个仅可变重链单域或其抗原结合部分，其中至少一个仅可变重链单域包含分别选自以下项的HCDR1、HCDR2和HCDR3：

SEQ ID NO:67、68和69；

SEQ ID NO:67、87和69；

SEQ ID NO:67、88和69；

SEQ ID NO:67、89和69；

SEQ ID NO:67、68和90；

SEQ ID NO:70、91和72；

SEQ ID NO:70、92和72；

SEQ ID NO:70、93和72；

SEQ ID NO:94、95和96；

SEQ ID NO:70、71和97；

SEQ ID NO:73、98和75；

SEQ ID NO:73、99和75；

SEQ ID NO:73、100和75；

SEQ ID NO:73、101和102；以及

SEQ ID NO:73、103和104。

在一些实施方案中，本公开提供了抗CD38抗体或其抗原结合部分，该抗CD38抗体或其抗原结合部分包含至少一个仅可变重链单域或其抗原结合部分，其中至少一个仅可变重链(VHO)单域包含与SEQ ID NO:4和17-30中任一者具有至少85％同一性的氨基酸序列或其抗原结合部分。

在另一方面，本公开提供了抗CD3抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，本公开提供了抗CD3抗体或其抗原结合部分，该抗CD3抗体或其抗原结合部分包含含有命名为HCDR1、HCDR2和HCDR3的三个互补决定区(CDR)的重链可变区，其中HCDR1、HCDR2和HCDR3分别选自：

SEQ ID NO:105、108和107；

SEQ ID NO:105、109和107；

SEQ ID NO:105、110和107；以及

SEQ ID NO:118、119和120。

在一些实施方案中，本公开提供了抗CD3抗体或其抗原结合部分，该抗CD3抗体或其抗原结合部分包含含有命名为LCDR1、LCDR2和LCDR3的三个CDR的轻链可变区，其中LCDR1、LCDR2和LCDR3分别选自：

SEQ ID NO:114、112和113；以及

SEQ ID NO:115、116和117。

在一些实施方案中，本公开提供了抗CD3抗体或其抗原结合片段，该抗CD3抗体或其抗原结合片段包含含有与SEQ ID NO:32-34和39中任一者具有至少85％同一性的氨基酸序列或其抗原结合部分的重链序列，以及含有与SEQ ID NO:36-38中任一者具有至少85％同一性的氨基酸序列或其抗原结合部分的轻链序列。

在一些实施方案中，本公开提供了抗CD3抗体或其抗原结合片段，该抗CD3抗体或其抗原结合片段包含分别含有以下项的轻链序列和重链序列：SEQ ID NO:39和38；SEQ IDNO:41和40；SEQ ID NO:31和35；SEQ ID NO:31和36；SEQ ID NO:31和37；SEQ ID NO:32和35；SEQ ID NO:32和36；SEQ ID NO:32和37；SEQ ID NO:33和35；SEQ ID NO:33和36；SEQ IDNO:33和37；SEQ ID NO:34和35；SEQ ID NO:34和36；或SEQ ID NO:34和37。

本文所公开的抗CD38或抗CD3抗体或其抗原结合片段可以是人的、人源化的、或嵌合的抗体、或抗原结合片段。

本文所公开的抗CD38或抗CD3抗体或其抗原结合片段可以是全长IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4抗体，或者可以是它们的抗原结合片段，如Fab、F(ab’)2、或scFv片段。抗体主链可以被修饰成影响功能性，例如，消除残余效应子功能。

在另一方面，本公开提供了双特异性抗体，该双特异性抗体包含：

第一结合臂，该第一结合臂包含：

从N-末端到C-末端包含屏蔽物A、蛋白酶序列A，以及IgG重链或其抗原结合部分的第一重链融合蛋白，以及

从N-末端到C-末端包含屏蔽物B、蛋白酶序列B，以及IgG轻链或其抗原结合部分的第一轻链融合蛋白，

其中第一结合臂的IgG重链或其抗原结合部分以及IgG轻链或其抗原结合部分可以靶向CD3相关途径，并且包含如本文所述的抗CD3抗体或抗原结合片段；以及

第二结合臂，该第二结合臂包含：

从N-末端到C-末端包含屏蔽物C、蛋白酶序列C，以及IgG重链或其抗原结合部分的第二重链融合蛋白；以及

从N-末端到C-末端包含屏蔽物D、蛋白酶序列D，以及IgG轻链或其抗原结合部分的第二轻链融合蛋白，

其中第二结合臂的IgG重链或其抗原结合部分以及IgG轻链或其抗原结合部分可以靶向CD38相关途径，并且包含如本文所述的抗CD38抗体或抗原结合片段。

屏蔽物A-D可以彼此相同或不同，并且蛋白酶序列A-D可以彼此相同或不同。屏蔽物A-D和蛋白酶序列A-D是任选的，这意味着它们中的一些或全部可以存在或不存在。

在某些实施方案中，本公开提供了双特异性抗体，该双特异性抗体包含：

第一结合臂，该第一结合臂包含：

从N-末端到C-末端包含信号序列A—屏蔽物A—接头A—蛋白酶序列A—接头B—IgG重链或其抗原结合部分的第一重链融合蛋白，以及

从N-末端到C-末端包含信号序列B—屏蔽物B—接头C—蛋白酶序列B—接头D—IgG轻链或其抗原结合部分的第一轻链融合蛋白，

其中第一结合臂的IgG重链或其抗原结合部分以及IgG轻链或其抗原结合部分能够靶向CD3相关途径，并且包含如本文所述的抗CD3抗体或抗原结合片段；以及

第二结合臂，该第二结合臂包含：

从N-末端到C-末端包含信号序列C—屏蔽物C—接头E—蛋白酶序列C—接头F—IgG重链或其抗原结合部分的第二重链融合蛋白；以及

从N-末端到C-末端包含信号序列D—屏蔽物D—接头G—蛋白酶序列D—接头H—IgG轻链或其抗原结合部分的第二轻链融合蛋白，

其中第二结合臂的IgG重链或其抗原结合部分以及IgG轻链或其抗原结合部分能够靶向CD38相关途径，并且包含如本文所述的抗CD38抗体或抗原结合片段。

信号序列A-D可以彼此相同或不同，并且接头A-H可以彼此相同或不同。信号序列A-D、屏蔽物A-D、蛋白酶序列A-D，以及接头A-H是任选的，这意味着它们中的一些或全部可以存在或不存在。

第一结合臂，该第一结合臂包含：

第二结合臂，该第二结合臂包含：

从N-末端到C-末端包含屏蔽物C、蛋白酶序列C，以及IgG重链的第二重链融合蛋白，该IgG重链包含至少一个仅可变重链(VHO)单域或其抗原结合部分，

其中至少一个仅可变重链单域或其抗原结合部分能够靶向CD38相关途径，并且包含如本文所述的抗CD38 VHO或抗原结合片段。

屏蔽物A-C可以彼此相同或不同，并且蛋白酶序列A-C可以彼此相同或不同。屏蔽物A-C和蛋白酶序列A-C是任选的，这意味着它们中的一些或全部可以存在或不存在。

第一结合臂，该第一结合臂包含：

其中第一结合臂的IgG重链或其抗原结合部分以及IgG轻链或其抗原结合部分能够靶向CD3相关途径；以及

第二结合臂，该第二结合臂包含：

从N-末端到C-末端包含信号序列C—屏蔽物C—接头E—蛋白酶序列C—接头F—IgG重链的第二重链融合蛋白，该IgG重链包含至少一个仅可变重链单域或其抗原结合部分，

信号序列A-C可以彼此相同或不同，并且接头A-F可以彼此相同或不同。信号序列A-C、屏蔽物A-C、蛋白酶序列A-C，以及接头A-F是任选的，这意味着它们中的一些或全部可以存在或不存在。

在某些实施方案中，在本文所公开的双特异性抗体中，IgG是人IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4。

在某些实施方案中，在本文所公开的双特异性抗体中，第一结合臂是单价的，并且第二结合臂是单价的、二价的、或多价的。

在某些实施方案中，在本文所公开的双特异性抗体中，第二结合臂包含两个或三个串联的仅IgG可变重链单域，其中两个或三个仅IgG可变重链单域任选地经由一个或多个接头序列连接。

在某些实施方案中，在本文所公开的双特异性抗体中，第一结合臂(抗CD3臂)包含：

包含命名为HCDR1、HCDR2和HCDR3的三个互补决定区(CDR)的重链可变区，其中HCDR1、HCDR2和HCDR3分别选自：SEQ ID NO:105、108和107；SEQ ID NO:105、109和107；SEQID NO:105、110和107；以及SEQ ID NO:118、119和120；以及

包含命名为LCDR1、LCDR2和LCDR3的三个CDR的轻链可变区，其中LCDR1、LCDR2和LCDR3分别选自：SEQ ID NO:114、112和113；以及SEQ ID NO:115、116和117。

在某些实施方案中，在本文所公开的双特异性抗体中，第二结合臂(抗CD38臂)包含：

包含命名为HCDR1、HCDR2和HCDR3的三个互补决定区(CDR)的重链可变区，其中HCDR1、HCDR2和HCDR3分别选自：SEQ ID NO:64、65和66；SEQ ID NO:64、83和84；SEQ ID NO:64、65和85；以及SEQ ID NO:64、65和86；以及

包含命名为LCDR1、LCDR2和LCDR3的三个CDR的轻链可变区，其中LCDR1、LCDR2和LCDR3分别选自：SEQ ID NO:61、62和63；SEQ ID NO:76、77和78；SEQ ID NO:79、80和81；以及SEQ ID NO:82、62和78。

在某些实施方案中，在本文所公开的双特异性抗体中，第二结合臂(抗CD38臂)包含至少一个仅可变重链单域或其抗原结合部分，其中至少一个仅可变重链单域包含分别选自以下项的三个CDR(HCDR1、HCDR2和HCDR3)：SEQ ID NO:67、68和69；SEQ ID NO:67、87和69；SEQ ID NO:67、88和69；SEQ ID NO:67、89和69；SEQ ID NO:67、68和90；SEQ ID NO:70、91和72；SEQ ID NO:70、92和72；SEQ ID NO:70、93和72；SEQ ID NO:94、95和96；SEQ ID NO:70、71和97；SEQ ID NO:73、98和75；SEQ ID NO:73、99和75；SEQ ID NO:73、100和75；SEQ IDNO:73、101和102；以及SEQ ID NO:73、103和104。

在某些实施方案中，在本文所公开的双特异性抗体中，第一结合臂(抗CD3臂)的IgG重链包含选自SEQ ID NO:31-34、39和41的氨基酸序列、与SEQ ID NO:31-34、39和41中任一者具有至少85％同一性的氨基酸序列、或其抗原结合部分，并且第一结合臂的IgG轻链包含选自SEQ ID NO:35-38和40的氨基酸序列、与SEQ ID NO:35-38和40中任一者具有至少85％同一性的氨基酸序列、或其抗原结合部分。

在某些实施方案中，在本文所公开的双特异性抗体中，第二结合臂(抗CD38臂)的IgG重链包含选自SEQ ID NO:3-6和12-30的氨基酸序列、与SEQ ID NO:3-6和12-30中任一者具有至少85％同一性的氨基酸序列、或其抗原结合部分，并且第二结合臂的IgG轻链包含选自SEQ ID NO:2和7-11的氨基酸序列、与SEQ ID NO:2和7-11中任一者具有至少85％同一性的氨基酸序列、或其抗原结合部分。

在某些实施方案中，在本文所公开的双特异性抗体中，至少一个仅可变重链单域包含选自SEQ ID NO:4-6和17-30的氨基酸序列、与SEQ ID NO:4-6和17-30中任一者具有至少85％同一性的氨基酸序列、或其抗原结合部分。

在某些实施方案中，在本文所公开的双特异性抗体中，屏蔽物A、屏蔽物B、屏蔽物C，以及屏蔽物D各自独立地选自SEQ ID NO:42-52中所示的氨基酸序列。

在某些实施方案中，在本文所公开的双特异性抗体中，蛋白酶序列A、蛋白酶序列B、蛋白酶序列C，以及蛋白酶序列D各自独立地选自SEQ ID NO:53-60中所示的氨基酸序列。

在某些实施方案中，在本文所公开的双特异性抗体中，第一结合臂(抗CD3臂)的IgG重链和IgG轻链分别包含以下项中所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:39和38；SEQ ID NO:41和40；SEQ ID NO:31和35；SEQ ID NO:31和36；SEQ ID NO:31和37；SEQ ID NO:32和35；SEQ ID NO:32和36；SEQ ID NO:32和37；SEQ ID NO:33和35；SEQ ID NO:33和36；SEQ IDNO:33和37；SEQ ID NO:34和35；SEQ ID NO:34和36；或SEQ ID NO:34和37。

在某些实施方案中，在本文所公开的双特异性抗体中，第二结合臂(抗CD38臂)的IgG轻链和IgG重链分别包含以下项中所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:2和3；SEQ ID NO:7和12；SEQ ID NO:7和13；SEQ ID NO:7和14；SEQ ID NO:7和15；SEQ ID NO:7和16；SEQ ID NO:8和12；SEQ ID NO:8和13；SEQ ID NO:8和14；SEQ ID NO:8和15；SEQ ID NO:8和16；SEQ IDNO:9和12；SEQ ID NO:9和13；SEQ ID NO:9和14；SEQ ID NO:9和15；SEQ ID NO:9和16；SEQID NO:10和12；SEQ ID NO:10和13；SEQ ID NO:10和14；SEQ ID NO:10和15；SEQ ID NO:10和16；SEQ ID NO:11和12；SEQ ID NO:11和13；SEQ ID NO:11和14；SEQ ID NO:11和15；或SEQ ID NO:11和16。

在某些实施方案中，在本文所公开的双特异性抗体中，至少一个仅可变重链单域包含两个各自独立地选自SEQ ID NO:4-6和17-30的仅可变重链单域。

在某些实施方案中，在本文所公开的双特异性抗体中，至少一个仅可变重链单域从N-末端到C-末端包含任选地经由接头连接的SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5、任选地经由接头连接的SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6、任选地经由接头连接的SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6、任选地经由接头连接的SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:4、任选地经由接头连接的SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:5、或任选地经由接头连接的SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:4。

在某些实施方案中，本文所公开的抗体或双特异性抗体包含修饰的Fc，以延长双特异性抗体的半衰期、增强双特异性抗体对蛋白水解降解的抗性、降低双特异性抗体的效应子功能、有利于通过Fc异二聚化生成双特异性抗体、有利于双特异性抗体的多聚化，并且/或者改善双特异性抗体的制造和药物稳定性。

在另一方面，本公开提供了缀合物，该缀合物包含与部分(如细胞毒性剂)缀合的本文所公开的抗体或双特异性抗体。

在另一方面，本公开提供了组合物，该组合物包含本文所公开的抗体或双特异性抗体或本文所公开的缀合物。在某些实施方案中，本公开提供了药物组合物，该药物组合物包含本文所公开的抗体或双特异性抗体或本文所公开的缀合物，以及药学上可接受的载剂。

在另一方面，本公开提供了核酸，该核酸编码抗CD38抗体或其抗原结合部分。

在另一方面，本公开提供了核酸，该核酸编码抗CD3抗体或其抗原结合部分。

在另一方面，本公开提供了核酸，该核酸编码本文所公开的双特异性抗体、第一重链融合蛋白、第一轻链融合蛋白、第二重链融合蛋白、或第二轻链融合蛋白。

在另一方面，本公开提供了重组载体如表达载体，该重组载体包含本文所公开的核酸。

在另一方面，本公开提供了宿主细胞，该宿主细胞包含本文所公开的重组载体如表达载体、或核酸。

在另一方面，本公开提供了用于制备本文所公开的抗体或双特异性抗体的方法，该方法包括培养本文所公开的宿主细胞，使宿主细胞在宿主细胞培养物中生长，提供其中表达本文所公开的核酸的宿主细胞培养条件，以及从宿主细胞或从宿主细胞培养物中回收抗体或双特异性抗体。在某些实施方案中，双特异性抗体使用受控的Fab臂交换获得。

在另一方面，本公开提供了用于在对其有需要的受试者中治疗或预防CD38介导的疾病或病症的方法，该方法包括向受试者施用药学有效量的本文所公开的抗体、双特异性抗体、缀合物、或药物组合物。在某些实施方案中，疾病或病症选自人类癌症，包括胃癌和结直肠癌、胰腺癌、***癌、肺癌、肝细胞癌、三阴性乳腺癌、鼻咽癌、***、恶性血液病，如MM、淋巴瘤、急性髓系白血病、慢性淋巴细胞性白血病、急性B淋巴母细胞性白血病等，心脏病、病毒感染(包括HIV感染)、哮喘和其他呼吸道炎症性病症、过敏性气道疾病、母胎耐受、自闭症谱系病症、肾小球硬化、炎性肠病、类风湿性关节炎、糖尿病、多尿症、慢性自身免疫性甲状腺炎和格雷夫斯氏病、神经退行性和神经炎症性疾病，如阿尔茨海默病。在一些实施方案中，CD38介导的疾病或病症选自人类癌症，包括胃癌和结直肠癌、胰腺癌、***癌、肺癌、肝细胞癌、三阴性乳腺癌、鼻咽癌、***，以及恶性血液病。

在另一方面，本公开提供了用于在对其有需要的受试者中介导CD38的方法，该方法包括向受试者施用有效量的本文所公开的抗体或双特异性抗体或药物组合物。

本文更详细地描述了本公开的这些和其他实施方案。

附图说明

图1是示出CD38在免疫细胞中的作用的示意图。图1A显示了CD38主要在免疫细胞上表达，并将烟酰胺核苷酸(NAD⁺和NMN)代谢为ADPR和cADPR(Hogan,Chini等人,2019)。图1B显示了阻碍抗肿瘤免疫的多种免疫抑制机制。

图2显示了CD38的mRNA表达谱。

图3示出了抗CD38抗体的作用机制。

图4示出了抗CD38抗体的抗性机制。

图5是CD38 x CD3双特异性抗体的示意图。图5A显示了屏蔽的双特异性抗体，其包含两组不同的重链(HC)和轻链(LC)配对，如以“第一臂”和“第二臂”注释所指示。双臂均可以被屏蔽。图5B显示了双特异性抗体，其包含两组不同的重链(HC)和轻链(LC)配对，没有屏蔽或掩蔽域。图5C示出了具有屏蔽的CD3臂(第一臂)开放阅读框和CD38结合臂(第二臂)开放阅读框的特定组分。图5D示出了不具有屏蔽的CD3臂(第一臂)开放阅读框和CD38结合臂(第二臂)开放阅读框的特定组分。

图6是包含一个或多个抗CD38仅可变重链(VHO)单域的CD3 x CD38双特异性抗体的示意图。图6A显示了这样的CD3 x CD38双特异性抗体的两个实例：在“第二臂”(靶向CD38的臂)中包含单一VHO的双特异性抗体(左图)；包含CD38结合臂(第二臂)的双特异性抗体，该CD38结合臂包含两个融合在一起的VHO(右图)。在这两个实例中，VHO连接至屏蔽域。

图6B显示了在左图中，在“第二臂”(靶向CD38的臂)中包含单一VHO的双特异性抗体；以及在右图中，包含CD38结合臂(第二臂)的双特异性抗体，该CD38结合臂包含两个融合在一起的VHO。在这两个实例中，VHO不与屏蔽域连接。

图6C示出了具有屏蔽的CD3臂(第一臂)开放阅读框和CD38结合臂(第二臂)开放阅读框的特定组分。

图6D示出了不具有屏蔽的CD3臂(第一臂)开放阅读框和CD38结合臂(第二臂)开放阅读框的特定组分。

图7是从CD38 x CD3双特异性抗体中蛋白酶消化移除掩蔽域的示意图。

图8展示了在ELISA测定中抗CD3抗体与重组人(图8A)和食蟹猴(图8B)CD3δ和ε域蛋白的浓度依赖性ELISA结合。在结合测定中使用阳性对照抗CD3抗体SP34。SP34具有重链可变域序列：EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWV ARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYC VRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:127)以及轻链可变域序列：QTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLI GGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNLWV FGGGTKLTVL(SEQ ID NO:38)。y轴是以450nm吸光度单位的光密度表示的结合响应。x轴是所测试分子的浓度。SP34和SP34 v8(SEQID NO:38为轻链且SEQ ID NO:39为重链)与人和食蟹猴δ和ε域蛋白具有有力结合。

图9展示了抗CD3抗体与来自PBMC制备物的带有CD3的原代人T细胞的浓度依赖性流式细胞术结合。y轴是以全局平均荧光强度(gMFI，得自检测AlexaFluor647)表示的结合响应。x轴是所评估分子的浓度。

图10展示了抗CD38抗体与(图10A、D和E)重组人、(图10B)重组食蟹猴和(图10C)小鼠重组CD38蛋白的浓度依赖性ELISA结合。抗CD38单域抗体与人CD38的浓度依赖性ELISA结合显示于图10D和E中。y轴是以450nm吸光度单位的光密度表示的结合响应。x轴是所测试分子的浓度。结果显示，分别具有SEQ ID NO:2和3(mAb)，以及SEQ ID NO:4、5、6、17、18、20、21、24和29(VHO)的分子与重组人CD38蛋白结合。分别具有SEQ ID NO:4和5的分子可以与重组食蟹猴CD38蛋白结合。包含SEQ ID NO:4的分子可以与重组小鼠CD38蛋白结合。

图11展示了在存在带有CD38的H929多发性骨髓瘤细胞的情况下，来自带有CD3的Jurkat T细胞报告物测定系的CD38 x CD3双特异性抗体T细胞活化的剂量响应。具有SEQID NO:4的CD38 VHO与不同的CD3臂配对以制成所指定的CD38 x CD3双特异性抗体(分别表示为SEQ ID NO:4x Cris7 v4(具有SEQ ID NO:33的重链可变序列、具有SEQ ID NO:36的轻链可变序列)、SEQ ID NO:4x Cris7 v3(具有SEQ ID NO:32的重链可变序列、具有SEQ IDNO:37的轻链可变序列)，以及SEQ ID NO:4x SP34 v8(具有SEQ ID NO:39的重链可变序列、具有SEQ ID NO:38的轻链可变序列))。y轴是以相对光单位计的报告物测定响应。x轴是所测试分子的浓度。

图12展示了在存在带有CD38的L363多发性骨髓瘤细胞的情况下，来自带有CD3的Jurkat T细胞报告物测定系的CD38 x CD3双特异性抗体T细胞活化的剂量响应。具有SEQID NO:4的CD38 VHO与不同的CD3臂配对，以制成所指定的CD38 x CD3双特异性抗体(分别表示为SEQ ID NO:4x Cris7 v3(具有SEQ ID NO:32的重链可变序列、具有SEQ ID NO:37的轻链可变序列)、SEQ ID NO:4x Cris7 v4(具有SEQ ID NO:33的重链可变序列、具有SEQ IDNO:36的轻链可变序列)，以及SEQ ID NO:4x SP34)。y轴是以相对光单位计的报告物测定响应。x轴是所测试分子的浓度。

图13展示了在存在带有CD38的RPMI 8226多发性骨髓瘤细胞的情况下，来自带有CD3的Jurkat T细胞报告物测定系的CD38 x CD3双特异性抗体T细胞活化的剂量响应。具有SEQ ID NO:4的CD38 VHO与不同的CD3臂配对，以制成所指定的CD38 x CD3双特异性抗体。观察到了有力的T细胞活化响应。y轴是以相对光单位计的报告物测定响应。x轴是所评估分子的浓度。

图14展示了CD38 x CD3双特异性抗体指导的原代人T细胞杀伤带有CD38的多发性骨髓瘤细胞系H929的剂量响应。使用两个不同批次(图14A和14B)的PBMC。具有SEQ ID NO:4的CD38 VHO与不同的CD3臂配对，以制成图14中所指示的CD38 x CD3双特异性抗体。观察到了有力的T细胞杀伤响应。y轴是细胞杀伤百分比。x轴是所评估分子的浓度。

图15展示了CD38 x CD3双特异性抗体指导的原代人T细胞杀伤带有CD38的多发性骨髓瘤细胞系RPMI 8226的剂量响应。使用四个不同批次(图15A、15B、15C和15D)的PBMC。具有SEQ ID NO:4的CD38 VHO与不同的CD3臂配对，以制成图15中所指示的CD38 x CD3双特异性抗体。观察到了有力的T细胞杀伤响应。y轴是细胞杀伤百分比。x轴是所评估分子的浓度。

图16展示了CD38 x CD3双特异性抗体指导的原代人T细胞杀伤带有CD38的多发性骨髓瘤细胞系L363的剂量响应。使用不同批次(图16A、16B、16C和16D)的PBMC。具有SEQ IDNO:4的CD38 VHO与不同的CD3臂配对，以制成图16中所指示的CD38 x CD3双特异性抗体。观察到了有力的T细胞杀伤响应。y轴是细胞杀伤百分比。x轴是所评估分子的浓度。

图17显示了表示为SEQ ID NO:4x SP34 v8(包含CD38 SEQ ID NO:4和CD3 SP34v8(SEQ ID NO:38为轻链且SEQ ID NO:39为重链))；和SEQ ID NO:4x 40G5(包含CD38 SEQID NO:4和40G5(SEQ ID NO:40为轻链且SEQ ID NO:41为重链)的两种CD38 x CD3双特异性抗体的功效的小鼠模型。图17A显示了使用经包含新型抗CD38特异性的双特异性抗体以及具有已知抗CD3双特异性抗体活性的阳性对照抗CD3抗体处理的移植人PBMC和人NCI-H929多发性骨髓瘤细胞，小鼠功效模型的两种研究设计(“供体1/2”和“供体3/4”)。图17B-17C(对应于研究设计供体1/2)和图17D-17E(对应于研究设计供体3/4)显示了在使用移植的人PBMC并用图17B-17E所指示的抗体处理的小鼠功效模型中的人NCI-H929多发性骨髓瘤细胞肿瘤生长抑制。

发明详述

定义

本说明书中引用的所有出版物，包括但不限于专利和专利申请，均以引用方式并入本文，如同充分阐述一样。如果本文引用的参考文献的某些内容与本公开矛盾或不一致，则以本公开为准。

本文所述的公开内容的任一个实施方案，包括仅在描述本公开的特定方面的说明书的一个章节中所描述的那些，以及仅在实施例或附图中所描述的那些，可以与任何其他一个或多个实施方案组合，除非明确否认或不适当。

应当理解，本文使用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，并非旨在进行限制。除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语都具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。

尽管与本文所述的那些类似或等同的任何方法和材料均可在测试本公开的实践中使用，本文描述了示例性材料和方法。在描述和要求保护本公开时，将使用以下术语。

如在本说明书和所附权利要求中所用，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指代，除非内容另有明确规定。因此，例如，提及到的“细胞”包括两种或更多种细胞的组合等等。

“抗体”是广义的含义并且包括免疫球蛋白分子，包括单克隆抗体，包括鼠、人、人源化和嵌合单克隆抗体、抗体片段、双特异性或多特异性抗体、二聚体、四聚体或多聚体抗体、单链抗体、域抗体，以及包含所需特异性的抗原结合位点的免疫球蛋白分子的任何其他修饰构型。

“全长抗体分子”由通过二硫键互连的两条重链(HC)和两条轻链(LC)以及其多聚体(例如，IgM)构成。每条重链均由重链可变区(V_H)和重链恒定区(由域C_H1、铰链、C_H2和C_H3构成)构成。每条轻链由轻链可变区(V_L)和轻链恒定区(C_L)构成。V_H和V_L区可进一步细分为超变区，称为互补决定区(CDR)，散布有框架区(FR)。每个V_H和V_L由从氨基到羧基末端如下次序布置的三个CDR和四个FR片段构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。

“互补决定区(CDR)”是抗体中的“抗原结合位点”。CDR可以使用各种术语来定义：(i)互补决定区(CDR)，即V_H中的三个(HCDR1、HCDR2、HCDR3)以及V_L中的三个(LCDR1、LCDR2、LCDR3)，是基于序列变异性的(Wu和Kabat 1970)(Kabat等人,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第5版,Public Health Service,National InstitutesofHealth,Bethesda,Md.,1991)。(ii)“高变区”、“HVR”、或“HV”，即V_H中的三个(H1、H2、H3)以及V_L中的三个(L1、L2、L3)，是指抗体可变域的区域，它们在结构中是高变的，如Chothia和Lesk(Chothia和Lesk 1987)所定义。International ImMunoGeneTics(IMGT)数据库(http://www_imgt_org)提供了抗原结合位点的标准化编号和定义。描述了CDR、HV和IMGT划定之间的对应关系(Lefranc,Pommie等人,2003)。如本文所用，术语“CDR”、“HCDR1”、“HCDR2”、“HCDR3”、“LCDR1”、“LCDR2”和“LCDR3”包括由上文所描述的任何方法、Kabat、Chothia或IMGT定义的CDR，除非本说明书中另外明确说明。

取决于重链恒定区氨基酸序列，免疫球蛋白可归属于五大类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。IgA和IgG进一步细分为同种型IgA₁、IgA₂、IgG₁、IgG₂、IgG₃和IgG₄。基于其恒定区的氨基酸序列，任何脊椎动物物种的抗体轻链均可归属于两种明显不同的类型之一，即kappa(κ)和lambda(λ)。

“抗体片段”、“抗原结合片段”、或“抗原结合部分”是指免疫球蛋白分子中保留重链和/或轻链抗原结合位点的部分，如重链互补决定区(HCDR)1、2和3、轻链互补决定区(LCDR)1、2和3、重链可变区(V_H)、或轻链可变区(V_L)。抗体片段包括公知的F_ab、F(_ab’)2、F_d和F_v片段，以及由一个V_H域组成的域抗体(dAb)。V_H和V_L域可以经由合成接头连接在一起以形成各种类型的单链抗体设计，其中V_H/V_L域可以分子内配对，或者在V_H和V_L域由单独的单链抗体构建体表达时的那些情况下分子间配对，以形成单价抗原结合位点，如单链Fv(scFv)或双抗体；描述于例如国际专利公开No.WO1998/44001、WO1988/01649、WO1994/13804和WO1992/01047中。

“抗体模拟物”是指表现出与靶标特异性结合的工程化抗体蛋白。例如，抗体模拟物可以是亲和体(Affibody)、DARPin、Anticalin、Avimer、Versabody、或Duocalin。

“单克隆抗体”是指在每条重链和每条轻链中具有单一氨基酸组成的抗体群，除了可能的公知改变，如从抗体重链中移除C末端赖氨酸之外。单克隆抗体典型地结合一种抗原表位，除了例如双特异性单克隆抗体结合两种不同的抗原表位之外。单克隆抗体可在抗体群内具有异质糖基化。单克隆抗体可以是单特异性的或多特异性的、或者单价的、二价的、或多价的。双特异性抗体包括在术语单克隆抗体中。

“分离的抗体”是指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体或抗体片段。“分离的抗体”涵盖以较高纯度分离的抗体，如至少80％，如80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％纯的抗体。

“人源化抗体”是指其中抗原结合位点衍生自非人物种并且可变区框架衍生自人免疫球蛋白序列的抗体。人源化抗体可以包括框架中的取代，使得框架可能不是所表达的人免疫球蛋白或人免疫球蛋白种系基因序列的精确拷贝。

“人抗体”是指具有重链和轻链可变区的抗体，其中框架和抗原结合位点均衍生自人源序列并且被优化成在施用于人类受试者时具有最小免疫应答。如果抗体含有恒定区或恒定区的一部分，则恒定区也衍生自人源序列。

“抗靶标”是指可结合特定靶分子如CD38的抗体或抗体域(也称为抗体的抗原结合部分或片段)(即，抗CD38是可结合CD38的抗体或抗体域)。形式“CD38”是指CD38蛋白或CD38基因产物。形式“CD38”是指CD38基因。

“CD3 x CD38”是指可与CD3和CD38结合的双特异性抗体或抗体片段。制备双特异性抗体的过程需要对亲本mAb氨基酸序列中任一者进行重组修饰。尽管每个亲本mAb的CH1、CL和Fc域的氨基酸序列可能不相同，但在CD3 x CD38与CD38 x CD3双特异性抗体之间不存在结合上的显著差异。本文中“第一臂”和“第二臂”的注释是任意的。例如，在本文所公开的双特异性抗体中，第一臂可以靶向CD3，并且第二臂可以靶向CD38；或者第一臂可以靶向CD38，并且第二臂可以靶向CD3。

贯穿本说明书，抗体恒定区中氨基酸残基的编号是根据EU索引的，如描述于Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991)，除非另有明确说明。

本文中使用常规单和三字母氨基酸代码，如表1所显示。

表1

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本文所提供的多肽、核酸、融合蛋白，以及其他组合物可以涵盖与本文所提供的氨基酸序列或DNA序列具有所叙述的百分比同一性的多肽、核酸、融合蛋白等等。术语“同一性”是指两个或更多个多肽分子或两个或更多个核酸分子的序列之间的关系，如通过比对和比较序列所确定。“百分比同一性”、“百分比同源性”、“序列同一性”、或“序列同源性”等等意指所比较分子中的氨基酸或核苷酸之间相同残基的百分比，并且基于所比较的最小分子的尺寸来计算。例如，与序列B“至少85％同一性”的序列A意指序列A包含与序列B的那些至少85％，例如至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的残基。对于这些计算，优选地通过特定数学模型或计算机程序(即“算法”)寻址比对中的空位(如果有的话)。可用于计算所比对的核酸或多肽的同一性的方法包括描述于Computational Molecular Biology,(Lesk,A.M.编辑),1988,New York:OxfordUniversity Press；Biocomputing Informatics and Genome Projects,(Smith,D.W.编辑),1993,New York:Academic Press；Computer Analysis of Sequence Data,Part I,(Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编辑),1994,New Jersey:Humana Press；von Heinje,G.,1987,Sequence Analysis in Molecular Biology,New York:Academic Press；SequenceAnalysis Primer,(Gribskov,M.and Devereux,J.编辑),1991,New York:M.StocktonPress；以及Carillo等人,1988,SIAM J.Applied Math.48:1073中的那些。在计算百分比同一性时，所比较的序列典型地以给出序列之间最大匹配的方式进行比对。

哺乳动物IgG重链的恒定区序列按序列命名为C_H1-铰链-C_H2-C_H3。根据EU索引，IgG的“铰链”、“铰链区”或“铰链域”通常被定义为包括Glu216且终止于人IgG₁的Pro230，但在功能上，链的柔性部分可以被认为包括被称作上和下铰链区的额外的残基，如从Glu216到Gly237，并且下铰链涉及到F_c区的残基233至239，其中F_cγR结合通常归因于此。其他IgG同种型的铰链区可以通过放置形成重链间S-S键的第一个和最后一个半胱氨酸残基而与IgG₁序列进行比对。尽管边界可能略有不同，但如根据EU索引编号，C_H1域与V_H域和免疫球蛋白重链分子铰链区的氨基末端相邻，并且包括免疫球蛋白重链的第一个(最氨基末端)恒定区，例如来自约EU位置118-215。F_c域从氨基酸231延伸至氨基酸447；C_H2域是从约Ala231至Lys340或Gly341，并且C_H3是从约Gly341或Gln342至Lys447。C_H1区的IgG重链恒定区的残基终止于Lys。含有F_c域的分子至少包含抗体恒定区的C_H2和C_H3域，因此至少包含IgG重链恒定区的约Ala231至Lys447的区域。含有F_c域的分子可任选地包含铰链区的至少一部分。

“表位”是指抗体特异性结合的抗原的一部分(例如CD3或CD38)。表位典型地由化学活性(如极性、非极性、或疏水性)表面簇集的部分，如氨基酸或多糖侧链组成，并且可具有特定三维结构特征以及特定电荷特征。表位可以由形成构象空间单元的连续和/或不连续氨基酸构成。对于不连续表位，来自抗原线性序列的不同部分的氨基酸通过蛋白质分子的折叠而在3维空间中靠近。抗体“表位”取决于用于鉴定表位的方法。

如本文所用，“前导序列”(也称为“信号肽”或“信号序列”)包括可由哺乳动物细胞加工的任何信号肽，包括人B2M前导序列。此类序列在本领域中是公知。

“可切割接头”(也称为“蛋白酶序列”)是可以被酶切割的肽底物。可操作地，可切割接头在被酶切割后允许活化具有掩蔽域(例如，基于IGF2的掩蔽域)的本发明的屏蔽的抗体(也称为前抗体)。优选地，可切割接头被选择成使得活化发生在所期望的作用位点处，该作用位点可以是靶细胞(例如，癌细胞)或组织之中或附近的位点。例如，可切割接头是针对在作用位点中特异性或高度表达的酶特异性的肽底物，使得可切割接头在靶位点中的切割率大于靶位点以外的位点中的切割率。

术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可在本文中互换使用，并且是指任何长度的氨基酸的聚合物形式，其可以包括编码和非编码的氨基酸、化学或生物化学修饰或衍生的氨基酸，以及具有修饰肽骨架的多肽。该术语还包括具有多肽的共翻译(例如，信号肽切割)和翻译后修饰的多肽，如例如二硫键形成、糖基化、乙酰化、磷酸化、蛋白水解切割等等。

此外，如本文所用，“多肽”是指包括对天然序列的修饰，如缺失、添加和取代(通常本质上是保守的，如本领域的技术人员已知)的蛋白质，只要该蛋白质维持所期望的活性即可。这些修饰可以是有意的，如通过定点诱变，或者可以是偶然的，如通过产生蛋白质的宿主的突变、或由PCR扩增或其他重组DNA方法所致的错误。

本公开中的术语“掩蔽域”(也称为“屏蔽物”、“屏蔽域”、或“掩蔽物”)是指能够与抗体融合并掩蔽抗体与其抗原的结合的蛋白质域。屏蔽域可以掩蔽抗体识别其靶表位，因此抗体保持为无活性的屏蔽抗体形式。在移除屏蔽域后，抗体的可变域暴露出来，并且可以与其靶标结合并发挥作用。

如本文中用于描述核酸分子的术语“重组体”意指基因组、cDNA、病毒、半合成、和/或合成来源的多核苷酸，由于其来源或操纵，其与自然界中与之相关联的多核苷酸序列的全部或一部分不相关。如关于蛋白质或多肽所用，术语“重组体”是指通过由重组多核苷酸表达所产生的多肽。如关于宿主细胞或病毒所用，术语“重组体”是指重组多核苷酸已引入到其中的宿主细胞或病毒。重组体在本文中也用于指材料(例如，细胞、核酸、蛋白质、或载体)，该材料通过引入异源材料(例如，细胞、核酸、蛋白质、或载体)而修饰。

术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”在本文中可互换使用，以包括核苷酸的聚合物形式(核糖核苷酸或是脱氧核糖核苷酸)。该术语仅指分子的一级结构。

“载体”是指能够在生物***内复制或者可在此类***之间移动的多核苷酸。载体多核苷酸典型地含有元件，如复制起点、聚腺苷酸化信号或选择标记，其功能是有利于这些多核苷酸在生物***(如细胞、病毒、动物、植物，以及利用能够复制载体的生物组分的重构生物***)中复制或维持。载体多核苷酸可以是单链或双链的DNA或RNA分子、cDNA、或这些的杂交体。

“表达载体”是指可用于生物***或重构生物***中以指导由存在于表达载体中的多核苷酸序列编码的多肽的翻译的载体。

如本文所用，提及到的核酸序列、蛋白质或多肽所使用的术语“异源”意指这些分子不天然存在于衍生该异源核酸序列、蛋白质或多肽的细胞中。例如，***到非人细胞的细胞中的编码人多肽的核酸序列在该特定情形下是异源核酸序列。尽管异源核酸可衍生自不同的生物体或动物物种，但这样的核酸不一定衍生自异源的单独生物体物种。例如，在某些情况下，合成核酸序列或由其编码的多肽对于其所引入的细胞可以是异源的，因为该细胞此前不含有该合成核酸。因此，例如，即使合成核酸序列或由其编码的多肽的一种或多种组分最初衍生自人类细胞，合成核酸序列或由其编码的多肽可以被认为对于人类细胞也是异源的。

如本文所用，“宿主细胞”表示能够用本公开的核酸或载体转化以便产生由此编码的多肽的任何类型的细胞。例如，宿主细胞可以是体内或体外真核细胞或来自作为单细胞实体培养的多细胞生物体的细胞(例如，细胞系)，该真核细胞可以或已经被用作核酸的受者(例如，包含编码本公开的多聚体多肽的核苷酸序列的表达载体)，并且包括已被该核酸遗传修饰的原始细胞的子代。应当理解，由于自然、意外、或有意突变，单一细胞的子代在形态学或基因组或总DNA互补序列上不一定与原始亲本完全相同。“重组宿主细胞”(也称为“遗传修饰的宿主细胞”)是异源核酸(例如，表达载体)已引入其中的宿主细胞。例如，遗传修饰的真核宿主细胞是借助于向合适的真核宿主细胞中引入异源核酸，例如，对于真核宿主细胞而言外来的外源核酸、或真核宿主细胞中通常不存在的重组核酸而进行遗传修饰的。

“特异性结合”或“特异性地结合”或“结合”是指抗体以比其他抗原更大的亲和力与特定抗原结合。典型地，当结合的平衡解离常数(K_D)为约1x 10^-8M或更小，例如约1x 10^-9M或更小、约1x 10^-10M或更小、约1x 10^-11M或更小、或约1x 10^-12M或更小，典型地K_D比其与非特异性抗原(例如，BSA、酪蛋白)结合的K_D低至少一百倍时，抗体“特异性地结合”。K_D可以使用标准程序进行测量。

如本文所用，术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”等等是指获得期望的药理学和/或生理学效应。效应就完全或部分预防疾病或其症状而言可以是预防性的，并且/或者就部分或完全治愈疾病和/或可归因于该疾病的副作用而言可以是治疗性的。如本文所用，“治疗”涵盖对哺乳动物(例如人类)的疾病的任何治疗，并且包括：(a)预防疾病在可能易患疾病但尚未诊断患有疾病的受试者中发生；(b)抑制疾病，即阻止其发展；和(c)缓和疾病，即，引起疾病消退。

本文可互换使用的术语“个体”、“受试者”、“宿主”和“患者”是指哺乳动物，包括但不限于鼠科动物(例如，大鼠、小鼠)、兔类动物(例如，兔)、非人灵长类、人类、犬科动物、猫科动物、有蹄类动物(例如，马科动物、牛科动物、绵羊科动物、猪科动物、山羊科动物)等。

“治疗有效量”、“药学有效量”、“有效量”、或“有效的量”是指当施用给哺乳动物或其他受试者以治疗疾病时足以影响此类疾病治疗的药剂的量、或两种药剂的组合量。“治疗有效量”将取决于一种或多种药剂、疾病及其严重程度，以及待治疗的受试者的年龄、体重等而变化。

在进一步描述本公开之前，应当理解，本公开不限于所描述的特定实施方案，因此当然可以变化。还应当理解，本文使用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，并非旨在进行限制。

CD38和抗CD38抗体

如图1A所显示，CD38主要在免疫细胞上表达，并将烟酰胺核苷酸(NAD⁺和NMN)代谢为ADPR和cADPR(Hogan,Chini等人,2019)。这些代谢物动员钙离子。尽管细胞内CD38存在于细胞质和细胞器膜中，但绝大多数CD38活性是细胞外的，这导致NAD⁺合成所需的NAD⁺前体(例如，NMN)降解。如图1B所显示，CD38的细胞外活性对感染、代谢功能障碍、衰老，以及肿瘤生物学背景下的NAD⁺稳态具有广泛的影响。多种免疫抑制机制阻碍抗肿瘤免疫。其中，细胞外腺苷的积聚是一种有力且广泛的策略，肿瘤利用该策略通过活化嘌呤能受体来逃避免疫监视。在免疫***中，A2a和A2b腺苷受体的接合是保护组织免受过度免疫反应的关键调节机制。在肿瘤中，该途径被劫持并妨碍抗肿瘤免疫，从而促使癌症进展(Allard,Beavis等人,2016)。

如图2所显示，CD38表达在胸腺和***中较高。然而，表达水平在活化BDCA4+树突状细胞、CD56+NK细胞、白血病细胞和淋巴瘤细胞上高得多。该图使用BioGPS软件生成(Su,Wiltshire等人,2004,Wu,Jin等人,2016)。

如图3所显示，抗CD38抗体可以识别MM细胞上的CD38，从而经由Fc依赖性机制且经由免疫调节效应导致抗MM活性(Saltarella,Desantis等人,2020)。Fc依赖性机制可以包含(a)抗体依赖性细胞毒性(ADCC)；(b)经由抗体Fc域与FcγR表达效应细胞(例如，NK细胞、γδT细胞、中性粒细胞和巨噬细胞)接合的抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)，从而分别引起MM细胞的裂解和/或吞噬作用；(c)经由C1q的接合以活化补体级联的补体依赖性细胞毒性(CDC)，从而导致能够裂解靶细胞的膜攻击复合物(MAC)的装配。抗CD38抗体可以通过抑制CD38胞外酶活性而具有免疫调节效应，从而导致免疫抑制性胞外腺苷(ADO)减少。此外，可以消除CD38+免疫抑制细胞(即，MDSC、Treg和Breg)，由此促使T细胞增殖和效应子功能。

如图4所显示，抗CD38抗体可以诱导数种抗性机制，包括以下：(a)CD38dim MM细胞的克隆选择，由此最小化细胞上的mAb机制；(b)经由CD38内吞作用、粒细胞和单核细胞的胞啃，以及经由有助于腺苷产生和免疫抑制的CD38表达微泡的释放来减少CD38；(c)经由骨髓源性干细胞/基质细胞(BMSC)的细胞内途径的下调、减少效应记忆T细胞、M1巨噬细胞以及T细胞上的共刺激CD28表达而得到的免疫调节效应；(d)MM细胞中CD46和膜相关补体抑制蛋白(CD55和CD59)的过表达，其防止了CDC；(e)识别肿瘤上的免疫检查点信号调节蛋白α(SIRP)的CD47的MM细胞过表达，由此抑制抗体依赖性细胞毒性吞噬作用(ADCP)；以及(f)经由自残杀ADCC使CD38+NK细胞消减。

人CD38的一级氨基酸序列如表2中SEQ NO:1中所示。

表2

在一些实施方案中，本公开提供了抗CD38抗体及其抗原结合部分。作为非限制性实例，本公开提供了如表3中SEQ ID NO:2-30所示的抗CD38重链和轻链可变区氨基酸序列。

在一些实施方案中，本公开提供了抗CD38抗体或其抗原结合部分，该抗CD38抗体或其抗原结合部分包含含有命名为HCDR1、HCDR2和HCDR3的三个互补决定区(CDR)的重链可变区，其中HCDR1、HCDR2和HCDR3分别选自：SEQ ID NO:64、65和66；SEQ ID NO:64、83和84；SEQ ID NO:64、65和85；以及SEQ ID NO:64、65和86。

在一些实施方案中，本公开提供了抗CD38抗体或其抗原结合部分，该抗CD38抗体或其抗原结合部分包含含有命名为LCDR1、LCDR2和LCDR3的三个CDR的轻链可变区，其中LCDR1、LCDR2和LCDR3分别选自：SEQ ID NO:61、62和63；SEQ ID NO:76、77和78；SEQ ID NO:79、80和81；以及SEQ ID NO:82、62和78。

在一些实施方案中，本公开提供了抗CD38抗体或其抗原结合部分，该抗CD38抗体或其抗原结合部分包含：

在一些实施方案中，本公开提供了抗CD38抗体或其抗原结合片段，该抗CD38抗体或其抗原结合片段包含含有与SEQ ID NO:12-16中任一者具有至少85％同一性(例如，85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％)的氨基酸序列或其抗原结合部分的重链序列，以及含有与SEQ ID NO:7-11中任一者具有至少85％同一性(例如，85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％)的氨基酸序列或其抗原结合部分的轻链序列。

在一些实施方案中，本公开提供了抗CD38抗体或其抗原结合部分，该抗CD38抗体或其抗原结合部分包含至少一个仅可变重链单域或其抗原结合部分，其中至少一个仅可变重链单域包含分别选自以下项的三个CDR(HCDR1、HCDR2和HCDR3)：SEQ ID NO:67、68和69；SEQ ID NO:67、87和69；SEQ ID NO:67、88和69；SEQ ID NO:67、89和69；SEQ ID NO:67、68和90；SEQ ID NO:70、91和72；SEQ ID NO:70、92和72；SEQ ID NO:70、93和72；SEQ ID NO:94、95和96；SEQ ID NO:70、71和97；SEQ ID NO:73、98和75；SEQ ID NO:73、99和75；SEQ ID NO:73、100和75；SEQ ID NO:73、101和102；以及SEQ ID NO:73、103和104。

在一些实施方案中，本公开提供了抗CD38抗体或其抗原结合部分，该抗CD38抗体或其抗原结合部分包含至少一个仅可变重链单域或其抗原结合部分，其中至少一个仅可变重链(VHO)单域包含与SEQ ID NO:4和17-30中任一者具有至少85％同一性(例如，85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％)的氨基酸序列或其抗原结合部分。

本公开的抗CD38抗体涵盖包含两条重链和两条轻链的全长抗体。抗体可以是人或人源化嵌合抗体。如本文所用，人源化抗体包括嵌合抗体和CDR移植抗体。嵌合抗体是包括与人恒定区连接的非人抗体可变区的抗体。CDR移植抗体是这样的抗体：其包括来自非人“供体”抗体的CDR，该CDR与来自人“受者”抗体的框架区连接。示例性人或人源化抗体包括IgG、IgM、IgE、IgA和IgD抗体。本发明的抗体可以是任何类别(IgG、IgM、IgE、IgA、IgD等)或同种型。例如，人抗体可以包含IgG Fc域，如同种型IgGl、IgG2、IgG3、或IgG4中的至少一种。

在一些实施方案中，抗CD38抗体或其抗原结合部分选自整个抗体、抗体片段、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体、缀合物、抗体模拟物，以及去岩藻糖基化抗体。在进一步实例中，抗CD38抗体片段选自UniBody、仅可变重链单域抗体，以及纳米抗体。例如，抗CD38抗体片段是如SEQ ID NO:17-30中所提到的纳米抗体。在一些实例中，抗CD38抗体片段选自单域VHH、单域VHO、亲和体、DARPin、Anticalin、Avimer、Versabody，以及Duocalin。

抗CD3抗体

在一些实施方案中，本公开提供了抗CD3抗体及其抗原结合部分。作为非限制性实例，本公开提供了如表4中SEQ ID NO:31-41所示的抗CD3氨基酸序列。

在一些实施方案中，本公开提供了抗CD3抗体或其抗原结合部分，该抗CD3抗体或其抗原结合部分包含含有命名为HCDR1、HCDR2和HCDR3的三个互补决定区(CDR)的重链可变区，其中HCDR1、HCDR2和HCDR3分别选自：SEQ ID NO:105、108和107；SEQ ID NO:105、109和107；SEQ ID NO:105、110和107；以及SEQ ID NO:118、119和120。

在一些实施方案中，本公开提供了抗CD3抗体或其抗原结合部分，该抗CD3抗体或其抗原结合部分包含含有命名为LCDR1、LCDR2和LCDR3的三个CDR的轻链可变区，其中LCDR1、LCDR2和LCDR3分别选自：SEQ ID NO:114、112和113；以及SEQ ID NO:115、116和117。

在一些实施方案中，本公开提供了抗CD3抗体或其抗原结合部分，该抗CD3抗体或其抗原结合部分包含：

在一些实施方案中，本公开提供了抗CD3抗体或其抗原结合片段，该抗CD3抗体或其抗原结合片段包含含有与SEQ ID NO:32-34和39中任一者具有至少85％同一性(例如，85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％)的氨基酸序列或其抗原结合部分的重链序列，以及含有与SEQ ID NO:36-38中任一者具有至少85％同一性的氨基酸序列或其抗原结合部分的轻链序列。

本公开的抗CD3抗体涵盖包含两条重链和两条轻链的全长抗体。抗体可以是人或人源化抗体。

在一些实施方案中，抗CD3抗体或其抗原结合部分选自整个抗体、抗体片段、人抗体、人源化抗体、单链抗体、缀合物、抗体模拟物，以及去岩藻糖基化抗体。在进一步实例中，抗CD3抗体片段选自UniBody、仅可变重链单域抗体，以及纳米抗体。在一些实例中，抗CD3抗体片段选自单域VHH、单域VHO、亲和体、DARPin、Anticalin、Avimer、Versabody，以及Duocalin。

双特异性CD3 x CD38抗体

在一些实施方案中，本公开提供了CD3 x CD38双特异性抗体，它同时靶向与CD38相关途径有关的蛋白质以及能够活化CD3 T细胞活性的蛋白质。在一些实施方案中，本公开提供了包含屏蔽域的CD3 x CD38双特异性抗体。在一些实施方案中，本公开提供了不含屏蔽域的CD3 x CD38双特异性抗体。CD3和CD38靶标在病理部位和正常组织中具有差异性表达水平。由于掩蔽域对结合域的抑制效应，屏蔽的CD3 x CD38双特异性抗体在正常组织中保持无活性。掩蔽域被疾病部位中的蛋白酶切割掉，并且屏蔽的CD3 x CD38双特异性抗体转化为活性CD3 x CD38双特异性抗体。

在一些实施方案中，本公开提供了同时靶向并结合人CD38和CD3，具有高亲和力，并且能够在蛋白质水平上有效阻断CD38蛋白的双特异性抗体。该双特异性抗体结合CD3和CD38蛋白两者，并且与一种蛋白结合而不影响另一种蛋白的结合，也就是说，具有同时结合CD3和CD38的能力。本文所公开的双特异性抗体填补了不存在同时靶向CD3和CD38的抗体的空白。本文所公开的双特异性抗体抑制CD38介导的疾病或病症，如血管内皮细胞、人肺癌细胞、人乳腺癌细胞、人胰腺癌细胞、和/或人胃癌细胞的增殖。

在一些实施方案中，本公开提供了双特异性抗体，该双特异性抗体包含：

第一结合臂，该第一结合臂包含：

其中第一结合臂的IgG重链或其抗原结合部分以及IgG轻链或其抗原结合部分可以靶向CD3相关途径；以及

第二结合臂，该第二结合臂包含：

其中第二结合臂的IgG重链或其抗原结合部分以及IgG轻链或其抗原结合部分可以靶向CD38相关途径。

屏蔽物A-D可以彼此相同或不同，并且蛋白酶序列A-D可以彼此相同或不同。

第一结合臂，该第一结合臂包含：

第二结合臂，该第二结合臂包含：

其中第二结合臂的IgG重链或其抗原结合部分以及IgG轻链或其抗原结合部分能够靶向CD38相关途径。

信号序列A-D可以彼此相同或不同，并且接头A-H可以彼此相同或不同。

第一结合臂，该第一结合臂包含：

第二结合臂，该第二结合臂包含：

其中至少一个仅可变重链单域或其抗原结合部分能够靶向CD38相关途径。

屏蔽物A-C可以彼此相同或不同，并且蛋白酶序列A-C可以彼此相同或不同。

第一结合臂，该第一结合臂包含：

第二结合臂，该第二结合臂包含：

其中至少一个仅可变重链单域能够靶向CD38相关途径。

信号序列A-C可以彼此相同或不同，并且接头A-F可以彼此相同或不同。

在一些实施方案中，双特异性抗体由两组轻链融合体和两组重链融合体组成。例如，来自相应亲本抗体的轻链融合体和重链融合体的结构显示于图5中。例如，双特异性抗体可以包含人IgG1重链融合体，该人IgG1重链融合体从N-末端到C-末端包含氨基酸序列：信号序列A—屏蔽物A—接头A—蛋白酶序列A—接头B—IgG1重链；以及人IgG1轻链融合体，该人IgG1轻链融合体从N-末端到C-末端包含氨基酸序列：信号序列B—屏蔽物B—接头B—蛋白酶序列B—接头C—IgG1轻链。信号序列A可以与信号序列B相同或不同。屏蔽物A可以与屏蔽物B相同或不同。接头A可以与接头B相同或不同。蛋白酶序列B可以与蛋白酶序列A相同或不同。在一些实施方案中，双特异性抗体由两组重链融合体和一组轻链融合体组成，如图6A和6B所示。

本公开提供了双特异性抗体，该双特异性抗体可以经由受控的Fab臂交换或经由共表达使用CH1、CH2和CH3域中充分确立的点突变来生成。在一些实施方案中，所有构建体都是对称的，使得对相应亲本抗体的点突变的选择没有偏好。

图5-7示出了具有或不具有掩蔽域的本文所公开的双特异性抗体的几种形式。图5A显示了双特异性抗体，其具有两组不同的重链(HC)和轻链(LC)配对，如以“第一臂”(靶向CD3)和“第二臂”(靶向CD38)注释所指示。图5B显示了双特异性Ab的CD3臂(第一臂)可以包含具有HC和LC的人IgG，其中轻链融合体从N末端到C末端包含：掩蔽域B、蛋白酶可切割接头B、LC可变区VL，以及恒定轻链CL(例如Cλ)，并且其中重链融合体从N末端到C末端包含：掩蔽域A、蛋白酶可切割接头A、HC可变区VH、CH1域，以及Fc区。图5C显示了双特异性Ab的CD38结合臂(第二臂)可以包含具有HC和LC的人IgG，其中轻链融合体从N末端到C末端包含：掩蔽域B、蛋白酶可切割接头B、LC可变区VL，以及恒定轻链CL(例如Cκ或Cλ)，并且其中重链从N末端到C末端包含：掩蔽域A、蛋白酶可切割接头A、串联的HC可变区VH或VHO、CH1域，以及Fc区。Fc区可进一步遗传融合到归巢域(HD)。不同或相同的接头可以置于掩蔽物A与蛋白酶可切割接头A、蛋白酶可切割接头A与VH、以及Fc域与HD域之间。不同或相同的接头可以置于掩蔽物B与蛋白酶可切割接头B、蛋白酶可切割接头B与串联的VH或VHO、以及Fc域与HD域之间。重链和轻链可以具有相同或不同的互补掩蔽域以及蛋白酶可切割接头。

图6A显示了双特异性抗体在“第二臂”(靶向CD38的臂)中包含单一VHO，并且图6B显示了CD38结合臂(第二臂)包含两个融合在一起的VHO。图6C显示了图6A和6B所示的双特异性Ab的CD3臂(第一臂)可以包含具有HC和LC的人IgG，如图5B所示。图6C还显示了CD38结合臂从N-末端到C-末端包含：掩蔽域A、蛋白酶可切割接头A、HC VHO可变区、CH1域，以及Fc区。可以存在超过一个由接头域隔开的VHO融合体，以获得更高的特异性。CD38结合臂可以具有与CD3结合臂不同的接头和掩蔽域。

图7是显示从CD38 x CD3双特异性抗体中移除掩蔽域的示意图。肿瘤微环境中浓度较高的蛋白酶可以沿着蛋白酶可切割接头进行切割，以将屏蔽的双特异性抗体转化为活性双特异性抗体。

本文所公开的双特异性抗体中的VHO域的基因融合(例如，包含与人IgGl的CHl-铰链-CH2-CH3域或人IgGl的铰链-CH2-CH3域连接的人VHO单域)产生了尺寸为常规抗体的一半(75vs.150kDa)的高度可溶性嵌合重链抗体，如图5和6所显示。此类构建体可以比常规抗体更好地渗透组织。此外，本文所公开的双特异性分子将利用其在患病组织中增加的肿瘤细胞生长抑制功效，但通过屏蔽正常组织中CD3和CD38的结合表位来减轻增加的毒性问题，如图7所显示。因此，本文所公开的双特异性抗体对于根源于CD38过表达的肿瘤学和其他病症具有CD38的有效靶向，但安全性问题降低，从而扩展了CD38在多种癌症以及其他非肿瘤学适应症的疗法情形中的作用。

在本文所公开的双特异性抗体的一些实施方案中，靶向CD3的结合臂的结合价为1。双特异性抗体优选地被设计为具有单价CD3结合(即，一个Fab臂结合CD3的表位)。二价CD3结合与效应细胞中活化诱导的细胞死亡过度有关，这将限制T细胞重定向的功效。此外，二价CD3重定向分子可导致肿瘤抗原非依赖性免疫效应细胞活化，从而可增加患者中的全身毒性。使用高亲和力的抗CD3抗体Fab臂也可增加毒性。由于导致大量细胞因子释放，抗CD3 Fab或scFv的高亲和力变体典型地在食蟹猴中耐受性较差。对CD3的高亲和力也使双特异性抗体生物分布从肿瘤向富CD3组织转换，从而导致细胞因子释放综合征的风险增加。因此，高度期望抗CD3臂的结合亲和力低于抗CD38臂。二价抗CD3剂可以增加与CD3结合的亲合力，并可能导致肿瘤外CD3阳性细胞的细胞因子释放综合征的增加。

在本文所公开的双特异性抗体的一些实施方案中，靶向CD38相关途径(如CD38)的第二结合臂可以包含串联的两至四个，如两或三个IgG仅可变重链单域或其抗原结合部分，其中两个或三个IgG仅可变重链单域或其抗原结合部分任选地经由一个或多个接头连接。靶向CD38相关途径(如CD38)的第二结合臂可以是单价、二价、三价、四价等。例如，可以在双特异性抗体中存在对CD38的双重或三重或四重表位识别，以增强接合的特异性。

长期施用抗CD3或抗CD38生物制剂药物给患者带来了很大的风险因素。在一些实施方案中，本公开提供了能够形成分子间相互作用以阻断Fab臂与其相应表位接合的屏蔽物的组合。屏蔽物可以融合至重链和/或轻链域。屏蔽物可以经由空间位阻来阻断Fab CDR区与抗原的结合。屏蔽物的存在可以最小化本文所公开的CD3 x CD38双特异性抗体的全身毒性，并且可以增加双特异性抗体中相应臂的安全特性和治疗窗口。屏蔽物可以通过存在于肿瘤微环境中的蛋白酶和/或其他原位特异性酶移除。本文所公开的双特异性抗体中的屏蔽域(也称为屏蔽物、掩蔽物、或掩蔽域)，例如屏蔽物A、B、C、D、E和F，可以相同或不同。在一些实施方案中，屏蔽物A、屏蔽物B、屏蔽物C、屏蔽物D、屏蔽物E，以及屏蔽物F各自独立地选自SEQ ID NO:42-52中所示的氨基酸序列。

本文所公开的双特异性抗体中的蛋白酶序列，例如蛋白酶序列A、B、C、D、E和F可以相同或不同。在一些实施方案中，蛋白酶序列A、蛋白酶序列B、蛋白酶序列C、蛋白酶序列D、蛋白酶序列E，以及蛋白酶序列F各自独立地选自SEQ ID NO:53-60中所示的氨基酸序列。

本文所公开的双特异性抗体中的肽接头，例如接头A、B、C、D、E和F可以相同或不同。

在一些实施方案中，本文所公开的双特异性抗体包含选自SEQ ID NO:3和12-16的重链序列以及选自SEQ ID NO:2和7-11的轻链序列。

在一些实施方案中，本文所公开的双特异性抗体可以包含多个靶向CD38的结合臂。例如，本文所公开的双特异性抗体包含第一CD38结合臂，该第一CD38结合臂包含含有SEQ ID NO:2的轻链和含有SEQ ID NO:3的重链；第二CD38结合臂，该第二CD38结合臂包含选自SEQ ID NO:7-11的轻链序列和选自SEQ ID NO:12-16的重链序列。

在一些实施方案中，本文所公开的双特异性抗体包含可靶向CD38的结合臂，其中该结合臂包含选自SEQ ID NO:2-6的人IgG1重链和轻链序列。

前导序列

在某些实施方案中，引入前导肽，以驱动本文所述的抗体(例如，屏蔽的CD3 xCD38双特异性抗体)分泌到细胞培养上清液中作为分泌的相应亲本抗体蛋白。可以使用任何已知的分泌蛋白质/肽的任何前导肽。

如本文所用，“前导肽(leader peptide)、“前导肽(lead peptide)”、或“信号肽”包括长度通常为16-30个氨基酸的短肽，它存在于大多数新合成的蛋白质的N-末端，被定向分泌途径。尽管前导肽在序列上极其异质，并且许多原核和真核前导肽即使在不同物种之间也在功能上可互换，但蛋白质分泌的效率可强烈地由前导/信号肽的序列决定。

在某些实施方案中，前导肽来自于驻留在特定细胞器(如内质网、高尔基体、或内体(endosome))内、从细胞分泌、或***到大多数细胞膜中的蛋白质。

在某些实施方案中，前导肽来自于真核蛋白质。

在某些实施方案中，前导肽来自于分泌蛋白，例如分泌到细胞外的蛋白。

在某些实施方案中，前导肽来自于膜蛋白。

在某些实施方案中，前导肽含有一段被信号肽酶识别并切割的氨基酸。

在某些实施方案中，前导肽不含有信号肽酶的切割识别序列。

在某些实施方案中，前导肽是用于组织纤溶酶原激活剂(tPA)、单纯疱疹病毒糖蛋白D(HSV gD)、生长激素、细胞因子、脂蛋白输出信号、CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD4、CD8α、CD19、CD28、4-1BB或GM-CSFR的信号肽、或是酿酒酵母(S.cerevisiae)配合因子α-1信号肽。

在一些实施方案中，如本文所述的前导序列可以是哺乳动物CD4或CD8前导序列，包括但不限于例如人CD4或CD8前导序列、非人灵长类CD4或CD8前导序列、啮齿动物CD4或CD8前导序列等等。在一些实施方案中，CD4或CD8前导序列包含与人CD4或CD8前导序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

适用于屏蔽的CD3 x CD38双特异性抗体设计的抗CD3和抗D38抗体以及片段

在一些实施方案中，本公开提供了用于CD3 x CD38双特异性抗体设计的抗CD3和抗CD38抗体以及它们的抗原结合片段。CD3和CD38抗体或其抗原结合片段的fab可以经由蛋白酶可切割接头序列连接至屏蔽物，以制成如本文所公开的屏蔽的CD3 x CD38双特异性抗体。

适用于本公开的屏蔽的CD3 x CD38双特异性抗体设计的抗CD3和抗CD38抗体以及片段涵盖包含两条重链和两条轻链的全长抗体。抗体可以是人或人源化抗体。

在一些实施方案中，抗CD38抗体或抗CD3抗体选自整个抗体、抗体片段、人或人源化抗体、单链抗体、缀合物、抗体模拟物，以及去岩藻糖基化抗体。在进一步实例中，抗CD38或抗CD3抗体片段选自UniBody、仅可变重链单域抗体，以及纳米抗体。例如，抗CD38抗体片段是如SEQ ID NO:17-30中所提到的纳米抗体。在一些实例中，抗CD38或抗CD3抗体选自单域VHH、单域VHO、亲和体、DARPin、Anticalin、Avimer、Versabody，以及Duocalin。作为非限制性实例，本公开提供了如表3中SEQ ID NO:2-30所示的抗CD38重链和轻链可变区氨基酸序列。作为非限制性实例，本公开提供了如表4中SEQ ID NO:31-41所示的CD3构建体氨基酸序列。可以制备包含表3和4中所示的氨基酸序列的任何合适的组合的本文所公开的双特异性抗体。

表3

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表4

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在一些实施方案中，本公开提供了结合人CD38上的表位的分离的抗CD38单克隆抗体、或其抗原结合部分、抗体片段、或抗体模拟物，该人CD38上的表位由包含含有选自SEQID NO:3和12-16的氨基酸序列的重链可变区以及含有选自SEQ ID NO:2和7-11的氨基酸序列的轻链可变区的抗体识别。

在一些实施方案中，本公开提供了抗CD38抗体，该抗CD38抗体选自单域VHH、包含含有选自SEQ ID NO:4-6和17-30的氨基酸序列的HC(重链)可变区的单域VHO(仅可变重链)域、亲和体、DARPin、Anticalin、Avimer、Versabody，以及Duocalin。

在一些实施方案中，本公开提供了组合物，该组合物包含本文所公开的分离的抗CD38抗体、或抗原结合部分、抗体片段、或抗体模拟物，以及药学上可接受的载剂。

在一些实施方案中，本公开提供了分离的核酸分子，该分离的核酸分子编码结合人CD38上的表位的抗CD38分离抗体或抗原结合部分、或抗体片段的重链或轻链。在一些实施方案中，本公开提供了包含此类核酸分子的表达载体，以及包含此类表达载体的宿主细胞。

在一些实施方案中，本公开提供了用于制备抗CD38抗体的方法，所述方法包括以下步骤：获得含有一种或多种编码抗CD38抗体的核酸分子的宿主细胞；使宿主细胞在宿主细胞培养物中生长；提供其中表达一种或多种核酸分子的宿主细胞培养条件；以及从宿主细胞或从宿主细胞培养物中回收抗体。

还描述了结合人CD38上的表位的分离的抗CD38单克隆抗体或其抗原结合部分、抗体片段、或抗体模拟物，该人CD38上的表位由包含选自以下的重链可变区和轻链可变区的抗体识别：SEQ ID NO:3和12-16中所示的重链可变区氨基酸序列以及SEQ ID NO:2和7-11中所示的轻链可变区氨基酸序列；以及SEQ ID NO:4-6和17-30中所示的重链单域可变区氨基酸序列。

本文还描述了分离的单克隆抗体、或其抗原结合部分，其结合具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的CD38多肽上的表位，该表位由包含含有选自SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链可变区以及含有SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的轻链可变区的抗体识别。本文还描述了分离的单克隆单域抗体、或其抗原结合部分，其结合具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的CD38多肽上的表位，该表位由包含含有选自SEQ ID NO:4-6和17-30的氨基酸序列的重链可变区的抗体识别。

还描述了结合人CD38上的表位的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分、抗体片段、或抗体模拟物，该人CD38上的表位由包含选自以下的重链可变区和轻链可变区的抗体识别：SEQ ID NO:12中所示的重链可变区氨基酸序列以及SEQ ID NO:7中所示的轻链可变区氨基酸序列；SEQ ID NO:12中所示的重链可变区氨基酸序列以及SEQ ID NO:8中所示的轻链可变区氨基酸序列；SEQ ID NO:12中所示的重链可变区氨基酸序列以及SEQ ID NO:9中所示的轻链可变区氨基酸序列；SEQ ID NO:12中所示的重链可变区氨基酸序列以及SEQID NO:10中所示的轻链可变区氨基酸序列；SEQ ID NO:12中所示的重链可变区氨基酸序列以及SEQ ID NO:11中所示的轻链可变区氨基酸序列；SEQ ID NO:13中所示的重链可变区氨基酸序列以及SEQ ID NO:7中所示的轻链可变区氨基酸序列；SEQ ID NO:13中所示的重链可变区氨基酸序列以及SEQ ID NO:8中所示的轻链可变区氨基酸序列；SEQ ID NO:13中所示的重链可变区氨基酸序列以及SEQ ID NO:9中所示的轻链可变区氨基酸序列；SEQ IDNO:13中所示的重链可变区氨基酸序列以及SEQ ID NO:10中所示的轻链可变区氨基酸序列；SEQ ID NO:13中所示的重链可变区氨基酸序列以及SEQ ID NO:11中所示的轻链可变区氨基酸序列；SEQ ID NO:14中所示的重链可变区氨基酸序列以及SEQ ID NO:7中所示的轻链可变区氨基酸序列；SEQ ID NO:14中所示的重链可变区氨基酸序列以及SEQ ID NO:8中所示的轻链可变区氨基酸序列；SEQ ID NO:14中所示的重链可变区氨基酸序列以及SEQ IDNO:9中所示的轻链可变区氨基酸序列；以及SEQ ID NO:14中所示的重链可变区氨基酸序列以及SEQ ID NO:10中所示的轻链可变区氨基酸序列；SEQ ID NO:14中所示的重链可变区氨基酸序列以及SEQ ID NO:11中所示的轻链可变区氨基酸序列；SEQ ID NO:15中所示的重链可变区氨基酸序列以及SEQ ID NO:7中所示的轻链可变区氨基酸序列；SEQ ID NO:15中所示的重链可变区氨基酸序列以及SEQ ID NO:8中所示的轻链可变区氨基酸序列；SEQ IDNO:15中所示的重链可变区氨基酸序列以及SEQ ID NO:9中所示的轻链可变区氨基酸序列；SEQ ID NO:15中所示的重链可变区氨基酸序列以及SEQ ID NO:10中所示的轻链可变区氨基酸序列；SEQ ID NO:15中所示的重链可变区氨基酸序列以及SEQ ID NO:11中所示的轻链可变区氨基酸序列；SEQ ID NO:16中所示的重链可变区氨基酸序列以及SEQ ID NO:7中所示的轻链可变区氨基酸序列；SEQ ID NO:16中所示的重链可变区氨基酸序列以及SEQ IDNO:8中所示的轻链可变区氨基酸序列；SEQ ID NO:16中所示的重链可变区氨基酸序列以及SEQ ID NO:9中所示的轻链可变区氨基酸序列；SEQ ID NO:16中所示的重链可变区氨基酸序列以及SEQ ID NO:10中所示的轻链可变区氨基酸序列；以及SEQ ID NO:16中所示的重链可变区氨基酸序列以及SEQ ID NO:11中所示的轻链可变区氨基酸序列。

还描述了结合人CD3上的表位的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分、抗体片段、或抗体模拟物，该人CD3上的表位由包含选自以下的重链可变区和轻链可变区的抗体识别：SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:35；SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:36；SEQ ID NO:31和SEQ IDNO:37；SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:35；SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:36；SEQ ID NO:32和SEQID NO:37；SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:35；SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:36；SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:37；SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:35；SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:36；SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:37；SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:38；SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:40中所示的重链和轻链可变区氨基酸序列。

在一些实施方案中，本公开提供了编码本公开的分离的抗CD38或抗CD3抗体或其抗原结合部分的重链或轻链的分离的核酸分子，并且在进一步的方面可以包括包含此类核酸的表达载体，以及包含此类表达载体的宿主细胞。

本公开的另一个实施方案是表达本公开的抗CD38或抗CD3抗体或其抗原结合部分的杂交瘤。

本公开的其他方面涉及制备本公开的抗CD38或抗CD3抗体的方法，该方法包括以下步骤：用CD38肽或CD3肽；或CD38蛋白或CD3蛋白；或CD38域或CD3域对动物进行免疫，从所述动物的B细胞中回收mRNA；以及使所述mRNA转化为cDNA。

在一些实施方案中，本公开提供了用于制备抗CD38抗体或抗CD3抗体的方法，所述方法包括以下步骤：获得含有一种或多种编码本公开的抗CD38抗体或抗CD3抗体的核酸分子的宿主细胞；使宿主细胞在宿主细胞培养物中生长；提供其中表达一种或多种核酸分子的宿主细胞培养条件；以及从宿主细胞或从宿主细胞培养物中回收抗体。

在一些实施方案中，本公开提供了表达编码抗CD38或抗CD3单克隆抗体或其抗原结合部分、抗体片段、或抗体模拟物的cDNA的方法：使所述cDNA在噬菌体中表达，使得由所述cDNA编码的抗CD38抗体或抗CD3抗体呈递在所述噬菌体的表面上；选择呈递抗CD38抗体或抗CD3抗体的噬菌体；从所述选择的噬菌体中回收编码所述抗CD38免疫球蛋白和所述抗CD3免疫球蛋白的核酸分子；在宿主细胞中表达所述回收的核酸分子；以及从所述宿主细胞中回收分别结合CD38和CD3的抗体。

作为非限制性实例，本公开提供了CD3结合构建体的制备，其中宿主细胞可以与编码以下项的配对的核酸共转染：SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:35；SEQ ID NO:31和SEQ IDNO:36；SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:37；SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:35；SEQ ID NO:32和SEQID NO:36；SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:37；SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:35；SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:36；SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:37；SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:35；SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:36；SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:37；SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39；或SEQID NO:40和SEQ ID NO:41。

作为非限制性实例，本公开提供了CD38结合构建体，其中宿主细胞可以与编码以下项的核酸共转染：SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3；单独的SEQ ID NO:4；单独的SEQ ID NO:5，以及单独的SEQ ID NO:6；SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:12；SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:13；SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:14；SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:15；SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:16；SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:37；SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:12；SEQ ID NO:8和SEQ IDNO:13；SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:14；SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:15；SEQ ID NO:8和SEQ IDNO:16；SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:12；SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:13；SEQ ID NO:9和SEQ IDNO:14；SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:15；SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:16；SEQ ID NO:10和SEQID NO:12；SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:13；SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:14；SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:15；SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:16；SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12；SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:13；SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:14；SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:15；或SEQID NO:11和SEQ ID NO:16。CD38 VHO臂可以单独地表达为SEQ ID NO:17-30中的任一者。CD38结合臂可以具有串联序列SEQ ID NO:4-接头-SEQ ID NO:5；SEQ ID NO:4-接头-SEQID NO:6、SEQ ID NO:5-接头SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5-接头-SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:6-接头-SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6-接头-SEQ ID NO:5，以及选自SEQ ID NO.17-30的序列的任何对。

一些实施方案提供了双特异性抗体，该双特异性抗体包含靶向CD3的抗体序列，该靶向CD3的抗体序列选自包含SEQ ID NO:31至34中所示的氨基酸序列的重链可变区；以及包含SEQ ID NO:35至40中所示的氨基酸序列的轻链可变区；以及靶向CD38的抗体序列，该靶向CD38的抗体序列选自SEQ ID NO:2-30中所示的氨基酸序列。

抗CD38、抗CD3以及CD3 x CD38双特异性抗体的Fc区

本文所公开的抗CD38、抗CD3以及CD3 x CD38双特异性抗体可以包含修饰的F_c区，其中修饰的F_c区包含相对于天然F_c区而言的至少一个氨基酸修饰，例如，以延长双特异性抗体的半衰期、增强双特异性抗体对蛋白水解降解的抗性、降低双特异性抗体的效应子功能、有利于通过Fc异二聚化生成双特异性抗体、有利于双特异性抗体的多聚化，并且/或者改善双特异性抗体的制造和药物稳定性。

在一些实施方案中，Fc域被改变成允许Fc域沉默，以使可以引起免疫细胞消减和细胞因子释放综合征的效应子功能活性最小化。

在一些实施方案中，如本文所述的抗CD38、抗CD3以及CD3 x CD38双特异性抗体提供有修饰的F_c区，其中当与生物环境中的亲本天然抗体相比时，天然存在的F_c区被修饰成延长抗体的半衰期，例如通过体外测定法所测量的血清半衰期或半衰期。可以单独或组合进行的示例性突变为T250Q、M252Y、I253A、S254T、T256E、P257I、T307A、D376V、E380A、M428L、H433K、N434S、N434A、N434H、N434F、H435A，以及H435R突变。

在某些实施方案中，通过工程化根据EU索引的IgG1 F_c残基编号中的M252Y/S254T/T256E突变，可以实现半衰期的延长(Dall'Acqua,Kiener等人,2006)。

在某些实施方案中，半衰期的延长还可以通过工程化IgG₁ F_c中的M428L/N434S突变来实现(Zalevsky,Chamberlain等人,2010)。

在某些实施方案中，半衰期的延长还可以通过工程化IgG₁ F_c中的T250Q/M428L突变来实现(Hinton,Xiong等人,2006)。

在某些实施方案中，半衰期的延长还可以通过工程化IgG₁ F_c中的N434A突变来实现(Shields,Namenuk等人,2001)。

在某些实施方案中，半衰期的延长还可以通过工程化IgG₁ F_c中的T307A/E380A/N434A突变来实现(Petkova,Akilesh等人,2006)。

可以相对于具有天然IgG F_c的抗体而言在小鼠中的PK研究中评价F_c工程化对延长抗体半衰期的效应。

在一些实施方案中，如本文所述的抗CD38、抗CD3以及CD3 x CD38双特异性抗体提供有修饰的F_c区，其中天然存在的F_c区被修饰成增强抗体对蛋白酶的蛋白水解降解的抗性，该蛋白酶在残基222-237(EU编号)之间或之处切割野生型抗体。

在某些实施方案中，对蛋白水解降解的抗性可以通过在与亲本天然抗体相比时在具有G236缺失的铰链区中工程化E233P/L234A/L235A突变来实现，残基编号根据EU索引(Kinder,Greenplate等人,2013)。

在不期望效应子功能的情况下，本公开的抗体可以进一步被工程化成在抗体F_c中引入至少一种突变，该突变降低抗体与活化F_cγ受体(F_cγR)的结合并且/或者降低F_c效应子功能，如C1q结合、补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或吞噬作用(ADCP)。

可以突变成降低抗体与活化F_cγR的结合并后续降低效应子功能的F_c位置是例如在(Xu,Alegre等人,2000)(Vafa,Gilliland等人,2014)(Bolt,Routledge等人,1993,Shields,Namenuk等人,2001,Chu,Vostiar等人,2008)中描述的那些。具有最小ADCC、ADCP、CDC、Fc介导的细胞活化的Fc突变也被描述为IgG1、IgG2和IgG4的σ突变(Tam,McCarthy等人,2017)。可以单独或组合进行的示例性突变为IgG₁、IgG₂、IgG₃或IgG₄上的K214T、E233P、L234V、L234A、G236缺失、V234A、F234A、L235A、G237A、P238A、P238S、D265A、S267E、H268A、H268Q、Q268A、N297A、A327Q、P329A、D270A、Q295A、V309L、A327S、L328F、A330S和P331S突变。

可以用于降低ADCC的示例性组合突变为IgG₁上的L234A/L235A、IgG₂上的V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S、IgG₄上的F234A/L235A、IgG₄上的S228P/F234A/L235A、IgG₁、IgG₂、IgG₃或IgG₄上的N297A、IgG₂上的V234A/G237A、IgG₁上的K214T/E233P/L234V/L235A/G236缺失/A327G/P331A/D365E/L358M、IgG₂上的H268Q/V309L/A330S/P331S、IgG₁上的S267E/L328F、IgG₁上的L234F/L235E/D265A、IgG₁上的L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S、IgG₄上的S228P/F234A/L235A/G237A/P238S，以及IgG₄上的S228P/F234A/L235A/G236缺失/G237A/P238S。还可以使用杂合IgG_2/4F_c域，如具有来自IgG₂的残基117-260以及来自IgG₄的残基261-447的F_c。

在一些实施方案中，CD3 x CD38双特异性抗体提供有修饰的F_c区，其中天然存在的Fc区被修饰成有利于通过Fc异二聚化生成双特异性抗体。

在某些实施方案中，Fc异二聚化可以通过在两种亲本抗体上工程化F405L和K409R突变并在称为Fab臂交换的过程中生成双特异性抗体来实现(Labrijn,Meesters等人,2014)。

在某些实施方案中，Fc异二聚化也可以通过Fc突变来实现，以有利于旋钮入孔结构(Knob-in-Hole)策略(参见例如国际公开No.WO 2006/028936)。将具有小侧链的氨基酸(孔)引入到一个Fc域中，并将具有大侧链的氨基酸(旋钮)引入到另一Fc域中。在两条重链共表达之后，作为带有“孔”的重链与带有“旋钮”的重链的优先相互作用的结果，形成了异源二聚体(Ridgway,Presta等人,1996)。形成旋钮和孔的示例性Fc突变对是：T366Y/F405A、T366W/F405W、F405W/Y407A、T394W/Y407T、T394S/Y407A、T366W/T394S、F405W/T394S和T366W/T366S/L368A/Y407V。

在某些实施方案中，Fc异二聚化也可以通过Fc突变来实现，以有利于静电匹配的相互作用策略(Gunasekaran,Pentony等人,2010)。突变可以被工程化成生成在一个Fc域处的带正电残基，以及另一Fc域处的带负电残基，如描述于US专利公开No.US2010/0015133；US专利公开No.US2009/0182127；US专利公开No.US2010/028637或US专利公开No.US2011/0123532中。重链异二聚化可以通过两个突变的Fc之间的静电匹配相互作用形成。

在一些实施方案中，本发明的CD3 x CD38双特异性抗体提供有修饰的F_c区，其中天然存在的Fc区被修饰成有利于抗体在与细胞表面受体相互作用后的多聚化，尽管双特异性抗体通常作为单体存在于血清和溶液中。有利于抗体多聚化的F_c突变包括但不限于E345R突变、E430G突变、E345R/E430G突变、E345R/E430G/Y440R突变，如描述于(Diebolder,Beurskens等人,2014)中。此类突变也可以包括但不限于T437R突变、T437R/K248E突变和T437R/K338A突变，如描述于(Zhang,Armstrong等人,2017)中。

抗体修饰

进一步包含保守修饰的抗体在本公开的范围之内。“保守修饰”是指不显著影响或改变含有氨基酸序列的抗体的结合特征的氨基酸修饰。保守修饰包括氨基酸取代、添加，以及缺失。保守取代是其中氨基酸被具有相似侧链的氨基酸残基取代的那些。具有相似侧链的氨基酸残基的家族被明确定义，并且包括具有酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、色氨酸)、芳香族侧链(例如，苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸、酪氨酸)、脂族侧链(例如，甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸)、酰胺(例如，天冬酰胺、谷氨酰胺)、β-支化侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及含硫侧链(半胱氨酸、甲硫氨酸)。此外，多肽中的任何天然残基也可用丙氨酸取代，如先前对于丙氨酸扫描诱变所描述。本公开的抗体的氨基酸取代可以通过已知的方法进行，例如通过PCR诱变(US公开No.4,683,195)。或者，变体文库可以例如使用随机(NNK)或非随机密码子，例如编码11种氨基酸(Ala、Cys、Asp、Glu、Gly、Lys、Asn、Arg、Ser、Tyr、Trp)的DVK密码子生成。可以使用本文所述的测定法来评价所得抗体变体的特征。

本公开的抗体可以通过如糖基化、异构化、去糖基化或非天然存在的共价修饰如添加聚乙二醇部分(聚乙二醇化)和脂化的过程进行翻译后修饰。这种修饰可以发生在体内或体外。例如，本公开的抗体可以缀合至聚乙二醇(PEG化)以改善它们的药代动力学特征。缀合可以通过本领域的技术人员已知的技术进行。治疗性抗体与PEG的缀合显示增强药效学，同时不干扰功能。

本公开的抗体可以被修饰成改善稳定性、选择性、交叉反应性、亲和力、免疫原性或其他期望的生物学或生物物理特性，这些特性都在本公开的范围之内。抗体的稳定性受到许多因素的影响，包括(1)影响其内在稳定性的单独域的核心包装，(2)对HC和LC配对有影响的蛋白质/蛋白质界面相互作用，(3)极性和带电残基的埋藏，(4)极性和带电残基的H键网络；以及(5)其他分子内和分子间力中的表面电荷和极性残基分布(Worn和Pluckthun2001)。在某些情况下，可以基于抗体的晶体结构或通过分子建模来鉴定潜在的结构不稳定残基，并且可以通过生成和评价在所鉴定的残基中带有突变的变体来评估残基对抗体稳定性的效应。提高抗体稳定性的方式之一是提高如由差示扫描量热法(DSC)所测量的热转变中点(T_m)。一般而言，蛋白质T_m与其稳定性相关联，并且与其在溶液中去折叠和变性的易感性以及取决于蛋白质去折叠倾向的降解过程呈负相关。许多研究发现了通过DSC以热稳定性测量的制剂的物理稳定性的等级与通过其他方法测量的物理稳定性之间的相关性。制剂研究表明，Fab T_m对相应mAb的长期物理稳定性有影响。

本公开的抗体可以在F_c区中具有氨基酸取代，这改善了制造和药物稳定性。用于IgG₁的实例是铰链221-DKTHTC-226(EU编号)中的H224S(或H224Q)，它阻断自由基诱导的切割；并且对于IgG₄，S228P突变阻断半抗体交换。

屏蔽或掩蔽域

作为非限制性实例，本公开提供了包含屏蔽域(也称为掩蔽域、掩蔽物、或帽)的双特异性抗体，该屏蔽域选自能够屏蔽CD38 Fab的结合的如表5中SEQ ID NO:42-45所示的屏蔽域氨基酸序列，以及能够屏蔽CD3 Fab的结合的如表5中SEQ ID NO:46-52所示的屏蔽域氨基酸序列。一些实施方案提供了如SEQ ID NO:42-51中所提到的掩蔽CD38结合的各种屏蔽物或帽。一些实施方案提供了如SEQ ID NO:46-52中所提到的掩蔽CD3结合的各种屏蔽物或帽。

表5

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蛋白酶可切割接头

蛋白酶可切割接头包含可以被蛋白酶切割的肽底物，其将屏蔽域与抗体重链或轻链连接起来。蛋白酶可切割接头包含一种或多种蛋白酶底物序列和任选的接头间隔区序列(参见图5-7)。在一些实施方案中，屏蔽序列作为可与重链和轻链融合的序列对存在。例如，对于双特异性抗体的两个Fab臂域中的每者，屏蔽序列均经由一个蛋白酶可切割接头融合至抗体重链的N末端，并且补体序列经由另一个蛋白酶可切割接头融合至抗体轻链的N末端。

许多疾病组织(包括肿瘤微环境和炎症部位)富含各种类型的蛋白酶，这些蛋白酶的过表达与疾病进展相关联。在疾病组织中，屏蔽的抗体的蛋白酶可切割接头序列被适当类型的蛋白酶识别，并且屏蔽物可以从抗体链上释放。例如，在屏蔽的双特异性抗体的一个结合臂中，蛋白酶可以切割两个蛋白酶可切割接头两者或两个蛋白酶可切割接头序列之一，因此屏蔽域是无活性的。在任一种情况下，屏蔽域均不能干扰或阻断Fab臂与其靶抗原的结合。因此，屏蔽的抗体转化为活性抗体，以与其靶标结合并发挥其功能活性(图7)。

在一些实施方案中，在屏蔽的抗体中使两个屏蔽域与两个Fab域连接的蛋白酶可切割接头序列包含待被相同类型的蛋白酶切割的相同序列。

在一些实施方案中，在屏蔽的抗体中使两个掩蔽域与两个Fab域连接的蛋白酶可切割接头序列包含具有被不同类型的蛋白酶切割的底物序列的不同序列。

在基质金属蛋白酶(MMP)家族中，MMP2和MMP9在许多类型的癌症中上调，包括乳腺癌、结直肠癌和肺癌。此外，MMP2和MMP9的表达和活性还与许多自身免疫性病症和炎性疾病的进展相关，包括类风湿性关节炎、银屑病、多发性硬化症、慢性阻塞性肺疾病、炎性肠病和骨质疏松症(Lin,Lu等人,2020)。本公开提供了包含被MMP2和MMP9切割的底物肽序列的蛋白酶可切割接头序列。作为非限制性实例，本公开提供了如SEQ ID NO:53-57所示的MMP2和MMP9可切割底物肽序列。作为非限制性实例，本公开提供了如SEQ ID NO:58所示的MMP3可切割底物肽序列。

据报道，尿激酶纤溶酶原激活剂(uPA)在许多类型的癌症，尤其是乳腺癌中过表达(Banys-Paluchowski,Witzel等人,2019)。uPA是丝氨酸蛋白酶，它可以催化纤溶酶原转化为纤溶酶，从而可以降解基底膜或细胞外基质。基质降解可以有利于肿瘤细胞迁移和侵袭到周围组织中。本公开提供了包含被uPA切割的底物肽序列的蛋白酶可切割接头序列。作为非限制性实例，本公开提供了如表6中SEQ ID NO:59和60所示的uPA可切割底物肽序列。

表6

本公开的蛋白酶可切割接头可以包括插置在例如屏蔽序列与蛋白酶底物肽序列之间、和/或蛋白酶底物肽序列与抗体Fab之间的一种或多种接头肽。

合适的接头(也称为“间隔子”)可以容易地选择，并且可以是任何数量的合适长度，如1个氨基酸至30个氨基酸(例如，1至30之间的任何特定整数、或1个氨基酸(例如，Gly)至约20个氨基酸，2-15、3-12、4-10、5-9、6-8、或7-8个氨基酸)。

示例性接头包括甘氨酸聚合物(G)_n、甘氨酸-丝氨酸聚合物(包括例如(GS)_n、(GSGGS)_n和(GGGS)_n，其中n为至少一的整数，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物、丙氨酸-脯氨酸、可以包含IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA、IgE、IgM的免疫球蛋白同种型和亚型铰链，以及本领域已知的其他柔性接头。Gly和Ser是非结构化的，因此可充当组分之间的中性系链。

在某些实施方案中，接头是甘氨酸聚合物。甘氨酸甚至比丙氨酸进入显著更大的phi-psi空间，并且比具有较长侧链的残基受到的限制要小得多(Scheraga 2008)。示例性接头可以包含氨基酸序列，包括但不限于：GGS；GGSG；GGSGG；GGGGS；GSGSG；GSGGG；GGGSG；GSSSG等等。

在某些实施方案中，接头是丙氨酸-脯氨酸聚合物。示例性接头可以包含氨基酸序列，包括但不限于(AP)_n，其中n为至少一的整数(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20)。

在某些实施方案中，接头为刚性接头(Chen,Zaro等人,2013)。示例性刚性接头可以包含氨基酸序列，包括但不限于富脯氨酸序列(XP)_n，其中X指定任何氨基酸，优选地Ala、Lys、或Glu，其中n为至少一的整数(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20)。示例性刚性接头还可以包含氨基酸序列，包括但不限于具有(EAAAK)_n序列的α螺旋形成接头，其中n为至少一的整数(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20)。

抗体的表达和纯化

本公开的抗体可以由用于蛋白质表达的一种或多种核酸编码。例如，本公开的屏蔽的CD3 x CD38双特异性抗体可以由单一核酸(例如，包含编码屏蔽的抗体的轻链和重链多肽的核苷酸序列的单一核酸)、或者由两种或更多种单独的核酸编码，每种核酸编码屏蔽的亲本抗体的不同部分。

适当的重组DNA通过DNA重组技术来制备，然后转染到哺乳动物细胞中，表达、纯化、鉴定、和/或筛选相应的抗CD3和抗CD38抗体。

可以使用受控的Fab臂交换或其他双特异性抗体生成过程由抗CD3和抗CD38抗体生成双特异性抗体，以产生显示出同时结合CD38和CD3的生物效应的双特异性抗体。通过体外实验来鉴定双特异性抗体亲和力和阻断效率。

本文所述的核酸可以***载体中，例如核酸表达载体和/或靶向载体。这样的载体能够以各种方式使用，例如用于在细胞或转基因动物中表达具有本文所述的掩蔽域的前抗体(掩蔽的抗体)。载体典型地被选择成在将使用该载体的宿主细胞中发挥功能。编码抗体(例如，具有本文所述的掩蔽域的前抗体)的核酸分子可以在原核、酵母、昆虫(杆状病毒***)和/或真核宿主细胞中扩增/表达。宿主细胞的选择将部分取决于本文所公开的抗体(如本文所述的屏蔽的CD3 x CD38双特异性抗体)是否被翻译后修饰(例如，糖基化和/或磷酸化)。如果是这样，酵母、昆虫、或哺乳动物宿主细胞是优选的。表达载体典型地含有一种或多种以下组分：启动子、一种或多种增强子序列、复制起点、转录终止序列、含有供体和受体剪接位点的完整内含子序列、用于分泌的前导序列、核糖体结合位点、聚腺苷酸化序列、用于***编码待表达的多肽的核酸的多聚接头区、以及选择性标记元件。

在一些实施方案中，前导序列或信号序列在本文所述的抗体(例如，屏蔽的CD3 xCD38双特异性抗体)的N末端工程化以指导其分泌。由宿主细胞分泌屏蔽的CD3 x CD38双特异性抗体将导致信号肽从抗体中移除。因此，成熟的屏蔽CD3 x CD38双特异性抗体将缺乏任何前导序列或信号序列。在一些实施方案中，如在真核宿主细胞表达***中期望糖基化的情况下，可以操纵各种前序列以改善糖基化或产量。例如，可以改变信号肽的肽酶切割位点，或者添加前序列，这也可能影响糖基化。

本公开进一步提供了包含本公开的核酸或载体的细胞(例如，分离或纯化的细胞)。细胞可以是能够用本公开的核酸或载体转化以便产生由此编码的多肽的任何类型的细胞。例如，为了表达本文所述的屏蔽的CD3 x CD38双特异性抗体，将如上所述获得的编码部分或全长轻链和重链的DNA***到表达载体中，使得基因可操作地连接至转录和翻译控制序列。

将核酸和载体引入分离的细胞中以及体外培养和选择转化的宿主细胞的方法在本领域中是已知的，并且包括使用氯化钙介导的转化、转导、缀合、三亲本杂交、DEAE、葡聚糖介导的转染、感染、脂质体膜融合、DNA包被微弹的高速轰击、直接显微注射到单细胞中，以及电穿孔。

在本公开的核酸或载体引入宿主细胞中之后，在适于表达所编码序列的条件下培养细胞。然后可以从细胞中分离抗体、抗原结合片段、或抗体的部分。

在某些实施方案中，可以将一起编码本文所述的屏蔽的CD3 x CD38双特异性抗体的两个或更多个载体引入宿主细胞中。

分泌到细胞培养基中的本文所述的抗体(例如，屏蔽的CD3 x CD38双特异性抗体)的纯化可以使用多种技术来实现，包括亲和力、免疫亲和力或离子交换层析、分子筛层析、制备型凝胶电泳或等电聚焦、层析聚焦，以及高压液相层析。例如，包含F_c区的抗体可以采用选择性结合F_c区的蛋白A通过亲和层析来纯化。抗体(如屏蔽的CD3 x CD38双特异性抗体)的修饰形式可以在其羧基或氨基末端采用亲和标签如六聚组氨酸或其他小肽如FLAG(Eastman Kodak Co.,New Haven,Conn.)或Myc(Invitrogen)进行制备，并通过一步亲和柱进行纯化。例如，聚组氨酸以极大的亲和力和特异性与镍结合，因此镍亲和柱(如镍柱)可用于纯化聚组氨酸标记的选择性结合剂。在一些情况下，可以采用多于一个纯化步骤。

屏蔽的CD3 x CD38双特异性抗体对结合和功能活性的效应

本文所公开的屏蔽的CD3 x CD38双特异性抗体可以抑制或阻断Fab臂结合相应抗原CD3和CD38的能力。掩蔽域可以降低屏蔽的双特异性抗体与相应抗原结合的最大结合能力。掩蔽域还可以降低屏蔽的双特异性抗体与相应抗原结合的结合亲和力。

当掩蔽域被蛋白酶切割掉时，屏蔽的抗体转化为活性双特异性抗体，且恢复了抗体与其抗原结合的能力。掩蔽域从屏蔽的双特异性抗体的移除可以使用重组或纯化蛋白酶通过体外蛋白酶切割测定来实现。掩蔽域从屏蔽的双特异性抗体的移除也可以通过患病部位中过表达的蛋白酶在体内实现。可以通过由SDS-PAGE、IEX、或HIC分析将具有掩蔽域的屏蔽的抗体的重链和轻链的分子量与不具有掩蔽域的活性抗体进行比较来评估掩蔽域的移除。

本领域中充分描述了用于测定前抗体(屏蔽的双特异性抗体)、活性抗体，以及蛋白酶切割后转化的抗体与其抗原的结合的体外和基于细胞的测定法。例如，可以通过固定化重组或纯化的抗原、用固定化抗原多价螯合抗体并测定结合的抗体的量由ELISA来测定抗体的结合。这也可以使用仪器执行结合相互作用的动力学分析。对于基于细胞的结合测定法，可以通过将抗体与在细胞表面表达抗原的细胞一起孵育并测定与细胞表面抗原结合的抗体的量通过流式细胞术来测定抗体的结合。

药物组合物

根据本公开使用的抗体，如屏蔽的CD3 x CD38双特异性抗体可配制到组合物，尤其是药物组合物中，以用于本文的方法中。此类组合物包含治疗或预防有效量的本公开所述的抗体，例如双特异性抗体，以及合适的载剂，例如药学上可接受的试剂。典型地，本公开所述的抗体在配制到药物组合物中之前被充分纯化以施用给动物。

在一些实施方案中，本公开提供了包含抗CD38抗体或其抗原结合部分的组合物。在一些实施方案中，本公开提供了包含抗CD38抗体或其抗原结合部分以及药学上可接受的载剂的药物组合物。

在一些实施方案中，本公开提供了包含抗CD3抗体或其抗原结合部分的组合物。在一些实施方案中，本公开提供了包含抗CD3抗体或其抗原结合部分以及药学上可接受的载剂的药物组合物。

在一些实施方案中，本公开提供了包含屏蔽或非屏蔽的CD3 x CD38双特异性抗体的组合物。在一些实施方案中，本公开提供了包含屏蔽或非屏蔽的CD3 x CD38双特异性抗体以及药学上可接受的载剂的药物组合物。

药学上可接受的试剂包括载剂、赋形剂、稀释剂、抗氧化剂、防腐剂、着色剂、矫味剂，以及稀释剂、乳化剂、悬浮剂、溶剂、填充剂、增量剂、缓冲液、递送媒介物、张度剂、共溶剂、润湿剂、络合剂、缓冲剂、抗微生物剂，以及表面活性剂。

组合物可以是液体形式或冻干或冷冻干燥形式，并且可以包括一种或多种冻干保护剂、赋形剂、表面活性剂、高分子量结构添加剂和/或增量剂。

在一些实施方案中，组合物包含屏蔽的CD3 x CD38双特异性抗体、或抗CD38抗体或其抗原结合部分、或抗CD3抗体或其抗原结合部分，以及至少一种缓冲剂、至少一种稳定剂、和/或至少一种表面活性剂。

在一些实施方案中，本文所公开的组合物为液体。在一些实施方案中，组合物被配制用于皮下注射。在一些实施方案中，组合物是无菌的。在一些实施方案中，组合物还包含组氨酸HCl、海藻糖、甲硫氨酸和/或聚山梨醇酯。

组合物可以适用于胃肠外施用。示例性组合物适用于通过技术人员可用的任何途径注射或输注到动物中，如关节内、皮下、静脉内、肌内、腹膜内、脑内(实质内)、脑室内、肌内、眼内、动脉内、病灶内、直肠内、经皮、口服，以及吸入途径。

本文所述的药物组合物可以配制用于以在特定局部环境中提供产物局部浓度(例如，推注、贮库效应)的持续释放和/或增加的稳定性或半衰期的方式进行受控或持续递送。

在一些实施方案中，CD3 x CD38双特异性抗体或抗CD38抗体或其抗原结合部分、或抗CD3抗体或其抗原结合部分能够以1mg/mL至250mg/mL、10mg/mL至250mg/mL、1mg/mL至100mg/mL、2mg/mL至50mg/mL，以及2mg/mL至40mg/mL的浓度存在于药物组合物中。

治疗和使用方法

在一些实施方案中，本公开提供了用于在对其有需要的受试者中治疗或预防疾病或病症的方法，该方法包括将有效量的本文所公开的屏蔽的CD3 x CD38双特异性抗体或抗CD38抗体或其抗原结合部分施用于受试者。疾病或病症选自CD38介导的疾病或病症，例如人类癌症，包括胃癌和结直肠癌、胰腺癌、***癌、肺癌、肝细胞癌、三阴性乳腺癌、鼻咽癌、***、恶性血液病，如MM、淋巴瘤、急性髓系白血病、慢性淋巴细胞性白血病、急性B淋巴母细胞性白血病等，心脏病、病毒感染(包括HIV感染)、哮喘和其他呼吸道炎症性病症、过敏性气道疾病、母胎耐受、自闭症谱系病症、肾小球硬化、炎性肠病、类风湿性关节炎、糖尿病、多尿症、慢性自身免疫性甲状腺炎和格雷夫斯氏病、以及年龄相关的神经退行性或神经炎症性疾病，如阿尔茨海默病。

一些实施方案还提供了CD3 x CD38双特异性抗体或抗CD38抗体或其抗原结合部分在制造用于治疗或预防癌症，优选地肺癌、乳腺癌、结直肠癌、胃癌、肠癌、和/或胰腺癌的药物中的应用。

在一些实施方案中，本公开提供了本文所公开的屏蔽的CD3 x CD38双特异性抗体或抗CD38抗体或其抗原结合部分用于治疗或预防选自CD38介导的疾病或病症的疾病或病症。

在一些实施方案中，本公开提供了本文所公开的屏蔽的CD3 x CD38双特异性抗体或抗CD38抗体或其抗原结合部分在制造用于治疗或预防选自CD38介导的疾病或病症的疾病或病症的药物中的用途。

在一些实施方案中，本公开提供了本文所述的屏蔽的CD3 x CD38双特异性抗体或抗CD38抗体或其抗原结合部分用于治疗或预防胃癌、肺癌、胰腺癌、结直肠癌和其他癌症。与相应的治疗性抗体相比，屏蔽的CD3 x CD38双特异性抗体可在治疗这些疾病中具有相当的功效，这是由于通过患病部位过表达的蛋白酶移除屏蔽域，屏蔽的抗体在患病部位特异性地转化为活性抗体。然而，由于在缺乏足够量的切割掉掩蔽域所需的蛋白酶的正常组织中抗体活性被屏蔽域所掩蔽，屏蔽的抗体可以具有降低的全身毒性。本文所述的屏蔽的双特异性抗体在治疗疾病中作为相应的治疗性抗体可以是有效的，但安全特性大大改善。由于安全特性改善，可以向患者施用包含屏蔽的双特异性抗体的增加的给予水平，治疗功效得到改善。

在一些实施方案中，本公开还提供了在受试者中治疗癌症的方法，该方法包括施用治疗有效量的屏蔽的CD3 x CD38双特异性抗体。本公开还提供了本文所提供的屏蔽的双特异物在治疗癌症的方法中的用途；以及本文所提供的屏蔽的CD3 x CD38双特异性抗体在制造用于癌症的药物中的用途。示例性癌症包括但不限于MM、非小细胞肺癌、急性髓性白血病、女性乳腺癌、胰腺癌、结直肠癌，以及腹膜癌。

在一些实施方案中，本文所公开的双特异性抗体或抗CD38抗体或其抗原结合部分可以有效地抑制CD38受体与整联蛋白和/或下游信号传导的关联。

在一些实施方案中，本文所公开的双特异性抗体或抗CD38抗体或其抗原结合部分可以与化学疗法联合使用。例如，用于治疗癌症的联合方案可以使用更高剂量的化学疗法和CD3 x CD38双特异性抗体来确定最佳协同配偶体。

在一些实施方案中，本公开提供了本文所公开的双特异性抗体或抗CD38抗体或其抗原结合部分以及另一种治疗剂的缀合物。在一些实施方案中，其他治疗剂是细胞毒素或放射性同位素。

除非本文另外指明或者其他方面明显与上下文相矛盾，本文所述的各种元件的所有组合均在本公开的范围之内。

从以下实验细节中将更好地理解本公开。然而，本领域的技术人员将容易理解，所讨论的具体方法和结果仅是对本公开的说明，如在随后的权利要求中更全面描述的。

实施例1：抗CD38和抗CD3抗体的表达和纯化

将掩蔽和未掩蔽的抗CD3和抗CD38抗体基因置入单独的质粒中，以评价单克隆抗CD3和抗CD38抗体的制备以及抗CD3和抗CD38双特异性抗体的制备。在屏蔽的抗体的情况下，制备了表达抗CD3和抗CD38屏蔽mAb的重链和轻链构建体。遵循转染试剂盒说明书(Thermo Scientific)，将编码这些抗CD3和抗CD38掩蔽抗体的重链和轻链的质粒共转染到Expi293F细胞中。将细胞在转染后五天离心，并使上清液通过0.2μm过滤器。所表达的掩蔽抗体上清液的纯化通过亲和层析在蛋白A琼脂糖柱(GE Healthcare Life Sciences)上进行。通过透析将纯化的掩蔽抗体缓冲液交换到pH7.2的DPBS中，并通过280nm处的UV吸光度测定蛋白质浓度。以类似的方式制备和纯化未屏蔽的抗CD3和抗CD38单克隆抗体。

抗CD3和抗CD38屏蔽mAb具有掩蔽域，该掩蔽域利用用于MMP2/MMP9的底物序列与抗体重链和轻链的N末端融合。经纯化的掩蔽抗体通过SDS-PAGE分析进行表征。

实施例2：具有掩蔽域的抗体的蛋白酶消化

建立体外蛋白酶切割测定，以评价屏蔽域是否被蛋白酶从掩蔽的Ab中移除。对于MMP2，根据制造商的说明书(R&D Systems)，通过与对氨基苯基汞醋酸盐(APMA)一起孵育来活化重组人MMP2。将10mg的掩蔽Ab与50ng的活化MMP2一起在37℃下孵育过夜。在还原条件下，通过SDS-PAGE评价掩蔽mAb的消化。消化的掩蔽Ab的重链和轻链的分子量相对于相应的未消化前抗体略微较小。经蛋白酶处理后，加帽mAb的分子量更接近参考mAb的分子量。

实施例3：ELISA测定中抗CD3抗体与重组人和食蟹猴CD3抗原结合

使由CD3ε和CD3δ链组成的生物素标记的人重组CD3蛋白与链霉亲和素包被的ELISA板结合，以捕获固相上的抗原。然后，将不同浓度的测试抗CD3抗体添加到包被板中，并使用标准ELISA方案检测和定量结合的抗体。图8A所显示的结果展示了这些抗CD3抗体与预期的人CD3靶标结合的能力。在该测定形式中，抗体展现出一系列对抗原的亲和力。该亲和力范围很有价值，因为不同的CD3亲和力可能在疾病特异性应用中或在与双特异性形式的其他抗体的特异性配对中是理想的。

使由CD3ε和CD3δ链组成的生物素标记的食蟹猴重组CD3蛋白与链霉亲和素包被的ELISA板结合，以捕获固相上的抗原。然后，将不同浓度的测试抗CD3抗体添加到包被板中，并使用标准ELISA方案检测和定量结合的抗体。图8B所显示的结果展示了该抗CD3种类除了其展示的与人CD3蛋白的结合之外，还能够与食蟹猴CD3蛋白结合并发生交叉反应。也结合食蟹猴CD3蛋白的能力是药物开发的重要促成特性，因为其可有利于使用这些动物用于毒理学以及对这些抗体并尤其是含有它们的双特异性抗体的其他所需研究。

将由单一抗CD38臂与多种抗CD3臂配对组成的双特异性抗体以一系列递增的双特异性物浓度与含有CD3阳性T细胞的人PBMC混合。使用标准流式细胞术方法检测和定量双特异性抗体的结合。结果显示于图9中。这些数据展示，所测试的抗CD3抗体除了其展示出的与分离的重组蛋白结合的能力之外，还能够与按原样天然呈递在预期靶T细胞表面上的人CD3蛋白结合。因此，CD3抗体展示出ELISA和细胞结合两者。

实施例4：ELISA测定中抗CD38抗体与重组人、重组食蟹猴和重组小鼠CD38抗原的结合

使生物素标记的重组CD38蛋白与链霉亲和素包被的ELISA板结合，以捕获固相上的抗原。然后，将不同浓度的测试抗CD38抗体添加到包被板中，并使用标准ELISA方案检测和定量结合的抗体。图10所显示的结果展示了这些抗CD38种类与预期人CD38靶标且在某些情况下也与小鼠抗原结合的能力。达雷木单抗是一种已知且目前上市的具有临床活性的CD38特异性抗体(具有SEQ ID NO:2、3的重链可变区和轻链可变区)，且具有SEQ ID NO:5和6的单域抗体可变重链作为阳性对照包括在内并用于比较目的。图10所显示的结果展示了这些新型抗CD38种类SEQ ID NO:4、17、18、20、5、21、24、6、29结合预期人CD38靶标的能力。在该测定形式中，抗体展现出一系列对抗原的亲和力。SEQ ID NO:4抗CD38抗体可以以ELISA形式与食蟹猴CD38抗原结合(图10B)。SEQ ID NO:4抗CD38抗体可以以ELISA形式与小鼠CD38抗原结合(图10C)。使生物素标记的食蟹猴重组CD38蛋白与链霉亲和素包被的ELISA板结合，以捕获固相上的抗原。然后，将不同浓度的测试抗CD38抗体添加到包被板中，并使用标准ELISA方案检测和定量结合的抗体。图10所显示的结果展示了这些新型抗CD38种类除了其展示的与人CD38蛋白的结合之外，还能够与食蟹猴CD38靶标结合并发生交叉反应。也结合食蟹猴CD38蛋白的能力是药物开发的重要促成特性，因为其可有利于使用这些动物用于毒理学以及对这些抗体并尤其是含有它们的双特异性抗体的其他所需研究。

采用基于ELISA的结合测定来评价CD3 x CD38双特异性抗体对CD3和CD38的结合。在该测定中，将人CD38包被在板上，然后添加CD3 x CD38双特异性抗体或CD3抗体与CD38抗体的混合物，连同带有His标签的重组CD3。在洗去非特异性结合后，通过HRP缀合的抗His二抗(BioLegend)来检测CD3的存在。CD3 x CD38双特异性抗体(而非通过两种亲本抗体的混合物)剂量依赖性地募集CD3。因此，双特异性抗体能够同时结合CD3和CD38。

实施例5：在CD38阳性靶细胞系H929存在下抗CD38 x CD3抗体结合并活化人CD3阳性T细胞系

将包含分别与多种抗CD3臂配对的单一抗CD38臂的双特异性抗体以双特异性抗体的一系列递增浓度与2种细胞系进行混合：一种是报告T细胞系，且另一种是靶细胞系H929，即CD38阳性多发性骨髓瘤细胞系。报告T细胞系是人CD3阳性Jurkat T细胞系，其被工程化成当其表面上的T细胞受体被结合并活化以进行杀伤时产生易于测量的信号。靶细胞系是H929人CD38阳性多发性骨髓瘤细胞系。在癌症疗法中，CD38 x CD3双特异性抗体预期与攻击性杀伤T细胞上的CD3且与靶癌细胞上的CD38结合。图11所显示的结果展示了作为双特异性抗体与CD3和CD38蛋白两者结合的结果的T细胞的浓度依赖性活化。这些数据展示，所测试的抗CD3和抗CD38臂能够结合这两种蛋白，因为它们呈递在细胞的细胞表面上。在双特异性抗体中存在惰性臂的情况下，存在最低的活化。该数据进一步支持了这样的结论：这种结合还介导了靶癌细胞杀伤所需的T细胞途径的期望活化。

实施例6：在CD38阳性靶细胞系L363存在下抗CD38 x CD3抗体结合并活化人CD3阳性T细胞系

将包含分别与多种抗CD3臂配对的单一抗CD38臂的双特异性抗体以双特异性抗体的一系列递增浓度与2种细胞系进行混合：一种是报告T细胞系，且另一种是靶细胞系。报告T细胞系是人CD3阳性Jurkat T细胞系，其被工程化成当其表面上的T细胞受体被结合并活化以进行杀伤时产生易于测量的信号。靶细胞系是L363人CD38阳性多发性骨髓瘤细胞系。在癌症疗法中，CD38 x CD3双特异性抗体预期与攻击性杀伤T细胞上的CD3且与靶癌细胞上的CD38结合。图12所显示的结果展示了作为双特异性抗体与CD3和CD38蛋白两者结合的结果的T细胞的浓度依赖性活化。这些数据展示，所测试的抗CD3和抗CD38臂能够结合这两种蛋白，因为它们呈递在细胞的细胞表面上。在双特异性抗体中存在惰性臂的情况下，存在最低的活化。该数据进一步支持了这样的结论：这种结合还介导了靶癌细胞杀伤所需的T细胞途径的期望活化。

实施例7：在CD38阳性靶细胞系RPMI 8226存在下抗CD38 x CD3抗体结合并活化人CD3阳性T细胞系

将包含分别与多种抗CD3臂配对的单一抗CD38臂的双特异性抗体以双特异性抗体的一系列递增浓度与2种细胞系进行混合：一种是报告T细胞系，且另一种是靶细胞系。报告T细胞系是人CD3阳性Jurkat T细胞系，其被工程化成当其表面上的T细胞受体被结合并活化以进行杀伤时产生易于测量的信号。靶细胞系是RPMI 8226人CD38阳性多发性骨髓瘤细胞系。在癌症疗法中，CD38 x CD3双特异性抗体预期与攻击性杀伤T细胞上的CD3且与靶癌细胞上的CD38结合。图13所显示的结果展示了作为双特异性抗体与CD3和CD38蛋白两者结合的结果的T细胞的浓度依赖性活化。这些数据展示，所测试的抗CD3和抗CD38臂能够结合这两种蛋白，因为它们呈递在细胞的细胞表面上。在双特异性抗体中存在惰性臂的情况下，存在最低的活化。该数据进一步支持了这样的结论：这种结合还介导了靶癌细胞杀伤所需的T细胞途径的期望活化。

实施例8：抗CD38 x CD3抗体指导PBMC杀伤CD38阳性靶细胞系H929

将包含分别与多种抗CD3臂配对的单一抗CD38臂的双特异性抗体以双特异性抗体的一系列递增浓度与PBMC批次和靶细胞系进行混合。靶细胞系是H929人CD38阳性多发性骨髓瘤细胞系。图14所显示的结果展示了作为双特异性抗体与CD3和CD38蛋白两者结合的结果的浓度依赖性T细胞杀伤。这些数据表明，所测试的抗CD3和抗CD38臂除了其展示出的与分离的重组蛋白结合的能力之外，还能够结合这两种蛋白，因为它们呈递在细胞的细胞表面上。该数据进一步支持这样的结论：这种结合还介导了期望的T细胞指导的靶癌细胞杀伤。采用被用作效应细胞的两种不同的PBMC供体T细胞的这些实验导致了PBMC供体T细胞有力杀伤H929细胞。该数据进一步支持这样的结论：与CD3和CD38蛋白两者的结合也导致了双特异性抗体介导的人原代T细胞的活化及其对靶癌细胞的杀伤。

实施例9：抗CD38 x CD3抗体指导PBMC杀伤CD38阳性靶细胞系RPMI 8226

将包含分别与多种抗CD3臂配对的单一抗CD38臂的双特异性抗体以双特异性抗体的一系列递增浓度与PBMC批次和靶细胞系进行混合。靶细胞系是RPMI 8226人CD38阳性多发性骨髓瘤细胞系。图15所显示的结果展示了作为双特异性抗体与CD3和CD38蛋白两者结合的结果的浓度依赖性T细胞杀伤。这些数据表明，所测试的抗CD3和抗CD38臂除了其展示出的与分离的重组蛋白结合的能力之外，还能够结合这两种蛋白，因为它们呈递在细胞的细胞表面上。该数据进一步支持这样的结论：与CD3和CD38蛋白两者的结合还介导了期望的T细胞指导的靶癌细胞杀伤。采用被用作效应细胞的4种不同的PBMC供体T细胞的这些实验导致了PBMC供体T细胞有力杀伤RPMI 8226细胞。该数据进一步支持这样的结论：与CD3和CD38蛋白两者的结合也导致了双特异性抗体介导的人原代T细胞的活化及其对靶癌细胞的杀伤。

实施例10：抗CD38 x CD3抗体指导PBMC杀伤CD38阳性靶细胞系L363

将包含分别与多种抗CD3臂配对的单一抗CD38臂的双特异性抗体以双特异性抗体的一系列递增浓度与PBMC批次和靶细胞系进行混合。靶细胞系是L363人CD38阳性多发性骨髓瘤细胞系。图16所显示的结果展示了作为双特异性抗体与CD3和CD38蛋白两者结合的结果的浓度依赖性T细胞杀伤。这些数据表明，所测试的抗CD3和抗CD38臂除了其展示出的与分离的重组蛋白结合的能力之外，还能够结合这两种蛋白，因为它们呈递在细胞的细胞表面上。该数据进一步支持这样的结论：这种结合还介导了期望的T细胞指导的靶癌细胞杀伤。采用被用作效应细胞的3种不同的PBMC供体T细胞的这些实验导致了PBMC供体T细胞有力杀伤L363细胞。该数据进一步支持这样的结论：与CD3和CD38蛋白两者的结合也导致了双特异性抗体介导的人原代T细胞的活化及其对靶癌细胞的杀伤。

实施例11：CD3 x CD38双特异性抗体的体内抗肿瘤功效

在小鼠肿瘤异种移植模型中评价了CD3 x CD38双特异性抗体在肿瘤细胞杀伤中的功效。如SEQ ID NO:4中所提到的新型抗CD38抗体被制成IgG1Fc融合体，并在双特异性抗体中与已知能够指导T细胞杀伤以及评估SEQ ID NO:4指导T细胞杀伤CD38表达细胞的能力的40G5 CD3臂配对。将这种双特异性抗体在NCI-H929人多发性骨髓瘤异种移植模型中进行评价，其中含有CD3阳性效应T细胞的人PBMC在皮下植入癌细胞后一天(图17B-17C)或皮下植入癌细胞前5天(图17D-17E)被移植到免疫受损的小鼠中。将CD38表达细胞系NCI-H929接种到NCG小鼠中以用于肿瘤异种移植物建立。将测试分子经腹膜内施用于小鼠，并评估抗体介导的肿瘤缩小(图17A)。因为应当理解，这些模型的结果取决于来自不同供体的移植T细胞的性质而有很大差异，因此实验使用小鼠的两个平行队列执行，每队列移植来自不同供体的T细胞。使用两组不同的CD3臂来制备CD38 x CD3双特异性抗体。对照CD3臂命名为40G5，其包含重链可变区SEQ ID NO:40和轻链可变区SEQ ID NO:41。测试抗CD3臂命名为SP34 v8，其包含重链可变区SEQ ID NO:39和轻链可变区SEQ ID NO:38。图17所显示的实验结果展示，CD38 x CD3双特异性抗体，即与40G5臂配对的SEQ ID NO:4以及与SP34 v8臂配对的SEQ ID NO:4在两个队列中在抑制肿瘤生长中呈高度活性，其中一种T细胞供体部分抑制肿瘤，且第二供体完全抑制肿瘤生长。这种抑制特别值得注意，因为每个队列还用达雷木单抗处理，其是已被批准用于多发性骨髓瘤的临床应用并且已知在多发性骨髓瘤患者中呈高度活性的抗CD38抗体。结果显示，达雷木单抗在该模型中没有活性，而CD38 x CD3抗体对两种供体T细胞队列均显示出明显的抗肿瘤活性。主要结论是，本实验中测试的双特异性物的抗CD38臂在体内针对多发性骨髓瘤高度有效。

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Claims

1.抗CD38抗体或其抗原结合片段，其包含：

包含HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链可变区，其中所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别选自：SEQID NO:64、65和66；SEQ ID NO:64、83和84；SEQ ID NO:64、65和85；以及SEQ ID NO:64、65和86；以及

包含LCDR1、LCDR2和LCDR3的轻链可变区，其中所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分别选自：SEQID NO:61、62和63；SEQ ID NO:76、77和78；SEQ ID NO:79、80和81；以及SEQ ID NO:82、62和78。

2.根据权利要求1所述的抗CD38抗体或抗原结合片段，其包含含有与SEQ ID NO:12-16中任一者具有至少85％同一性的氨基酸序列或其抗原结合片段的重链序列，以及含有与SEQ ID NO:7-11中任一者具有至少85％同一性的氨基酸序列或其抗原结合片段的轻链序列。

3.抗CD38抗体或其抗原结合片段，其包含分别含有以下项的轻链序列和重链序列：SEQID NO:2和3；SEQ ID NO:7和12；SEQ ID NO:7和13；SEQ ID NO:7和14；SEQ ID NO:7和15；SEQ ID NO:7和16；SEQ ID NO:8和12；SEQ ID NO:8和13；SEQ ID NO:8和14；SEQ ID NO:8和15；SEQ ID NO:8和16；SEQ ID NO:9和12；SEQ ID NO:9和13；SEQ ID NO:9和14；SEQ ID NO:9和15；SEQ ID NO:9和16；SEQ ID NO:10和12；SEQ ID NO:10和13；SEQ ID NO:10和14；SEQID NO:10和15；SEQ ID NO:10和16；SEQ ID NO:11和12；SEQ ID NO:11和13；SEQ ID NO:11和14；SEQ ID NO:11和15；或SEQ ID NO:11和16。

4.抗CD38抗体或其抗原结合片段，其包含：至少一个仅可变重链单域或其抗原结合片段，其中所述至少一个仅可变重链单域包含分别选自以下项的HCDR1、HCDR2和HCDR3：SEQID NO:67、68和69；SEQ ID NO:67、87和69；SEQ ID NO:67、88和69；SEQ ID NO:67、89和69；SEQ ID NO:67、68和90；SEQ ID NO:70、91和72；SEQ ID NO:70、92和72；SEQ ID NO:70、93和72；SEQ ID NO:94、95和96；SEQ ID NO:70、71和97；SEQ ID NO:73、98和75；SEQ ID NO:73、99和75；SEQ ID NO:73、100和75；SEQ ID NO:73、101和102；以及SEQ ID NO:73、103和104。

5.根据权利要求4所述的抗CD38抗体或抗原结合片段，其包含至少一个仅可变重链单域或其抗原结合片段，其中所述至少一个仅可变重链单域包含与SEQ ID NO:4和17-30中任一者具有至少85％同一性的氨基酸序列或其抗原结合片段。

6.抗CD3抗体或其抗原结合片段，其包含：包含HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链可变区，其中所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别选自：SEQ ID NO:105、108和107；SEQ ID NO:105、109和107；SEQ ID NO:105、110和107；以及SEQ ID NO:118、119和120；以及包含LCDR1、LCDR2和LCDR3的轻链可变区，其中所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分别选自：SEQ ID NO:114、112和113；以及SEQ ID NO:115、116和117。

7.根据权利要求6所述的抗CD3抗体或抗原结合片段，其包含含有与SEQ ID NO:32-34和39中任一者具有至少85％同一性的氨基酸序列或其抗原结合片段的重链序列，以及含有与SEQ ID NO:36-38中任一者具有至少85％同一性的氨基酸序列或其抗原结合片段的轻链序列。

8.抗CD3抗体或其抗原结合片段，其包含分别含有以下项的轻链序列和重链序列：SEQID NO:39和38；SEQ ID NO:41和40；SEQ ID NO:31和35；SEQ ID NO:31和36；SEQ ID NO:31和37；SEQ ID NO:32和35；SEQ ID NO:32和36；SEQ ID NO:32和37；SEQ ID NO:33和35；SEQID NO:33和36；SEQ ID NO:33和37；SEQ ID NO:34和35；SEQ ID NO:34和36；或SEQ ID NO:34和37。

9.抗CD3和抗CD38双特异性抗体，其包含：

(1)第一结合臂，所述第一结合臂包含：

从N-末端到C-末端包含任选的屏蔽物A、任选的蛋白酶序列A，以及IgG重链或其抗原结合片段的第一重链融合蛋白，以及

从N-末端到C-末端包含任选的屏蔽物B、任选的蛋白酶序列B，以及IgG轻链或其抗原结合片段的第一轻链融合蛋白，

其中：

所述第一结合臂的所述IgG重链或其抗原结合片段包含分别选自以下项的HCDR1、HCDR2和HCDR3：SEQ ID NO:105、108和107；SEQ ID NO:105、109和107；SEQ ID NO:105、110和107；以及SEQ ID NO:118、119和120；并且

所述第一结合臂的所述IgG轻链或其抗原结合片段包含分别选自以下项的LCDR1、LCDR2和LCDR3：SEQ ID NO:114、112和113；以及SEQ ID NO:115、116和117；以及

(2)第二结合臂，所述第二结合臂包含：

从N-末端到C-末端包含任选的屏蔽物C、任选的蛋白酶序列C，以及IgG重链或其抗原结合片段的第二重链融合蛋白；以及

从N-末端到C-末端包含任选的屏蔽物D、任选的蛋白酶序列D，以及IgG轻链或其抗原结合片段的第二轻链融合蛋白，

其中：

所述第二结合臂的所述IgG重链或其抗原结合片段包含分别选自以下项的HCDR1、HCDR2和HCDR3：SEQ ID NO:64、65和66；SEQ ID NO:64、83和84；SEQ ID NO:64、65和85；以及SEQ ID NO:64、65和86；并且

所述第二结合臂的所述IgG轻链或其抗原结合片段包含分别选自以下项的LCDR1、LCDR2和LCDR3：SEQ ID NO:61、62和63；SEQ ID NO:76、77和78；SEQ ID NO:79、80和81；以及SEQ ID NO:82、62和78；

并且

其中所述屏蔽物A-D彼此相同或不同，并且蛋白酶序列A-D彼此相同或不同。

10.根据权利要求9所述的抗CD3和抗CD38双特异性抗体，其中：

所述第一结合臂的所述IgG重链或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:32-34和39中任一者具有至少85％同一性的氨基酸序列或其抗原结合片段，

所述第一结合臂的所述IgG轻链或其抗原结合片段包含含有与SEQ ID NO:36-38中任一者具有至少85％同一性的氨基酸序列或其抗原结合片段的轻链序列；并且

其中：

所述第二结合臂的所述IgG重链或其抗原结合片段包含含有与SEQ ID NO:12-16中任一者具有至少85％同一性的氨基酸序列或其抗原结合片段的重链序列，并且

所述第二结合臂的所述IgG轻链或其抗原结合片段包含含有与SEQ ID NO:7-11中任一者具有至少85％同一性的氨基酸序列或其抗原结合片段的轻链序列。

11.抗CD3和抗CD38双特异性抗体，其包含：

(1)第一结合臂，所述第一结合臂包含：

其中：

(2)第二结合臂，所述第二结合臂包含：

从N-末端到C-末端包含任选的屏蔽物C、任选的蛋白酶序列C，以及IgG重链的第二重链融合蛋白，所述IgG重链包含至少一个仅可变重链单域或其抗原结合片段，

其中所述至少一个仅可变重链单域或其抗原结合片段包含分别选自以下项的HCDR1、HCDR2和HCDR3：SEQ ID NO:67、68和69；SEQ ID NO:67、87和69；SEQ ID NO:67、88和69；SEQID NO:67、89和69；SEQ ID NO:67、68和90；SEQ ID NO:70、91和72；SEQ ID NO:70、92和72；SEQ ID NO:70、93和72；SEQ ID NO:94、95和96；SEQ ID NO:70、71和97；SEQ ID NO:73、98和75；SEQ ID NO:73、99和75；SEQ ID NO:73、100和75；SEQ ID NO:73、101和102；以及SEQ IDNO:73、103和104；并且

其中所述屏蔽物A-C彼此相同或不同，并且蛋白酶序列A-C彼此相同或不同。

12.根据权利要求11所述的抗CD3和抗CD38双特异性抗体，其中：

其中：

所述至少一个仅可变重链单域或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:4和17-30中任一者具有至少85％同一性的氨基酸序列或其抗原结合片段。

13.根据权利要求11-12中任一项所述的双特异性抗体，其中所述第一结合臂是单价的，并且所述第二结合臂是单价的、二价的、或多价的。

14.根据权利要求11-13中任一项所述的双特异性抗体，其中所述第二结合臂包含两个或三个串联的仅IgG可变重链单域，其中所述两个或三个仅IgG可变重链单域任选地经由一个或多个接头序列连接。

15.根据权利要求9-14中任一项所述的双特异性抗体，其中所述屏蔽物A、屏蔽物B、屏蔽物C，以及屏蔽物D各自独立地选自SEQ ID NO:42-52中所示的氨基酸序列。

16.根据权利要求9-15中任一项所述的双特异性抗体，其中所述蛋白酶序列A、蛋白酶序列B、蛋白酶序列C，以及蛋白酶序列D各自独立地选自SEQ ID NO:53-60中所示的氨基酸序列。

17.包含CD3靶向结合臂的双特异性抗体，其中所述CD3靶向结合臂包含分别含有以下项的重链序列和轻链序列：SEQ ID NO:39和38；SEQ ID NO:41和40；SEQ ID NO:31和35；SEQID NO:31和36；SEQ ID NO:31和37；SEQ ID NO:32和35；SEQ ID NO:32和36；SEQ ID NO:32和37；SEQ ID NO:33和35；SEQ ID NO:33和36；SEQ ID NO:33和37；SEQ ID NO:34和35；SEQID NO:34和36；或SEQ ID NO:34和37。

18.根据权利要求17所述的双特异性抗体，其还包含CD38靶向结合臂，其中所述CD38靶向结合臂包含分别含有以下项的重链序列和轻链序列：SEQ ID NO:2和3；SEQ ID NO:7和12；SEQ ID NO:7和13；SEQ ID NO:7和14；SEQ ID NO:7和15；SEQ ID NO:7和16；SEQ ID NO:8和12；SEQ ID NO:8和13；SEQ ID NO:8和14；SEQ ID NO:8和15；SEQ ID NO:8和16；SEQ IDNO:9和12；SEQ ID NO:9和13；SEQ ID NO:9和14；SEQ ID NO:9和15；SEQ ID NO:9和16；SEQID NO:10和12；SEQ ID NO:10和13；SEQ ID NO:10和14；SEQ ID NO:10和15；SEQ ID NO:10和16；SEQ ID NO:11和12；SEQ ID NO:11和13；SEQ ID NO:11和14；SEQ IDNO:11和15；或SEQID NO:11和16。

19.根据权利要求17所述的双特异性抗体，其还包含CD38靶向结合臂，其中所述CD38靶向结合臂包含两个仅可变重链单域，所述仅可变重链单域从N-末端到C-末端包含任选地经由接头连接的SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5、任选地经由接头连接的SEQ ID NO:4和SEQ IDNO:6、任选地经由接头连接的SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6、任选地经由接头连接的SEQ IDNO:5和SEQ ID NO:4、任选地经由接头连接的SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:5、或任选地经由接头连接的SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:4。

20.缀合物，其包含与细胞毒性剂缀合的根据权利要求1-5中任一项所述的抗CD38抗体或抗原结合片段、根据权利要求6-8中任一项所述的抗CD3抗体或抗原结合片段、或根据权利要求9-19中任一项所述的双特异性抗体。

21.药物组合物，其包含根据权利要求1-5中任一项所述的抗CD38抗体或抗原结合片段、根据权利要求6-8中任一项所述的抗CD3抗体或抗原结合片段、根据权利要求9-19中任一项所述的双特异性抗体、或根据权利要求20所述的缀合物，以及药学上可接受的载剂。

22.核酸，其编码根据权利要求1-5中任一项所述的抗CD38抗体或抗原结合片段、根据权利要求6-8中任一项所述的抗CD3抗体或抗原结合片段、或根据权利要求9-19中任一项所述的双特异性抗体。

23.宿主细胞，其包含根据权利要求22所述的核酸。

24.用于制备根据权利要求1-5中任一项所述的抗CD38抗体或抗原结合片段、根据权利要求6-8中任一项所述的抗CD3抗体或抗原结合片段、或根据权利要求9-19中任一项所述的双特异性抗体的方法，其包括：培养根据权利要求23所述的宿主细胞，使所述宿主细胞在宿主细胞培养物中生长，提供其中表达根据权利要求22所述的核酸的宿主细胞培养条件，以及从所述宿主细胞或从所述宿主细胞培养物中回收所述抗体或双特异性抗体。

25.用于在对其有需要的受试者中治疗或预防CD38介导的疾病或病症的方法，其包括向所述受试者施用药学有效量的根据权利要求1-5中任一项所述的抗CD38抗体或抗原结合片段、根据权利要求6-8中任一项所述的抗CD3抗体或抗原结合片段、根据权利要求9-19中任一项所述的双特异性抗体、根据权利要求20所述的缀合物、或根据权利要求21所述的药物组合物。

26.根据权利要求25所述的用于治疗或预防CD38介导的疾病或病症的方法，其中所述CD38介导的疾病或病症选自胃癌、结直肠癌、胰腺癌、***癌、肺癌、肝细胞癌、三阴性乳腺癌、鼻咽癌、***，以及恶性血液病。