KR20180085730A - 키메라 rsv, 면역원성 조성물, 및 사용 방법 - Google Patents

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에모리 유니버시티
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Abstract

본 개시내용은 키메라 호흡기 세포융합 바이러스 (chimeric respiratory syncytial virus)(RSV), 생약독화 백신 및 면역원성 조성물, 및 사용 방법에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 키메라 호흡기 세포융합 바이러스는 79번 위치에 M, 191번 위치에 R, 357번 위치에 K 및/또는 371번 위치에 Y를 갖는 RSV F 단백질을 암호화하는 돌연변이된 유전자 패턴을 갖는다.

Description

키메라 RSV, 면역원성 조성물 및 사용 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2015년 10월 29일자로 출원된 미국 가출원 제62/247,962호 및 2016년 5월 11일자로 출원된 미국 가출원 제62/334,547호에 대한 우선권을 청구한다. 이들 출원 각각의 전문이 모든 목적을 위해 본 원에 참조로 포함된다.
오피스 전자출원 시스템(EFS-WEB)을 통해 텍스트 화일로서 제출된 자료의 참조 포함
본 출원과 연관된 서열목록은 서류 사본 대신에 텍스트 포맷으로 제공되며, 본 출원의 명세서에 참조로 포함된다. 서열목록을 포함하는 텍스트 파일명은 15198PCT_ST25.txt이다. 텍스트 파일은 49 KB이고, 2016년 10월 26일에 생성되었고, EFS-Web을 통해 전자제출된 상태이다.
인간 호흡기 세포융합 바이러스 (respiratory syncytial virus)(RSV)는 기도 감염을 유발한다. 유아기 및 소아기 동안 병원 방문이 주요 원인이다. 팔리비주맙은 특정 고-위험 유아에서 RSV에 의해 유발되는 심각한 하기도 질환의 예방을 위해 FDA 승인된 RSV 융합 단백질 (RSV F)에 결합되는 인간화 단일클론 항체 (IgG)이다. 1개월 용량으로 투여되는 키메라 항체로서의 팔리비주맙은 제한된 효능을 가지며, 종종 알러지 반응을 유발한다. 이에 따라, RSV에 대한 개선된 치료 및 예방법을 확인할 필요가 있다.
백신은 통상 살아있는 바이러스 균주의 죽은 (불활성화) 또는 약화된 (약독화) 버젼이다. Kim 등은 포르말린-불활성화 RSV 백신의 투여가 충분히 효과적이지 못했음을 보고하고 있다. 참조[문헌(Am J Epidemiol 89, 422-434 (1969))]. 약독화 RSV 백신 후보는 중요한 안전성 장애에 직면하였고, 충분히 약독화되고 면역원성인 소아 RSV 생-약독화 백신 (live-attenuated vaccine)(LAV) 균주의 개발은 어려웠다. 참조[Collins 등 Progress in understanding and controlling respiratory syncytial virus: still crazy after all these years. Virus Res 162, 80-99 (2011)].
Karron 등은 RNA 합성 인자 M2-2의 개방형 해독 프레임 (open reading frame)(ORF)의 대부분이 결실된 RSV가 어린이들에서 항체 반응이 개선된 약독화 RSV 백신을 수득한다고 보고하고 있다 [참조: 문헌(Sci Transl Med 7, 312ra175 (2015))]. Meng 등은 독성 유전자의 표적화된 코돈 탈최적화에 의한 호흡기 세포융합 바이러스의 약독화 및 면역원성을 보고하고 있다. [참조: MBio 5, e01704-01714 (2014)]. 또한, 미국 공개출원 번호 2016/0030549를 참조하라. Hotard 등은 융합 활성 및 발병을 제어하는 인간 RSV 융합 단백질의 잔기를 보고하고 있다 [참조: 2015, J Virol 89:512-522]. Rostad 등은 저-융합 F 단백질에 의해 약독화된 재조합 호흡기 세포융합 바이러스 백신 후보가 코튼 래트에서의 도전에 대해 면역원성이고 보호됨을 보고하고 있다 [참조: J Virol, 2016, 90(16):7508-7518].
본원에 인용된 참조문헌은 선행 기술분야의 입장이 아니다.
발명의 요약
본 개시내용은 키메라 호흡기 세포융합 바이러스 (chimeric respiratory syncytial virus)(RSV), 생약독화 백신 및 면역원성 조성물, 및 사용 방법에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 키메라 RSV는 79번 위치에 M, 191번 위치에 R, 357번 위치에 K 및/또는 371번 위치에 Y를 갖는 RSV F 단백질을 암호화하는 돌연변이된 유전자 패턴을 갖는다. 특정 구현예에서, RSV F 단백질은 557번 위치에 V를 갖거나, F 단백질이 557번 위치가 V가 되도록 돌연변이된다.
특정 구현예에서, 79번 위치에 M, 191번 위치에 R, 357번 위치에 K, 및 371번 위치에 Y가 RSV F 단백질에 존재하지 않으며, 이때 천연 발생 RSV F 단백질은 그러한 특별한 아미노산 패턴을 갖는다, 즉 돌연변이체 RSV F 단백질은 적어도 1개의 아미노산 치환을 포함함으로써, 79번 위치에 M, 191번 위치에 R, 357번 위치에 K 및 371번 위치에 Y를 갖는 아미노산의 RSV F 단백질 패턴을 제공하는 천연 발생 서열과 비교하는 경우에 돌연변이된 RSF F 단백질이 79, 191, 357 또는 371번 위치에 적어도 1개의 개질을 갖도록 한다.
특정 구현예에서, 돌연변이된 RSV F 단백질은 RSV 라인 19에서 발견되는 F 단백질이 아닌 다른 RSV F 단백질, 예를 들어, 서브그룹 B의 RSV 균주 [예: "부에노스 아이레스(Buenos Aires)" (BAF) 균주]로부터 유래된다. 특정 구현예에서, RSV F 단백질은 서열확인번호: 3 또는 4를 함유하지 않거나, 서열확인번호: 3 또는 4와 실질적인 동일성을 갖지 않는다. 특정 구현예에서, 돌연변이된 RSV F는 서열확인번호: 1과 85% 또는 90% 초과의 동일성을 갖지만, 서열확인번호: 4와는 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 미만의 동일성을 갖는다. 특정 구현예에서, 돌연변이된 RSV F는 서열확인번호: 1과 85% 초과의 동일성을 갖지만, 서열확인번호: 4와는 99% 미만의 동일성을 갖는다.
특정 구현예에서, 돌연변이된 RSV F 단백질은 (서열확인번호: 1) MELLIHRSSAIFLTLAINALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKETKCNGTDTKVKLMKQELDKYKNAVTELQLLMQNTPAANRARREAPQYMNYTINTTKLNVSISKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNfIKNALLSTKAVVSLSNGVSVLTSRVLDLKNYINNQLLPIVNQQSCRJSNIETVIEFQQKNSRLLEITREFSVNAGVTTPLSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSSNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPIYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNIKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQADKCKVQSRVFCDTMYSLTLPSEVSLCNTDIFNSKYDCKIMTSKTDISSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASKRGIIKTFSNGCDYVSKGVDTVSVGNTLYYVNKLEGKLYVKGEPIINYYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRRSDELLHNVNTGKSTTNIMITAIIIVIIVVLLSLIAIGLL LYCKAKNTPVTLSKDQLSGINNIAFS, 또는 이의 변이체를 갖는다.
특정 구현예에서, 본 개시내용은 막횡단(transmembrane) 도메인이 결여되거나, 아미노산 1-524를 갖는 키메라 RSV F 단백질, 예를 들어, (서열확인번호: 13) MELLIHRSSAIFLTLAINALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKETKCNGTDTKVKLMKQELDKYKNAVTELQLLMQNTPAANNRARREAPQYMNYTINTTKNLNVSISKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNfIKNALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSRVLDLKNYINNQLLPIVNQQSCRISNIETVIEFQQKNSRLLEITREFSVNAGVTTPLSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSSNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPIYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNIKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQADKCKVQSNRVFCDTMYSLTLPSEVSLCNTDIFNSKYDCKIMTSKTDISSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLEGKNLYVKGEPIINYYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRRSDELLHNVNTGKSTTN을 계획한다.
특정 구현예에서, 변이체는 서열확인번호: 1과 95%, 98%, 또는 99% 초과의 서열 동일성 또는 유사성을 갖는다. 특정 구현예에서, 변이체는 1개, 2개, 3개 또는 그 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입이 있되, 단 79번 위치에 M, 191번 위치에 R, 357번 위치에 K, 및 371번 위치에 Y의 어떠한 치환도 존재하지 않는다. 특정 구현예에서, 치환은 보존(conserved) 치환이다.
특정 구현예에서, RSV F 변이체는 11번 위치에 V를 갖고, 20번 위치에 F를 가지며, 23번 위치에 A를 갖고, 45번 위치에 F를 가지며, 102번 위치에 T 또는 V를 갖고, 103번 위치에 V를 가지며, 119번 위치에 V를 갖고, 121번 위치에 A를 가지며, 123번 위치에 R을 갖고, 104번 위치에 S를 가지며, 129번 위치에 T를 갖고, 173번 위치에 A를 가지며, 242번 위치에 R을 갖고, 276번 위치에 N을 가지며, 518번 위치에 A를 갖고, 529번 위치에 V를 가지며, 554번 위치에 T를 갖거나, 이들의 조합이다.
특정 구현예에서, 본 명세서에 기재된 RSV F 단백질 서열의 변이체는 1개, 2개, 3개 또는 그 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 가지되, 단 79번 위치에 M, 191번 위치에 R, 357번 위치에 K, 및 371번 위치에 Y의 어떠한 치환도 존재하지 않는다. 특정 구현예에서, 치환은 보존 치환이다.
특정 구현예에서, 변이체는 1개 또는 2개 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입이 있되, 단 치환은 79번 위치에 M, 191번 위치에 R, 357번 위치에 K, 371번 위치에 Y, 및 557번 위치에 V의 어떠한 치환도 아니다. 특정 구현예에서, 치환은 보존 치환이다.
특정 구현예에서, 변이체는 1개, 2개 또는 3개 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입이 있되, 단 치환은 79번 위치에 M, 191번 위치에 R, 357번 위치에 K, 또는 371번 위치에 Y의 어떠한 치환도 아니다. 특정 구현예에서, 치환은 보존 치환이다.
특정 구현예에서, 변이체는 1개, 2개 또는 3개 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입이 있되, 단 치환은 79번 위치에 M, 191번 위치에 R, 357번 위치에 K, 371번 위치에 Y, 및 557번 위치에 V의 어떠한 치환도 아니다. 특정 구현예에서, 치환은 보존 치환이다.
특정 구현예에서, 변이체는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 20개 초과의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 함유하지 않되, 단 치환은 79번 위치에 M, 191번 위치에 R, 357번 위치에 K, 및 371번 위치에 Y의 어떠한 치환도 아니다. 특정 구현예에서, 치환은 보존 치환이다.
특정 구현예에서, 변이체는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 20개 초과의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 함유하지 않되, 단 치환은 79번 위치에 M, 191번 위치에 R, 357번 위치에 K, 371번 위치에 Y, 및 557번 위치에 V의 어떠한 치환도 아니다. 특정 구현예에서, 치환은 보존 치환이다.
특정 구현예에서, 키메라 RSV는 RSV NS1, NS2를 암호화하는 유전자를 가지며, G 단백질은 코돈-탈최적화시켜, NS1, NS2 및 G의 발현율이 야생형 A2 바이러스에 비하여 베로(Vero) 세포에서 1/2 초과까지 감소되도록 한다.
특정 구현예에서, 포유류 세포중 G의 발현율은 야생형 A2 바이러스에 비하여 베로 세포에서 1/3, 1/4, 1/5, 또는 1/10 초과까지 감소된다.
특정 구현예에서, NS1의 발현율은 야생형 A2 바이러스에 비하여 베로 세포에서 1/3, 1/4, 1/5, 또는 1/10 초과까지 감소된다.
특정 구현예에서, NS2의 발현율은 야생형 A2 바이러스에 비하여 베로 세포에서 1/3, 1/4, 1/5, 또는 1/10 초과까지 감소된다.
특정 구현예에서, SH 단백질을 암호화하는 유전자는 절단된 단백질이 발현되거나 어떠한 단백질도 발현되지 않도록 결실되거나 변화된다. 특정 구현예에서, M2-2를 암호화하는 유전자는 절단된 단백질이 발현되거나 어떠한 단백질도 발현되지 않도록 결실되거나 변화된다.
특정 구현예에서, F 단백질을 암호화하는 유전자는 557번 위치에 V가 아니거나, I가 557번 위치에 존재하도록 돌연변이된다.
특정 구현예에서, 개시내용은 본 명세서에 기재된 RSV F 단백질, 예를 들어, 서열확인번호: 1, 13 및 변이체를 포함하는 융합 단백질을 계획한다.
특정 구현예에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 키메라 RSV를 포함하는 백신 및 면역원성 조성물에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 조성물은 보조제 및/또는 다른 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 보조제는 알루미늄 겔, 알루미늄 염 또는 모노포스포릴 지질 A이다.
특정 구현예에서, 보조제는 수중유(oil-in-water) 에멀젼이다. 특정 구현예에서, 수중유 에멀젼은 α-토코페롤, 스쿠알렌 및/또는 계면활성제를 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, 개시내용은 호흡기 세포융합 바이러스에 대해 대상체를 백신화 또는 면역화하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 대상체에 유효량의 본 명세서에 기재된 키메라 RSV 또는 이를 포함하는 면역원성 조성물을 투여함을 포함한다. 특정 구현예에서, 유효량은 대상체에서 보호 면역반응을 일으킨다.
특정 구현예에서, 대상체는 산모, 2, 3 또는 4세 미만인 어린이이다. 특정 구현예에서, 대상체는 감소된 면역 시스템을 가지며, 60 또는 65세가 넘거나, 화학요법 또는 면역억제 약제를 규칙적으로 투여받는다.
특정 구현예에서, 개시내용은 본 명세서에 기재된 RSV F 단백질을 암호화하는 핵산에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 핵산은 하기 서열확인번호: 14, 또는 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98 또는 99% 초과의 서열 동일성을 갖는 변이체를 포함한다:
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
.
특정 구현예에서, 개시내용은 본 명세서에 기재된 RSV F 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 벡터는 플라스미드 또는 세균 인공 염색체(bacterial artificial chromosome)로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 키메라 RSV는 하기 서열확인번호: 15, 또는 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98 또는 99% 초과의 서열 동일성을 갖는 변이체를 포함한다:
Figure pct00004
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Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
특정 구현예에서, 키메라 RSV는 인간 대상체에 감염성인 것들 및 인간 대상체에 비감염성인 것들을 포함한다.
특정 구현예에서, 개시내용은 입자, RSV 입자, 또는 본 명세서에 기재된 돌연변이된 RSV F 단백질을 포함하는 바이러스 유사 입자에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 입자는 살아있고 감염성인 약독화 RSV 게놈 및 안티게놈(antigenome)을 포함한다. 특정 구현예에서, 입자는 핵산을 포함하지 않거나, 예를 들어, RSV 단백질중 1개, 2개, 3개 또는 그 이상이나 임의의 것을 발현할 수 없는 핵산을 포함하는, 불활성화 RSV 게놈 또는 안티게놈을 포함한다. 특정 구현예에서, 입자는 열 또는 포름알데히드와 같은 방법을 사용하여 사독화시킨다. 특정 구현예에서, 입자는 바이러스성 구조 단백질 및 본 명세서에 기재된 돌연변이된 RSV F 단백질의 발현에 의해 재구성된다.
도 1은 I557 V 돌연변이를 갖는 F 단백질 (Query) (서열확인번호: 3) 및 통상적인 야생형 RSV 균주 라인 19 서열 (Sbjct) (서열확인번호: 4)의 RSV 서열 비교를 예시한 것이다.
도 2는 RSV 백신 후보 OE4를 예시한 것이다. 코돈-탈최적화된 NS1 및 NS2 (dNS1/dNS2)를 갖는 RSV는 유전적으로 안정하고 RSV를 약독화시키는 반면에, 야생형 바이러스 A2와 같은 면역원성을 유지한다. OE4는 또한 G 단백질의 코돈-탈최적화, SH 단백질의 결실을 갖고, RSV 라인 19 F 단백질을 발현한다.
도 3은 RSV가 베로 세포를 감염시킨 경우 코돈-탈최적화된 RSV G, NS1, NS2 유전자에 대해 감소된 단백질 발현을 나타내는 베로 세포 용해물의 웨스턴을 나타낸다.
도 4는 라인 19 F를 발현하는 키메라 RSV (A2 라인19F)가 균주 A2의 RSV F에 비하여 선-융합 F 성향을 나타냄을 제시하는 데이터를 보여준다.
도 5a는 부에노스 아이레스 클레이드(Buenos Aires clade)의 저-융합 RSV 서브그룹 B 균주 (BAF)에 대해 컨센서스 서열 (Sbjct) (서열확인번호: 2)과 비교하는 경우에, DB1 QUAD (Query) (서열확인번호: 1)로 표시되는 79번 위치에 M, 191번 위치에 R, 357번 위치에 K 및 371번 위치에 Y의 치환을 갖는 F 단백질의 서열을 예시하고 있다.
도 5b는 DB1 QUAD F 단백질의 아미노산 서열 (Query) (서열확인번호: 1) 및 통상적인 야생형 RSV 균주 라인 19 서열 (Sbjct) (서열확인번호: 4)의 비교를 예시하고 있다. 519/573 (91%)의 동일성 및 548/573 (95%)의 유사성이 있다.
도 6a는 서열확인번호: 2의 컨센서스 F 단백질을 함유하는 DB1을 포함하는 7일 후 특정 RSV 작제물의 열안정성(thermostability)에 대한 데이터를 나타낸다.
도 6b는 라인 19의 F 단백질에서 발견되는 특정 위치에 상응하는 F 단백질 아미노산을 함유하는 DB1 작제물을 포함하는 7일 후 특정 RSV 작제물의 열안정성에 대한 데이터를 나타낸다. DB1 QUAD는 79번 위치에 M, 191번 위치에 R, 357번 위치에 K, 371번 위치에 Y, 및 557번 위치에 V의 아미노산 패턴을 포함하는 서열확인번호: 1을 갖는 F 단백질을 지칭한다.
도 6c는 특정 백신 후보의 전체 F (선-융합 및 후-융합 F)에 대한 선-융합 F의 비를 나타내는 데이터를 보여준다.
도 7a는 DB1 QUAD가 A2-라인19F와 비교시 보다 더 약독화되었음 나타내는 BALB/c 마우스 중 백신 작제물의 약독화에 대한 데이터를 보여준다.
도 7b는 RSV B에 대해 DB1 QUAD 증가된 면역원성을 나타내는 상이한 RSV 균주에 대한 BALB/c 마우스 중 백신 작제물의 면역원성에 대한 데이터를 보여준다.
본 개시내용이 보다 상세히 기술되기 전에, 본 개시내용은 기술된 특별한 구현예로 제한되지 않으며, 그 자체는 물론 변할 수 있음을 이해해야 한다. 또한, 본 개시내용의 범위가 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 것이므로, 본 명세서에 사용된 용어는 단지 특별한 구현예를 기술할 목적이며, 제한하고자 하는 것은 아님을 이해해야 한다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 개시내용이 속하는 당해 분야의 통상의 숙련가중 누군가에 의해 통상 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기술된 것들과 유사하거나 대등한 어떠한 방법 및 물질이 또한 본 개시내용의 실행 또는 시험에 사용될 수 있음에도 불구하고, 바람직한 방법 및 물질들이 지금부터 기술된다.
본 명세서 중에 인용된 모든 간행물과 특허는, 각각의 개별 간행물 또는 특허가 구체적으로, 그리고 개별적으로 참고문헌으로서 포함되어 있다고 명시되어 있고, 인용된 간행물들과 연관된 방법들 및/또는 물질들을 개시 및 기술하기 위해 참고문헌으로서 포함되어 있는 것처럼, 본원에 참고문헌으로 포함되어 있다. 임의의 간행물의 인용은 출원일 이전의 개시내용에 관한 것이지, 선행 개시내용에 의해 본 개시내용이 이와 같은 간행물 발행일에 선행하는 지위가 부여되지 않음을 자인하는 것으로서 해석되어서는 안된다. 또한, 제공된 공개 일자들은 독립적으로 확인될 필요가 있을 수 있는 실제 공개 일자와 상이할 수 있었다.
본 개시내용이 읽어질 때, 당업자들에 명백할 바와 같이, 본원에 기술 및 예시된 개별 구현예들 각각은, 본 개시내용의 범주 또는 취지로부터 벗어나지 않고 기타 몇몇 구현예들 중 임의의 것의 특징들로부터 용이하게 분리되거나 합하여질 수 있는 변별적 구성요소들과 특징들을 가진다. 인용된 임의의 방법은 인용된 현상들의 순서대로, 또는 논리적으로 가능한 기타 다른 임의의 순서대로 수행될 수 있다.
본 개시내용의 구현예들은, 달리 특정되지 않는 한, 당업계의 기술에 속하는 면역학, 의학, 유기 화학, 생화학, 분자생물학, 약학 및 생리학 등에 있어서의 기법들을 사용할 것이다. 이러한 기법들은 문헌에 충분히 설명되어 있다.
본 명세서와 첨부된 청구항들에 사용된 바와 같이 단수 형태("a", "an", 및 "the")는 맥락이 달리 명확하게 규정하지 않는 한 복수의 지시대상을 포함하는 것임이 주목되어야 한다. 히어지는 본 명세서와 청구범위에서, 다른 의도가 분명하지 않는 한, 하기 의미를 갖도록 정의될 수많을 용어를 참조할 것이다.
다양한 구현예를 기술하기 전에, 하기의 정의가 제공되며, 달리 특정되지 않는 한 사용되어야 한다.
용어 "단백질" 및 "폴리펩티드"는 펩티드 결합을 통해 연결된 아미노산을 포함하는 화합물을 지칭하며, 상호교환적으로 사용된다.
단백질에 관하여 사용되는 경우에 ("제시된 단백질의 일부"에서와 같이) 용어 "일부(portion)"는 그 단백질의 단편을 지칭한다. 단편은 크기가 4개 아미노산 잔기로부터 전체 아미노 서열 - 1개의 아미노산 범위일 수 있다.
용어 "키메라 호흡기 세포융합 바이러스" 또는 "키메라 RSV"는 게놈 또는 안티게놈이 숙주 세포 (예: 베로 세포)에서 복제될 수 있기에 충분한 RSV 유전자를 함유하는 핵산을 지칭하며, 서열 핵산은 즉, RSV 균주가 전체 RSV 게놈에 대해 천연적으로 발생되기 때문에 구조적으로 그 천연 RSV 균주가 아닌 적어도 1개의 핵산 절편을 포함하도록 변화된다. 키메라 호흡기 세포융합 바이러스는 심지어 RSV가 천연적으로 발현되는 것들과 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 생성할 지라도, 천연 발생되는 것들과는 상이하도록 코돈이 변화된 RSV 유전자를 포함한다. RSV의 상이한 균주는 상이한 뉴클레오티드 서열을 가질 것이고, 유사한 기능을 갖는 상이한 아미노산 서열을 갖는 단백질을 발현할 것이다. 이에 따라, 키메라 RSV는, 1개의 균주로부터의 1개 이상의 유전자가 대안으로 유전자 또는 제2 균주로부터 대체됨으로써, 전체 RSV 게놈의 핵산 서열은 자연에서 발견되는 RSV와 동일하지 않도록 하는 RSV 유전자를 포함한다. 특정 구현예에서, 키메라 RSV는 단백질 발현을 절단하기 위해 출발 해독을 위한 코돈 뒤에 핵산이 결실된 균주들을 포함하며, 단 상기 게놈에 대한 절단 패턴은 천연 발생 RSV에서는 발견되지 않는다. 특정 구현예에서, 키메라 RSV는 인간 대상체에서 감염성이고 복제될 수 있는 것들을 포함한다.
폴리펩티드에 관하여 사용되는 경우에 용어 "융합"은 그들이 자연 환경에 함께 존재하지 않고, 함께 클론화되었으며, 해독후, 단일 폴리펩티드 서열로서 작용하도록 하는 상이한 공급원으로부터 수득된 2개 이상의 코딩 서열의 발현 생성물을 지칭한다. 융합 폴리펩티드는 또한 "하이브리드(hybrid)" 폴리펩티드로서 지칭된다. 코딩 서열은 동일한 것으로부터 또는 상이한 종의 유기체로부터 수득된 것들을 포함한다.
그러나, 융합 단백질의 이러한 형태는 기재된 백신의 RSV 융합 단백질과 동일하지 않다. RSV 융합 단백질 (F)은 비리온 막을 표적 세포막에 융합시키는 주요 표면 당단백질이다. 융합 단백질은 후속해서 비리온 및 표적 세포막에 근접하여 융합될 수 있는 안정한 후-융합 형태로 주요 리폴딩(refolding)을 수행하는 준안정성(metastable) 선-융합 형태로 존재한다. F 단백질은 RSV 균주 중에 상당히 보존성이고, 효능있는 RSV 면역원이다. 인간에서 자연 감염후, 항-RSV 중화 항체의 대부분은 F 단백질, 특히 F의 선-융합 형태에 대해 유도된다.
폴리펩티드에 관하여 사용된 경우에 용어 "상동체(homolog)" 또는 "상동성(homologous)"은 두 폴리펩티드 사이에 높은 정도의 서열 동일성, 또는 3차원 구조 간에 높은 정도의 유사성 또는 활성 부위와 작용 메카니즘 사이에 높은 정도의 유사성을 지칭한다. 바람직한 구현예에서, 상동체는 참조 서열과 60% 초과의 서열 동일성, 및 보다 바람직하게는 75% 초과의 서열 동일성, 및 보다 더 바람직하게는 90% 초과의 서열 동일성을 갖는다.
폴리펩티드에 적용된 바와 같이, 용어 "실질적인 동일성(substantial identity)"은 두 펩티드 서열이 최적으로 정렬되는 경우에, 예를 들어, 디폴트 갭 중량을 사용하는 프로그램 GAP 또는 BESTFIT에 의해, 적어도 80% 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 90% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 95% 서열 동일성 또는 그 이상 (예: 99% 서열 동일성)을 공유함을 의미한다. 바람직하게는, 동일하지 않은 잔기 위치는 보존성 아미노산 치환에 의해 달라진다.
폴리펩티드에 관하여 사용된 경우에 용어 "변이체(variant)" 및 "돌연변이체(mutant)"는 1개 이상의 아미노산이 다른 것과, 대개는 관련된 폴리펩티드와 상이한 아미노산 서열을 지칭한다. 변이체는 "보존성(conservative)" 변화를 가질 수 있고, 이때 치환된 아미노산은 유사한 구조적 또는 화학적 특성을 갖는다. 보존성 아미노산 치환의 한 형태는 유사한 측쇄를 갖는 잔기의 호환성을 지칭한다. 예를 들어, 지방족 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 이솔류신이고; 지방족-하이드록실 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 세린 및 트레오닌이며; 아미드-함유 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 아스파라긴 및 글루타민이고; 방향족 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판이며; 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 리신, 아르기닌 및 히스티딘이고; 황-함유 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 시스테인 및 메티오닌이다. 바람직한 보존성 아미노산 치환 그룹은 다음과 같다: 발린-류신-이솔류신, 페닐알라닌-티로신, 리신-아르기닌, 알라닌-발린 및 아스파라긴-글루타민. 보다 드물게, 변이체는 "비-보존성" 변화 (예: 글리신을 트립토판으로 치환)를 가질 수 있다. 유사한 소수의 변환은 아미노산 결실 또는 삽입 (환언하면, 첨가)이나, 이 둘 모두를 또한 포함할 수 있다. 얼마나 많은 아미노산 잔기가 생물학적 활성에 영향을 주지않으면서 치환, 삽입 또는 결실될 수 있는 지를 결정하는 지침은 당해 분야에 잘 알려진 컴퓨터 프로그램, 예를 들어, DNAStar 소프트웨어를 사용하여 확인할 수 있다. 변이체는 기능 분석에서 시험될 수 있다. 바람직한 변이체는 10% 미만, 및 바람직하게는 5% 미만, 및 보다 더 바람직하게는 2% 미만의 변화 (치환, 결실 등이든 간에)를 갖는다.
용어 "유전자"는 RNA, 또는 폴리펩티드 또는 그의 전구체 (예: 프로인슐린)의 제조에 필요한 코딩 서열을 포함하는 핵산 (예: DNA 또는 RNA) 서열을 지칭한다. 기능성 폴리펩티드는 폴리펩티드의 원하는 활성 또는 기능적 특성 (예: 효소 활성, 리간드 결합, 신호 변환 등)이 유지되는 한 전장 코딩 서열에 의해 또는 코딩 서열중 임의의 일부에 의해 암호화될 수 있다. 유전자에 관하여 사용된 경우 용어 "일부"는 그 유전자의 단편을 지칭한다. 단편은 크기가 소수의 뉴클레오티드로부터 전체 유전자 서열 - 1개의 뉴클레오티드까지의 범위일 수 있다. 이에 따라, "유전자의 적어도 일부를 포함하는 뉴클레오티드"는 유전자 단편 또는 전체 유전자를 포함할 수 있다.
용어 "유전자"는 또한 구조 유전자의 코딩 영역을 내포하고, 유전자가 전장 mRNA의 길이에 상응하도록 각각에 대해 약 1 kb의 거리에 대해 5' 및 3' 말단에 모두 코딩 영역에 인접하게 위치한 서열을 포함한다. 코딩 영역의 5'에 위치하고 mRNA 상에 존재하는 서열은 5' 비-해독 서열로서 지칭한다. 코딩 영역의 3' 또는 하류에 위치하고 mRNA 상에 존재하는 서열은 3' 비-해독 서열로서 지칭한다. 용어 "유전자"는 cDNA 및 유전자의 게놈 형태를 모두 내포한다. 유전자의 게놈 형태 또는 클론은 "인트론" 또는 "개재 영역(intervening regions)" 또는 "개재 서열"로 불리는 비-코딩 서열로 차단된 코딩 영역을 함유한다. 인트론은 핵 RNA (mRNA)로 전사되는 유전자 절편이고; 인트론은 인핸서(enhancer)와 같은 제어 요소를 함유할 수 있다. 인트론은 핵 또는 1차 전사물로부터 제거되거나 "스플라이스 아웃(spliced out)"되며; 이에 따라 인트론은 메신저 RNA (mRNA) 전사물에 존재하지 않는다. mRNA는 해독 동안 신생 폴리펩티드에서 아미노산 서열 또는 순서를 명시하도록 작용한다.
인트론 함유 이외에, 유전자의 게놈 형태는 RNA 전사물에 존재하는 서열의 5' 및 3' 말단 모두에 위치하는 서열을 또한 포함할 수 있다. 이들 서열은 "플랭킹(flanking)" 서열 또는 영역 (이들 플랭킹 서열은 mRNA 전사물에 존재하는비-해독 서열에 대해 5' 또는 3'에 위치한다)으로 지칭된다. 5' 플랭킹 영역은 유전자의 전사를 제어하거나 영향을 주는 프로모터 및 인핸서와 같은 제어 서열을 함유할 수 있다. 3' 플랭킹 영역은 전사 종결, 전사후 절단 및 폴리아데닐화를 지시하는 서열을 함유할 수 있다.
"이종 유전자(heterologous gene)"는 그의 본래 환경에 존재하지 않는 (즉, 사람 손으로 변화시킨) 인자를 암호화하는 유전자를 지칭한다. 예를 들어, 이종 유전자는 다른 종으로 도입된 한 종으로부터의 유전자를 포함한다. 이종 유전자는 또한 일부 방법으로 변화시킨 (예: 돌연변이된, 다중 복사체에 첨가된, 비-고유(non-native promoter) 프로모터 또는 인핸서 서열에 결합된, 등) 유기체에 고유한 유전자를 포함한다. 이종 유전자는 이종 유전자 서열이 통상 이종 유전자에 의해 암호화된 단백질에 대한 유전자와 또는 염색체내 식물 유전자 서열과 자연적으로 연관됨이 발견되지 않거나, 본래 발견되지 않는 염색체 일부와 연관된 (예: 정상적으로 발현되지 않는 좌위에서 발현된 유전자) 프로모터와 같은 제어 요소를 포함하는 뉴클레오티드 서열에 결합되는 내인성 식물 유전자와 구별된다.
용어 "폴리뉴클레오티드"는 2개 이상의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클렐오티드, 바람직하게는 3개 초과, 및 대개는 10개 초과로 구성된 분자를 지칭한다. 정확한 크기는 많은 요인에 따라 좌우될 것이고, 이는 결국 올리고뉴클레오티드의 궁극적인 기능 또는 용도에 따라 좌우된다. 폴리뉴클레오티드는 화학적 합성, DNA 복제, 역전사 또는 이들의 조합을 포함한, 임의의 방법으로 생성될 수 있다. 용어 "올리고뉴클레오티드"는 일반적으로 용어 "폴리뉴클레오티드"와 또한 호환적으로 사용될 수 있음에도 불구하고, 대개 길이가 30개 미만의 뉴클레오티드인 짧은 길이의 단일-가닥 폴리뉴클레오티드를 지칭한다.
용어 "핵산"은 상기 기술한 바와 같은 뉴클레오티드 중합체, 또는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 상기 용어는 단일 분자 또는 분자의 집합을 표시하는데 사용된다. 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있고, 코딩 영역 및 하기 기술되는 바와 같은, 다양한 제어 요소 영역을 포함할 수 있다.
용어 "유전자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드" 또는 "유전자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드" 또는 특정 폴리펩티드를 "암호화하는 핵산 서열"은 유전자의 코딩 영역을 포함하는 핵산 서열 또는 환언하면, 유전자 생성물을 암호화하는 핵산 서열을 지칭한다. 코딩 영역은 cDNA, 게놈성 DNA 또는 RNA 형태로 존재할 수 있다. DNA 형태로 존재하는 경우에, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 단일-가닥 (즉 센스 스트랜드(sense strand)) 또는 이중-가닥일 수 있다. 전사의 적절한 개시 및/또는 1차 RNA 전사물의 정확한 처리를 허용할 필요가 있다면, 적절한 제어 요소 (예: 인핸서/프로모터, 접목 이음부(splice junctions), 폴리아데닐화 신호 등)가 유전자의 코딩 영역에 근접하게 위치할 수 있다. 대안적으로, 본 개시내용의 발현 벡터에 사용되는 코딩 영역은 내인성 인핸서/프로모터, 접목 이음부, 개재 서열, 폴리아데닐화 신호 등이나, 내인성 및 외인성 제어 요소 모두의 조합을 함유할 수 있다.
핵산 분자에 관하여 제조한 경우 용어 "재조합"은 분자생물 기법에 의해 함께 결합시킨 핵산 절편으로 구성된 핵산 분자를 지칭한다. 단백질 또는 폴리펩티드에 관하여 제조한 경우 용어 "재조합"은 재조합 핵산 분자를 사용하여 발현시킨 단백질 분자를 지칭한다.
용어 "상보적(complementary)" 및 "상보성(complementarity)"은 염기-짝짓기 규칙에 의해 관련되는 폴리뉴클레오티드 (즉, 뉴클레오티드 서열)를 지칭한다. 예를 들어, "A-G-T" 서열의 경우 서열 "T-C-A"에 대해 상보적이다. 상보성은 핵산 염기의 단지 일부가 염기 짝짓기 규칙에 따라 매칭되는, "부분적(partial)"일 수 있다. 또는, 핵산 사이에 "완전한(complete)" 또는 "전체적인(total)" 상보성이 존재할 수 있다. 핵산 가닥 사이에 상보성 정도는 핵산 가닥 사이에 하이브리드화의 효율 및 강도에 유의한 효과를 갖는다. 이는 핵산 사이에 결합에 따라 좌우되는 검출 방법뿐만 아니라, 증폭 반응에서 특히 중요하다.
핵산과 관련하여 사용된 경우에 용어 "상동성(homology)"은 상보성 정도를 지칭한다. 부분적 상동성 또는 완전 상동성 (즉, 동일성)이 존재할 수 있다. "서열 동일성"은 2개 이상의 핵산 또는 단백질 사이에 관련성 척도를 지칭하며, 전체 비교 길이에 관한 %로서 제시된다. 동일성 계산은 동일하고 그들 각각의 보다 큰 서열에서 동일한 상대적 위치에 있는 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기들을 고려한다. 동일성 계산은 컴퓨터 프로그램, 예를 들어, "GAP" (Genetics Computer Group, Madison, Wis.) 및 "ALIGN" (DNAStar, Madison, Wis.)에 포함된 알고리즘에 의해 수행할 수 있다. 부분적으로 상보성인 서열은 표적 핵산으로의 하이브리드화로부터 완전히 상보성인 서열을 적어도 부분적으로 억제하는 (또는 이것과 경쟁하는) 것으로, 기능적 용어 "실질적으로 상동성"을 사용하여 언급된다. 완전 상보성인 서열의 표적 서열로의 하이브리드화 억제는 낮은 엄격함의 조건하에 하이브리드화 분석법 [서던(Southern) 또는 노던(Northern) 블롯(blot) 및 용액 하이브리드화 등]을 사용하여 검사할 수 있다. 실질적으로 상동성인 서열 또는 프로브는 낮은 엄격함의 조건하에 표적에 대해 완전히 상동성인 서열의 결합 (즉, 하이브리드화)에 대해 경쟁하고 이를 억제할 것이다. 이는 낮은 엄격함의 조건이 비-특이적 결합이 하용되도록 함을 말하는 것이 아니고; 낮은 엄격함 조건은 서로에 대한 두 서열의 결합이 특정한 (즉, 선택적인) 상호작용임을 요한다. 비-특이적 결합의 부재는 심지어 부분적 상보성 정도 (예: 약 30% 미만의 동일성)에도 결여되는 제2 표적을 사용하여 시험할 수 있고; 비-특이적 결합의 부재시, 프로브는 제2 비-상보성 표적으로 하이브리드화되지 않을 것이다.
하기의 용어들은 2개 이상의 폴리뉴클레오티드 사이에 서열 관계를 기술하기 위해 사용된다: "참조 서열(reference sequence)", "서열 동일성(sequence identity)", "서열 동일성 %", 및 "실질적인 동일성". "참조 서열"은 서열 비교를 위한 기준으로서 사용되는 한정된 서열이고; 참조 서열은, 예를 들어, 서열 목록에 제시된 전장 cDNA 서열의 절편으로서 보다 큰 서열의 서브셋일 수 있거나, 완전한 유전자 서열을 포함할 수 있다. 일반적으로, 참조 서열은 길이가 적어도 20개 뉴클레오티드, 종종 길이가 적어도 25개 뉴클레오티드, 및 종종 길이가 적어도 50개 뉴클레오티드이다. 2개의 폴리뉴클레오티드는 각각 (1) 두 폴리뉴클레오티드 사이에 유사한 서열 (즉, 완전한 폴리뉴클레오티드 서열의 일부)을 포함할 수 있고, (2) 두 폴리뉴클레오티드 사이에 상이한 서열을 추가로 포함할 수 있으므로, 2개 (또는 그 이상) 폴리뉴클레오티드 사이에 서열 비교는 통상 서열 유사성의 국부 영역을 확인하고 비교하기 위한 "비교창(comparison window)"에 대해 두 폴리뉴클레오티드 서열을 비교함으로써 수행한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "비교창"은 적어도 20개의 인접한 뉴클레오티드 위치의 개념적 절편을 지칭하며, 이때 폴리뉴클레오티드 서열은 적어도 20개의 인접 뉴클레오티드의 참조 서열과 비교할 수 있고, 비교창에서 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 정렬을 위한 참조 서열 (이는 첨가 또는 결실을 포함하지 않음)과 비교시 20% 또는 그 미만의 첨가 또는 결실 (즉, 갭)을 포함할 수 있다. 비교창을 정렬하기 위한 서열의 최적 정렬은 Smith와 Waterman의 국부 상동성 알고리즘에 의해 (Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)), Needleman과 Wunsch의 상동성 정렬 알고리즘에 의해 (Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)), Pearson과 Lipman의 유사성 방법을 위한 연구에 의해 (Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.) 85:2444 (1988)), 이들 알고리즘의 컴퓨터 실행에 의해 (GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), 또는 검사에 의해 수행할 수 있고, 다양한 방법에 의해 생성된 최상의 정렬 (즉, 비교창에 대한 상동성의 최고 %로 생성되는)이 선택된다.
특정 구현예에서, 용어 "서열 동일성 %"는 비교창에 대한 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하고, 매칭된 위치 수를 얻기 위해 동일한 핵산 염기 (예: A, T, C, G, U, 또는 I)가 두 서열 모두 존재하는 위치 수를 측정하고, 매칭된 위치 수를 비교창의 전체 위치 수로 나누고 (즉, 창 크기), 결과에 100을 곱하여 서열 동일성 %를 수득함으로써 계산된다.
특정 구현예에서, 서열 "동일성"은 내부 갭이 대등한 위치로서 카운팅된 오버행은 배제하고, 더 큰 최단 서열 또는 대등한 위치의 수로 나눈 동일한 위치 수를 사용하여 계산한 두 정렬 서열 사이에 서열 정렬중 정확히 매칭된 아미노산 (%로 표현됨)의 수를 지칭한다. 예를 들어, 폴리펩티드 GGGGGG 및 GGGGT는 5개중 4개 또는 80%의 서열 동일성을 갖는다. 예를 들어, 폴리펩티드 GGGPPP 및 GGGAPPP은 7개중 6개 또는 85%의 서열 동일성을 갖는다. 특정 구현예에서, 본 명세서에 표현된 서열 동일성의 임의 인용은 서열 유사성에 대해 대체될 수 있다. % "유사성"은 두 정렬 서열 사이에 유사성을 정량화하기 위해 사용된다. 이 방법은 동일성 측정과 동일하되, 단 특정 아미노산이 매칭되도록 동일할 필요는 없다. 아미노산은 그들이 하기 아미노산 그룹에 따르는 유사한 특성을 갖는 그룹에 속한다면 매치(match)로서 분류된다: 방향족 - F Y W; 소수성-A V I L; 양전하: R K H; 음전하 - D E; 폴라 - S T N Q.
본 명세서에 사용된 바와 같이 용어 "실질적인 동일성"은 폴리뉴클레오티드 서열의 특징을 나타내며, 이때 폴리뉴클레오티드는 적어도 20개 뉴클레오티드 위치의 비교창에 대해, 종종 적어도 25-50개 뉴클레오티드의 창에 대한 참조 서열과 비교시, 적어도 85% 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 90 내지 95% 서열 동일성, 보다 대개는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하며, 이때 서열 동일성 %는 비교창에 대해 총 20% 또는 그 미만의 참조 서열인 결실 또는 첨가를 포함할 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 참조 서열을 비교함으로써 계산된다. 참조 서열은, 예를 들어, 본 개시내용에서 청구된 조성물의 전장 서열과 같이, 보다 큰 서열의 서브셋일 수 있다.
cDNA 또는 게놈성 클론과 같은 이중-가닥 핵산 서열에 관하여 사용된 경우에, 용어 "실질적으로 상동성"은 상기 기술한 바와 같이 낮음 내지 높은 엄격함의 조건하에 이중-가닥 핵산 서열중 하나 또는 두 가닥 모두에 대해 하이브리드될 수 있는 임의의 프로브를 지칭한다.
단일-가닥 핵산 서열에 관한여 사용된 경우에, 용어 "실질적으로 상동성"은 상기 기술한 바와 같이 낮음 내지 높은 엄격함의 조건하에 단일-가닥 핵산 서열에 대해 하이브리드될 수 있는 (즉, 이의 보체이다) 임의의 프로브를 지칭한다.
용어 "작동가능한 조합으로(in operable combination)" 및 "작동가능하게 결합된(operably linked)"은 제시된 유전자의 전사 및/또는 원하는 단백질 분자의 합성을 유도할 수 있는 핵산 분자가 생성되도록 하는 방식의 핵산 서열의 결합을 지칭한다. 상기 용어는 또한 기능성 단백질이 생성되도록 하는 방식으로의 아미노산 서열의 결합을 지칭한다.
용어 "조절 요소(regulatory element)"는 핵산 서열 발현의 일부 측면을 제어하는 유전적 요소를 지칭한다. 예를 들어, 프로모터는 작동가능하게 결합된 코딩 영역의 전사 개시를 용이하게 하는 조절 요소이다. 다른 조절 요소는 스플라이싱 신호, 폴리아데닐화 신호, 종결 신호 등이다.
진핵생물에서 전사 조절 신호는 "프로모터" 및 "인핸서" 요소를 포함한다. 프로모터 및 인핸서는 전사에 관여되는 세포성 단백질과 특히 상호작용하는 DNA 서열의 짧은 어레이로 이루어진다 (Maniatis, 등, Science 236: 1237, 1987). 프로모터 및 인핸서 요소는 효모, 곤충, 포유류 및 식물 세포의 유전자를 포함한 다양한 진핵생물 공급원으로부터 분리되었다. 프로모터 및 인핸서 요소는 또한 바이러스에서 분리되었고, 원핵생물에서 발견된다. 특별한 프로모터 및 인핸서의 선택은 관심있는 단백질을 발현시키는데 사용되는 세포 형태에 따라 좌우된다. 일부 진핵생물 프로모터 및 인핸서는 광범위한 숙주 범위를 갖지만 다른 것들은 제한된 세포 형태의 서브셋에서 작용한다 (검토를 위해, 참조: Voss, 등, Trends Biochem. Sci., 11 :287, 1986; and Maniatis, 등, supra 1987).
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "프로모터 요소", "프로모터" 또는 "프로모터 서열"은 DNA 중합체의 단백질 코딩 영역이 5' 말단에 위치하는 (즉, 진행성인) DNA 서열을 지칭한다. 자연에 알려진 대부분의 프로모터의 위치는 전사 영역을 앞선다. 프로모터는 스위치로서 작용하여 유전자 발현을 활성화시킨다. 유전자가 활성화되면, 전사되거나, 전사에 참여하고 있다고 얘기한다. 전사는 유전자로부터 mRNA의 합성을 포함한다. 따라서, 프로모터는 전사 조절 요소로서 작용하고, 또한 mRNA로 유전자의 전사를 개시하기 위한 부위를 제공한다.
프로모터는 조직 특이적 또는 세포 특이적일 수 있다. 프로모터에 적용된 바와 같이, 용어 "조직 특이적"은 상이한 형태의 조직 (예: 잎)에서 관심있는 동일한 뉴클레오티드 서열 발현의 상대적 부재로 특정 형태의 조직 (예: 종자)에서 관심있는 뉴클레오티드 서열의 선택적 발현을 유도할 수 있는 프로모터를 지칭한다. 프로모터의 조직 특이성은, 예를 들어, 리포터 작제물을 생성하기 위하여 프로모터 서열에 리포터 유전자를 작동가능하게 결합시키고, 리포터 작제물이 생성된 형질전환 식물의 모든 조직으로 통합되도록 식물 게놈으로 리포터 작제물을 도입시키며, 형질전환 식물의 상이한 조직에서 리포터 유전자의 발현을 검출 (예: mRNA, 단백질, 또는 리포터 유전자에 의해 암호화된 단백질의 활성 검출)함으로써 평가할 수 있다. 다른 조직에서 리포터 유전자의 발현 수준에 비하여 1개 이상의 조직에서 리포터 유전자의 더 큰 발현 수준의 검출은 프로모터가 더 큰 발현 수준이 검출된 조직에 대해 특이적임을 보여준다. 프로모터에 적용된 바와 같이 용어 "세포 형태 특이적"은 동일한 조직 내에 상이한 형태의 세포에서 관심있는 동일한 뉴클레오티드 서열 발현의 상대적인 부재로 특정 형태의 세포에서 관심있는 뉴클레오티드 서열의 선택적 발현을 유도할 수 있는 프로모터를 지칭한다. 프로모터에 적용된 경우에 용어 "세포 형태 특이적"은 또한 단일 조직 내에 영역에서 관심있는 뉴클레오티드 서열의 선택적 발현을 촉진할 수 있는 프로모터를 의미한다. 프로모터의 세포 형태 특이성은 당해 분야에 잘 알려진 방법, 예를 들어, 면역조직화학 염색법을 사용하여 평가할 수 있다. 간단히, 조직 단면을 파라핀에 내재시키고, 파라핀 섹션은 프로모터에 의해 그의 발현이 제어되는 관심있는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 폴리펩티드 생성물에 대해 특이적인 1차 항체와 반응시킨다. 1차 항체에 대해 특이적인 표지된 (예: 퍼옥시다제 접합된) 2차 항체는 절단된 조직에 결합시키고, 현미경 검사로 특정 결합을 검출했다 (예: 아비딘/비오틴 사용).
프로모터는 구성적이거나 조절가능할 수 있다. 프로모터에 관해서 만든 경우 용어 "구성적(constitutive)"은 프로모터가 자극 (예: 열 쇽, 화학약품, 빛 등)이 없을 때 작동가능하게 결합된 핵산 서열의 전사를 유도할 수 있음을 의미한다. 통상적으로, 구성적 프로모터는 실질적으로 임의의 세포 및 임의의 조직에서 트랜스젠(transgene)의 발현을 유도할 수 있다.
대조적으로, "조절가능한" 또는 "유도가능한(inducible)" 프로모터는 자극 (예: 열 쇽, 화학약품, 빛 등)의 존재시 작동가능하게 결합된 핵산 서열의 전사 수준을 유도할 수 있는 것으로, 이는 자극이 없을 때 작동가능하게 결합된 핵산 서열의 전사 수준과 상이하다.
인핸서 및/또는 프로모터는 "내인성" 또는 "외인성" 또는 "이종성(heterologous)"일 수 있다. "내인성" 인핸서 또는 프로모터는 게놈에서 제공된 유전자와 자연스럽게 결합되는 것이다. "외인성" 또는 "이종성" 인핸서 또는 프로모터는 유전자의 전사가 결합된 인핸서 또는 프로모터에 의해 유도되도록 유전적 조작 (즉, 분자생물 기법)에 의해 유전자에 병치로 놓이는 것이다. 예를 들어, 제1 유전자와 작동가능하게 조합된 내인성 프로모터는 분리되고, 제거되어, 제2 유전자와 작동가능하게 조합되어 위치할 수 있음으로써, 제2 유전자와 작동가능하게 조합된 "이종성 프로모터"를 만든다. 다양한 이러한 조합이 시도되었다 (예: 제1 및 제2 유전자는 동일한 종으로부터 또는 상이한 종으로부터 존재할 수 있다).
진핵 세포에서 재조합 DNA 서열의 효율적인 발현은 통상적으로 생성된 전사물의 효율적인 종결 및 폴리아데닐화를 유도하는 신호의 발현을 요한다. 전사 종결 신호는 일반적으로 폴리아데닐화 신호의 하류에서 발견되고, 길이는 수 백 뉴클레오티드이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "폴리(A) 부위" 또는 "폴리(A) 서열"은 신생 RNA 전사물의 종결 및 폴리아데닐화를 모두 유도하는 DNA 서열을 나타낸다. 폴리(A) 테일이 결여된 전사물은 불안정하고 신속히 분해되기 때문에 재조합 전사물의 효율적인 폴리아데닐화가 바람직하다. 발현 벡터에 사용된 폴리(A) 신호는 "이종성" 또는 "내인성"일 수 있다. 내인성 폴리(A) 신호는 게놈에 제공된 유전자의 코딩 영역의 3' 말단에서 자연스럽게 발견된다. 이종성 폴리(A) 신호는 한 유전자로부터 분리되었고, 다른 유전자에 대해 3'에 위치한 것이다. 통상 사용되는 이종성 폴리(A) 신호는 SV40 폴리(A) 신호이다. SV40 폴리(A) 신호는 237 bp BamHI/BclI 제한 절편에 포함되며, 종결 및 폴리아데닐화를 모두 유도한다.
용어 "벡터"는 한 세포에서 다른 세포로 DNA 절편(들)을 전달하는 핵산 분자를 지칭한다. 용어 "비히클(vehicle)"은 종종 "벡터"와 호환적으로 사용된다.
용어 "발현 벡터" 또는 "발현 카세트(expression cassette)"는 특별한 숙주 유기체에서 작동가능하게 결합된 코딩 서열의 발현에 사용되는 적절한 핵산 서열 및 원하는 코딩 서열을 함유하는 재조합 핵산을 지칭한다. 원핵생물에서 발현에 사용되는 핵산 서열은 통상 종종 다른 서열과 함께, 프로모터, 오퍼레이터 (선택적) 및 리보솜 결합 부위를 포함한다. 프로모터, 인핸서, 및 종결과 폴리아데닐화 신호를 이용하는 진핵 세포가 알려져 있다.
용어 "숙주 세포"는 이종 유전자를 복제 및/또는 전사 및/또는 해독할 수 있는 임의의 세포를 지칭한다. 이에 따라, "숙주 세포"는 시험관내 또는 생체내에 위치하든지 간에, 임의의 진핵 또는 원핵 세포 (예: 세균 세포, 예를 들어, 이. 콜라이(E. coli), 효모 세포, 포유류 세포, 조류 세포, 양서류 세포, 식물 세포, 어류 세포 및 곤충 세포)를 지칭한다. 예를 들어, 숙주 세포는 형질전환 동물에 위치할 수 있다.
"선택가능한 마커(selectable marker)"는 인공적 선택 또는 동정 (리포터 유전자)에 적합한 특징을 부여하는 폴리펩티드를 암호화하는 재조합 벡터로 도입되는 핵산으로, 예를 들어, 베타-락타마제는 항생제 내성을 부여하며, 이는 성장 배지에서 항생제의 존재하에 유기체 발현 베타-락타마제가 생존할 수 있도록 한다. 다른 예는 티미딘 키나제로, 이는 숙주가 간시클로버(ganciclovir) 선택에 민감하도록 만든다. 이는 예상되는 색상의 존재 또는 부재를 기반으로 하여 원하는 것과 원치않는 세포 사이를 구별할 수 있도록 하는 선별가능한 마커일 수 있다. 예를 들어, lac-z-유전자는 X-gal (5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토시드)의 존재하에 청색을 부여하는 베타-갈락토시다제 효소를 생성한다. 재조합 삽입물이 lac-z-유전자를 불활성화한하면, 생성된 콜로니는 무색이다. 1개 이상의 선택가능한 마커, 예를 들어, 그의 성장에 필요한 특별한 화합물을 합성하기 위해 발현 유기체의 무능력을 보완할 수 있는 효소 (영양요구성) 및 성장에 독성인 다른 화합물로 한 화합물을 전환시킬 수 있는 것이 존재할 수 있다. URA3, 오로티딘-5' 포스페이트 데카복실라제는 우라실 생합성에 필요하고, 우라실에 대해 영양요구성인 ura3 돌연변이체를 보완할 수 있다. URA3은 또한 5-플루오로오로트산을 독성 화합물 5-플루오로우라실로 전환시킨다. 부가의 시도된 선택가능한 마커는 항균 내성을 부여하거나 형광 단백질을 발현하는 임의의 유전자를 포함한다. 그 예로, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 하기의 유전자를 포함한다: ampr, camr, tetr, 블라스티시딘, neor, hygr, abxr, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 타입 II 유전자 (nptII), p-글루크로니다제 (gus), 녹색 형광 단백질 (gfp), egfp, yfp, mCherry, p-갈락토시다제 (lacZ), lacZa, lacZAM15, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 (cat), 알칼리성 포스파타제 (phoA), 세균성 루시페라제 (luxAB), 비알라포스 저항성 유전자 (bar), ㅍ포스포만노스 이소머라제 (pmi), 크실로스 이소머라제 (xylA), 아라비톨 데하이드로게나제 (atlD), UDP-글루코스:갈락토스-l-포스페이트 우리딜트랜스퍼라제I (galT), 안트라닐레이트 신타제의 피드백-무감 α 서브유닛 (OASA1D), 2-데옥시글루코스 (2-DOGR), 벤질아데닌-N-3-글루쿠로니드, 이. 콜라이 트레오닌 데아미나제, 글루타메이트 1-세마알데히드 아미노트랜스퍼라제 (GSA-AT), D-아미노 아시독시나제 (DAAO), 염-허용 유전자 (rstB), 페레독신-유사 단백질 (pflp), 트레할로스-6-P 신타제 유전자 (AtTPSl), 리신 라세마제 (lyr), 디하이드로디피콜리네이트 신타제 (dapA), 트립토판 신타제 베타 1 (AtTSB 1), 데할로게나제 (dhlA), 만노스-6-포스페이트 리덕타제 유전자 (M6PR), 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제 (HPT), 및 D-세린 암모니아리아제 (dsdA).
"표지(label)"는 그 분자의 검출을 용이하게 하기 위하여, 항체 또는 단백질과 같은 다른 분자에 직접 또는 간접적으로 접합되는 검출가능한 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 표지의 특정한, 비-제한적 예는 형광 태그, 효소적 결합 및 방사성 동위원소를 포함한다. 한 예로, "표지 수용체"는 수용체로 이종성 폴리펩티드의 혼입을 말한다. 표지는 표시된 아비딘 (예를 들어, 광학 또는 비색법에 의해 검출될 수 있는 형광 마커 또는 효소 활성을 함유하는 스트렙타비딘)에 의해 검출될 수 있는 폴리펩티드에 대한 방사성표지된 아미노산의 혼입 또는 비오티닐 잔기의 공유 결합을 포함한다. 폴리펩티드 및 당단백질을 표지화하는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있고, 사용될 수 있다. 폴리펩티드를 위한 표지의 예는, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 다음을 포함한다: 방사성동위원소 또는 방사성핵종 (예: 35S 또는　131I), 형광 표지 [예: 플루오레신 이소티오시아네이트 (FITC), 로다민, 란타니드 포스포르(lanthanide phosphors)], 효소 표지 (예: 서양고추냉이 퍼옥시다제, 베타-갈락토시다제, 루시페라제, 알칼리성 포스파타제), 화학발광 마커, 비오티닐 그룹, 2차 리포터 (예: 류신 지퍼 쌍 서열, 2차 항체를 위한 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프 태그)에 의해 인지되는 계획된 폴리펩티드, 또는 자기 제제 (예: 가돌리늄 킬레이트). 일부 구현예에서, 표지는 잠재적인 입체 장애를 감소시키기 위해 다양한 길이의 스페이서 암(arm)으로 부착시킨다.
특정 구현예에서, 개시내용은 본 명세서에 기재된 서열 또는 이의 변이체 또는 융합을 포함하는 재조합 폴리펩티드에 관한 것으로, 이때 아미노산 서열의 아미노 말단부 또는 탄소 말단부는 선택적으로 이종성 아미노산 서열, 표지 또는 리포터 분자에 부착된다.
특정 구현예에서, 개시내용은 본 명세서에 기재된 폴리펩티드 또는 이의 융합 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 재조합 벡터는 선택적으로 포유류, 인간, 곤충, 바이러스, 세균, 박테리아 플라스미드, 효모 연관된 복제 기원 또는 유전자, 예를 들어, 유전자 또는 레트로바이러스 유전자 또는 렌티바이러스 LTR, TAR, RRE, PE, SLIP, CRS, 및 INS 뉴클레오티드 절편 또는 tat, rev, nef, vif, vpr, vpu, 및 vpx로부터 선택된 유전자 또는 gag, pol, 및 env로부터 선택된 구조 유전자를 포함한다.
특정 구현예에서, 재조합 벡터는 선택적으로 유전자 벡터 요소 (핵산), 예를 들어, 선택가능한 마커 영역, lac 오페론, CMV 프로모터, 하이브리드 치킨 B-액틴/CMV 인핸서 (CAG) 프로모터, tac 프로모터, T7 RNA 폴리머라제 프로모터, SP6 RNA 폴리머라제 프로모터, SV40 프로모터, 내부 리보솜 유입 부위 (internal ribosome entry site)(IRES) 서열, cis-작용 우드척 후조절 요소(woodchuck post regulatory element)(WPRE), 스캐폴드-부착 영역 (scaffold-attachment region)(SAR), 역 말단 반복체 (inverted terminal repeats)(ITR), FLAG 태그 코딩 영역, c-myc 태그 코딩 영역, 금속 친화성 태그 코딩 영역, 스트렙타비딘 결합 펩티드 태그 코딩 영역, polyHis 태그 코딩 영역, HA 태그 코딩 영역, MBP 태그 코딩 영역, GST 태그 코딩 영역, 폴리아데닐화 코딩 영역, SV40 폴리아데닐화 신호, SV40 복제 기원, Col El 복제 기원, fl 기원, pBR322 기원, 또는 pUC 기원, TEV 프로테아제 인지 부위, loxP 부위, Cre 리컴비나제 코딩 영역, 또는 예를 들어, 50 또는 60개 미만의 뉴클레오티드의 연속 절편 내에 5, 6, 또는 7개나 그 이상의 제한 부위를 갖거나, 또는 20 또는 30개 미만의 뉴클레오티드의 연속 절편 내에 3 또는 4개나 그 이상의 제한 부위를 갖는 다중 클로닝 부위를 포함한다.
용어 "리포터 유전자(reporter gene)"는 분석될 수 있는 단백질을 암호화하는 유전자를 지칭한다. 리포터 유전자의 예는, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 개질된 katushka, mkate 및 mkate2 (참조예: Merzlyak 등, Nat. Methods, 2007, 4, 555-557 및 Shcherbo 등, Biochem. J., 2008, 418, 567-574), 루시페라제 (참조예: deWet 등, Mol. Cell. Biol. 7:725 (1987) 및 미국 특허 제6,074,859호; 제5,976,796호; 제5,674,713호; 및 제5,618,682호; 이들 모두는 본 명세서에 참조로 포함된다), 녹색 형광 단백질 (예: GenBank 수탁번호 U43284; 수많은 GFP 변이체가 ClonTech Laboratories(Palo Alto, Calif 소재)로부터 시판되고 있다), 클로르암페니콜 아세틸트랜스퍼라제, 베타-갈락토시다제, 알칼리성 포스파타제, 및 서양고추냉이 퍼옥시다제를 포함한다.
유전자에 관하여 만든 경우 용어 "야생형(wild-type)"은 천연 발생 공급원으로부터 분리된 유전자의 특징을 갖는 유전자를 지칭한다. 유전자 생성물에 관하여 만든 경우 용어 "야생형"은 천연 발생 공급원으로부터 분리된 유전자 생성물의 특징을 갖는 유전자 생성물을 지칭한다. 대상에 적용시킨 경우 본 명세서에 사용된 바와 같이 용어 "천연-발생(naturally-occurring)"은 대상이 자연에서 발견될 수 있다는 사실을 의미한다. 예를 들어, 자연의 공급원으로부터 분리될 수 있는 유기체 (바이러스 포함)에 존재하고, 실험실에서 인간에 의해 의도적으로 변형되지 않은 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열이 천연-발생이다. 야생형 유전자는 집단에서 대부분 빈번히 관찰되고 이에 따라 "일반적(normal)" 또는 "야생형"의 유전자를 임의로 표시하는 것이다. 대조적으로, 유전자 또는 유전자 생성물에 관해 만든 경우 용어 "개질된(modified)" 또는 "돌연변이체"는 각각 야생형 유전자 또는 유전자 생성물과 비교하는 경우 서열 및/또는 기능적 특성에 변형을 나타내는 (즉, 변화된 특징) 유전자 또는 유전자 생성물을 지칭한다. 천연-발생 돌연변이체는 분리될 수 있고; 이들은 그들이 야생형 유전자 또는 유전자 생성물과 비교하는 경우 변화된 특징을 갖는다는 사실에 의해 확인됨을 주지한다.
용어 "안티센스(antisense)" 또는 "안티게놈(antigenome)"은 이의 뉴클레오티드 잔기 서열이 센스 가닥에서 뉴클레오티드 잔기 서열과 비교하여 5'에서 3' 배향으로 역으로 존재하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. DNA 듀플렉스의 "센스 가닥"은 그의 본래 상태인 세포에 의해 "센스 mRNA"로 전사되는 DNA 듀플렉스의 가닥을 지칭한다. 이에 따라, "안티센스" 서열은 DNA 듀플렉스에서 비-코딩 가닥과 동일한 서열을 갖는 서열이다.
용어 "분리된(isolated)"은 실질적으로 그의 천연 발생 환경에서 그것을 통상 수반하거나 그와 상호작용하는 성분을 함유하지 않는, 바이러스, 핵산 또는 단백질과 같은 생물학적 물질을 지칭한다. 분리된 물질은 선택적으로 그의 자연 환경의 물질 (예: 세포)과 함께 발견되지 않는 물질을 포함한다. 예를 들어, 물질이 그의 자연 환경에 존재한다면 (예: 세포), 물질은 그 환경에서 발견되는 물질에 대해 고유하지 않은 세포 (예: 게놈 또는 유전적 요소)의 위치에 위치했었다. 예를 들어, 천연 발생 핵산 (예: 코딩 서열, 프로모터, 인핸서 등)은 그 핵산에 대해 고유하지 않은 게놈의 좌위 (예: 벡터, 예를 들어, 플라스미드 또는 바이러스 벡터, 또는 앰플리콘)로 비-천연 발생 수단에 의해 도입된다면 분리된 것이다. 이러한 핵산은 또한 "이종성" 핵산으로 칭한다. 분리된 바이러스는, 예를 들어, 야생형 바이러스의 고유 환경 (예: 감염된 개체의 비인강)이 아닌 다른 환경 (예: 세포 배양 시스템 또는 세포 배양으로부터 정제된)에 존재한다.
RSV의 "면역학적 유효량(immunologically effective amount)"은 RSV에 대한 후속 노출에 대해 개체 (예: 인간) 자신의 면역 반응을 개선하기에 충분한 양이다. 유도된 면역성 수준은, 예를 들어, 플라크 중화(plaque neutralization), 보체 고정, 효소-결합 면역흡착법, 또는 MN 분석(microneutralization assay)에 의해 분비 및/또는 혈청 항체의 중화양을 측정함으로써 모니터할 수 있다.
RSV에 대한 "보호 면역반응(protective immune response)"은 개체가 후속해서 야생형 RSV에 노출되고/되거나 그것으로 감염된 경우, 심각한 하기도 질환 (예: 폐렴 및/또는 세기관지염)에 대해 보호적인 개체 (예: 인간)에 의해 나타내는 면역반응을 지칭한다.
키메라 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV)
천연 발생 RSV 입자는 통상 기질 단백질 및 당단백질을 함유하는 외피로 둘러싸여 있는 나선형 뉴클레오캡시드 내에 바이러스 게놈을 함유한다. 인간 야생형 RSV의 게놈은 단백질, NS1, NS2, N, P, M, SH, G, F, M2-1, M2-2를 암호화하고, L. G, F, 및 SH는 당단백질이다. RSV 폴리머라제 활성은 큰 단백질 (L) 및 인단백질 (P)로 이루어진다. 바이러스 M2-1 단백질은 전사 동안 사용되며, 아마도 트랜스크립타제 복합체의 성분일 것이다. 바이러스 N 단백질은 복제 동안 신생 RNA를 단백질막으로 싸기 위해 사용된다.
게놈은 숙주 세포의 세포질에서 전사되어 복제된다. 숙주-세포 전사는 통상 10개의 메틸화 및 폴리아데닐화된 mRNA를 합성한다. 안티게놈은 복제 동안 생성된 게놈의 포지티브-센스 RNA 보체이고, 이는 또한 게놈 합성을 위한 주형으로서 작용한다. 바이러스 유전자는 보존성 유전자-개시 (gene-start) (GS) 및 유전자-말단 (gene-end) (GE) 서열에 의해 플랭킹된다. 게놈의 3' 및 5' 말다에 리더(leader) 및 트레일러(trailer) 뉴클레오티드가 있다. 야생형 리더 서열은 3' 말단에 프로모터를 함유한다. 바이러스 폴리머라제가 GE 신호에 이르면, 폴리머라제는 mRNA를 폴리아데닐화시켜 방출하고, 이어지는 GS 신호에서 RNA 합성을 재개시한다. L-P 복합체는 프로모터, RNA 합성, mRNA의 5' 말단의 캡핑 및 메틸화 및 그들의 3' 말단에서 폴리아데닐화의 인지에 관여하는 것으로 여겨진다. 폴리머라제는 종종 이음부에 유전자로부터 해리되는 것으로 여겨진다. 폴리머라제가 게놈의 3' 말단에서 전사를 개시하기 때문에, 이는 발현의 구배를 생성하고, 게놈의 3' 말단에서 유전자는 5' 말단의 것보다 더 빈번히 전사된다.
게놈을 복제하기 위하여, 폴리머라제는 시스-작용 GE 및 GS 신호에 반응하지 않고, 게놈의 포지티브-센스 RNA 보체인, 안티센스를 생성한다. 안티게놈의 3' 말단에는 트레일러 보체가 있으며, 이는 프로모터를 함유한다. 폴리머라제는 이 프로모터가 게놈-센스 RNA를 생성하는 것을 돕는다. 네이키드(naked) RNA로서 방출되는, mRNA와 달리, 안티게놈 및 게놈 RNA는 그들이 합성될 때 바이러스 핵단백질 (N)로 캡슐화된다.
바이러스 mRNA의 해독후, 전장 (+) 안티게놈 RNA가 (-) RNA 게놈의 복제를 위한 주형으로서 생성된다. 감염성 재조합 RSV (rRSV) 입자는 형질감염된 플라스미드로부터 회수될 수 있다. 전장 안티게놈 RNA뿐만 아니라, RSV N, P, L, 및 M2-1 단백질의 공-발현은 RSV 복제를 위해 충분하다. (참조: Collins 등, Proc Natl Acad Sci U S A., 1995, 92(25): 11563-11567 및 미국 특허 제6,790,449호).
특정 구현예에서, 개시내용은 특정 바람직한 RSV F 폴리펩티드 서열 및 이를 암호화하는 재조합 핵산에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 개시내용은 이들 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터 및 상기 벡터를 포함하는 세포를 계획하였다. 특정 구현예에서, 벡터는 선택가능한 마커 또는 리포터 유전자를 포함한다.
RSV를 저장하기 위한 통상의 벡터는 플라스미드 및 세균 인공염색체 (BAC)를 포함한다. 통상적으로, 세균 인공염색체는 선택가능한 마커, 예를 들어, 항생체에 대한 내성을 제공하는 유전자와 작동가능하게 조합된 인자 F의 oriS, repE, parA 및 parB 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 유전자를 포함한다. 핵산 서열은 선택적으로 돌연변이된 바이러스, 예를 들어, 선택적으로 돌연변이된 RSV 균주의 게놈 또는 안티게놈 서열일 수 있다.
이. 콜라이 세균에서 RSV의 배양은 세균 인공염색체(BAC)를 이용하여 성취할 수 있다. RSV를 저장하고 유전적 조작을 위한 BAC 백터는 문헌(참조: Stobart 등, Methods Mol Biol., 2016, 1442: 141-53 및 미국 특허출원 공보 제2012/0264217호)에 보고되어 있다. 기재된 BAC는 RSV 균주 라인 19의 안티게놈 서열인, F 유전자를 제외한, 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV) 균주 A2의 완전한 안티게놈 서열을 함유한다. 이는 헬퍼 플라스미드와 함께, 감염성 바이러스의 회수를 위해 역 유전적 시스템에 사용될 수 있다. 플라스미드 상의 안티게놈 서열은 바이러스 회수 전에 돌연변이되어 원하는 돌연변이를 갖는 바이러스를 생성할 수 있다.
특정 구현예에서, 본 개시내용은 BAC 유전자 및 RSV 안티게놈을 갖는 벡터를 분리된 진핵세포에 삽입시키고, RSV 비리온이 형성되도록 하는 조건하에 하기의 것으로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 벡터를 세포로 삽입시키는 단계를 포함하는 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV) 입자의 생성 방법에 관한 것이다: RSV의 N 단백질을 암호화하는 벡터, RSV의 P 단백질을 암호화하는 벡터, RSV의 L 단백질을 암호화하는 벡터, 및 RSV의 M2-1 단백질을 암호화하는 벡터. 세포로 벡터의 삽입은 물리적 주입법, 천공법, 또는 벡터가 세포로 도입되도록 하는 조건하에 세포와 벡터의 혼합에 의해 일어날 수 있다.
키메라 RSV는 특정 돌연변이, 결실 또는 변이체 조합, 예를 들어, RSV의 cp(cold-passaged) 비-온도 민감성 (non-temperature sensitive) (ts) 유도체, cpRSV, 예를 들어, rA2cp248/404/1030ΔSH를 포함하도록 계획되었다. rA2cp248/404ΔSH는 4개의 독립적인 약독화 유전적 요소를 함유한다: N 및 L 단백질과 cpRSV의 비-ts 약독화 표현형을 함께 부여하는 F 당단백질에서 5개의 미스센스 돌연변이를 기반으로 하는 cp; ts248, L 단백질의 미스센스 돌연변이; ts404, M2 유전자의 유전자-개시 전사 신호에서의 뉴클레오티드 치환; 및 ΔSH, SH 유전자의 완전한 결실. rA2cp248/404/1030ΔSH는 5개의 독립적인 약독화 유전적 요소를 함유한다: L 단백질의 다른 미스센스 돌연변이인, rA2cp248/404ΔSH 및 ts1030에 존재하는 것들. 문헌(Karron 등, J Infect Dis., 2005, 191(7): 1093-1104, 본 명세서에 참조로 포함됨)을 참조하라. 특정 구현예 내에서, RSV 안티게놈은 비필수 유전자 (예: SH, NS1, NS2, 및 M2-2 유전자)의 결실 또는 돌연변이나 이들의 조합을 함유할 수 있도록 계획하였다.
중복되는 유전 코드로 인해, 개별 아미노산은 종종 동의 코돈(synonymous codon)으로 불리우는, 다중 코돈 서열에 의해 암호화된다. 상이한 종에서는, 종종 코돈 성향(codon bias)으로 불리우는 동의 코돈이 다소 빈번히 사용된다. 유전자의 코딩 서열로 언더-레프리젠티드(under-represented) 동의 코돈의 유전공학은 단백질의 아미노산 서열의 변화없이 감소된 단백질 해독률을 야기하는 것으로 밝혀졌다. Mueller 등은 코돈 바이러스의 변화에 의한 바이러스 약독화를 보고하고 있다 (참조: Science, 2008, 320: 1784. 또한, WO/2008121992, WO/2006042156, Burns 등, J Virology, 2006, 80(7):3259 및 Mueller 등, J Virology, 2006, 80(19):9687).
RSV에서 코돈 탈최적화의 이용이 문헌(Meng, 등, MBio 5, e01704-01714 (2014) 및 미국 특허출원 공보 2016/0030549)에 보고되고 있다. 특정 구현예에서, 본 개시내용은 분리된 핵산, 코돈 탈최적화를 갖는 재조합 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV), 이로부터 제조된 백신, 및 이와 관련된 백신화 방법에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 코돈 탈최적화는 비구조적 유전자 NS1 및 NS2에, 그리고 선택적으로 유전자 G에, 그리고 선택적으로 유전자 L에 존재한다. 추가의 구현예에서, 유전자 SH는 결실된다. 추가의 구현예에서, 유전자 F는 돌연변이된다, 예를 들어, RSV F 단백질은 79번 위치에 M, 191번 위치에 R, 357번 위치에 K, 및 371번 위치에 Y와, 557번 위치에 V의 아미노산 패턴을 갖는다.
특정 구현예에서, 개시내용은 야생형 인간 RSV 또는 변이체의 탈최적화된 유전자 NS1 및/또는 NS2 및 선택적으로 유전자 G 및 선택적으로 유전자 L을 암호화하는 분리된 핵산에 관한 것으로, 이때 뉴클레오티드는 치환되어, Gly을 생성하는 코돈이 GGT이고, Asp를 생성하는 코돈이 GAT이며, Glu을 생성하는 코돈이 GAA이고, His을 생성하는 코돈이 CAT이며, Ile을 생성하는 코돈이 ATA이고, Lys을 생성하는 코돈이 AAA이며, Leu을 생성하는 코돈이 CTA이고, Asn을 생성하는 코돈이 AAT이며, Gln을 생성하는 코돈이 CAA이고, Val을 생성하는 코돈이 GTA이며, 또는 Tyr을 생성하는 코돈이 TAT이거나, 또는 이들의 조합이 되도록 한다. 특정 구현예에서, 분리된 핵산의 유전자는 개별 코돈중 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 모두의 조합을 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 분리된 핵산의 유전자는 코돈중 적어도 20, 30, 40 또는 50개나 그 이상을 포함한다.
특정 구현예에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 분리된 핵산에 관한 것으로, 이때 뉴클레오티드는 치환되어 Ala을 생성하는 코돈이 GCG이고, Cys을 생성하는 코돈이 TGT이며, Phe을 생성하는 코돈이 TTT이고, Pro을 생성하는 코돈이 CCG이며, Arg을 생성하는 코돈이 CGT이고, Ser을 생성하는 코돈이 TCG이며, 또는 Thr을 생성하는 코돈이 ACG이고, 또는 이들의 조합이 되도록 한다. 특정 구현예에서, 핵산을 함유하는 유전자는 개별 코돈중 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16개 또는 모두의 조합을 포함한다. 특정 구현예에서, 분리된 핵산의 유전자는 코돈중 적어도 20, 30, 40 또는 50개나 그 이상을 추가로 포함한다.
Glenn 등은 출산 연령인 건강한 여성에서 호흡기 세포융합 바이러스 재조합 융합 (F) 나노입자 백신의 랜덤화된, 블라인드, 조절되는, 용량-범위 연구 (randomized, blinded, controlled, dose-ranging study)를 보고하고 있다 (참조: J Infect Dis. 2016, 213(3):411-22). 특정 구현예에서, 본 개시내용은 본 명세서에 보고된 돌연변이된 F 단백질을 함유하는 바이러스 입자 및 바이러스-유사 입자 (VLP)에 관한 것이다. 바이러스 입자는 통상 불활성화 백신 (또는 사독 백신)으로서 사용된다. RSV는 배양시 성장시킨 다음, 열 또는 포름알데히드와 같은 방법을 사용하여 사독화할 수 있다. 생약독화 백신은 통상적으로 약화되어 복제 및/또는 감염률이 더 느려진다.
특정 구현예에서, 개시내용은 전반적으로 바이러스 백신인 키메라 RSV 입자, 예를 들어, RSV의 게놈이 비-복제성 또는 비-감염성이 되도록 열, 화학약품 또는 방사선에 노출된 전체 바이러스 입자를 계획하고 있다. 특정 구현예에서, 본 개시내용은 바이러스를 차단하기 위해 세제를 사용하고, 바이러스에 대한 반응을 일으키기 위해 면역 시스템을 자극하는 항원으로서 본 명세서에 기재된 돌연변이된 F 단백질을 정제함으로써 생성된 스플릿 바이러스 백신중 키메라 RSV 입자를 계획한다.
VLP는 성숙 비리온을 아주 닮았지만, 그들은 바이러스 게놈 물질 (즉, 바이러스 게놈 RNA)을 함유하지 않는다. 따라서, VLP는 본래 비-복제성이다. 또한, VLP는 VLP의 표면에서 단백질을 발현할 수 있다. 더욱이, VLP가 온전하 비리온을 닮고 다가 미립자 구조이기 때문에, VLP는 표면 단백질에 대한 항체 중화를 유도하는데 효과적일 수 있다. VLP는 반복적으로 투여될 수 있다.
특정 구현예에서, 개시내용은 표면에 본 명세서에 기재된 돌연변이된 F 단백질 및 인플루엔자 바이러스 기질 (M1) 단백질 코어를 포함하는 VLP를 계획한다. Quan 등은 인플루엔자 바이러스 기질 (M1) 단백질 코어 및 표면상의 RSV-F로 구성된 바이러스-유사 입자 (VLP)의 제조 방법을 보고하고 있다 (참조: J Infect Dis. 2011, 204(7): 987-995). RSV F 및 인플루엔자 M1을 발현하는 재조합 바클로바이러스 (rBV)를 생성하여, 제조를 위해 그들을 곤충 세포로 형질감염시킬 수 있다.
사용 방법
특정 구현예에서, 개시내용은 본 명세서에 기재된 키메라 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV), RSV 폴리펩티드, RSV 입자, RSV 바이러스-유사 입자, 및/또는 핵산을 면역학적 유효량으로 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 본 개시내용은 RSV에 대한 보호 면역반응을 일으키기 위해 개체의 면역 시스템을 자극하는 방법에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 면역학적 유효량의 본 명세서에 기재된 키메라 RSV, 폴리펩티드 및/또는 핵산을 생리학적으로 허용되는 담체와 개체에 투여한다.
특정 구현예에서, 개시내용은 본 명세서에 기재된 사용을 위한 본 명세서에 기재된 핵산을 포함하는 약제 및 백신 생성물에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 개시내용은 본 명세서에 기재된 사용을 위해 약제의 제조를 위한 본 명세서에 기재된 핵산 또는 벡터의 용도에 관한 것이다.
본 개시내용은 또한 다른 형태의 약독화 돌연변이를 분석하고, 백신 또는 다른 용도를 위해 그들을 키메라 RSV로 혼입하는 능력을 제공한다. 예를 들어, 마우스의 폐렴 바이러스의 조직 배양-적응(tissue culture-adapted) 비병원성 균주 (RSV의 생쥐(murine) 카운터파트)는 G 단백질의 세포질 테일이 결여되어 있다 (Randhawa 등, Virology 207: 240-245 (1995)). 유추에 의해, RSV 당단백질, F, G 및 SH 각각의 세포질 및 막횡단 도메인은 약독화를 성취하기 위해 결실되거나 개질시킬 수 있다.
본 개시내용의 감염성 RSV에 사용하기 위한 다른 돌연변이는 RSV 미니게놈의 돌연변이 분석 동안 확인된 시스-작용 신호의 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 리더 및 트레일러 및 플랭킹 서열의 삽입 및 결실 분석으로 바이러스 프로모터 및 전사 신호를 확인하였고, RNA 복제 또는 전사의 다양한 감소 정도와 연관된 일련의 돌연변이를 제공하였다. 이들 시스-작용 신호의 포화 돌연변이유발(Saturation mutagenesis) (이에 의해 각 위치는 또한 뉴클레오티드 대체물로 각각 개질된다)로 RNA 복제 또는 전사가 감소된 (또는 한 경우에 증가된) 많은 돌연변이를 또한 확인하였다. 이들 돌연변이중 어떤 것을 본 명세서에 기술된 바와 같이 완전한 안티게놈 또는 게놈으로 삽입시킬 수 있다. 다른 돌연변이는 RNA 복제 및 전사의 변화와 연관된, 안티게놈으로부터의 그의 카운터파트로 게놈의 3' 말단의 대체를 포함한다. 또한, 유전자사이 영역(intergenic region) (Collins 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 :4594-4598 (1986), 본 명세서에 참조로 포함됨)은 서열 내용을 단축시키거나, 길게하거나 변화를 줄 수 있고, 천연-발생 유전자 중복 (Collins 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5134-5138 (1987), 본 명세서에 참조로 포함됨)은 본 명세서에 기술된 방법에 의해 제거되거나 상이한 유전자사이 영역으로 변화될 수 있다.
백신 사용을 위해, 본 개시내용에 따라 생성된 바이러스는 백신 제형에 직접 사용되거나, 경우에 따라, 당업자에게 잘 알려진 동결건조 프로토콜을 사용하여 동결건조시킬 수 있다. 동결건조된 바이러스는 통상 약 4℃에서 유지할 것이다. 즉시 사용시, 동결건조된 바이러스는 하기에 추가로 기술되는 바와 같이, 보조제의 존재 또는 부재하에, 안정화 용액 (예: 염수)에서 또는 SPG, Mg, 및 HEPES를 포함하여 재구성한다.
통상적으로, 본 개시내용의 RSV 백신은 활성 성분으로서 면역학적 유효량의 본 명세서에 기술된 바와 같이 제조된 RSV를 함유한다. 개질된 바이러스는 생리학적으로 허용되는 담체 및/또는 보조제와 함께 대상체에 도입시킬 수 있다. 유용한 담체는 당해 분야에 잘 공지되어 있고, 예를 들어, 물, 완충수, 0.4% 염수, 0.3% 글리신 및 히알루론산 등을 포함한다. 생성된 수용액은 사용을 위해 그대로 포장하거나 동결건조시키고, 동결건조된 제제는 상기 언급한 바와 같이, 투여 전에 멸균 용액과 합한다. 조성물은 생리학적 조건에 근접하는데 필요한 약학적으로 허용되는 보조 물질, 예를 들어, pH 조절 및 완충제, 장성 조절제, 습윤제 등, 예를 들어, 나트륨 아세테이트, 나트륨 락테이트, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 소르비탄 모노라우레이트 및 트리에탄올아민 올레에이트 등을 함유할 수 있다. 허용되는 보조제는 당해 분야에 잘 알려진 물질인, 불완전 프로인트 보조제 (incomplete Freund's adjuvant), 인산알루미늄, 수산화알루미늄 또는 백반을 포함한다.
본 명세서에 기술된 바와 같이 RSV 조성물로 면역화시, 에어로졸, 점적, 구강, 국소 또는 다른 경로를 통해, 대상체의 면역 시스템은 RSV 바이러스 단백질 (예: F 당단백질)에 대해 특이적인 항체를 생성함으로써 백신에 반응한다. 백신화 결과, 대상체는 RSV 감염에 대해 적어도 부분적으로 또는 완전히 면역이 되거나, 또는 특히 하기도의 보통 또는 중증 RSV 감염의 발병에 대해 내성이 된다.
백신이 투여된 대상체는 RSV 또는 밀접하게 관련된 바이러스에 의해 감염되기 쉽고, 대상체가 백신화 균주의 항원에 대해 보호 면역반응을 생서할 수 있는 임의의 포유류일 수 있다. 이에 따라, 적절한 대상체는 인간, 비-인간 영장류, 소, 말, 돼지, 양, 염소, 라가모프(lagamorph), 설치류 등을 포함한다. 따라서, 본 개시내용은 다양한 인간 및 수의학적 용도를 위한 백신의 생성 방법을 제공한다.
본 개시내용의 RSV를 함유하는 백신 조성물은 대상체 자신의 면역반응 능력을 개선하기 위하여 RSV 감염 위험에 들기 쉽거나 다른 대상체에 투여된다. 이러한 양은 "면역학적 유효량"으로 정의된다. 이러한 사용시, 정밀한 양은 다시 대상체의 건강 및 체중 상태, 투여 경로, 제형의 특성에 따라 좌우된다. 백신 제형은 심각하거나 생명을 위협하는 RSV 감염에 대해 대상체 환자를 효과적으로 보호하기에 충분한 양으로 본 개시내용의 개질된 RSV를 제공한다.
본 개시내용에 따라 제조된 RSV는 다중 RSV 서브그룹 또는 균주에 대한 보호를 성취하기 위하여 다른 서브그룹의 바이러스 또는 균주와 합할 수 있거나, 이들 균주의 보호 에피토프는 본 명세서에 기술된 바와 같이 1개의 바이러스로 조작할 수 있다. 통상적으로, 상이한 바이러스는 혼합되어 동시에 투여될 것이지만, 또한 별도로 투여될 수 있다. 예를 들어, 2개의 RSV 서브그룹의 F 당단백질은 아미노산 서열에서 단지 약 11% 만큼만 상이하기 때문에, 이러한 유사성은 RSV 또는 F 항원으로 면역화되고 이종성 균주로 챌린지된 동물에서 관찰되는 바와 같이 교차-방어적(cross-protective) 면역반응에 대한 기반이 된다. 이에 따라, 한 균주에 의한 면역화는 동일하거나 상이한 서브그룹의 상이한 균주에 대해 보호할 수 있다.
일부 경우에, 본 개시내용의 RSV 백신은 다른 제제, 특히 다른 어린이 바이러스에 대해 보호 반응을 유도하는 백신과 합하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 RSV 백신은 본 명세서에 참조로 인용된 문헌(Clements 등, J. Clin. Microbiol. 29: 1175-1182 (1991))에 기술된 바와 같이, 파라인플루엔자 바이러스 백신과 동시에 투여할 수 있다. 개시내용의 다른 측면에 있어서, RSV는 보호 항원을 암호화하는 서열을 본 명세서에 기술된 바와 같은 감염성 RSV를 생성하는데 사용되는 RSV 게놈 또는 안티게놈으로 혼입시킴으로써 다른 기도 병원균 (예: 파라인플루엔자)의 보호 항원을 위한 벡터로서 사용될 수 있다.
본 개시내용의 백신 조성물의 단일 또는 다중 투여를 수행할 수 있다. 신생아 및 유아에서, 순차적 투여는 충분한 면역성 수준을 나타내기 위해 필요할 수 있다. 투여는 고유의 (야생형) RSV 감염에 대한 충분한 보호 수준을 유지하는데 필요에 따라, 태어나 첫달 이내에, 또는 전에, 약 2개월, 통상적으로 6개월보다 늦지 않게, 그리고 소아기를 통해 간격을 두어, 예를 들어, 2개월, 6개월, 1년 및 2년에 시작할 수 있다. 유사하게, 특히 반복되거나 심각한 RSV 감염되기 쉬운 성인, 예를 들어, 의료계 종사자, 보육시설종사자, 어린이의 가족 구성원, 성인 (55, 60 또는 65세 넘는) 또는 손상된 심폐 기능을 갖는 개체는 보호 면역반응을 일으키고 및/또는 유지하기 위해 다중 면역화를 필요로 할 수 있다. 유도된 면역성 수준은 중화된 분비 및 혈청 항체의 양, 및 원하는 수준의 보호를 유지하는데 필요한 만큼 조절되는 용량 또는 반복되는 백신화를 측정하여 모니터할 수 있다. 추가로, 상이한 백신 바이러스가 상이한 수용체 그룹에 대해 유용할 수 있다. 예를 들어, T 세포 에피토프에 풍부한 부가의 단백질을 발현하는 조작된 RSV 균주는 유아에 대해 보다는 오히려 성인에 특히 유용할 수 있다.
개시내용의 또 다른 측면에 있어서, RSV는 기도의 일시적 유전자 요법을 위한 벡터로서 사용된다. 이 구현예에 따르면, 재조합 RSV 게놈 또는 안티게놈은 관심있는 유전자 생성물을 암호화할 수 있는 서열을 포함한다. 관심있는 유전자 생성물은 RSV 발현을 조절하는 동일하거나 상이한 프로모터의 조절하에 놓인다. 재조합 RSV 게놈 또는 안티게놈과 N, P, L 및 M2-1 단백질을 공발현시키고, 관심있는 유전자 생성물을 암호화하는 서열을 함유함으로써 제조된 감염성 RSV가 환자에 투여된다. 통상 에어로졸, 분무기 또는 다른 국소 적용에 의해 치료할 환자의 기도로 투여된다. 재조합 RSV는 원하는 유전자 생성물의 치료학적 또는 예방학적 수준의 발현을 일으키기에 충분한 양으로 투여된다. 이 방법으로 투여되는 대표적인 유전자 생성물의 예는, 예를 들어, 일시적 발현에 특히 적합한 것들을 암호화하는 것들, 예를 들어, 인터루킨-2, 인터루킨-4, 감마-인터페론, GM-CSF, G-CSF, 에리트로포이에틴, 및 다른 사이토카인, 글루코세레브로시다제, 페닐알라닌 하이드록실라제, 낭포성섬유증 막횡단 전도 조절유전자 (CFTR), 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제, 세폭독소, 종양 억제제 유전자, 안티센스 RNA 및 백신 항원을 포함한다.
특정 구현예에서, 개시내용은 면역학적 유효량의 본 발명의 재조합 RSV (예: 약독화된 생 재조합 RSV 또는 불활성화, 비-복제 RSV), 면역학적 유효량의 본 명세서에 기재된 폴리펩티드, 및/또는 면역학적 유효량의 본 명세서에 기재된 핵산을 포함하는 면역원성 조성물 (예: 백신)에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 개시내용은 RSV에 대한 보호 면역반응을 생성하기 위하여 개체의 면역 시스템을 자극하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법에서, 면역학적 유효량의 본 명세서에 기재된 재조합 RSV, 면역학적 유효량의 본 명세서에 기재된 폴리펩티드, 및/또는 면역학적 유효량의 본 명세서에 기재된 핵산은 생리학적으로 허용되는 담체 속에서 개체에 투여된다.
통상적으로, 담체 또는 부형제는 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제, 예를 들어, 멸균수, 수성 식염수, 수성 완충 식염수, 수성 덱스트로스 용액, 수성 글리세롤 용액, 에탄올 또는 이들의 조합이다. 멸균성, pH, 등장성, 및 안정성을 보장하는 상기 용액의 제조는 당해 분야에 정립된 프로토콜에 따라 수행한다. 일반적으로, 담체 또는 부형제는 알레르기 또는 다른 바람직하지 못한 효과를 최소화하고, 특별한 투여 경로, 예를 들어, 피하, 근육내, 비내, 경구, 국소 등에 적합하도록 선택된다. 생성된 수용액은, 예를 들어, 그대로 사용하기 위해 포장되거나 동결건조시킬 수 있고, 동결건조된 제제는 투여 전에 멸균 용액과 합한다.
특정 구현예에서, RSV (또는 RSV 성분)는 RSV의 1개 이상의 균주에 대해 특이적인 면역 반응을 자극하기에 충분한 양으로 투여된다 (예: 면역학적 유효량의 RSV 또는 RSV 성분이 투여된다). 바람직하게는, RSV의 투여로 보호 면역반응이 나타난다. RSV에 대한 보호 면역반응을 생성하는데 적합할 수 있는, 포지티브 항-바이러스 면역반응을 나타내는 용량 및 방법이 당업자에게 알려져 있다 (참조예: 미국 특허 제5,922,326호; Wright 등 (1982) Infect. Immun. 37:397-400; Kim 등 (1973) Pediatrics 52:56-63; 및 Wright 등 (1976) J. Pediatr. 88:931-936). 예를 들어, 바이러스는 투여되는 용량당 약 103-106　pfu (plaque forming units)의 범위 (예: 104-105　pfu/투여 용량)로 제공될 수 있다. 통상적으로, 용량은 연령, 물리적 상태, 체중, 성별, 식이, 투여 형태와 시간, 및 다른 임상적 요인을 근거로 하여 조절될 것이다. 백신 제형은, 예를 들어, 침 및 주사기나 무침 주사 장치를 사용하여 피하 또는 근육내 주사에 의해 전신 투여될 수 있다. 바람직하게는, 백신 제형은, 예를 들어, 점적, 에어로졸 (예: 큰 입자 에어로졸 (약 10 마이크론보다 큰)), 또는 분무에 의해 상기도로 비내 투여된다. 상기 전달 경로중 어떤 것은 보호성 전신 면역반응을 일으키지만, 비내 투여는 바이러스 유입 부위에서 점막 면역성을 나타내는 부가 잇점을 제공한다. 비내 투여의 경우, 약독화된 생바이러스 백신, 예를 들어, 약독화되고, 냉 적응 및/또는 온도 민감성의 재조합 RSV (예: 키메라 재조합 RSV)가 종종 바람직하다. 약독화 생바이러스 백신에 대한 대안으로서 또는 이것 이외에, 사독 바이러스 백신, 핵산 백신 및/또는 폴리펩티드 서브유닛 백신이, 예를 들어, 문헌(Walsh 등 (1987) J. Infect. Dis. 155: 1198-1204 and Murphy 등 (1990) Vaccine 8:497-502)에 제시된 바와 같이 사용될 수 있다.
특정 구현예에서, 약독화된 재조합 RSV가 백신에 사용된 바와 같으며, 감염 증상 또는 적어도 심각한 감염 증상이 약독화된 RSV로 면역화된 (또는 달리 감염된) 대부분의 개체에서 일어나지 않도록 하기에 충분히 약독화시킨다 - 바이러스 성분 (예: 본 명세서의 핵산 또는 폴리펩티드)이 백신 또는 면역원성 성분으로서 사용되는 구현예에서. 그러나, 독성은 경미 또는 중증의 하기도 감염이 통상 백신화되거나 우발적인 대상체에서 일어나지 않도록 충분히 차단된다.
단일 용량에 의한 보호 면역반응의 자극이 바람직하지만, 부가의 용량이 동일하거나 상이한 경로에 의해 투여되어 바람직한 예방학적 효과를 성취할 수 있다. 신생아 및 유아에서, 예를 들어, 다중 투여는 충분한 수준의 면역성을 나타내는데 필요할 수 있다. 투여는 야생형 RSV 감염에 대한 충분한 보호 수준을 유지하기 위해 필요에 따라, 소아기에 걸쳐 간격을 두고 계속될 수 있다. 유사하게, 특히 반복되거나 중증 RSV 감염되기 쉬운 성인, 예를 들어, 의료계 종사자, 보육시설종사자, 어린이의 가족 구성원, 성인, 및 손상된 심폐 기능을 갖는 개체는 보호 면역반응을 일으키고 및/또는 유지하기 위해 다중 면역화를 필요로 할 수 있다. 유도된 면역성 수준은, 예를 들어, 바이러스-중화된 분비 및 혈청 항체의 양, 및 원하는 수준의 보호를 유도하고 유지하는데 필요한 만큼 조절되는 용량 또는 반복되는 백신화를 측정하여 모니터할 수 있다.
대안적으로, 면역반응은 바이러스에 의한 수지 세포의 생체외 또는 생체내 표적화에 의해 자극할 수 있다. 예를 들어, 증식되는 수지 세포는 수지 세포에 의한 RSV 항원의 포획을 허용하기에 충분한 양 및 충분한 기간 동안 바이러스에 노출시킨다. 그 다음에, 세포는 표준 정맥내 이식 방법에 의해 백신화시킬 대상체로 전달한다.
선택적으로, RSV의 투여를 위한 제형은 또한 RSV 항원에 대한 면역반응을 향상하기 위한 1개 이상의 보조제를 함유한다. 계획된 보조제는 알루미늄 염, 예를 들어, Alhydrogel® 및 Adjuphos®이다. 계획된 보조제는 유화제로 안정화된, 수중유 에멀젼(여기서 오일은 수상중 용질로서 작용하고 분리된 점적을 형성한다)을 포함한다. 특정 구현예에서, 에멀젼은 부가의 유화제 (예: 소르비탄 트리올레에이트) 및 계면활성제로서 폴리소르베이트-80 (PS80)과 함께 스쿠알렌 또는 α-토코페롤 (비타민 E)를 함유한다. 특정 구현예에서, 에멀젼은 글루코피라노실 지질 A (GLA)를 함유한다. GLA는 단독으로 또는 스쿠알렌-기반 수중유 안정한 에멀젼 (SE)으로 키메라 RSV, 입자 또는 RSV F 단백질과 함께 제형화될 수 있다. Iyer 등은 호흡기 세포융합 바이러스 융합 단백질 (RSV-F)을 사용하는 상이한 입자 크기의 수중유 보조제를 보고하고 있다. (참조: Hum Vaccin Immunother, 2015, 11(7): 1853-1864).
적절한 보조제는, 예를 들어, 완전 프로인트 보조제, 불완전 프로인트 보조제, 사포닌, 무기 겔 (예: 수산화알루미늄), 표면활성 물질, 예를 들어, 리소레시틴, 플루로닉 폴리올, 폴리안이온, 펩티드, 오일 또는 탄화수소 에멀젼, BCG (bacille Calmette-Guerin), 코리네박테리윰 파르붐 및 합성 보조제 QS-21을 포함한다.
바람직하다면, RSV의 예방학적 백신 투여는 1개 이상의 면역자극 분자의 투여와 함께 수행할 수 있다. 면역자극 분자는 면역자극, 면역증강 및 프로-염증성 활성을 갖는 다양한 사이토카인, 림포카인 및 케모카인, 예를 들어, 인터루킨 (예: IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-12, IL-13); 성장 인자 (예: 과립구-대식세포 (GM)-콜로니 자극 인자 (CSF)); 및 다른 면역자극 분자, 예를 들어, 대식세포 염증성 인자, Flt3 리간드, B7.1; B7.2, 등을 포함한다. 면역자극 분자는 RSV와 동일한 제형으로 투여될 수 있거나, 별도로 투여될 수 있다. 단백질 또는 단백질을 암호화하는 발현 벡터를 투여하여 면역자극 효과를 일으킬 수 있다.
특별한 서브그룹의 특별한 균주의 약독화된 RSV에 의한 개체의 백신화가 상이한 균주 및/또는 서브그룹의 RSV에 대해 교차-보호를 유도할 수 있지만, 교차-보호는 경우에 따라, 예를 들어, 이들 각각이 상이한 서브그룹을 나타내는, 적어도 2개의 균주로부터 약독화된 RSV에 의해 개체를 백신화시켜 향상시킬 수 있다. 유사하게, 약독화 RSV 백신은 선택적으로 다른 감염성 제제에 대한 보호 면역반응을 유도하는 백신과 합할 수 있다.
키메라 RSV 바이러스의 어셈블리(Assembly) 및 구제(rescue)
하기 재조합 바이러스: A2, A2-라인19F, A2-라인19F(M79I), A2-라인19F(R191K), A2-라인19F(K357T), A2-라인19F(Y371N), A2-라인19F(I557V), A2-라인19F(K357T/Y371N) 및 A2-mKate2-2-20F/G는 하기 문헌에 기술된 바와 같이 제조할 수 있다:
Hotard 등 Identification of residues in the human respiratory syncytial virus fusion protein that modulate fusion activity and pathogenesis. J Virol 89, 512-522 (2015).
Meng 등 Respiratory Syncytial Virus Attachment Glycoprotein Contribution to Infection Depends on the Specific Fusion Protein. Journal of virology 90, 245-253 (2015)
Hotard 등 A stabilized respiratory syncytial virus reverse genetics system amenable to recombination-mediated mutagenesis. Virology 434, 129-136 (2012).
OE4에 대한 세균 인공염색체 (BAC) 작제물은 공개된 BAC 함유 A2-mKate2-라인19F(I557V)의 개질을 통해 생성하였다. 단량체성 Katushka 2에 대한 유전자 (mKate2, K), 원적외부 형광 리포터는 RSV 안티게놈 cDNA의 처음 유전자 위치에 존재한다. 이 위치에 mKate2의 포함은 시험관내 또는 마우스에서 RSV를 약독화시키지 못했다. SH의 결실 (ΔSH)은 재조합-매개된 돌여변이유발 (recombineering)에 의해 수행하였다. 하기의 올리고뉴클레오티드 (통합된 DNA 기술/IDT)가 galK 카세트를 PRC-증폭시키기 위해 사용되어, 앰플리콘 말단은 SH가 galK로 치환된 표적 부위에 상동성이 되도록 하였다: dSH50f (서열확인번호: 5) 5' -AGATCTAGTACTCAAATAAGTTAATAAAAAATATACACATGGACGTCCATCCTGTTG ACAATTAATCATCGGCA - 3') (여기서 밑줄친 일부는 BAC의 SH 유전자 개시의 50nt 바로 상류를 나타낸다), 및 dSH50r (서열확인번호: 6) 5' -GTCTTAGCGGTGCGTTGGTCCTTGTTTTTGGACATGTTTGCATTTGCCCCTCAGCACT GTCCTGCTCCTT - 3'), (여기서 밑줄친 일부는 BAC의 G 유전자 개시로 시작되는 50nt의 보체를 나타낸다). 프라이머의 밑줄없는 일부는 기술된 37과 같이, galK 카세트에 대해 특이적이다. 이. 콜라이중 재조합으로 유전자 개시 시작으로부터 SH-G 유전자사이 영역에서 SH를 galK 카세트로 치환시켰다. 하기의 상보성 올리고뉴클레오티드를 어닐링시켰고, 리컴비니어링의 제2 단계에서 galK 카세트를 제거하기 위해 사용되었다: dSH1OOf (서열확인번호: 7) 5' -AGATCTAGTACTCAAATAAGTTAATAAAAAATATACACATGGACGTCCATGGGGCA AATGCAAACATGTCCAAAAACAAGGACCAACGCACCGCTAAGAC - 3') 및 dSH100r (서열확인번호: 8) 5' GTCTTAGCGGTGCGTTGGTCCTTGTTTTTGGACATGTTTGCATTTGCCCCATGGACGT CCATGTGTATATTTTTTATTAACTTATTTGAGTACTAGATCT - 3'). SH의 정밀한 결실은 시퀀싱(sequencing)에 의해 확인되었고, A2-K-ΔSH-라인19F(I557V) BAC가 수득되었다.
인간 코돈-탈최적화된 NS1 및 NS2 코딩 영역 (dNSh)은 A2-dNSh의 회수를 위해 사용된 BAC로부터 분해시켰고, A2-K-ΔSH-라인19F(I557V) BAC에 결찰시켜 A2-K-dNSh-ΔSH-라인19F(I557V)를 수득하였다. 이 작제물은 OE4 + 야생형 A2 G (OE4 + wtG로 언급됨)의 회수를 위해 사용되었다. G의 코돈-탈최적화는 A2의 RSV G 서열로 인간 코돈 이용 성향을 기반으로 최소 빈도로 사용된 모든 코돈의 실리코 치환을 통해 수행하였다. 점돌연변이 (M48I)는 G의 분비 형태를 제거하기 위해 도입되었다. 코돈-탈최적화된 G (dG)의 코딩 영역은 GenScript에 의해 합성하였고, 제한 분해 및 A2-K-dNSh-ΔSH-라인19F(I557V) BAC로 결찰에 의해 클론화시켜 OE4를 위한 BAC를 회수하며, A2-K-dNSh-ΔSH-dG-라인19F(I557V)를 수득하였다.
BAF(Buenos Aires consensus F)의 구제를 위한 BAC는 상기 기술한 방법을 통해 BAF 유전자 서열을 OE4 + wtG BAC로 클로닝시켜 생성하였다. BAF-357/371은 라인 19 F 잔기 K357 및 Y371을 BAF 코딩 서열로 도입을 통해 생성하였다. A2-ΔM2-2의 구제를 위한 BAC는 리컴비니어링에 의해 생성하였다. M2-2의 ΔM2-238234 nt (7번째 코돈으로부터 정지 코돈까지)에 대해 수행했던 것과 같이 결실되었다. 하기의 올리고뉴클레오티드는 리컴비니어링의 제1 단계를 위해 galK 카세트를 PRC-증폭시키기 위해 사용되었다: delM2-l-f (서열확인번호: 9) 5' TTAGTGATACAAATGACCATGCCAAAAATAATGATACTACCTGACAAATACCTGTTG ACAATTAATCATCGGCA - 3') 및 delM2-2-r (서열확인번호: 10) 5' -ATTGTTTGAATTAATAATGTAACGATGTGGTGAGTGTTAGAATTGAGTGTTCAGCAC TGTCCTGCTCCTT - 3'). 하기의 상보성 올리고뉴클레오티드를 어닐링시켰고, 제2 리컴비니어링 단계를 위해 사용하였다: M22_100f (서열확인번호: 11) 5' - TTAGTGATACAAATGACCATGCCAAAAATAATGATACTACCTGACAAATAACACTC AATTCTAACACTCACCACATCGTTACATTATTAATTCAAACAAT - 3'), 및 M22_100r (서열확인번호: 12) 5' ATTGTTTGAATTAATAATGTAACGATGTGGTGAGTGTTAGAATTGAGTGTTATTTGTC AGGTAGTATCATTATTTTTGGCATGGTCATTTGTATCACTAA - 3'). 표적화된 234 nt의 정밀한 결실은 시퀀싱에 의해 확인하였다.
재조합 바이러스는 BSR-T7/5 세포에서 구제되었고, 바이러스 스톡은 베로 세포에서 번식시켰다.
코튼 래트 항-혈청에서 RSV nAb 역가의 정량화를 위해 사용되는 RSV 균주 패널은 합성된 하기 A 및 B 균주 (GeneArt, Invitrogen)의 F 및 G 유전자의 cDNA를 갖는 처음 것에 의해 생성하였다: RSVA/1998/12-21 (JX069802), Riyadh A/91/2009 (JF714706/JF714710); 및 RSV B 균주 NH1276 (JQ680988/JQ736678), 9320 (AY353550), 및 TX11-56 (JQ680989JQ736679). G 및 F 유전자 절편은 제한 분해 및 결찰에 의해 A2-K BAC로 클론화시켰고, 리포터 바이러스는 BSR-T7/5 세포로 형질감염시킨 다음, HEp-2 세포에서 스톡의 번식에 의해 회수하였다.
재조합 바이러스는 RSV 안티게놈성 BAC를 BSR T7/5 세포에서 RSV N, P, M2-1, 또는 L 단백질을 발현한 4개의 인간 코돈-최적화 헬퍼 플라스미드로 공형질감염시켜 회수하였다. 백신 균주의 마스터 및 작업(working) 바이러스 스톡은 후속해서 베로 세포에서 번식시켜 하베스트하였다.
Pre-F 항원 ELISA
바이러스 모액을 해동시켰고, MEM으로 희석시켜 높은 역가의 스톡 현탁액을 수득하였다. 각각의 바이러스 스톡 현탁액 100 μL를 코스타 검정 플레이트 (높은 결합) (Corning)의 3배 시리즈의 웰에 가했다. 플레이트를 덮었고, 실온에서 밤새 인큐베이션시켰다. 다음날, 바이러스 현탁액을 플레이트로부터 버렸고, 플레이트는 웰당 150 μL의 PBS-Tween (PBST, PBS중 0.05% Tween20)으로 1회 세척한 다음, 차단을 위해 웰당 150 μL의 5% BSA (PBS중)를 가했다. 플레이트를 2시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. Pre-F-특이적 mAb MPE839는 인간 코돈-최적화 VH 및 VL 서열을 사용하여 HEK293-X2FreeStyle 세포에서 U-단백질 발현에 의해 생성하였다. pre-F 및 post-F를 결합하는 모타비주맙 mAb는 Nancy Ulbrandt (Medlmmune/AZ)에 의해 제공되었다. MPE8 및 모타비주맙 항체는 1% BSA로 연속 희석에 의해 1:10,000 내지 1:320,000의 추가 희석 전에 PBS중 1 μg/mL로 항체를 희석시켜 제조하였다. 차단에 이어서, 플레이트는 웰당 PBST 150 μL로 다시 1회 세척한 다음, 희석된 1차 항체 100 μL를 웰에 적용시켰다. 플레이트는 제거하기 전에 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였고, 웰당 PBST 150 μL로 3회 세척하였다. 세척후, 1% BSA중 항-인간-HRP 항체의 1:10,000 희석액 100 μL를 적용시켰고, 플레이트는 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그 다음에, 플레이트를 비웠고, PBST 150 μL로 3회 세척한 후, 예비-혼합된 반응성 기질 시약 혼합물 (R&D Systems) 100 μL를 적용시켜 비색 반응을 촉매화하였다. 플레이트를 덮어 대략 10분 동안 인큐베이션하였고, 그 후 반응은 0.2N 황산 100 μL의 첨가에 의해 켄칭시켰다. 플레이트는 ELISA 플레이트 리더상에서 450 nm에서 판독하였다. 수집된 흡광도 기록을 배경(background)에서 뺐고 커브로 플롯팅하였다. 모타비주맙 (pre-F 및 post-F, 전체 F)에 대한 곡선 아래 면적에 대한 MPE8 (pre-F)에 대한 곡선 아래 면적의 비가 전체 F로 정규화된 pre-F 수준을 측정하는데 사용되었다.
베로(Vero)에서 성장
BEAS-2B, NHBE, 및 HAE 세포. 6-웰 플레이트에 70% 합류 베로 또는 BEAS-2B 세포로부터의 매질을 흡인시켰고, 0.01 MOI에서 0.5 mL의 바이러스를 첨가하여 각 바이러스 균주에 대해 얻어지는 각각의 시점에 대해 웰을 복제하였다. 플레이트를 1시간 동안 실온에서 흔들어주었다. 감염에 이어서, 바이러스를 주의해서 흡인시켰고, 단일층은 PBS 1 mL로 2회 세척한 후, 2 mL의 예비-가온된 완전 E-MEM (베로) 또는 RPMI (BEAS-2B)를 가했다. 플레이트는 시간 경과의 지속시간 동안 37℃ 및 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 시점은 감염 후 1, 12, 24, 36, 48, 72, 및 96 h에 얻어졌다. 각각의 시점에서, 단일층은 상등액에 조각으로 부수어 넣어 잠깐 소용돌이시켰고, -80℃에서 저장하기 전에 액체 질소로 플래시 동결시켰다. 두 공여자로부터의 NHBE 세포는 ALI에서 미분화시켰고, 단일층은 2.6의 MOI에서 바이러스 100 μL로 정점에서 감염시키기 전에 PBS로 세척했다. 바이러스는 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하기 위해 방치시켰고, 그 후 제거 및 PBS로 3회 이어서 세척하였다. 표시된 시점에서, 인듀서없이 150 μL의 미분화 매질을 37℃에서 10분 동안 정점 표면에서 인큐베이션하였고, 그 후 하베스트하여 마이크로원심분리 튜브로 옮겼다. 과정을 반복하여 총 300 μL의 풀링(pooled)된 정점의 세척액을 수득하였고, 이는 액체 질소에서 동결시켰고, 이후 적정을 위해 -80℃에서 저장하였다. NHBE 감염과 유사하에, 두 공여자로부터의 HAE 세포는 ALI에서 미분화시켰고, 정점 표면은 PBS로 세척했으며, 6.7의 초기 MOI로 감염시켰다. 37℃에서 2시간 인큐베이션한 다음, 바이러스 주입물을 흡인시켰고, 정점 층은 PBS로 3회 세척했으며, 배양액은 37℃에서 인큐베이션하였다. 각각의 표시된 시점에 대해, 정점 층은 37℃에서 30분 동안 425 μL의 매질로 세척하였고, 상등액은 -80℃에서 저장하였다. FFU 적정은 HEp-2 또는 베로 세포 상에서 상기 기술한 바와 같이 모든 분석에 대해 수행하였다.
마우스에서 바이러스 부하, 중화 역가 및 보호
바이러스 부하의 측정을 위해, 7주된 암컷 BALB/c 마우스 (Charles River)는 진정 상태에서 혈청-비함유 MEM 중 바이러스 100 μL로 비내(i.n.) 감염시켰다. 2, 4, 6 및 8일째에, 마우스를 안락사시켰고, 바이러스 FFU 역가 검정을 위해 좌측 폐를 하베스트하였다. 검출 한계 아래의 역가가 검출 한계의 1/2에 상응하는 값으로 할당되었다. 혈청 nAb 역가의 측정 및 챌린지 연구를 위해, 7주된 암컷 BALB/c 마우스 (Jackson)는 혈청-비함유 MEM 중 바이러스 100 μL로 비내(i.n.) 감염시켰다. 35, 70, 및 100일째에, 마우스를 진정시켰고, 혈청 샘플은 턱밑 림프 정맥 출혈을 통해 수득하였다. 혈청은 FFU 마이크로중화 분석에 의해 정량화될 때까지 -80℃에서 저장하였다. 중화 역가는 37℃에서 1시간 동안 50-100 FFU의 바이러스로 2배 연속 희석시킨, 열-불활성화 (56℃, 30분) 혈청을 공-인큐베이션하여 측정하였다. 그 다음에, 혈청-바이러스 혼합물은 완전 MEM에서 0.75% 메틸셀룰로스와 겹쳐지기 전에, 4℃에서 30분 동안 2900 x g로 96-웰 플레이트의 HEp-2 단일층 위로 스피노큘레이트(spinoculated)하였다. 웰당 FFU는 2일 후 카운팅하였고, EC50 역가는 비서형 회귀 분석에 의해 결정하였다. 백신화 후 마우스를 챌린지하기 위해, 마우스는 주입 후 102일째에 진정시켰고, 105 PFU A2-라인19F로 비내 감염시켰다. 4일 후, 바이러스 부하는 HEp-2 세포 상에서 플라크 검정에 의해 좌측 폐에서 측정하였다.
증진된 열안정성 및 면역원성을 갖는 생-약독화 RSV 백신
다른 파라믹소바이러스 융합 단백질과 마찬가지로, RSV 융합 당단백질 (RSV F)은 바이러스 외피 및 표적 세포의 융합을 매개하는 타입 I 막관통 단백질이다. RSV F는 먼저 준안정성, 전-융합 형태로 삼합체와 같이 비리온 막에서 어셈블리된다. 트리거링(Triggering)은 후-융합 형태로 F의 주요 리폴딩을 야기하며, 이는 바이러스 및 표적 막에 근접하여 융합을 매개한다. pre-F 및 post-F가 모두 바이러스 스톡에서 제조된 RSV 비리온에 존재하므로, ELISA-기반 접근법을 사용하여 RSV 스톡중 pre-F 항원의 상대적 양을 평가할 수 있다. 원형 A2 균주의 배경에서 균주 라인 19의 F 단백질을 발현하는, 균주 A2-라인19F는 균주 A2보다 pre-F-특이적 mAb에 대해 유의적으로 더 높은 상대적 결합을 나타냈다. A2-라인19F에 의한 BALB/c 마우스의 비내 (i.n.) 주입으로 A2보다 더 높은 nAb 역가를 생성했다.
라인 19F에 독특한 5개의 아미노산 잔기가 있다: M79, R191, K357, Y371, 및 I557. 이들 각각의 위치에서 A2 잔기를 함유하는 A2-라인19F 돌연변이체 상의 Pre-F 항원 ELISA는 잔기 K357 및 Y371이 라인 19F pre-F 항원 수준에 대해 중요함을 보여줬다.
RSV는 이열성(heat-labile) 바이러스로 알려져 있고, 승온은 RSV post-F 형태로의 전이를 방해할 수 있다. pre-F 수준이 증진된 RSV는 온도-불활성화에 보다 내성이어야 한다. RSV A2-라인19F 감염성은 4℃ 및 37℃에서 라인 19F의 K357 및 Y371 잔기에 의해 부분적으로 매개된 표현형인, A2보다 시간이 경과함에 따라 더욱 열안정성이었다. K357 및 Y371은 유전적으로 분기된 백신 균주 DB1의 F로 도입시켰고, 이는 항원 서브그룹 B "부에노스 아이레스" (BAF) 클레이드의 컨센서스 F 유전자를 발현한다. 본 발명자는 앞서 DB1의 생성을 기술하였고, 이는 유전자형 RSV-A2-dNS1-dNS2-ΔSH-BAF와 함께, 코돈-탈최적화된 비구조적 단백질 유전자 및 결실 SH 유전자를 또한 함유한다. DB1은 낮은 수준의 pre-F 항원을 발현했고, 열적으로 불안정했다; 그러나, DB1-357/371를 생성하기 위해 K357 및 Y371 잔기의 혼입은 MPE8 결합을 증진시켰고, 부분적으로 열안정성을 회복하였다. 이들 데이터는 잔기 357 및 371이 pre-F 항원 수준의 상관물인, MPE8 결합뿐만 아니라, 바이러스 스톡에서 열 불활성화에 대한 바이러스 내성을 좌우했음을 입증하였다.
OE4라 불리우는 RSV LAV는 라인 19F를 다중-성분 백신으로 혼입시켜 생성하였다. 인터페론 경로를 표적화하고 아폽토시스(apoptosis)를 억제함으로써 숙주 선천성 면역을 억제하는 2개의 RSV의 비구조 단백질을 암호화하는 NS1 및 NS2 유전자는 코돈-탈최적화시켰다. NS1 및 NS2 유전자의 코돈-탈최적화는 유전적으로 안정했고, NS1 및 NS2 단백질 발현을 감소시켰으며, 이로 인해 마우스에서 다소 증진된 면역원성을 갖는 바이러스 약독화를 일으켰다. 작은 소수성 (SH) 단백질 유전자는 바이러스 리더에 대한 그들의 근접성을 변화시켜, F를 포함한, 하류 바이러스 유전자의 전사를 증가시킬 목적으로 결실시켰다. SH 결실은 또한 마우스 및 침팬지에서 경미하게 약독화시키지만, 선행 연구에서 어린이들의 백신 후보에서는 명확한 약독화는 제공하지 않았다. RSV 부착 (G) 당단백질 유전자를 코돈-탈최적화시켰고, G의 분비된 형태는 점돌연변이에 의해 제거하였다. RSV는 G의 막-결합 형태 (Gm) 및 분비 형태 (Gs)를 발현하며, 이는 불멸화 세포주에서의 바이러스 복제에 필요치 않다. RSV G는 보호 중화 항체를 유도할 수 있다. 그러나, G는 F보다 덜 보존적이고, 케모카인 의태를 통해 선천성 면역반응을 억제한다. Gs는 항원 유인물로서 작용하고, C-형 렉틴과의 상호작용을 통해 수지 세포 신호화 및 활성화를 변화시킬 수 있다. 생성된 OE4 백신 후보의 유전자형은 RSV-A2-dNS1-dNS2-ΔSH-dGm-Gsnu11-라인19F이다. 웨스턴 블롯팅을 사용하여, OE4가 모체 A2에 비하여 NS1, NS2, 및 G의 발현 수준을 감소시켰음을 측정하였다. OE4는 SH 결실에 기인할 것 같은, A2-라인19F보다 더 높은 수준의 F 발현을 가졌다.
OE의 MPE8 및 D25 결합을 분석하였고, 4℃ 및 37℃에서 백신 열안정성을 측정하였다. A2-라인19F와 유사하게, OE4는 항체 결합에 의해 높은 상대적인 pre-F 항원 수준 및 라인19F 단백질의 그의 발현과 일관된 열안정성을 나타냈다. 측정된 바와 같은 Pre-F 안정성은 시간 경과에 따라 4℃에서 인큐베이션한 바이러스 스톡으로부터 OE4 및 A2의 MPE8 결합에 의해 정량화하였다. 상대적인 pre-F 항원 수준은 8일의 기간에 걸쳐 두 바이러스에서 감소하였다. 따라서, A2 및 OE4 감염성의 열안정성 동역학은 pre-F 항원 수준의 감소와 상관관계가 없었다. 그러나, OE4는 A2에 비하여 각 시점에서 pre-F 항원 수준의 2배를 초과하여 유지하였고, pre-F의 최소 임계는 감염성을 유지하는데 충분할 수 있다.
RSV A2 및 OE4로 비리온 및 당단백질 혼입의 전반적인 구조를 평가하기 위하여, BEAS-2B 세포로부터 버딩된(budded) 바이러스의 얇은-단면 투과전자현미경 (TEM), 고유의 면역-TEM 및 저온-전자 단층촬영 (cryo-ET)을 수행하였다. BEAS-2B는 불멸화된 인간 기관지 상피세포주이다. 바이러스-감염된 세포 및 방출된 비리온은 비리온의 고유 구조의 보존을 최대화하기 위하여 하기의 최소 샘플 처리를 따라 분석하였다. 먼저, 얇은-단면 TEM과 합해진 고유의 면역금(immunogold) 표지화는 우선적으로 pre-F (MPE8), post-F (131 -2A), 전체 F (모타비주맙), 또는 G (131-2G)를 결합하는 mAb를 사용하여 수행하였다. 막 길이당 금의 밀도는 각각의 바이러스 및 면역표지에 대해 정량화하였다. OE4 바이러스 입자는 잠잭적으로 SH의 결실로 인하여, A2보다 더 큰 밀도의 혼입된 pre-F 및 전체 F를 나타내었다. A2 및 OE4 입자 표면에서 검출된 post-F의 양에 있어서 유의한 차이는 없었다. OE4 입자 상의 G 단백질 밀도는 G 유전자의 코돈-탈최적화 셋팅시 예상된 바와 같이, 유의하게 감소되었다.
OE4 백신 후보는 불멸화 세포 및 1차 인간 기도 상피세포에서 약독화 수준을 측정함으로써 시험관내 특성화하였다. 바이러스 스톡 생성에 사용되었던 베로 세포에서, OE4는 모체 비-약독화 A2-라인 19F 다소 아래인 역가로 성장하였다. OE4는 BEAS-2B 세포에서 야생형에 비하여 더 약독화되었다. 이어서, 본 발명자는 혈청검사 음성형(seronegative) 어린이에서 RSV LAV 약독화에 근사하기 위해 정립된 시스템인, 1차 인간 기도 상피세포에서 OE4 성장을 평가하였다. 본 발명자는 2개의 모델, NHBE-ALI 및 HAE-ALI를 실행하였고, OE4가 두 모델에서 유의하게 약독화되었고, 배양을 통한 전개시 결핍을 나타냈음이 밝혀졌다. OE4에서 G의 코돈-탈최적화는 아마도 1차 세포에서 G의 앞서 기술한 부착 역할로 인하여, NHBE-ALI에서 야생형 G를 발현하는 OE4 (OE4 + wtG)에 비하여 약독화 수준에 유의하게 도움이 됐다. BALB/c 마우스에서, OE4는 적절히 약독화되었고, A2-라인19F와 대등하고 A2보다 더 높은 nAb 역가를 유도하였다. 비내 주입에 이어, 마우스는 A2-라인19F와 102일째 챌리지하였고, OE4-백신화 마우스는 챌린지에 대해 완전히 보호되었다.
OE4는 임상 시험 전에 코튼 래트에서 평가하였다. 코튼 래트에서, OE4는 상부 및 하부 기도에서 상당히 약독화되었고, OE4는 RSV 다양성을 나타내는 RSV 균주의 패널에 대해 비교적 높은 수준의 혈청 nAb를 유도하였다. OE4-백신화된 코튼 래트는 폐에서 뿐만 아니라, 상부 기도에서 RSV 챌린지에 대해 완전히 보호되었다. 그럼에도불구하고 OE4 정립된 효과적인 점막 면역성은 상당히 약독화되었다.
다른 RSV 백신 후보인, 포르말린-불활성화 RSV의 손상에 의해 두드러진 1차 관심은 자연 감염시 질환에 대한 백신-증진된 기폭을 위한 잠재력이다. RSV LAV 후보가 질병을 증진시키는 것으로 보이진 않았지만, OE4에 의해 사용된 신규 백신화 전략이 챌리지시 증진된 질환에 대해 기폭이 되는지는 코튼 래트에서 평가하였다. RSV 챌린지는 모의(mock)에 비하여 OE4에 의한 감염에 이어 질병을 증진시키지 않았다. 대조적으로, 포르말린-불활성화 RSV는 OE4 및 모의에 비하여 증가된 세기관지주위 침윤 및 폐포염과 연관된 질환을 증진시켰다.
저-융합 F 단백질에 의해 약독화된 키메라 호흡기 세포융합 바이러스 백신 후보는 코튼 래트에서 면역원성이고 챌린지에 대해 보호적이다
단독으로 표현시, 부에노스 아이레스 F 단백질 (BAF)은 A2F 및 라인19F 단백질에 비하여 형편없이 융합유도적(fusogenic)이었다. 역유전학은 비-구조 단백질 NS1 및 NS2에 대한 유전자의 코돈-탈최적화 (dNS); 작은 소수성 단백질 유전자 결실 (ΔSH); 및 부에노스 아이레스 클레이드의 저-융합 RSV 서브그룹 B F 컨센서스 (BAF)에 의한 야생형 융합(F) 단백질 유전자의 대체를 조합한 LAV를 디자인하도록 실행하였다. "DB1"이라 불리우는 이러한 백신 후보 RSV-A2-dNS-ΔSH-BAF는 1차 인간 기도 상피세포와 코튼 래트의 상부 및 하부 기도의 두 모델에서 약독화되었다. DB1은 또한 코튼 래트에서 상당히 면역원성이었고, 재조합 RSV 균주의 상이한 패널에 대해 중화 항체를 광범위하게 유도하였다. 백신화된 코튼 래트를 야생형 RSV A로 챌린지한 경우에, DB1은 비백신화 동물에 비하여, 각각 3.8 log10 총 PFU 및 2.7 log10 PFU/g 조직 만큼 상부 및 하부 기도에서 바이러스 역가를 감소시켰다 (P < 0.0001). 이에 따라, DB1은 코튼 래트에서 RSV 챌린지에 대해 약독화되었고, 상당히 면역원성이며 보호적이었다. DB1은 바이러스 복제를 약독화하고 면역원성을 보존하는 전략으로서 저-융합 F 단백질을 혼입시키기 위한 제1의 RSV LAV이다.
DB1은 코튼 래트의 상부 및 하부 기도에서 10배보다 크게 약독화시켰지만, 여전히 RSV A 및 B 재조합 균주의 상이한 패널에 대해 nAb의 높은 역가를 광범위하게 유도하였다. DB1은 또한 코튼 래트 비내 세척 시험편에서 RSV-특이적 IgA 항체의 형태로 점막 면역성을 생성했다. 백신화 동물이 RSV로 챌린지된 경우에, DB1은 비내 세척 및 폐 세척 시험편 모두에서 챌린지 균주 역가를 > 99%까지 감소시켰다. 이에 따라. DB1은 코튼 래트에서 RSV 챌린지에 대해 약독화되었고, 상당히 면역원성이며, 보호시 효능적이었다.
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tcaaatacat 13620 tcttagccaa gatgcaagtt tacatagagt aaaaggatgt catagcttca aattatggtt 13680 tcttaaacgt cttaatgtag cagaattcac agtttgccct tgggttgtta acatagatta 13740 tcatccaaca catatgaaag caatattaac ttatatagat cttgttagaa tgggattgat 13800 aaatatagat agaatacaca ttaaaaataa acacaaattc aatgatgaat tttatacttc 13860 taatctcttc tacattaatt ataacttctc agataatact catctattaa ctaaacatat 13920 aaggattgct aattctgaat tagaaaataa ttacaacaaa ttatatcatc ctacaccaga 13980 aaccctagag aatatactag ccaatccgat taaaagtaat gacaaaaaga cactgaatga 14040 ctattgtata ggtaaaaatg ttgactcaat aatgttacca ttgttatcta ataagaagct 14100 tattaaatcg tctgcaatga ttagaaccaa ttacagcaaa caagatttgt ataatttatt 14160 ccctatggtt gtgattgata gaattataga tcattcaggc aatacagcca aatccaacca 14220 actttacact actacttccc accaaatatc tttagtgcac aatagcacat cactttactg 14280 catgcttcct tggcatcata ttaatagatt caattttgta tttagttcta caggttgtaa 14340 aattagtata gagtatattt taaaagatct taaaattaaa gatcccaatt gtatagcatt 14400 cataggtgaa ggagcaggga atttattatt gcgtacagta gtggaacttc atcctgacat 14460 aagatatatt tacagaagtc tgaaagattg caatgatcat agtttaccta ttgagttttt 14520 aaggctgtac aatggacata tcaacattga ttatggtgaa aatttgacca ttcctgctac 14580 agatgcaacc aacaacattc attggtctta tttacatata aagtttgctg aacctatcag 14640 tctttttgtc tgtgatgccg aattgtctgt aacagtcaac tggagtaaaa ttataataga 14700 atggagcaag catgtaagaa agtgcaagta ctgttcctca gttaataaat gtatgttaat 14760 agtaaaatat catgctcaag atgatattga tttcaaatta gacaatataa ctatattaaa 14820 aacttatgta tgcttaggca gtaagttaaa gggatcggag gtttacttag tccttacaat 14880 aggtcctgcg aatatattcc cagtatttaa tgtagtacaa aatgctaaat tgatactatc 14940 aagaaccaaa aatttcatca tgcctaagaa agctgataaa gagtctattg atgcaaatat 15000 taaaagtttg ataccctttc tttgttaccc tataacaaaa aaaggaatta atactgcatt 15060 gtcaaaacta aagagtgttg ttagtggaga tatactatca tattctatag ctggacgtaa 15120 tgaagttttc agcaataaac ttataaatca taagcatatg aacatcttaa aatggttcaa 15180 tcatgtttta aatttcagat caacagaact aaactataac catttatata tggtagaatc 15240 tacatatcct tacctaagtg aattgttaaa cagcttgaca accaatgaac ttaaaaaact 15300 gattaaaatc acaggtagtc tgttatacaa ctttcataat gaataatgaa taaagatctt 15360 ataataaaaa ttcccatagc tatacactaa cactgtattc aattatagtt attaaaaatt 15420 aaaaatcgta cgatttttta aataactttt agtgaactaa tcctaaagtt atcattttaa 15480 tcttggagga ataaatttaa accctaatct aattggttta tatgtgtatt aactaaatta 15540 cgagatatta gtttttgaca ctttttttct cgt 15573

Claims (20)

  1. 79번 위치에 M, 191번 위치에 R, 357번 위치에 K, 및 371번 위치에 Y를 가지되, 단 호흡기 세포융합 바이러스 (respiratory syncytial virus)(RSV) F 단백질은 서열확인번호: 3 또는 서열확인번호: 4는 갖지 않는, RSV F 단백질을 암호화하는 돌연변이된 유전자를 갖는 생약독화된 키메라((live attenuated chimeric) RSV를 포함하는 면역원성 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 RSV F 단백질이 557번 위치에 V를 갖거나, 557번 위치가 V가 되도록 F 단백질을 돌연변이시킨, 면역원성 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 RSV F 단백질이 서열확인번호: 1 또는 13을 갖는 면역원성 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서, RSV NS1, NS2 및 G 단백질을 암호화하는 상기 유전자를 코돈-탈최적화(codon-deoptimized)시켜, NS1, NS2 및 G의 발현율이 야생형 A2 바이러스에 비하여 베로(Vero) 세포에서 1/2 초과까지 감소되도록 한 면역원성 조성물.
  5. 청구항 4에 있어서, 포유류 세포중 상기 G의 발현율이 야생형 A2 바이러스에 비하여 베로 세포에서 1/10 초과까지 감소되는 면역원성 조성물.
  6. 청구항 4에 있어서, 상기 NS1의 발현율이 야생형 A2 바이러스에 비하여 베로 세포에서 1/4 초과까지 감소되는 면역원성 조성물.
  7. 청구항 4에 있어서, 상기 NS2의 발현율이 야생형 A2 바이러스에 비하여 베로 세포에서 1/4 초과까지 감소되는 면역원성 조성물.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 SH 단백질을 암호화하는 유전자가 결실되거나 절단된 면역원성 조성물.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 F 단백질을 암호화하는 유전자는 557번 위치가 V가 아니거나, I가 557번 위치에 존재하도록 돌연변이시킨 면역원성 조성물.
  10. 청구항 1 내지 19 중 어느 한 항에 있어서, 보조제 및/또는 다른 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 보조제가 알루미늄 겔, 알루미늄 염 또는 모노포스포릴 지질 A인 면역원성 조성물.
  12. 청구항 10에 있어서, 상기 보조제가 선택적으로 α-토코페롤, 스쿠알렌 및/또는 계면활성제를 포함하는 수중유(oil-in-water) 에멀젼인 면역원성 조성물.
  13. .
  14. 청구항 1 내지 14 중 어느 한 항의 면역원성 조성물을 유효량으로 대상체에 투여함을 포함하는, 호흡기 세포융합 바이러스에 대한 대상체의 면역화 방법.
  15. 79번 위치는 I이고, 191번 위치는 K이며, 357번 위치는 T이고, 371번 위치는 N이 되도록 RSV F 단백질을 암호화하는 핵산.
  16. 청구항 15에 있어서, 서열확인번호: 14 또는 변이체를 포함하는 핵산.
  17. 청구항 16의 핵산을 포함하는 벡터.
  18. 청구항 17에 있어서, 플라스미드 또는 세균 인공염색체(bacterial artificial chromosome)로부터 선택되는 벡터.
  19. 79번 위치는 M이고, 191번 위치는 R이며, 357번 위치는 K이고, 371번 위치는 Y가 되도록 RSV F 단백질을 포함하는 분리된 재조합 입자.
  20. 청구항 19에 있어서, 생약독화된 RSV 게놈 또는 안티게놈을 포함하는 분리된 재조합 입자.
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