JP2001517958A - Immunological method - Google Patents

Immunological method

Info

Publication number
JP2001517958A
JP2001517958A JP50035099A JP50035099A JP2001517958A JP 2001517958 A JP2001517958 A JP 2001517958A JP 50035099 A JP50035099 A JP 50035099A JP 50035099 A JP50035099 A JP 50035099A JP 2001517958 A JP2001517958 A JP 2001517958A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
specific
cells
cell
antigen
cell receptor
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP50035099A
Other languages
Japanese (ja)
Inventor
アンドリュー ケイ リチャード
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Dundee
Original Assignee
University of Dundee
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of Dundee filed Critical University of Dundee
Publication of JP2001517958A publication Critical patent/JP2001517958A/en
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5047—Cells of the immune system
    • G01N33/505—Cells of the immune system involving T-cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6881—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for tissue or cell typing, e.g. human leukocyte antigen [HLA] probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)

Abstract

(57)【要約】 あるＴ細胞の集団内においてある抗原応答Ｔ細胞を同定する方法であって、その方法は以下のステップを含む。（１）その抗原に応答したＴ細胞を含むある試料を得ること、および（２）ある複数の特異的Ｔ細胞受容体のいずれかに対して個々に又はＴ細胞受容体のある複数のサブセットのいずれかに対して個々に、ある特異的Ｔ細胞受容体をコードしているある遺伝子の発現又はＴ細胞受容体のあるサブセットをコードしている遺伝子の発現が、特異的Ｔ細胞受容体陽性Ｔ細胞ごと又は特異的Ｔ細胞受容体陽性Ｔ細胞サブセットごとに、その抗原に応答しなかったＴ細胞を含むある試料における前記遺伝子のその発現に比較して、増加しているかどうかを決定すること。この方法は、リュウマチ性関節炎のようなある疾患状態に関連する抗原応答T細胞を同定する為に有効である。   (57) [Summary] A method for identifying an antigen-responsive T cell in a population of T cells, the method comprising the following steps. (1) obtaining a sample comprising T cells that responded to the antigen; and (2) individually or against a subset of T cell receptors for any of a plurality of specific T cell receptors. For each, individually, the expression of a gene encoding a specific T cell receptor or the expression of a gene encoding a subset of T cell receptors is altered by the expression of a specific T cell receptor positive T cell receptor. Determining, for each cell or for each specific T cell receptor positive T cell subset, whether it is increased relative to its expression in a sample containing T cells that did not respond to the antigen. This method is useful for identifying antigen-responsive T cells associated with certain disease states, such as rheumatoid arthritis.

Description

【発明の詳細な説明】 免疫学的方法 本発明は、免疫学的方法に関し、特に抗原応答Ｔ細胞を同定する方法に関する 。 Ｔ細胞は、免疫過程の基盤である。それらは免疫反応の広い範囲にわたってレ ギュレーターあるいはエフェクターとしての中心的役割を演じている。それらの 機能は感染あるいは腫瘍への免疫応答における宿主に有益なものであるが、それ は自己免疫疾患、アレルギー及び移植拒絶のような不利益にもなりうる。 これらの応答に対応するＴ細胞の正確な同定は感染及びおそらく腫瘍に対する ワクチンの改良を助けるであろう、そしてＴ細胞過剰反応が疾患原因であるそれ らの疾患において特に標的とされるべき免疫抑制治療を可能にし得るだろう。 Ｔ細胞は、主要組織適合性複合体コード分子［1,2］のコンテクストにおいて それらに提示されるペプチド抗原を認識する。それらは、イデオティピックＴ細 胞受容体（ＴＣＲ）として知られるクローン的に放出されたヘテロダイマーであ る細胞表面によってこれを達成する。ＴＣＲは通常α鎖とβ鎖とからなり、もっ と珍しくはγ鎖とδ鎖とからなる。それらの鎖のいずれもが可変及び不変領域を 有する免疫グロブリン様構造を有する。その不変領域は（その名前が示すように ）いずれの鎖タイプ（即ち、全てのα鎖不変領域が相同的である）においても同 様であるが、その可変領域はそれぞれのＴＣＲにおいて異なる［1,3-5］。 可変領域構造の雑多である範囲が生じるが、それはそれらをコードしている その遺伝子が、互いに不正確に結合したより小さな遺伝子セグメントのランダム な組換えによって形成されるからである。それらのより小さなセグメントは可変 （Ｖ）、雑多（Ｄ）、（β及びδ鎖だけ）及び結合（Ｊ）遺伝子セグメントとし て知られる［６］。そのＴＣＲをコードしている染色体の構造の研究が、５０− ５２機能的ＴＣＲＡＶ（β鎖可変遺伝子セグメント）［7］、少なくとも７０Ｔ ＣＲＡＶ（α鎖可変遺伝子セグメント）［8‐14］、５７ＴＣＲＡＪ（α鎖結合 遺伝子セグメント）［15］が存在することを明らかにしている。多数のそれらの より小さな遺伝子セグメント、それらのランダム組換え及び結合時により多様性 を作る不正確な機構が与えられたならば、そのＴＣＲのレパートリーは、偶然の 停止コドンあるいはフレーム外冗長性を係数に加えたとして［16‐18］１０15と １０18の間の異なる受容体が存在し得ると見積もられている。そのヒトβＴ細胞 受容体座位の完全な６８５キロベースＤＮＡ配列は知られている（Rowen.et al （1996）Science 272、1755‐1762）。その配列及び注釈はそのゲノム シークエ ンス データ ベースにおいて承認番号Ｌ３６０９２、Ｌ３６１９０及びＵ０３１ １５として蓄積されている。 刺激抗原あるいは応答ＴＣＲの構造がわかっているときには、抗原応答Ｔ細胞 の同定は比較的簡単である。不幸にも、主要な診療状況においてはそのどちらも 知られていない。 抗原−応答Ｔ細胞を同定することを主張する方法が既に記載されており、そし て“免疫組織化学”及び“分子生物学”アプローチとして広く分類され得るもの である。 二つの異なる免疫組織化学的な方法が取られてきた。その第一のものは、特に ＴＣＲＢＶコード遺伝子生成物を有するＴ細胞の数を計数するためと、活性マー カーと呼ばれる（例えば、ＨＬＡ‐ＤＲ、ＣＤ２５）を有するそれらの細 胞の数を確定するためとの免疫組織化学的技術の使用を含む。これらの全ての技 術はある免疫病変におけるＴ細胞のレパートリーを測定することが推測される。 その抗原に応答しているＴ細胞が増殖するとき、その最大数Ｔ細胞（解剖学的あ るいは疾患基盤のコントロールとの比較において）は、抗原によって分化駆動さ れた細胞であるはずだと推測されている。 私が思うにこの推論は瑕疵がある。あらゆる免疫病変においてＴ細胞のごく少 数の割合のみが抗原特異的であることが知られている［19-21］。その他は受身 的にそこで補充される。ＣＤ４５Ｒ０（記憶）Ｔ細胞性向的に炎症部位に帰着し ［22-24］、そしてその病変におけるＴ細胞のレパートリーは適切な抗原によっ て決定されるだけではなく過去における記憶Ｔ細胞を誘導したことのある抗原に よっても決定される。以前の免疫学的経験の範囲が量的に考慮に入れられること はほとんど不可能であろうし、異なる働き手によって手に入れられた結果の多様 性に対する一つの理由でもある。この方法に付きまとうもうひとつ別の問題は、 ＨＬＡ‐ＤＲとＣＤ２５様の分子が疑いもなく活性Ｔ細胞上において発現されて いるが、抗原に対する特異的対抗体によって必要的には誘導されないということ である。ＣＤ２５の細胞表面発現は、ＩＬ−７［27,28］、腫瘍壊死因子［29］ あるいはＣＤ４０のようなＴ細胞反応性リガンドのようなサイトカインだけでは なくオートクリンあるいはパラクリン様において生産されるインターロイキン− ２（ＩＬ‐II）によっても誘導され得る；ＨＬＡ‐ＤＲはインターフェロン−γ によって同様に活性化制御され得る［31］。他の言葉で言えば、活性免疫障害に おいてそれらが直接に抗体によって刺激されることなくＴ細胞上の‘活性化分子 ’を誘導可能なサイトカインが存在する。それ故、どちらのＴ細胞が抗原によっ て引き出されるかということ及びそちらが受身的にこの方法論を使ったケモカイ ンによって活性化されるのかということを推測することは不可能である。 この分子生物学的方法は、特異的部位または特異的病変において発現している ＴＣＲ ｍＲＮＡのスペクトルを計数することと、これを他の部位またはコント ロール個体におけるＴＣＲ ｍＲＮＡと比較することとを含んでいる。ポリメラ ーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）に大幅に依存しているこれを成し遂げるた めに様々な技術が使われている［32］。計数の条件において最も信頼のある技術 は逆ＰＣＲまたはアンカーＰＣＲである。ファミリー特異的ＰＣＲのような他の 二次定量技術も使われてきている。この方法は本質的に免疫組織化学の方法と同 様である、しかし全てのそのＴＣＲＢＶ遺伝子が現在は知られているので、それ は今日までより限られた範囲の抗−Ｖβモノクローナル抗体を用いて達成可能で あったものよりもっと完全である。 ＴＣＲ ｍＲＮＡレベルが特異的Ｔ細胞数に近いことが前もって仮定されてい るが、これが正しいものであるためには二つの基礎的な仮定も正しくなければな らない。すなわち、（１）全てのＴＣＲ遺伝子が同じ割合で転写されるべきであ ること、及び（２）Ｔ細胞が刺激され得たときの遺伝子転写が多様であってはな らないことである。以下においてより詳細に議論されるように、私のデータはそ れらの仮定の両方が間違っていることを提示している。 ＴＣＲはＭＨＣ分子のコンテクストにおいて提示される抗原ペプチドに対して 精巧な特異性を示すことができる。しかしＴＣＲのペプチド／ＭＨＣ複合体に対 する親和性は低くそしてその相互作用におけるそのオフ−レイトは高い［33-35 ］。さらにこの明かなパラドックスを複雑にするのは、１００ペプチド／ＭＨＣ 程度の少数複合体がおそらく完全に特異的Ｔ細胞を誘起するために必要であると いう事実、及びペプチド／ＭＨＣ維持ＴＣＲ複合体接触が活性化への完全Ｔ細胞 拘束が必要とされるという事実である［36‐38］。 最新のデータは、そのＴ細胞が比較的小数のその抗原提示細胞（ＡＰＣ’ｓ） のＭＨＣ／ペプチド複合体と数万の自身の表面ＴＣＲによって接触しながら順次 その抗原提示細胞の表面を移動するためにその細胞骨格を使用するということを 提起している［38‐40］。 通常一定の細胞表面ＴＣＲ［41,42］の再利用がある、しかし抗原誘発に続く リン酸化の後にその受容体は内在化され分解される［43-45］。幸運にも２つの 別のＴＣＲを有するＴ細胞クローンを使った研究が、変わらない表面濃度におい てその非活性ＴＣＲが持続するのに抗原結合受容体がその細胞表面から抑制制御 されるということを示した［46］。 毒性−ショック症候群にかかっている患者においてＴＣＲＢＶ ｍＲＮＡの２ 次定量測定が、そのｍＲＮＡレベルが短期間に急激に上昇し、上手く治療されな がらこの病気に罹ってからの約３ヶ月以内にコントロールレベルに落ち着いたと いうことを示した。この毒性ショック症候群毒（ＴＳＳＴ‐1）はＴＣＲＢＶ２ がコードされたＴＣＲに対して超抗原特異的である［47,48］。ＴＣＲ Ｖβ ｍ ＲＮＡは、“特異的Ｔ細胞ごと”に基づいて測定されるのではない。 スタピロコッカス及びストレプトコッカス放出ＴＳＳＴ‐1用超抗原による病 気である川崎病において、個々のＴ細胞によって生産されるＴＣＲＢＶ２Ｓ１ｍ ＲＮＡの割合はこの病気の短期間に上昇しそして治療後にはコントロールレベル に位置していた。対称的に、その同じ働きにおいて、in vivoにおいてＴ細胞が ＳＥＢ（異なるＴＣＲＢＶ１２ｍＲＮＡ特異的超抗原）で治療された後ではＴＣ ＲＢＶ１２ ｍＲＮＡの生産割合は変わらないことが示された。しかしながら、 そのｍＲＮＡ生産割合が一定のようであっても、この治療後は細胞数とｍＲＮＡ レベルの両方が割合的に上昇する［49,50］。特異的Ｔ細胞毎の特異的ＴＣＲ ｍ ＲＮＡ生産における測定の上昇は、その刺激抗原および応答ＴＣＲが知られてい ない時、一般に抗原応答Ｔ細胞を同定するために使われ得るという提案とはなら ない。 Duchmann等は（1993）DNA and Cell Biol．12，217‐225において言われると ころによれば逆転写（ＲＴ）‐ＰＣＲによるＴＣＲ Ｖβサブファミリー測定の ための定量方法を記載しているが、しかし特異的Ｔ細胞ごとにＴＣＲ ｍＲＮＡ が測定されているわけではない。 特に刺激抗原及び応答ＴＣＲが知られていない場合において、抗原応答Ｔ細胞 (または抗原応答に含まれるその特異的ＴＣＲ)を同定するための方法に対する必 要性は残っている。 本発明の一つの目的は、刺激抗原が知られていない時及び抗原応答にかかわる 特異的Ｔ細胞又はＴＣＲについて全くあるいはほとんど糸口のない時に、ある抗 原応答において抗原応答Ｔ細胞または特異的ＴＣＲの同定を可能とする方法を提 供することである。 この方法は、抗原仲介疾患に関わるＴ細胞(及びＴ細胞受容体；ＴＣＲ)型を同 定するために有効である。アレルギー、自己免疫疾患、同系移植組織片(allogra ft)拒絶及び許容、寄生病のようないくつかの感染症、及びいくつかのガンなど のような多くのヒトの疾患が抗原駆動Ｔ細胞に関わっていると信じられている。 これらの疾患は例えば多発性硬化症、農夫肺、枯草熱、湿疹などを含む。 わたしは、抗原誘起中にその細胞表面から失われてしまったその受容体を置き 換えるために抗原刺激の後にＴＣＲ遺伝子発現を増加することを提案している。 出版されたデータが提起するように完全活性にＴ細胞をコミットするためにはほ ぼ半分の細胞表面のＴＣＲが抗原に結合することが要求される(及び、それ故に リン酸化と内在化される)が［46］、私はこの機構がおそらく通常の Ｔ細胞機能に対して有効であると提案する。 サイトカインによるＴ細胞の活性化は細胞表面のＴＣＲの分解を含まないであ ろうが、私はＴＣＲ特異的ｍＲＮＡ生産率の測定があらゆる免疫プロセスの中で 受身的補充／受身的活性化Ｔ細胞と抗原特異的Ｔ細胞エフェクターとを分別する ための特に適切な方法であると提案する。典型的には,ｍＲＮＡ合成率が所定時 間中（例えば、抗体のそのＴ細胞との接触とそのｍＲＮＡが測定される時間との 所定時間がある）測定され、そしてそのｍＲＮＡ合成率ははある所定時間におけ る合成されたｍＲＮＡの量に同等である。抗原仲介プロセスを含む慢性病はＴ細 胞に対する抗原の慢性的存在が関わると信じられている。これらの状況において 、合理的にＴ細胞がコンスタントに抗原によって誘起されつづけていると推測さ れ得る。 本発明の方法に係る好ましい実施例において、特異的Ｔ細胞ごとの特異的ＴＣ Ｒ ｍＲＮＡ精製の測定は抗原刺激及び特異的Ｔ細胞数またはｍＲＮＡのいずれ かのみの測定ではないことを示す。診療上、多量のＴ細胞活性化が起こるところ で（例えば、毒性ショック症候群において）、特異的細胞あるいはｍＲＮＡのい ずれかの定量化又は特異的抗原へのＴ細胞応答を決定するためには十分かもしれ ない（それはどちらのＴ細胞サブセット（特異的Ｖβ）でありどちらがあなたの 探している超抗原であるかを知るためには役に立つけれども）。しかしながら、 それらの方法は（例えば、特異的Ｔ細胞数を測定することまたは特異的Ｔ細胞受 容体ｍＲＮＡを測定すること）より微妙な状況において又は従来のように処理さ れた抗原（広範な主要性）がリスポンシブルしているときにおいて、抗原誘起細 胞を同定しないだろう。 本発明の第一の側面は、あるＴ細胞の集団内においてある抗原応答Ｔ細胞を同 定するある方法を提供する。その方法は以下のステップを含む。 （１）その抗原に応答したＴ細胞を含むある試料を得ること。 （２）ある複数の特異的Ｔ細胞受容体のいずれかに対して個々に又はＴ細胞受 容体のある複数のサブセットのいずれかに対して個々に、ある特異的Ｔ細胞受容 体をコードしているある遺伝子の発現又はＴ細胞受容体のあるサブセットをコー ドしている遺伝子の発現が、特異的Ｔ細胞受容体陽性Ｔ細胞ごと又は特異的Ｔ細 胞受容体陽性Ｔ細胞サブセットごとに、その抗原に応答しなかったＴ細胞を含む ある試料における前記遺伝子のその発現に比較して、増加しているかどうかを決 定すること。 抗原刺激に続く特異的ＴＣＲ遺伝子発現においてその上昇はあらゆる適切な方 法を使って決定されて構わない。典型的には、ＴＣＲ遺伝子発現に続いて、ｍＲ ＮＡが合成されそしてｍＲＮＡがポリペプチドに翻訳される。ｍＲＮＡ合成を同 定するためのあらゆる手順が利用されて構わない、そしてｍＲＮＡは比較的不安 定なのでそのｍＲＮＡの特定時間以上の量の測定はおそらく新しいｍＲＮＡの合 成の合理的な概算である。ポリペプチドは一般にｍＲＮＡよりも安定であり、そ して典型的には特異的ＴＣＲポリペプチドのその量を測定することが現存ＴＣＲ ポリペプチドと新たに合成されたＴＣＲポリペプチドとを分別しないかもしれな い、しかしながら、新しく合成された特異的ＴＣＲポリペプチドと現存の特異的 ＴＣＲポリペプチドとを分別できる方法が本発明に係る方法として使われても構 わない、けれどももし個々のＴ細胞受容体あるいはＴ細胞受容体のサブセットに 対して特異的ｍＲＮＡが測定されるのならばより好ましい。 この抗原に応答しなかったＴ細胞を含んでいる試料は、以下により詳しく議論 されているようなあらゆる適切コントロール試料であって構わない。特異的 Ｔ細胞受容体をコードしている遺伝子あるいはＴ細胞受容体のサブセットをコー ドしている遺伝子のそのコントロール発現レベルはその試験試料について測定さ れる、典型的には、あるコントロールレベルは特異的Ｔ細胞受容体あるいはＴ細 胞受容体のサブセットそれぞれに対して設定され得る。このようにして本発明に 係る一つの実施例において、その抗原に応答しなかったＴ細胞を含んでいるある 試料におけるあるレベルとその抗原に応答したある試料における特異的遺伝子発 現のそのレベルの比較は事前に別個に決定されているあるコントロール試料にお けるそのレベルとの歴史的比較であるかもしれない、だが勿論もしある実質的に 同一なプロトコルがその試験試料及びそのコントロール試料における遺伝子発現 （例えば、特異的Ｔ細胞受容体ｍＲＮＡ）のレベルを測定するために使用される ならば特に好ましい。 他には、そしてさらに好ましくは、以下に議論されるように、遺伝子発現のそ のレベルのその比較が、採取されそして任意的に同時に分析された試料中におい て測定されることでるかもしれない。 本発明に係る特に好ましい実施例は、Ｔ細胞の集団におけるある抗原応答Ｔ細 胞を同定する方法を提供することであり、その方法は以下のステップを含む。 （１）その抗原に応答したＴ細胞を含んでいるある試料を得ること。 （２）特異的Ｔ細胞受容体のいずれかに対して個々について又はＴ細胞受容体 の複数のサブセットのいずれかに対して個々について、Ｔ細胞受容体に対して特 異的またはＴ細胞受容体のサブセットに対して特異的であるＴ細胞受容体ｍＲＮ Ａの量を、特異的Ｔ細胞受容体陽性Ｔ細胞ごとまたは特異的Ｔ細胞受容体陽性Ｔ 細胞サブセットごとに、ステップ（１）において得られた試料において決定する こと。かつ （３）どちらのＴ細胞受容体ｍＲＮＡが特異的Ｔ細胞ごとにステップ（１）に おいて得られたその試料中で増加したかを、その抗原に応答しなかったＴ細胞を 含んでいる試料中での増加量と比較して決定すること。 一つの好ましい実施例において、ステップ（１）は（ａ）その抗原に応答しな かったＴ細胞を含んでいる試料と（ｂ）その抗原に応答したＴ細胞を含んでいる 試料とを含んでおり、ステップ（３）において試料（ａ）と比較して試料（ｂ） において特異的Ｔ細胞ごとにどちらのＴ細胞受容体ｍＲＮＡが量を増加するかを 決定する。 このように、ある状況においては試料（ａ）及び（ｂ）は採取されそして任意 にその特異的ＴＣＲ ｍＲＮＡ同時に測定され得る、またはある状況では試料（ ａ）は歴史試験試料とされても良い、と考えられる。 便宜上、非誘起Ｔ細胞（すなわち、抗原に応答しなかったもの）に対する特異 的ＴＣＲ遺伝子発現の正常の範囲は正常で健康的な個体への参照によって得られ る。例えば、Ｔ細胞は、適切な数（例えば、８から２０）の正常で健康的な個体 から採血することによって及びそのＴＣＲ ｍＲＮＡ分子を、研究したい特異的 ＴＣＲ遺伝子またはＴＣＲの特異的サブセットごとに対して測定することによっ て得ることができる。 例えば、実施例１において研究される４つの個体において、細胞ごとのＴＣＲ 特異的ｍＲＮＡ分子の数における個体ごとの多様性はＴＣＲＢＶ２Ｓ１とＴＣＲ ＢＶ３Ｓ１（図４と５）では大きくはない。対象の抹消血液（ＰＲＥ試料）から 得られた新鮮なＴ細胞と、実施例１に記載されるようなRPMI１６４０と１０％加 熱培養ウシ胎児血清（ＣＯＮ試料）の存在下において３日間培養され た同様の細胞との間での細胞ごとの特異的ＴＣＲ ｍＲＮＡ分子の数にほとんど 多様性は無いことが示されているはずである。このように、このコントロール試 料は培養中の適切なＴ細胞由来である。 抗原誘起Ｔ細胞についての発現範囲を確定することは有益である。抗原誘起Ｔ 細胞における細胞ごとの特異的ＴＣＲ ｍＲＮＡ分子の多数についての範囲は、 培養中において例えば超抗原と抗−Vβ−特異的モノクローナル抗体あるいは抗 ＣＤ‐3抗体のいずれかにより誘起されるそのＴ細胞によって引き出し得る。こ の最後の誘起の方法はin vitroにおいて従来の抗原と重なる条件に近づけること が考えられる。再び、もし適切な数（例えば、８から２０）の正常個体がＴ細胞 源として使用されるならば、細胞ごとに誘起されるＴＣＲ ｍＲＮＡ分子につい ての範囲が得られ得る。 もしＴＣＲＢＶ−特異的疾患にかかっている患者の多数がその疾患にかかって いる間及び再び彼等が順調に回復したときにおいて調査されるならば、細胞レベ ルごとの誘起されたＴＣＲ ｍＲＮＡに対する範囲はin vivoにおいて得られるか もしれない。以下においてさらに詳しく議論されるように、例には毒性ショック 症候群または川崎病におけるＴ細胞ごとのＴＣＲＢＶ ｍＲＮＡレベルを含んで いる。 本発明の方法は特異的抗原応答Ｔ細胞を同定するために使用されても良く、又 特異的抗原応答において関わるＴ細胞のサブセットを同定するために使用されて も良い；例えば、この方法は、ある共通のＶβセグメントあるいはある共通のＶ αセグメントあるいはその組み合わせを含むいずれかのあるＴ細胞受容体サブセ ットを同定するために使用されても良い。しかしながら、ある抗原応答に関わる Ｔ細胞のより小さいサブセットが、例えば最初にその特異的Ｖβセグメントを、 続いてその特異的Ｖβ−Jサブセットを、さらに続いてその特異 的Ｖαサブセットを、その後にその特異的Ｖα−Jサブセットを、そしてそのＴ ＣＲの特異的Ｖβ−J／Ｖα−Jサブセットを同定することによって、同定しうる 。 この方法は、ある抗原応答Ｔ細胞とそれ故ある病状に関連のある特異的Ｔ細胞 受容体型を同定するのに特に有用である。Ｔ細胞の集団は、例えば哺乳類由来の Ｔ細胞といったあらゆる適切なＴ細胞の集団でありうる。もしこのＴ細胞の集団 が人の患者由来のものであれば好ましい；特にもしそのＴ細胞の集団がある人の 患者におけるある疾患に関連するＴ細胞のある集団であれば好ましい。 便宜上、この抗原に応答しなかったＴ細胞を含んでいるその試料（“試料（ａ ）”）はある個体の非疾患部位から得られたものであり、そしてその抗原に応答 したＴ細胞を含んでいるその試料（“試料（ｂ）”）はある個体のある疾患部位 から得られたものである。例えば、試料（ａ）はある患者の非疾患滑液試料から 得られてもよいことを考慮すれば試料（ｂ）は同じ患者の由来リュウマチ性関節 炎の兆候を示している関節の滑液試料から得られても良い。この様に、本発明の 方法を使いながらリュウマチ性関節炎に関連する抗原応答Ｔ細胞が同定されるか もしれない。 しかも便宜上、この抗原に応答しなかったＴ細胞を含んでいるこの試料（“試 料（ａ）”）はある非疾患個体から得られたものであり、この抗原に応答したＴ 細胞を含んでいるこの試料（“試料（ｂ）”）はある疾患個体から得られたもの であって構わない。例えば、試料（ａ）はある健康なコントロール個体あるいは 回復期の川崎病患者及び試料（ｂ）は急性川崎病の患者から得られたものでも構 わない。 いくつか状況において抗原に応答しなかったＴ細胞を含んでいるその試料は in vitroにおいてその抗原（それはおそらくある疾患原因エージェントの形であ る）と接触されていないある個体から得られたある試料であると認められるだろ う。例えば、その試料はある微生物でin vitroにおいて処理された、またはin v ivoにおいてある微小生物から得られた抗原またはその混合物で処理されたある 個体由来のＴ細胞含有試料でも良い。例えば、Ｔ細胞のその集団は、スタピロコ ッカル エンテロ トキシンＢ(staphylococcal enterotoxin B)（ＳＥＢ；ある 超抗原）で処理されたある末梢血試料から得られた白血球でも良い。 その方法はその疾患関連抗原が知られているときにはある集団内である抗原応 答Ｔ細胞を同定するために使用されても構わないけれども、もしその抗原あるい はある疾患に関連する抗原が知られていないときにはあるＴ細胞の集団内である 抗原応答Ｔ細胞を同定するために使用されるならば特に好ましい。その方法はあ る超抗原に応答するあるＴ細胞を同定するために使用されても構わない、しかし もしある従来の抗原に応答するあるＴ細胞を同定するために使用されるならばよ り好ましい。 超抗原は、典型的には多数のバクテリアまたはウィルスのタンパク質生成物で ある。従来の抗原に見られる名前と比較するとそれらの名前は多数のＴ細胞を刺 激するためのそれらの能力に由来している。それらは、多数の方法において従来 の抗原とは異なっている。 超抗原は不活性たんぱく質として機能する。従来の抗原は一般に８から１２ア ミノ酸長の小さなペプチドでありある抗原提示細胞によって巨大たんぱく質の内 在化とタンパク分解から得られる。 超抗原は、抗原提示細胞のその表面上に主要組織適合性複合体クラスII分子 のその‘ペプチド結合グローブ’の外側に結合する。従来の抗原ペプチドはその クラスII分子内のこのグローブ中に位置する。 一般に超抗原は第４超可変領域と呼ばれるＴ細胞受容体のそのβ鎖のある特異 的領域に結合する。これはＴＣＲＢＶ遺伝子セグメントのみによってコードされ る。このＴＣＲαとＴＣＲＢＪ遺伝子セグメントの構造は超抗原結合の親和性に 影響を与えることにおいてマイナーな役割を演じている。従来の抗原は、そのα とβＴＣＲ鎖の両方の相補性決定領域（特に、Ｖ‐(Ｄ)‐Ｊ遺伝子セグメント組 換え及びＮ領域付加によって形成されるＣＤＲ３）によって認識されると考えら れている。(Kay R.A．（1995）Clin．Exp．Immunol．100，4‐6；とHerman A.， et al（1991）Annu．Rev．Immunol．9，745‐772)。 多くの疾患において一つ以上の疾患関連抗原が存在するかもしれないというこ とおよびそれ故あるＴ細胞の集団内に一つ以上の抗原応答Ｔ細胞型が存在するか もしれないということが認められるかもしれない。この方法は、ある疾患関連抗 原に対応する抗原応答Ｔ細胞ごとに同定することにおいて有用であると信じられ ている、しかし特にこの方法は特異的Ｔ細胞ごとのその特異的Ｔ細胞受容体ｍＲ ＮＡ生産が最も高いところにおいて抗原応答Ｔ細胞を同定するのに適していると 認められるであろう。 Ｔ細胞を含んでいるその使用はあらゆるＴ細胞を含んでいる適切な試料であっ てかまわないということが認められるだろう。便宜上、この試料は抹消血液の試 料または骨髄の試料であるが、しかしそれはＴ細胞を有するある個体からの試料 でも構わない。in vitroで培養されているある個体由来の試料が使われても構わ ない。 本発明に係るある好ましい実施例において、Ｔ細胞受容体はあるサブセット である、ここにおいていすれかのＴ細胞はある特異的Ｖβ領域またはセグメント を含んでいる。このそのＴＣＲ ｍＲＮＡの特異的Ｖβ領域またはセグメントは その特異的VβセグメントｍＲＮＡにハイブリダイズするある特異的核酸プロー ブを使って認識しても良い。ある特異的Ｖβセグメントを含んでいるｍＲＮＡの 量を同定及び定量するためのあらゆる便利なあらゆる方法が使われて構わない、 例えば特異的なｍＲＮＡまたはｃＤＮＡを検出するための“チップ”ハイブリダ イゼーション法が使われても構わない。以下により詳しく記載されているように ポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）が使われることは特に好ましい； さらに好ましくはある定量ＰＣＲ法が使用されることである。ＰＣＲはＤＮＡの 鋳型に依存しているので、そのＰＣＲ手順に前もってまたはその間にＴＣＲ ｍ ＲＮＡがｃＤＮＡに転写されるべきことが理解されるだろう。 ｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成するための方法は学術的に良く知られており、典 型的にはあるオリゴヌクレオチドプライマーをｍＲＮＡにハイブリダイズさせて デオキシヌクレオチドと逆転写酵素とを使ってＤＮＡを合成することを含む。ポ リメラーゼチェインリアクションを実行するための方法を学術的に良く知られて いる。ｃＤＮＡ合成の方法とＰＣＲ方法は、ここでは参照に組み込まれているSa mbrook et al（1989）Molecular cloning，a laboratory manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor Laboratory，New York，に記載 されている。 更なる本発明に係る好ましい実施例において、Ｔ細胞受容体のサブセットはあ るサブセットであって、ここではそれぞれのＴ細胞受容体がある特異的Ｖα領域 またはセグメントを含んでいる。このＴＣＲ ｍＲＮＡのこの特異的Ｖα領域は との特異的ＶαセグメントｍＲＮＡとハイブリダイズするある特異的核酸プロー ブを使って認識されても構わない。ＴＣＲ ｍＲＮＡを含んでいるそ の特異的Vαセグメントを同定及び定量するための類似の方法が、ＴＣＲ ｍＲＮ Ａを含んでいるその特異的Vβセグメントを同定及び定量するための方法に使わ れても構わない。 ＴＣＲｍＲＮＡに転写あるいはスプライシングされるＴＣＲ遺伝子のセグメン トに対してだけではなくβ鎖可変遺伝子セグメント（ＴＣＲＢＶ）及びα鎖可変 遺伝子セグメント（ＴＣＲＡＶ）及びα鎖結合遺伝子セグメント（ＴＣＲＡＪ） の多くについてヌクレオチド配列情報は利用可能である。この情報のほとんどは 、Gen Bank及びEMBLのような公共で可能なヌクレオチド配列データベースから利 用可能である。特に、そのヒトβＴ細胞受容体座の完全な６８５kbDNA配列は知 られている(Rowen et al（1996）Science 272，1755‐1762)。その配列及びその 注釈はそのGenome Sequence Data Baseにおいて認証番号L３６０９２、L３６１ ９０及びUO３１１５、として蓄積されており、ここにおいて全て参照に含まれて いる。特異的Vβ、Vα及び他のＴＣＲ遺伝子セグメントを測定するための適切な プローブ及びプライマーは、そのＴＣＲ遺伝子に対して一般に利用可能な配列か ら得られている。もしＴ細胞受容体ｍＲＮＡの量が定量ＰＣＲを使って決定され るならば好ましい；そして特にその定量ＰＣＲ方法は逆転写競合ＰＣＲ（ＲＴ‐ ＣＰＣＲ）であることが特に好ましい。逆転写競合ＰＣＲ(ＲＴ−ＰＣＲ)は以下 に詳しく記載されている：Kohsaka et al（1993）Nucl．Acids Res．21，3469‐ 3472およびTaniguchi et al（1994）J．Immunol．Methods 196，101‐109，とも に個々における参照に含まれている。 ＰＣＲによるあらゆる特異的ＴＣＲ遺伝子セグメントの測定に対して少なくと も一つのＴＣＲ遺伝子セグメント特異的オリゴヌクレオチドプライマーが必要で ある。特異的ＴＣＲ遺伝子セグメント含有ｍＲＮＡの定量は、いずれもがその特 異的ＴＣＲ遺伝子セグメント内でハイブリダイズするある１対のＰＣＲプライマ ーを使って実行されても構わないが、もしその特異的ＴＣＲ遺伝子セ グメント内でハイブリダイズするまたはその他のプライマーがゲノミックＤＮＡ においては(例えば、あるイントロンによって)分断されているそのｍＲＮＡ（ｃ ＤＮＡ）に近いＴＣＲ ｍＲＮＡのあるセグメントにハイブリダイズするのであ れば便利である。この方法は実質的にあらゆる含有ゲノミックＤＮＡの増幅を妨 げる；そして、それ故その方法はＴＣＲ ｃＤＮＡ／ｍＲＮＡとＴＣＲゲノミッ クＤＮＡとを分別するために有用である。 ＴＣＲ ｍＲＮＡにおいて特異的Vα及びVβセグメントを同定するための適切 なＰＣＲプライマーはWilliams et al（1992）J．Clin．Invest．90，326‐333 に記載されており、ここでは参照に含まれておりかつ図６に示されている。ここ で参照に組み込まれているMargurie et al（1992）Immunology Today 13，336‐ 338はＴＣＲ ｍＲＮＡを分析するためのＰＣＲベース方法に言及している。 一度ここにおいて記載されるようにその特異的Vβサブセットが決定されてい ると、特異的Ｊセグメント特異的Vβとの組み合わせを同定することが好ましい 。これは、例えばあるVβ特異的オリゴヌクレオチドをあるＰＣＲ反応における あるＪセグメントのいずれかに対して特異的なあるオリゴヌクレオチドとともに 使うことによって、実行されても良い。同様に、一度ここに記載したようにある 特異的Ｖαサブセットが決定されると、Ｊセグメントとの組み合わせはＶα及び Ｊ特異的オリゴヌクレオチドとともにＰＣＲを使って同定されうる。 特異的Ｖγ及びＶδセグメントは例えばＣγ特異的オリゴヌクレオチドと組み 合わせにおける特異的Ｖγセグメントを指向するオリゴヌクレオチドを使うこと によってあるいはＣδ特異的オリゴヌクレオチドとの組み合わせにおける特異的 Ｖδセグメントを指向するオリゴヌクレオチドを使うことによっても同定されて も構わないということが認められるであろう。特異的Ｖγ及びＶδセ グメントと特異的Ｊセグメントの組み合わせは例えば、あるＰＣＲ反応における 適切で選択的なオリゴヌクレオチドを使うことによるＶα−Ｊ及びｖβ−Ｊに対 するようなものと同様の方法を実質的に使うことにより同定しうる。 ある特異的サブセットにおける特異的Ｔ細胞受容体陽性Ｔ細胞の数またはＴ細 胞受容体陽性Ｔ細胞の数はあらゆる適切な方法を使うことによって決定されて良 い。従来は、そのＴＣＲの特異的Ｖβセグメント及び特異的Ｖαセグメントに対 して特異的な多くの抗体が利用可能であったので、ある特異的Ｔ細胞受容体にま たはＴ細胞のある特異的サブセットに（例えば、そのＴ細胞受容体のある特異的 Ｖβセグメントに）結合する抗体を使うことでその決定がされている。特異的Ｖ β及びＶα鎖に対して指向するモノクローナル抗体が容易に利用できる。 Endogenは以下の抗体を売っている(Bradsure Biologicals Ltd，67a Brook St reer，Shepshed，Loughborough，Leics 9RFによって配布されている)：抗体：V β３.１，Vβ５a，Vβ５c，Vβ６.７a，Vβ７.１，Vβ８，Vβ８b，Vβ１２，V β１３，Vβ１７，Vα２，Vα１２.１，Vγ４，Vγ９，Vδ１，Vδ２，Vδ１−J １。 同様に、Immunotechは以下の抗体を売っている(Coulter Electronics Ltd,Nor thwell Drive,Luton,Beds LU3 3RHによって引き継がれている)：抗体：Vδ１，V δ２，Vδ３，Vγ１，Vγ９，Vα２４，Vβ１，Vβ２，Vβ３，Vβ５.１，Vβ５ .２，Vβ５.３，Vβ６.１，Vβ８.１とVβ８.２，Vβ９，Vβ１１，Vβ１２，V β１３.１，Vβ１３.６，Vβ１４，Vβ１６，Vβ１７，Vβ１８，Vβ２０，Vβ ２１.３，Vβ２２.１を除いたγδ。 加えて、特異的Ｔ細胞受容体に対するモノクローナル抗体は特異的ヒトＴ細胞 腫瘍ラインに対してマイスを免疫化させること、マウスＢ細胞ハイブリドー マを作ることそして学術的に良く知られた方法を使ってその標的細胞ラインと異 なるヒトＴ細胞腫瘍ラインの両方に対して生産されるマウス抗体をスクリーニン グすることによって作られても良い。この方法において、選択されたそのハイブ リドーマ クローンはおそらく抗ＴＣＲ特異的モノクローナル抗体を生産するか もしれない。第２の方法はあるマウスＴＣＲのそのβ鎖上そのＶ領域をあるヒト Ｖβ領域により置換すること及び免疫マイスに作らさせたその細胞系を使うこと である，この方法において、ヒトVβ鎖を指向するモノクローナル抗体は生産さ れても良くそしてそのバックグラウンドスクリーニングの多くは除去されそして 標的のほとんどの範囲は生産されうる。可溶性ヒトＴＣＲは生産することが現在 可能なので、それらはこの技術分野において良く知られた方法を用いるVβ及びV αターゲットに対する更なるモノクローナル抗体を作るためのターゲットとして 使用されても良い。 特異的Ｔ細胞受容体陽性Ｔ細胞の数の定量は既知の方法を使って行われ得る。 例えば、その抗体は蛍光的に標識されても良くそしてその細胞は分別されその後 蛍光活性化細胞分別機(FACS)を使ってカウントされても良い。適切には、その抗 体は、例えばフルオロセインイソチアネート（ＦＩＴＣ）といったあらゆる便利 な蛍光物質によって標識される。 他には、しかしさらに好ましくは、ある特異的サブセットにおいてＴ細胞受容 体陽性Ｔ細胞の数又はＴ細胞受容体陽性Ｔ細胞の数がそのＴ細胞集団のゲノミッ クＤＮＡを分析することによって決定され得るということである。体内において 移転されていない特異的Ｔ細胞ＤＮＡが、ｍＲＮＡに対するのと同様の方法にお いて定量され得る。非移転及び移転ＴＣＲ遺伝子を分別するであろうあらゆる方 法が、特異的Ｔ細胞の数を決定するために使用されても構わない。 あるＴ細胞受容体に対して特異的又はＴ細胞受容体のあるサブセットに対し て特異的であるＴＣＲ ｍＲＮＡの数をその試料中で一度計数されてしまい、そ してある特異的サブセットの特異的Ｔ細胞受容体陽性Ｔ細胞又は特異的Ｔ細胞受 容体陽性Ｔ細胞の数が一度計数されてしまえば、特異的Ｔ細胞ごとの特異的ＴＣ Ｒ ｍＲＮＡ種の数は計算される。 これは、その抗原に応答しなかったＴ細胞を含んでいるある試料及びその抗原 に応答したＴ細胞を含んでいるある試料のいずれかに対して実行される。その比 較はその試験試料とあるコントロール試料との間において行われて良く、ここに おいてそのコントロール試料はある歴史的コントロール試料または別の健康な個 体またはそのコントロール試料が採取された個体におけるある非疾患部位から任 意に採取された試料である。 特異的Ｔ細胞ごとの特異的Ｔ細胞受容体ｍＲＮＡの量の増加は、ある抗原応答 Ｔ細胞であるその特異的Ｔ細胞(Ｔ細胞受容体またはＴ細胞受容体のサブセット) の表示するものである。 ある抗原応答を表示する特異的Ｔ細胞ごとに特異的Ｔ細胞受容体ｍＲＮＡの量 の増加は、その特異的抗原及びその特異的ＴＣＲまたはＴＣＲサブセットに応じ て多様になる。 典型的には、約２以上の上昇はある特異的Ｔ細胞を表示するものであり、しか しその上昇はおそらく１０以上または１００以上でありそして１０００以上かも しれない。 先に記載したように、ＴＣＲ遺伝子発現の通常の範囲は特異的Ｔ細胞またはＴ 細胞の特異的サブセットについて決定される。好ましくは、特異的Ｔ細胞ごとの 特異的Ｔ細胞受容体ｍＲＮＡの量に置けるある上昇はある抗原応答を表示するも のであるが、その上昇が確実的に十分であれば、少なくとも１くらい、 好ましくは少なくとも２であり、さらに好ましくは少なくとも３またはそのコン トロール(すなわち、非刺激状熊における発現の通常の範囲)レベルより上の標準 偏差以上であるのが条件である。 この方法は、このＴ細胞型がある特異な抗原仲介疾患に関連しているかを決定 するためには特に有効である。ある優性Ｔ細胞型はある疾患のプロセスに関わっ ているいくつかの状況において、そして例えばその同じＴ細胞型が個体の多数に おいてその疾患に関連している。このように、ある特異的な疾患の個体の多数に おいて関連しているＴ細胞型を同定することにおいてならばその方法は有効であ る。しかしながら、ある個別の患者におけるある特異的疾患に関連しているその 特異的Ｔ細胞型を決定するために個別の患者に対して使用することにこの方法は 特に適している。個別の患者の治療はその疾患に関連するその患者のＴ細胞型に 依存して仕立てられてもよいということが認められるであろう。 本発明にかかる更なる一面はある患者を治療するある方法を提供するが、ここ においてその患者はある抗原仲介疾患を有しており、その方法は以下のものを含 む（ａ）本発明の第１の側面に係る方法に応じてある抗原仲介疾患に関連するあ る抗原応答Ｔ細胞を同定すること（ｂ）その疾患を改善するある試薬の効果的な 量をその患者に投与すること。 その疾患を改善するその試薬は典型的にはその抗原に応答するＴ細胞を減少ま たは排除する試薬である。 一度、ある特異的Ｔ細胞受容体またはＴ細胞受容体のサブセットの相同性を本 発明に係る方法を使って抗原仲介疾患に関連するように決定してしまえば、その 疾患を改善するある試薬が選択されるかもしれない。例えば、ある特異的 Vβセグメントを指向するモノクローナル抗体は有効かもしれないまたある特異 的VβセグメントのあるＣＤＲから得られるペプチドも有効かもしれない。実験 的な自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）、人条件多発性硬化症のある動物モデルが、自 己免疫疾患における抗Ｔ細胞治療のその効率を試すための前駆的モデルを提供し た。LewisラットまたはＰＬ／ＪマイスにおけるＥＡＥにおいて、ミエリン塩タ ンパク質（ＭＢＰ）特異的脳脊髄炎Ｔ細胞は高度に機密扱いされていた、Vβ８. ２特異的モノクローナル抗体によって治療に対して成功的に標的とされうるもの であったVα２及びVβ８.２(Heber-Katz & Acha-Orbea，1989)からなる同様のＴ ＣＲを発現させていた一方でである。さらに、弱体化された脳炎遺伝子Ｔ細胞に よるワクチン接種がＥＡＥに対する防御を仲介した(Lider et al，1988)。その Ｖβ８.２ＴＣＲのＣＤＲ２(２次相補性決定領域)から得られるあるペプチドで のラットのワクチン接種が、病原性Ｔ細胞の活性化を阻害した抗−イディオティ ピックＴ細胞及び抗原を誘導しそしてＥＡＥを予防し且つ治療した。そのＣＤＲ ２または他の領域から取られたＴＣＲペプチドが、ＭＢＰ，コラーゲン，熱ショ ックタンパク質及び末梢ミエリンのＰ２たんぱく質に対する特異的病原性Ｔ細胞 の免疫制御を誘導しうることを他の研究が示している、そしてＥＡＥに加えて実 験的な関節炎、神経炎における治療の可能性を示してもいる(Howell et al，198 9;Stevens et al，1991;Kumaar & Sercarz，1993;Gregorian et al，１９９３； Broeren et al，1994;Matsumoto et al，1994;Kuhrober et al．1994;Haqqui et al，1995)。 進行性多発性硬化症でのヒトにおけるあるワクチンのようなあるＴＣＲ由来ペ プチドを使いながら、ある研究がワクチン応答者は免疫反応性を減少させており そして一年間の治療の間じゅう診療的には安定であるということを示しているが 、非応答者はＭＢＰに対する免疫反応性を持ちつづけており且つ診療的には悪化 した(Vandenbark et al，1996)。 Ｔ細胞ワクチン投与受動的抗−Ｔ細胞抗体治療及びペプチド免疫化が知られて いる。例えば、Heber−Katz E.,Acha−Orbea H.(1989)Immunol..Today 10,164‐ 169;Lider O.,et al（1988）Science 239，181‐183;Vandenbark A.A.,et al（1 989）Nature 341，541‐544;Offner H.,et al（1991）Science 251，430‐432;H o-well M.D.，et al（1989）Science 246，668‐670;Stevens D.B.,et al（1991 ）J．Neuroimmu-nol．37，123-129;Kumar V.,Sercerz E.E.(1993)J．Exp．Med． 178，909‐916;Gregorian S.K.，et al(1993)Am．Assoc．Immunol．150，28A;Br oerenc.P.M.,et al(1994)Proc．Natl．Acad．Sci．USA.91,5997‐6001;Matsumot o Y.,et al(1994)Cell．Immunol．153，468‐478;Kuhrober A.,et al（1994）Eu r．J．Immunol.24，1172‐1180;とHaqqui T.M.，et al（1995）Ninth Int．Cong r．Immunol．Abstr．5014，845参照されたい。これらは全て本明細書の一部を構 成する。 このように、本発明はある抗原由来疾患を有するある患者のためのある治療を 選択するためのある方法を含んでいる。 本発明は、以下の図および実施例を参照しながらより詳細に示されるであろう 。ここにおいて、 図１は、天然型及び突然変異体特異的プローブのある比較を示している。 図２は、天然型及び突然変異体特異的プローブに関するその光学密度(ＯＤ４ ５０/６３０)の比較可能性を示している。 図３は、未知のｃＤＮＡ試料のその測定を示している。 図４は、未分離白血球集合におけるVβ３.１ＴＣＲ＋Ｔ細胞によるＴＣＲＢＶ ３Ｓ１ｍＲＮＡ生産物及びＣＤ２５発現のある比較を示している。 図５は、未分離の白血球集合におけるVβ２．１ＴＣＲＴ細胞によるＴＣＲＢ Ｖ２Ｓ１ｍＲＮＡ生産及びＣＤ２５発現のある比較を示している。 図６は、ＴＣＲｍＲＮＡ(ｃＤＮＡ)のＶα及びＶβセグメントの特異的増幅に 対する適切なＰＣＲプライマーの配列を示す。さらに詳しくは、Williams et al （1992）J．Clin．Invest．90，326-333参照されたい。これは本明細書の一部を 構成する。 図７は、培地のみあるいはその超抗原ＳＥＢ又はＴＳＳＴ−１を補われた培地 において３日間培養された後と前における細胞ごとのＴＣＲＢＶ ｍＲＮＡレベ ルを示している。 図８は、抗原誘起Ｔ細胞におけるＣＤ２５発現及び細胞間ＴＣＲＢＶレベルの ある比較を示す。 図９は、培地のみ(ＵｎＲｘ)あるいは抗−ＣＤ２８(ＣＤ)、抗−Ｖβ３．１( Ｖβ)又はその２つ(ＣＤ＋Ｖβ)のある組み合わせを補った培地において培養さ れた白血球から得られた細胞間ＴＣＲＢＶ３Ｓ１ ｍＲＮＡレベルを示す。 図１０は、一日(集合化された)又は８週間(分離された)上であるクローンされ たＴＣＲＢＶ１７Ｓ１配列の１５０００分子の測定を示す。 図１１は、ある単一変異体ＢＶ１７Ｓ１クローンを有する５つの異なるＴＣＲ ＢＶ１７Ｓ１天然型テンプレートの１５０００分子の測定の正確性を示す。 図１２は、ＢＶ１７Ｓ１特異的及びβＰＣＲ５‘プライマーを使って天然型Ｂ Ｖ１７Ｓ１(クローン７)及び変異体ＢＶ１７Ｓ１(１７／２／１７変異体)テンプ レートの測定を示す。 図１３は、それぞれに変異体を有するＢＶ１７Ｓ１天然型テンプレート(クロ ーン１およびクローン７)の測定を示す。 図１４は、天然型ＴＣＲＢＶ１７Ｓ１テンプレートの異なる分子数の測定を示 す。 図１５は、培地のみ(●)又はＰＭＡを補われた(○)培地において４０時間の培 養後のＪａｋａｔ Ｔ細胞に導入された異なるプロモーター−ｐＸＰ２構成物の 相対活性を示す。実施例１：抗原応答Ｔ細胞の同定 抗原が誘起している間にその細胞表面から失われたその受容体を置き換えるた めに、抗原刺激に後にはＴＣＲ遺伝子の発現が増加するということを私は提案し ている。出版されたデータは細胞表面ＴＣＲのほとんど半分が抗原に結合（それ 故リン酸化及び内在化される）ことがそのＴ細胞を十分に活性化するためには必 要とされると提案するが[46]、私はこの機構が通常のＴ細胞機能に対してウィル ス的なものだろうと提案する。 サイトカインによるＴ細胞の活性化は細胞表面のＴＣＲの分解を含まないだろ うが、私はＴＣＲ特異的ｍＲＮＡ生成率の測定が、あらゆる免疫プロセスにおい て抗原特異的Ｔ細胞エフェクターから受身的に補充された／受身的に活性 化されたＴ細胞を分離するための実行可能な方法であることを提起する。 Ｔ細胞受容体(ＴＣＲ)伝達ＲＮＡ(ｍＲＮＡ)をある逆転写競合ポリメラーゼチ ェインリアクション(ＲＴ‐ＣＰＣＲ)によって測定される(例えば、Kohsaka et al（1993）Nucl．Acids Res．21，3469-3472;及びTaniguchi et al（1994）J．I mmunol．methods 169，101-109参照)。この方法において、ある変異体テンプレ ートが異なる濃度で天然型ｃＤＮＡテンプレートの分割量に加えられる、そして その２つの比率はＰＣＲ後の変異体及び天然型特異的オリゴヌクレオチドプロー ブによって決定される。定量は、特異的ＴＣＲ＋ｖｅＴ細胞ごとに発現される特 異的ＴＣＲ ｍＲＮＡの分子数として表される。刺激されていない及び抗原誘起 された細胞の間の遺伝子転写レベルにおける増加は２から１０００倍の間である 。これは異なるＴＣＲＢＶ遺伝子に対して様々である。我々のデータは、ＳＥＢ 駆動ＴＣＲＢＶ３Ｓ１転写はおよそ培地のみにおいては(８．７〜１６１．７倍 の範囲)コントロール培養の３０倍だが、ＴＳＳＴ‐１の存在下においては６． ７倍(３．７〜８．４倍の範囲)に増加すると提起する。私達は、これが誘起の背 景のある真実の実像を表しているのか又はＴＳＳＴ‐１の調整中における混入汚 染あるいはＴＳＳＴ‐１によるＴＣＲα鎖結合を反映しているかどうかは知らな い。ＴＳＳＴ‐１によって特異的に誘起されたとき、ＴＣＲＢＶ２Ｓ１は平均で ２７倍(８．３〜３４９．８倍の範囲)で増加する。培地のみ又はＳＥＢの存在下 でのコントロール培養においてもＴＣＲＢＶ２Ｓ１転写において違いは無いよう である。一度転写レベルがそれぞれのＴＣＲＢＶ遺伝子に対して分かったならば 、複数の抗原誘起Ｔ細胞があらゆる障害におけるあらゆる条件において同定可能 である。もし特異的ＴＣＲＢＶ ｍＲＮＡレベルがαβＴＣＲ鎖ｍＲＮＡのある 百分率として表されたならば、これはその場合ではないかもしれない。 ＲＴ‐ＰＣＲにおける使用に対するＴＣＲＢＶ遺伝子変異体 ＴＣＲＢＶ遺伝子変異体は、天然型ＰＣＲ生成物をＰＣＲｓｃｒｉｐｔのよう なあるベクターに使用者説明書に沿ってクローニングすること及びこのクローン されたテンプレートを変異することによって、製造される。この変異は、Higuch i et al(1988)及びHo et al(1989)の方法に沿って遺伝子ソーイング(gene SOEin g:sequence overlap extension)として知られるあるＰＣＲ基盤方法を使って、 行われる。簡単には、この天然型配列を２つの２等分で且つ別々の反応において 増幅する。その最初の反応はそのテンプレートのその上流半分をその上流のＴＣ ＲＢＶ特異的プライマー及びある変異的下流プライマーを使って増幅する。この 変異的プライマーを変異されるべきその部位のちょっと上側テンプレートにアニ ールして、５’末端にその新しい変異配列の１２から１５塩基対を運ぶ。別に行 われるその２次反応は、そのテンプレートの下半分を増幅する。その下流ＴＣＲ ＢＣ特異的プライマー及びある上流変異的プライマーを利用する。この変異的プ ライマーを変異されるべきその部位のちょっと下側テンプレートにアニールして 、５’末端にその新しい変異配列の１２から１５塩基対を運ぶ，増幅後、半分そ れぞれ精製して天然型テンプレートの無い状態にし、プライマー及びＴａｑポリ メラーゼが同濃度になるように希釈する。 その２つの２分割したものはそこであるＰＣＲ混合物と一緒にＴＣＲＢＶ及び ＴＣＲＢＣ特異的プライマーのみとともに入れられそして‘ホットスターティッ ド’ＰＣＲ反応において増幅される。この２回目の増幅の間、その２つの２分割 物は、それらの重複変異配列の利用によってともにアニールされ、そしてある新 しい変異体テンプレートがＰＣＲプロセスによって作られる。その新しいＰＣＲ 生成物はそこでＰＣＲｓｃｒｉｐｔのようなあるベクターに再クローンされ戻さ れうる、そして誤りの無いクローンが同定されるまで配列決定される。この方法 を使いながら、我々はＣＡＴＣＡＧＡＡＧＣＡＧＡＧＡＴＣＴ ＣＣ配列を、その天然型ＴＣＲＢＣ領域においてＧＡＴＧＴＣＡＡＧＣＴＧＧＴ ＣＧＡＧＡＡ配列を使って、ＴＣＲＡＣ遺伝子のその相当する領域から置き換え た。この変異はその全サイズ、ｄＧ／ｄＣ：ｄＡ／ｄＴ含量又はその元の天然型 テンプレートのそのアニーリングプライマー配列に影響するためにではなく設計 された。その変異されたテンプレートを多数のＴＣＲＢＶ‐特異的ＰＣＲ反応に おいてその天然型テンプレートとして同様の効率で増幅する。遺伝子ソーイング についてのさらに詳しいことは以下の文献を参照されたい、Higuchi R.，et al( 1988)Nucleic Acids Res．15，7351-7367およびHo S.N.，et al（1989）Gene 77 ，51-9。 細胞培養 リンパ細胞は、ある正常な個体からのある抹消血液試料から得られ、そしてペ ニシリン、ストレプトマイシン、グルタミン及び１０％（v/v）熱非動化ウシ胎 児血清含有ＲＰＭＩ１６４０におけるin vitroで１x１０6cell/mlにおいて３日 間培養した。細胞を、この培地のみ又は１００ng/mlストレプトコッカルエント レトキシンＢ（ＳＥＢは、別細胞の中でＶβ２+Ｔ細胞ではなくＶβ３+Ｔ細胞と 結合するある超抗原である）又は１０ng/mlのＴＳＳＴ−１（Ｖβ３+細胞ではな くＶβ２+Ｔ細胞と結合する）のいずれを補われた培地において培養した[51]。 特異的ＴＣＲ ｍＲＮＡの測定 Qiashredder（商標）(Qiagen）によって細胞を溶解しさらにＤＮＡ分離に続い て、使用者説明書に基づいてRNeasy（商標）抽出装置(Qiagen)を使って、全ＲＮ ＡをＴ細胞からin vivo又はin vitroのいずれかにおいて抽出する。７５度で５ 分間培養することで非動化されたＲＮアーゼ失活ＤＮアーゼを用い て１時間３７度で処理することによって、ＤＮＡ混入汚染を除去しても良い。全 ＲＮＡ濃度は、時にはこの時点で測定されても良いが、しばしば分光測定法で定 量され得るとは言いかねる。使用者説明書に基づいて‘ｈｏｔ ｓｔａｒｔ’に 続いてある最終容量の２０μｌにおいて９０分間１００ＵＭ-ＭＬＶ逆転写酵素( SuperscriptII;Life Technologies)を用いて９．５μｌの全ＲＮＡを逆転写する 。１μｌのｃＤＮＡを、０．１倍、１倍及び１０倍分子数の変異体プラスミドＤ ＮＡを用いて増幅する。ｃＤＮＡ濃度の評価は、既知の濃度のクローンされたＴ ＣＲＢＶ遺伝子生成物のある基準曲線に対する１μｌのｃＤＮＡの増幅によって 行われ得る。 このＰＣＲ反応は１ Ｕ Ｒｅｄ Ｈｏｔ（商標）Ｔａｑポリメラーゼ(Advan ced Biotechnologies)を使いながら１０から２５ピコモルづつのＴＣＲＢＶ特異 的およびアミノ化ＴＣＲＢＣ特異的オリゴヌクレオチドプライマー、２００μＭ ｄＮＴＰ及び２．０ｍＭ ＭｇＣｌ2を用いて、５０μｌの最終容量において 行われる。この反応は、ＰＨＣ‐３サーマルサイクラー(Techne)において９５度 で１０分間‘ｈｏｔ ｓｔａｒｔ’し、１分間に３度の割合で２５度まで冷却す る。２５度になった時１ＵのＲｅｄ Ｈｏｔ（商標）Ｔａｑポリメラーゼを加え 、その後その反応は、９５度で１分間、５４-５６度で３０秒そして７２度で３ ０秒の３５サイクルと７２度で５分間の伸長に続いて７２度で３分間伸長された 。 ５μｌをそのＰＣＲが働いていることを確かめるために１．５％(ｗ/ｖ)のア ガロースゲル上において実験する。承認されたＴＣＲＢＶ-特異的オリゴマーは その最初の２０個のＴＣＲＢＶファミリーについて既に出版されている(Will la ms et al（1992）J．Clin．Invest．90，326-333参照に含まれている)。その付 加的、機能的、５又はそのような(分類に応じて)機能的なＴＣＲ ＢＶ遺伝子ファミリーがそれらの出版された配列に対して設計されたプライマー によって増幅される(Rowen et al（1996）Science 272，1755-1762,これは本明 細書の一部を構成する)。その配列及びその注釈はゲノムシークエンスデータベ ース(承認番号Ｌ３６０９２、Ｌ３６１９０及びＵ０３１１５)に蓄積されている 。通常他のＴＣＲＢＶ配列とおそらく最も異なる領域であるその遺伝子のＣＤＲ １又はＣＤＲ２領域にアニールするプライマーが設計される。この増幅されたＰ ＣＲ生成物は、使用者説明書に応じてその‘クリーンアップ(clean up)’装置(A dvanced Biotechnologis Ltd)を使ってその組み込まれていないプライマーから 分離される。その生成されたＰＣＲ生成物を、９０μｌのＨ2Ｏに溶出し、等量 のＭＥＳ/ＥＤＴＡ緩衝液(50mlの2-[N-morupholino]ethanesulfonic acid)とと もに攪拌する。５０μｌのこの混合物を共有ＥＬＩＳＡプレート(2388;Corning Costar)の４つのウェルのそれぞれに４０μｌの架橋試薬溶液(5mlの水中におけ る40mg EDCと0.543mg sulfo-NHS)とともに加え、３７度で一晩培養する。そのプ レートを３回ｐＨ７．４のＰＢＳ溶液で洗浄する。１００μｌの０．１Ｍ水酸化 ナトリウム溶液によって１０分間室温で、その結合ＤＮＡを変成させる。その水 酸化ナトリウム溶液を捨てた後、そのプレートを一度０．１ｘＳＳＣで、２度Ｈ Ｗ緩衝液(6ｘＳＳＣ+0.1%(v/v)n-lauroylsarcosine)で洗浄する。そのときその プレートは５％ＭａｒｖｅｌとともにＨＷ緩衝液中で３０分間３７度で固定され る。 そのプレートに結合しているその１本鎖ＤＮＡは、ＨＷ緩衝液中のビオチン- 接合体、天然型特異的の(２ウェル)又はビオチン接合体、変異体特異的の(２ウ ェル)オリゴヌクレオチドによって９０分間４２度で調査される。そこでそのプ レートは３回ＷＨ緩衝液(2ｘＳＳＣ+0.1%(v/v)n-lauroylsarcosine)で１回緩衝 液Ｂ（100mMトリス-HCl pH7.5+800mM NaCl+0.5%(w/v)+ブロック試薬(Boehringer Mannhe im)で洗浄する。その結合しているプローブはそのウェルを１時間３７度で１０ ０μの使用者説明書に応じて作られたＡＢＣ(Avidin Biiotin Complex)ストレプトアビジンペルオキシダーゼとともに培養することに よって検出され、緩衝液Ｂ中にて１：１００００に希釈された。そのプレートを 、１回緩衝液Ｂによって、５回緩衝液Ａ(100mMトリス-HCl pH7.5+800mM NaCl)によ って洗浄する。ペルオキシダーゼ活性は、リン酸−クエン酸緩衝液中で１μｌの 過酸化水素とともに１００μｌのＴＭＢ基質(1mg/ml)を加えることによって検出 された。その適切な色濃度が進行したとき、その反応を100μlの硫酸溶液によっ て止め、その後２重波長ＥＬＩＳＡ読み取り機の６３０nmを補正とした４５０nm で読み取る。 その変異体及び天然型生成物の量はそれぞれの反応において直接的にそれらの 光学的濃度に対応している。初期変異体反応濃度の常用対数に対する光学濃度の 常用対数をプロットすることが初期自然型ｃＤＮＡ濃度の導出を可能にする。光 学濃度の割合の常用対数が０となる点がその２つのテンプレートが同じ初期濃度 であった点である。 変異体及び天然型特異的オリゴヌクレオチドプローブ由来のその光学濃度の比 較可能性は、そのＴＣＲＢＶ２Ｓ１およびＴＣＲＢＣＰＣＲプライマーアニーリ ング配列によって範囲づけられるある遺伝的領域内に含まれるそれらの配列のそ れぞれ１つコピーを含んだあるテンプレートを構築することにより決定された。 この構造は、天然型及び変異体クローンをＨｐａＩ及びＢａｌＩによって制限し て製造した。この適切な断片を互いに接合した、そしてＴＣＲＢＶ２ＳＩ及びＴ ＣＲＢＣ特異的プライマーを使って再増幅した。その新しいＰＣＲ生成物をその ＰＣＲｓｃｒｉｐｔベクターにクローンした。このテンプレートを配列決定して 、そのＴＣＲＢＶ２Ｓ１,ＴＣＲＢＣ、天然型及び変異体配列に対する誤りのな いアニーリング部位を含んでいることを確かめた。このテンプレートはビオチニ ル化（Biotinylated）ＴＣＲＢＣ特異的プライマーを使って増幅され、そしてあ るストレプトアビジン被覆プレートに多様な希釈度で 結合された。増幅されたテンプレート希釈度でその２つのプローブで得られたそ の光学濃度と比較しいているその線は、その原点(０．００、０．００)を通り０ ．９９±０．２２の勾配を有する直線(r2=１．００)である。 もし、ある特異的ＴＣＲβ鎖配列が定量されるべきならば、これは、ある特異 的オリゴヌクレオチドプライマーのＴＣＲＢＶ‐ＴＣＲＢＪの組合わせあるいは ある特異的オリゴヌクレオチドプライマーのＴＣＲＢＶ‐Ｎ領域組合せを使って 上記の方法を使って実行される。もしそのいずれかの場合、その変異体は最も良 くはそのＴＣＲＢＶ配列内に配置される。従来のように遺伝子ソーイングによっ て行われ得るのならば、最も便利な変異はある長さのセンス配列をアンチセンス 配列で置き換えることである。これはそのＧ／Ｃ：Ａ／Ｔ含りつを同じにしたま まであり、そして変異体及び天然型プローブの両方が等しい親和性を有するだろ うということは明かである。そのプローブ標的配列から最も離れたそのＰＣＲア ニーリング部位は、そのＰＣＲのオリゴマーがビオチニル化されるその末端とし て使われるべきである。 特異的Ｖβ＋Ｔ細胞数決定 Ｔ細胞の活性化の計算は、特異的Ｖβ＋Ｔ細胞ごとの特異的ｍＲＮＡの量が知 られていることを要求するので、その特異的Ｖβ＋Ｔ細胞数とＴＣＲＢＶ特異的 ｍＲＮＡ分子の量の両方が計数される。特異的Ｔ細胞数は、あるＶβ−特異的モ ノクローナル抗体のある組合せ及び細胞計数機を使って測定される。 ＴＣＲ及びＣＤ２５免疫組織化学；５ｘ１０5cellの分割量をペレットにして そして、０．０１％（w/v）アジ化ナトリウム及び１０％（v/v）熱非動態化正常 ヒト血清を含むｐＨ７．６のＰＢＳ溶液５０ｍｌに懸濁した。それらは、２０ｍ ｌＦＩＴＣ接合抗−Ｖβ２、抗−Ｖβ３又は抗−ＣＤ３とともに培養さ れその後１０ｍｌのＲＰＥ‐接合抗−ＣＤ２５によって４０分間氷上で対比染色 された。その後、細胞は３回洗浄され、ｐＨ７.４に緩衝された０.５％(v/v)パ ラホルムアルデヒドを含むＰＢＳ５００ｍｌ中で定着された。試料をＦＡＣＳｃ ａｎ分析器(Beckton Dickinson)において処理した。 利用可能なあるＶβ特異的モノクローナル抗体の存在下において、特異的ＴＣ ＲＢＶ‐含有ＤＮＡを定量できる。体内的に再アレンジされた特異的Ｔ細胞ＤＮ Ａを特異的β鎖ｍＲＮＡについてＣＰＣＲとして定量できる。さらにもう一度、 存在することが知られているその１３個のＴＣＲＢＪ配列全てをカバーするＴＶ ＲＢＪ特異的プライマーとの組合せにおいて、あるＴＣＲＢＶ特異的オリゴマー が使われる。上記のようなその変異はそのＴＣＲＢＶ配列に配置されるはずであ る。一度多数のＤＮＡ分子がＴＣＲＢＪ組合せごとについて知られたならば、Ｔ 細胞の数はそれぞれのＴ細胞がただ１つだけのＢＶ‐ＢＪの組合せを含むとして 計算される。増幅したいＴＣＲＢＪエレメントとその背後にあるエレメントの間 を切るある酵素を用いて増幅する前に、ゲノミックＤＮＡを前もって制限するこ とが時々有用である。γδＴ細胞はある再アレンジメントされたＴＣＲＢ遺伝子 複合体を有しているので、Ｔ細胞数における微かな過剰刺激をこの方法を使って 起こすことができるかもしれない。他には、このＴＣＲＢＪセグメントＢＪＩＳ １,ＢＪ２Ｓ１及びＢＪ２Ｓ７は最も良く使われているようなので、それら３つ のセグメントにおける組合せに対するそのＴＣＲＢＶ‐ＢＪの組合せは、ほとん どのＶβに対する全Ｖβ特異的Ｔ細胞遺伝子再アレンジメントの４０‐４５％と 見積もられるだろう(Jeddi-Teherani et al（1994）Human Immunology 40，93-1 999)。全体的及び特異的な、ＴＣＲＡ ｍＲＮＡの定量はＲＴ‐ＰＣＲを用いて 達成されても良い。最初の実施例において、ＴＣＲＡ変異体が製造されなくては ならない。ＴＣＲＢの方法とは逆に、変異体は、このＴＣＲＢＣ鎖から同等の配 列であるＣＡＴＣＡＧＡＡＧＣＡＧＡＧＡＴＣＴＣＣを遺伝子ソーイングによっ て置き換えられたＧＡＴＧＴＣＡ ＡＧＣＴＧＧＴＣＧＡＧＡＡ天然型ＴＣＲＡＣ配列有する。これは、採取された 配列に対して、ＴＣＲＡＶ‐及びＴＣＲＡＣ‐特異的プライマー(特異的α鎖メ ッセージの定量に対する)又は２つのＴＣＲＡＣ‐特異的プライマー(全αβｍＲ ＮＡの定量に対する)を使って増幅される。 しかしながら、この方法は特異的ＴＣＲＢＶ ｃＤＮＡ測定に対して記載され ている。ＴＣＲＡＣ‐特異的プライマーを使っての全αβ ｍＲＮＡレベルの測 定がＴＣＲＢＣ ｍＲＮＡのレベルを定量することよりもずっと優れている。こ れは、ＴＣＲβ鎖ｍＲＮＡがγδＴ細胞よって作られているがＴＣＲα鎖ｍＲＮ Ａは違うからである。 もし特異的ＴＣＲＡＶ‐ＴＣＲＡＪ組合せが測定されるならば、この方法はＴ ＣＲＢＶ‐ＴＣＲＢＪ定量についてのものである。明かに、この変異体はそのＴ ＣＲＡＶ領域において配置されていて且つ便宜上その既存配列のそのアンチセン スである。ＴＣＲＡＶ‐又はＴＣＲＡＪ−特異的プライマーのいずれかが、その オリゴマープローブアニーリング部位からより離れていることに依存してビオチ ニル化されるかもしれない。 結果を図１〜５に示す。図１は、天然型及び変異体−特異的プローブの特異性 のある比較を示す。あるＴＣＲＢＶ２Ｓ１ ｍＲＮＡ転写物は逆転写、ＰＣＲに よる増幅及びｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターへのクローンが行われる。そのＴ ＣＲＡＣ遺伝子のその相応する領域由来のある２０塩基対配列でそのＴＣＲＢＣ における２０塩基対配列を置き換えられるように、それは遺伝子ソーイングによ って変異された。そしてその変異体はｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローンされた 。天然型(wt)及び変異体(mut)配列(１０から１０7分子)の多様化された分子がＴ ＣＲＢＶ２Ｓ１‐及びＴＣＲＢＣ‐特異的プライマーを使ったＰＣＲによって増 幅された。その増幅されたテンプレートがあるアミン結合プレートに、そのＴＣ ＲＢＣ特異的プライマーの５’末端に付加されたそのア ミノ基を使って前記の方法に従い付加される。図１は、ｗｔ‐及びｍｕｔ‐特異 的プローブを有するｗｔ及びｍｕｔアプリコンを検索した結果を示す。 それぞれのプローブはその標的配列に対して完全に特異的のようであり、初期 テンプレート数の１０6倍の範囲にわたって無交叉反応性を示すようである。 図２は天然型−及び変異体−特異的プローブにおいて得られた光学濃度(ＯＤ4 50/630 )読み取り地の比較可能性を示す。天然型−及び変異体−特異的配列の両 方を含んでいるある構造が製造(上記参照)及びクローンされた。異なる構造(０ から１０6分子)がＴＣＲＢＶ２Ｓ１‐およびＴＣＲＢＣ‐特異的プライマーで増 幅され、あるアミノ酸結合ＥＬＩＳＡプレートに付加されそして天然型−及び変 異体−特異的プローブ(上記記載のような)で検索された。 その構造標的に対するそれぞれのプローブから得られたそのＯＤ値は正確にそ の０から１０6分子の範囲にわたって比較可能であった。 図３は、未知のｃＤＮＡ試料の測定を記載している。ＴＣＲＢＶ２Ｓ１ ｃＤ ＮＡの未知量の分割量が多様な未知量のｍｕｔ ＴＣＲＢＶ２Ｓ１とともに攪拌 されそしてその２つがともに一連のＰＣＲ反応において共増幅される。その天然 型アプリコンに対する変異体の割合をそのＤＮＡ計数ＥＬＩＳＡを使って分析し た後、それをその初期変異体テンプレート濃度に対してプロットする。その割合 の常用対数が０(即ち、天然型に対する変異体アプリコンの割合が１である)であ る点が、天然型及び変異体テンプレートが同じ初期濃度で存在していた点である 。 図４は未分離リンパ球集合におけるＶβ２．１ＴＣＲ＋Ｔ細胞によるＴＣＲＢ Ｖ２Ｓ１ ｍＲＮＡ生成物及びＣＤ２５発現のある比較を示す。Ｖβ２．１Ｔ細 胞は、未分離抹消血リンパ細胞のある集合内で、ＴＣＲＢＶ２Ｓ１ ｍＲ ＮＡ生成物(細胞ごとの分子)及びＣＤ２５発現(％陽性)について調べられた。そ の分析を、培養に先駆けて及び培地のみ(ＣＯＮ)又は１００ng/mlスタピロコッ カルエンテロトキシンＢ(ＳＥＢ)又は１０ng/ml毒ショック症候群毒−１（TSST- １）を補われた培地において培養された後３日後に実行した。４つの正常個体を 調べた。 ＴＣＲＢＶ２Ｓ１生成は、あらゆるそのコントロールよりもその適切に刺激さ れた（ＴＳＳＴ-１）細胞培養においてずっと高かった。ｍＲＮＡ生成における その規模はＣＤ２５において見られるものよりもはるかに大きく、正値性は特異 的ＴＣＲ ｍＲＮＡ生成率の分析がある未分離リンパ細胞集合におけるその抗原 駆動Ｔ細胞の明確な指摘を与えることを提起している。 図５は、未分離のリンパ球集合でのＶβ３．１ＴＣＲ+Ｔ細胞によるＴＣＲＢ Ｖ３Ｓ１ ｍＲＮＡ生成及びＣＤ２５発現のある比較を示している。Ｖβ３．１ Ｔ細胞は、未分離抹消血リンパ細胞のある集合内で、ＴＣＲＢＶ３Ｓ１ ｍＲＮ Ａ生成物（細胞ごとの分子）及びＣＤ２５発現（％陽性）について調べられた。 その分析を、培養に先駆けて及び培地のみ（ＣＯＮ）又は100ng/mlスタピロコッ カルエンテロトキシンＢ(ＳＥＢ)又は１０ng/ml毒ショック症候群毒−１（TSST- １）を補われた培地において培養された後３日後において実行した。４つの正常 個体を調べる。 ＴＣＲＢＶ３Ｓ１ ｍＲＮＡ生成は、その適切に刺激されたリンパ球（ＳＥＢ ）において最も高かった。ＰＥＲ及びＣＯＮコントロールと比較してＴＳＳＴ- １刺激培養においてＴＣＲＢＶ３Ｓ１の増加がみられた。これはＳＥＢ-刺激培 養において観測された物よりもまだ十分に低かった。そのＴＳＳＴ-１およびＳ ＥＢ培養においてＶβ３．１Ｔ細胞によるそのＣＤ２５における十分な違いはな い。これは、特異的Ｔ細胞後とに特異的ｍＲＮＡ生成の分析が、未分 離のリンパ細胞集合内でのその抗原駆動Ｔ細胞の相同性の明かな指摘を提供して いることを認証している。 結論 これらのデータが提起する多数の結果がある。 １．異なるＴＣＲ遺伝子のその連続する発現は多様である。Ｖβ２．１+Ｔ細胞 のコントロール培養は、同じ培養においてＶβ３．１Ｔ細胞よりも少ないＴ細胞 ごとの分子を生成する。 ２．Ｔ細胞をそれらに特異的な抗原によって刺激するとＴＣＲ生成率は大きく増 加するが、この増加の規模は異なるＴＣＲ遺伝子に対して多様である。 ３．ＴＣＲｍＲＮＡ分子は細胞ごとに活性化されたリンパ球による受身的培養に おいて増加するが、そのＴ細胞が直接抗原により刺激されたときと同程度ではな い。 ４．ＣＤ２５+発現はＴＣＲ遺伝子転写からは独立的に制御されているらしい。 ５．一緒に得られたならば、これらのデータは、細胞ごとのｍＲＮＡの特異的ｍ ＲＮＡ量の測定が免疫障害におけるＴ細胞の直接抗原誘起と受身的サイトカイン 仲介活性化を分別するかもしれないということを提起している。実施例２：あるラットモデルにおける移植組織片対宿主疾患 in vivoにおける抗原仲介ＴＣＲ誘起のある索引としてのＴ細胞ごとのＴＣＲ ｍＲＮＡ分子を測定することのある実施例である。 最近の証拠が、放射線照射されたＬｅｗｉｓラットリンパ細胞標的に対して生 成されたＤＡラット由来の長期間Ｔ細胞計及びクローンがそのＴＣＲＢＪ２Ｓ１ 遺伝子セグメントで置き換えられたＴＣＲＢＶ６Ｓ１遺伝子セグメントによって コードされ且つほとんど排他的なある明確なＮ領域配列を有するあるＴＣＲを使 用するということを示している(Tavakol Afshari et al（1997）Transpl．immun ol,．印刷中)。たくさんのＤＡ及びＤＡ Ｘ Ｌｅｗｉｓ Ｆｌラットを入手しそ して未知のＤＡリンパ細胞をそれらの後脚の肉球(footpads)に注射した。14日間 に渡って排出させつづけて、注射したラットからリンパ腺を得た、そのＤＡリン パ細胞はＲＴ1細胞表面標識-陽性リンパ細胞(Ｆｌ細胞)を排除することによって 生成される、そしてＴＣＲＢＶ６Ｓ１-ＴＣＲＢＪ２Ｓ1 ｍＲＮＡ及びゲノミッ クＤＮＡ分子の数が本質的には実施例１に記載されるように測定される。ＤＡＸ Ｌｅｗｉｓから得られたそのＤＡリンパ細胞はＴＣＲＢＶ６Ｓ１-ＴＣＲＢＪ２ Ｓ lｍＲＮＡのＤＮＡに対する比率（特異的Ｔ細胞ごとの特異的ＴＣＲ ｍＲＡ Ｎのより高いレベルを示している）がコントロール(ＤＡ)動物より高い比率を有 している。実施例３：高ガンマグロブリアエミック初期ショーグレン"ズ症候群(Hypergamma globulinaemic Primary Sjogren's Syndrome；ＨＧＰＳＳ)におけるＶβ１３ ．２ＴＣＲ-陽性Ｔ細胞ごとのＴＣＲＢＶ１３Ｓ２ｍＲＮＡのレベルの測定 ＨＧＰＳＳは、Ｔ細胞浸潤及び涙腺及び唾液腺の免疫破壊によって特徴付けれ られるある自己免疫病気である。このＴＣＲＢＶ１３Ｓ２遺伝子によってコード されるこの条件に対する遺伝的感受性及びこの条件を有する患者の唾液腺におけ るＴＣＲＢＶ１３Ｓ２遺伝子ｍＲＮＡの増加したレベルの証拠がある(Kay et al ，1992)。マイナーな唾液腺及び抹消血試料の生検がこの条件を有 する患者から得られる。関連のない条件(埋覆した親知らず除去)における歯科手 術を受けている患者からのマイナーな唾液腺生検がしかも得られる。その生検は コラゲナーゼ消化される。その消化された生検由来のリンパ細胞及びその抹消血 試料はフィッコール勾配を通して分離される、そしてＶβ１３．２+Ｔ細胞数は ある抗-Ｖβ１３．２、ＦＩＦＴ-Ｃ接合モノクローナル抗体を使って免疫組織的 に染色された後白血球計数及びＦＡＣＳ分析のある組合せによって定量される。 このＴＣＲＢＶ１３Ｓ２遺伝子ｍＲＮＡレベルは実施例１において記載されるよ うに測定される。特異的Ｖβ１３．２+Ｔ細胞ごとのＴＣＲＢＶ１３Ｓ２遺伝子 ｍＲＮＡのそのレベルは、そのＨＧＰＳＳ患者の抹消血（疾患組織内での選択的 帰還及び誘起）又は関係のない歯科的病気を有する患者のその唾液腺においてよ りもＨＧＰＳＳ患者の唾液腺においての方がより高い(Kay R.A.，Hutchings C.J .，Ollier W.E.R.(1995)Human Immunol．42，328-330及びSumida T.，et al.(19 92)J．Clin．Invest89，681-685.を参照されたい)。実施例４：４つの関連のない個体における超抗原刺激に対する応答 リンパ細胞は４つの正常なドナーからのその抹消血試料から分離されそして３ 日間１．５ｘ１０6cells/mlでペニシリン、ストレプトマイシン、グルタミン及 び１０％（v/v）熱非動態化ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０中で培養した 。細胞は培地のみあるいは１００ng/mlのＳＥＢ又は１０ng/mlのＴＳＳＴ-1を補 われた培地において培養された。ｍＲＮＡレベルは実施例１に前もって記載した ようにその混合物逆転写ＰＣＲを使って測定された。Ｖβ２．１+及びＶβ３． １+細胞数をそのＣＤ２５状態によって、実施例１において前記した様にＦＡＣ Ｓによって計数する。測定は、培養３日後だけではなく前もって(ＰＲＥ)も行わ れた。 その結果は、ＳＥＢが選択的にＶβ３．１+Ｔ細胞においてＴＣＲＢＶ３Ｓ１ レベルを刺激すること及びＴＳＳＴ-１がｖβ２．１+Ｔ細胞においてＴＣＲＢＶ ２Ｓ１に対して同様のことをするということを認証している。ｍＲＮＡレベルに おけるその相対的増加はＢＶ３Ｓ１に対しては５８倍であって、ＢＶ２Ｓ１に対 しては４０倍であった(図７)。ＢＶ２Ｓ１よりもＢＶ３Ｓ１に対して高い細胞ご との未刺激ＴＣＲ ｍＲＮＡレベルは、そのＴＣＲＢＶ３Ｓ１遺伝子がより高い レベルで転写されているということを提起している。図７は、培地のみあるいは その超抗原ＳＥＢ又はＴＳＳＴ-１を補われた培地における培養の前又は３日後 の細胞ごとのＴＣＲＢＶ３Ｓ１ ｍＲＮＡレベルを示している。 前述のようにこの結果は細胞ごとのＴＣＲＢＶレベルがＣＤ２５発現(図８)の 測定よりも抗原特異的Ｔ細胞誘起の良い指示体であることを示してもいる。図８ は、抗原誘起Ｔ細胞におけるＣＤ２５発現及び細胞間ＴＣＲＢＶレベルのある比 較を示している。実施例５：従来の抗原での刺激に対するＴ細胞の応答 リンパ細胞はある抹消血試料から分離されそして前記のように３日間培地のみ 又はある抗-Ｖβ３．１-特異的モノクローナル抗体、ある抗-ＣＤ-２８-特異的 モノクローナル抗体又は組み合わせたその両方の抗体を補われた培地において培 養された。 抗-ＣＤ２８のみが細胞間ＢＶ３Ｓ１ｍＲＮＡレベルを十分に上昇させなかった 。抗-Ｖβ３．１は細胞間Ｖβ３Ｓ１レベルを十分には上昇させなかった。しか しながら、ＳＥＢで得られたそれらに比較可能な細胞間ＢＶ３Ｓ１ ｍＲＮＡレ ベルが抗-ＣＤ-２８及び抗Ｖβ３．１（図９）の両方とともに３日間培 養した後に得られただけだった。図９は、培地のみ（ＵｎＲｘ）、抗-ＣＤ-２８ （ＣＤ）、抗-Ｖβ３．１（Ｖβ）又はその２つの組合せ（ＣＤ＋Ｖβ）を補わ れた培地において培養されたリンパ細胞から入手された細胞間ＴＣＲＢＶ３Ｓ１ ｍＲＮＡレベルを示している。ある抗-Ｖβ特異的モノクローナル抗体を使うこ とは従来の抗原での刺激と同等である。この実験は、この手法が従来の抗原（超 抗原だけではなく）がＴ細胞に対して応答すると思われている状況においての使 用に適しているということを実証している。しかもＣＤ−２８共刺激は、それが Ｔ細胞の増加に対するのと同様に全ＴＣＲ遺伝子転写に対しても重要である。実施例６：分析能力特徴 この分析時間中安定性を調べるために、あるＴＣＲＢＶ１７Ｓ１−特異的ｍＲ ＮＡを逆転写、増幅、クローン及び配列決定した。そのクローンを前述のように ＴＣＲＢＣ領域において変異させ、それがある短いＴＣＲＡＣ配列を含みそして その天然型テンプレートに対するある測定混合(measurement contaminant)とし て使われうるようにした。 天然型テンプレートの１５，０００分子を一日あるいは８週間にわたりこのコ ンタミナントＰＣＲを使って測定した。この結果を図１０に示す。そしてこの結 果はこの期間においてはその分析の正確さにおいてそれ程の影響がないことを実 証している。 図１０は、１日（集合）又は８週間（分離）におけるあるクローンされたＴＣ ＲＢＶ１７Ｓ１配列の１５，０００分子の測定を示す。 このＴＣＲのβ鎖の可変ドメインは３つの小さな遺伝子セグメントのある組 合せによってコードされている。それ故それぞれの異なるＴＣＲＢＶ１７Ｓ１コ ードＴＣＲにおいて、このＴＣＲＢＶ１７Ｓ１遺伝子セグメントはある異なるＢ Ｄ及びＢＪ遺伝子セグメントの組合せであるだろう。この生理学的な変異が測定 のその正確性に影響するかどうかを見るために、５つの異なるＢＶ１７Ｓ１天然 型テンプレートを測定するためにある変異体ＢＶ１７Ｓ１クローン（ＢＤ１及び ＢＪ１Ｓ１）が使われた。これらのテンプレートの１つがその変異体として同じ ＢＤ及びＢＪ組合せを有する；そのたの４つは異なっていた。もしこれらの異な るセグメントが測定に影響を与えたならば、遺伝的多様性のその上流領域を省い てそのＴＣＲＢＣ領域に純粋にアニールされるあるプライマーを使ってその天然 型を測定して調べることもできたであろう。そうして、図１１は、あるＢＶ１７ Ｓ１-特異的プライマー（遺伝的変異性領域を含む）及びあるβＰＣＲ５‘プラ イマー（遺伝的変異性領域を除く）の両方を使ってある単一の変異体混合ととも にそれらの５つの異なるＢＶ１７Ｓ１クローンの測定結果を示す。 その結果は、ＴＣＲ遺伝子再アレンジメントにおいて自然に起こる遺伝的変異 性が正確なデータを提供するためのある単一変異体クローンのその能力に影響し ないことを示す。さらに、ある単一変異体クローンは、ＴＣＲ配列のあるポリク ローナル集合又はある単一ＴＣＲテンプレートを同様の効率手測定できる（デー タは示さない）。 図１１はある単一変異体ＢＶ１７Ｓ１クローンを有する５つの異なるＴＣＲＢ Ｖ１７Ｓ１天然型テンプレートの１５，０００分子の測定のその正確性を示して いる。測定はあるＢＶ１７Ｓ１特異的プライマー及びあるＴＣＲＢＶ特異的プラ イマー（βＰＣＲ５’）の両方を使って作られそして使用された。それらのいず れかのプライマーを使って得られたその測定の間にはそれ程の違いは無かった。 遺伝的配列において非生理学的な変異がこのテストを妨害するかどうかを見る ために，そのＢＶ１７Ｓ１天然型テンプレートの１つからある変異体が製造され た。この変異体はある一面以外全ての面でその天然型と相同的であった。約６０ 塩基対のある短い配列がそのＢＶ２Ｓ１可変遺伝子のその中部からそのＢＶ１７ Ｓ１配列のその中部に置換された（１７/２/１７）変異体。この変異体とその天 然型との間のこの変更された配列相同体は、自然にはＢＤ/ＢＪ置換を有する異 なる天然型の間ではほとんど起こらない。測定はあるＢＶ１７Ｓ１特異的プライ マー（その変異体の５’にアニールする）及びあるβＰＣＲ５’（その変異体の 下流にアニールする）の両方を使ってその２つのテンプレートから作られた。そ の結果を図１２に示す。図１２はＢＶ１７Ｓ１特異的及びβＰＣＲ５’プライマ ーを使っての天然型ＢＶ１７Ｓ１（クローン７）及び変異体ＢＶ１７Ｓ１（１７ /２/１７変異体）テンプレートの測定を示す。 この結果は、ＢＶ２Ｓ１（決して自然的には起こらないであろう）のあるアナ ログセクションを有するそのＢＶ１７Ｓ１配列のある部分の置換が、その変異体 の上流にアニールするあるプライマーを有するその変異体テンプレートの測定を 停止するということを示す。もしこの変異体（βＰＣＲ５’）の下流にアニール するあるプライマーが使用されるならば、その天然型又は変異体テンプレートの 測定の正確性の間にそれ程の違いはない。 １つの変異体による天然型テンプレートおなる範囲の正確な測定がその変異体 の独特の特徴であったかどうかを見るために、ある初期点としてある異なるＢＶ １７Ｓ１天然型テンプレートを使ってある２次測定変異体が作られた。その結果 を図１３に示す。その結果はどちらもの変異体が両方の天然型テンプレートを正 確に測定することができることを実証している。図１３は、それらの各々の変異 体を有するＢＶ１７Ｓ１天然型テンプレート（クローン１およびク ローン７）の測定を示している。最終的に、この分析は天然型分子数のある範囲 を測定するための能力において調べられた。ＴＣＲＢＶ１７Ｓ１テンプレートの １００，０００、１０，０００、１，０００分子を測定した（図１４）。変異の この分析間計数はこの分子数範囲にわたって比較可能であって、およそ２３％で あった。この試験はテンプレート数において１０倍の違いは容易に分離可能であ った。この測定は、以前にin vitro実験において出会ったたことのあったあら ゆる分子数の大小どちらにも超過した範囲をカバーすることが意図された。 図１４は天然型ＴＶＲＢＶ１７Ｓ１テンプレートの分子の異なる数の測定を示 す。 要するに、このコンタミナント、定量ＰＣＲ方法は約２３％の正確性を持って in vitro(そしておそらくin vivo)において出会ったであろうＴＣＲ ｍＲＮＡ分 子を測定することができる。適切な刺激の後の細胞内ＴＣＲ ｍＲＮＡ分子レベ ルは約４０倍変化するので、この容易にＴ細胞誘起を検出するはずである（しか も、する）。それぞれのＴＣＲＢＶ遺伝子に対するある単一変異体テンプレート はすべてモノクローナル、オリゴクローナルそしてポリクローナルＴＣＲ ｍＲ ＮＡ集合を測定するために必要であり、その分析の正確性は時間によってずれな いようである。実施例７：休止中及び活性化(at rest and activation)後におけるＴＣＲＢＶ遺 伝子プロモーター機能 実施例１からのデータは細胞内ｍＲＮＡレベルが休止中及び活性化後の両方に おいて異なるＴＣＲＢＶ遺伝子間において多様であるということを示す。個々の ＴＣＲＢＶ遺伝子プロモーター間で起こるその配列の相違が与えられた 時、これは遺伝子転写における相違を示すようである。 これを試すために、ラットＴＣＲＢＶプロモーターがＰＣＲによってゲノミッ クＤＮＡから分離されｐＧＥＭ-Ｔ Ｅａｓｙベクター(Promega)にクローンされ 、そして配列決定された。異なるＴＣＲＢＶ遺伝子由来のそれらのプロモーター は、そのルシフェラーゼリポーター遺伝子ベクターであるｐＸＰ２中にサブクロ ーンされた。これらの構造物が共形質転換体コントロール（レニラルシフェラー ゼ発現をコントロールにするチミジンキナーゼプロモーター）とともに電気穿孔 によってヒトＴ細胞系であるＪｕｒｋａｔに形質転換導入される。この細胞を、 培地のみあるいは１０ng/mlでＰＭＡを補った培地において形質転換後４０時間 培養した。そのＰＭＡが薬学的にＴＣＲ誘起を模倣する。４０時間後、その細胞 を回収し溶解した。蛍シフェラーゼ(ＴＣＲＢＶ遺伝子制御された)及びレニラル シフェラーゼ測定がその２重ルシフェラーゼ分析装置(Ｐｒｏｇｍａ)を使って行 われ、そしてその割合を図１５に示す。 これらのデータは強力に異なるＴＣＲＢＶ遺伝子（ＢＶ５Ｓ１及びＢＶ５Ｓ２ のような同じファミリーの内の１つであったとしても）を異なる割合で休止中及 び活性化後の両方のお互いから転写した。これらのデータは、細胞間ＴＣＲ ｍ ＲＮＡレベルはＴＣＲＢＶ-特異的ｍＲＮＡ生成物における違いを反映している かもしれないという前記の提起を認証しているようである。細胞間ｍＲＮＡレベ ルにおいて見られる相違の程度はレポーター構成物で観測された物よりも大きい ということを知るべきである。これは、そのレポーター構成物においておそらく そのＴＣＲＢＶエンハンサーを含んでいないことによるのであろう。このＴＣＲ ＢＶエンハンサーは、そのプロモータに較べて比較的大変強くそして形質転換実 験においてルシフェラーゼ生成物を顕著に増加させる。図１５は、培地のみ(●) 又はＰＭＡを補われた培地(〇)において４０時間の培養後のＪａｋａｔ Ｔ細胞 に異なるプロモーター−ｐＸＰ２構成物を導入したその 相対活性を示す。 実施例４から７において提供された情報は、 （１） ４つ以上の個体におけるＴＳＳＴ-１及びＳＥＢに対する応答において 特異的に細胞ごとに、細胞間ＴＣＲ ｍＲＮＡが増加することを示す； （２） 細胞間ＴＣＲ ｍＲＮＡはＣＤ２５発現より優れた抗原刺激検出体であ ることを認証する； （３） ＴＣＲ ｍＲＮＡのそのレベルにおけるある類似上昇は、そのＴ細胞が 抗-ＣＤ-２８によって共刺激されたときだけではなく従来の抗原刺激（あるＶβ -特異的モノクローナル抗体によってと見なされる）よって誘導されうる。； （４） この定量ＰＣＲ方法は正確であり(約２５％またはそれ以下の分析間変 異を持って)、時間を通して安定でありそしてＴＣＲ遺伝子において起こる生理 学的な配列変異によって影響されない。しかしながら、その分析は非生理学的な 遺伝子変異に対して敏感である；そして （５） ヒトＪｕｒｋａｔＴ細胞系において形質転換されたラットＴＣＲ遺伝子 プロモーターを使ったルシフェラーゼレポーター遺伝子分析データであってそれ はＴＣＲ遺伝子転写がＴ細胞刺激の後に増加する及び変化するということを実証 している、休止中及び刺激後の両方において、異なるＴＣＲＢＶ遺伝子によって 。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION                               Immunological method   The present invention relates to immunological methods, and in particular to methods for identifying antigen-responsive T cells. .   T cells are the basis of the immune process. They cover a wide range of immune responses. He plays a central role as a regulator or effector. Them The function is beneficial to the host in the immune response to infection or tumor, Can also be disadvantageous such as autoimmune diseases, allergies and transplant rejection.   Accurate identification of T cells corresponding to these responses is It will help improve vaccines and that T cell hyperreactivity is the cause of the disease These diseases could enable immunosuppressive treatments to be specifically targeted.   T cells are expressed in the context of the major histocompatibility complex-encoding molecule [1,2]. Recognize peptide antigens presented to them. They are Ideopic T A clonally released heterodimer known as the vesicle receptor (TCR) This is achieved by a cell surface that can be used. TCRs usually consist of an α-chain and a β-chain, And, unusually, consist of γ and δ chains. Each of these chains contains variable and constant regions. Having an immunoglobulin-like structure. The immutable region (as its name implies ) The same for any chain type (ie, all α chain constant regions are homologous). However, the variable regions are different in each TCR [1,3-5].   Produces a heterogeneous range of variable region structures, which encode them The gene is randomized into smaller gene segments incorrectly linked to each other This is because they are formed by various recombination. Those smaller segments are variable (V), miscellaneous (D), (only β and δ chains) and linked (J) gene segments [6]. A study of the structure of the chromosome encoding the TCR revealed that 50- 52 functional TCRAV (β-chain variable gene segment) [7], at least 70T CRAV (α chain variable gene segment) [8-14], 57TCRAJ (α chain binding Gene segment) [15]. A large number of them Smaller gene segments, their random recombination and more diversity when combined Given an inaccurate mechanism to create a TCR, the TCR repertoire will be [16-18] 10 with stop codons or extraframe redundancy added to the coefficientsFifteenWhen 1018It has been estimated that there may be different receptors between. The human βT cell The complete 685 kilobase DNA sequence for the receptor locus is known (Rowen. et al (1996) Science 272, 1755-1762). Its sequence and annotations are Approval numbers L36092, L36190 and U031 15 is stored.   When the structure of the stimulating antigen or responding TCR is known, the antigen responding T cell Is relatively simple. Unfortunately, in major clinical situations, neither unknown.   Methods have been described that claim to identify antigen-responding T cells, and Can be broadly classified as "immunohistochemistry" and "molecular biology" approaches It is.   Two different immunohistochemical approaches have been taken. The first is especially For counting the number of T cells having a TCRBV encoding gene product, Cars (eg, HLA-DR, CD25) Including the use of immunohistochemical techniques to determine the number of cells. All these tricks It is speculated that surgery measures the repertoire of T cells in certain immune lesions. When T cells responding to the antigen proliferate, their maximum number of T cells (anatomical Or in comparison to disease-based controls) are differentiation driven by antigens It is speculated that the cells should have been removed.   I think this inference is flawed. Very few T cells in all immune lesions Only a percentage of the numbers are known to be antigen-specific [19-21]. Others are passive Is replenished there. CD45R0 (memory) T cell tropism resulted in inflammatory site [22-24], and the repertoire of T cells in the lesion depends on the appropriate antigen. Antigens that have induced memory T cells in the past It is also determined. The extent of previous immunological experience is taken into account quantitatively Would be almost impossible and the variety of results obtained by different workers It is also one reason for gender. Another problem with this approach is that HLA-DR and CD25-like molecules are undoubtedly expressed on activated T cells But not necessarily induced by a specific anti-antibody to the antigen It is. Cell surface expression of CD25 was measured by IL-7 [27,28], tumor necrosis factor [29]. Alternatively, cytokines such as T cell reactive ligands such as CD40 alone Interleukin produced in autocrine or paracrine-like 2 (IL-II); HLA-DR is interferon-γ Can be similarly activated [31]. In other words, active immune disorders Activating molecules on T cells without being directly stimulated by antibodies 'Can be induced. Therefore, which T cells are And that they are passively using this methodology It is impossible to guess whether it will be activated by the heat.   This molecular biological method is expressed at specific sites or specific lesions Counting the spectrum of TCR mRNA and comparing it to other sites or controls Comparing to TCR mRNA in a roll individual. Polymer Achieving this, which relies heavily on Seese Chain Reaction (PCR) Various techniques have been used [32]. The most reliable technology in counting conditions Is inverse PCR or anchor PCR. Other such as family-specific PCR Secondary quantification techniques have also been used. This method is essentially the same as that of immunohistochemistry. , But because all its TCRBV genes are now known, Can be achieved with a more limited range of anti-Vβ monoclonal antibodies to date. More complete than it was.   It has previously been assumed that TCR mRNA levels are close to specific T cell numbers. However, for this to be true, the two basic assumptions must also be correct. No. That is, (1) all TCR genes should be transcribed at the same rate. And (2) gene transcription when T cells can be stimulated should not be diverse. It is not. My data, as discussed in more detail below, Both of these assumptions suggest that they are wrong.   TCR reacts against antigenic peptides presented in the context of MHC molecules Can exhibit elaborate specificity. However, the TCR peptide / MHC complex Affinity is low and its off-rate in the interaction is high [33-35 ]. Further complicating this apparent paradox is the 100 peptide / MHC A small number of complexes are probably required to completely induce specific T cells And the fact that peptide / MHC maintenance TCR complex contact is activated to complete T cells The fact that detention is required [36-38].   The latest data shows that the T cells have a relatively small number of their antigen presenting cells (APC's) In contact with tens of thousands of its own surface TCR with the MHC / peptide complex of To use the cytoskeleton to move over the surface of the antigen-presenting cell. Raised [38-40].   There is usually some cell surface TCR [41,42] recycling, but following antigen challenge After phosphorylation, the receptor is internalized and degraded [43-45]. Fortunately two Studies using T cell clones with different TCRs show that Antigen binding receptor regulates inhibition from its cell surface while its inactive TCR persists [46].   Toxic-TCRBV mRNA 2 in patients with shock syndrome Subsequent quantitative measurements indicate that the mRNA level rises rapidly in a short period of time and is not successfully treated. Within about three months of getting the disease, she settled down to control levels It was shown. This toxic shock syndrome toxin (TSST-1) is TCRBV2 Is superantigen specific for the encoded TCR [47,48]. TCR Vβ m RNA is not measured on a "per specific T cell" basis.   Diseases caused by superantigens for Staphylococcus and Streptococcus-releasing TSST-1 TCRBV2S1m produced by individual T cells in Kawasaki disease RNA proportions rise during the short term of the disease and control levels after treatment Was located in. In contrast, in the same way, T cells in vivo TC after treatment with SEB (different TCRBV12 mRNA specific superantigen) It was shown that the production ratio of RBV12 mRNA did not change. However, Even if the mRNA production ratio seems to be constant, cell number and mRNA after this treatment Both levels increase proportionately [49,50]. Specific TCR m for each specific T cell The increase in measurement of RNA production indicates that its stimulatory antigen and response TCR are known. If not, what is the general suggestion that it can be used to identify antigen-responsive T cells? Absent.   Duchmann et al. (1993) DNA and Cell Biol. In 12,217-225, According to the report, measurement of TCR Vβ subfamily by reverse transcription (RT) -PCR A quantification method is described, but for each specific T cell TCR mRNA Is not measured.   Particularly in cases where the stimulating antigen and the responding TCR are not known, (Or its specific TCR involved in the antigen response). The need remains.   One object of the present invention is when the stimulating antigen is unknown and involved in the antigen response. When there is little or no clue about specific T cells or TCRs, To provide a method that allows the identification of antigen-responsive T cells or specific TCRs in the primary response. Is to provide.   This method identifies T cell (and T cell receptor; TCR) types involved in antigen-mediated diseases. It is effective to specify. Allergies, autoimmune diseases, allografts (allogra ft) Rejection and tolerance, some infectious diseases such as parasites, and some cancers etc. Are believed to involve antigen-driven T cells. These diseases include, for example, multiple sclerosis, farmer's lung, hay fever, eczema, and the like.   I put the receptor that was lost from the cell surface during antigen induction It has been proposed to increase TCR gene expression after antigen stimulation to alter. To commit T cells to full activity as published data raises, It is required that about half of the cell surface TCR binds to the antigen (and therefore Phosphorylation and internalization) [46], but I believe this mechanism is probably normal It is proposed to be effective for T cell function.   Activation of T cells by cytokines does not involve degradation of the cell surface TCR. In my opinion, measurement of TCR-specific mRNA production rate Differentiate between passively recruited / passively activated T cells and antigen-specific T cell effectors Is a particularly appropriate method for Typically, when the mRNA synthesis rate is (Eg, the time between contact of the antibody with the T cell and the time at which the mRNA is measured) At a given time) and the mRNA synthesis rate is measured at a given time Equivalent to the amount of synthesized mRNA. Chronic diseases involving antigen-mediated processes It is believed that the chronic presence of the antigen on the vesicles is involved. In these situations Speculated that T cells continue to be constantly induced by antigen. Can be   In a preferred embodiment according to the method of the present invention, the specific TC R mRNA purification is measured by antigen stimulation and specific T cell count or mRNA. It is not a measurement of only Where a large amount of T cell activation occurs in clinical practice (Eg, in toxic shock syndrome), specific cells or mRNA May be sufficient to quantify any or to determine T cell responses to specific antigens No (which is either T cell subset (specific Vβ) and which It is useful to know if it is the superantigen you are looking for). However, These methods include, for example, measuring the number of specific T cells or receiving specific T cells. Measuring container mRNA) processed in more sensitive situations or conventionally When antigens (represented by a broad spectrum) are responsible, Will not identify the vesicle.   The first aspect of the present invention relates to the identification of an antigen-responsive T cell within a population of T cells. Provide a way to determine The method includes the following steps.   (1) Obtaining a sample containing T cells that responded to the antigen.   (2) Individual or T cell receptor for any of a plurality of specific T cell receptors A specific T cell receptor individually for any of the subsets of the condition Encoding the expression of a gene encoding the body or a subset of the T cell receptor. The expression of the gene being loaded is either specific T cell receptor positive T cells or specific T cells. For each vesicle receptor positive T cell subset, include T cells that did not respond to the antigen Determine if the gene has increased relative to its expression in a sample Be determined.   Increase in specific TCR gene expression following antigenic stimulation is any appropriate It can be determined using the law. Typically, following TCR gene expression, the mR NA is synthesized and the mRNA is translated into a polypeptide. mRNA synthesis Any procedure to determine can be used, and mRNA is relatively insecure Measurement of the amount of that mRNA for more than a certain amount of time is probably This is a reasonable approximation of success. Polypeptides are generally more stable than mRNA and Typically, measuring the amount of a specific TCR polypeptide is carried out using an existing TCR. May not distinguish between the polypeptide and the newly synthesized TCR polypeptide However, newly synthesized specific TCR polypeptides and existing specific A method that can distinguish TCR polypeptide from TCR polypeptide may be used as the method according to the present invention. No, but not to individual T cell receptors or a subset of T cell receptors More preferably, specific mRNA is measured.   Samples containing T cells that did not respond to this antigen are discussed in more detail below. It may be any suitable control sample as described. Specific Genes encoding T cell receptors or subsets of T cell receptors The control expression level of the loading gene is measured for the test sample. Typically, some control levels are specific T cell receptors or T cells. Can be set for each subset of cell receptors. Thus, the present invention In one such embodiment, the cell comprises a T cell that did not respond to the antigen. Specific gene expression in a sample in response to a certain level in a sample and its antigen The current comparison of that level is based on a control sample that has been previously determined separately. May be a historical comparison with that level, but of course The same protocol is used for gene expression in the test sample and the control sample Used to measure levels of (eg, specific T cell receptor mRNA) Is particularly preferred.   Alternatively, and more preferably, as discussed below, that of gene expression. Levels of the sample in the sample taken and optionally simultaneously analyzed May be measured.   A particularly preferred embodiment according to the present invention is directed to certain antigen-responsive T cells in a population of T cells. The present invention provides a method for identifying a vesicle, the method comprising the following steps.   (1) Obtaining a sample containing T cells that responded to the antigen.   (2) Individual or T cell receptor for any of the specific T cell receptors Individual for any of several subsets of T cell receptor mRNs that are differential or specific for a subset of T cell receptors The amount of A is determined for each specific T cell receptor positive T cell or for the specific T cell receptor positive T cell. For each cell subset, determine in the sample obtained in step (1) thing. And   (3) Which T cell receptor mRNA is used in step (1) for each specific T cell T cells that did not respond to the antigen were determined to have increased in the sample obtained in To be determined by comparison with the increase in the containing sample.   In one preferred embodiment, step (1) comprises the steps of (a) not responding to the antigen. A sample containing T cells and (b) T cells that responded to the antigen A sample (b) compared to the sample (a) in step (3). Which T cell receptor mRNA increases the amount for each specific T cell in decide.   Thus, in some situations, samples (a) and (b) are taken and Can be measured simultaneously with its specific TCR mRNA, or in some situations the sample ( It is considered that a) may be a historical test sample.   For convenience, specificity for non-induced T cells (ie, those that did not respond to the antigen) Normal range of TCR gene expression can be obtained by reference to normal and healthy individuals You. For example, T cells can be obtained from an appropriate number (eg, 8 to 20) of normal, healthy individuals. By collecting blood from the TCR mRNA molecule and examining the specific By measuring for each TCR gene or specific subset of TCRs, Can be obtained.   For example, in the four individuals studied in Example 1, the TCR per cell Individual diversity in the number of specific mRNA molecules was TCRBV2S1 and TCR In BV3S1 (FIGS. 4 and 5) it is not large. From target peripheral blood (PRE sample) The resulting fresh T cells were combined with RPMI 1640 and 10% as described in Example 1. Cultured for 3 days in the presence of heat-cultured fetal calf serum (CON sample) The number of specific TCR mRNA molecules per cell between similar cells It should show that there is no diversity. Thus, this control trial The feed is from the appropriate T cells in culture.   It is instructive to determine the expression range for antigen-induced T cells. Antigen induced T The range for a large number of specific TCR mRNA molecules per cell in a cell is: During culture, for example, the superantigen and the anti-Vβ-specific monoclonal antibody or It can be elicited by its T cells induced by any of the CD-3 antibodies. This The last method of induction is to approach conditions that overlap with conventional antigens in vitro Can be considered. Again, if the appropriate number (eg, 8 to 20) of normal If used as a source, cell-specific TCR mRNA molecules All ranges can be obtained.   If the majority of patients with a TCRBV-specific disease have the disease, Cell levels, if examined during their recovery and when they have again recovered satisfactorily. The range for per-unit induced TCR mRNA obtained in vivo? Maybe. Examples include toxic shock, as discussed in more detail below. Including TCRBV mRNA levels per T cell in Syndrome or Kawasaki disease I have.   The method of the invention may be used to identify specific antigen-responsive T cells, Used to identify a subset of T cells involved in specific antigen responses For example, the method may use a common Vβ segment or a common Vβ segment. any T cell receptor subsequence containing the α segment or a combination thereof. It may be used to identify a set. However, it is involved in certain antigen responses A smaller subset of T cells, for example, first Subsequently, the specific Vβ-J subset, followed by the specific Subset, followed by its specific V-J subset, and its T Can be identified by identifying a specific Vβ-J / Vα-J subset of CRs .   The method comprises the steps of identifying an antigen-responsive T cell and, therefore, a specific T cell associated with a disease state. It is particularly useful for identifying receptor types. The population of T cells is, for example, derived from a mammal. It can be any suitable population of T cells, such as T cells. If this T cell population Is preferably from a human patient; in particular, if the population of T cells is Preferably, a certain population of T cells associated with a disease in a patient.   For convenience, the sample containing T cells that did not respond to this antigen ("Sample (a ) ") Is obtained from the non-diseased site of an individual and responds to the antigen The sample containing the isolated T cells ("sample (b)") is It is obtained from For example, sample (a) is from a non-disease synovial fluid sample of a patient. Considering that it may be obtained, sample (b) is derived from the same patient's rheumatoid joint. It may be obtained from a synovial fluid sample of a joint showing signs of flame. Thus, the present invention To identify antigen-responsive T cells associated with rheumatoid arthritis using the method Maybe.   Moreover, for convenience, this sample containing T cells that did not respond to this antigen ("Test (A) ") was obtained from a non-diseased individual and T This sample containing cells ("sample (b)") was obtained from an individual with a certain disease It does not matter. For example, sample (a) is a healthy control individual or The convalescent Kawasaki disease patients and sample (b) may be obtained from patients with acute Kawasaki disease. I don't know.   In some situations the sample containing T cells that did not respond to the antigen In vitro, the antigen (which is probably in the form of some disease-causing agent) A sample obtained from an individual that has not been contacted with U. For example, the sample has been treated in vitro with a microorganism, or treated in vivo with an antigen or mixture thereof obtained from a small organism A T cell-containing sample derived from an individual may be used. For example, the population of T cells Staphylococcal enterotoxin B (SEB; Leukocytes obtained from a peripheral blood sample treated with a superantigen).   The method is based on antigen response within a population when the disease-associated antigen is known. It may be used to identify T cells, but if its antigen or Is within a population of T cells when the antigen associated with a disease is not known It is particularly preferred if used to identify antigen responsive T cells. The way is May be used to identify certain T cells that respond to a superantigen, If used to identify certain T cells that respond to certain conventional antigens. Is more preferable.   Superantigens are typically protein products of many bacteria or viruses. is there. Compared to the names found on conventional antigens, those names stab many T cells. Derived from their ability to intensify. They are traditional in many ways Is different from the antigen.   Superantigens function as inactive proteins. Conventional antigens are generally 8 to 12 antigens. Within the giant protein by antigen presenting cells, which are small peptides of amino acid length Obtained from localization and proteolysis.   Superantigens are major histocompatibility complex class II molecules on their surface of antigen presenting cells Outside of the 'peptide binding glove'. Conventional antigen peptides are Located in this globe within the class II molecule.   Hyperantigens are commonly referred to as the fourth hypervariable region, some specificity of that β-chain of the T cell receptor. To the target area. It is encoded only by the TCRBV gene segment You. The structure of this TCRa and TCRBJ gene segment is Plays a minor role in influencing. Conventional antigens have their α And the complementarity-determining regions of both βTCR chains (particularly the V- (D) -J gene segment set CDR3) formed by exchange and N-region addition Have been. (Kay R. A. (1995) Clin. Exp. Immunol. 100, 4-6; and Herman A. , et al (1991) Annu. Rev. Immunol. 9, 745-772).   The fact that there may be more than one disease-associated antigen in many diseases And whether there is more than one antigen-responsive T cell type in a population of T cells It may be admitted that it may not. This method is useful for certain disease-related Is believed to be useful in identifying each antigen-responsive T cell corresponding to the original However, in particular, this method is based on the specific T cell receptor mR per specific T cell. Suitable for identifying antigen-responsive T cells where NA production is highest Will be recognized.   Its use containing T cells is suitable for any sample containing T cells. It will be appreciated that it does not matter. For convenience, this sample is Or a sample of bone marrow, but it is a sample from an individual with T cells But it doesn't matter. It does not matter if a sample from an individual cultured in vitro is used Absent.   In certain preferred embodiments of the present invention, the T cell receptor is a subset Where any T cell has a specific Vβ region or segment Contains. This specific Vβ region or segment of the TCR mRNA is A specific nucleic acid probe that hybridizes to the specific Vβ segment mRNA May be used for recognition. MRNA containing a specific Vβ segment Any convenient method of identifying and quantifying the quantity may be used, For example, a "chip" hybrid for detecting specific mRNA or cDNA It is also possible to use the isemination method. As described in more detail below It is particularly preferred that polymerase chain reaction (PCR) is used; More preferably, a certain quantitative PCR method is used. PCR is DNA Due to the dependence on the template, the TCR m before or during the PCR procedure It will be appreciated that RNA should be transcribed into cDNA.   Methods for synthesizing cDNA from mRNA are well known in the art, Typeally, a certain oligonucleotide primer is hybridized to mRNA. Includes synthesizing DNA using deoxynucleotides and reverse transcriptase. Po Scientifically well-known methods for performing remerase chain reactions I have. Methods for cDNA synthesis and PCR are described in Sa, hereby incorporated by reference. mbrook et al (1989) Molecular cloning, a laboratory manual, Cold Spring Described in Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor Laboratory, New York Have been.   In a further preferred embodiment of the present invention, the subset of T cell receptors is A specific Vα region in which each T cell receptor is located Or contains a segment. This specific Vα region of the TCR mRNA Specific nucleic acid probe that hybridizes with a specific Vα segment mRNA It may be recognized by using a node. It contains TCR mRNA A similar method for identifying and quantifying specific Vα segments of TCR mRN Use in a method for identifying and quantifying its specific Vβ segment containing A You can do it.   Segment of TCR gene transcribed or spliced into TCR mRNA Chain variable gene segment (TCRBV) and α chain variable Gene segment (TCRAV) and α-chain binding gene segment (TCRAJ) Nucleotide sequence information is available for many of the Most of this information Available from publicly available nucleotide sequence databases such as GenBank, Gen Bank and EMBL. Is available. In particular, the complete 685 kb DNA sequence of the human βT cell receptor locus is known. (Rowen et al (1996) Science 272, 1755-1762). The array and its The annotation is the certification number L36092, L361 in the Genome Sequence Data Base. 90 and UO 3115, all of which are hereby incorporated by reference. I have. Suitable for measuring specific Vβ, Vα and other TCR gene segments Are the probes and primers generally available sequences for the TCR gene? Has been obtained. If the amount of T cell receptor mRNA is determined using quantitative PCR And especially the quantitative PCR method is reverse transcription competitive PCR (RT- CPCR). Reverse transcription competitive PCR (RT-PCR) In detail: Kohsaka et al (1993) Nucl. Acids Res. 21, 3469- 3472 and Taniguchi et al (1994) J. Am. Immunol. Methods 196, 101-109, both Are included in individual references.   At least for the measurement of any specific TCR gene segment by PCR Also requires one TCR gene segment specific oligonucleotide primer is there. Quantification of mRNA containing specific TCR gene segments A pair of PCR primers hybridizing within a heterogeneous TCR gene segment It may be performed using a specific TCR gene Or other primers are genomic DNA In its mRNA (c, for example, by an intron) DNA) that hybridizes to a segment of TCR mRNA It would be convenient. This method prevents amplification of virtually any contained genomic DNA. And therefore the method is based on TCR cDNA / mRNA and TCR genomics. It is useful for separating DNA from DNA.   Appropriate for identifying specific Vα and Vβ segments in TCR mRNA Novel PCR primers are described in Williams et al (1992) J. Am. Clin. Invest. 90,326-333 And is incorporated herein by reference and is shown in FIG. here Margurie et al (1992) Immunology Today 13,336- No. 338 refers to a PCR-based method for analyzing TCR mRNA.   Once its specific Vβ subset has been determined as described herein Then, it is preferable to identify a combination with a specific J segment-specific Vβ . This means that, for example, certain Vβ-specific oligonucleotides can be used in certain PCR reactions. With an oligonucleotide specific for any of the J segments It may be performed by using. As well as once described here Once the specific Vα subset is determined, the combination with the J segment is Vα and It can be identified using PCR with a J-specific oligonucleotide.   Specific Vγ and Vδ segments can be combined with, for example, Cγ-specific oligonucleotides. Using oligonucleotides directed to specific Vγ segments in alignments Or in combination with Cδ-specific oligonucleotides Also identified by using oligonucleotides pointing to the Vδ segment It will be appreciated that this is acceptable. Specific Vγ and Vδ cells Combination with a specific J segment, for example, in a PCR reaction. Against Vα-J and vβ-J by using appropriate and selective oligonucleotides Can be identified by substantially using methods similar to those described above.   The number or T cells of specific T cell receptor positive T cells in a specific subset The number of vesicle receptor positive T cells can be determined by using any suitable method. No. Conventionally, a specific Vβ segment and a specific Vα segment As many specific antibodies were available for use, some specific T cell receptors were Or a specific subset of T cells (eg, a specific subset of its T cell receptors). The determination has been made by using an antibody that binds to the Vβ segment). Specific V Monoclonal antibodies directed against β and Vα chains are readily available.   Endogen sells the following antibodies (Bradsure Biologicals Ltd, 67a Brook St. reer, Shepshed, Loughborough, distributed by Leics 9RF): Antibody: V β3. 1, Vβ5a, Vβ5c, Vβ6. 7a, Vβ7. 1, Vβ8, Vβ8b, Vβ12, V β13, Vβ17, Vα2, Vα12. 1, Vγ4, Vγ9, Vδ1, Vδ2, Vδ1-J One.   Similarly, Immunotech sells the following antibodies (Coulter Electronics Ltd, Nor thwell Drive, Luton, Beds Taken over by LU3 3RH): Antibody: Vδ1, V δ2, Vδ3, Vγ1, Vγ9, Vα24, Vβ1, Vβ2, Vβ3, Vβ5. 1, Vβ5 . 2, Vβ5. 3, Vβ6. 1, Vβ8. 1 and Vβ8. 2, Vβ9, Vβ11, Vβ12, V β13. 1, Vβ13. 6, Vβ14, Vβ16, Vβ17, Vβ18, Vβ20, Vβ 21. 3, Vβ22. Γδ excluding 1.   In addition, monoclonal antibodies to specific T cell receptors are specific human T cells Immunizing mice against tumor lines, mouse B cell hybrid Make the target cell line different from its target cell line using well-known and academic methods. Mouse antibody produced against both human T cell tumor lines It may be made by doping. In this way, the selected hive Do lidoma clones probably produce anti-TCR specific monoclonal antibodies? Maybe. The second method is to transfer the V region on the β chain of a mouse TCR to a human Replacing it with the Vβ region and using its cell line made immune mice In this method, a monoclonal antibody directed to human Vβ chain was produced. And much of that background screening is removed and Most areas of the target can be produced. Producing soluble human TCR is now As far as possible, they are Vβ and V using methods well known in the art. As a target for making further monoclonal antibodies against the α target May be used.   Quantification of the number of specific T cell receptor positive T cells can be performed using known methods. For example, the antibody may be fluorescently labeled and the cells are sorted and then Counting may be performed using a fluorescence activated cell sorter (FACS). Properly, its anti The body is made up of any convenient fluorescein isocyanate (FITC) Labeled with a fluorescent material.   Alternatively, but more preferably, in a specific subset, The number of body positive T cells or the number of T cell receptor positive T cells is the genomics of that T cell population. Can be determined by analyzing DNA. In the body Specific T cell DNA that has not been transferred can be treated in a similar manner to mRNA. And can be quantified. Anyone who will separate non-transferred and transferred TCR genes The method may be used to determine the number of specific T cells.   Specific to a certain T cell receptor or to a certain subset of T cell receptors The number of TCR mRNAs that are specific for A specific subset of specific T cell receptor positive T cells or specific T cell recipients Once the number of condition positive T cells has been counted once, the specific TC for each specific T cell The number of R mRNA species is calculated.   This includes a sample containing T cells that did not respond to the antigen and the antigen. Performed on any of the samples containing T cells that responded to Its ratio The comparison may be performed between the test sample and a control sample, where The control sample may be a historical control sample or another healthy individual. From a non-diseased part of the body or the individual from whom the control sample was taken. This is a sample that has been collected.   An increase in the amount of specific T cell receptor mRNA per specific T cell is indicative of a certain antigen response Its specific T cells that are T cells (T cell receptor or a subset of T cell receptors) Is displayed.   Amount of specific T cell receptor mRNA for each specific T cell displaying a certain antigenic response Increases depending on the specific antigen and its specific TCR or TCR subset Be diverse.   Typically, an increase of about 2 or more is indicative of a specific T cell, And the rise is probably more than 10 or more than 100 and more than 1000 unknown.   As described above, the normal range of TCR gene expression is specific T cells or TCRs. Determined for a specific subset of cells. Preferably, for each specific T cell Certain increases in the amount of specific T cell receptor mRNA may indicate a certain antigenic response However, if the increase is definitely enough, at least about 1 Preferably it is at least 2, more preferably at least 3 or a component thereof. Standards above trawl (i.e. the normal range of expression in unirritated bears) levels The condition is that it is equal to or larger than the deviation.   The method determines whether this T cell type is associated with a specific antigen-mediated disease. It is particularly effective in doing so. Certain dominant T cell types are involved in certain disease processes In some situations, and for example, the same T cell type In the disease. Thus, a large number of individuals with a specific disease The method is effective in identifying T cell types You. However, that is associated with a specific disease in an individual patient This method can be used on individual patients to determine specific T cell types. Particularly suitable. Treatment of individual patients depends on their T cell types associated with the disease It will be appreciated that it may be tailored.   A further aspect of the present invention provides a method of treating a patient. The patient has an antigen-mediated disease in which methods include: (A) A method associated with an antigen-mediated disease according to the method of the first aspect of the present invention. (B) identifying the effective response of certain reagents to ameliorate the disease; Administer the dose to the patient.   The agent that ameliorates the disease typically reduces T cells that respond to the antigen. Or a reagent to be excluded.   Once, the homology of a specific T cell receptor or subset of T cell receptors was determined. Once determined to be related to an antigen-mediated disease using the method of the invention, Certain reagents that improve the disease may be selected. For example, one specific Monoclonal antibodies directed against the V.BETA. Segment may be effective and some specific A peptide derived from a CDR with a target Vβ segment may also be effective. Experiment Animal model with severe autoimmune encephalomyelitis (EAE), human multiple sclerosis Provides a precursor model to test its efficiency in anti-T cell therapy in autoimmune diseases Was. In EAE in Lewis rats or PL / J mice, myelin salt Protein (MBP) -specific encephalomyelitis T cells were highly classified, Vβ8. What can be successfully targeted for therapy by bispecific monoclonal antibodies Vα2 and Vβ8. 2 (Heber-Katz & Acha-Orbea, 1989) This is while CR was being expressed. In addition, weakened encephalitis gene T cells Vaccination mediated protection against EAE (Lider et al, 1988). That Vβ8. A peptide obtained from CDR2 (secondary complementarity determining region) of 2TCR Vaccination of rats inhibited the activation of pathogenic T cells Pick T cells and antigens were induced and EAE was prevented and treated. That CDR TCR peptides taken from 2 or other regions are used for MBP, collagen, heat Pathogenic T cells for P2 protein of protein and peripheral myelin Other studies have shown that it can induce immune regulation in mice and that in addition to EAE, Have shown therapeutic potential in experimental arthritis and neuritis (Howell et al, 198 9; Stevens et al, 1991; Kumaar & Sercarz, 1993; Gregorian et al, 1993; Broeren et al, 1994; Matsumoto et al, 1994; Kuhrober et al. 1994; Haqqui et  al, 1995).   Certain TCR-derived vaccines, such as certain vaccines in humans with progressive multiple sclerosis One study found that vaccine responders reduced immunoreactivity while using peptides And shows that it is clinically stable throughout the year of treatment, Non-responders continue to have immunoreactivity to MBP and worse clinically (Vandenbark et al, 1996).   Known T cell vaccine administration passive anti-T cell antibody therapy and peptide immunization I have. For example, Heber-Katz E. , Acha-Orbea H. (1989) Immunol. . Today 10,164- 169; Lider O. , et al (1988) Science 239, 181-183; Vandenbark A. A. , et al (1 989) Nature 341, 541-544; Offner H. , et al (1991) Science 251, 430-432; H o-well M. D. , Et al (1989) Science 246, 668-670; Stevens D. B. , et al (1991 J.). Neuroimmu-nol. 37, 123-129; Kumar V. , Sercerz E. E. (1993) J.C. Exp. Med. 178, 909-916; Gregorian S. K. , Et al (1993) Am. Assoc. Immunol. 150, 28A; Br oerenc. P. M. , et al (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91,5997-6001; Matsumot o Y. , et al (1994) Cell. Immunol. 153, 468-478; Kuhrober A. , et al (1994) Eu r. J. Immunol. 24, 1172-1180; and Haqqui T. M. , Et al (1995) Ninth Int. Cong r. Immunol. Abstr. See 5014,845. These are all part of this specification. To achieve.   Thus, the present invention provides a therapy for a patient having a disease derived from an antigen. Includes some way to choose.   The present invention will be shown in more detail with reference to the following figures and examples. . put it here,   FIG. 1 shows a comparison of native and mutant-specific probes.   FIG. 2 shows the optical density (OD4) for native and mutant-specific probes. 50/630).   FIG. 3 shows the measurement of an unknown cDNA sample.   FIG. 4 shows that Vβ3. TCRBV by 1 TCR + T cell 3 shows a comparison of 3S1 mRNA product and CD25 expression.   FIG. 5 shows that Vβ2. TCRB with 1 TCRT cells 2 shows a comparison of V2S1 mRNA production and CD25 expression.   FIG. 6 shows specific amplification of Vα and Vβ segments of TCR mRNA (cDNA). 2 shows the sequences of the appropriate PCR primers. For more information, see Williams et al (1992) J.I. Clin. Invest. 90, 326-333. This is part of the specification Constitute.   FIG. 7 shows the medium alone or the medium supplemented with its superantigen SEB or TSST-1. TCRBV mRNA levels after cell culture for 3 days before and after Is shown.   FIG. 8 shows CD25 expression and antigen-cell TCRBV levels in antigen-induced T cells. Here is a comparison.   FIG. 9 shows medium alone (UnRx) or anti-CD28 (CD), anti-Vβ3. 1 ( Vβ) or some combination of the two (CD + Vβ) 2 shows the intercellular TCRBV3S1 mRNA levels obtained from isolated leukocytes.   FIG. 10 shows clones that are over a day (aggregated) or 8 weeks (isolated). 1 shows the measurement of 15000 molecules of the TCRBV17S1 sequence.   FIG. 11 shows five different TCRs with one single mutant BV17S1 clone. Figure 3 shows the accuracy of measurement of 15,000 molecules of the BV17S1 native template.   FIG. 12 shows that BV17S1 specific and native B V17S1 (clone 7) and mutant BV17S1 (17/2/17 mutant) template 4 shows a rate measurement.   FIG. 13 shows BV17S1 native template (clo 1 shows the results of the measurements of clone 1 and clone 7).   FIG. 14 shows the measurement of the number of different molecules of the native TCRBV17S1 template. You.   FIG. 15 shows the culture for 40 hours in the medium alone (●) or the medium supplemented with PMA (ＰＭ) Of different promoter-pXP2 constructs introduced into cultured Jakat T cells Shows relative activity.Example 1: Identification of antigen-responsive T cells   To replace its receptor lost from its cell surface during antigen induction For this reason, I suggest that TCR gene expression increases after antigen stimulation. ing. Published data show that almost half of the cell surface TCR binds to antigen Phosphorylation and internalization) are necessary to fully activate the T cell. [46], but I believe this mechanism will work for normal T cell function. Suggest that it is something   Activation of T cells by cytokines may not involve degradation of the cell surface TCR In spite of this, I measure the rate of TCR-specific mRNA production in all immune processes. Recruited / actively recruited from antigen-specific T cell effectors It is proposed that this is a feasible method for separating transformed T cells.   T cell receptor (TCR) transducing RNA (mRNA) It is measured by chain reaction (RT-CPCR) (for example, Kohsaka et al. al (1993) Nucl. Acids Res. 21, 3469-3472; and Taniguchi et al (1994) J. Am. I mmunol. methods 169, 101-109). In this method, a mutant template At different concentrations to the aliquot of the native cDNA template, and The ratio of the two is based on the mutant and natural type specific oligonucleotide probes after PCR. Determined by The quantification is based on the specific TCR + Expressed as the number of molecules of the heterologous TCR mRNA. Unstimulated and antigen-induced Increase in gene transcription levels between isolated cells is between 2- to 1000-fold . This varies for different TCRBV genes. Our data is SEB Driven TCRBV3S1 transcription is approximately (8.7-161.7 times) in medium alone. 5.) 30 times that of control culture, but in the presence of TSST-1 It is proposed to increase by a factor of 7 (range 3.7-8.4). We believe that this is Does it represent a real image with a view of the scenery or contamination during the adjustment of TSST-1? It is not known whether this reflects TCR α-chain binding by staining or TSST-1. No. When specifically induced by TSST-1, TCRBV2S1 averages It increases by a factor of 27 (ranging from 8.3 to 349.8 times). Medium alone or in the presence of SEB No difference in TCRBV2S1 transcription in control culture It is. Once transcript levels are known for each TCRBV gene , Multiple antigen-induced T cells can be identified in any condition in any disorder It is. If specific TCRBV mRNA levels are present in αβ TCR chain mRNA If expressed as a percentage, this may not be the case. TCRBV gene variants for use in RT-PCR   The TCRBV gene variant converts the native PCR product like PCRscript. Cloning into a certain vector according to the user's instructions and this clone It is produced by mutating the template obtained. This mutation, Higuch According to the method of i et al (1988) and Ho et al (1989), gene sequencing (gene SOEin g: sequence overlap extension) using a PCR-based method known as Done. Briefly, the native sequence is divided into two bisected and separate reactions. Amplify. The first reaction uses the upstream half of the template as its TC Amplify using RBV specific primers and some mutant downstream primers. this Add the mutated primer to the template just above the site to be mutated. Carrying the new mutant sequence 12 to 15 base pairs to the 5 'end. Separate line The resulting secondary reaction amplifies the lower half of the template. Downstream TCR A BC specific primer and some upstream mutant primer are utilized. This variant Anneal the primer to the template just below the site to be mutated Carries 12 to 15 base pairs of its new mutant sequence at the 5 'end. Each was purified to the absence of the native template, primers and Taq poly Dilute to give the same concentration of merase.   The two halves together with the PCR mixture there are TCRBV and Included only with TCRBC specific primers and hot start Amplified in a PCR reaction. During this second amplification, the two halves Are annealed together by the use of their overlapping mutant sequences, and New mutant templates are created by the PCR process. The new PCR The product was then recloned back into some vector, such as PCRscript. And sequenced until an error-free clone is identified. This way While using CATCAGAAGCAGAGATCT The CC sequence is replaced with GATGTCAAGCTGGGT in its native TCRBC region. Using the CGGAAA sequence to replace the corresponding region of the TCRAC gene Was. This mutation may have its full size, dG / dC: dA / dT content or its original native form. Designed not to affect the template's annealing primer sequence Was done. The mutated template is used in a number of TCRBV-specific PCR reactions. In the same manner as the natural template. Gene sewing For further details on the above, see the following literature, Higuchi R., et al ( 1988) Nucleic Acids Res. 15, 7351-7367 and Ho S.N., et al (1989) Gene 77 , 51-9. Cell culture   Lymphocytes are obtained from a peripheral blood sample from a normal individual, and Nicilin, streptomycin, glutamine and 10% (v / v) heat-inactivated calf 1x10 in vitro in RPMI 1640 containing infant serum63 days at cell / ml The culture was continued for a while. Cells are grown in this medium alone or 100 ng / ml streptococcal Letoxin B (SEB is a Vβ3 + T cell but not a Vβ2 + T cell among other cells. 10 ng / ml TSST-1 (which is not a superantigen that binds) (Binding to Vβ2 + T cells) in a supplemented medium [51]. Measurement of specific TCR mRNA   Lyse cells with Qiashredder ™ (Qiagen) and follow DNA isolation Using the RNeasy ™ extraction device (Qiagen) based on the user instructions A is extracted from T cells either in vivo or in vitro. 5 at 75 degrees RNase-inactivated DNase immobilized by culturing for For 1 hour at 37 ° C. to remove DNA contamination. all RNA concentration may sometimes be measured at this point, but is often determined spectrophotometrically. It cannot be said that it can be quantified. ‘Hot start’ based on user ’s instructions Subsequently, 100 UM-MLV reverse transcriptase (90 μl in a final volume of 20 μl for 90 minutes) SuperscriptIIReverse transcription of 9.5 μl of total RNA using Life Technologies) . 1 μl of cDNA was converted to 0.1, 1 and 10 times the number of mutant plasmid D Amplify using NA. Evaluation of cDNA concentration was performed using known concentrations of cloned T By amplification of 1 μl of cDNA against a certain reference curve of the CRBV gene product Can be done.   This PCR reaction was performed using 1 U Red Hot ™ Taq polymerase (Advan cd Biotechnologies) using 10 to 25 picomoles of TCRBV specific And aminated TCRBC specific oligonucleotide primers, 200 μM   dNTP and 2.0 mM MgClTwoWith a final volume of 50 μl Done. This reaction was performed at 95 ° C in a PHC-3 thermal cycler (Techne). 'Hot start' for 10 minutes and cool to 25 degrees at 3 times a minute You. At 25 degrees, add 1 U of Red Hot ™ Taq polymerase The reaction is then performed at 95 degrees for 1 minute, 54-56 degrees for 30 seconds and 72 degrees for 3 seconds. 35 cycles of 0 seconds and extension at 72 degrees for 5 minutes followed by extension at 72 degrees for 3 minutes .   5 μl of 1.5% (w / v) aliquot to confirm that the PCR is working. Experiment on a galose gel. Approved TCRBV-specific oligomers The first 20 TCRBV families have already been published (Will la ms et al (1992) Clin. Invest. 90, 326-333). Attached Additional, functional, 5 or such (according to classification) functional TCR Primers whose BV gene family was designed against their published sequence (Rowen et al (1996) Science 272, 1755-1762, which is Form part of the handbook). The sequence and its annotation are described in the genome sequence database. (Authorization numbers L36092, L36190 and U03115) . CDRs of that gene, usually the region most likely to differ from other TCRBV sequences Primers that anneal to the 1 or CDR2 region are designed. This amplified P The CR product is supplied to its 'clean up' device (A (dvanced Biotechnologis Ltd) Separated. The resulting PCR product is mixed with 90 μl of HTwoEluted in O, equal volume With MES / EDTA buffer (50 ml of 2- [N-morupholino] ethanesulfonic acid) Stir again. 50 μl of this mixture was applied to a shared ELISA plate (2388; Corning 40 μl of cross-linking reagent solution (in 5 ml of water) Together with 40 mg EDC and 0.543 mg sulfo-NHS) and culture overnight at 37 ° C. That The rate is washed three times with a pH 7.4 PBS solution. 100 μl of 0.1 M hydroxylation Denature the bound DNA with sodium solution for 10 minutes at room temperature. The water After discarding the sodium oxide solution, the plate was washed once with 0.1 × SSC twice Wash with W buffer (6 × SSC + 0.1% (v / v) n-lauroylsarcosine). Then that Plates were fixed in HW buffer for 30 minutes at 37 degrees with 5% Marvel You.   The single-stranded DNA bound to the plate is biotin-HW buffer. Conjugates, native specific (2 wells) or biotin conjugates, mutant specific (2 wells) (Well) probed at 42 degrees for 90 minutes with oligonucleotides. So the Rate is buffered once with WH buffer (2xSSC + 0.1% (v / v) n-lauroylsarcosine) three times Solution B (100 mM Tris-HCl pH7.5 + 800 mM NaCl + 0.5% (w / v) + blocking reagent (Boehringer Mannhe im). The bound probe allows the wells to grow for 10 hours at 37 degrees for 1 hour. ABC (Avidin) made according to the user's manual of 0μ Biiotin Complex) Culture with streptavidin peroxidase Therefore, it was detected and diluted 1: 10000 in buffer B. That plate 1 time with buffer B, 5 times with buffer A (100 mM Tris-HCl pH7.5 + 800 mM NaCl) Wash. Peroxidase activity was measured in 1 μl of phosphate-citrate buffer. Detection by adding 100 μl of TMB substrate (1 mg / ml) with hydrogen peroxide Was done. When the appropriate color density has progressed, the reaction is initiated with 100 μl of sulfuric acid solution. And then 450 nm corrected for 630 nm of a dual wavelength ELISA reader Read with.   The amounts of the mutant and natural products are directly It corresponds to the optical density. Optical density vs. common logarithm of initial mutant reaction concentration Plotting the common log makes it possible to derive the initial native cDNA concentration. light The point where the common logarithm of the ratio of the chemical concentration is 0 is the case where the two templates have the same initial concentration That was the point.   Ratio of its optical density from mutant and natural type specific oligonucleotide probes Comparability is indicated by the TCRBV2S1 and TCRBBCPCR primer annealing. Of those sequences contained within a certain genetic region delimited by the Determined by constructing certain templates, each containing one copy. This structure limits the native and mutant clones by HpaI and BalI. Manufactured. This appropriate fragment was ligated together and TCRBV2SI and T Re-amplification was performed using CRBC specific primers. The new PCR product is It was cloned into a PCRscript vector. Sequence this template No error for its TCRBV2S1, TCRBC, native and mutant sequences. It was confirmed that it contained a high annealing site. This template is biotini Amplified using Biotinylated TCRBC specific primers, and Different dilutions on streptavidin-coated plates Combined. The amplification obtained with the two probes at the amplified template dilution The line comparing to the optical density of 0 passes through its origin (0.00, 0.00) . A straight line with a slope of 99 ± 0.22 (rTwo= 1.00).   If a specific TCR β chain sequence is to be quantified, Combination of TCRBV-TCRBJ of the specific oligonucleotide primer or Using the TCRBV-N region combination of certain specific oligonucleotide primers Performed using the method described above. If any, the variant is best Or located within the TCRBV sequence. As before, gene-sewing The most convenient mutations, if possible, are to antisense a certain length of the sense sequence. Is to replace it with an array. This keeps the G / C: A / T inclusions the same. And both the mutant and native probes will have equal affinities That is clear. The PCR probe furthest from the probe target sequence The annealing site is the end of the PCR where the oligomer is biotinylated. Should be used. Specific Vβ + T cell number determination   The calculation of T cell activation is based on the amount of specific Vβ + specific mRNA per T cell. The specific Vβ + T cell count and TCRBV specific Both quantities of mRNA molecules are counted. The number of specific T cells is It is measured using some combination of noclonal antibodies and a cell counter.   TCR and CD25 immunohistochemistry; 5x10FivePellet the cell division amount And 0.01% (w / v) sodium azide and 10% (v / v) heat passivated normal The cells were suspended in 50 ml of a pH 7.6 PBS solution containing human serum. They are 20m Cultured with 1 FITC conjugated anti-Vβ2, anti-Vβ3 or anti-CD3 And then counterstained with 10 ml of RPE-conjugated anti-CD25 for 40 minutes on ice Was done. The cells are then washed three times and buffered to pH 7.4 with 0.5% (v / v). The cells were fixed in 500 ml of PBS containing laformaldehyde. FACSc sample An analyzer (Beckton Dickinson).   In the presence of certain Vβ-specific monoclonal antibodies available, specific TC RBV-containing DNA can be quantified. Specific T cell DN rearranged in vivo A can be quantified as CPCR for specific β chain mRNA. One more time, TV covering all 13 of its TCRBJ sequences known to be present Certain TCRBV-specific oligomers in combination with RBJ-specific primers Is used. The mutation as described above should be located in the TCRBV sequence. You. Once multiple DNA molecules are known for each TCRBJ combination, T The number of cells is based on the assumption that each T cell contains only one BV-BJ combination. Is calculated. Between the TCRBJ element to be amplified and the element behind it Genomic DNA must be restricted before amplification with certain enzymes. And are sometimes useful. γδ T cells have certain rearranged TCRB genes Due to the complex, slight overstimulation in T cell numbers can be achieved using this method. May be able to wake up. In addition, this TCRBJ segment BJIS 1, BJ2S1 and BJ2S7 are the three most commonly used The TCRBV-BJ combination for the combination in the segment of 40-45% of all Vβ-specific T cell gene rearrangements for any Vβ (Jeddi-Teherani et al (1994) Human Immunology 40, 93-1). 999). Total and specific TCRA mRNA quantification was performed using RT-PCR. May be achieved. In a first example, a TCRA variant must be produced. No. Contrary to the method of TCRB, the mutant is identical to this TCRBC chain. The sequence CATCAGAAGCAGAGATCTCC is obtained by gene sawing. GATGTCA replaced AGCTGGTCGAGAA has a native TCRAC sequence. It was harvested For sequences, TCRAV- and TCRAC-specific primers (specific α chain Or two TCRAC-specific primers (total αβmR) (For quantitation of NA).   However, this method has been described for specific TCRBV cDNA measurements. ing. Measurement of total αβ mRNA levels using TCRAC-specific primers Is much better than quantifying the level of TCRBC mRNA. This This is because TCRβ chain mRNA is produced by γδ T cells, but TCRα chain mRN A is different.   If a specific TCRAV-TCRAJ combination is measured, the method For CRBV-TCRBJ quantification. Obviously, this variant has its T The antisense of the existing sequence located in the CRAV region and conveniently. Is. Either TCRAV- or TCRAJ-specific primers Biotin dependent on being further away from the oligomer probe annealing site May be nilated.   The results are shown in FIGS. FIG. 1 shows the specificity of native and mutant-specific probes. Shows a comparison with. Certain TCRBV2S1 mRNA transcripts are used for reverse transcription and PCR. Amplification and cloning into the pBluescript vector. That T The TCRBC with a certain 20 base pair sequence from its corresponding region of the CRAC gene It is possible to replace the 20 base pair sequence in Was mutated. And the mutant was cloned into pBluescript. . The native (wt) and mutant (mut) sequences (10 to 107Molecule) is T Increased by PCR using CRBV2S1- and TCRBC-specific primers It was width. Add the TC to the amine-bound plate with the amplified template. The ABC added to the 5 'end of the RBC-specific primer It is added according to the method described above using a mino group. FIG. 1 shows wt- and mut-specific 5 shows the results of searching for wt and mut aplicons having a specific probe.   Each probe appears to be completely specific for its target sequence, 10 templates6It appears to show no cross-reactivity over a two-fold range.   FIG. 2 shows the optical densities (OD) obtained for the native- and mutant-specific probes.Four 50/630 ) Show the comparability of reading locations. Both native- and variant-specific sequences Certain structures were produced (see above) and cloned. Different structures (0 From 106Molecule) increased with TCRBV2S1- and TCRBC-specific primers Width, added to certain amino acid binding ELISA plates and Searched with variant-specific probes (as described above).   The OD value obtained from each probe for that structural target is exactly 0 to 106Comparable over a range of molecules.   FIG. 3 describes the measurement of an unknown cDNA sample. TCRBV2S1 cD Stirring with unknown unknown amount of mut TCRBV2S1 where the unknown amount of NA is varied And the two are co-amplified together in a series of PCR reactions. Its natural The ratio of mutant to type apricon was analyzed using its DNA counting ELISA After that, it is plotted against its initial mutant template concentration. Its proportion Is 0 (ie, the ratio of mutant aplicon to natural is 1) Is that the native and mutant templates were present at the same initial concentration. .   FIG. 4 shows TCRB by Vβ2.1 TCR + T cells in unsegregated lymphocyte population 3 shows a comparison of V2S1 mRNA product and CD25 expression. Vβ2.1T fine The vesicles contain TCRBV2S1 mR within certain populations of unseparated peripheral blood lymphocytes. NA products (cell-specific molecules) and CD25 expression (% positive) were examined. So Analysis prior to culture and medium only (CON) or 100 ng / ml Calenterotoxin B (SEB) or 10 ng / ml toxic shock syndrome toxin-1 (TSST- This was performed 3 days after culturing in the medium supplemented with 1). Four normal individuals Examined.   TCRBV2S1 production is more appropriately stimulated than any of its controls. (TSST-1) cell culture was much higher. In mRNA production Its magnitude is much larger than that seen in CD25, and positivity is unique Antigens in unseparated lymphocyte populations with specific TCR mRNA production analysis It is proposed to give a clear indication of driving T cells.   FIG. 5 shows TCRB by Vβ3.1 TCR + T cells in unseparated lymphocyte population. 7 shows certain comparisons of V3S1 mRNA production and CD25 expression. Vβ3.1 T cells are expressed in TCRBV3S1 mRN within certain populations of unseparated peripheral blood lymphocytes. A products (molecules per cell) and CD25 expression (% positive) were examined. The analysis was performed prior to culture and with medium alone (CON) or 100 ng / ml Calenterotoxin B (SEB) or 10 ng / ml toxic shock syndrome toxin-1 (TSST- This was performed 3 days after culturing in the medium supplemented with 1). Four normal Examine the individual.   TCRBV3S1 mRNA production is determined by its appropriately stimulated lymphocytes (SEB ). TSST- compared to PER and CON control In one stimulation culture, TCRBV3S1 was increased. This is SEB-stimulus culture It was still well below what was observed in the culture. The TSST-1 and S There is no significant difference in its CD25 by Vβ3.1 T cells in EB culture. No. This is because the analysis of specific mRNA production after specific T cells Providing a clear indication of the homology of its antigen-driven T cells within isolated lymphocyte populations Certify that Conclusion   There are numerous results raised by these data. 1. Its sequential expression of different TCR genes is diverse. Vβ2.1 + T cells Control cultures have fewer T cells than Vβ3.1 T cells in the same culture. Generate a molecule for each. 2. Stimulation of T cells with their specific antigen greatly increases the rate of TCR production. In addition, the magnitude of this increase is variable for different TCR genes. 3. TCR mRNA molecule is used for passive culture of activated lymphocytes on a cell-by-cell basis But not as much as when the T cells were directly stimulated with antigen. No. 4. CD25 + expression appears to be regulated independently of TCR gene transcription. 5. If obtained together, these data indicate the specific mRNA of mRNA per cell. Measurement of RNA levels is directly induced by T cells in immune disorders and passive cytokines It proposes that mediation activation may be discriminated.Example 2: Graft versus host disease in a rat model   TCR per T cell as an index of antigen-mediated TCR induction in vivo This is an example of measuring an mRNA molecule.   Recent evidence suggests that live against Lewis rat lymphocyte targets Long-term T cell counts and clones derived from DA rats generated were TCRBJ2S1 By TCRBV6S1 gene segment replaced by gene segment CodedAnd with some distinct N-region sequences that are almost exclusiveUse TCR (Tavakol Afshari et al (1997) Transpl. Immun ol ,. Printing). Obtain a lot of DA and DA X Lewis Fl rats Unknown DA lymphocytes were then injected into their hind leg footpads. 14 days Lymph glands were obtained from the injected rats and their DA phosphorus Pa cells are by eliminating RT1 cell surface labeled-positive lymphocytes (Fl cells) Produced and TCRBV6S1-TCRBJ2S1 mRNA and genomic The number of DNA molecules is determined essentially as described in Example 1. DAX The DA lymphocytes obtained from Lewis were TCRBV6S1-TCRBJ2 Ratio of Sl mRNA to DNA (specific TCR mRA for each specific T cell) N indicating a higher level) than control (DA) animals are doing.Example 3: High Gamma Globulia Emic Early Showgren's Syndrome (Hypergamma Vβ13 in globulinaemic Primary Sjogren's Syndrome (HGPSS) . Measurement of TCRBV13S2 mRNA level for each 2TCR-positive T cells   HGPSSS is characterized by T cell infiltration and immune destruction of the lacrimal and salivary glands Is an autoimmune disease. Coded by this TCRBV13S2 gene Susceptibility to this condition and the salivary glands of patients with this condition There is evidence of increased levels of TCRBV13S2 gene mRNA (Kay et al. , 1992). Biopsies of minor salivary glands and peripheral blood samples meet this condition. Obtained from patients. Dental hand in unrelated conditions (burial wisdom tooth removal) A minor salivary gland biopsy from the patient undergoing surgery is also obtained. The biopsy Collagenase digested. Lymphocytes from the digested biopsy and their peripheral blood Samples are separated through a Ficoll gradient and the Vβ13.2 + T cell count is Immunohistochemistry using an anti-Vβ13.2, FIFT-C conjugated monoclonal antibody Quantitated by some combination of leukocyte counting and FACS analysis after staining. This TCRBV13S2 gene mRNA level is described in Example 1. Is measured. TCRBV13S2 gene per specific Vβ13.2 + T cell The level of mRNA is determined by the peripheral blood of the HGPSS patient (selective in diseased tissue). Return and induction) or in the salivary glands of patients with unrelated dental illness. Are higher in the salivary glands of patients with HGPSSS (Kay R.A., Hutchings C.J. ., Ollier W.E.R. (1995) Human Immunol. 42, 328-330 and Sumida T., et al. (19 92) J. Clin. Invest89, 681-685.).Example 4: Response to hyperantigen stimulation in four unrelated individuals   Lymphocytes were separated from their peripheral blood samples from four normal donors and 3 1.5x10 days6Penicillin, streptomycin, glutamine and cells / ml And 10% (v / v) heat-passivated fetal bovine serum in RPMI 1640 . Cells were supplemented with medium alone or 100 ng / ml SEB or 10 ng / ml TSST-1. Cultured in the culture medium. mRNA levels were previously described in Example 1. The mixture was measured using reverse transcription PCR. Vβ2.1 + and Vβ3. 1+ cell counts were determined by their CD25 status by FAC as described in Example 1 above. Count by S. Measurement is performed not only after 3 days of culture but also in advance (PRE) Was.   The results show that SEB selectively shows TCRBV3S1 in Vβ3.1 + T cells. Stimulating levels and TCSTV in TSST-1 in vβ2.1 + T cells It has authenticated that it does the same for 2S1. mRNA level Its relative increase in BV3S1 is 58 times that in BV2S1, Was 40 times higher (FIG. 7). Higher cell count for BV3S1 than for BV2S1 Unstimulated TCR mRNA levels with higher TCRBV3S1 gene Raises that it is transcribed at the level. FIG. 7 shows only the medium or Before or after 3 days of culture in medium supplemented with its superantigen SEB or TSST-1 2 shows TCRBV3S1 mRNA levels for each cell.   As described above, this result indicates that the TCRBV level in each cell indicates that CD25 expression (FIG. 8) was observed. It also indicates that it is a better indicator of antigen-specific T cell induction than measurement. FIG. Is a ratio of CD25 expression on antigen-induced T cells and intercellular TCRBV levels Shows a comparison.Example 5: Response of T cells to stimulation with conventional antigen   Lymphocytes are separated from certain peripheral blood samples and media only for 3 days as described above. Or an anti-Vβ3.1-specific monoclonal antibody, an anti-CD-28-specific Culture in medium supplemented with monoclonal antibody or a combination of both antibodies Nourished. Anti-CD28 alone did not sufficiently increase intercellular BV3S1 mRNA levels . Anti-Vβ3.1 did not sufficiently increase intercellular Vβ3S1 levels. Only Meanwhile, the intercellular BV3S1 mRNA levels comparable to those obtained with SEB Bell was incubated with both anti-CD-28 and anti-Vβ3.1 (FIG. 9) for 3 days. It was only obtained after feeding. FIG. 9 shows medium only (UnRx), anti-CD-28 (CD), anti-Vβ3.1 (Vβ) or a combination of the two (CD + Vβ) TCRBV3S1 obtained from lymphocytes cultured in defined media  Shows mRNA levels. Use certain anti-Vβ specific monoclonal antibodies Is equivalent to stimulation with conventional antigens. This experiment shows that this technique is a (Not only antigens) are believed to respond to T cells. Has proven to be suitable for And the CD-28 costimulation is It is as important for whole TCR gene transcription as it is for T cell expansion.Example 6: Analysis capability characteristics   To determine the stability during this analysis time, a TCRBV17S1-specific mR NA was reverse transcribed, amplified, cloned and sequenced. Clone the clone as described above Mutated in the TCRBC region, comprising a short TCRAC sequence and A measurement contaminant for the native template To be used.   15,000 molecules of the native template can be used for one day or eight weeks. The measurement was carried out using an independent PCR. The result is shown in FIG. And this conclusion The results show that during this period the accuracy of the analysis was not significantly affected. Testify.   FIG. 10 shows a cloned TC at 1 day (aggregation) or 8 weeks (segregation). 1 shows the measurement of 15,000 molecules of the RBV17S1 sequence.   The variable domain of the TCR β chain is a set of three small gene segments. Coded by matching. Therefore each different TCRBV17S1 In TC TCR, this TCRBV17S1 gene segment It would be a combination of D and BJ gene segments. This physiological variation is measured 5 different BV17S1 native to see if it affects its accuracy Mutant BV17S1 clones (BD1 and BJ1S1) was used. One of these templates is the same as its variant It has a BD and BJ combination; only four were different. If these strange If the segment affected the measurement, omit its upstream region of genetic diversity. Using a primer that is purely annealed to the TCRBC region The mold could have been measured and examined. Then, FIG. 11 shows a certain BV17 S1-specific primers (including genetically mutated regions) and certain βPCR5 ‘ With a single variant mix using both immers (excluding genetically mutated regions) Shows the measurement results of the five different BV17S1 clones.   The result is a natural variation in the TCR gene rearrangement. Affects the ability of a single mutant clone to provide accurate data Indicates no. In addition, one single mutant clone contains a polynucleotide with a TCR sequence. Similar efficiency can be measured for a lonal set or a single TCR template (data Is not shown).   FIG. 11 shows five different TCRBs with one single mutant BV17S1 clone. Demonstrating its accuracy in measuring 15,000 molecules of the V17S1 native template I have. The measurement was performed using a BV17S1 specific primer and a TCRBV specific primer. Made and used with both imers (βPCR5 ′). None of them There was no significant difference between the measurements obtained with these primers.   See if non-physiological variations in genetic sequence interfere with this test Thus, a variant was produced from one of its BV17S1 natural templates. Was. This mutant was homologous in all but one aspect to its native form. About 60 A short base paired sequence from the middle of the BV2S1 variable gene to the BV17 A (17/2/17) variant substituted into its middle part of the S1 sequence. This variant and its sky This altered sequence homologue to the native form naturally differs from the variant having a BD / BJ substitution. It rarely occurs between natural types. The measurement was performed with a specific BV17S1 specific primer. (Anneals to 5 'of the mutant) and a certain βPCR 5' (of the mutant (Annealed downstream) from the two templates. So FIG. 12 shows the results. FIG. 12 shows BV17S1-specific and βPCR5 ′ primers. BV17S1 (clone 7) and mutant BV17S1 (17 2/2/17 variant) shows the measurement of the template.   The result is an analog with BV2S1 (which will never happen naturally). Substitution of a portion of the BV17S1 sequence having a log section is a variant of the Measurement of its mutant template with a primer that anneals upstream of Indicates that it will stop. If annealed downstream of this mutant (βPCR5 ') If a primer is used, its native or mutant template There is not much difference between the accuracy of the measurements.   Accurate measurement of the range of natural template by one mutant To see if it was a unique feature of a different BV One secondary measurement mutant was created using the 17S1 native template. as a result Is shown in FIG. The results show that both variants correct both native templates. Demonstrates that it can be measured reliably. FIG. 13 shows the mutations in each of them. BV17S1 native template with clones (clone 1 and 7 shows the measurement of loan 7). Ultimately, this analysis covers a range of natural The ability to measure was determined. TCRBV17S1 template 100,000, 10,000, and 1,000 molecules were measured (FIG. 14). Mutant The inter-assay counts are comparable across this range of molecules, with approximately 23% there were. In this test, a 10-fold difference in the number of templates is easily separable. Was. This measurement is based on previously encountered in vitro experiments. It was intended to cover the range exceeding any number of molecules.   FIG. 14 shows measurements of different numbers of molecules of the native TVRBV17S1 template. You.   In short, this contaminant, quantitative PCR method has about 23% accuracy. TCR mRNA content that would have been encountered in vitro (and probably in vivo) The child can be measured. Intracellular TCR mRNA molecular level after appropriate stimulation Should be able to detect this T cell induction easily, since Also do). One single mutant template for each TCRBV gene Are all monoclonal, oligoclonal and polyclonal TCR mR Necessary for measuring NA sets and the accuracy of the analysis is not It seems to be.Example 7: TCRBV remains at rest and after activation Gene promoter function   Data from Example 1 show that intracellular mRNA levels were both at rest and after activation. And that there is diversity among different TCRBV genes. Individual Given the sequence differences that occur between the TCRBV gene promoters At times, this appears to indicate a difference in gene transcription.   To test this, the rat TCRBV promoter was genomically amplified by PCR. DNA and cloned into pGEM-T Easy vector (Promega) And sequenced. Their promoters from different TCRBV genes Is subcloned into the luciferase reporter gene vector, pXP2. Was launched. These constructs serve as co-transformant controls (Renilla Lucifera). Electroporation together with the thymidine kinase promoter to control the expression of Into a human T cell line, Jurkat. This cell, 40 hours after transformation in medium alone or medium supplemented with PMA at 10 ng / ml Cultured. The PMA pharmaceutically mimics TCR induction. 40 hours later, the cells Was recovered and dissolved. Firefly luciferase (TCRBV gene regulated) and Renilla A luciferase assay was performed using the dual luciferase analyzer (Progma). And the ratio is shown in FIG.   These data indicate that strongly different TCRBV genes (BV5S1 and BV5S2 At different rates, even if they are one of the same family And transcribed from each other after activation. These data indicate the intercellular TCR m RNA levels reflect differences in TCRBV-specific mRNA products It appears to be validating the above statement that it may be. Intercellular mRNA level The degree of difference seen in the reporter construct is greater than that observed in the reporter construct You should know that. This is probably due to its reporter composition Probably because it did not contain the TCRBV enhancer. This TCR The BV enhancer is relatively very strong compared to its promoter and Significantly increase the luciferase product in the experiment. FIG. 15 shows only the culture medium (●). Or Jakat T cells after culturing for 40 hours in medium (培 地) supplemented with PMA Into which a different promoter-pXP2 construct was introduced. Shows relative activity. The information provided in Examples 4 to 7 is: (1) In response to TSST-1 and SEB in four or more individuals Show that intercellular TCR mRNA is increased specifically for each cell; (2) Intercellular TCR mRNA is an antigen stimulation detector superior to CD25 expression Certify that (3) Some similar increase in that level of TCR mRNA indicates that the T cell Not only when co-stimulated with anti-CD-28 but also with conventional antigen stimulation (some Vβ -Considered by specific monoclonal antibodies). ; (4) This quantitative PCR method is accurate (variation between assays of about 25% or less). Physiology that is stable over time and occurs in the TCR gene Unaffected by chemical sequence variation. However, the analysis is unphysiological Sensitive to genetic mutations; and (5) Rat TCR gene transformed in human Jurkat T cell line Luciferase reporter gene analysis data using a promoter Demonstrates that TCR gene transcription increases and changes after T cell stimulation Different TCRBV genes, both during resting and after stimulation .

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ， ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，Ｅ Ｅ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ， ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，Ｕ Ｚ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page    (81) Designated country EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, I T, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ , CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, KE, L S, MW, SD, SZ, UG, ZW), EA (AM, AZ , BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AL , AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CU, CZ, DE, DK, E E, ES, FI, GB, GE, GH, GM, GW, HU , ID, IL, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, M D, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL , PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, US, U Z, VN, YU, ZW

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １． Ｔ細胞の集団内において抗原応答Ｔ細胞を同定する方法であって、その方 法は以下のステップを含む。 （１）その抗原に応答したＴ細胞を含むある試料を得ること、および （２）ある複数の特異的Ｔ細胞受容体のいずれかに対して個々に又はＴ細胞受 容体のある複数のサブセットのいずれかに対して個々に、ある特異的Ｔ細胞受容 体をコードしているある遺伝子の発現又はＴ細胞受容体のあるサブセットをコー ドしている遺伝子の発現が、特異的Ｔ細胞受容体陽性Ｔ細胞ごと又は特異的Ｔ細 胞受容体陽性Ｔ細胞サブセットごとに、その抗原に応答しなかったＴ細胞を含む ある試料における前記遺伝子のその発現に比較して、増加しているかどうかを決 定すること。 ２．Ｔ細胞の集団における抗原応答Ｔ細胞を同定する請求項１記載の方法であっ て、その方法は以下のステップを含む。 （１）その抗原に応答したＴ細胞を含むある試料を得ること、 （２）ある複数の特異的Ｔ細胞受容体のいずれかに対して個々に又はＴ細胞受 容体のある複数のサブセットのいずれかに対して個々に、あるＴ細胞受容体に対 して特異的又はＴ細胞受容体のあるサブセットに対して特異的であるＴ細胞受容 体ｍＲＮＡの量を、特異的Ｔ細胞受容体陽性Ｔ細胞ごとまたは特異的Ｔ細胞受容 体陽性Ｔ細胞のあるサブセットごとに、ステップ（１）において得られる試料に おいて、決定すること、および （３）どちらのＴ細胞受容体ｍＲＮＡが特異的Ｔ細胞ごとにステップ（１）に おいて得られるその試料中で増加するかを、その抗原に応答しなかったＴ細胞を 含むある試料中での増加量と比較して決定すること。 ３．前記ステップ(１)はその抗原に応答しなかったＴ細胞を含むある試料(ａ)と その抗原に応答したＴ細胞を含むある試料（ｂ）を含み、ステップ(３)にお いてどちらのＴ細胞ｍＲＮＡが特異的Ｔ細胞ごとに試料（ｂ）において増加した かを試料（ａ）と比較して決定する請求項２記載の方法。 ４．前記試料（ａ）はある個体のある非疾患部位から採取され、且つ試料（ｂ） はその個体のある疾患部位から採取される請求項３記載の方法。 ５．前記試料（ａ）はある非疾患個体から採取され、且つ試料（ｂ）はある疾患 個体から採取される請求項３記載の方法。 ６．前記Ｔ細胞受容体のそのサブセットはあるサブセットであってここにおいて それぞれのＴ細胞受容体はある特異的Vβ領域を含む請求項１〜５のいずれかに 記載の方法。 ７．前記Ｔ細胞受容体のそのサブセットはあるサブセットであってここにおいて それぞれのＴ細胞受容体はある特異的Vα領域を含む請求項１〜５のいずれかに 記載の方法。 ８．前記Ｔ細胞受容体のそのサブセットはあるサブセットであってここにおいて それぞれのＴ細胞受容体はある特異的Vα領域およびある特異的Vβ領域を含む先 行する請求項のいずれかに記載の方法。 ９．前記Ｔ細胞受容体のそのサブセットはあるサブセットであってここにおいて それぞれのＴ細胞受容体はある特異的Ｊ領域を含む請求項８記載の方法。 １０．前記Ｔ細胞受容体ｍＲＮＡのその量が定量ＰＣＲを使って決定される請求 項２〜９のいずれかに記載の方法。 １１．前記定量ＰＣＲは逆転写競合ＰＣＲ(ＲＴ−ＰＣＲ)である請求項１０記載 の方法。 １２．前記Ｔ細胞受容体陽性Ｔ細胞の数又はＴ細胞受容体陽性Ｔ細胞の数がある 特異的サブセットにおいてある特異的Ｔ細胞受容体又はＴ細胞受容体のある特異 的サブセットに結合する抗体を使って決定される先行する請求項のいずれかに記 載の方法。 １３．前記抗体はある特異的Vβ領域抗体である請求項１２記載の方法。 １４．前記抗体はある特異的Vα領域抗体である請求項１２記載の方法。 １５．前記特異的サブセットにおける特異的Ｔ細胞受容体陽性Ｔ細胞の数又はＴ 細胞受容体陽性Ｔ細胞の数が、特異的Ｔ細胞受容体ＤＮＡの量又はＴ細胞受容体 ＤＮＡをある特異的サブセットにおいて定量することによって、ステップ(１)で 得られるその試料中において決定される請求項１〜１１のいずれかに記載の方法 。 １６．前記特異的ＤＮＡのその量は定量ＰＣＲを使って決定される請求項１５記 載の方法。 １７．前記定量ＰＣＲは競合ＰＣＲである請求項１６記載の方法。 １８．ある抗原仲介疾患を有するある患者を処理する方法であって、その方法は 請求項１の方法に関するある抗原仲介疾患に関連するある抗原応答Ｔ細胞を同定 すること（ａ）及びこの疾患を改善するために選ばれたある試薬の効果的な量を その患者投与すること（ｂ）を含む。 １９．前記試薬はその抗原に対するＴ細胞応答を減少又は排除する請求項１８記 載の方法。 ２０．前記方法はＴ細胞ワクチン接種又は抗ＴＣＲ抗体処理又はペプチド免疫化 を含む請求項１８又は１９記載の方法。[Claims] 1. A method for identifying antigen-responsive T cells in a population of T cells, comprising: The method includes the following steps.   (1) obtaining a sample containing T cells that responded to the antigen; and   (2) Individual or T cell receptor for any of a plurality of specific T cell receptors A specific T cell receptor individually for any of the subsets of the condition Encoding the expression of a gene encoding the body or a subset of the T cell receptor. The expression of the gene being loaded is either specific T cell receptor positive T cells or specific T cells. For each vesicle receptor positive T cell subset, include T cells that did not respond to the antigen Determine if the gene has increased relative to its expression in a sample Be determined. 2. 2. The method of claim 1, wherein antigen-responsive T cells in the population of T cells are identified. Thus, the method includes the following steps.   (1) obtaining a sample containing T cells that responded to the antigen;   (2) Individual or T cell receptor for any of a plurality of specific T cell receptors Individually for any of a number of subsets of the Cell receptor that is specific for a subset of T cell receptors The amount of somatic mRNA was determined for each specific T cell receptor positive T cell or for specific T cell receptor. For each subset of body positive T cells, the sample obtained in step (1) To decide, and   (3) Which T cell receptor mRNA is used in step (1) for each specific T cell T cells that did not respond to the antigen were expanded in the sample obtained in To be determined in comparison to the increase in a given sample. 3. The step (1) comprises the step of preparing a sample (a) containing T cells that did not respond to the antigen. A sample (b) containing T cells that responded to the antigen, and Either T cell mRNA increased in sample (b) for each specific T cell The method according to claim 2, wherein the determination is made by comparing with the sample (a). 4. The sample (a) is collected from a certain non-disease site of an individual, and the sample (b) 4. The method according to claim 3, wherein is collected from a disease site of the individual. 5. The sample (a) is collected from a non-disease individual, and the sample (b) is collected from a certain disease. 4. The method of claim 3, wherein the method is obtained from an individual. 6. The subset of the T cell receptor is a subset, wherein 6. The method according to claim 1, wherein each T cell receptor contains a specific Vβ region. The described method. 7. The subset of the T cell receptor is a subset, wherein 6. The method according to claim 1, wherein each T cell receptor contains a specific Vα region. The described method. 8. The subset of the T cell receptor is a subset, wherein Each T cell receptor contains a specific Vα region and a specific Vβ region. The method according to any of the preceding claims. 9. The subset of the T cell receptor is a subset, wherein 9. The method of claim 8, wherein each T cell receptor contains a specific J region. 10. Claims: The amount of the T cell receptor mRNA is determined using quantitative PCR Item 10. The method according to any one of Items 2 to 9. 11. The said quantitative PCR is reverse transcription competition PCR (RT-PCR). the method of. 12. There is the number of T cell receptor positive T cells or the number of T cell receptor positive T cells A specific T cell receptor or a specific of a T cell receptor in a specific subset Any of the preceding claims, determined using antibodies that bind to the The method described. 13. The method according to claim 12, wherein the antibody is a specific Vβ region antibody. 14． The method according to claim 12, wherein the antibody is a specific Vα region antibody. 15. The number or T of specific T cell receptor positive T cells in said specific subset The number of cell receptor positive T cells is determined by the amount of specific T cell receptor DNA or T cell receptor By quantifying DNA in a specific subset, in step (1) A method according to any of the preceding claims, determined in the sample obtained. . 16. 16. The method of claim 15, wherein the amount of the specific DNA is determined using quantitative PCR. The method described. 17． 17. The method according to claim 16, wherein the quantitative PCR is a competitive PCR. 18. A method of treating a patient having an antigen-mediated disease, the method comprising: 2. Identifying an antigen-responsive T cell associated with an antigen-mediated disease according to the method of claim 1. (A) and the effective amount of certain reagents selected to ameliorate the disease Administering to the patient (b). 19. 19. The method of claim 18, wherein the reagent reduces or eliminates a T cell response to the antigen. The method described. 20. The method comprises T cell vaccination or anti-TCR antibody treatment or peptide immunization 20. The method according to claim 18 or 19, comprising:
JP50035099A 1997-05-27 1998-05-27 Immunological method Pending JP2001517958A (en)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB9710820.3A GB9710820D0 (en) 1997-05-27 1997-05-27 Immunological method
GB9710820.3 1997-05-27
PCT/GB1998/001382 WO1998054223A2 (en) 1997-05-27 1998-05-27 Immunological method

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2001517958A true JP2001517958A (en) 2001-10-09

Family

ID=10813057

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP50035099A Pending JP2001517958A (en) 1997-05-27 1998-05-27 Immunological method

Country Status (6)

Country Link
EP (1) EP1017724A2 (en)
JP (1) JP2001517958A (en)
AU (1) AU728909B2 (en)
CA (1) CA2291004A1 (en)
GB (1) GB9710820D0 (en)
WO (1) WO1998054223A2 (en)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016005466A (en) * 2007-03-05 2016-01-14 株式会社癌免疫研究所 Cancer antigen-specific t-cell receptor gene, peptide encoded by the gene, and use of them
JP2017046698A (en) * 2011-06-28 2017-03-09 株式会社癌免疫研究所 Receptor gene for peptide cancer antigen-specific t cell
US10500257B2 (en) 2003-06-27 2019-12-10 International Institute Of Cancer Immunology, Inc. Method of selecting WT1 vaccine adaptive patient

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1243327A1 (en) * 2001-03-19 2002-09-25 BioChip Technologies GmbH Suface with a pattern of cells and method for its production
GB0128153D0 (en) * 2001-11-23 2002-01-16 Bayer Ag Profiling of the immune gene repertoire

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2671356B1 (en) * 1991-01-09 1993-04-30 Inst Nat Sante Rech Med METHOD FOR DESCRIBING ANTIBODY (AB) DIRECTORIES AND T CELL RECEPTORS (TCR) IN THE INDIVIDUAL'S IMMUNE SYSTEM.
CA2116526A1 (en) * 1991-08-28 1993-03-18 William V. Williams T cell receptor-based therapy for rheumatoid arthritis
WO1994014067A1 (en) * 1992-12-14 1994-06-23 T Cell Sciences, Inc. Diagnosis and therapy of sarcoidosis
AU3878697A (en) * 1996-06-20 1998-02-02 Cornell Research Foundation Inc. Identification of abnormalities in the expression of t and cell antigen receptors as indicators of disease diagnosis, prognosis and therapeutic predictors

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10500257B2 (en) 2003-06-27 2019-12-10 International Institute Of Cancer Immunology, Inc. Method of selecting WT1 vaccine adaptive patient
JP2016005466A (en) * 2007-03-05 2016-01-14 株式会社癌免疫研究所 Cancer antigen-specific t-cell receptor gene, peptide encoded by the gene, and use of them
US10093977B2 (en) 2007-03-05 2018-10-09 International Institute Of Cancer Immunology, Inc. Cancer antigen-specific T-cell receptor gene, peptide encoded by the gene, and use of them
US10669584B2 (en) 2007-03-05 2020-06-02 International Institute Of Cancer Immunology, Inc. Cancer antigen-specific T-cell receptor gene, peptide encoded by the gene, and use of them
JP2017046698A (en) * 2011-06-28 2017-03-09 株式会社癌免疫研究所 Receptor gene for peptide cancer antigen-specific t cell
US9803246B2 (en) 2011-06-28 2017-10-31 International Institute Of Cancer Immunology, Inc. Receptor gene for peptide cancer antigen-specific T cell
US10648036B2 (en) 2011-06-28 2020-05-12 International Institute Of Cancer Immunology, Inc. Receptor gene for peptide cancer antigen-specific T cell

Also Published As

Publication number Publication date
CA2291004A1 (en) 1998-12-03
AU728909B2 (en) 2001-01-18
GB9710820D0 (en) 1997-07-23
AU7663198A (en) 1998-12-30
WO1998054223A2 (en) 1998-12-03
EP1017724A2 (en) 2000-07-12
WO1998054223A3 (en) 1999-03-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Thornton et al. Helios+ and Helios− Treg subpopulations are phenotypically and functionally distinct and express dissimilar TCR repertoires
Lever et al. Resident macrophages reprogram toward a developmental state after acute kidney injury
Miyake et al. Genetically determined interferon‐γ production influences the histological phenotype of lupus nephritis
CN101370946B (en) Method and apparatus for correlating levels of biomarker products with disease
CN105189779B (en) The immunocompetence carried out by adaptive immunity receptor diversity and Clonal characterization is assessed
Hattori et al. Demyelinating and axonal features of Charcot–Marie–Tooth disease with mutations of myelin‐related proteins (PMP22, MPZ and Cx32): a clinicopathological study of 205 Japanese patients
Weyand New insights into the pathogenesis of rheumatoid arthritis
Pae et al. Cyclin D3 drives inertial cell cycling in dark zone germinal center B cells
McElwaine et al. Microarray transcript profiling distinguishes the transient from the acute type of megakaryoblastic leukaemia (M7) in Down's syndrome, revealing PRAME as a specific discriminating marker
Norris et al. Oligoclonal expansion of intraepidermal T cells in psoriasis skin lesions
CN103097888A (en) Monitoring health and disease status using clonotype profiles
CN101641451A (en) Cancer susceptibility variants on the chr8q24.21
Battistini et al. γδ T cell receptor analysis supports a role for HSP 70 selection of lymphocytes in multiple sclerosis lesions
Julé et al. Th1 polarization defines the synovial fluid T cell compartment in oligoarticular juvenile idiopathic arthritis
JP2003529315A (en) Components and methods for disease diagnosis and treatment
JPH05504409A (en) Diagnosis and treatment of diseases
KR20200081380A (en) Genetic regulation
Ismaïl et al. Polymorphism in transporter antigen peptides gene (TAP1) associated with atopy in Tunisians
Makino et al. Extrathymic differentiation of a T cell bearing invariant Vα14Jα281 TCR
Ajith et al. Humanized mouse model as a novel approach in the assessment of human allogeneic responses in organ transplantation
JP2001517958A (en) Immunological method
Jones et al. Epitope spreading is not required for relapses in experimental autoimmune encephalomyelitis
MX2010011445A (en) Single nucleotide polymorphisms (snp) and association with resistance to immune tolerance induction.
Zang et al. Human anti‐idiotypic T cells induced by TCR peptides corresponding to a common CDR3 sequence motif in myelin basic protein‐reactive T cells
US20240067970A1 (en) Methods to Quantify Rate of Clonal Expansion and Methods for Treating Clonal Hematopoiesis and Hematologic Malignancies