JP2001245682A - 骨および軟骨誘導蛋白質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 骨および／または軟骨欠損並びに創傷治癒お
よび関連する組織修復に使用できる蛋白質をコードする
ＤＮＡおよび当該ＤＮＡを使用して上記蛋白質を提供す
ること。 【解決手段】 精製した軟骨および／または骨誘導体蛋
白質およびその製造法を記載している。また、それら蛋
白質のアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡの塩
基配列を記載している。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本出願は1990年5月16日出願
のアメリカ合衆国特許出願第07／525357号および1991年
1月15日出願のアメリカ合衆国特許出願第07／641204号
の一部継続出願である。

【０００２】本発明は軟骨および／又は骨形成誘導能を
示す精製蛋白質およびこれらを得るための方法に関す
る。これらの蛋白質は骨および／又は軟骨形成を誘導す
るためおよび傷の治療および組織の修復に用いることが
出来る。本発明は、BMP-8蛋白質と称する新規蛋白質を
提供する。うしおよびおそらくは他の種のBMP-8蛋白質
は、

【表１０】 を含むアミノ酸配列と同一又は実質的に同一の少なくと
も一種のアミノ酸配列を含むことを特徴とする。

【０００３】本発明のBMP-8蛋白質は更に、ドデシル硫
酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PA
GE)により測定した見かけの分子量が28000〜38000ダル
トンであることを特徴とする。SDS-PAGEの還元条件下
で、蛋白質は約14000〜20000ダルトンの範囲である。

【０００４】BMP-8蛋白質はまた、少なくとも一種の以
下のDNA配列を含む、BMP-8蛋白質をコードするDNA配列
を特徴とする：

【表１１】

【０００５】本発明の蛋白質は軟骨および／又は骨の形
成を刺激、促進、又はその他の方法で誘導することが出
来る。

【０００６】前記のアミノ酸配列は本明細書において以
下に記載するようにうしの骨調製品から得られる。他の
「BMP」蛋白質の知見に基づくと、ひとの配列はうしの配
列と同一又は相同であると考えられる。本発明は更にひ
とBMP-8蛋白質および＃75010で本明細書において開示さ
れるひとBMP-8蛋白質をコードするDNAを包含する。

【０００７】本発明は更に、本発明のBMP-8蛋白質をコ
ードするDNA配列を得るための方法を包含する。本方法
は標準的技術を用いてひと遺伝子又はそのフラグメント
に関してライブラリーをスクリーンするためのプローブ
をデザインするために前記アミノ酸配列又はその一部を
利用する。

【０００８】本発明の蛋白質はBMP-8蛋白質をコードす
るDNA配列を用いて形質転換された細胞を培養し、培地
から

【表１２】

【表１３】 を含むアミノ酸配列と同一または実質的に同一の少なく
とも一種のアミノ酸配列を含むことを特徴とする蛋白質
を回収し、精製することによりえられる。

【０００９】発現された蛋白質は培地から単離され、回
収され、精製される。精製され、発現された蛋白質は、
同時に生産される他の蛋白質性物質ならびに他の不純物
を実質的に含まない。回収された精製蛋白質は軟骨およ
び／又は骨形成活性を示す。

【００１０】本発明の蛋白質は更に以下に記載するラッ
ト骨形成検定において軟骨および／又は骨形成活性を示
す能力を有することを特徴とする。更に、本発明の蛋白
質はこのラット骨形成検定において形成された骨1gあた
り0.5μ〜500μgの濃度で活性を示す。更にこれらの蛋
白質はこの分析において骨１g当たり1μ〜50μgの濃度
で活性を示す。更に詳細には、これらの蛋白質はラット
骨形成検定において１μgの蛋白質の能力が少なくとも
＋２点であることを特徴とする。

【００１１】本発明の他の態様は、医薬上許容される賦
形剤または担体中に治療上有効な量の本発明の蛋白質を
含有する医薬組成物を提供する。本発明の組成物は骨お
よび／又は軟骨形成を誘導するのに用いることが出来
る。これらの組成物は、傷の治療および組織修復にも用
いることが出来る。更に、本発明の組成物は本発明の蛋
白質のほかに少なくとも一種の他の医薬上有用な薬剤、
例えばPCT公開ＷＯ88／00205号およびＷＯ89／10409号
において開示されているBMP-1、BMP-２（以前BMP-２Aま
たはBMP-２・クラスIとも称する）BMP-3、BMP-4（以前B
MP2BまたはBMP2・クラス2とも称した）；およびPCT公開W
O90／11366号において開示されているBMP-５、BMP-６お
よびBMP-７等と称する蛋白質を含んでもよい。

【００１２】他の医薬上有用な薬剤としては、表皮成長
因子（EGF）、線維芽細胞成長因子(FGF)、および形質転
換成長因子(TGF-aおよびTGF-b)などの成長因子を含む。
本発明の組成物は例えば、組成物の支持および／又は骨
および／又は軟骨の成長のための表面を提供するための
適切なマトリックスを含んでもよい。このマトリックス
はBMP蛋白質をゆっくり放出するか又はBMP蛋白質の呈示
に適切な環境を提供する。

【００１３】該組成物は、多くの骨および／又は軟骨欠
損、および歯周疾患の治療法に採用される。これらはま
た種々の傷の治療および組織修復においても用いられ
る。本発明に基づくこれらの方法では、このような骨お
よび／又は軟骨形成、傷の治療又は組織修復を必要とす
る患者に治療上有効な量の本発明の蛋白質を投与する。
これらの方法では、本発明の蛋白質（又はその一部）
を、前記出願において開示されている「BMP」蛋白質
（又はその一分）の少なくとも一種と組み合わせて投与
する。更に、これらの方法は、EGF、FGF、TGF-aおよびT
GF-bを含む他の成長因子とともに本発明の蛋白質を投与
することも包含する。

【００１４】本発明の更に他の態様は、本発明のBMP-8
蛋白質の発現をコードするDNA配列である。このような
配列は、前記ペプチド配列と同一又は実質的に同一の少
なくとも一種のペプチド配列またはそのフラグメントを
コードするヌクレオチド配列を含む。

【００１５】本発明の別の態様では、前記のごとくその
発現制御配列と操作可能に結合している本発明の BMP-
８蛋白質をコードするDNA配列を含有するベクターを提
供する。BMP-8蛋白質の生産において用いるためにこの
ようなベクターを用いて形質転換された宿主細胞も本発
明により提供される。BMP-8をコードするDNA配列を含有
する宿主細胞は本発明の蛋白質の新規製造法において用
いることが出来る。この形質転換された宿主細胞を適当
な培地中で培養し、本発明の蛋白質を細胞、細胞溶解
物、又は調整培地から通常の技術により単離し、精製す
る。この方法では、多くの公知の細胞（原核および真核
の両方）をポリペプチドの発現のための宿主細胞として
用いてもよい。

【００１６】本発明の他の態様および利点は以下の詳細
な記述および好ましい具体例の考察により明らかであ
る。

【００１７】図面の簡単な説明 第１図は、ジチオスレイトールを用いた還元後の骨誘導
性フラクション（28000〜38000ダルトン、非還元）のSD
S-PAGE分析を示す。

【００１８】発明の詳細な記載 本発明の精製BMP-8軟骨／骨蛋白質は、

【表１４】 を含むアミノ酸配列と同一又は実質的に同一の少なくと
も一種のアミノ酸配列を含むことを特徴とする。

【００１９】精製BMP-8蛋白質は、同時に生産される蛋
白質性物質ならびに他の不純物を実質的に含まない。こ
れらの蛋白質は更に軟骨および／又は骨形成誘導能を特
徴とする。この活性は実施例３において記載するラット
骨形成検定における活性で示される。更に、これらの蛋
白質は、検定において形成される骨１グラムあたり0.5
μ〜500μgの濃度で活性を示す。これらの蛋白質は更に
この分析において骨１グラムあたり1μg〜50μgの濃度
で活性を示す。この蛋白質は更にもとの又は修飾された
得点法のいずれかを用いてこの検定において1μgの能力
が最低＋２であることを特徴とする。

【００２０】本発明の蛋白質は更に、ドデシル硫酸ナト
リウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)によ
り測定すると見かけの分子量が28000〜38000ダルトンで
あることを特徴とする。SDS-PAGEにおける還元条件下
で、蛋白質は約14000〜20000ダルトンの範囲である。

【００２１】更に別の態様では、本発明は、本発明のBM
P-8骨／軟骨蛋白質をコードするDNA配列を得る方法を提
供する。DNA配列を得る方法は前記アミノ酸配列を利用
して標準的方法を用いてライブラリーをスクリーンする
ためのプローブをデザインする。このようにして同定さ
れたうし配列又はひと遺伝子はひとセルライン又は類似
の軟骨／骨蛋白質を合成する組織を同定するためのプロ
ーブとしても用いられる。cDNAライブラリーを合成し、
ひとまたはうしコード化配列由来のプローブでスクリー
ンする。このようにして同定されたひと配列を宿主細胞
中に形質転換し、該宿主細胞を培養し、蛋白質を培地か
ら回収し、単離し、精製する。精製蛋白質は実施例３の
ラット骨形成検定において軟骨および／又は骨形成活性
を示すことが予想される。

【００２２】本発明で提供される蛋白質は、前記配列に
よりコードされる因子も含むが、その配列に対する修飾
は自然におこなわれるか（例えば、ポリペプチドにおけ
るアミノ酸変更を誘導しうるヌクレオチド配列における
対立遺伝子的改編）又は慎重な工学的処理により行われ
る。同様に、BMP-8蛋白質の蛋白質のアミノ酸残基の連
続配列を全体的又は部分的に複製する合成ポリペプチド
も本発明に包含される。これらの配列は、本発明の他の
軟骨／骨蛋白質と共有の一次、二次又は三次構造および
立体配座特性により、共通して骨および／または軟骨成
長因子生物的特性を有し得る。従って、これらは治療方
法において天然に存在する蛋白質の生物学的活性代用物
として用いることも出来る。

【００２３】本明細書において記載された本発明の蛋白
質の配列の他の特異的突然変異体はグリコシル化部位が
修飾されていてもよい。これらの修飾はO-結合又はN-結
合グリコシル化部位を含む。例えば、グリコシル化の不
存在又は一部のみのグリコシル化は、本発明の蛋白質の
配列に存在するアスパラギン結合グリコシル化認識部位
におけるアミノ酸置換又は欠失に起因する。アスパラギ
ン結合グリコシル化認識部位は、適当な細胞のグリコシ
ル化酵素により特異的に認識されるトリペプチド配列を
含む。これらのトリペプチド配列は、アスパラギン-X-
トレオニン又はアスパラギン-X-セリン（但し、Xは通常
任意のアミノ酸である）のいずれかでである。グリコシ
ル化認識部位の第一又は第三アミノ酸位の一方又は両方
における様々なアミノ酸置換又は欠失（および／又は第
二位におけるアミノ酸欠失）は、修飾トリペプチド配列
における非グリコシル化をもたらす。このように変更さ
れたヌクレオチド配列の発現はその部位でグリコシル化
されていない変種をもたらす。

【００２４】また本発明は、他の蛋白質性材料をコード
するDNA配列との組み合わせを含まず、本発明の蛋白質
の発現をコードする新規DNA配列を包含する。更に、ス
トリンジェント・ハイブリダイゼーション条件下で前記
方法にしたがって単離されるDNA配列とハイブリダイゼ
ーションし、ラット骨形成検定における軟骨および／又
は骨形成活性を示す配列を含む[ティー・マニアチス
ら、「モレキュラー・クローニング（ア・ラボラトリー
・マニュアル）、コールド・スプリング・ハーバー・ラ
ボラトリー（1982）、387〜389頁参照 ]。このようなス
トリンジェント・ハイブリダイゼーション条件の一例と
しては、65℃にて４xSSCでハイブリダイゼーションし、
続いて、６５℃にて１時間0.1xSCC中で洗浄する。ある
いは、ストリンジェント・ハイブリダイゼーション条件
の一例としては、50％ホルムアミド、4ｘSSC中４２℃で
行う。

【００２５】同様に、前記のようにして単離されたBMP-
8蛋白質をコードするが遺伝子コードの退縮またはアレ
リック変異（アミノ酸変更を誘導する場合もしない場合
もありうる種の集団に起こる天然塩基の変形）故にコド
ン配列が異なるDNA配列もまた、本明細書に記載された
本発明の蛋白質をコードする。点突然変異又は誘導修飾
（挿入、欠失および置換を誘導）により起こるそれによ
りコードされるポリペプチドの活性、半減期又は生産の
向上が誘発されるDNA配列における変形も本発明に包含
される。

【００２６】本発明の別の態様は、本発明の蛋白質の新
規製造法を提供する。この方法は、既知調節配列の制御
下、本発明の蛋白質の発現をコードするDNA配列により
形質転換した適当なセルラインの培養を含む。調節配列
は、プロモーターフラグメント、ターミネーターフラグ
メントおよび適当な宿主細胞におけるBMP-8蛋白質の発
現を行う他の適当な配列を含む。本発明の精製BMP-8蛋
白質を培地から回収し、単離し、精製する。精製蛋白質
は、

【表１５】 を含むアミノ酸配列と同一又は実質的に同一の少なくと
も一種の配列を含むことを特徴とする。

【００２７】適当な細胞又はセルラインはほ乳類細胞、
例えばチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞(CHO)であり
得る。適当なほ乳類宿主細胞の選択ならびに形質転換、
培養、増幅、スクリーニング、および製品の製造および
精製の方法は当業界では周知である。例えば、ゲシング
およびサンブルック、「ネイチャー」、293、620〜625
（1981）または別法としてカウフマンら、「モレキュラ
ー・アンド・セルラー・バイオロジー」、5（7）1750〜
1759（1985）又はハウレイら、アメリカ合衆国特許第44
19446号参照。後記実施例記載の別の適当なほ乳類セル
ラインは、さるCOS-1セルラインである。ほ乳類細胞CV-
1も適当である。更に、典型的なほ乳類宿主細胞として
は、特に霊長類セルラインおよび齧歯類セルライン（形
質転換セルラインを含む）が挙げられる。通常の倍数細
胞、一次組織のインビトロ培養由来の細胞種、ならびに
一次移植片も適当である。候補となる細胞は、選択遺伝
子が遺伝子型的に欠失しているか又は圧倒的な活動選択
遺伝子を含有する。他の適当なほ乳類セルラインは、ヒ
ーラ、マウスL-929細胞、スイスBalb-cまたはNIHマウス
由来の３Ｔ３ライン、BHKまたはHaKハムスターセルライ
ンであるがこれに限定されない。

【００２８】細菌細胞もまた適当な宿主である。例え
ば、エシェリヒア・コリのような様々な株（例、HB10
1、MC1061)はバイオテクノロジー分野において宿主細胞
としてよく知られている。バシルス・サブチリス、プソ
イドモナス、他のかん菌などの様々な株もまたこの方法
において使用され得る。

【００２９】当業界の熟練者には周知の多くの酵母細胞
株もまた、この発明のポリペプチドの発現用の宿主細胞
として利用され得る。更に、所望により、昆虫細胞もこ
の発明の方法における宿主細胞として利用され得る。例
えば、ミラーら、「ジェネティック・エンジニアリン
グ」、8、227〜298（プレナム・プレス1986）およびそ
の引用文献参照。

【００３０】本発明の別の態様は、本発明の蛋白質の発
現方法で使用されるベクターを提供する。好ましくは、
これらのベクターは、本発明の新規軟骨／骨蛋白質をコ
ードする前述の完全な新規BMP-8 DNA配列を含む。更に
また、これらのベクターは、蛋白質配列を発現させる適
当な発現制御配列を含む。他方、上記切断又は修飾配列
が組み込まれたベクターはまた、この発明の具体例であ
り、本発明の蛋白質の製造に有用である。これらのベク
ターはセルラインの形質転換方法で使用され得、選択さ
れた宿主細胞におけるその複製および発現を指向し得る
本発明のDNAコード配列と機能的に組み合わせて選択さ
れた調節配列を含み得る。これらのベクターに有用な調
節配列は当業界の熟練者には周知であり、選択された宿
主細胞に応じて選択され得る。この選択は常套的であ
り、本発明の一部を形成するものではない。ベクターの
成分、例えばレプリコン、選択遺伝子、エンハンサー、
プロモーターなどは、天然源から得られるかまたは既知
の方法により合成される。カウフマンら、「ジャーナル
・オブ・モレキュラー・バイオロジー」、159：511〜52
1(1982)、およびカウフマン、「プロシーディングズ・
オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシ
ーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメ
リカ」、82：689〜693（1985）参照。このようなベクタ
ーにより形質転換された宿主細胞および軟骨／骨蛋白質
の生産に用いるその子孫もまた本発明により提供され
る。

【００３１】骨および／又は軟骨が正常には形成されな
い様な環境において軟骨および／又は骨形成を誘導する
本発明の蛋白質は、ひとおよび他の動物における骨折お
よび軟骨欠損の治癒に適用性を有する。本発明の蛋白質
の一種を用いる製剤は閉鎖および複雑骨折の縮小ならび
に人口関節の固定改善における予防的用途を有し得る。
骨原性薬剤により新たに誘導される骨形成は、先天的、
外傷性又は腫瘍切除による頭顔欠損の修復に貢献し、美
容形成外科においても有用である。本発明の蛋白質は、
歯周病の処置および他の歯修復プロセスにおいて用いる
ことが出来る。これらの薬剤は、骨形成細胞を誘引し、
骨形成細胞の成長を刺激し、又は骨形成細胞の原始細胞
の分化を誘導する。数種の骨形成性、軟骨誘導性および
骨誘導性因子が既に報告されている。ヨーロッパ特許出
願第148155号および第169016号参照。

【００３２】本発明の蛋白質は、傷の治療および関連す
る組織の修復に用いることが出来る。傷の種類として
は、火傷、切り傷および潰瘍が挙げられるが、これに限
定されるわけではない（例えば、傷の治療および関連す
る組織修復の考察に関してはPCT特許公開WO84／01106号
参照）。

【００３３】本発明の更に別の態様は骨折および骨およ
び／又は軟骨欠損に関連した他の症状又は歯周病の治療
のための治療法および組成物を包含する。更に、本発明
は、傷の治療および組織修復のための治療法および組成
物を含む。このような組成物は、医薬上許容される賦形
剤、担体またはマトリックスとの混合物中、治療上有効
量の少なくとも一種の本発明の蛋白質を含む。本発明の
蛋白質は、他の１種以上の関連する蛋白質および成長因
子と共同して、あるいはおそらくは相乗的に作用すると
考えられる。本発明の治療法および組成物はしたがっ
て、１種以上の本発明の蛋白質を含む。更に、本発明の
治療法および組成物はしたがって、治療的量の少なくと
も１種の本発明の蛋白質を、前記同時係属中のアメリカ
合衆国特許出願に開示されている治療的量の少なくとも
１種の他の「BMP」蛋白質とともに含む。このような本
発明の方法および組成物は、本発明の蛋白質又はその一
部を前述の「BMP」蛋白質又はその一部と共に含む。こ
のような組み合わせは各蛋白質又は各蛋白質の一部によ
り形成されるヘテロ分子由来の個々の分子を含んでもよ
い。本発明の方法および組成物はしたがって、本発明の
蛋白質又は前記の異なる「BMP」蛋白質の一部と結合し
た部分を含み、ヘテロ分子を形成する。例えば、BMP-８
サブユニットはBMP-2、BMP-３、BMP-４、BMP-５、BMP-
６、BMP-７又は他のBMP蛋白質のサブユニットと結合し
ていてもよい。このような結合は、ジスルフィド結合を
含む。

【００３４】更に、本発明の治療法および組成物は、本
発明の蛋白質又はその一部を骨および／又は軟骨欠損、
傷又は問題となる組織の治療に有用な他の薬剤と組み合
わせて含む。これらの薬剤は、様々な成長因子、例え
ば、表皮成長因子（EGF ）、線維芽細胞成長因子(FG
F)、血小板由来成長因子(PDGF)、形質転換成長因子(TGF
-aおよびTGF-b)、およびインシュリン様成長因子(IGF)
などの成長因子を含む。これらの薬剤の一部もまた本発
明の組成物に用いてもよい。

【００３５】pH、等張性、安定性などに関して必要な注
意を払ったこのような生理学的に許容しうる蛋白組成物
の製造および製剤は当業界で知られている。また、この
治療組成物は軟骨および骨成長因子蛋白質における明ら
かな種特異性がないことのために現在獣医学的用途に関
して有用である。ひとのほか、家畜およびサラブレッド
の馬は本発明の蛋白質を用いたこのような治療の望まし
い患者である。

【００３６】この治療方法は、インプラント又は装置と
して、組成物を局所的、全身的または局部的に投与する
ことを含む。投与される場合、もちろんこの発明で使用
される治療組成物は、発熱物質を含まない、生理学的に
許容しうる形態を呈する。更にこの組成物は、望ましく
は軟骨および／または骨または組織損傷部位への送達に
適した粘稠性形態で封入又は注射され得る。局所投与は
傷の治癒および組織修復に有用であり得る。好ましく
は、骨および／又は軟骨形成のために、この組成物は、
本発明の軟骨および／又は骨蛋白質を骨および／又は軟
骨損傷部位に送達し、成長する骨および軟骨構造を提供
し、最適状態で体内に再吸収され得るマトリックスを含
む。このようなマトリックスは、他の移植医学適応例で
現在使用されている材料により形成され得る。

【００３７】マトリックス材料の選択は、生理学的適合
性、生物分解性、機械特性、美容的外観および界面特性
にもとづいて行われる。特定の本発明の組成物の適用性
は適当な製剤を限定する。組成物に適用され得るマトリ
ックスは、生物分解性で化学的に定義されるもの、例え
ば、硫酸カルシウム、燐酸トリカルシウム、ヒドロキシ
アパタイト、ポリ乳酸およびポリ無水物である。他の有
効なマトリックスは、生物分解性で生物学的に明確に定
義されるもの、例えば骨もしくは皮膚コラーゲンであ
る。他のマトリックスは純粋な蛋白質又は細胞外マトリ
ックス成分を含む。他の有効なマトリックスは、非生物
分解性で化学的に定義されるもの、例えば、焼結ヒドロ
キシアパタイト、生体ガラス、アルミン酸塩、又は他の
セラミックである。マトリックスは、前述のタイプの材
料の組み合わせ、例えばポリ乳酸およびヒドロキシアパ
タイト又はコラーゲンおよび燐酸トリカルシウムであり
得る。生体セラミックもまた組成物、たとえばカルシウ
ム−アルミン酸塩-燐酸塩において改変され得、例え
ば、孔サイズ、粒子サイズ、粒子形状および生物分解性
の改変が行われ得る。

【００３８】投与量については、本発明の蛋白質の作用
を修飾する様々な要因を考慮して担当医が決定する。本
発明の蛋白質の作用を修飾する要因としては、形成され
るべき骨の重量、骨の損傷部位、損傷した骨の状態、傷
の大きさ、損傷組織の種類、患者の年令、性別および治
療食、感染の重症度、投与時間および他の臨床要因が挙
げられる。用量は、再構成および組成物中に存在する骨
および／軟骨蛋白質のタイプにより変動し得る。最終組
成物への他の既知成長因子、例えばEGF、PDGF、TGF-a、
TGF-bおよびIGF-Iの添加もまた用量に影響を与え得る。

【００３９】経過は軟骨および／又は骨成長および／又
は修復の定期的評価によりモニターすることが出来る。
経過は、例えばX線、組織形態計測およびテトラサイク
リンラベリングを用いてモニターすることが出来る。以
下、実施例により、本発明のうし軟骨および／又は骨蛋
白質の回収および特性検定、これらの蛋白質の使用によ
る対応するひと蛋白質の回収および組み換え技術による
蛋白質の発現における本発明の実施態様を説明する。

【００４０】実施例１ うし軟骨／骨誘導蛋白質の単離 ウリストら、「プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショ
ナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・
ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ」、70：3511
（1973）の方法に従い、破砕したうしの骨粉（20〜120
メッシュ、コーラ・テック）を製造する（但し、下記の
とおりいくつかの抽出工程を除く）。10kgの粉末を、4
℃で48時間激しい撹拌下、0.6NのHClを連続交換しなが
ら脱塩する。得られた懸濁液を26リットルの0.5M EDTA
中に4時間かけて抽出する。残さを蒸留水で2回洗浄した
後、「クリニカル・オーソペディックス・アンド・リレ
ーテッド・レサーチ」、171：213（1982）の記載に従
い、１０リットルの４Ｍグアニジン塩酸塩[GuCl]、1mＭ
N-エチルマレイミド、1mM ヨード酢酸、1mM フェニル
メチルスルホニルフルオリド中に再懸濁する。16〜20時
間後、上清を除去し、別の6リットルのGuCl緩衝液と置
き換える。6リットルのGuCl緩衝液での最終抽出を16時
間行う。

【００４１】粗GuCl抽出物を合し、0.45mMデュッラポア
タンジェンシャルフローフィルターパケットでペリコン
装置を通してろ過し、10000分子量遮断膜を備えたアミ
コンRA2000装置上で約50倍に濃縮し、次いで、20mM ト
リス、0.05M NaCl、6M尿素（pH7.1）、第一カラム用出
発緩衝液中で透析する。十分透析後、蛋白質を2リット
ルDEAEセルロースカラムに仕込み、非結合フラクション
を集める。

【００４２】非結合フラクションを濃縮し、6Ｍ尿素中5
0mM NaAc、50mM NaCl(pH 4.6)に対して透析する。非結
合フラクションをカルボキシメチルセルロースカラムに
適用する。カラムに結合していない蛋白質を出発緩衝液
で十分洗浄することにより除去し、ローゼン修飾サンパ
ス・レディ検定（以下の実施例３に記載）で測定される
骨および／又は軟骨形成活性を有する蛋白質を含有する
材料を50mM NaAc、0.25mM NaCl、6M 尿素(pH 4.6)によ
りカラムから脱着させる。この段階溶離から得られた蛋
白質を20〜40倍に濃縮し、次いで80mM KPO_４、6M 尿素
(pH 6.0)に対して十分透析する。80mM KPO_４、6M 尿素
(pH 6.0)中で平衡状態にしたヒドロキシアパタイトカラ
ム(IBF)に試料を適用し、同緩衝液でカラムを洗浄する
ことにより、未結合蛋白質をすべて除去する。骨および
／又は軟骨形成活性を有する蛋白質を100mM KPO_４(pH
7.4)および6M 尿素により溶離させる。

【００４３】この蛋白質を0.1875M NaCl、6M尿素溶液で
5倍に希釈し、最終濃度を20mM KPO _４、150mM NaCl 、6M
尿素とする。この材料を、20mM KPO_４、150mM NaCl 、
6M尿素中で平衡状態にしたヘパリン-セファロースカラ
ムに適用する。出発緩衝液でカラムを十分洗浄後、骨お
よび／軟骨誘導活性を有する蛋白質を20mM KPO_４、700m
M NaCl 、6M 尿素(pH 7.4)により溶離させる。このフラ
クションを10〜20倍に濃縮し、50mM NaAc、6M尿素(pH
4.6)に対して透析し、ファルマシア・モノSHRカラムに
適用する。カラムを1.0M NaCl、50mM NaAc、6M 尿素(pH
4.6)への勾配により展開する。吸光度280mMのフラクシ
ョンをすべてプールする。このモノＳステップは現在か
ならずしも必要でないと考えられており、将来省略でき
るであろう。この材料を0.1％TFA中4.7ｘ30cmウォータ
ーズ・プレパック500Ｃ４カートリッジに適用し、カラ
ムを95％アセトニトリル、0.1％TFAへの勾配により1分
あたり45mlで100分間展開する。フラクションを軟骨お
よび／又は骨形成活性に関して検定する。

【００４４】マッコナヘイら、「インターナショナル・
アーカイブス・オブ・アラージー」、29：185〜189（19
66）、ボルトンら、「バイオケミカル・ジャーナル」、
133：529（1973）およびボーウェン-ポープ、「ジャー
ナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー」、237：5
161（1982）の中の一法により、適当なフラクションの
アリコートをヨウ素化する。これらのフラクション中に
存在するヨウ素化蛋白質をSDSゲル電気泳動により分析
する。

【００４５】実施例２ うし軟骨／骨誘導因子の特性検定 A.分子量 実施例1により得られた0.1％ＴＦＡおよび約45％アセト
ニトリル中フラクションを含有する活性BMP由来の約2.5
mgの蛋白質をサバント・スピード・ヴァック濃縮器で乾
燥し、レムリ試料緩衝液で可溶化し、12.5％ポリアクリ
ルアミドゲルに適用し、SDS-PAGE[レムリ、ネイチャ
ー、227：680〜685(1970)]に付す（試料をジチオスレイ
トールで還元しない）。分子量をヨウ素化バイオ-ラド
分子量標準と比べて測定する。固定されていないゲルの
オートラジオグラフィーの後、約28000〜38000ダルトン
のバンドを切除し、蛋白質を電気泳動でゲルから溶離す
る[ハンカピラーら、メソッズ・イン・エンザイモロジ
ー、91：227〜236（1983）]。前記同時係属中の「BMP」
出願中に記載されている同様の精製骨フラクションにお
いては骨および／又は軟骨活性は約28000〜38000領域に
おいて見られるが、これにもとづいて、このバンドは骨
および／又は軟骨誘導フラクションを含むと推定され
る。

【００４６】B.サブユニット特性検定 単離されたうし骨蛋白質のサブユニット組成物も測定す
る。前記の溶離蛋白質を完全に還元し、ヨードアセテー
トおよび標準的方法を用いて2％SDS中でアルキル化す
る。完全に還元し、アルキル化された試料を次いで更に
12.5％ゲル上SDS-PAGEに適用し、得られたダブレット／
トリプレットを呈する約14000〜20000ダルトンの領域は
未固定ゲルのオートラジオグラフィーにより検出され
る。試料の銀染色法[メリルら、サイエンス、211：1437
（1981）]を分子量標識と共に第１図に示す。14000〜20
000ダルトン領域は括弧で示す。したがって、約28000〜
30000ダルトン蛋白質は14000〜20000の広い領域をもた
らす。

【００４７】実施例３ ローゼン修飾サンパス-レディ検定 サンパスおよびレディ、「プロシーディングズ・オブ・
ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・
オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリ
カ」、80：6591〜6595（1983）に記載されたラット骨形
成検定の変法を用いて、本発明の蛋白質の骨および／又
は軟骨活性を評価する。この修飾検定を、本明細書にお
いては、ローゼン修飾サンパス-レディ検定と称する。
サンパス-レディ法のエタノール沈殿工程の代わりに検
定フラクションの水に対する透析（組成物が溶液の場
合）またはダイアフィルタリング（溶液が懸濁液の場
合）を行う。溶液又は懸濁液を0.1％TFA中に再溶解し、
得られた溶液を20mgのラット・マトリックスに加える。
蛋白質で処理していないモック・ラット・マトリックス
試料を対照とする。この材料を冷凍し、凍結乾燥し、生
成した粉末を＃５ゼラチンカプセルに封入する。カプセ
ルを21〜49日令の雄ロング・エバンス・ラットの腹部胸
領域に皮下内植する。7〜14日後インプラントを除去す
る。各インプラントの半分を用いてアルカリ性ホスファ
ターゼ分析をする。[レディら、プロシーディンブズ・
オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシ
ーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメ
リカ」、69：1601（1972）参照]。

【００４８】各インプラントの残り半分を固定し、組織
分析を行う。グリコメタクリレート部分（1μm）をボン
・コッサおよび酸性フーシン(fuschin)又はトルイジン
ブルーで染色することにより、各インプラント中存在す
る誘導された骨および軟骨形成の量を採点する。＋1〜
＋5は新しい骨および／又は軟骨細胞および新たに形成
された骨およびマトリックスに占められたインプラント
の各組織片の領域を示す。＋5点は、インプラントの50
％以上がインプラント中の蛋白質の直接の結果として生
成する新しい骨および／又は軟骨であることを示す。＋
4点、＋3点、＋2点および＋1点はそれぞれインプラント
の40％、30％、20％、10％以上が新しい軟骨および／又
は骨を含有することを示す。

【００４９】マトリックス試料の試料を含有する軟骨お
よび／又は骨誘導性蛋白質の用量応答性は、形成された
骨および／又は軟骨の量が試料中の軟骨／骨誘導蛋白質
の量と共に増加することを示す。対照試料はいかなる骨
および／又は軟骨形成も示さない。

【００５０】他の軟骨および／又は骨誘導蛋白質、例え
ば前記「BMP」蛋白質に関しては、形成された骨および
／又は軟骨はマトリックスによりふさがれた空間に物理
的に閉じ込められる。試料をSDSゲル電気泳動および等
電点電気泳動で分析し、次いでオートラジオグラフィー
を行う。活性は蛋白質バンドおよびpIと相関関係を示
す。1OD／mg-cmの消衰係数を蛋白質に関する推定値とし
て使用し、特定フラクション中の蛋白質の純度を評価
し、蛋白質をSDS PAGEにかけ、続いて銀染色法またはラ
ジオヨードネーションおよびオートラジオグラフィーに
かける。

【００５１】実施例４ うし蛋白質組成物 実施例２Ｂに記載された約14000〜20000ダルトン領域の
ゲルスライスを切除し、蛋白質を電気泳動でゲルから溶
離する（ハンカピラーら、前掲）。この単離された蛋白
質試料を次いで5容積の90％n-プロパノールで希釈後30
Ｘ2.1MMブラウンリーRP-18に結合させることによりSDS
から除く[シンプソンら、ヨーロピアン・ジャーナル・
オブ・バイオケミストリー、165：21〜29（1987）]。40
％n-プロパノール、0.1％TFAの段階を用いて溶離するこ
とにより蛋白質を回収する。溶離された蛋白質ピークを
含有するフラクションをプールし、サバント・バック濃
縮器中で乾固寸前にする。蛋白質を次いで0.1M炭酸水素
アンモニウムで再溶解し、1μgTPCK処理トリプシン（ワ
ーシントン）で16時間37℃にて消化する。別の1μg用量
のトリプシンを添加し、消化を更に4時間続ける。得ら
れた消化物を次にC4Vydac RPHPLCカラムおよび0.1％TFA
-水、0.1％TFA水-アセトニトリル勾配を用いてRPHPLCに
付す。得られたペプチドピークを214および280nmでのUV
吸光度によりモニターし、アプライド・バイオシステム
気相配列分析装置（470A型）を用いて直接アミノ末端ア
ミノ酸配列分析に付す。アミノ酸の標準的な３文字で表
示した（括弧内のアミノ酸は配列中で不明確であること
を示す）以下のアミノ酸配列を有する３種のトリプシン
消化性フラグメントを標準的方法により単離する。

【表１６】

【００５２】４種のアミノ酸配列はPCT公開出願WO88／0
0205号およびWO89／10409号において開示されているBMP
-2、BMP-3およびBMP-4、およびUSSN第437409号、第4900
33号、および第438919号（それぞれ、1989年11月15日、
1989年11月15日、1989年11月17日出願）中に開示されて
いるBMP-5、BMP-6およびBMP-7等の他のBMP蛋白質と相同
性を示す。特に、前記アミノ酸配列

【表１７】 は以下の人相同性配列を含有するBMP-2、BMP-3、BMP-
4、BMP-5、BMP-6およびBMP-7と相同性を示す。

【表１８】 第二のアミノ酸配列

【表１９】 はこれらのBMP分子の以下のひと配列と相同性を示す。

【表２０】 第三のアミノ酸配列

【表２１】 はこれらのＢＭＰ分子

【表２２】 と相同性を示す。

【００５３】第四のアミノ酸配列は、PCT公開出願WO88/
00205号およびWO89/10409号において開示されているBMP
-3と相同性（即ち、Asn-Glu-Leu-Pro-）を示す。本発明
のBMP-8蛋白質はこれらのBMP蛋白質BMP-2〜BMP-7と構造
的に類似している。成熟BMP-8蛋白質はポリペプチドサ
ブユニットと結合したジスルフィドのダイマーを含む。

【００５４】実施例５ DNAの単離 BMP-8蛋白質をコードするDNA配列は当業界において周知
の様々な技術を用いて単離することができる。以下に記
載するように、オリゴヌクレオチドプローブを前項で同
定したトリプシンフラグメントのアミノ酸配列にもとづ
いて設計し、自動DNAシンセサイザーで合成する。プロ
ーブは、レイズ、「ジャーナル・オブ・モレキュラー・
バイオロジー」、183（１）：1〜12（1985）の方法にし
たがってトリプシン配列から設計されたオリゴヌクレオ
チドのプール又は特有のオリゴヌクレオチドからなる。

【００５５】３種の前記アミノ酸配列のBMP-2からBMP-7
との同義性にもとづいて、本発明のBMP-8蛋白質はアミ
ノ酸配列（３）およびアミノ酸配列（２）が以下のよう
に互いににすぐ隣に位置する構造を有し得る。

【表２３】

【００５６】以下の４種のオリゴヌクレオチドは前項で
同定されたトリプシンフラグメント[BMP-8アミノ酸配列
（２）Leu-(Ser)-Ala-Thr-Ser-Val-Leu-Tyr-Tyr-Asp-Se
r-Ser-Asn-Asn-Val-Ile-Leu-Arg]にもとづいて設計さ
れ、自動DNAシンセサイザーで合成される。

【表２４】

【００５７】オリゴヌクレオチド＃１〜＃４のはじめの
９種のヌクレオチド（下線部）は特異的に増幅された、
BMP-8蛋白質をコードし、前記アミノ酸配列（２）由来
でないDNA配列の操作を促進するために、制限エンドヌ
クレアーゼXbaIの認識配列を含有する。

【００５８】以下のオリゴヌクレオチドは他のすでに同
定したトリプシンフラグメント[BPM-8アミノ酸配列
（３）Ala-Cys-Cys-Ala-Pro-Thr-Lys]のアミノ酸配列に
もとづいて設計され、自動DNAシンセサイザーで合成さ
れる。

【表２５】

【００５９】オリゴヌクレオチド＃５のはじめの８種の
ヌクレオチド（下線部）は制限エンドヌクレアーゼBamH
Iの認識配列を含有し、前記の理由のために、アミノ酸
配列（３）由来でない。すでに同定した標準的ヌクレオ
チドのシンボルは以下のとおりである：A:アデノシン、
C：シトシン、G：グアニン、T：チミン、N：アデノシン
又はシトシン又はグアニン又はチミン、R：アデノシン
またはグアニン、Y：シトシン又はチミン、およびH：ア
デノシンまたはシトシンまたはチミン。

【００６０】すでに同定したオリゴヌクレオチド＃４お
よび＃５は、プライマーとして用いられ、うしゲノムDN
A由来の特定のヌクレオチド配列を増幅させる。増幅反
応は以下のようにして行う。

【００６１】うしゲノムDNA（源：うしの肝臓）を100℃
にて5分間変性させ、次いで氷上で冷却し、それぞれ200
μMのトリ燐酸デオキシヌクレオチド（dATP、dGTP、dCT
PおよびdTTP）、10mMトリス-HCl pH8.3、50mM KCl、1.5
mM MgCl_２、0.001％ゼラチン、1.25単位Taq DNAポリメ
ラーゼ、100pM オリゴヌクレオチド＃４および100pMオ
リゴヌクレオチド＃5を含有する反応混合物に添加す
る。この反応混合物を94℃にて2分間培養し、以下の方
法で熱的サイクルに付す 。94℃にて1分、40℃にて1
分、72℃にて1分を3サイクル、次いで94℃にて1分、55
℃にて1分、72℃にて1分を37サイクル、続いて72℃にて
7分。

【００６２】この反応で特異的に増幅されたDNAをエタ
ノールで沈殿させ、制限エンドヌクレアーゼXbaIおよび
BamHIで消化し、アガロースゲル電気泳動にかける。ゲ
ルの領域を切断し、DNAを電気的に溶離し、80塩基対の
生成物をプラスミドベクターpGEM3中ポリリンカーのXba
IおよびBamHI位間にサブクローン化する。得られたサブ
クローンのDNA配列分析により、特異的に増幅されたDNA
配列生成物がトリプシンフラグメント(2)および（３）
においてのべたアミノ酸配列をコードすることがわか
る。

【００６３】DNA配列（配列表５)及びこの特異的に増幅
されたDNAフラグメントの誘導されたアミノ酸配列（配
列表６)は以下のとおりである。

【表２６】

【００６４】この配列のヌクレオチド１〜２４は、オリ
ゴヌクレオチド＃５の一部を含み、ヌクレオチド58〜80
は、特異的増幅反応を行うために用いられるオリゴヌク
レオチド＃４のリバースコンプリメントの一部を含む。
増幅反応を開始する際のオリゴヌクレオチド＃４および
＃５の機能のために、これらは正確に、BMP-8蛋白質を
コードする実際の配列に対応せず、したがって、前記ア
ミノ酸誘導体中に翻訳されない。

【００６５】以下のオリゴヌクレオチドプローブは前記
うしDNA配列にもとづいて設計され、自動DNA シンセサ
イザーで合成される。

【表２７】

【００６６】このオリゴヌクレオチドプローブを^３２Ｐ
で放射性標識を行い、ベクターλ EMBL3中に構築された
うしゲノムライグラリーをスクリーニングするために用
いる。400000のうしゲノム組換え体ライブライリーを50
のプレート上、1プレート当たり組換え体8000個の割合
で培養する。これらの培地から組換えバクテリオファー
ジプラークの重複ニトロセルロースレプリカを作成し、
増幅する。オリゴヌクレオチドプローブ＃６をハイブリ
ダイゼーションしてニトロセルロースレプリカを65℃に
てSHB（標準的ハイブリダイゼーション緩衝液）中に増
幅し、65℃にて1ｘSSC、0.1% SDSで洗浄する。11の陽性
ハイブリダイゼーション組換え体を得、プラーク精製す
る。バクテリオファージプレートストックを作成し、バ
クテリオファージDNAを11のプラーク精製組換え体の各
々から単離する。λ 9800-10で示される組み換え体の１
種のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を
0.4kb PstIフラグメントに対して局在化する。このフラ
グメントをプラスミドベクター（pGEM-3）中にサブクロ
ーン化し、DNA配列分析を行う。クローンλ9800-10のこ
の領域の部分的DNA配列（配列表７)および誘導されたア
ミノ酸配列（配列表８)を第１表に示す。バクテリオフ
ァージλ 9800-10を1991年5月15日に受託番号12301とし
てアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
（「ATCC」）（メリーランド、ロックビル、パークロー
ン・ドライブ12301）に寄託した。この寄託物は、特許
手続きを目的とする微生物の寄託の国際的承認に関する
ブダペスト条約およびその下での規則の必要条件を満た
している。 第１表

【表２８】

【００６７】ヌクレオチド95は「T」であるので、前記D
NAフラグメント中で対応するヌクレオチドは「C」であ
る。このλ 9800-10クローンは本発明のうしBMP-8蛋白
質少なくとも一部をコードする。このクローン由来のBM
P-8ペプチド配列は49アミノ酸長で、ヌクレオチド30か
らヌクレオチド176のDNA配列によりコードされる。牛骨
28〜30kD材料から単離されたトリプシンフラグメント
（２）および（３）に対応するアミノ酸配列は第１表の
下線部分である。インフレーム停止コドン(TGA)[ヌクレ
オチド177〜179]は、このクローンが、本発明のうしBMP
-8蛋白質のカルボキシ末端部分をコードすることを示
す。このヌクレオチド1〜29はコンセンサススプライス
部位（ジヌクレオチドAGの前のピリミジン濃厚域）の存
在およびコードされたアミノ酸の他のBMP蛋白質との相
同性の欠如に基づきイントロン配列であると考えられ
る。

【００６８】以下の２種のオリゴヌクレオチドは前記ト
リプシンフラグメントのアミノ酸配列

【表２９】 （配列表１）にもとづいて設計される。

【表３０】

【００６９】これらのオリゴヌクレオチドは42℃にてSH
B中クローンλ 9800-10とハイブリダイゼーションさ
れ、42℃で5ｘSSC、0.1％SDSで洗浄する。前記オリゴ＃
7および＃8の両方のハイブリダイゼーション領域を含有
するクローンλ 9800-10の制限フラグメントをプラスミ
ドベクター（pGEM-3)中にサブクローン化し、DNA配列分
析を行う。クローンl 9800-10のこの領域の部分的DNA
配列(配列表９)および誘導されたアミノ酸配列(配列表
１０)を第２表示す。 第２表

【表３１】

【００７０】クローンλ 9800-10のこの領域は、本発明
のうしBMP-8蛋白質の他の部分をコードする。このクロ
ーンから得られるBMP-8ペプチド配列は37アミノ酸長で
あり、DNA配列のヌクレオチド51からヌクレオチド161に
よりコードされる。牛骨28〜30kD材料から単離されるト
リプシンフラグメント（１）(配列表１） の対応するア
ミノ酸配列の一部は第２表の下線部である。ヌクレオチ
ド1〜50はコンセンサススプライス部位の存在および誘
導されたアミノ酸のトリプシンフラグメント（１）の残
りとの相同性の欠如に基づきイントロン配列であると考
えられる。同様に、ヌクレオチド配列162〜172もまたイ
ントロン配列であると考えられる。

【００７１】クローンλ 9800-10の別のPstI制限フラグ
メントをサブクローン化し、前記と同様の方法で配列決
定する。部分的DNA配列(配列表１１)およびクローンλ
9800-10のこの領域の誘導されたアミノ酸配列(配列表１
２)を第３表に示す。 第３表

【表３２】 クローンλ 9800-10のこの領域は、本発明のBMP-8蛋白
質の他の部分をコードする。このクローンのBMP-8ペプ
チド配列は26アミノ酸長であり、ヌクレオチド20からヌ
クレオチド99の配列によりコードされる。牛骨28〜30kD
材料から単離されるトリプシンフラグメント（１）に対
応するアミノ酸配列の残りの部分は第３表の下線部分で
ある。この配列は、牛骨28〜30kD材料から単離されるト
リプシンフラグメント（４）の一部

【表３３】 を含むペプチド配列をコードすることも重要である。こ
のトリプシンペプチドに対応するアミノ酸配列も第３表
の下線部分である。ヌクレオチド配列1〜19および100〜
120もすでに記載したような理由に基づきイントロン配
列であると考えられる。

【００７２】第１、２および３表においてすでに記載し
た誘導されたアミノ酸配列に基づき、本発明のうしBMP-
8蛋白質は第４表のアミノ酸配列(配列表１３)を含有す
る。 第４表

【表３４】

【００７３】この配列は他のBMP蛋白質と相同性である
ことがわかる。例えば、カルボキシ末端システイン濃厚
域（第４表のアミノ酸＃11〜＃112）は以下のアミノ酸
同一性を示す：BMP-2: 55%、BMP-3: 41%、BMP-4: 55%、
BMP-5: 74%、BMP-6: 75%、BMP-7: 75％

【００７４】実施例６ ひとBMP-8 第１表において記載した配列を含む0.4kb PstI うしゲ
ノムBMP-8フラグメントを ^３２Pで放射線標識を行い、ベ
クターλ FIX中に構築されたひとゲノムライブラリー
[ストレートジーン・クローニング・システム（カタロ
グ＃944201）]をスクリーニングするためのプローブと
して用いる。このひとゲノムライブラリーの1000000の
組換え体を、1プレート当たりバクテリオファージ20000
個の割合で培養する。組換え体バクテリオファージプラ
ークの重複ニトロセルロースレプリカを作成し、65℃に
てSHB中うしゲノムプローブとハイブリダイゼーション
し、65℃にて0.2ｘSSC、0.1% SDSで洗浄する。25陽性を
得、再培養する。以下のオリゴヌクレオチドプローブを
第２表において記載したDNA配列のヌクレオチド57から
ヌクレオチド86にもとづいて設計し、自動DNAシンセサ
イザーで合成する。

【表３５】

【００７５】以下のオリゴヌクレオチドプローブを第３
表において記載したDNA配列のヌクレオチド20からヌク
レオチド43にもとづいて設計し、自動DNAシンセサイザ
ーで合成する。

【表３６】

【００７６】二次フィルターの１セットをSHB中65℃に
てプローブ＃９とハイブリダイゼーションし、65℃にて
1ｘSSC、0.1％SDSで洗浄し、二次フィルターの別のセッ
トをSHB中50℃にてプローブ＃10とハイブリダイゼーシ
ョンし、50℃にて5ｘSSC、0.1％SDSで洗浄する。２種の
クローンは両方のオリゴヌクレオチドプローブとハイブ
リダイゼーションすることがわかる。オリゴヌクレオチ
ド＃9および＃10のこれらの２種のひとゲノムクローン
との陽性ハイブリダイゼーションにより、これらは本発
明のBMP-8蛋白質のひと同等体をコードするヌクレオチ
ド配列の少なくとも一部を含有することがわかる。これ
らのクローンの１種は、λ H8 12-1と称し、1991年5月1
5日受託番号＃75010として「ATCC」に寄託された。この
寄託物は、特許手続きを目的とする微生物の寄託の国際
的承認に関するブダペスト条約およびその下での規則の
必要条件を満たしている。

【００７７】ひと軟骨および／又は骨誘導因子分子の一
部をコードするDNAを含有する組換え体バクテリオファ
ージを得、ひとコード配列を骨誘導因子を合成するひと
セルラインまたは組織を同定するプローブとして用いる
ことができる。あるいは、うしコード配列は、このよう
なひとセルライン又は組織を同定するためのプローブと
して用いられる。簡単にいうと、RNAを選択した細胞又
は組織源から抽出し、ホルムアルデヒドアガロースゲル
上で電気泳動し、ニトロセルロースに移入するか又はホ
ルムアルデヒドと反応させ、直接ニトロセルロース上に
スポットする。ニトロセルロースを次いでうしまたはひ
と軟骨および／又は骨誘導蛋白質のコード配列由来のプ
ローブとハイブリダイゼーションする。mRNAをオリゴ(d
T)セルロースクロマトグラフィーにより選択し、cDNAを
確立された技術により（ツールら、前出）ラムダgt10に
クローン化する。

【００７８】当業者に周知の別の方法を用いて、本発明
のひとおよび他の種の軟骨／骨蛋白質を単離することが
出来る。前記の方法を用いてうしまたはひと蛋白質をプ
ローブ源として用いることにより問題となる他の関連し
た蛋白質を単離してもよい。このような他の蛋白質はな
かでも骨折の修復、傷の治癒および組織修復に同様の有
用性がある。

【００７９】実施例７ 軟骨／骨蛋白質の発現 本発明のうし、ひとまたは他のほ乳類の蛋白質を製造す
るために、常用的遺伝子工学技術によりそれをコードす
る前記のように単離したDNAを適当な発現ベクターに移
入し、ほ乳類細胞または他の好ましい真核生物又は原核
生物宿主に導入する。トランスフェクションの方法とし
ては、エレクトロポーレーション、CaPO _４沈殿、プロト
プラストフュージョン、マイクロ注入およびリポフェク
ションがあげられる。宿主細胞を形質転換し、次いで安
定な形質転換体を標準的免疫学的生物学的または酵素検
定により生成物の発現に関してスクリーニングする。こ
のBMP-8ポリペプチドををコードするDNAおよびmRNAを、
サザンおよびノザンブロット法等の標準的方法により検
出し、高発現セルラインをクローン化するかまたは適当
な選択性のレベルで再クローン化して、より相同性の高
い細胞集団を得る。

【００８０】選択された形質転換宿主細胞を培養し、そ
れにより発現した本発明のBMP-8蛋白質を回収し、単離
し、精製する。標準的技術を用いて発現した蛋白質の特
性検定を行う。例えば、特性検定は、[35 S]メチオニ
ンまたはシステインでのパルス標識、ポリアクリルアミ
ド電気泳動による分析を包含する。組み換え発現された
BMP-8蛋白質は、同時に生産され、元々天然で結合して
いる蛋白質性材料を含まず、例えば細胞メディアに見ら
れる物質のような他の不純物も含まない。

【００８１】本発明の生物学的に活性な組換えひと蛋白
質の好ましい発現システムは、安定に形質転換されたほ
乳類細胞である。一時的な発現に関しては、選択される
セルラインはSV40形質転換アフリカグリーンモンキーの
腎臓COS-1で、これは典型的にはプラスミド中に1〜4日
間で中程度の量の蛋白質を生産する。更に、好ましいほ
乳類細胞はCHO細胞である。

【００８２】当業界の熟練者であれば、本発明のDNA配
列ならびに既知ベクター、例えばpCD「岡山ら、モレキ
ュラー・アンド・セルラー・バイオロジー」、2：161〜
170（1982）およびpJL3、pJL4「ゴフら、EMBO・ジャー
ナル」、4：645〜653（1985）を用いることによりほ乳
類発現ベクターの構築は可能である。これらのベクター
の適当な宿主細胞への形質転換により、本発明の蛋白質
が発現され得る。当業界の熟練者であれば、コード配列
の側面に位置するほ乳類調製配列を削除又はこれを細菌
性配列と置き換えることにより本発明の配列を操作し、
細菌細胞による細菌内又は細菌外発現用細菌性ベクター
を構築することが可能である。例えば、コード配列は更
に操作（例、他の既知リンカーまたは他の公知技術によ
るそこからの非コード配列の欠失もしくは存在するヌク
レオチドの改変による修飾）され得る。次いで修飾コー
ド配列は、例えば谷口ら、「プロシーディングズ・オブ
・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ
・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリ
カ」、77：5230〜5233（1980）に記載された方法を用い
て既知細菌性ベクターに挿入され得る。次いで、この実
例的細菌性ベクターにより細菌宿主細胞を形質転換し、
本発明の蛋白質を発現させ得る。細菌細胞における本発
明の軟骨および／骨蛋白質の細胞外発現の実施法につい
ては、例えばヨーロッパ特許出願EPA177343を参照。

【００８３】昆虫細胞で発現させる昆虫性ベクターの構
築についても同様の操作が実施され得る[例えば、公開
されたヨーロッパ特許出願155476記載の方法を参照]。
酵母ベクターもまた、酵母細胞による本発明の因子の細
胞内又は細胞外発現を目的とする酵母調節配列を用いて
構築されうる。[例えば、公開PCT出願WO86／00639およ
びヨーロッパ特許出願EPA123289参照]。

【００８４】ほ乳類細胞から高レベルの本発明蛋白質を
製造する方法は、本発明の蛋白質をコードする異種遺伝
子の多数のコピーを含む細胞の構築を含む。異種遺伝子
は、増幅可能なマーカー、例えばジヒドロ葉酸還元酵素
(DHFR)遺伝子（この場合、カウフマンおよびシャープ、
「ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー」、
159：601〜629(1982)の方法に従い、多量の遺伝子コピ
ーを含む細胞が、メトトレキセート（MTX)の高濃縮液に
おける伸長に関して選択され得る）に結合され得る。こ
の方法はいくつかの異なる細胞タイプにより使用され得
る。例えば、本発明の蛋白質に関するDNA配列を含むプ
ラスミドは、その発現を可能にする他のプラスミド配列
およびDHFR発現プラスミドpAdA26SV(A)3[カウフマンお
よびシャープ、「モレキュラー・アンド・セルラー・バ
イオロジー」、2：1304（1982）]と効果的に組み合わさ
れて、燐酸カルシウム共沈殿およびトランスフェクショ
ン、エレクトロポーレーションまたはプロトプラストフ
ュージョンによりDHFR-欠失CHO細胞、DUKX-BII中に共に
導入され得る。DHFR発現形質転換体を、透析うし胎児血
清を含むアルファ培地での成長に関して選択し、続いて
MTX高濃縮液（0.02、0.2、1.0および5μM MTXにおける
連続段階) での成長による増幅に関して選択する[カ
ウフマンら、「モレキュラー・アンド・セルラー・バイ
オロジー」、5：1750（1983）]。形質転換体をクローン
化し、本発明の蛋白質を培地から回収し、単離し、精製
する。前記実施例３に記載したローゼン-修飾サンパス-
レディ・ラット骨形成検定により生物学的活性蛋白質発
現をモニターする。蛋白質発現は、MTX耐性のレベルが
高くなると、増加すべきである。同様の方法は、他の関
連した蛋白質にも使用され得る。

【００８５】実施例８ 発現した軟骨／骨蛋白質の生物学的活性 上記実施例６で得られた発現したBMP-8蛋白質の生物学
的活性を測定するために、蛋白質をヘパリンセファロー
スカラムにおいて部分的に精製し、当業者に周知の標準
的精製技術を用いて更に精製する。例えば、培地から集
めたポストトランスフェクション調節培地上清を限外ろ
過により濃縮し、透析し、ヘパリンセファロースカラム
にかける。

【００８６】調製的NaDodSO_４/PAGE[レムリ、「ネイチ
ャー」、227：680〜685（1970）]により更に精製が行わ
れる。例えば、蛋白質をゲルに適用する。回収率は、前
記のようにしてヘパリン-セファロースで精製したL-[
^３５S]メチオニン標識BMP蛋白質を添加することにより
評価することが出来る。蛋白質は、隣接レーンの銅染色
により可視化される[リーら、「アナリティカル・バイ
オケミストリー」、166:308〜312(1987)]。適当なバン
ドを切断し、抽出する。

【００８７】得られた溶液の適量を20mgのラットマトリ
ックスと混合し、次いでインビボ骨および／又は軟骨形
成活性に関してローゼン修飾サンパス-レディ検定によ
り検定する。モックトランスフェクション上清分画を対
照として使用する。特定量の本発明のひと蛋白質が加え
られたラットマトリックスを含有するインプラントを7
日後にラットから除去し、組織評価を行う。各インプラ
ントからの代表的部分を新規骨無機質の存在に対してボ
ン・コッサおよび酸性フーシンにより染色し、軟骨特異
的マトリックス形成の存在に対してトルイジンブルーに
より染色する。その部分内に存在する細胞のタイプおよ
びこれらの細胞が表現型を示す程度を評価し、実施例３
に記載したように採点する。

【００８８】以上、本発明の好ましい実施態様について
詳細に記載した。その実施に際し、これらの記載事項を
考慮して多くの修正および変更が行われることは当業界
の熟練者であれば容易に想到し得るはずである。それら
の修正および変更も後記請求の範囲内に包含されるもの
と考えられる。

【００８９】

【配列表】（１）一般的情報 （i）出願人： ヒューイック、ロドニー・エムワン
グ、ジャック・エイチ （ii）発明の名称： 骨および軟骨誘導蛋白質 （iii）配列数： １３ （iv）通信のあて名 （Ａ）名宛先： ジェネティックス・インスティテュー
ト・インコーポレイテッド、リーガル・アフェアーズ （Ｂ）町名番地： ケンブリッジパーク・ドライブ ８
７番 （Ｃ）市名： ケンブリッジ （Ｄ）州名： マサチューセッツ （Ｅ）国名： アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号： ０２１４０ （ｖ）コンピューター読取り形式 （Ａ）媒体の型： フロッピー（登録商標）ディスク （Ｂ）コンピューター： ＩＢＭ ＰＣ コンパチブル （Ｃ）オペレイティング・システム： ＰＣ−ＤＯＳ/
ＭＳ−ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウェア： パテントイン・リリース ♯
１.０、バージョン ♯１.２５ （vi）現在の出願データ （Ａ）出願番号： ＵＳ （Ｂ）出願日： １９９１年５月１５日 （Ｃ）分類： （viii）委任／代理人情報 （Ａ）名前： カピノス、エレン・ジェイ （Ｂ）登録番号： ３２,２４５ （Ｃ）件名／事件簿： ＧＩ５１８２Ｘ−ＰＣＴ （ix）遠隔通信情報 （Ａ）電話： ６１７−８７６−１１７０ （Ｂ）ファクシミリ： ６１７−８７６−５８５１ （２）配列番号１に関する情報 （i）配列の特徴 （Ａ）長さ： ２３アミノ酸残基 （Ｂ）型： アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： １本鎖 （Ｄ）トポロジー： 未詳 （ii）配列の種類： ペプチド （iii）ハイポセティカル： 否 （iv）アンチセンス： 否 （vi）起源 （Ｆ）組織の種類： 骨 （xi）配列： 配列番号１

【表３７】 （２）配列番号２に関する情報 （i）配列の特徴 （Ａ）長さ： １８アミノ酸残基 （Ｂ）型： アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： １本鎖 （Ｄ）トポロジー： 未詳 （ii）配列の種類： ペプチド （iii）ハイポセティカル： 否 （iv）アンチセンス： 否 （ｖ）フラグメント型： 中間部 （vi）起源 （Ａ）生物名： ボス・タウルス （Ｆ）組織の種類： 骨 （xi）配列： 配列番号２

【表３８】 （２）配列番号３に関する情報 （i）配列の特徴 （Ａ）長さ： ７アミノ酸残基 （Ｂ）型： アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： １本鎖 （Ｄ）トポロジー： 未詳 （ii）配列の種類： ペプチド （iii）ハイポセティカル： 否 （iv）アンチセンス： 否 （vi）起源 （Ａ）生物名： ボス・タウルス （Ｆ）組織の種類： 骨 （xi）配列： 配列番号３

【表３９】 （２）配列番号４に関する情報 （i）配列の特徴 （Ａ）長さ： ２３アミノ酸残基 （Ｂ）型： アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： １本鎖 （Ｄ）トポロジー： 未詳 （ii）配列の種類： ペプチド （iii）ハイポセティカル： 否 （iv）アンチセンス： 否 （vi）起源 （Ａ）生物名： ボス・タウルス （Ｆ）組織の種類： 骨 （xi）配列： 配列番号４

【表４０】 （２）配列番号５に関する情報 （i）配列の特徴 （Ａ）長さ： ８０塩基対 （Ｂ）型： 核酸 （Ｃ）鎖の数： ２本鎖 （Ｄ）トポロジー： 直鎖状 （ii）配列の種類： ＤＮＡ（ゲノム） （iii）ハイポセティカル： 否 （iv）アンチセンス： 否 （vi）起源 （Ａ）生物名： ボス・タウルス （vii）直接の起源 （Ｂ）クローン名： ａｃｃ３０ （viii）ゲノム内での位置 （Ｃ）単位： 塩基対 （ix）配列の特徴 （Ａ）名称／特徴を表わす記号： ＣＤＳ （Ｂ）位置： ２５..５７ （xi）配列： 配列番号５

【表４１】 （２）配列番号６に関する情報 （i）配列の特徴 （Ａ）長さ： １１アミノ酸残基 （Ｂ）型： アミノ酸 （Ｄ）トポロジー： 直鎖状 （ii）配列の種類： プロテイン （xi）配列： 配列番号６

【表４２】 （２）配列番号７に関する情報 （i）配列の特徴 （Ａ）長さ： １９９塩基対 （Ｂ）型： 核酸 （Ｃ）鎖の数： ２本鎖 （Ｄ）トポロジー： 直鎖状 （ii）配列の種類： ＤＮＡ（ゲノム） （iii）ハイポセティカル： 否 （vi）起源 （Ａ）生物名： ボス・タウルス （vii）直接の起源 （Ａ）ライブラリー名： うしゲノム （Ｂ）クローン名： ラムダ ９８００−１０ （viii）ゲノム内での位置 （Ｃ）単位： 塩基対 （ix）配列の特徴 （Ａ）名称／特徴を表わす記号： エキソン （Ｂ）位置： ３０..１９９ （ix）配列の特徴 （Ａ）名称／特徴を表わす記号： イントロン （Ｂ）位置： １..２９ （ix）配列の特徴 （Ａ）名称／特徴を表わす記号： ＣＤＳ （Ｂ）位置： ３０..１７９ （xi）配列： 配列番号７

【表４３】 （２）配列番号８に関する情報 （i）配列の特徴 （Ａ）長さ： ４９アミノ酸残基 （Ｂ）型： アミノ酸 （Ｄ）トポロジー： 直鎖状 （ii）配列の種類： プロテイン （xi）配列： 配列番号８

【表４４】 （２）配列番号９に関する情報 （i）配列の特徴 （Ａ）長さ： １７２塩基対 （Ｂ）型： 核酸 （Ｃ）鎖の数： ２本鎖 （Ｄ）トポロジー： 直鎖状 （ii）配列の種類： ＤＮＡ（ゲノム） （iii）ハイポセティカル： 否 （vi）起源 （Ａ）生物名： ボス・タウルス （vii）直接の起源 （Ａ）ライブラリー名： うしゲノム （Ｂ）クローン名： ラムダ ９８００−１０ （viii）ゲノム内での位置 （Ｃ）単位： 塩基対 （ix）配列の特徴 （Ａ）名称／特徴を表わす記号： エキソン （Ｂ）位置： ５１..１６１ （ix）配列の特徴 （Ａ）名称／特徴を表わす記号： イントロン （Ｂ）位置： １..５０ （ix）配列の特徴 （Ａ）名称／特徴を表わす記号： イントロン （Ｂ）位置： １６２..１７２ （ix）配列の特徴 （Ａ）名称／特徴を表わす記号： ＣＤＳ （Ｂ）位置： ５１..１６１ （xi）配列： 配列番号９

【表４５】 （２）配列番号１０に関する情報 （i）配列の特徴 （Ａ）長さ： ３７アミノ酸残基 （Ｂ）型： アミノ酸 （Ｄ）トポロジー： 直鎖状 （ii）配列の種類： プロテイン （xi）配列： 配列番号１０

【表４６】 （２）配列番号１１に関する情報 （i）配列の特徴 （Ａ）長さ： １１９塩基対 （Ｂ）型： 核酸 （Ｃ）鎖の数： ２本鎖 （Ｄ）トポロジー： 直鎖状 （ii）配列の種類： ＤＮＡ（ゲノム） （iii）ハイポセティカル： 否 （vi）起源 （Ａ）生物名： ボス・タウルス （vii）直接の起源 （Ａ）ライブラリー名： うしゲノム （Ｂ）クローン名： ラムダ ９８００−１０ （viii）ゲノム内での位置 （Ｃ）単位： 塩基対 （ix）配列の特徴 （Ａ）名称／特徴を表わす記号： エキソン （Ｂ）位置： ２０..９９ （ix）配列の特徴 （Ａ）名称／特徴を表わす記号： イントロン （Ｂ）位置： １..１９ （ix）配列の特徴 （Ａ）名称／特徴を表わす記号： イントロン （Ｂ）位置： １００..１１９ （ix）配列の特徴 （Ａ）名称／特徴を表わす記号： ＣＤＳ （Ｂ）位置： ２２..９９ （xi）配列： 配列番号１１

【表４７】 （２）配列番号１２に関する情報 （i）配列の特徴 （Ａ）長さ： ２６アミノ酸残基 （Ｂ）型： アミノ酸 （Ｄ）トポロジー： 直鎖状 （ii）配列の種類： プロテイン （xi）配列： 配列番号１２

【表４８】 （２）配列番号１３に関する情報 （i）配列の特徴 （Ａ）長さ： １１２アミノ酸残基 （Ｂ）型： アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： １本鎖 （Ｄ）トポロジー： 直鎖状 （ii）配列の種類： ペプチド （iii）ハイポセティカル： 否 （vi）起源 （Ｆ）組織の種類： ボス・タウルス （xi）配列： 配列番号１３

【表４９】

【表５０】

【図面の簡単な説明】

【図１】 第１図は、ジチオスレイトールを用いた還元
後の骨誘導性フラクション（28000〜38000ダルトン、非
還元）のSDS-PAGE分析を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 5/10 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (72)発明者 ジャック・エイチ・ウォング アメリカ合衆国02173マサチューセッツ、 レキシントン、ローウェル・ストリート 522番

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記配列 【表１】 （配列番号７） 【表２】 （配列番号９）および 【表３】 （配列番号１１） の少なくとも１種を含む、ＢＭＰ−８蛋白質をコード化
   するＤＮＡ。
2. 【請求項２】 下記配列＃９と１０のオリゴヌクレオチ
   ドとハイブリダイズするＤＮＡであって、ＡＴＣＣ番号
   ７５０１０として寄託されているＤＮＡによりコード化
   されるアミノ酸配列を有する精製蛋白質： 【表４】 および 【表５】 。
3. 【請求項３】 下記配列＃９と１０のオリゴヌクレオチ
   ドとハイブリダイズするＤＮＡであって、ＢＭＰ−８を
   コード化する、ＡＴＣＣ番号７５０１０として寄託され
   ているＤＮＡ： 【表６】 および 【表７】 。
4. 【請求項４】 (a)その発現制御配列と機能可能に結合
   している請求項１記載のＤＮＡを有するベクターにより
   形質転換された細胞を培養し、 (b)軟骨および／または骨形成誘導能を特徴とする蛋白
   質を上記培養媒質から採取し、分離し、精製する段階に
   より製造される精製蛋白質。
5. 【請求項５】 (a)その発現制御配列と機能可能に結合
   しており、下記配列＃９と１０のオリゴヌクレオチドと
   ハイブリダイズするＤＮＡであって、ＢＭＰ−８をコー
   ド化するＡＴＣＣ番号７５０１０のＤＮＡを含むベクタ
   ーにより形質転換された細胞を培養し、 (b)軟骨および／または骨形成誘導能を特徴とするＢＭ
   Ｐ−８蛋白質を上記培養媒質から採取し、分離し、精製
   する段階により製造される精製蛋白質： 【表８】 および 【表９】 。
6. 【請求項６】 請求項１記載のＤＮＡで形質転換された
   宿主細胞。
7. 【請求項７】 請求項３記載のＤＮＡで形質転換された
   宿主細胞。
8. 【請求項８】 (a)その発現制御配列と機能可能に結合
   している請求項１記載のＤＮＡを有するベクターにより
   形質転換された細胞を培養し、 (b)軟骨および／または骨形成誘導能を特徴とする蛋白
   質を上記培養媒質から採取し、分離し、精製する段階を
   含む、ＢＭＰ−８蛋白質の製造法。
9. 【請求項９】 (a)その発現制御配列と機能可能に結合
   している請求項３記載のＤＮＡを有するベクターにより
   形質転換された細胞を培養し、 (b)軟骨および／または骨形成誘導能を特徴とする蛋白
   質を上記培養媒質から採取し、分離し、精製する段階を
   含む、精製ＢＭＰ−８蛋白質の製造法。