JP2001501100A

JP2001501100A - Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼおよびグリーン蛍光タンパク質融合遺伝子

Info

Publication number: JP2001501100A
Application number: JP10516659A
Authority: JP
Inventors: エイ．スザレイ，アルダー; ワン，ゲフ; ワン，ユバオ
Original assignee: ロマリンダユニバーシティ
Priority date: 1996-10-04
Filing date: 1997-09-24
Publication date: 2001-01-30
Also published as: DE69726306D1; DE69726306T2; AU4500497A; US5976796A; WO1998014605A1; EP0934425A4; CA2267068C; AU730040B2; CA2267068A1; ATE254664T1; EP0934425A1; EP0934425B1

Abstract

(57)【要約】 RenillaルシフェラーゼのcDNAおよび「ヒト化」Aequoreaグリーン蛍光タンパク質のcDNAを含む融合遺伝子が提供される。この融合遺伝子を使用して、新規のタンパク質「Renilla-GFP融合タンパク質」を産生させた。これは、Renillaルシフェラーゼのルシフェラーゼ活性およびGFPの緑色の蛍光の両方を示す。Renilla-GFP融合遺伝子は、UV光および酵素活性によって遺伝子発現を定量的にモニターするための二連のマーカーとして有用である。

Description

【発明の詳細な説明】 Renillaルシフェラーゼおよびグリーン蛍光タンパク質融合遺伝子関連参照出願本願は、「Renillaルシフェラーゼおよびグリーン蛍光タンパク質融合遺伝子の構築および発現」と題された米国特許出願08/771,850（1996年12月23日出願）に対応する国際出願であり、そして「E.collおよび哺乳動物細胞におけるRenill aルシフェラーゼおよびグリーン蛍光タンパク質融合遺伝子の構築および発現」と題された米国仮特許出願60/027,657（1996年10月４日出願）の一部継続出願であり、その内容は、本明細書中でその全体が参考として援用される。技術背景グリーン蛍光タンパク質（GFP）は、クラゲAequorea victoriaから精製された発光タンパク質である。GFPは、外因性の青色光を含む光源およびRenillaルシフェラーゼ触媒反応からのエネルギー転移を受容することにより緑色光を発光し得る。GFPの遺伝子は、クローン化され、そしてそのcDNAは、種々の生物系（細菌、真菌、および哺乳動物組織を含む）における強力なレポーター遺伝子である。 UV光刺激GFP蛍光は、補因子を必要とせず、そして遺伝子産物単独で光学顕微鏡下で生きている細胞の検出を可能にするのに充分であり得る。野生型GFPタンパク質の改変により、明るい発光を伴う赤方偏移のGFP改変体もまた、産生されている。これらの改変体には、EGFP、GFPS65T、およびRSGFが挙げられる。最近になって、GFPはヒト細胞株およびインビボで発現された。C.Kae ther,H.H.Gerdes「Visuallzation of protein transport along the secretory pathway using green fluorescent protein」FEBS-Lett．1995;369:267-71。「ヒト化」GFPは、１例を除いてアミノ酸配列を変化させないヌクレオチド変化を伴って合成された。 Renillaルシフェラーゼは、Renilla reniformisから精製された酵素である。この酵素は、酸素の存在下でセレンテラジンの酸化的脱炭酸を触媒して、478nm の極大発光波長を伴う青色光を生成する。しかし、Renilla reniformis細胞において、この反応は、グリーン蛍光タンパク質へのエネルギー転移に起因して、51 0nmの極大波長を有する緑色へと偏移する。 Renillaルシフェラーゼの遺伝子（ruc）をクローン化し、そしてそのcDNAが種々の生物系においてレポーター遺伝子として有用であることが示された。D.C.Pr asher、V.K．Eckenrode,W.W．Ward,F.G．Prendergast，M.J.Cormier．「Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein」Gene 1992 :111:229-33。適切なプロモーターを遺伝子カセットとしてcDNAに提供することにより、遺伝子を細菌、形質転換植物細胞、および哺乳動物細胞中で発現させた。効率の高いRenillaルシフェラーゼは、遺伝子発現研究についてのマーカー酵素として有用な形質である。 GFPおよびRenillaルシフェラーゼの形質が与えられると、UV光線励起によって定量的に、または酵素活性測定によって定性的に、遺伝子発現をモニターするためにRenillaルシフューラーゼ酵素およびGFPの両方の機能を組み合わせた単一のタンパク質を有することが有用である。発明の要旨本発明の１つの実施態様に従って、RenillaルシフェラーゼのcDNAおよび「ヒト化」Aequoreaグリーン蛍光タンパク質のcDNAを含む融合遺伝子構築物が提供される。融合遺伝子構築物を使用して、原核生物細胞および真核生物細胞の両方を形質転換させた。１つの構築物を約65kDaの分子量を有するポリペプチドとして発現させた。このポリペプチド「Renilla-GFP融合タンパク質」は、二機能性であり、Renillaルシフェラーゼのルシフェラーゼ活性およびGFPの緑色の蛍光の両方を示した。Renilla-GFP融合遺伝子は、生きている細胞における遺伝子発現をモニターし、そして酵素活性によって定量的にモニターするための二連マーカーとして有用である。本発明は、ルシフェラーゼ活性およびGFP活性の両方を有するポリペプチド、またはルシフェラーゼおよびGFPの両方を有するポリペプチドの生物学的に活性な改変体を含むタンパク質、あるいはルシフェラーゼ活性およびGFP活性の両方を有するポリペプチドに親和性を有するモノクローナル抗体によって認識されるタンパク質を含む。ポリペプチドは、組換えDNA方法によって作製され得る。本発明は、さらに、ポリペプチドに免疫反応する高親和性のモノクローナル抗体を含む。この抗体は、IgMクラス、IgGクラス、およびIgAクラスからなる群から選択されるFc部分を有し得る。本発明はまた、ルシフェラーゼ活性およびGFP 活性の両方を有するポリペプチドに免疫反応する高親和性のモノクローナル抗体を含む。本発明は、さらに、ルシフェラーゼ活性およびGFP活性の両方を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、またはその相補鎖、およびそのような配列にハイブリダイズし、そしてルシフェラーゼ活性およびGFP活性の両方を有するポリペプチドを発現においてコードするポリヌクレオチド配列またはその相補鎖を含む。本発明は、さらに、ルシフェラーゼ活性およびGFP活性の両方を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、精製されそして単離されたDNA分子またはその相補鎖を含む。このポリヌクレオチドは、配列番号１に示される配列を含み得る。本発明は、さらに、ルシフェラーゼ活性およびGFP活性の両方を有するポリペプチドをコードするDNA分子を含むベクターを含む。このポリヌクレオチドは、配列番号１に示される配列を含み得る。ベクターは、宿主細胞を安定に形質転換するかまたは一過的にトランスフェクトするために使用され得る。本発明は、さらに、ルシフェラーゼ活性およびGFP活性の両方を有するポリペプチドの作製方法を含む。この方法は、まず、ルシフェラーゼ活性およびGFP活性の両方を有するポリペプチドをコードする遺伝子カセットを含むポリヌクレオチドベクターで形質転換した微生物を培養する工程を含む。次に、ルシフェラーゼ活性およびGFP活性の両方を有するポリペプチドが回収される。本発明は、さらに、ルシフェラーゼ活性測定に基づくプロモーター活性化およびGFP蛍光を定量する方法を含む。この方法は、本発明に従って、ポリペプチドを提供する工程を含む。本発明は、さらに、ルシフェラーゼ活性およびGFP活性の両方を有するポリペプチドと免疫反応するモノクローナル抗体を作製する方法を含む。この方法は、まず宿主の抗体産生細胞からのこのポリペプチドに対する抗体の産生を誘導するために充分な量でルシフェラーゼ活性およびGFP活性の両方を有するポリペプチドを宿主に投与する工程を含む。次に、抗体産生細胞が宿主から回収される。次いで、細胞ハイブリッドを、実質的に無限の増殖をし得る細胞に抗体産生細胞を融合させることにより形成する。次いで、ハイブリッドを培養する。次に、モノクローナル抗体をハイブリッドの産物として回収する。本発明は、さらに、ルシフェラーゼ活性およびGFP活性の両方を有するポリペプチドをコードする遺伝子融合構築物を使用する細胞において遺伝子発現を定量的および定性的にモニターする方法を含む。この方法は、まず、Renillaルシフェラーゼ活性およびGFP活性の両方を有するポリペプチドをコードする遺伝子融合構築物を提供する工程を含む。次に、遺伝子融合構築物を細胞に導入する。次いで、遺伝子融合構築物を含む細胞を、細胞がポリペプチドを発現することが可能な様式で維持する．，次いで、この細胞をルシフェラーゼ活性および蛍光活性について測定する。構築物は、配列番号１に示されるポリヌクレオチド配列を含み得る。本発明は、さらにルシフェラーゼ活性およびGFP活性の両方を有するポリペプチドをコードする遺伝子融合構築物を用いて細胞内で遺伝子発現を定量的および定性的にモニターする方法を含む。この方法は、まず、ルシフェラーゼ活性およびGFP活性の両方を有するポリペプチドをコードする遺伝子融合構築物を提供する工程を含む。次に、遺伝子融合構築物を細胞に導入する。次いで、遺伝子融合構築物を含む細胞を、細胞がポリペプチドを発現することが可能な様式で維持する。次に、細胞をルシフェラーゼ活性および蛍光活性について測定する。図面の説明本発明の、これらおよび他の特徴、局面、および利点は、以下の説明、添付の請求の範囲、および添付の図面を参照することによって、より良好に理解される。ここで：図１は、本発明に従って、E.coliにおける遺伝子発現について、Renillaルシフェラーゼおよび「ヒト化」GFP融合遺伝子カセットの構築物を示す模式図である。ここで、「RG」（上部）は、５’末端におけるRenillaルシフェラーゼコード配列（ruc）を伴う融合遺伝子カセットであり、そして「GR」（下部）は、５ ’末端でGFPコード配列（gfp_h）を伴う融合遺伝子カセットである；図２は、本発明に従って、哺乳動物細胞における遺伝子発現について、Renill aルシフェラーゼおよび「ヒト化」GFP融合遺伝子カセットの構築物を示す模式図である。ここで、「RG」（上部）は、５’末端におけるRenillaルシフェラーゼコード配列（ruc）を伴う融合遺伝子カセットであり、そして「GR」（下部）は、５’末端でGFPコード配列（gfp_h）を伴う融合遺伝子カセットである；図３は、E.coliに、おけるRG遺伝子構築物（上部）およびE.coliにおけるGR遺伝子構築物（下部）のクローニングおよび発現のために使用したプラスミドの地図である；図４は、哺乳動物系におけるRG遺伝子構築物（上部）および哺乳動物系におけるGR遺伝子構築物（下部）のクローニングおよび発現のために使用したプラスミドの地図である；図５は、GFP活性を示すために蛍光顕微鏡および蛍光画像法を用いる、融合遺伝子によって形質転換された細胞の顕微鏡写真である；図６は、E.coli（上部）および哺乳動物細胞（下部）における融合遺伝子構築物のルシフェラーゼ活性の棒グラフである；図７は、E.coliにおけるRenillaルシフェラーゼ活性およびGFP活性の分光学的な測定値である；図８は、抗Renillaルシフェラーゼ抗体を用いたE.coliにおける融合遺伝子発現の検出を示すウエスタンブロットである；図９は、RG融合遺伝子の発現を示す蛍光画像分析を用いるマウス胚幹細胞の顕微鏡写真である；そして図10は、RG融合遺伝子の発現を示す蛍光画像分析を用いるマウス胚の顕微鏡写真である。発明の説明本発明の１つの実施態様に従って、RenillaルシフェラーゼのcDNAおよび「ヒト化」Aequoreaグリーン蛍光タンパク質のcDNAを含む融合遺伝子が提供される。本発明の別の実施態様に従って、Renillaルシフェラーゼ活性およびGFP活性の両方を示す単一のポリペプチドが提供される。この二機能性ポリペプチドは、単一細胞レベル、細胞培養物、形質転換組織および器官において、ポリペプチドの蛍光に基づいて形質転換細胞の同定を容易にし得る。同時に、ポリペプチドはまた、プロモーターの活性化およびGFP蛍光をルシフェラーゼ活性測定に基づいて定量化するために使用され得る。 Renilla reniformisルシフェラーゼ（ruc）のcDNAは、種々のトランスジェニック種においてマーカー遺伝子として首尾良くクローン化されそして使用されてきている。例えば、Lorenz,W.W.McCann,R.O.，Longiaru,M.およびCormier,M.J. 「Isolation and expression of a cDNA encoding Renilla reniformis lucifer ase」Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1991:88:4438-4442;Mayerhofer,R.,Langridge,W. H.R.,Cormier,M.J.およびSzalay,A.A．「Expression of recombinant Renilla l uciferase in transgenic plants results in high levels of light emission 」The Plant Journal 1995;7:1031−1038;およびLorenz,W.W.，Cormier,M.J.,O ’Kane,D.J.,Hua，D.,Escher,A.A.Szalay,A.A．「Expression of the Renilla r eniformis luciferase gene in mammalian cells」J．Biolumin．Chemilumin．1 995;11:31-37を参照のこと。本明細書中でその全体を参考として援用する。同様に、Aequorea victoria由来のグリーン蛍光タンパク質（GFP）cDNAの移入および発現は、形質転換細胞において高レベルのGFPを生じ、これは、顕微鏡下で個々の細胞の簡便な可視化を可能にした。例えば、Chalfie,M.,Tu,Y.，Euskirchen， G.，Ward,W.W.およびPrasher,D.C．「Green fluorescent protein as a marker for gene expression」Science 1994;263:802-805を参照のこと、本明細書中でその全体を参考として援用する。本発明は、RenillaのcDNA（ruc）および「ヒト化」Aequorea GFP(gfp_h)のcDNA 由来の融合遺伝子の産生を含む。「ヒト化」Aequorea GFP(gfp_h)の記載は、例えば、Zolotukhin,S.,Potter,M.およびHuaswirth,W.W.,Guy,J.ならびにMuzyczka,N .「A"humanized"green fluorescent protein cDNA adapted for high-level e xpression in mammalian cells」J．Virology 1996:70:4646-4654（これは、その全体を参考として援用する）に見い出され得る。第１の融合遺伝子（「RG融合遺伝子」（配列番号１）と称され、そして図１および２の上部に示される）は、５アミノ酸であるAla-Ala-Ala-Ala-Thr（配列番号１の残基312-316）をコードする15ポリヌクレオチドリンカー配列に改変3'末端で連結したRenilla cDNAを含み、続いてインタクトなGFP cDNAの5'末端を含む。第２の融合遺伝子（「GR融合遺伝子」（配列番号２）と称され、そして図１および２の下部に示される）は、９アミノ酸であるGly-Try-Gln−Ile-Glu-Phe-Ser -Leu-Lys（配列番号２の残基239-247）をコードする27ポリヌクレオチドリンカー配列に連結したGFPのcDNAを含み、続いてRenilla cDNAの5'末端を含む。両方の遺伝子を、原核生物のpGEM-5zf(+)発現ベクターおよび真核生物のpCEP4発現ベクター中に配置し、そしてE．coliおよび種々の哺乳動物細胞株に形質転換し、そしてマウス胚に微量注入した。PT₇は、遺伝子発現に使用された細菌T7プロモーターであった。P_cmvは、マウス線維芽細胞、胚幹細胞、およびマウス胚での遺伝子発現に使用されたCMVプロモーターであった。予期せぬことに、RG融合遺伝子で形質転換した細胞が、顕微鏡下でUV光に対して最小の応答を示したGR融合遺伝子を含む場合、この細胞のみが強い蛍光を示した。対照的に、RG遺伝子カセットまたはGR遺伝子カセットで形質転換した細胞のホモジネートにおけるルシフェラーゼ測定値は、細菌および哺乳動物細胞の両方において互いに区別がつかなかった。さらに、分光蛍光分析データは、RG融合遺伝子含有細胞中で、RenillaルシフェラーゼとGFPとの間でのエネルギー転移があったことを示すが、GR融合遺伝子含有細胞中でのこのようなエネルギー転移は示さなかった。RG融合遺伝子含有細胞におけるタンパク質発現を分析し、65kDaポリペプチドであることを見出した。融合遺伝子の構築および発現の詳細な説明、ならびにそれらのタンパク質産物の分析を、以下に示す。融合遺伝子構築物の産生： E．coliおよび哺乳動物系における遺伝子構築物のクローニングおよび発現のために使用されるベクターは、それぞれpGEM-5zf(+)（Promega）およびpCEP4であった。図３は、E．coli、pGEM-5zf(+)-RG（上部）におけるRG遺伝子構築物のクローニングおよび発現に使用されるプラスミドの地図であり、ならびにE．col i、pGEM-5zf(+)-GR（下部）におけるGR遺伝子構築物のクローニングおよび発現に使用されるプラスミドの地図である。両方とも、T7プロモーターの転写制御下にあった。形質転換されたE．coli株は、DLT101およびDH5αであった。同様に、図４は、哺乳動物系、pCEP4-RG（上部）におけるRG遺伝子構築物のクローニングおよび発現に使用されるプラスミドの地図であり、ならびに哺乳動物系、pCEP4-GR（下部）におけるGR遺伝子構築物のクローニングおよび発現に使用されるプラスミドの地図である。両方とも、CMVプロモーターの転写制御下にあった。形質転換された哺乳動物細胞株は、LM-TK-胚肝細胞および胚であった。５つのプライマーを、RGおよびGR遺伝子構築物をクローニングするために設計した。一重下線は、Shine-Dalgarno配列を示す。二重下線は、制限部位を示す。開始コドンは、太字である。太字のイタリックで示された配列は、rucおよびgfp_h の両方の遺伝子からの停止コドンの除去を示す。 AGAAGGAATTCAGCTTAAAGATG3' プライマー３、配列番号５：GFP5:5'GGGGTACC（KpnI） CCATGAGCAAGGGCGAGGAACT3' プライマー４、配列番号６：GFP3:5'GGGGTACC（KpnI） CCTTGTACAGCTCGTCCATGCCA3' AGGAGGTACCCCATGAGCAAG3' Renillaルシフェラーゼ-GFP融合遺伝子（RG遺伝子カセット）およびGFP-Renil laルシフェラーゼ融合遺伝子（GR遺伝子カセット）を、終止コドンを除き、そして制限酵素部位およびShine-Dalgarno配列を、当業者に公知の技術に従ってPCR を用いて、cDNAの5'末端に付与することにより構築した。PCR産物を、pGEM-T系を用いてクローニングした（Promega Corporation，Madison，WI）。プライマーを、下流のcDNAが上流のcDNAとともにインフレームであるように設計した。リンカー配列を図１および２に示し、そして上述する。クローニングの後、RGおよび GR遺伝子カセットは，pGEM-5zf(+)ベクターではT7、そしてpCEP4ベクターではCM Vの転写制御下にあり、これらをそれぞれ、E．coliおよび哺乳動物細胞における発現に使用した。融合遺伝子およびそれに対応するタンパク質産物の活性の決定：インビボでのGFP活性を以下のように可視化した。E．coli株DH5αを、プラスミドpGEM-5zf(+)-RGおよびpGEM-5zf(+)-GRで形質転換した。当業者に公知の技術によって、ポジティブコロニーを同定し、そしてLB培地中で100μｇ/mlのアンピシリン選択により培養した。12時間後、E．coli培養物の１滴をスライド上に乗せ、そして蛍光顕微鏡により、1000×倍率で可視化した。LM-TK^-細胞を、当業者に公知のリン酸カルシウム法を用いて、プラスミドpCEP4-RGおよびpCEP-GRでトランスフェクトした。培養皿を、トランスフェクションの12時間後、倒立蛍光顕微鏡を用いてモニターした。ルシフエラーゼ活性を、以下のようにアッセイした。形質転換したE．coliを、IPTG誘導の前後で、Turner TD 20e照度計（Turner Designs，Sunnyvale，CA）におけるルシフェラーゼアッセイに使用した。結果を、相対光単位として記録した。哺乳動物細胞を、トランスフェクションの36時間後に収集し、そしてルシフェラーゼ活性について測定した。補正発光スペクトルを、SPEX蛍光ログ（fluorolog）分光蛍光光度計を用いて、比モードでの操作により、分光蛍光分析的に検出した。蛍光発光を、390nmで励起した。バイオルミネッセンス発光を、励起光遮断、次いで酸性化メタノール中の0.1μｇのセレンテラジンの添加により記録した。400〜600nmの範囲の波長にわたる５つのスペクトルを、各サンプルについて平均化した。融合タンパク質を単離し、そして以下のように免疫活性を検出した。１mlのE. coli（OD₆₀₀=1.0）を採集した。400μｌの細胞懸濁緩衝液（0.1M NaCl，0.01M T ris-HCl pH7.6，0.001M EDTA，100μｇ/ml PMSF）および100μｌのローディング緩衝液（50mM Tris-HCl pH6.8，2% SDS，10%グリセロール，5% 2-メルカプトエタノール）を添加した。サンプルを４分間煮沸し、そして7.5%-20%勾配のSDS-ポリアクリルアミドゲルに装填した。ポリクローナル抗Renillaルシフェラーゼを、検出のために一次抗体として使用し、そしてヤギペルオキシダーゼ抗IgG（抗ウサギ）を二次抗体として使用した。ここで、図５を参照する。これは、形質転換したE．coli細胞（5A、左側）およびLM-TK-マウス線維芽細胞（5B、右側）におけるGFP活性の、蛍光顕微鏡および蛍光画像法による顕微鏡写真を示す。見られるように、RG融合遺伝子構築物で形質転換した個々のE．coli細胞および哺乳動物細胞は、浸油下で強い緑色の蛍光を示した。ここで、図６を参照する。これは、E．coli細胞（上部）および哺乳動物細胞（下部）における遺伝子構築物のルシフェラーゼ活性の棒グラフを示す。白い棒はプロモーター誘導の前の活性を示す。黒い棒はプロモーター誘導後の活性を示す。見られるように、RG融合遺伝子構築物で形質転換した細胞は、顕著なルシフェラーゼ活性（GR融合遺伝子構築物で形質転換した細胞では３倍減少した）を有する。ここで、図７を参照する。これは、種々の遺伝子構築物で形質転換したE．col iにおけるRenillaルシフェラーゼ活性およびGFP活性の分光学的測定値を示す。見られるように、Renillaルシフェラーゼ遺伝子（短い点線）を含有する細胞は、約478nmで１つだけの発光ピークを示す。GR遺伝子融合構築物を含有する細胞（細い線）もまた、約478nmで１つの発光ピークを示し、これはRenillaルシフェラーゼ活性のみを示す。対照的に、RG遺伝子融合構築物（太い線）を含む細胞は、390nmでの励起により、約510nmで１つの発光ピークを示す。セランテリジン（ coelanterizine）の添加による（長い点線）RG遺伝子融合構築物を含む細胞は、約478nmおよび510nmの両方で発光ピークを示す。これは、RenillaルシフェラーゼとGFPとの間のエネルギー転移がこれらの細胞IgGで起こったことを示す。GR遺伝子カセット形質転換細胞株におけるGFP活性の欠如は、とりわけ、融合タンパク質中での、不正確な折り畳みに起因するか、遊離GFP C末端の必要性に起因するか、またはGFP活性でのリンカーポリペプチドの干渉に起因する。ここで、図８を参照する。これは、抗Renillaルシフェラーゼ抗体を用いるE.c oliでの融合遺伝子発現を検出するために使用されるウェスタンブロットを示す。左から右へ、「C」レーンは、非形質転換E．coli細胞から抽出された総タンパク質を示す。「R」レーンは、ruc遺伝子単独で形質転換したE．coli細胞から抽出された総タンパク質を示す。「G」レーンは、gfp_h遺伝子単独で形質転換したE.c oli細胞から抽出した総タンパク質を示す。「RG」レーンは、RG融合遺伝子カセットで形質転換したE．coli細胞から抽出した総タンパク質を示す。「GR」レーンは、GR融合遺伝子カセットで形質転換したE．coli細胞から抽出した総タンパク質を示す。見られるように、ruc遺伝子単独で形質転換したE．coli細胞から抽出されたタンパク質は、約34kDaの分子量のバンドを示した。RG融合遺伝子カセットで形質転換したE．coli細胞から抽出したタンパク質は、約65kDaの分子量のバンドを示した。GR融合遺伝子カセットで形質転換したE．coli細胞から抽出したタンパク質は、約34kDaの分子量のバンドを示した。これらのデータは、GR融合遺伝子カセットで形質転換した細胞はルシフェラーゼを産生したが、融合タンパク質を産生しなかったことを意味する。GR融合カセットで形質転換した細胞による融合タンパク質の産生のこのような欠如は、これらの細胞内での緑色の蛍光活性の欠如を説明する。ここで、図９を参照する。これは、エレクトロポレーション手順により形質転換したマウス胚肝細胞におけるRG融合遺伝子の発現を示す蛍光画像分析を用いた顕微鏡写真を示す。形質転換したコロニーを、蛍光顕微鏡下でGFP活性に基づいて選択した。ここで、図１０を参照する。これは、マウス胚におけるRG融合遺伝子の発現を示す蛍光画像分析を用いた顕微鏡写真を示す。胚を、線状化したRGプラスミドで導入し、そしてインビトロで培養した。GFP活性の発現を、毎日、蛍光顕微鏡でモニターし、そして画像集積システムにより記録した。このデータに基づいて、本発明者らは、本明細書中で開示されるRG融合構築物が、真核生物および原核生物細胞の両方で発現され得、RenillaルシフェラーゼおよびGFP活性の両方を示す二機能性ポリペプチドを産生することを結論づける。この二機能性ポリペプチドは、蛍光に基づく単一細胞レベルでの、形質転換した細胞の同定のための有用な手段である。これは、形質転換した組織およびトランスジェニック生物において、ルシフェラーゼ活性を測定することによるプロモーター活性化の同時定量を可能にする。このタンパク質の二重機能性は、それらの生存宿主、ならびに発達中の胚および動物全体での細胞分化における細菌細胞のモニタリングを可能にする。本発明は、特定の好ましい実施態様の参考により考慮すべき詳細において議論されるが、他の実施態様も可能である。それゆえ、添付の請求の範囲の精神および範囲は、本明細書中に含まれる好ましい実施態様の説明に限定されるべきではない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＣＢ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ワン，ユバオアメリカ合衆国カリフォルニア 92354, ロマリンダ，アカデミーストリート 24929

Claims

【特許請求の範囲】１．ルシフェラーゼ活性およびGFP活性の両方を有するポリペプチドを含むタンパク質、またはその生物学的に活性な改変体。２．請求項１に記載の組換えタンパク質。３．配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のタンパク質。４．請求項１に記載のポリペプチドと免疫反応する、高親和性モノクローナル抗体。５．IgMクラス、IgGクラス、およびIgAクラスからなる群から選択されるFc部分を有する、請求項４に記載の抗体。６．請求項１に記載のポリペプチドと親和性を有するモノクローナル抗体によって認識される、タンパク質。７．精製されそして単離された形態の請求項１に記載のタンパク質。８．請求項１に記載のタンパク質をコードするDNA配列、またはその相補鎖。９．請求項８に記載のDNA配列にハイブリダイズし、そしてルシフェラーゼ活性およびGFP活性の両方を有するポリペプチドを発現においてコードするDNA配列、またはその相補鎖。１０．ルシフェラーゼ活性およびGFP活性の両方を有するポリペプチドと免疫反応する、高親和性のモノクローナル抗体。１１．ルシフェラーゼ活性およびGFP活性の両方を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはその相補鎖を含む、精製されそして単離されたDN A分子。１２．前期ポリヌクレオチドが、配列番号１に示される配列を含む、請求項１１に記載のDNA。１３．ルシフェラーゼ活性およびGFP活性の両方を有するポリペプチドをコードするDNA分子を含む、ベクター。１４．前期ポリヌクレオチドが、配列番号１に示される配列を含む、請求項１３に記載のベクター。１５．請求項１３に記載のベクターによって安定に形質転換またはトランスフェクトされる、原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞。１６．ルシフェラーゼ活性およびGFP活性の両方を有するポリペプチドを作製するための方法であって、以下の工程：（ａ）ルシフェラーゼ活性およびGFP活性の両方を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドで形質転換した微生物を培養する工程；および（ｂ）ルシフェラーゼ活性およびGFP活性の両方を有するポリペプチドを回収する工程、を包含する、方法。１７．ルシフェラーゼ活性測定に基づいてプロモーター活性化およびGFP蛍光を定量する方法であって、請求項１に記載のポリペプチドを提供する工程を包含する、方法。１８．ルシフェラーゼ活性およびGFP活性の両方を有するポリペプチドと免疫反応するモノクローナル抗体を作製する方法であって、以下の工程：（ａ）ルシフェラーゼ活性およびGFP活性の両方を有するポリペプチドを、該ポリペプチドに対する抗体の産生を誘導するのに充分な量で、宿主に投与する工程；（ｂ）抗体産生細胞を宿主から回収する工程；（ｃ）実質的に限界のない再増殖をし得る細胞に該抗体産生細胞を融合することによって、細胞ハイブリッドを形成する工程；（ｄ）該ハイブリッドを培養する工程；および（ｅ）該ハイブリッドの産物として該モノクローナル抗体を収集する工程、を包含する、方法。１９．ルシフェラーゼ活性およびGFP活性の両方を有するポリペプチドをコードする遺伝子融合構築物を使用して、細胞における遺伝子発現を定量的および定性的にモニターする方法であって、以下の工程：（ａ）Renillaルシフェラーゼ活性およびGFP活性の両方を有するポリペプチドをコードする遺伝子融合構築物を提供する工程；（ｂ）該細胞に該遺伝子融合構築物を導入する工程；（ｃ）該細胞に、該ポリペプチドを発現させることを可能にする様式で、該遺伝子融合構築物を含む該細胞を維持する工程；および（ｄ）ルシフェラーゼ活性および蛍光活性について該細胞を測定する工程、を包含する、方法。２０．前記提供する工程が、配列番号１に示されるポリヌクレオチド配列を含む構築物を提供することを包含する、請求項１９に記載の方法。２１．ルシフェラーゼ活性およびGFP活性の両方を有するポリペプチドをコードする遺伝子融合構築物を使用して、細胞において、遺伝子発現を定量的および定性的にモニターする方法であって、以下の工程：（ａ）請求項１に記載のタンパク質を含む遺伝子融合構築物を提供する工程；（ｂ）該細胞に該遺伝子融合構築物を導入する工程；（ｃ）該細胞に、該ポリペプチドを発現させることを可能にする様式で、該遺伝子融合構築物を含む該細胞を維持する工程；および（ｄ）ルシフェラーゼ活性および蛍光活性について該細胞を測定する工程、を包含する、方法。