JP2001517958A

JP2001517958A - 免疫学的方法

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Publication number: JP2001517958A
Application number: JP50035099A
Authority: JP
Inventors: アンドリューケイリチャード
Original assignee: University of Dundee
Current assignee: University of Dundee
Priority date: 1997-05-27
Filing date: 1998-05-27
Publication date: 2001-10-09
Also published as: WO1998054223A3; WO1998054223A2; CA2291004A1; EP1017724A2; GB9710820D0; AU728909B2; AU7663198A

Abstract

(57)【要約】あるＴ細胞の集団内においてある抗原応答Ｔ細胞を同定する方法であって、その方法は以下のステップを含む。（１）その抗原に応答したＴ細胞を含むある試料を得ること、および（２）ある複数の特異的Ｔ細胞受容体のいずれかに対して個々に又はＴ細胞受容体のある複数のサブセットのいずれかに対して個々に、ある特異的Ｔ細胞受容体をコードしているある遺伝子の発現又はＴ細胞受容体のあるサブセットをコードしている遺伝子の発現が、特異的Ｔ細胞受容体陽性Ｔ細胞ごと又は特異的Ｔ細胞受容体陽性Ｔ細胞サブセットごとに、その抗原に応答しなかったＴ細胞を含むある試料における前記遺伝子のその発現に比較して、増加しているかどうかを決定すること。この方法は、リュウマチ性関節炎のようなある疾患状態に関連する抗原応答T細胞を同定する為に有効である。

Description

【発明の詳細な説明】免疫学的方法本発明は、免疫学的方法に関し、特に抗原応答Ｔ細胞を同定する方法に関する。Ｔ細胞は、免疫過程の基盤である。それらは免疫反応の広い範囲にわたってレギュレーターあるいはエフェクターとしての中心的役割を演じている。それらの機能は感染あるいは腫瘍への免疫応答における宿主に有益なものであるが、それは自己免疫疾患、アレルギー及び移植拒絶のような不利益にもなりうる。これらの応答に対応するＴ細胞の正確な同定は感染及びおそらく腫瘍に対するワクチンの改良を助けるであろう、そしてＴ細胞過剰反応が疾患原因であるそれらの疾患において特に標的とされるべき免疫抑制治療を可能にし得るだろう。Ｔ細胞は、主要組織適合性複合体コード分子［1,2］のコンテクストにおいてそれらに提示されるペプチド抗原を認識する。それらは、イデオティピックＴ細胞受容体（ＴＣＲ）として知られるクローン的に放出されたヘテロダイマーである細胞表面によってこれを達成する。ＴＣＲは通常α鎖とβ鎖とからなり、もっと珍しくはγ鎖とδ鎖とからなる。それらの鎖のいずれもが可変及び不変領域を有する免疫グロブリン様構造を有する。その不変領域は（その名前が示すように）いずれの鎖タイプ（即ち、全てのα鎖不変領域が相同的である）においても同様であるが、その可変領域はそれぞれのＴＣＲにおいて異なる［1,3-5］。可変領域構造の雑多である範囲が生じるが、それはそれらをコードしているその遺伝子が、互いに不正確に結合したより小さな遺伝子セグメントのランダムな組換えによって形成されるからである。それらのより小さなセグメントは可変（Ｖ）、雑多（Ｄ）、（β及びδ鎖だけ）及び結合（Ｊ）遺伝子セグメントとして知られる［６］。そのＴＣＲをコードしている染色体の構造の研究が、５０− ５２機能的ＴＣＲＡＶ（β鎖可変遺伝子セグメント）［7］、少なくとも７０ＴＣＲＡＶ（α鎖可変遺伝子セグメント）［8‐14］、５７ＴＣＲＡＪ（α鎖結合遺伝子セグメント）［15］が存在することを明らかにしている。多数のそれらのより小さな遺伝子セグメント、それらのランダム組換え及び結合時により多様性を作る不正確な機構が与えられたならば、そのＴＣＲのレパートリーは、偶然の停止コドンあるいはフレーム外冗長性を係数に加えたとして［16‐18］１０¹⁵と１０¹⁸の間の異なる受容体が存在し得ると見積もられている。そのヒトβＴ細胞受容体座位の完全な６８５キロベースＤＮＡ配列は知られている（Rowen.et al （1996）Science 272、1755‐1762）。その配列及び注釈はそのゲノムシークエンスデータベースにおいて承認番号Ｌ３６０９２、Ｌ３６１９０及びＵ０３１１５として蓄積されている。刺激抗原あるいは応答ＴＣＲの構造がわかっているときには、抗原応答Ｔ細胞の同定は比較的簡単である。不幸にも、主要な診療状況においてはそのどちらも知られていない。抗原−応答Ｔ細胞を同定することを主張する方法が既に記載されており、そして“免疫組織化学”及び“分子生物学”アプローチとして広く分類され得るものである。二つの異なる免疫組織化学的な方法が取られてきた。その第一のものは、特にＴＣＲＢＶコード遺伝子生成物を有するＴ細胞の数を計数するためと、活性マーカーと呼ばれる（例えば、ＨＬＡ‐ＤＲ、ＣＤ２５）を有するそれらの細胞の数を確定するためとの免疫組織化学的技術の使用を含む。これらの全ての技術はある免疫病変におけるＴ細胞のレパートリーを測定することが推測される。その抗原に応答しているＴ細胞が増殖するとき、その最大数Ｔ細胞（解剖学的あるいは疾患基盤のコントロールとの比較において）は、抗原によって分化駆動された細胞であるはずだと推測されている。私が思うにこの推論は瑕疵がある。あらゆる免疫病変においてＴ細胞のごく少数の割合のみが抗原特異的であることが知られている［19-21］。その他は受身的にそこで補充される。ＣＤ４５Ｒ０（記憶）Ｔ細胞性向的に炎症部位に帰着し［22-24］、そしてその病変におけるＴ細胞のレパートリーは適切な抗原によって決定されるだけではなく過去における記憶Ｔ細胞を誘導したことのある抗原によっても決定される。以前の免疫学的経験の範囲が量的に考慮に入れられることはほとんど不可能であろうし、異なる働き手によって手に入れられた結果の多様性に対する一つの理由でもある。この方法に付きまとうもうひとつ別の問題は、ＨＬＡ‐ＤＲとＣＤ２５様の分子が疑いもなく活性Ｔ細胞上において発現されているが、抗原に対する特異的対抗体によって必要的には誘導されないということである。ＣＤ２５の細胞表面発現は、ＩＬ−７［27,28］、腫瘍壊死因子［29］あるいはＣＤ４０のようなＴ細胞反応性リガンドのようなサイトカインだけではなくオートクリンあるいはパラクリン様において生産されるインターロイキン− ２（ＩＬ‐II）によっても誘導され得る；ＨＬＡ‐ＤＲはインターフェロン−γ によって同様に活性化制御され得る［31］。他の言葉で言えば、活性免疫障害においてそれらが直接に抗体によって刺激されることなくＴ細胞上の‘活性化分子 ’を誘導可能なサイトカインが存在する。それ故、どちらのＴ細胞が抗原によって引き出されるかということ及びそちらが受身的にこの方法論を使ったケモカインによって活性化されるのかということを推測することは不可能である。この分子生物学的方法は、特異的部位または特異的病変において発現しているＴＣＲｍＲＮＡのスペクトルを計数することと、これを他の部位またはコントロール個体におけるＴＣＲｍＲＮＡと比較することとを含んでいる。ポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）に大幅に依存しているこれを成し遂げるために様々な技術が使われている［32］。計数の条件において最も信頼のある技術は逆ＰＣＲまたはアンカーＰＣＲである。ファミリー特異的ＰＣＲのような他の二次定量技術も使われてきている。この方法は本質的に免疫組織化学の方法と同様である、しかし全てのそのＴＣＲＢＶ遺伝子が現在は知られているので、それは今日までより限られた範囲の抗−Ｖβモノクローナル抗体を用いて達成可能であったものよりもっと完全である。ＴＣＲｍＲＮＡレベルが特異的Ｔ細胞数に近いことが前もって仮定されているが、これが正しいものであるためには二つの基礎的な仮定も正しくなければならない。すなわち、（１）全てのＴＣＲ遺伝子が同じ割合で転写されるべきであること、及び（２）Ｔ細胞が刺激され得たときの遺伝子転写が多様であってはならないことである。以下においてより詳細に議論されるように、私のデータはそれらの仮定の両方が間違っていることを提示している。ＴＣＲはＭＨＣ分子のコンテクストにおいて提示される抗原ペプチドに対して精巧な特異性を示すことができる。しかしＴＣＲのペプチド／ＭＨＣ複合体に対する親和性は低くそしてその相互作用におけるそのオフ−レイトは高い［33-35 ］。さらにこの明かなパラドックスを複雑にするのは、１００ペプチド／ＭＨＣ程度の少数複合体がおそらく完全に特異的Ｔ細胞を誘起するために必要であるという事実、及びペプチド／ＭＨＣ維持ＴＣＲ複合体接触が活性化への完全Ｔ細胞拘束が必要とされるという事実である［36‐38］。最新のデータは、そのＴ細胞が比較的小数のその抗原提示細胞（ＡＰＣ’ｓ）のＭＨＣ／ペプチド複合体と数万の自身の表面ＴＣＲによって接触しながら順次その抗原提示細胞の表面を移動するためにその細胞骨格を使用するということを提起している［38‐40］。通常一定の細胞表面ＴＣＲ［41,42］の再利用がある、しかし抗原誘発に続くリン酸化の後にその受容体は内在化され分解される［43-45］。幸運にも２つの別のＴＣＲを有するＴ細胞クローンを使った研究が、変わらない表面濃度においてその非活性ＴＣＲが持続するのに抗原結合受容体がその細胞表面から抑制制御されるということを示した［46］。毒性−ショック症候群にかかっている患者においてＴＣＲＢＶｍＲＮＡの２次定量測定が、そのｍＲＮＡレベルが短期間に急激に上昇し、上手く治療されながらこの病気に罹ってからの約３ヶ月以内にコントロールレベルに落ち着いたということを示した。この毒性ショック症候群毒（ＴＳＳＴ‐1）はＴＣＲＢＶ２がコードされたＴＣＲに対して超抗原特異的である［47,48］。ＴＣＲＶβ ｍＲＮＡは、“特異的Ｔ細胞ごと”に基づいて測定されるのではない。スタピロコッカス及びストレプトコッカス放出ＴＳＳＴ‐1用超抗原による病気である川崎病において、個々のＴ細胞によって生産されるＴＣＲＢＶ２Ｓ１ｍＲＮＡの割合はこの病気の短期間に上昇しそして治療後にはコントロールレベルに位置していた。対称的に、その同じ働きにおいて、in vivoにおいてＴ細胞がＳＥＢ（異なるＴＣＲＢＶ１２ｍＲＮＡ特異的超抗原）で治療された後ではＴＣＲＢＶ１２ｍＲＮＡの生産割合は変わらないことが示された。しかしながら、そのｍＲＮＡ生産割合が一定のようであっても、この治療後は細胞数とｍＲＮＡレベルの両方が割合的に上昇する［49,50］。特異的Ｔ細胞毎の特異的ＴＣＲｍＲＮＡ生産における測定の上昇は、その刺激抗原および応答ＴＣＲが知られていない時、一般に抗原応答Ｔ細胞を同定するために使われ得るという提案とはならない。 Duchmann等は（1993）DNA and Cell Biol．12，217‐225において言われるところによれば逆転写（ＲＴ）‐ＰＣＲによるＴＣＲＶβサブファミリー測定のための定量方法を記載しているが、しかし特異的Ｔ細胞ごとにＴＣＲｍＲＮＡが測定されているわけではない。特に刺激抗原及び応答ＴＣＲが知られていない場合において、抗原応答Ｔ細胞 (または抗原応答に含まれるその特異的ＴＣＲ)を同定するための方法に対する必要性は残っている。本発明の一つの目的は、刺激抗原が知られていない時及び抗原応答にかかわる特異的Ｔ細胞又はＴＣＲについて全くあるいはほとんど糸口のない時に、ある抗原応答において抗原応答Ｔ細胞または特異的ＴＣＲの同定を可能とする方法を提供することである。この方法は、抗原仲介疾患に関わるＴ細胞(及びＴ細胞受容体；ＴＣＲ)型を同定するために有効である。アレルギー、自己免疫疾患、同系移植組織片(allogra ft)拒絶及び許容、寄生病のようないくつかの感染症、及びいくつかのガンなどのような多くのヒトの疾患が抗原駆動Ｔ細胞に関わっていると信じられている。これらの疾患は例えば多発性硬化症、農夫肺、枯草熱、湿疹などを含む。わたしは、抗原誘起中にその細胞表面から失われてしまったその受容体を置き換えるために抗原刺激の後にＴＣＲ遺伝子発現を増加することを提案している。出版されたデータが提起するように完全活性にＴ細胞をコミットするためにはほぼ半分の細胞表面のＴＣＲが抗原に結合することが要求される(及び、それ故にリン酸化と内在化される)が［46］、私はこの機構がおそらく通常のＴ細胞機能に対して有効であると提案する。サイトカインによるＴ細胞の活性化は細胞表面のＴＣＲの分解を含まないであろうが、私はＴＣＲ特異的ｍＲＮＡ生産率の測定があらゆる免疫プロセスの中で受身的補充／受身的活性化Ｔ細胞と抗原特異的Ｔ細胞エフェクターとを分別するための特に適切な方法であると提案する。典型的には,ｍＲＮＡ合成率が所定時間中（例えば、抗体のそのＴ細胞との接触とそのｍＲＮＡが測定される時間との所定時間がある）測定され、そしてそのｍＲＮＡ合成率ははある所定時間における合成されたｍＲＮＡの量に同等である。抗原仲介プロセスを含む慢性病はＴ細胞に対する抗原の慢性的存在が関わると信じられている。これらの状況において、合理的にＴ細胞がコンスタントに抗原によって誘起されつづけていると推測され得る。本発明の方法に係る好ましい実施例において、特異的Ｔ細胞ごとの特異的ＴＣＲｍＲＮＡ精製の測定は抗原刺激及び特異的Ｔ細胞数またはｍＲＮＡのいずれかのみの測定ではないことを示す。診療上、多量のＴ細胞活性化が起こるところで（例えば、毒性ショック症候群において）、特異的細胞あるいはｍＲＮＡのいずれかの定量化又は特異的抗原へのＴ細胞応答を決定するためには十分かもしれない（それはどちらのＴ細胞サブセット（特異的Ｖβ）でありどちらがあなたの探している超抗原であるかを知るためには役に立つけれども）。しかしながら、それらの方法は（例えば、特異的Ｔ細胞数を測定することまたは特異的Ｔ細胞受容体ｍＲＮＡを測定すること）より微妙な状況において又は従来のように処理された抗原（広範な主要性）がリスポンシブルしているときにおいて、抗原誘起細胞を同定しないだろう。本発明の第一の側面は、あるＴ細胞の集団内においてある抗原応答Ｔ細胞を同定するある方法を提供する。その方法は以下のステップを含む。（１）その抗原に応答したＴ細胞を含むある試料を得ること。（２）ある複数の特異的Ｔ細胞受容体のいずれかに対して個々に又はＴ細胞受容体のある複数のサブセットのいずれかに対して個々に、ある特異的Ｔ細胞受容体をコードしているある遺伝子の発現又はＴ細胞受容体のあるサブセットをコードしている遺伝子の発現が、特異的Ｔ細胞受容体陽性Ｔ細胞ごと又は特異的Ｔ細胞受容体陽性Ｔ細胞サブセットごとに、その抗原に応答しなかったＴ細胞を含むある試料における前記遺伝子のその発現に比較して、増加しているかどうかを決定すること。抗原刺激に続く特異的ＴＣＲ遺伝子発現においてその上昇はあらゆる適切な方法を使って決定されて構わない。典型的には、ＴＣＲ遺伝子発現に続いて、ｍＲＮＡが合成されそしてｍＲＮＡがポリペプチドに翻訳される。ｍＲＮＡ合成を同定するためのあらゆる手順が利用されて構わない、そしてｍＲＮＡは比較的不安定なのでそのｍＲＮＡの特定時間以上の量の測定はおそらく新しいｍＲＮＡの合成の合理的な概算である。ポリペプチドは一般にｍＲＮＡよりも安定であり、そして典型的には特異的ＴＣＲポリペプチドのその量を測定することが現存ＴＣＲポリペプチドと新たに合成されたＴＣＲポリペプチドとを分別しないかもしれない、しかしながら、新しく合成された特異的ＴＣＲポリペプチドと現存の特異的ＴＣＲポリペプチドとを分別できる方法が本発明に係る方法として使われても構わない、けれどももし個々のＴ細胞受容体あるいはＴ細胞受容体のサブセットに対して特異的ｍＲＮＡが測定されるのならばより好ましい。この抗原に応答しなかったＴ細胞を含んでいる試料は、以下により詳しく議論されているようなあらゆる適切コントロール試料であって構わない。特異的Ｔ細胞受容体をコードしている遺伝子あるいはＴ細胞受容体のサブセットをコードしている遺伝子のそのコントロール発現レベルはその試験試料について測定される、典型的には、あるコントロールレベルは特異的Ｔ細胞受容体あるいはＴ細胞受容体のサブセットそれぞれに対して設定され得る。このようにして本発明に係る一つの実施例において、その抗原に応答しなかったＴ細胞を含んでいるある試料におけるあるレベルとその抗原に応答したある試料における特異的遺伝子発現のそのレベルの比較は事前に別個に決定されているあるコントロール試料におけるそのレベルとの歴史的比較であるかもしれない、だが勿論もしある実質的に同一なプロトコルがその試験試料及びそのコントロール試料における遺伝子発現（例えば、特異的Ｔ細胞受容体ｍＲＮＡ）のレベルを測定するために使用されるならば特に好ましい。他には、そしてさらに好ましくは、以下に議論されるように、遺伝子発現のそのレベルのその比較が、採取されそして任意的に同時に分析された試料中において測定されることでるかもしれない。本発明に係る特に好ましい実施例は、Ｔ細胞の集団におけるある抗原応答Ｔ細胞を同定する方法を提供することであり、その方法は以下のステップを含む。（１）その抗原に応答したＴ細胞を含んでいるある試料を得ること。（２）特異的Ｔ細胞受容体のいずれかに対して個々について又はＴ細胞受容体の複数のサブセットのいずれかに対して個々について、Ｔ細胞受容体に対して特異的またはＴ細胞受容体のサブセットに対して特異的であるＴ細胞受容体ｍＲＮＡの量を、特異的Ｔ細胞受容体陽性Ｔ細胞ごとまたは特異的Ｔ細胞受容体陽性Ｔ細胞サブセットごとに、ステップ（１）において得られた試料において決定すること。かつ（３）どちらのＴ細胞受容体ｍＲＮＡが特異的Ｔ細胞ごとにステップ（１）において得られたその試料中で増加したかを、その抗原に応答しなかったＴ細胞を含んでいる試料中での増加量と比較して決定すること。一つの好ましい実施例において、ステップ（１）は（ａ）その抗原に応答しなかったＴ細胞を含んでいる試料と（ｂ）その抗原に応答したＴ細胞を含んでいる試料とを含んでおり、ステップ（３）において試料（ａ）と比較して試料（ｂ）において特異的Ｔ細胞ごとにどちらのＴ細胞受容体ｍＲＮＡが量を増加するかを決定する。このように、ある状況においては試料（ａ）及び（ｂ）は採取されそして任意にその特異的ＴＣＲｍＲＮＡ同時に測定され得る、またはある状況では試料（ａ）は歴史試験試料とされても良い、と考えられる。便宜上、非誘起Ｔ細胞（すなわち、抗原に応答しなかったもの）に対する特異的ＴＣＲ遺伝子発現の正常の範囲は正常で健康的な個体への参照によって得られる。例えば、Ｔ細胞は、適切な数（例えば、８から２０）の正常で健康的な個体から採血することによって及びそのＴＣＲｍＲＮＡ分子を、研究したい特異的ＴＣＲ遺伝子またはＴＣＲの特異的サブセットごとに対して測定することによって得ることができる。例えば、実施例１において研究される４つの個体において、細胞ごとのＴＣＲ特異的ｍＲＮＡ分子の数における個体ごとの多様性はＴＣＲＢＶ２Ｓ１とＴＣＲＢＶ３Ｓ１（図４と５）では大きくはない。対象の抹消血液（ＰＲＥ試料）から得られた新鮮なＴ細胞と、実施例１に記載されるようなRPMI１６４０と１０％加熱培養ウシ胎児血清（ＣＯＮ試料）の存在下において３日間培養された同様の細胞との間での細胞ごとの特異的ＴＣＲｍＲＮＡ分子の数にほとんど多様性は無いことが示されているはずである。このように、このコントロール試料は培養中の適切なＴ細胞由来である。抗原誘起Ｔ細胞についての発現範囲を確定することは有益である。抗原誘起Ｔ細胞における細胞ごとの特異的ＴＣＲｍＲＮＡ分子の多数についての範囲は、培養中において例えば超抗原と抗−Vβ−特異的モノクローナル抗体あるいは抗ＣＤ‐3抗体のいずれかにより誘起されるそのＴ細胞によって引き出し得る。この最後の誘起の方法はin vitroにおいて従来の抗原と重なる条件に近づけることが考えられる。再び、もし適切な数（例えば、８から２０）の正常個体がＴ細胞源として使用されるならば、細胞ごとに誘起されるＴＣＲｍＲＮＡ分子についての範囲が得られ得る。もしＴＣＲＢＶ−特異的疾患にかかっている患者の多数がその疾患にかかっている間及び再び彼等が順調に回復したときにおいて調査されるならば、細胞レベルごとの誘起されたＴＣＲｍＲＮＡに対する範囲はin vivoにおいて得られるかもしれない。以下においてさらに詳しく議論されるように、例には毒性ショック症候群または川崎病におけるＴ細胞ごとのＴＣＲＢＶｍＲＮＡレベルを含んでいる。本発明の方法は特異的抗原応答Ｔ細胞を同定するために使用されても良く、又特異的抗原応答において関わるＴ細胞のサブセットを同定するために使用されても良い；例えば、この方法は、ある共通のＶβセグメントあるいはある共通のＶ αセグメントあるいはその組み合わせを含むいずれかのあるＴ細胞受容体サブセットを同定するために使用されても良い。しかしながら、ある抗原応答に関わるＴ細胞のより小さいサブセットが、例えば最初にその特異的Ｖβセグメントを、続いてその特異的Ｖβ−Jサブセットを、さらに続いてその特異的Ｖαサブセットを、その後にその特異的Ｖα−Jサブセットを、そしてそのＴＣＲの特異的Ｖβ−J／Ｖα−Jサブセットを同定することによって、同定しうる。この方法は、ある抗原応答Ｔ細胞とそれ故ある病状に関連のある特異的Ｔ細胞受容体型を同定するのに特に有用である。Ｔ細胞の集団は、例えば哺乳類由来のＴ細胞といったあらゆる適切なＴ細胞の集団でありうる。もしこのＴ細胞の集団が人の患者由来のものであれば好ましい；特にもしそのＴ細胞の集団がある人の患者におけるある疾患に関連するＴ細胞のある集団であれば好ましい。便宜上、この抗原に応答しなかったＴ細胞を含んでいるその試料（“試料（ａ）”）はある個体の非疾患部位から得られたものであり、そしてその抗原に応答したＴ細胞を含んでいるその試料（“試料（ｂ）”）はある個体のある疾患部位から得られたものである。例えば、試料（ａ）はある患者の非疾患滑液試料から得られてもよいことを考慮すれば試料（ｂ）は同じ患者の由来リュウマチ性関節炎の兆候を示している関節の滑液試料から得られても良い。この様に、本発明の方法を使いながらリュウマチ性関節炎に関連する抗原応答Ｔ細胞が同定されるかもしれない。しかも便宜上、この抗原に応答しなかったＴ細胞を含んでいるこの試料（“試料（ａ）”）はある非疾患個体から得られたものであり、この抗原に応答したＴ細胞を含んでいるこの試料（“試料（ｂ）”）はある疾患個体から得られたものであって構わない。例えば、試料（ａ）はある健康なコントロール個体あるいは回復期の川崎病患者及び試料（ｂ）は急性川崎病の患者から得られたものでも構わない。いくつか状況において抗原に応答しなかったＴ細胞を含んでいるその試料は in vitroにおいてその抗原（それはおそらくある疾患原因エージェントの形である）と接触されていないある個体から得られたある試料であると認められるだろう。例えば、その試料はある微生物でin vitroにおいて処理された、またはin v ivoにおいてある微小生物から得られた抗原またはその混合物で処理されたある個体由来のＴ細胞含有試料でも良い。例えば、Ｔ細胞のその集団は、スタピロコッカルエンテロトキシンＢ(staphylococcal enterotoxin B)（ＳＥＢ；ある超抗原）で処理されたある末梢血試料から得られた白血球でも良い。その方法はその疾患関連抗原が知られているときにはある集団内である抗原応答Ｔ細胞を同定するために使用されても構わないけれども、もしその抗原あるいはある疾患に関連する抗原が知られていないときにはあるＴ細胞の集団内である抗原応答Ｔ細胞を同定するために使用されるならば特に好ましい。その方法はある超抗原に応答するあるＴ細胞を同定するために使用されても構わない、しかしもしある従来の抗原に応答するあるＴ細胞を同定するために使用されるならばより好ましい。超抗原は、典型的には多数のバクテリアまたはウィルスのタンパク質生成物である。従来の抗原に見られる名前と比較するとそれらの名前は多数のＴ細胞を刺激するためのそれらの能力に由来している。それらは、多数の方法において従来の抗原とは異なっている。超抗原は不活性たんぱく質として機能する。従来の抗原は一般に８から１２アミノ酸長の小さなペプチドでありある抗原提示細胞によって巨大たんぱく質の内在化とタンパク分解から得られる。超抗原は、抗原提示細胞のその表面上に主要組織適合性複合体クラスII分子のその‘ペプチド結合グローブ’の外側に結合する。従来の抗原ペプチドはそのクラスII分子内のこのグローブ中に位置する。一般に超抗原は第４超可変領域と呼ばれるＴ細胞受容体のそのβ鎖のある特異的領域に結合する。これはＴＣＲＢＶ遺伝子セグメントのみによってコードされる。このＴＣＲαとＴＣＲＢＪ遺伝子セグメントの構造は超抗原結合の親和性に影響を与えることにおいてマイナーな役割を演じている。従来の抗原は、そのα とβＴＣＲ鎖の両方の相補性決定領域（特に、Ｖ‐(Ｄ)‐Ｊ遺伝子セグメント組換え及びＮ領域付加によって形成されるＣＤＲ３）によって認識されると考えられている。(Kay R.A．（1995）Clin．Exp．Immunol．100，4‐6；とHerman A.， et al（1991）Annu．Rev．Immunol．9，745‐772)。多くの疾患において一つ以上の疾患関連抗原が存在するかもしれないということおよびそれ故あるＴ細胞の集団内に一つ以上の抗原応答Ｔ細胞型が存在するかもしれないということが認められるかもしれない。この方法は、ある疾患関連抗原に対応する抗原応答Ｔ細胞ごとに同定することにおいて有用であると信じられている、しかし特にこの方法は特異的Ｔ細胞ごとのその特異的Ｔ細胞受容体ｍＲＮＡ生産が最も高いところにおいて抗原応答Ｔ細胞を同定するのに適していると認められるであろう。Ｔ細胞を含んでいるその使用はあらゆるＴ細胞を含んでいる適切な試料であってかまわないということが認められるだろう。便宜上、この試料は抹消血液の試料または骨髄の試料であるが、しかしそれはＴ細胞を有するある個体からの試料でも構わない。in vitroで培養されているある個体由来の試料が使われても構わない。本発明に係るある好ましい実施例において、Ｔ細胞受容体はあるサブセットである、ここにおいていすれかのＴ細胞はある特異的Ｖβ領域またはセグメントを含んでいる。このそのＴＣＲｍＲＮＡの特異的Ｖβ領域またはセグメントはその特異的VβセグメントｍＲＮＡにハイブリダイズするある特異的核酸プローブを使って認識しても良い。ある特異的Ｖβセグメントを含んでいるｍＲＮＡの量を同定及び定量するためのあらゆる便利なあらゆる方法が使われて構わない、例えば特異的なｍＲＮＡまたはｃＤＮＡを検出するための“チップ”ハイブリダイゼーション法が使われても構わない。以下により詳しく記載されているようにポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）が使われることは特に好ましい；さらに好ましくはある定量ＰＣＲ法が使用されることである。ＰＣＲはＤＮＡの鋳型に依存しているので、そのＰＣＲ手順に前もってまたはその間にＴＣＲｍＲＮＡがｃＤＮＡに転写されるべきことが理解されるだろう。ｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成するための方法は学術的に良く知られており、典型的にはあるオリゴヌクレオチドプライマーをｍＲＮＡにハイブリダイズさせてデオキシヌクレオチドと逆転写酵素とを使ってＤＮＡを合成することを含む。ポリメラーゼチェインリアクションを実行するための方法を学術的に良く知られている。ｃＤＮＡ合成の方法とＰＣＲ方法は、ここでは参照に組み込まれているSa mbrook et al（1989）Molecular cloning，a laboratory manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor Laboratory，New York，に記載されている。更なる本発明に係る好ましい実施例において、Ｔ細胞受容体のサブセットはあるサブセットであって、ここではそれぞれのＴ細胞受容体がある特異的Ｖα領域またはセグメントを含んでいる。このＴＣＲｍＲＮＡのこの特異的Ｖα領域はとの特異的ＶαセグメントｍＲＮＡとハイブリダイズするある特異的核酸プローブを使って認識されても構わない。ＴＣＲｍＲＮＡを含んでいるその特異的Vαセグメントを同定及び定量するための類似の方法が、ＴＣＲｍＲＮＡを含んでいるその特異的Vβセグメントを同定及び定量するための方法に使われても構わない。ＴＣＲｍＲＮＡに転写あるいはスプライシングされるＴＣＲ遺伝子のセグメントに対してだけではなくβ鎖可変遺伝子セグメント（ＴＣＲＢＶ）及びα鎖可変遺伝子セグメント（ＴＣＲＡＶ）及びα鎖結合遺伝子セグメント（ＴＣＲＡＪ）の多くについてヌクレオチド配列情報は利用可能である。この情報のほとんどは、Gen Bank及びEMBLのような公共で可能なヌクレオチド配列データベースから利用可能である。特に、そのヒトβＴ細胞受容体座の完全な６８５kbDNA配列は知られている(Rowen et al（1996）Science 272，1755‐1762)。その配列及びその注釈はそのGenome Sequence Data Baseにおいて認証番号L３６０９２、L３６１９０及びUO３１１５、として蓄積されており、ここにおいて全て参照に含まれている。特異的Vβ、Vα及び他のＴＣＲ遺伝子セグメントを測定するための適切なプローブ及びプライマーは、そのＴＣＲ遺伝子に対して一般に利用可能な配列から得られている。もしＴ細胞受容体ｍＲＮＡの量が定量ＰＣＲを使って決定されるならば好ましい；そして特にその定量ＰＣＲ方法は逆転写競合ＰＣＲ（ＲＴ‐ ＣＰＣＲ）であることが特に好ましい。逆転写競合ＰＣＲ(ＲＴ−ＰＣＲ)は以下に詳しく記載されている：Kohsaka et al（1993）Nucl．Acids Res．21，3469‐ 3472およびTaniguchi et al（1994）J．Immunol．Methods 196，101‐109，ともに個々における参照に含まれている。ＰＣＲによるあらゆる特異的ＴＣＲ遺伝子セグメントの測定に対して少なくとも一つのＴＣＲ遺伝子セグメント特異的オリゴヌクレオチドプライマーが必要である。特異的ＴＣＲ遺伝子セグメント含有ｍＲＮＡの定量は、いずれもがその特異的ＴＣＲ遺伝子セグメント内でハイブリダイズするある１対のＰＣＲプライマーを使って実行されても構わないが、もしその特異的ＴＣＲ遺伝子セグメント内でハイブリダイズするまたはその他のプライマーがゲノミックＤＮＡにおいては(例えば、あるイントロンによって)分断されているそのｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）に近いＴＣＲｍＲＮＡのあるセグメントにハイブリダイズするのであれば便利である。この方法は実質的にあらゆる含有ゲノミックＤＮＡの増幅を妨げる；そして、それ故その方法はＴＣＲｃＤＮＡ／ｍＲＮＡとＴＣＲゲノミックＤＮＡとを分別するために有用である。ＴＣＲｍＲＮＡにおいて特異的Vα及びVβセグメントを同定するための適切なＰＣＲプライマーはWilliams et al（1992）J．Clin．Invest．90，326‐333 に記載されており、ここでは参照に含まれておりかつ図６に示されている。ここで参照に組み込まれているMargurie et al（1992）Immunology Today 13，336‐ 338はＴＣＲｍＲＮＡを分析するためのＰＣＲベース方法に言及している。一度ここにおいて記載されるようにその特異的Vβサブセットが決定されていると、特異的Ｊセグメント特異的Vβとの組み合わせを同定することが好ましい。これは、例えばあるVβ特異的オリゴヌクレオチドをあるＰＣＲ反応におけるあるＪセグメントのいずれかに対して特異的なあるオリゴヌクレオチドとともに使うことによって、実行されても良い。同様に、一度ここに記載したようにある特異的Ｖαサブセットが決定されると、Ｊセグメントとの組み合わせはＶα及びＪ特異的オリゴヌクレオチドとともにＰＣＲを使って同定されうる。特異的Ｖγ及びＶδセグメントは例えばＣγ特異的オリゴヌクレオチドと組み合わせにおける特異的Ｖγセグメントを指向するオリゴヌクレオチドを使うことによってあるいはＣδ特異的オリゴヌクレオチドとの組み合わせにおける特異的Ｖδセグメントを指向するオリゴヌクレオチドを使うことによっても同定されても構わないということが認められるであろう。特異的Ｖγ及びＶδセグメントと特異的Ｊセグメントの組み合わせは例えば、あるＰＣＲ反応における適切で選択的なオリゴヌクレオチドを使うことによるＶα−Ｊ及びｖβ−Ｊに対するようなものと同様の方法を実質的に使うことにより同定しうる。ある特異的サブセットにおける特異的Ｔ細胞受容体陽性Ｔ細胞の数またはＴ細胞受容体陽性Ｔ細胞の数はあらゆる適切な方法を使うことによって決定されて良い。従来は、そのＴＣＲの特異的Ｖβセグメント及び特異的Ｖαセグメントに対して特異的な多くの抗体が利用可能であったので、ある特異的Ｔ細胞受容体にまたはＴ細胞のある特異的サブセットに（例えば、そのＴ細胞受容体のある特異的Ｖβセグメントに）結合する抗体を使うことでその決定がされている。特異的Ｖ β及びＶα鎖に対して指向するモノクローナル抗体が容易に利用できる。 Endogenは以下の抗体を売っている(Bradsure Biologicals Ltd，67a Brook St reer，Shepshed，Loughborough，Leics 9RFによって配布されている)：抗体：V β３.１，Vβ５a，Vβ５c，Vβ６.７a，Vβ７.１，Vβ８，Vβ８b，Vβ１２，V β１３，Vβ１７，Vα２，Vα１２.１，Vγ４，Vγ９，Vδ１，Vδ２，Vδ１−J １。同様に、Immunotechは以下の抗体を売っている(Coulter Electronics Ltd,Nor thwell Drive,Luton,Beds LU3 3RHによって引き継がれている)：抗体：Vδ１，V δ２，Vδ３，Vγ１，Vγ９，Vα２４，Vβ１，Vβ２，Vβ３，Vβ５.１，Vβ５ .２，Vβ５.３，Vβ６.１，Vβ８.１とVβ８.２，Vβ９，Vβ１１，Vβ１２，V β１３.１，Vβ１３.６，Vβ１４，Vβ１６，Vβ１７，Vβ１８，Vβ２０，Vβ ２１.３，Vβ２２.１を除いたγδ。加えて、特異的Ｔ細胞受容体に対するモノクローナル抗体は特異的ヒトＴ細胞腫瘍ラインに対してマイスを免疫化させること、マウスＢ細胞ハイブリドーマを作ることそして学術的に良く知られた方法を使ってその標的細胞ラインと異なるヒトＴ細胞腫瘍ラインの両方に対して生産されるマウス抗体をスクリーニングすることによって作られても良い。この方法において、選択されたそのハイブリドーマクローンはおそらく抗ＴＣＲ特異的モノクローナル抗体を生産するかもしれない。第２の方法はあるマウスＴＣＲのそのβ鎖上そのＶ領域をあるヒトＶβ領域により置換すること及び免疫マイスに作らさせたその細胞系を使うことである，この方法において、ヒトVβ鎖を指向するモノクローナル抗体は生産されても良くそしてそのバックグラウンドスクリーニングの多くは除去されそして標的のほとんどの範囲は生産されうる。可溶性ヒトＴＣＲは生産することが現在可能なので、それらはこの技術分野において良く知られた方法を用いるVβ及びV αターゲットに対する更なるモノクローナル抗体を作るためのターゲットとして使用されても良い。特異的Ｔ細胞受容体陽性Ｔ細胞の数の定量は既知の方法を使って行われ得る。例えば、その抗体は蛍光的に標識されても良くそしてその細胞は分別されその後蛍光活性化細胞分別機(FACS)を使ってカウントされても良い。適切には、その抗体は、例えばフルオロセインイソチアネート（ＦＩＴＣ）といったあらゆる便利な蛍光物質によって標識される。他には、しかしさらに好ましくは、ある特異的サブセットにおいてＴ細胞受容体陽性Ｔ細胞の数又はＴ細胞受容体陽性Ｔ細胞の数がそのＴ細胞集団のゲノミックＤＮＡを分析することによって決定され得るということである。体内において移転されていない特異的Ｔ細胞ＤＮＡが、ｍＲＮＡに対するのと同様の方法において定量され得る。非移転及び移転ＴＣＲ遺伝子を分別するであろうあらゆる方法が、特異的Ｔ細胞の数を決定するために使用されても構わない。あるＴ細胞受容体に対して特異的又はＴ細胞受容体のあるサブセットに対して特異的であるＴＣＲｍＲＮＡの数をその試料中で一度計数されてしまい、そしてある特異的サブセットの特異的Ｔ細胞受容体陽性Ｔ細胞又は特異的Ｔ細胞受容体陽性Ｔ細胞の数が一度計数されてしまえば、特異的Ｔ細胞ごとの特異的ＴＣＲｍＲＮＡ種の数は計算される。これは、その抗原に応答しなかったＴ細胞を含んでいるある試料及びその抗原に応答したＴ細胞を含んでいるある試料のいずれかに対して実行される。その比較はその試験試料とあるコントロール試料との間において行われて良く、ここにおいてそのコントロール試料はある歴史的コントロール試料または別の健康な個体またはそのコントロール試料が採取された個体におけるある非疾患部位から任意に採取された試料である。特異的Ｔ細胞ごとの特異的Ｔ細胞受容体ｍＲＮＡの量の増加は、ある抗原応答Ｔ細胞であるその特異的Ｔ細胞(Ｔ細胞受容体またはＴ細胞受容体のサブセット) の表示するものである。ある抗原応答を表示する特異的Ｔ細胞ごとに特異的Ｔ細胞受容体ｍＲＮＡの量の増加は、その特異的抗原及びその特異的ＴＣＲまたはＴＣＲサブセットに応じて多様になる。典型的には、約２以上の上昇はある特異的Ｔ細胞を表示するものであり、しかしその上昇はおそらく１０以上または１００以上でありそして１０００以上かもしれない。先に記載したように、ＴＣＲ遺伝子発現の通常の範囲は特異的Ｔ細胞またはＴ細胞の特異的サブセットについて決定される。好ましくは、特異的Ｔ細胞ごとの特異的Ｔ細胞受容体ｍＲＮＡの量に置けるある上昇はある抗原応答を表示するものであるが、その上昇が確実的に十分であれば、少なくとも１くらい、好ましくは少なくとも２であり、さらに好ましくは少なくとも３またはそのコントロール(すなわち、非刺激状熊における発現の通常の範囲)レベルより上の標準偏差以上であるのが条件である。この方法は、このＴ細胞型がある特異な抗原仲介疾患に関連しているかを決定するためには特に有効である。ある優性Ｔ細胞型はある疾患のプロセスに関わっているいくつかの状況において、そして例えばその同じＴ細胞型が個体の多数においてその疾患に関連している。このように、ある特異的な疾患の個体の多数において関連しているＴ細胞型を同定することにおいてならばその方法は有効である。しかしながら、ある個別の患者におけるある特異的疾患に関連しているその特異的Ｔ細胞型を決定するために個別の患者に対して使用することにこの方法は特に適している。個別の患者の治療はその疾患に関連するその患者のＴ細胞型に依存して仕立てられてもよいということが認められるであろう。本発明にかかる更なる一面はある患者を治療するある方法を提供するが、ここにおいてその患者はある抗原仲介疾患を有しており、その方法は以下のものを含む（ａ）本発明の第１の側面に係る方法に応じてある抗原仲介疾患に関連するある抗原応答Ｔ細胞を同定すること（ｂ）その疾患を改善するある試薬の効果的な量をその患者に投与すること。その疾患を改善するその試薬は典型的にはその抗原に応答するＴ細胞を減少または排除する試薬である。一度、ある特異的Ｔ細胞受容体またはＴ細胞受容体のサブセットの相同性を本発明に係る方法を使って抗原仲介疾患に関連するように決定してしまえば、その疾患を改善するある試薬が選択されるかもしれない。例えば、ある特異的 Vβセグメントを指向するモノクローナル抗体は有効かもしれないまたある特異的VβセグメントのあるＣＤＲから得られるペプチドも有効かもしれない。実験的な自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）、人条件多発性硬化症のある動物モデルが、自己免疫疾患における抗Ｔ細胞治療のその効率を試すための前駆的モデルを提供した。LewisラットまたはＰＬ／ＪマイスにおけるＥＡＥにおいて、ミエリン塩タンパク質（ＭＢＰ）特異的脳脊髄炎Ｔ細胞は高度に機密扱いされていた、Vβ８. ２特異的モノクローナル抗体によって治療に対して成功的に標的とされうるものであったVα２及びVβ８.２(Heber-Katz & Acha-Orbea，1989)からなる同様のＴＣＲを発現させていた一方でである。さらに、弱体化された脳炎遺伝子Ｔ細胞によるワクチン接種がＥＡＥに対する防御を仲介した(Lider et al，1988)。そのＶβ８.２ＴＣＲのＣＤＲ２(２次相補性決定領域)から得られるあるペプチドでのラットのワクチン接種が、病原性Ｔ細胞の活性化を阻害した抗−イディオティピックＴ細胞及び抗原を誘導しそしてＥＡＥを予防し且つ治療した。そのＣＤＲ２または他の領域から取られたＴＣＲペプチドが、ＭＢＰ，コラーゲン，熱ショックタンパク質及び末梢ミエリンのＰ２たんぱく質に対する特異的病原性Ｔ細胞の免疫制御を誘導しうることを他の研究が示している、そしてＥＡＥに加えて実験的な関節炎、神経炎における治療の可能性を示してもいる(Howell et al，198 9;Stevens et al，1991;Kumaar & Sercarz，1993;Gregorian et al，１９９３； Broeren et al，1994;Matsumoto et al，1994;Kuhrober et al．1994;Haqqui et al，1995)。進行性多発性硬化症でのヒトにおけるあるワクチンのようなあるＴＣＲ由来ペプチドを使いながら、ある研究がワクチン応答者は免疫反応性を減少させておりそして一年間の治療の間じゅう診療的には安定であるということを示しているが、非応答者はＭＢＰに対する免疫反応性を持ちつづけており且つ診療的には悪化した(Vandenbark et al，1996)。Ｔ細胞ワクチン投与受動的抗−Ｔ細胞抗体治療及びペプチド免疫化が知られている。例えば、Heber−Katz E.,Acha−Orbea H.(1989)Immunol..Today 10,164‐ 169;Lider O.,et al（1988）Science 239，181‐183;Vandenbark A.A.,et al（1 989）Nature 341，541‐544;Offner H.,et al（1991）Science 251，430‐432;H o-well M.D.，et al（1989）Science 246，668‐670;Stevens D.B.,et al（1991 ）J．Neuroimmu-nol．37，123-129;Kumar V.,Sercerz E.E.(1993)J．Exp．Med． 178，909‐916;Gregorian S.K.，et al(1993)Am．Assoc．Immunol．150，28A;Br oerenc.P.M.,et al(1994)Proc．Natl．Acad．Sci．USA.91,5997‐6001;Matsumot o Y.,et al(1994)Cell．Immunol．153，468‐478;Kuhrober A.,et al（1994）Eu r．J．Immunol.24，1172‐1180;とHaqqui T.M.，et al（1995）Ninth Int．Cong r．Immunol．Abstr．5014，845参照されたい。これらは全て本明細書の一部を構成する。このように、本発明はある抗原由来疾患を有するある患者のためのある治療を選択するためのある方法を含んでいる。本発明は、以下の図および実施例を参照しながらより詳細に示されるであろう。ここにおいて、図１は、天然型及び突然変異体特異的プローブのある比較を示している。図２は、天然型及び突然変異体特異的プローブに関するその光学密度(ＯＤ４５０/６３０)の比較可能性を示している。図３は、未知のｃＤＮＡ試料のその測定を示している。図４は、未分離白血球集合におけるVβ３.１ＴＣＲ＋Ｔ細胞によるＴＣＲＢＶ３Ｓ１ｍＲＮＡ生産物及びＣＤ２５発現のある比較を示している。図５は、未分離の白血球集合におけるVβ２．１ＴＣＲＴ細胞によるＴＣＲＢＶ２Ｓ１ｍＲＮＡ生産及びＣＤ２５発現のある比較を示している。図６は、ＴＣＲｍＲＮＡ(ｃＤＮＡ)のＶα及びＶβセグメントの特異的増幅に対する適切なＰＣＲプライマーの配列を示す。さらに詳しくは、Williams et al （1992）J．Clin．Invest．90，326-333参照されたい。これは本明細書の一部を構成する。図７は、培地のみあるいはその超抗原ＳＥＢ又はＴＳＳＴ−１を補われた培地において３日間培養された後と前における細胞ごとのＴＣＲＢＶｍＲＮＡレベルを示している。図８は、抗原誘起Ｔ細胞におけるＣＤ２５発現及び細胞間ＴＣＲＢＶレベルのある比較を示す。図９は、培地のみ(ＵｎＲｘ)あるいは抗−ＣＤ２８(ＣＤ)、抗−Ｖβ３．１( Ｖβ)又はその２つ(ＣＤ＋Ｖβ)のある組み合わせを補った培地において培養された白血球から得られた細胞間ＴＣＲＢＶ３Ｓ１ｍＲＮＡレベルを示す。図１０は、一日(集合化された)又は８週間(分離された)上であるクローンされたＴＣＲＢＶ１７Ｓ１配列の１５０００分子の測定を示す。図１１は、ある単一変異体ＢＶ１７Ｓ１クローンを有する５つの異なるＴＣＲＢＶ１７Ｓ１天然型テンプレートの１５０００分子の測定の正確性を示す。図１２は、ＢＶ１７Ｓ１特異的及びβＰＣＲ５‘プライマーを使って天然型ＢＶ１７Ｓ１(クローン７)及び変異体ＢＶ１７Ｓ１(１７／２／１７変異体)テンプレートの測定を示す。図１３は、それぞれに変異体を有するＢＶ１７Ｓ１天然型テンプレート(クローン１およびクローン７)の測定を示す。図１４は、天然型ＴＣＲＢＶ１７Ｓ１テンプレートの異なる分子数の測定を示す。図１５は、培地のみ(●)又はＰＭＡを補われた(○)培地において４０時間の培養後のＪａｋａｔＴ細胞に導入された異なるプロモーター−ｐＸＰ２構成物の相対活性を示す。実施例１：抗原応答Ｔ細胞の同定抗原が誘起している間にその細胞表面から失われたその受容体を置き換えるために、抗原刺激に後にはＴＣＲ遺伝子の発現が増加するということを私は提案している。出版されたデータは細胞表面ＴＣＲのほとんど半分が抗原に結合（それ故リン酸化及び内在化される）ことがそのＴ細胞を十分に活性化するためには必要とされると提案するが[46]、私はこの機構が通常のＴ細胞機能に対してウィルス的なものだろうと提案する。サイトカインによるＴ細胞の活性化は細胞表面のＴＣＲの分解を含まないだろうが、私はＴＣＲ特異的ｍＲＮＡ生成率の測定が、あらゆる免疫プロセスにおいて抗原特異的Ｔ細胞エフェクターから受身的に補充された／受身的に活性化されたＴ細胞を分離するための実行可能な方法であることを提起する。Ｔ細胞受容体(ＴＣＲ)伝達ＲＮＡ(ｍＲＮＡ)をある逆転写競合ポリメラーゼチェインリアクション(ＲＴ‐ＣＰＣＲ)によって測定される(例えば、Kohsaka et al（1993）Nucl．Acids Res．21，3469-3472;及びTaniguchi et al（1994）J．I mmunol．methods 169，101-109参照)。この方法において、ある変異体テンプレートが異なる濃度で天然型ｃＤＮＡテンプレートの分割量に加えられる、そしてその２つの比率はＰＣＲ後の変異体及び天然型特異的オリゴヌクレオチドプローブによって決定される。定量は、特異的ＴＣＲ＋ｖｅＴ細胞ごとに発現される特異的ＴＣＲｍＲＮＡの分子数として表される。刺激されていない及び抗原誘起された細胞の間の遺伝子転写レベルにおける増加は２から１０００倍の間である。これは異なるＴＣＲＢＶ遺伝子に対して様々である。我々のデータは、ＳＥＢ駆動ＴＣＲＢＶ３Ｓ１転写はおよそ培地のみにおいては(８．７〜１６１．７倍の範囲)コントロール培養の３０倍だが、ＴＳＳＴ‐１の存在下においては６．７倍(３．７〜８．４倍の範囲)に増加すると提起する。私達は、これが誘起の背景のある真実の実像を表しているのか又はＴＳＳＴ‐１の調整中における混入汚染あるいはＴＳＳＴ‐１によるＴＣＲα鎖結合を反映しているかどうかは知らない。ＴＳＳＴ‐１によって特異的に誘起されたとき、ＴＣＲＢＶ２Ｓ１は平均で２７倍(８．３〜３４９．８倍の範囲)で増加する。培地のみ又はＳＥＢの存在下でのコントロール培養においてもＴＣＲＢＶ２Ｓ１転写において違いは無いようである。一度転写レベルがそれぞれのＴＣＲＢＶ遺伝子に対して分かったならば、複数の抗原誘起Ｔ細胞があらゆる障害におけるあらゆる条件において同定可能である。もし特異的ＴＣＲＢＶｍＲＮＡレベルがαβＴＣＲ鎖ｍＲＮＡのある百分率として表されたならば、これはその場合ではないかもしれない。ＲＴ‐ＰＣＲにおける使用に対するＴＣＲＢＶ遺伝子変異体ＴＣＲＢＶ遺伝子変異体は、天然型ＰＣＲ生成物をＰＣＲｓｃｒｉｐｔのようなあるベクターに使用者説明書に沿ってクローニングすること及びこのクローンされたテンプレートを変異することによって、製造される。この変異は、Higuch i et al(1988)及びHo et al(1989)の方法に沿って遺伝子ソーイング(gene SOEin g:sequence overlap extension)として知られるあるＰＣＲ基盤方法を使って、行われる。簡単には、この天然型配列を２つの２等分で且つ別々の反応において増幅する。その最初の反応はそのテンプレートのその上流半分をその上流のＴＣＲＢＶ特異的プライマー及びある変異的下流プライマーを使って増幅する。この変異的プライマーを変異されるべきその部位のちょっと上側テンプレートにアニールして、５’末端にその新しい変異配列の１２から１５塩基対を運ぶ。別に行われるその２次反応は、そのテンプレートの下半分を増幅する。その下流ＴＣＲＢＣ特異的プライマー及びある上流変異的プライマーを利用する。この変異的プライマーを変異されるべきその部位のちょっと下側テンプレートにアニールして、５’末端にその新しい変異配列の１２から１５塩基対を運ぶ，増幅後、半分それぞれ精製して天然型テンプレートの無い状態にし、プライマー及びＴａｑポリメラーゼが同濃度になるように希釈する。その２つの２分割したものはそこであるＰＣＲ混合物と一緒にＴＣＲＢＶ及びＴＣＲＢＣ特異的プライマーのみとともに入れられそして‘ホットスターティッド’ＰＣＲ反応において増幅される。この２回目の増幅の間、その２つの２分割物は、それらの重複変異配列の利用によってともにアニールされ、そしてある新しい変異体テンプレートがＰＣＲプロセスによって作られる。その新しいＰＣＲ生成物はそこでＰＣＲｓｃｒｉｐｔのようなあるベクターに再クローンされ戻されうる、そして誤りの無いクローンが同定されるまで配列決定される。この方法を使いながら、我々はＣＡＴＣＡＧＡＡＧＣＡＧＡＧＡＴＣＴＣＣ配列を、その天然型ＴＣＲＢＣ領域においてＧＡＴＧＴＣＡＡＧＣＴＧＧＴＣＧＡＧＡＡ配列を使って、ＴＣＲＡＣ遺伝子のその相当する領域から置き換えた。この変異はその全サイズ、ｄＧ／ｄＣ：ｄＡ／ｄＴ含量又はその元の天然型テンプレートのそのアニーリングプライマー配列に影響するためにではなく設計された。その変異されたテンプレートを多数のＴＣＲＢＶ‐特異的ＰＣＲ反応においてその天然型テンプレートとして同様の効率で増幅する。遺伝子ソーイングについてのさらに詳しいことは以下の文献を参照されたい、Higuchi R.，et al( 1988)Nucleic Acids Res．15，7351-7367およびHo S.N.，et al（1989）Gene 77 ，51-9。細胞培養リンパ細胞は、ある正常な個体からのある抹消血液試料から得られ、そしてペニシリン、ストレプトマイシン、グルタミン及び１０％（v/v）熱非動化ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０におけるin vitroで１x１０⁶cell/mlにおいて３日間培養した。細胞を、この培地のみ又は１００ng/mlストレプトコッカルエントレトキシンＢ（ＳＥＢは、別細胞の中でＶβ２+Ｔ細胞ではなくＶβ３+Ｔ細胞と結合するある超抗原である）又は１０ng/mlのＴＳＳＴ−１（Ｖβ３+細胞ではなくＶβ２+Ｔ細胞と結合する）のいずれを補われた培地において培養した[51]。特異的ＴＣＲｍＲＮＡの測定 Qiashredder（商標）(Qiagen）によって細胞を溶解しさらにＤＮＡ分離に続いて、使用者説明書に基づいてRNeasy（商標）抽出装置(Qiagen)を使って、全ＲＮＡをＴ細胞からin vivo又はin vitroのいずれかにおいて抽出する。７５度で５分間培養することで非動化されたＲＮアーゼ失活ＤＮアーゼを用いて１時間３７度で処理することによって、ＤＮＡ混入汚染を除去しても良い。全ＲＮＡ濃度は、時にはこの時点で測定されても良いが、しばしば分光測定法で定量され得るとは言いかねる。使用者説明書に基づいて‘ｈｏｔｓｔａｒｔ’に続いてある最終容量の２０μｌにおいて９０分間１００ＵＭ-ＭＬＶ逆転写酵素( Superscript^II;Life Technologies)を用いて９．５μｌの全ＲＮＡを逆転写する。１μｌのｃＤＮＡを、０．１倍、１倍及び１０倍分子数の変異体プラスミドＤＮＡを用いて増幅する。ｃＤＮＡ濃度の評価は、既知の濃度のクローンされたＴＣＲＢＶ遺伝子生成物のある基準曲線に対する１μｌのｃＤＮＡの増幅によって行われ得る。このＰＣＲ反応は１ＵＲｅｄＨｏｔ（商標）Ｔａｑポリメラーゼ(Advan ced Biotechnologies)を使いながら１０から２５ピコモルづつのＴＣＲＢＶ特異的およびアミノ化ＴＣＲＢＣ特異的オリゴヌクレオチドプライマー、２００μＭｄＮＴＰ及び２．０ｍＭＭｇＣｌ₂を用いて、５０μｌの最終容量において行われる。この反応は、ＰＨＣ‐３サーマルサイクラー(Techne)において９５度で１０分間‘ｈｏｔｓｔａｒｔ’し、１分間に３度の割合で２５度まで冷却する。２５度になった時１ＵのＲｅｄＨｏｔ（商標）Ｔａｑポリメラーゼを加え、その後その反応は、９５度で１分間、５４-５６度で３０秒そして７２度で３０秒の３５サイクルと７２度で５分間の伸長に続いて７２度で３分間伸長された。５μｌをそのＰＣＲが働いていることを確かめるために１．５％(ｗ/ｖ)のアガロースゲル上において実験する。承認されたＴＣＲＢＶ-特異的オリゴマーはその最初の２０個のＴＣＲＢＶファミリーについて既に出版されている(Will la ms et al（1992）J．Clin．Invest．90，326-333参照に含まれている)。その付加的、機能的、５又はそのような(分類に応じて)機能的なＴＣＲＢＶ遺伝子ファミリーがそれらの出版された配列に対して設計されたプライマーによって増幅される(Rowen et al（1996）Science 272，1755-1762,これは本明細書の一部を構成する)。その配列及びその注釈はゲノムシークエンスデータベース(承認番号Ｌ３６０９２、Ｌ３６１９０及びＵ０３１１５)に蓄積されている。通常他のＴＣＲＢＶ配列とおそらく最も異なる領域であるその遺伝子のＣＤＲ１又はＣＤＲ２領域にアニールするプライマーが設計される。この増幅されたＰＣＲ生成物は、使用者説明書に応じてその‘クリーンアップ(clean up)’装置(A dvanced Biotechnologis Ltd)を使ってその組み込まれていないプライマーから分離される。その生成されたＰＣＲ生成物を、９０μｌのＨ₂Ｏに溶出し、等量のＭＥＳ/ＥＤＴＡ緩衝液(50mlの2-[N-morupholino]ethanesulfonic acid)とともに攪拌する。５０μｌのこの混合物を共有ＥＬＩＳＡプレート(2388;Corning Costar)の４つのウェルのそれぞれに４０μｌの架橋試薬溶液(5mlの水中における40mg EDCと0.543mg sulfo-NHS)とともに加え、３７度で一晩培養する。そのプレートを３回ｐＨ７．４のＰＢＳ溶液で洗浄する。１００μｌの０．１Ｍ水酸化ナトリウム溶液によって１０分間室温で、その結合ＤＮＡを変成させる。その水酸化ナトリウム溶液を捨てた後、そのプレートを一度０．１ｘＳＳＣで、２度ＨＷ緩衝液(6ｘＳＳＣ+0.1%(v/v)n-lauroylsarcosine)で洗浄する。そのときそのプレートは５％ＭａｒｖｅｌとともにＨＷ緩衝液中で３０分間３７度で固定される。そのプレートに結合しているその１本鎖ＤＮＡは、ＨＷ緩衝液中のビオチン- 接合体、天然型特異的の(２ウェル)又はビオチン接合体、変異体特異的の(２ウェル)オリゴヌクレオチドによって９０分間４２度で調査される。そこでそのプレートは３回ＷＨ緩衝液(2ｘＳＳＣ+0.1%(v/v)n-lauroylsarcosine)で１回緩衝液Ｂ（100mMトリス-HCl pH7.5+800mM NaCl+0.5%(w/v)+ブロック試薬(Boehringer Mannhe im)で洗浄する。その結合しているプローブはそのウェルを１時間３７度で１００μの使用者説明書に応じて作られたＡＢＣ(Avidin Biiotin Complex)ストレプトアビジンペルオキシダーゼとともに培養することによって検出され、緩衝液Ｂ中にて１：１００００に希釈された。そのプレートを、１回緩衝液Ｂによって、５回緩衝液Ａ(100mMトリス-HCl pH7.5+800mM NaCl)によって洗浄する。ペルオキシダーゼ活性は、リン酸−クエン酸緩衝液中で１μｌの過酸化水素とともに１００μｌのＴＭＢ基質(1mg/ml)を加えることによって検出された。その適切な色濃度が進行したとき、その反応を100μlの硫酸溶液によって止め、その後２重波長ＥＬＩＳＡ読み取り機の６３０nmを補正とした４５０nm で読み取る。その変異体及び天然型生成物の量はそれぞれの反応において直接的にそれらの光学的濃度に対応している。初期変異体反応濃度の常用対数に対する光学濃度の常用対数をプロットすることが初期自然型ｃＤＮＡ濃度の導出を可能にする。光学濃度の割合の常用対数が０となる点がその２つのテンプレートが同じ初期濃度であった点である。変異体及び天然型特異的オリゴヌクレオチドプローブ由来のその光学濃度の比較可能性は、そのＴＣＲＢＶ２Ｓ１およびＴＣＲＢＣＰＣＲプライマーアニーリング配列によって範囲づけられるある遺伝的領域内に含まれるそれらの配列のそれぞれ１つコピーを含んだあるテンプレートを構築することにより決定された。この構造は、天然型及び変異体クローンをＨｐａＩ及びＢａｌＩによって制限して製造した。この適切な断片を互いに接合した、そしてＴＣＲＢＶ２ＳＩ及びＴＣＲＢＣ特異的プライマーを使って再増幅した。その新しいＰＣＲ生成物をそのＰＣＲｓｃｒｉｐｔベクターにクローンした。このテンプレートを配列決定して、そのＴＣＲＢＶ２Ｓ１,ＴＣＲＢＣ、天然型及び変異体配列に対する誤りのないアニーリング部位を含んでいることを確かめた。このテンプレートはビオチニル化（Biotinylated）ＴＣＲＢＣ特異的プライマーを使って増幅され、そしてあるストレプトアビジン被覆プレートに多様な希釈度で結合された。増幅されたテンプレート希釈度でその２つのプローブで得られたその光学濃度と比較しいているその線は、その原点(０．００、０．００)を通り０．９９±０．２２の勾配を有する直線(r²=１．００)である。もし、ある特異的ＴＣＲβ鎖配列が定量されるべきならば、これは、ある特異的オリゴヌクレオチドプライマーのＴＣＲＢＶ‐ＴＣＲＢＪの組合わせあるいはある特異的オリゴヌクレオチドプライマーのＴＣＲＢＶ‐Ｎ領域組合せを使って上記の方法を使って実行される。もしそのいずれかの場合、その変異体は最も良くはそのＴＣＲＢＶ配列内に配置される。従来のように遺伝子ソーイングによって行われ得るのならば、最も便利な変異はある長さのセンス配列をアンチセンス配列で置き換えることである。これはそのＧ／Ｃ：Ａ／Ｔ含りつを同じにしたままであり、そして変異体及び天然型プローブの両方が等しい親和性を有するだろうということは明かである。そのプローブ標的配列から最も離れたそのＰＣＲアニーリング部位は、そのＰＣＲのオリゴマーがビオチニル化されるその末端として使われるべきである。特異的Ｖβ＋Ｔ細胞数決定Ｔ細胞の活性化の計算は、特異的Ｖβ＋Ｔ細胞ごとの特異的ｍＲＮＡの量が知られていることを要求するので、その特異的Ｖβ＋Ｔ細胞数とＴＣＲＢＶ特異的ｍＲＮＡ分子の量の両方が計数される。特異的Ｔ細胞数は、あるＶβ−特異的モノクローナル抗体のある組合せ及び細胞計数機を使って測定される。ＴＣＲ及びＣＤ２５免疫組織化学；５ｘ１０⁵cellの分割量をペレットにしてそして、０．０１％（w/v）アジ化ナトリウム及び１０％（v/v）熱非動態化正常ヒト血清を含むｐＨ７．６のＰＢＳ溶液５０ｍｌに懸濁した。それらは、２０ｍｌＦＩＴＣ接合抗−Ｖβ２、抗−Ｖβ３又は抗−ＣＤ３とともに培養されその後１０ｍｌのＲＰＥ‐接合抗−ＣＤ２５によって４０分間氷上で対比染色された。その後、細胞は３回洗浄され、ｐＨ７.４に緩衝された０.５％(v/v)パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳ５００ｍｌ中で定着された。試料をＦＡＣＳｃａｎ分析器(Beckton Dickinson)において処理した。利用可能なあるＶβ特異的モノクローナル抗体の存在下において、特異的ＴＣＲＢＶ‐含有ＤＮＡを定量できる。体内的に再アレンジされた特異的Ｔ細胞ＤＮＡを特異的β鎖ｍＲＮＡについてＣＰＣＲとして定量できる。さらにもう一度、存在することが知られているその１３個のＴＣＲＢＪ配列全てをカバーするＴＶＲＢＪ特異的プライマーとの組合せにおいて、あるＴＣＲＢＶ特異的オリゴマーが使われる。上記のようなその変異はそのＴＣＲＢＶ配列に配置されるはずである。一度多数のＤＮＡ分子がＴＣＲＢＪ組合せごとについて知られたならば、Ｔ細胞の数はそれぞれのＴ細胞がただ１つだけのＢＶ‐ＢＪの組合せを含むとして計算される。増幅したいＴＣＲＢＪエレメントとその背後にあるエレメントの間を切るある酵素を用いて増幅する前に、ゲノミックＤＮＡを前もって制限することが時々有用である。γδＴ細胞はある再アレンジメントされたＴＣＲＢ遺伝子複合体を有しているので、Ｔ細胞数における微かな過剰刺激をこの方法を使って起こすことができるかもしれない。他には、このＴＣＲＢＪセグメントＢＪＩＳ１,ＢＪ２Ｓ１及びＢＪ２Ｓ７は最も良く使われているようなので、それら３つのセグメントにおける組合せに対するそのＴＣＲＢＶ‐ＢＪの組合せは、ほとんどのＶβに対する全Ｖβ特異的Ｔ細胞遺伝子再アレンジメントの４０‐４５％と見積もられるだろう(Jeddi-Teherani et al（1994）Human Immunology 40，93-1 999)。全体的及び特異的な、ＴＣＲＡｍＲＮＡの定量はＲＴ‐ＰＣＲを用いて達成されても良い。最初の実施例において、ＴＣＲＡ変異体が製造されなくてはならない。ＴＣＲＢの方法とは逆に、変異体は、このＴＣＲＢＣ鎖から同等の配列であるＣＡＴＣＡＧＡＡＧＣＡＧＡＧＡＴＣＴＣＣを遺伝子ソーイングによって置き換えられたＧＡＴＧＴＣＡＡＧＣＴＧＧＴＣＧＡＧＡＡ天然型ＴＣＲＡＣ配列有する。これは、採取された配列に対して、ＴＣＲＡＶ‐及びＴＣＲＡＣ‐特異的プライマー(特異的α鎖メッセージの定量に対する)又は２つのＴＣＲＡＣ‐特異的プライマー(全αβｍＲＮＡの定量に対する)を使って増幅される。しかしながら、この方法は特異的ＴＣＲＢＶｃＤＮＡ測定に対して記載されている。ＴＣＲＡＣ‐特異的プライマーを使っての全αβ ｍＲＮＡレベルの測定がＴＣＲＢＣｍＲＮＡのレベルを定量することよりもずっと優れている。これは、ＴＣＲβ鎖ｍＲＮＡがγδＴ細胞よって作られているがＴＣＲα鎖ｍＲＮＡは違うからである。もし特異的ＴＣＲＡＶ‐ＴＣＲＡＪ組合せが測定されるならば、この方法はＴＣＲＢＶ‐ＴＣＲＢＪ定量についてのものである。明かに、この変異体はそのＴＣＲＡＶ領域において配置されていて且つ便宜上その既存配列のそのアンチセンスである。ＴＣＲＡＶ‐又はＴＣＲＡＪ−特異的プライマーのいずれかが、そのオリゴマープローブアニーリング部位からより離れていることに依存してビオチニル化されるかもしれない。結果を図１〜５に示す。図１は、天然型及び変異体−特異的プローブの特異性のある比較を示す。あるＴＣＲＢＶ２Ｓ１ｍＲＮＡ転写物は逆転写、ＰＣＲによる増幅及びｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターへのクローンが行われる。そのＴＣＲＡＣ遺伝子のその相応する領域由来のある２０塩基対配列でそのＴＣＲＢＣにおける２０塩基対配列を置き換えられるように、それは遺伝子ソーイングによって変異された。そしてその変異体はｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローンされた。天然型(wt)及び変異体(mut)配列(１０から１０⁷分子)の多様化された分子がＴＣＲＢＶ２Ｓ１‐及びＴＣＲＢＣ‐特異的プライマーを使ったＰＣＲによって増幅された。その増幅されたテンプレートがあるアミン結合プレートに、そのＴＣＲＢＣ特異的プライマーの５’末端に付加されたそのアミノ基を使って前記の方法に従い付加される。図１は、ｗｔ‐及びｍｕｔ‐特異的プローブを有するｗｔ及びｍｕｔアプリコンを検索した結果を示す。それぞれのプローブはその標的配列に対して完全に特異的のようであり、初期テンプレート数の１０⁶倍の範囲にわたって無交叉反応性を示すようである。図２は天然型−及び変異体−特異的プローブにおいて得られた光学濃度(ＯＤ₄ _50/630 )読み取り地の比較可能性を示す。天然型−及び変異体−特異的配列の両方を含んでいるある構造が製造(上記参照)及びクローンされた。異なる構造(０から１０⁶分子)がＴＣＲＢＶ２Ｓ１‐およびＴＣＲＢＣ‐特異的プライマーで増幅され、あるアミノ酸結合ＥＬＩＳＡプレートに付加されそして天然型−及び変異体−特異的プローブ(上記記載のような)で検索された。その構造標的に対するそれぞれのプローブから得られたそのＯＤ値は正確にその０から１０⁶分子の範囲にわたって比較可能であった。図３は、未知のｃＤＮＡ試料の測定を記載している。ＴＣＲＢＶ２Ｓ１ｃＤＮＡの未知量の分割量が多様な未知量のｍｕｔＴＣＲＢＶ２Ｓ１とともに攪拌されそしてその２つがともに一連のＰＣＲ反応において共増幅される。その天然型アプリコンに対する変異体の割合をそのＤＮＡ計数ＥＬＩＳＡを使って分析した後、それをその初期変異体テンプレート濃度に対してプロットする。その割合の常用対数が０(即ち、天然型に対する変異体アプリコンの割合が１である)である点が、天然型及び変異体テンプレートが同じ初期濃度で存在していた点である。図４は未分離リンパ球集合におけるＶβ２．１ＴＣＲ＋Ｔ細胞によるＴＣＲＢＶ２Ｓ１ｍＲＮＡ生成物及びＣＤ２５発現のある比較を示す。Ｖβ２．１Ｔ細胞は、未分離抹消血リンパ細胞のある集合内で、ＴＣＲＢＶ２Ｓ１ｍＲＮＡ生成物(細胞ごとの分子)及びＣＤ２５発現(％陽性)について調べられた。その分析を、培養に先駆けて及び培地のみ(ＣＯＮ)又は１００ng/mlスタピロコッカルエンテロトキシンＢ(ＳＥＢ)又は１０ng/ml毒ショック症候群毒−１（TSST- １）を補われた培地において培養された後３日後に実行した。４つの正常個体を調べた。ＴＣＲＢＶ２Ｓ１生成は、あらゆるそのコントロールよりもその適切に刺激された（ＴＳＳＴ-１）細胞培養においてずっと高かった。ｍＲＮＡ生成におけるその規模はＣＤ２５において見られるものよりもはるかに大きく、正値性は特異的ＴＣＲｍＲＮＡ生成率の分析がある未分離リンパ細胞集合におけるその抗原駆動Ｔ細胞の明確な指摘を与えることを提起している。図５は、未分離のリンパ球集合でのＶβ３．１ＴＣＲ+Ｔ細胞によるＴＣＲＢＶ３Ｓ１ｍＲＮＡ生成及びＣＤ２５発現のある比較を示している。Ｖβ３．１Ｔ細胞は、未分離抹消血リンパ細胞のある集合内で、ＴＣＲＢＶ３Ｓ１ｍＲＮＡ生成物（細胞ごとの分子）及びＣＤ２５発現（％陽性）について調べられた。その分析を、培養に先駆けて及び培地のみ（ＣＯＮ）又は100ng/mlスタピロコッカルエンテロトキシンＢ(ＳＥＢ)又は１０ng/ml毒ショック症候群毒−１（TSST- １）を補われた培地において培養された後３日後において実行した。４つの正常個体を調べる。ＴＣＲＢＶ３Ｓ１ｍＲＮＡ生成は、その適切に刺激されたリンパ球（ＳＥＢ）において最も高かった。ＰＥＲ及びＣＯＮコントロールと比較してＴＳＳＴ- １刺激培養においてＴＣＲＢＶ３Ｓ１の増加がみられた。これはＳＥＢ-刺激培養において観測された物よりもまだ十分に低かった。そのＴＳＳＴ-１およびＳＥＢ培養においてＶβ３．１Ｔ細胞によるそのＣＤ２５における十分な違いはない。これは、特異的Ｔ細胞後とに特異的ｍＲＮＡ生成の分析が、未分離のリンパ細胞集合内でのその抗原駆動Ｔ細胞の相同性の明かな指摘を提供していることを認証している。結論これらのデータが提起する多数の結果がある。１．異なるＴＣＲ遺伝子のその連続する発現は多様である。Ｖβ２．１+Ｔ細胞のコントロール培養は、同じ培養においてＶβ３．１Ｔ細胞よりも少ないＴ細胞ごとの分子を生成する。２．Ｔ細胞をそれらに特異的な抗原によって刺激するとＴＣＲ生成率は大きく増加するが、この増加の規模は異なるＴＣＲ遺伝子に対して多様である。３．ＴＣＲｍＲＮＡ分子は細胞ごとに活性化されたリンパ球による受身的培養において増加するが、そのＴ細胞が直接抗原により刺激されたときと同程度ではない。４．ＣＤ２５+発現はＴＣＲ遺伝子転写からは独立的に制御されているらしい。５．一緒に得られたならば、これらのデータは、細胞ごとのｍＲＮＡの特異的ｍＲＮＡ量の測定が免疫障害におけるＴ細胞の直接抗原誘起と受身的サイトカイン仲介活性化を分別するかもしれないということを提起している。実施例２：あるラットモデルにおける移植組織片対宿主疾患 in vivoにおける抗原仲介ＴＣＲ誘起のある索引としてのＴ細胞ごとのＴＣＲｍＲＮＡ分子を測定することのある実施例である。最近の証拠が、放射線照射されたＬｅｗｉｓラットリンパ細胞標的に対して生成されたＤＡラット由来の長期間Ｔ細胞計及びクローンがそのＴＣＲＢＪ２Ｓ１遺伝子セグメントで置き換えられたＴＣＲＢＶ６Ｓ１遺伝子セグメントによってコードされ且つほとんど排他的なある明確なＮ領域配列を有するあるＴＣＲを使用するということを示している(Tavakol Afshari et al（1997）Transpl．immun ol,．印刷中)。たくさんのＤＡ及びＤＡＸＬｅｗｉｓＦｌラットを入手しそして未知のＤＡリンパ細胞をそれらの後脚の肉球(footpads)に注射した。14日間に渡って排出させつづけて、注射したラットからリンパ腺を得た、そのＤＡリンパ細胞はＲＴ1細胞表面標識-陽性リンパ細胞(Ｆｌ細胞)を排除することによって生成される、そしてＴＣＲＢＶ６Ｓ１-ＴＣＲＢＪ２Ｓ1 ｍＲＮＡ及びゲノミックＤＮＡ分子の数が本質的には実施例１に記載されるように測定される。ＤＡＸＬｅｗｉｓから得られたそのＤＡリンパ細胞はＴＣＲＢＶ６Ｓ１-ＴＣＲＢＪ２Ｓ lｍＲＮＡのＤＮＡに対する比率（特異的Ｔ細胞ごとの特異的ＴＣＲｍＲＡＮのより高いレベルを示している）がコントロール(ＤＡ)動物より高い比率を有している。実施例３：高ガンマグロブリアエミック初期ショーグレン"ズ症候群(Hypergamma globulinaemic Primary Sjogren's Syndrome；ＨＧＰＳＳ)におけるＶβ１３．２ＴＣＲ-陽性Ｔ細胞ごとのＴＣＲＢＶ１３Ｓ２ｍＲＮＡのレベルの測定ＨＧＰＳＳは、Ｔ細胞浸潤及び涙腺及び唾液腺の免疫破壊によって特徴付けれられるある自己免疫病気である。このＴＣＲＢＶ１３Ｓ２遺伝子によってコードされるこの条件に対する遺伝的感受性及びこの条件を有する患者の唾液腺におけるＴＣＲＢＶ１３Ｓ２遺伝子ｍＲＮＡの増加したレベルの証拠がある(Kay et al ，1992)。マイナーな唾液腺及び抹消血試料の生検がこの条件を有する患者から得られる。関連のない条件(埋覆した親知らず除去)における歯科手術を受けている患者からのマイナーな唾液腺生検がしかも得られる。その生検はコラゲナーゼ消化される。その消化された生検由来のリンパ細胞及びその抹消血試料はフィッコール勾配を通して分離される、そしてＶβ１３．２+Ｔ細胞数はある抗-Ｖβ１３．２、ＦＩＦＴ-Ｃ接合モノクローナル抗体を使って免疫組織的に染色された後白血球計数及びＦＡＣＳ分析のある組合せによって定量される。このＴＣＲＢＶ１３Ｓ２遺伝子ｍＲＮＡレベルは実施例１において記載されるように測定される。特異的Ｖβ１３．２+Ｔ細胞ごとのＴＣＲＢＶ１３Ｓ２遺伝子ｍＲＮＡのそのレベルは、そのＨＧＰＳＳ患者の抹消血（疾患組織内での選択的帰還及び誘起）又は関係のない歯科的病気を有する患者のその唾液腺においてよりもＨＧＰＳＳ患者の唾液腺においての方がより高い(Kay R.A.，Hutchings C.J .，Ollier W.E.R.(1995)Human Immunol．42，328-330及びSumida T.，et al.(19 92)J．Clin．Invest89，681-685.を参照されたい)。実施例４：４つの関連のない個体における超抗原刺激に対する応答リンパ細胞は４つの正常なドナーからのその抹消血試料から分離されそして３日間１．５ｘ１０⁶cells/mlでペニシリン、ストレプトマイシン、グルタミン及び１０％（v/v）熱非動態化ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０中で培養した。細胞は培地のみあるいは１００ng/mlのＳＥＢ又は１０ng/mlのＴＳＳＴ-1を補われた培地において培養された。ｍＲＮＡレベルは実施例１に前もって記載したようにその混合物逆転写ＰＣＲを使って測定された。Ｖβ２．１+及びＶβ３．１+細胞数をそのＣＤ２５状態によって、実施例１において前記した様にＦＡＣＳによって計数する。測定は、培養３日後だけではなく前もって(ＰＲＥ)も行われた。その結果は、ＳＥＢが選択的にＶβ３．１+Ｔ細胞においてＴＣＲＢＶ３Ｓ１レベルを刺激すること及びＴＳＳＴ-１がｖβ２．１+Ｔ細胞においてＴＣＲＢＶ２Ｓ１に対して同様のことをするということを認証している。ｍＲＮＡレベルにおけるその相対的増加はＢＶ３Ｓ１に対しては５８倍であって、ＢＶ２Ｓ１に対しては４０倍であった(図７)。ＢＶ２Ｓ１よりもＢＶ３Ｓ１に対して高い細胞ごとの未刺激ＴＣＲｍＲＮＡレベルは、そのＴＣＲＢＶ３Ｓ１遺伝子がより高いレベルで転写されているということを提起している。図７は、培地のみあるいはその超抗原ＳＥＢ又はＴＳＳＴ-１を補われた培地における培養の前又は３日後の細胞ごとのＴＣＲＢＶ３Ｓ１ｍＲＮＡレベルを示している。前述のようにこの結果は細胞ごとのＴＣＲＢＶレベルがＣＤ２５発現(図８)の測定よりも抗原特異的Ｔ細胞誘起の良い指示体であることを示してもいる。図８は、抗原誘起Ｔ細胞におけるＣＤ２５発現及び細胞間ＴＣＲＢＶレベルのある比較を示している。実施例５：従来の抗原での刺激に対するＴ細胞の応答リンパ細胞はある抹消血試料から分離されそして前記のように３日間培地のみ又はある抗-Ｖβ３．１-特異的モノクローナル抗体、ある抗-ＣＤ-２８-特異的モノクローナル抗体又は組み合わせたその両方の抗体を補われた培地において培養された。抗-ＣＤ２８のみが細胞間ＢＶ３Ｓ１ｍＲＮＡレベルを十分に上昇させなかった。抗-Ｖβ３．１は細胞間Ｖβ３Ｓ１レベルを十分には上昇させなかった。しかしながら、ＳＥＢで得られたそれらに比較可能な細胞間ＢＶ３Ｓ１ｍＲＮＡレベルが抗-ＣＤ-２８及び抗Ｖβ３．１（図９）の両方とともに３日間培養した後に得られただけだった。図９は、培地のみ（ＵｎＲｘ）、抗-ＣＤ-２８（ＣＤ）、抗-Ｖβ３．１（Ｖβ）又はその２つの組合せ（ＣＤ＋Ｖβ）を補われた培地において培養されたリンパ細胞から入手された細胞間ＴＣＲＢＶ３Ｓ１ｍＲＮＡレベルを示している。ある抗-Ｖβ特異的モノクローナル抗体を使うことは従来の抗原での刺激と同等である。この実験は、この手法が従来の抗原（超抗原だけではなく）がＴ細胞に対して応答すると思われている状況においての使用に適しているということを実証している。しかもＣＤ−２８共刺激は、それがＴ細胞の増加に対するのと同様に全ＴＣＲ遺伝子転写に対しても重要である。実施例６：分析能力特徴この分析時間中安定性を調べるために、あるＴＣＲＢＶ１７Ｓ１−特異的ｍＲＮＡを逆転写、増幅、クローン及び配列決定した。そのクローンを前述のようにＴＣＲＢＣ領域において変異させ、それがある短いＴＣＲＡＣ配列を含みそしてその天然型テンプレートに対するある測定混合(measurement contaminant)として使われうるようにした。天然型テンプレートの１５，０００分子を一日あるいは８週間にわたりこのコンタミナントＰＣＲを使って測定した。この結果を図１０に示す。そしてこの結果はこの期間においてはその分析の正確さにおいてそれ程の影響がないことを実証している。図１０は、１日（集合）又は８週間（分離）におけるあるクローンされたＴＣＲＢＶ１７Ｓ１配列の１５，０００分子の測定を示す。このＴＣＲのβ鎖の可変ドメインは３つの小さな遺伝子セグメントのある組合せによってコードされている。それ故それぞれの異なるＴＣＲＢＶ１７Ｓ１コードＴＣＲにおいて、このＴＣＲＢＶ１７Ｓ１遺伝子セグメントはある異なるＢＤ及びＢＪ遺伝子セグメントの組合せであるだろう。この生理学的な変異が測定のその正確性に影響するかどうかを見るために、５つの異なるＢＶ１７Ｓ１天然型テンプレートを測定するためにある変異体ＢＶ１７Ｓ１クローン（ＢＤ１及びＢＪ１Ｓ１）が使われた。これらのテンプレートの１つがその変異体として同じＢＤ及びＢＪ組合せを有する；そのたの４つは異なっていた。もしこれらの異なるセグメントが測定に影響を与えたならば、遺伝的多様性のその上流領域を省いてそのＴＣＲＢＣ領域に純粋にアニールされるあるプライマーを使ってその天然型を測定して調べることもできたであろう。そうして、図１１は、あるＢＶ１７Ｓ１-特異的プライマー（遺伝的変異性領域を含む）及びあるβＰＣＲ５‘プライマー（遺伝的変異性領域を除く）の両方を使ってある単一の変異体混合とともにそれらの５つの異なるＢＶ１７Ｓ１クローンの測定結果を示す。その結果は、ＴＣＲ遺伝子再アレンジメントにおいて自然に起こる遺伝的変異性が正確なデータを提供するためのある単一変異体クローンのその能力に影響しないことを示す。さらに、ある単一変異体クローンは、ＴＣＲ配列のあるポリクローナル集合又はある単一ＴＣＲテンプレートを同様の効率手測定できる（データは示さない）。図１１はある単一変異体ＢＶ１７Ｓ１クローンを有する５つの異なるＴＣＲＢＶ１７Ｓ１天然型テンプレートの１５，０００分子の測定のその正確性を示している。測定はあるＢＶ１７Ｓ１特異的プライマー及びあるＴＣＲＢＶ特異的プライマー（βＰＣＲ５’）の両方を使って作られそして使用された。それらのいずれかのプライマーを使って得られたその測定の間にはそれ程の違いは無かった。遺伝的配列において非生理学的な変異がこのテストを妨害するかどうかを見るために，そのＢＶ１７Ｓ１天然型テンプレートの１つからある変異体が製造された。この変異体はある一面以外全ての面でその天然型と相同的であった。約６０塩基対のある短い配列がそのＢＶ２Ｓ１可変遺伝子のその中部からそのＢＶ１７Ｓ１配列のその中部に置換された（１７/２/１７）変異体。この変異体とその天然型との間のこの変更された配列相同体は、自然にはＢＤ/ＢＪ置換を有する異なる天然型の間ではほとんど起こらない。測定はあるＢＶ１７Ｓ１特異的プライマー（その変異体の５’にアニールする）及びあるβＰＣＲ５’（その変異体の下流にアニールする）の両方を使ってその２つのテンプレートから作られた。その結果を図１２に示す。図１２はＢＶ１７Ｓ１特異的及びβＰＣＲ５’プライマーを使っての天然型ＢＶ１７Ｓ１（クローン７）及び変異体ＢＶ１７Ｓ１（１７ /２/１７変異体）テンプレートの測定を示す。この結果は、ＢＶ２Ｓ１（決して自然的には起こらないであろう）のあるアナログセクションを有するそのＢＶ１７Ｓ１配列のある部分の置換が、その変異体の上流にアニールするあるプライマーを有するその変異体テンプレートの測定を停止するということを示す。もしこの変異体（βＰＣＲ５’）の下流にアニールするあるプライマーが使用されるならば、その天然型又は変異体テンプレートの測定の正確性の間にそれ程の違いはない。１つの変異体による天然型テンプレートおなる範囲の正確な測定がその変異体の独特の特徴であったかどうかを見るために、ある初期点としてある異なるＢＶ１７Ｓ１天然型テンプレートを使ってある２次測定変異体が作られた。その結果を図１３に示す。その結果はどちらもの変異体が両方の天然型テンプレートを正確に測定することができることを実証している。図１３は、それらの各々の変異体を有するＢＶ１７Ｓ１天然型テンプレート（クローン１およびクローン７）の測定を示している。最終的に、この分析は天然型分子数のある範囲を測定するための能力において調べられた。ＴＣＲＢＶ１７Ｓ１テンプレートの１００，０００、１０，０００、１，０００分子を測定した（図１４）。変異のこの分析間計数はこの分子数範囲にわたって比較可能であって、およそ２３％であった。この試験はテンプレート数において１０倍の違いは容易に分離可能であった。この測定は、以前にin vitro実験において出会ったたことのあったあらゆる分子数の大小どちらにも超過した範囲をカバーすることが意図された。図１４は天然型ＴＶＲＢＶ１７Ｓ１テンプレートの分子の異なる数の測定を示す。要するに、このコンタミナント、定量ＰＣＲ方法は約２３％の正確性を持って in vitro(そしておそらくin vivo)において出会ったであろうＴＣＲｍＲＮＡ分子を測定することができる。適切な刺激の後の細胞内ＴＣＲｍＲＮＡ分子レベルは約４０倍変化するので、この容易にＴ細胞誘起を検出するはずである（しかも、する）。それぞれのＴＣＲＢＶ遺伝子に対するある単一変異体テンプレートはすべてモノクローナル、オリゴクローナルそしてポリクローナルＴＣＲｍＲＮＡ集合を測定するために必要であり、その分析の正確性は時間によってずれないようである。実施例７：休止中及び活性化(at rest and activation)後におけるＴＣＲＢＶ遺伝子プロモーター機能実施例１からのデータは細胞内ｍＲＮＡレベルが休止中及び活性化後の両方において異なるＴＣＲＢＶ遺伝子間において多様であるということを示す。個々のＴＣＲＢＶ遺伝子プロモーター間で起こるその配列の相違が与えられた時、これは遺伝子転写における相違を示すようである。これを試すために、ラットＴＣＲＢＶプロモーターがＰＣＲによってゲノミックＤＮＡから分離されｐＧＥＭ-ＴＥａｓｙベクター(Promega)にクローンされ、そして配列決定された。異なるＴＣＲＢＶ遺伝子由来のそれらのプロモーターは、そのルシフェラーゼリポーター遺伝子ベクターであるｐＸＰ２中にサブクローンされた。これらの構造物が共形質転換体コントロール（レニラルシフェラーゼ発現をコントロールにするチミジンキナーゼプロモーター）とともに電気穿孔によってヒトＴ細胞系であるＪｕｒｋａｔに形質転換導入される。この細胞を、培地のみあるいは１０ng/mlでＰＭＡを補った培地において形質転換後４０時間培養した。そのＰＭＡが薬学的にＴＣＲ誘起を模倣する。４０時間後、その細胞を回収し溶解した。蛍シフェラーゼ(ＴＣＲＢＶ遺伝子制御された)及びレニラルシフェラーゼ測定がその２重ルシフェラーゼ分析装置(Ｐｒｏｇｍａ)を使って行われ、そしてその割合を図１５に示す。これらのデータは強力に異なるＴＣＲＢＶ遺伝子（ＢＶ５Ｓ１及びＢＶ５Ｓ２のような同じファミリーの内の１つであったとしても）を異なる割合で休止中及び活性化後の両方のお互いから転写した。これらのデータは、細胞間ＴＣＲｍＲＮＡレベルはＴＣＲＢＶ-特異的ｍＲＮＡ生成物における違いを反映しているかもしれないという前記の提起を認証しているようである。細胞間ｍＲＮＡレベルにおいて見られる相違の程度はレポーター構成物で観測された物よりも大きいということを知るべきである。これは、そのレポーター構成物においておそらくそのＴＣＲＢＶエンハンサーを含んでいないことによるのであろう。このＴＣＲＢＶエンハンサーは、そのプロモータに較べて比較的大変強くそして形質転換実験においてルシフェラーゼ生成物を顕著に増加させる。図１５は、培地のみ(●) 又はＰＭＡを補われた培地(〇)において４０時間の培養後のＪａｋａｔＴ細胞に異なるプロモーター−ｐＸＰ２構成物を導入したその相対活性を示す。実施例４から７において提供された情報は、（１）４つ以上の個体におけるＴＳＳＴ-１及びＳＥＢに対する応答において特異的に細胞ごとに、細胞間ＴＣＲｍＲＮＡが増加することを示す；（２）細胞間ＴＣＲｍＲＮＡはＣＤ２５発現より優れた抗原刺激検出体であることを認証する；（３）ＴＣＲｍＲＮＡのそのレベルにおけるある類似上昇は、そのＴ細胞が抗-ＣＤ-２８によって共刺激されたときだけではなく従来の抗原刺激（あるＶβ -特異的モノクローナル抗体によってと見なされる）よって誘導されうる。；（４）この定量ＰＣＲ方法は正確であり(約２５％またはそれ以下の分析間変異を持って)、時間を通して安定でありそしてＴＣＲ遺伝子において起こる生理学的な配列変異によって影響されない。しかしながら、その分析は非生理学的な遺伝子変異に対して敏感である；そして（５）ヒトＪｕｒｋａｔＴ細胞系において形質転換されたラットＴＣＲ遺伝子プロモーターを使ったルシフェラーゼレポーター遺伝子分析データであってそれはＴＣＲ遺伝子転写がＴ細胞刺激の後に増加する及び変化するということを実証している、休止中及び刺激後の両方において、異なるＴＣＲＢＶ遺伝子によって。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】１．Ｔ細胞の集団内において抗原応答Ｔ細胞を同定する方法であって、その方法は以下のステップを含む。（１）その抗原に応答したＴ細胞を含むある試料を得ること、および（２）ある複数の特異的Ｔ細胞受容体のいずれかに対して個々に又はＴ細胞受容体のある複数のサブセットのいずれかに対して個々に、ある特異的Ｔ細胞受容体をコードしているある遺伝子の発現又はＴ細胞受容体のあるサブセットをコードしている遺伝子の発現が、特異的Ｔ細胞受容体陽性Ｔ細胞ごと又は特異的Ｔ細胞受容体陽性Ｔ細胞サブセットごとに、その抗原に応答しなかったＴ細胞を含むある試料における前記遺伝子のその発現に比較して、増加しているかどうかを決定すること。２．Ｔ細胞の集団における抗原応答Ｔ細胞を同定する請求項１記載の方法であって、その方法は以下のステップを含む。（１）その抗原に応答したＴ細胞を含むある試料を得ること、（２）ある複数の特異的Ｔ細胞受容体のいずれかに対して個々に又はＴ細胞受容体のある複数のサブセットのいずれかに対して個々に、あるＴ細胞受容体に対して特異的又はＴ細胞受容体のあるサブセットに対して特異的であるＴ細胞受容体ｍＲＮＡの量を、特異的Ｔ細胞受容体陽性Ｔ細胞ごとまたは特異的Ｔ細胞受容体陽性Ｔ細胞のあるサブセットごとに、ステップ（１）において得られる試料において、決定すること、および（３）どちらのＴ細胞受容体ｍＲＮＡが特異的Ｔ細胞ごとにステップ（１）において得られるその試料中で増加するかを、その抗原に応答しなかったＴ細胞を含むある試料中での増加量と比較して決定すること。３．前記ステップ(１)はその抗原に応答しなかったＴ細胞を含むある試料(ａ)とその抗原に応答したＴ細胞を含むある試料（ｂ）を含み、ステップ(３)においてどちらのＴ細胞ｍＲＮＡが特異的Ｔ細胞ごとに試料（ｂ）において増加したかを試料（ａ）と比較して決定する請求項２記載の方法。４．前記試料（ａ）はある個体のある非疾患部位から採取され、且つ試料（ｂ）はその個体のある疾患部位から採取される請求項３記載の方法。５．前記試料（ａ）はある非疾患個体から採取され、且つ試料（ｂ）はある疾患個体から採取される請求項３記載の方法。６．前記Ｔ細胞受容体のそのサブセットはあるサブセットであってここにおいてそれぞれのＴ細胞受容体はある特異的Vβ領域を含む請求項１〜５のいずれかに記載の方法。７．前記Ｔ細胞受容体のそのサブセットはあるサブセットであってここにおいてそれぞれのＴ細胞受容体はある特異的Vα領域を含む請求項１〜５のいずれかに記載の方法。８．前記Ｔ細胞受容体のそのサブセットはあるサブセットであってここにおいてそれぞれのＴ細胞受容体はある特異的Vα領域およびある特異的Vβ領域を含む先行する請求項のいずれかに記載の方法。９．前記Ｔ細胞受容体のそのサブセットはあるサブセットであってここにおいてそれぞれのＴ細胞受容体はある特異的Ｊ領域を含む請求項８記載の方法。１０．前記Ｔ細胞受容体ｍＲＮＡのその量が定量ＰＣＲを使って決定される請求項２〜９のいずれかに記載の方法。１１．前記定量ＰＣＲは逆転写競合ＰＣＲ(ＲＴ−ＰＣＲ)である請求項１０記載の方法。１２．前記Ｔ細胞受容体陽性Ｔ細胞の数又はＴ細胞受容体陽性Ｔ細胞の数がある特異的サブセットにおいてある特異的Ｔ細胞受容体又はＴ細胞受容体のある特異的サブセットに結合する抗体を使って決定される先行する請求項のいずれかに記載の方法。１３．前記抗体はある特異的Vβ領域抗体である請求項１２記載の方法。１４．前記抗体はある特異的Vα領域抗体である請求項１２記載の方法。１５．前記特異的サブセットにおける特異的Ｔ細胞受容体陽性Ｔ細胞の数又はＴ細胞受容体陽性Ｔ細胞の数が、特異的Ｔ細胞受容体ＤＮＡの量又はＴ細胞受容体ＤＮＡをある特異的サブセットにおいて定量することによって、ステップ(１)で得られるその試料中において決定される請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。１６．前記特異的ＤＮＡのその量は定量ＰＣＲを使って決定される請求項１５記載の方法。１７．前記定量ＰＣＲは競合ＰＣＲである請求項１６記載の方法。１８．ある抗原仲介疾患を有するある患者を処理する方法であって、その方法は請求項１の方法に関するある抗原仲介疾患に関連するある抗原応答Ｔ細胞を同定すること（ａ）及びこの疾患を改善するために選ばれたある試薬の効果的な量をその患者投与すること（ｂ）を含む。１９．前記試薬はその抗原に対するＴ細胞応答を減少又は排除する請求項１８記載の方法。２０．前記方法はＴ細胞ワクチン接種又は抗ＴＣＲ抗体処理又はペプチド免疫化を含む請求項１８又は１９記載の方法。