JP2000517165A

JP2000517165A - 新規な脂質キナーゼ

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Publication number: JP2000517165A
Application number: JP10500305A
Authority: JP
Inventors: バート・ヴァンハーゼブローク; マイケル・デレク・ウォーターフィールド
Original assignee: ルートヴィヒインスティテュートフォーキャンサー・リサーチ
Priority date: 1996-06-01
Filing date: 1997-05-30
Publication date: 2000-12-26
Anticipated expiration: 2017-05-30
Also published as: CA2256483C; HK1020751A1; EP0914448B1; US20050064572A1; GB9611460D0; DK0914448T3; US6482623B1; CN1220701A; CN1260360C; DE69736807D1; EP0914448A1; DE69736807T2; AU2970597A; US7422886B2; JP3902663B2; US6849420B2; WO1997046688A1; CA2256483A1; NZ332634A; ES2274543T3

Abstract

(57)【要約】本発明は、ＰＩ３キナーゼファミリーの一部である新規なリピドキナーゼに関する。ＰＩ３キナーゼはイノシトールに対する燐酸の付加によるイノシトールモノ、ジおよびトリ燐酸の生成を触媒する。イノシトール燐酸は、他の事象の中でも、細胞骨格の再モデリングと細胞運動性の調節をもたらしうる遺伝子発現の交代を発生させる細胞間シグナル伝達カスケードの調節に関係する。さらに具体的には、本発明は、ｐ８５と相互作用し、広範なホスホイノシチド特異性を有し、ＰＩ３キナーゼｐ１１０αと同一のキナーゼ阻害剤に感受性をもつ、新規なヒトＰＩ３キナーゼであるｐ１１０δに関するものである。しかしながら、遍在性発現パターンを示す先に同定されたＰＩ３キナーゼと対照的に、ｐ１１０δは白血球で選択的に発現される。重要なことには、ｐ１１０δは試験したほとんどの黒色腫で発現増加を示し，それゆえ黒色腫が示す転移性の調節に決定的な役割を果たす可能性がある。したがって、ｐ１１０δ活性を増加させまたは減少させる剤の同定は、がんの転移を予防する可能性がある。

Description

【発明の詳細な説明】新規な脂質キナーゼ本発明は、ＰＩ３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）ファミリーの一部である新規なリピドキナーゼに関するものであり、さらに詳細には、本発明は、新規なリピドキナーゼ及びその種々の応用に関し、例えば、がん細胞の転移のような細胞の運動性または侵潤の診断または予測に関する、上記キナーゼの発現の検証に関し；また、本発明は、選択された細胞の移動をそれぞれ増強または制限することにより、上記運動性または侵潤を増加させ、減少させまたは防止させるための上記キナーゼの発現又は阻害を制御する剤に関する。酵素のＰＩ３キナーゼファミリーに関する概説は、同時係属中の我々の特許出願ＷＯ９３／２１３２８に記載されている。略述すると、この酵素のクラスは、ホスホイノシチド（PhosPhoinositide）（以下、ＰＩという）３−キナーゼ活性を示す。細胞のシグナル伝達および細胞の２次メッセンジャーシステムに関して我々が知る偉大な進歩の結果、ＰＩ３キナーゼ類は細胞の機能の調節に関して果たす大きな役割を有することが知られている。事実、ＰＩ３キナーゼ類は、リガンドによる刺激または細胞の形質転換の結果として活性化されたプロテイン−チロシンキナーゼと会合する、多数の潜在的なシグナル送達系蛋白質の一員であることが知られている。このように会合した場合、それらは細胞のシグナル送達経路に重要な複合体を提供し、所期の結果に向かって直接的な作用を指示する。ＰＩ３キナーゼは、イノシトール脂質のイノシトール環の３’―ＯＨ位への燐酸の付加により、ホスファチジルイノシトールモノ燐酸、ホスファチジルイノシトールジ燐酸およびホスファチジルイノシトールトリ燐酸の生成を触媒する（ホワイトマンら、１９８８年；スチーブンら、１９８９年および１９９１年）。現在、一群のＰＩ３キナーゼ酵素が、植物、変形菌類（slime molds）、酵母、ミバエ類および哺乳類のようなさまざまな生物において確認されている（ツベレビルら、１９９６年）。種々のＰＩ３キナーゼ類が、インビボにおいて種々の３’―燐酸化イノシトール脂質の生成に関与していることが考えられる。インビトロにおける脂質の基質特異性に基づいて、３種類のＰＩ３キナーゼを区別することができる。第１類の酵素は、広範な基質特異性を有し、ＰｔｄＩｎｓ、ＰｔｄＩｎｓ（４）ＰおよびＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ₂を燐酸化する。クラスＩのＰＩ３キナーゼは、哺乳類のｐ１１０α、ｐ１１０βおよびｐ１１０γを含む（ヒルスら、１１９２年；フーら、１９９３年；スチーブンら、１９９４年；ストヤノフら、１９９５年）。ｐ１１０αおよびｐ１１０βは、ｐ８５アダプター蛋白質およびＧＴＰ−結合Ｒａｓと相互作用するＰＩ３キナーゼに関連している。２種の８５ｋＤａサブユニット、すなわちｐ８５αおよびｐ８５βがクローニングされた（オーツら、１９９２年）。これらの分子は、Ｎ末端ｓｒｃホモロジー３（ＳＨ３）ドメイン、２個のプロリンリッチ領域が隣接する（flanked）ブレイクポイントクラスター（ｂｃｒ）ホモロジー領域および２個のｓｒｃホモロジー２（ＳＨ２）ドメインを含む。ｐ８５α遺伝子からのオルターナティブスプライシングにより生成するかまたはｐ８５α／βのものと異なる遺伝子によりコード化される短縮されたｐ８５蛋白質は、すべてＳＨ３ドメインとｂｃｒ領域を欠失し、これらは単一の短いＮ末端により置き換えられたと思われる（ポンスら、１９９５年；イヌカイら、１９９６年；アントネッティら、１９９６年）。すべてのｐ８５分子中に存在するＳＨ２ドメインは、種々のレセプターおよびその他の細胞蛋白質上の燐酸化チロシン残基と相互作用する能力をもつヘテロダイマーのｐ８５／ｐ１１０ＰＩ３Ｋ類をもたらす。ｐ１１０αおよびβと対照的に、ｐ１１０γはｐ８５と相互作用しないが、その代わりｐ１０１アダブター蛋白質と会合する（スチーブンら、１９９６年）。ｐ１１０γ活性は、Ｇ蛋白質サブユニットにより刺激される。第２類のＰＩ３Ｋ類は、少なくともインビトロにおいて、ＰｔｄＩｎｓおよびＰｔｄＩｎｓ（４）Ｐを燐酸化するが、ＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ₂はしない酵素を含む（マクドゥガルら、１９９５年；バーバシウスら、１９９６年；モルツら、１９９６年）。これらのＰＩ３Ｋ類はすべてＣ末端にＣ２ドメインを含む。これらのクラスＩＩのＰＩ３Ｋ類のインビボにおける役割は未知である。第３類のＰＩ３Ｋ類は、ＰｔｄＩｎｓに限定された基質特異性を有する。これらのＰＩ３Ｋ類は、酵母におけるゴルジ体から液胞への新生蛋白質の移行、これは哺乳類におけるリソソームの均等物である、に関与する酵母のＶｐｓ３４と相同性がある（スタックら、１９９５年）。酵母および哺乳類のＶｐｓ３４ｐは、共に、１５０ｋＤａの蛋白質のセリン／スレオニンキナーゼであるＶｐｓ１５ｐとの複合体の形で存在する（スタックら、１９９５年；ボリニアら、１９９５年；パナレトウら、投稿中）。ＰｔｄＩｎｓ（３）Ｐは細胞中に全般的に存在し、その濃度は細胞外刺激により大きく変化しない。対照的に、ＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ₂およびＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ₃は静止期の細胞中にほとんど存在せず種々の成長因子による刺激で急速に産生されるが、これは第２メッセンジャー（second messengers ）としての類似機能を示唆する（スチーブンスら、１９９３年）。ＰＩ３Ｋ類およびその燐酸化脂質の細胞生理学における役割は、理解され始めたばかりである。これらの脂質は２重の役割を果たすことができる：すなわち、脂質２重層の彎曲上における物理的を電荷依存性作用の発揮とは別に、それらはまた特異的結合蛋白質と相互作用しその局在化および／または活性を調節する能力を有する。これらの脂質の潜在的標的の中には、プロテインキナーゼＣアイソフォーム類、プロテインキナーゼＮ／Ｒｈｏ活性化キナーゼ類およびＡｋｔ／ＲＡＣ／プロテインキナーゼＢのようなプロテインキナーゼ類がある（トカーら、１９９４年；パルマーら、１９９５年；バーゲリングおよびコッファー、１９９５年；フランケら、１９９５年；ジェームスら、１９９６年；クリッペルら、１９９６年）。Ａｋｔ／ＲＡＣ／プロテインキナーゼＢは、ｐ７０Ｓ６キナーゼおよびグリコーゲンシンターゼキナーゼ３のような標的の上流にあるようである（チャンら、１９９４年；クロスら、１９９５年）。またＰＩ３Ｋ類は、おそらくヌクレオチド交換の調節により、ＲａｃおよびＲａｂ５のような低分子ＧＴＰ結合蛋白質の活性に影響を与える（ホーキンスら、１９９５年；リーら、１９９６年）。最後に、これらの作用の組み合わせにより、細胞骨格の再配列、ＤＮＡ合成／***誘発、細胞生存および分化をもたらすことができる（バンヘーゼブレックら、１９９６年）。我々は、ここに、我々がＰ１１０δと命名した哺乳類の新規なクラスＩのＰＩ３キナーゼを報告する。この新規なＰＩ３キナーゼは、それがｐ８５α、ｐ８５ βおよびｐ８５γに結合するという点で、クラスＩのＰＩ３キナーゼファミリーの典型をあらわす。さらに、それはまたＧＴＰ−ｒａｓにも結合するが、ｐ１１０αと同様、ｒｈｏおよびｒａｃに対する結合を示さない。それはまた、ｐ１１０αおよびｐ１１０βと同一のＧＴＰ−ブロードホスホイノシチド脂質に対する基質特異性を共有し、またプロテインキナーゼ活性を示し、ｐ１１０αと同様な薬物感受性を有する。しかしながら、それは、その選択的組織分布により特徴づけられている。遍在的に発現されているように見えるｐ１１０αおよびｐ１１０βと対照的に、ｐ１１０δの発現は白血球集団すなわち脾臓、胸腺および特に末梢血白血球において特に高い。この観察に加えて、我々はまた、ｐ１１０δがほとんどの黒色腫で発現されるが、黒色腫に対応する正常細胞であるメラニン細胞では発現されないことを見出した。運動性または侵潤を示すことが知られる組織中におけるｐ１１０ δの自然分布およびがん細胞中におけるｐ１１０αの発現が前提になるならば、我々は、ｐ１１０δが細胞の運動性または侵潤に果たす役割を有し、したがってがん細胞におけるこのリピドキナーゼの発現ががん細胞の転移行動を説明できると考える。ｐ１１０δの別の新規な特徴は、Ｍｎ²⁺依存性におけるその自己燐酸化能力である。事実、我々は、自己燐酸化がこの蛋白質のリピドキナーゼ活性を妨げる傾向があることを示した。さらに、ｐ１１０δはプロリンリッチ領域を含む明確な潜在的な蛋白質−蛋白質相互作用モデュラス（図１、アミノ酸２０個中８個がプロリンである２９２−３１１位参照、）および塩基性領域であるロイシンジッパー（ｂＺＩＰ）様のドメイン（イングら、１９９４年およびヒライら、１９９６年）を含む。ｐ８５結合性ＰＩ３キナーゼ間のこのような生化学的および構造的差異は、それらが別個の機能的役割を果たしうることおよび／またはインビボにおいて区別して調節されうることを示す。我々は、ここに、ヒトに起源をもつ核酸分子（配列表の配列番号２）、およびｐ１１０δに関する対応するアミノ酸配列（配列表の配列番号１）データを開示する。この情報を使用すると、組織の運動性または侵潤を診断する目的で、種々の組織型におけるｐ１１０δの発現を測定し、特にがん組織におけるその発現を測定し、したがって生成しつつある２次腫瘍の可能性を予測することが可能である。その上、ｐ１１０δの発現を弱めるかまたはその機能を妨害する薬剤を提供することも可能であろう。例えば、ここに提示する配列データを考慮すると、ｐ１１０δの発現を予防するアンチセンス材料を提供することが可能である。上記のように、本発明は、ＰＩ３Ｋδ蛋白質をコードする核酸分子に選択的に結合してＰＩ３Ｋδ遺伝子の転写および／または翻訳を減少させるアンチセンスオリゴヌクレオチドを包含する。これは、ＰＩ３Ｋδ遺伝子の発現に帰せられる腫瘍細胞の表現型のあらゆる特性の減少を含めて、ＰＩ３Ｋδ遺伝子産物の発現の減少が望まれる実際上すべての医療状況で望ましいことである。このようにして、アンチセンス分子は、このような腫瘍細胞の表現型の特性を減速させまたは抑制するために使用することができる。ここに使用する「アンチセンスオリゴヌクレオチド」または「アンチセンス」の語は、生理学的条件下において特定の遺伝子を含むＤＮＡまたはその遺伝子のｍＲＮＡ転写物にハイブリダイズし、それによりその遺伝子の転写および／またはそのｍＲＮＡの翻訳を阻害する、オリゴリボヌクレオチド、オリゴデオキシリボヌクレオチド、修飾オリゴリボヌクレオチド、または修飾オリゴデオキシリボヌクレオチドなどであるオリゴヌクレオチドを表現するものである。アンチセンス分子は、標的遺伝子とハイブリダイズしたとき標的遺伝子の転写または翻訳を妨害するようにデザインされる。当業者は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの正確な長さと標的分子に対する相補性の程度が、標的の配列およびその配列を含む特定の塩基類を含めて、選択した具体的標的に依存していることを認識するであろう。アンチセンスオリゴヌクレオチドを、生理学的条件下で標的と選択的に結合、すなわち生理学的条件下で標的細胞中の他の任意の配列よりも標的配列に実質的によくハイブリダイズするように、構築または配置するのが好ましい。図９に示すＤＮＡ配列またはそのアレル変異もしくは相同的なゲノムおよび／またはＤＮＡ配列に基づき、当業者は本発明により使用するための数々の適当なアンチセンス分子のうち任意のものを、容易に選択し合成することができる。阻害が十分選択的で強力であるために、このようなアンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも７個（ワグナーら、ネーチャーバイオテクノロジー１４巻８４０−８４４ページ、１９９６年）、より好ましくは、少なくとも１５個の、標的に相補的な連続的な塩基を含む必要がある。最も好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、２０−３０塩基の相補的配列を含む。遺伝子またはｍＲＮＡ転写物の任意の領域にアンチセンス的なオリゴヌクレオチドを選択することができるが、好ましい態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、翻訳開始部位、転写開始部位またはプロモーター部位のようなＮ末端または５’上流部位に対応する。さらに、３’非翻訳領域も標的にすることができる。ｍＲＮＡスプライシング部位の標的化も当技術で使用されているが、別のｍＲＮＡスプライシングが生じるならば好ましくない。さらに、好ましくは、アンチセンスは、ｍＲＮＡの２次構造が予期されず（例えば、サイニオら、セルラー・アンド・モレキュラー・ニューロバイオロジー１４巻（５号）４３９―４５７ページ、１９９４年参照）蛋白質の結合が期待されない部位を標的化することができる。最後に、図９はｃＤＮＡ配列を開示するが、通常の当業者は、図９のｃＤＮＡに対応するゲノムＤＮＡを容易に誘導することができる。すなわち、本発明はまた、図９に対応するゲノムＤＮＡに相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドをも提供する。同様に、必要以上の実験なしに、そのアレル体または相同的なＤＮＡ類およびゲノムＤＮＡ類に対するアンチセンスも可能である。一連の実施態様において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、「天然」デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはそれらの任意の組み合わせから構成される。すなわち、一つの天然ヌクレオチドの５’末端および別の天然ヌクレオチドの３’末端を、天然系におけると同様に、ホスホジエステルヌクレオシド間結合を介して共有結合させることができる。これらのオリゴヌクレオチドは、手作業または自動合成機により当業界の通常の方法により調製できる。またそれらは、ベクターにより組換え法で生産できる。しかし、好ましい実施態様において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、「修飾」オリゴヌクレオチドを含むこともできる。すなわち、オリゴヌクレオチドは、標的に対するハイブリダイズを防止されないが安定性または標的性を増強しまたはその他の方法で治療効果を増強する数々の方法で修飾することができる。ここに使用する「修飾オリゴヌクレオチド」の語は、（１）そのヌクレオチドの少なくとも２個が合成ヌクレオシド間結合（すなわち、一つのヌクレオチドの５’末端と別のヌクレオチドの３’末端間のホスホジエステル結合以外の結合）を介して共有結合し、および／または（２）通常核酸に会合しない化学基がオリゴヌクレオチドに共有結合した、オリゴヌクレオチドを表現するものである。好ましい合成ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート、アルキルホスホネート、ホスホロジチオエート、ホスフェートエステル、アルキルホスホノチオエート、ホスホロアミデート、カルバメート、ホスフェートトリエステル、アセトアミデート、ペプチド、およびカルボキシメチルエステルである。また「修飾オリゴヌクレオチド」の語は、共有結合で修飾された塩基および／または糖を持ったオリゴヌクレオチドを包含する。例えば、修飾オリゴヌクレオチドは、３’位でヒドロキシル基以外および５’位でホスフェート基以外の低分子量有機基に共有結合した糖骨格をもつオリゴヌクレオチドを含む。すなわち、修飾オリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−アルキル化リボース基を含みうる。さらに、修飾オリゴヌクレオチドは、リボースの代わりにアラビノースのような糖を含みうる。また修飾オリゴヌクレオチドはＣ−５プロピン修飾塩基（C-5 propyn e modified dases）のような塩基性類似体を含むことができる（ワグナーら、ネーチャーバイオテクノロジー１４巻８４０−８４４ページ、１９９６年）。すなわち、本発明は、ＰＩ３Ｋδ蛋白質をコードする核酸に相補的であり生理学的条件下でこれとハイブリダイズする修飾アンチセンス分子を、医薬的に許容される担体と共に含む医薬組成物を意図する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、医薬組成物の一部として投与されうる。このような医薬組成物は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを、当業界で知られた任意の標準的な生理学的および／または医薬的に許容される担体と組み合わせて含みうる。組成物は、無菌であり、治療的有効量のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、患者に投与するに適した重量または容量の単位中に含むべきである。「医薬的に許容される」の語は、有効成分の生物活性の有効性を妨害しない非毒性材料を意味する。「生理学的に許容される」の語は、細胞、細胞培養物、組織または生物のような生物学系と相容性をもつ非毒性材料を意味する。担体の特性は、投与経路に依存する。生理学的および医薬的に許容される担体としては、希釈剤、充填剤、塩類、緩衝剤、安定剤、可溶化剤、およびその他の当業界で周知の他の材料などを含む。したがって、本発明の目的は、新規なＰＩ３キナーゼを同定し可能性がある細胞の運動性または侵潤を予測する手段を提供することである。本発明のさらに別の目的は、ｐ１１０δの発現を増加させ、減少させ、または防止する剤、および／または、細胞の運動性または侵潤をそれぞれ増強し、または障害し、または予防する目的で、ｐ１１０δの機能を妨害する剤を提供することである。本発明の最初の特徴によると、ＰＩ３キナーゼ活性を有する単離された自己燐酸化ポリペプチドが提供される。理想的には、上記ポリペプチドは、白血球から誘導され、典型的には黒色腫で発現されるものであり、さらに理想的には、上記ポリペプチドはヒト起源のものである。その上、ポリペプチドは、哺乳類ＰＩ３キナーゼのｐ８５サブユニットと会合して、理想的には活性複合体を産生する能力をもつ。さらに好ましくは、ポリペプチドは、図１Ａに示すアミノ酸配列（配列表の配列番号１）、または特にプロリンリッチドメインにより特徴づけられ、それに相同的な配列を有する。ここで相同的の語の引用は、同様の性質の、または共通の系統の、またはここに記載するように、緊縮条件下のような状況で、図９に示す核酸分子にハイブリダイズし得る核酸分子に対応する蛋白質または材料として特徴づけられるものを包含することを意図するものである。典型的なハイブリダイゼーション条件は、温度６０℃における５０％ホルムアミド、５ＸＳＳＰＥ、５Ｘデンハート溶液、０．２％ＳＤＳ、２００μｇ／ｍｌ変性音波処理したにしん***ＤＮＡおよび２００μｇ／ｍｌ酵母ＲＮＡ（公開特許明細書ＷＯ９３／２１３２８記載の条件）を含む。理想的には、ポリペプチドは、組換え体技術を使用して生産され、代表的にはヒト起源である。本発明の別の特徴によると、本発明のポリペプチドの少なくとも一部に対する抗体であって、その抗体はポリクローナルまたはモノクローナルであるものが提供される。本発明の別の特徴によると、図９に示す核酸分子の全部または一部分であって、その分子がＰＩ３キナーゼ活性を有する自己燐酸化ポリペプチドをコードするものが提供される。上記分子の一部分が提供される場合、部分はその目的を考慮して選択され、例えばその後の使用に役立つキナーゼ活性を有する部分または抗体生産に最適な他の部分を選択するのが望まれうる。本発明の別の特徴によると、本発明の核酸分子の全部またはその一部分を含む核酸分子構築物であって、後者の核酸分子が制御配列の制御下で適当な読み取り枠内にあり対応する蛋白質の発現を確実にするものが提供される。本発明のさらに別の特徴によると、理想的には本発明の構築物を使用して、対応するポリペプチドの全部または重要部分の発現を可能にするために図９に示す核酸分子の全部または一部分を含むように形質転換された宿主細胞が提供される。理想的には、これらの宿主細胞は、真核細胞、例えばバキュロウイルスの発現系を使用したスポドプテラ・フルギペルダ種（spodoptera frugiperda）の細胞のような昆虫細胞である。この発現系は、翻訳後修飾が必要な場合に有利である。このような修飾が必要でないならば、原核細胞を使用しうる。本発明の別の特徴によると、本発明のポリペプチドの発現に関して上記細胞の試料を試験することを含む、細胞の運動性診断法が提供される。理想的には、例えばＰＣＲ技術またはノザーンブロット分析により、本発明のポリペプチドに対応するｍＲＮＡが上記細胞中に発現されたか否かを確認するための検査が行われる。別の方法として、上記発現を確認するために任意の他の従来技術を使用しうる。本発明のさらに別の特徴によると、本発明のポリペプチドまたはその断片を使用して後記活性に関して候補分子をスクリーニングすることを含む、本発明のポリペプチドの活性のブロックに有効な拮抗薬の同定法が提供される。理想的には、スクリーニングは、コンピューター補助技術または従来の実験室技術のような人工的技術を包含しうる。理想的には、上記の方法は、天然にまたはウイルスにより形質転換された本発明のポリペプチドを発現することが知られた細胞を、適当な拮抗薬にさらし、ついでその運動性を観察することにより実施される。別の方法として、本発明の方法は、本発明のポリペプチドに選択的にかつ理想的には不可逆的に結合する薬剤を確認するための、競合的結合アッセイを含みうる。本発明のさらに別の特徴によると、医薬または獣医薬用に製剤され、所望により希釈剤、担体または賦形剤をも含みおよび／または単位用量形態にされた、本発明のポリペプチドの活性または発現の増強またはブロックに有効な薬剤を含む、医薬または獣医薬組成物が提供される。本発明のさらに別の特徴によると、細胞の集団を作用薬または拮抗薬または本発明のポリペプチドまたはここに記載するアンチセンス材料にさらすことを含む、細胞の運動性制御法が提供される。別の方法として、上述した方法において、上記細胞を、上記ポリペプチドの効果的な濃度を増加し細胞の運動性を増強する目的で、代わりとしてまたは追加として、本発明のポリペプチドにさらしうる。上述の方法は、インビボでもインビトロでも実施しうる。本発明のさらに別の特徴によると、細胞の運動性制御のための、本発明のポリペプチドの活性ブロックに有効な薬剤の使用が提供される。本発明のさらに別の特徴によると、細胞の運動性増強のための、本発明のポリペプチドの使用が提供される。本発明のさらに別の特徴によると、本発明の核酸にハイブリダイズするための、理想的にはここに記載のように修飾したアンチセンスオリゴヌクレオチドが提供される。本発明の実施態様を、単なる例示の目的で下記の図面、材料および方法を参照して示す。そのうち：図１（Ａ）は、ヒトｐ１１０δのｃＤＮＡの翻訳アミノ酸配列を示す。プロリンリッチ領域およびｂＺＩＰ様ドメインはそれぞれ枠囲いおよび斜線囲みで示す。（Ｂ）は、ｐ１１０δの全長アミノ酸配列とｐ１１０αおよびｐ１１０βのそれとのドットプロット対比を示す。非保存配列のモチーフを下線で示す。ドットプロット対比は、ＣＯＭＰＡＲＥプログラム（ＵＷＧＣＧパッケージ：ドベルーら、１９８４年）を用いて実施した。（Ｃ）は、ｐ１１０δアミノ酸配列のフランキングＨＲ３とｐ１１０αおよびｐ１１０βのそれぞれのホモローガス領域の比較を示す。アミノ酸番号はｐ１１０δのものである。プロリンリッチ領域：ｐ１１０δの左巻きポリプロリンＩＩ型ヘリックス形成を可能にする決定的プロリンをアスタリスクで示す。ｂＺＩＰ領域：ロイシンジッパー領域の保存Ｌ／Ｖ／Ｉ残基を矢頭で示す。図２は、ｐ１１０δとｐ８５およびＲａｓの相互作用を示す。（Ａ）は、昆虫細胞を、ＧＳＴ―ｐ１１０δをコードする組換え体バキュロウイルス単独またはｐ８５α、βもしくはγをコードするウイルスとの組み合わせに感染させ、２日後、グルタチオン−セファロースを用いて細胞溶解物からＧＳＴ−ｐ１１０δを精製し、洗浄し、ＳＤＳ―ＰＡＧＥおよびクーマシー染色で分析した。（Ｂ）は、ｐ１１０６を５００μｇのヒト好中球細胞質ゾルから免疫沈降させ、ウェスタンブロッティングにより種々のｐ８５アイソフォームの存否についてプローブ分析した。ｒｅｃは、Ｓｆ９細胞から精製した組換え体ｐ８５。（Ｃ）は、ＧＳＴ ―ｐ１１０α／８５αおよびＧＳＴ―ｐ１１０δ／８５α（０．２５μｇ）を指示量（μｇ）のＧＴＰ−またはＧＤＰ−付着（loaded）Ｖ１２Ｒａｓとインキュベートし、洗浄し、報告された（ロドリゲ−ビシアナら、１９９４年、１９９６年）ウェスタンブロッティングによりＲａｓの存否についてプローブ分析した。図３の（Ａ）は、ｐ１１０δのインビトロでの脂質の基質特異性を示す。ＧＳＴ−ｐ１１０δ／ｐ８５αを、Ｍｇ²⁺の存在下に指示した基質を用いてリピドキナーゼアッセイにかけた。同じｃｐｍを原点にスポットした。（Ｂ）は、ＧＳＴ ―ｐ１１０δ／ｐ８５αにより生成したＰｔｄＩｎｓ燐酸化産物のＨＰＬＣ分析を示す。ｐ１１０δ脱アシル産物（実線）ならびにグリセロホスホイノシトール −３Ｐおよびグリセロホスホイノシトール−４Ｐの標準品（点線）の溶離時間を示す。ＡＭＰおよびＡＤＰ対称の位置を矢印で示す。図４は、ｐ１１０δのプロテインキナーゼ活性を示す。（Ａ）は、指示したｐ８５サブユニットと複合したＧＳＴ−ｐ１１０αまたはＧＳＴ−ｐ１１０δをＭｎ²⁺の存在下にインビトロプロテインキナーゼ反応に付し、さらにＳＤＳ―ＰＡＧＥ、クーマシー染色、オートラジオグラフィーで分析したものである。（Ｂ）及び（Ｃ）は、ＰＤＧＦ−レセプターホスホペプチドビーズ上のｐ８５αまたは βと複合した非タッグ化ｐ１１０αおよびｐ１１０δ［野生型（ＷＴ）またはキナーゼ欠損突然変異（ｐ１１０α−Ｒ９１６Ｐおよびｐ１１０δ−Ｒ８９４Ｐ）］をインビトロキナーゼ反応に付し、さらに（Ａ）で記載したように分析した。白色および黒色の矢頭はｐ１１０およびｐ８５蛋白質をそれぞれ示す。（Ｂ）の右パネルは、ｐ８５αおよびｐ１１０δのホスホアミノ酸分析を示す。図５は、薬物に対するｐ１１０δのリピドキナーゼ活性の感受性を示す。ｐ１１０δ／ｐ８５α（黒四角）およびｐ１１０α／ｐ８５α（白丸）阻害を薬物であるウォルトマンニン不存在下の活性を基準に示した。これらのデータ点は、３回の実験の平均値（±標準誤差）である。図６は、ｐ１１０α、ｐ１１０βおよびｐ１１０δの発現のノザーンブロット分析を示す。図７は、ｐ１１０αおよびｐ１１０δ蛋白質の発現の分析を示す。レーン当たり総細胞溶解物１００μｇを付着した。材料および方法の項に記載した溶解緩衝液または２−メルカプトエタノール含有レムリゲル付着緩衝液中で細胞溶解した。ＰＭＢＣは抹消血単核細胞；ＰＢＬは末梢血リンパ球を示す。図８は、サイトカインシグナル伝達におけるｐ１１０αおよびｐ１１０δの関与を示す。Ｂａ／Ｆ３（Ａ）およびＭＣ／９（Ｂ）細胞系を指示したサイトカインで刺激した。対照である非処理細胞からの試料は標識化Ｃｏｎである。総細胞溶解物ならびにｐ１１０αおよびｐ１１０δＩＰをＳＤＳ―ＰＡＧＥで分離して２連のブロットを作成したが、その対照はｐ１１０δ／８５α（パネルａ、ｂおよびｄ）またはｐ１１０α／ｐ８５α（パネルｃおよびｅ）である。原ブロットのイムノブロッティングは４Ｇ１０（抗ＰＴｙｒ、パネルａ）および抗ｐ１１０ α（パネルｃ）で実施した。ついでブロットをストリップし抗ＳＨＰ２（Ａ、パネルｂ）、抗ｋｉｔ（Ｂ、パネルｂ）、抗ｐ１１０６（パネルｄ）および抗ｐ８５抗体（パネルｅ）で再プローブ分析した。矢頭はｐ１７０（ＩＲＳ―２）、ｐ１００およびｐ７０（ＳＨＰ２）（Ａ、パネルａ）、ならびにｐ１５０（ｃ―ｋｉｔ）およびｐ１００（Ｂ、パネルｂ）の位置を示す。図９は、ｐ１１０δのヒトの全ｃＤＮＡ配列を示す。なお、配列は配列表の配列番号２にも示す。図１０は、ｐ１１０δに対するアフィニティ精製した抗体をマイクロインジェクションしたネズミマクロファージの免疫蛍光反応像を示す。マクロファージの細胞骨格はファロイジン抱合ローダミンで画像化した。材料および方法ｐ１１０δのクローニングウシｐ１１０αおよびＳ．セレビシアエＶｐｓ３４ｐ間のホモローガス領域に基づくＲＴ―ＰＣＲによりクローンした部分的ＰＩ３キナーゼｃＤＮＡクローンの同定の詳細が報告されている（ボリニアら、１９９５年；マクドウガルら、１９９６年）。この方法により、ＭＯＬＴ４のＴ細胞系から部分的ｐ１１０δｃＤＮＡ断片が得られ、次いでこれがオリゴ（ｄＴ）プライムＵ９３７ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに使用された（ボリニアら、１９９５年）。相補的ＤＮＡを、ＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ（ストラタジーン）で消化したラムダＺＡＰＩＩベクターにクローニングした。スクリーニングした４百万個のクローンから６個の１次陽性プラークが見つかり、そのうち３個がさらに２回のスクリーニングでも陽性であった。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中のｃＤＮＡ挿入物は製造元（ストラタジーン）の指示に従いインビボ切断により作成した。３個の代表的なｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔクローン（０_5.1、０_9.1および０_11.1）を制限地図作成およびＰＣＲで特性確認し、４．４ｋｂ（０１_1.1）ないし５．０ｋｂ（０_5.1、０_9.1）にわたる大きさの挿入物を含有することが判明した。０_9.1クローンを詳細な特性確認に使用した。その挿入物の制限地図作成により、内部ＸｈｏＩ部位の不存在および、それぞれＥｃｏＲＩのｃＤＮＡ挿入部位から２３３および３８６２ヌクレオチド３’（ヌクレオチド１＝図９の下線ヌクレオチド）にある２個の内部ＥｃｏＲＩ部位の存在が明らかになった。したがって、ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩの組み合わせによる消化が０_9.1挿入物を３個の断片に分割し、さらにＥｃｏＲＩ断片Ｉ（ヌクレオチド１−２２２）、ＥｃｏＲＩ断片ＩＩ（ヌクレオチド２２３― ３８６１）およびＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ断片ＩＩＩ（ヌクレオチド３８６２―約５０００）を明らかにした。断片ＩおよびＩＩの両鎖を、Ｔａｑダイデオキシターミネーターサイクル配列決定システム（ＡＢＩ）を用いて配列決定に付し、その全長ｃＤＮＡ配列を図９に示す。０_9.1挿入物のヌクレオチド１９５から３３３０がオープンリーディングフレームであった。枠内停止コドンは潜在的開始コドンに先行し、翻訳開始に好ましい部分にあった（コザック、１９９１年）。この結果から、５’非翻訳領域（ＵＴ）の１９６ヌクレオチドおよび約２．２ｋｂの３’ＵＴがもたらされた。０_5.1、０_9.1および０_11.1クローンの配列決定した５’末端において、２個の異なるが関連性を有する５’非翻訳領域が認められたが、これは少なくとも２個のわずかに異なるメッセンジャーＲＮＡの存在を意味する。ｐ１１０δの発現ベクターの構築使用した昆虫細胞移送ベクターはｐＶＬ１３９３（非タッグ化ｐ１１０δ用；インビトロゲン）およびｐＡｃＧ３Ｘ（ＧＳＴ―ｐ１１０δ用；デービスら、１９９３年）であった。ｐ１１０δのコーディング領域を２段階でこれらのベクターにサブクローンした。まず、マルチクローニング部位へのリンカー挿入により発現ベクターを操作して、開始コドン（ヌクレオチド１９７；上記参照）から第２ＥｃｏＲＩ部位（ヌクレオチド２２３；上記参照）に広がるｐ１１０δＥｃｏＲＩ断片Ｉ配列の一部を含ませた。後者のＥｃｏＲＩ部位に、ｐ１１０δのＥｃｏＲＩ断片ＩＩをサブクローニングし、ついで正しい方向の挿入物をもつクローンを選択した。昆虫細胞ベクターに関する第１段はＢａｍＨＩ―ＥｃｏＲＩ切断であり、ついで下記リンカー（リンカーＩ）を挿入した。ＧＡＴＣＣＣＣＡＣＣＡＴＧＣＣＣＣＣＴＧＧＧＧＴＧＧＡＣＴＧＣＣＣＣＡＴＧＧ（センス：５’―３’）（アンチセンス：５’―３’）ＡＡＴＴＣＣＡＴＧＧＧＧＣＡＧＴＣＣＡＣＣＣＣＡＧＧＧＧＧＣＡＴＧＧＴＧＧＧこのリンカーは、最適のＫｏｚａｋコンセンサス配列（コザック、１９９１年）と共にＡＴＧを含む。ｐ１１０δの別の誘導体を、ＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼ（ニュー・イングランド・バイオラブス）を用いてＰＣＲで作成した。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＳＫ（またｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ｐ１１０δ−ＥｃｏＩＩとも示す）にサブクローニングしたｐ１１０δのＥｃｏＲＩ断片ＩＩを、ここで鋳型として使用した。これらのＰＣＲ反応において、ＥｃｏＲＩ断片ＩＩ挿入物の３’非翻訳領域は除去された。変異Ｒ８９４Ｐの作成に使用したオリゴヌクレオチドは次の通りである：センス変異オリゴヌクレオチド＝プライマー１（変異残基を下線で示す）＝５’−ＧＴＧＴＧＧＣＣＡＣＡＴＡＴＧＴＧＣＴＧＧＧＣＡＴＴＧＧＣＧＡＴＣＣＧＣＡＣＡＧＣＧＡＣＡＡＣＡＴＣＡＴＧＡＴＣＣＧアンチセンス＝プライマー２＝５’−ＧＧＣＣＣＧＧＴＧＣＴＣＧＡＧＡＡＴＴＣＴＡＣＴＧＣＣＴＧＴＴＧＴＣＴＴＴＧＧＡＣＡＣＧＴＴＧＴＧＧＧＣＣパラレルＰＣＲをプライマー２およびセンスプライマー（プライマー３＝５’ −ＧＴＧＴＧＧＣＣＡＣＡＴＡＴＧＴＧＣＴＧＧＧＣＡＴＴＧＧＣＧ）を使用し野生型ｐ１１０δを無傷で残して実施した。すべてのＰＣＲ産物を、ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで切断し、ＮｄｅＩ―ＸｈｏＩオープンｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ― ｐ１１０δ−ＥｃｏＩＩにサブクローニングし、配列決定した。ついで正しいクローンをＥｃｏＥＲＩカセットとしてリンカーＩ含有ＥｃｏＲＩオープンｐＶＬ１３９３に移行させ、ついで正しい方向の挿入物をもつクローンを選択した。昆虫細胞中におけるｐ１１０δの発現プラスミドＤＮＡを、リポフェクチン試薬（ギブコ）を用いてＢａｃｕｌｏＧｏｌｄＤＮＡ（ファルミンゲン、カリフォルニア州サンディエゴ）と同時移入した。組換え体プラークを、通常の方法（サマーズおよびスミス、１９８７年）により単離し確認した。細胞培養細胞は、１０％ウシ胎児血清、２０μＭ２―メルカプトエタノール、１００単位／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシンおよび２ｍＭグルタミンを補足したＲＰＭＩ１６４０培地中、加湿５％ＣＯ₂インキュベター中で培養した。Ｂａ／Ｆ３はマウスＩＬ３依存性プレＢ細胞系（パラシオスおよびスタインメッツ、１９８５年）であり、ＭＣ／９はマウスＩＬ３依存性マスト細胞系（ナベルら、１９８１年）である。Ｂａ／Ｆ３およびＭＣ／９の両者を、マウスＩＬ３源としてＷＥＨＩ３Ｂ由来の１０％（ｖ／ｖ）条件培地中で維持した。ＦＤＭＡＣ１１／４．６（ＦＤ−６）骨髄前駆細胞は、ＩＬ４ならびにＩＬ３、ＧＭ―ＣＳＦおよびＣＳＦ―１に反応して成長するＦＤＭＡＣ１１の在来変異である（ウエルハムら、１９９４年ａ）。これらの細胞を、ＡｇＸ６３／ＯＭＩＬ４細胞由来の３％（ｖ／ｖ）ＩＬ４条件培地中で維持した（カラスヤマおよびメルチャーズ、１９８８年）。リピドキナーゼアッセイリピドキナーゼ活性は、基本的にワイマンら（１９８５年）が報告した方法により測定した。リピドキナーゼアッセイ緩衝液は、２０ｍＭトリスＨＣｌｐＨ７．４、１００ｍＭＮａＣｌおよび０．５ｍＭＥＧＴＡとした。脂質はシグマから購入した。このアッセイにおけるＡＴＰおよびＭｇ²⁺の最終濃度は常にそれぞれ０．５および３．５ｍＭとしたが、脂質は０．２―０．４ｍＭ濃度で使用した。特に示さない限り、キナーゼ反応は３７℃で１０分間行った。反応産物のＴＬＣ分離用溶媒は、プロパン−１―オール／２Ｍ酢酸／５ＭＨ₃ＰＯ₄（６５：３５：１）とした。キナーゼに対する薬物効果のアッセイは４０μＭＡＴＰ（最終濃度）の存在下にＰｔｄＩｎｓを基質とし、２５℃で１０分間行った；すべての管に１％ＤＭＳＯを含有させた。活性は、ＴＬＣ分離脂質産物のホスホルイメージャー（phosphorimager）（モレキュラー・ダイナミックス）分析により定量した。ＨＰＬＣ分析組換え体ｐ１１０αを用いてＰｔｄＩｎｓを燐酸化することにより製造した［³² Ｐ］―ＰｔｄＩｎｓ３ＰおよびＰｔｄＩｎｓを０．５％ＮＰ−４０の存在下にＡ４３１膜で変換することにより生成させた［³²Ｐ］―ＰｔｄＩｎｓ４Ｐを標準品として使用した。脂質をメチルアミンで脱アシル化して生成させたグリセロホスホイノシトール（クラークおよびドーソン、１９８１年）をＰａｒｔｉｓｐｈｅｒｅＳＡＸカラム（ワットマン・インターナショナル）上で１Ｍ（ＮＨ₄）₂ＨＰＯ₄―水の直線勾配（０―２５％Ｂ；６０分）を使用して１ｍｌ／分でアニオン交換ＨＰＬＣにより分離した。放射能ピークは、オンライン検出器（リーブ・アナリティカル、グラスゴー）により検出した。実験間の均一性のために内部標準として加えたＡＤＰおよびＡＴＰヌクレオチド標準品は、２５４ｎｍにおける吸収により検出した。インビトロ蛋白質燐酸化アッセイおよびリピドキナーゼ活性に対する効果沈降した蛋白質を、プロテインキナーゼアッセイ緩衝液（２０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１００ｍＭＮａＣｌ、０．５ｍＭＥＧＴＡ、５０μＭＡＴＰおよび１ｍＭＭｎＣｌ₂・４Ｈ₂Ｏ、５−１０μＣｉ［γ−³²Ｐ］ＡＴＰ／ｍｌ）中、３７℃で３０分間インキュベートした。反応は、ＳＤＳ―ＰＡＧＥ試料緩衝液を添加して停止させ、反応産物はＳＤＳ―ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーで分析した。ホスホアミノ酸分析は、既報（ジェリネックおよびウエバー、１９９３年）のようにＨｕｎｔｅｒ薄層電気泳動システム(ＣＢＳサイエンティフィック・カンパニー、カリフォルニア州デルマー)上で実施した。低分子ＧＴＰ結合蛋白質とＰＩ―３Ｋのインビトロにおける相互作用ＧＳＴ―ＰＩ３Ｋに対するｒａｓ、ｒａｃおよびｒｈｏの結合を既報(ロドリンゲ−ビシアンスら、１９９５年、１９９６年)に従って実施した。抗体、免疫沈降およびイムノブロッティングウシｐ８５αに対するモノクローナル抗体(Ｕ１、Ｕ１３)およびｐ８５β(Ｔ１５)は報告されている(エンドら、レイフら、１９９３年)。ウシｐ８５γに対するモノクローナル抗体(Ｉ２)は我々の研究室で開発した。ＧＳＴ―ヒトｐ８５ α(ＡＡ５―３２１)に対するウサギポリクローナル抗血清は、ユニバーシティ・カレッジ・ロンドンのシェファード博士の好意により提供された。ウサギポリクローナル抗血清は、ｐ１１０δ（Ｃ）ＫＶＮＷＬＡＨＮＶＳＫＤＮＲＱ₁₀₄₄のＣ末端ペプチドに対しておよびヒトｐ１１０α(ＣＧＧ)ＳＶＴＱＥＡＥＥＲＥＥＦＦＤＥＴＲＲ₈₈のＮ末端ペプチドに対して作成した。ｐ１１０δ燐酸化型に対する抗体を作成するため、ペプチド配列１０４４をペプチド合成中にセリン残基を燐酸化した。ヒトｐ１１０αのＣ末端（ＫＭＤＷＩＦＨＴＩＫＱＨＡＬＮ）に対する抗血清は、ロヤ・フーシュマンド−ラド（ルードビッヒ・インスティチュート・フォー・カンサー・リサーチ、スウェーデン国ウプサラ）博士の好意により提供された。抗体は、アクチゲル（ステロジーン・バイオセパレーションズ、カリフォルニア州アーカディア）またはＡＦ―アミノトヨパールＴＳＫゲル（トーショー・カンパニー、日本国）に結合したペプチド上でアフィニティ精製した。抗体はそれらが指向するＰＩ３Ｋに特異的であることが認められた（Ｓｆ９細胞中で発現した下記ＰＩ３Ｋパネルに対して試験：ウシｐ１１０α、ヒトｐ１１０β（Ｃ．パナレトゥおよびＲ．Ｓ．：未発表結果）ヒトｐ１１０γ（ストヤノフら、１９９５年）、ｐ１１０δ、ＰＩ特異性３キナーゼ（ボリニアら、１９９５年））。末梢血管細胞は、フィコール（fieoll）勾配上で精製した（リンホプレプ；ナイコムド、ノルウェー国オスロ）。好中球の細胞溶解物は、既報のように音波処理により製造した（ビエンチエスら、１９９３年）。溶解緩衝液は、１％トリトン −Ｘ１００、１５０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭＮａＦ、１ｍＭＮａＶＯ₃、１ｍＭＤＴＴ、１ｍＭＰＭＳＦ、０．２７ＴＩＵ／ｍｌアプロチニンおよび１０μＭロイペプチンとした。いくつかの実験では，１ｍＭジイソプロピルフルオロフォスフェートおよび２７ｍＭＮａ−ｐ−トシル−Ｌ−リジン・クロロメチルケトン（塩酸塩）を添加した。サイトカイン実験に使用した溶解緩衝液は，５０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０％（ｖ／ｖ）グリセリン、１％（ｖ／ｖ）ＮＰ−４０、１５０ｍＭＮａＣｌ，１００μＭモリブデン酸ナトリウム、５００μＭフッ化ナトリウム、１００μＭオルトバナジウム酸ナトリウム、１ｍＭＥＤＴＡ、４０μｇ／ｍｌＰＭＳＦ、１０μｇ／ｍｌアプロチニン、０．７μ ｇ／ｍｌペプアスタチン、１ｍＭＤＩＦＰ、１ｍＭＴＬＣＫとした。サイトカイン刺激細胞は、ペレット化し、溶解液を次の分析前にマイクロ遠心機中４℃で５分間清澄化したほかは、既報（ウエルハムおよびシュラダー、１９９２年）のように、２×１０⁷細胞／ｍｌで溶解した。免疫沈降は、既報（ウエルハムら、１９９４年ａ）のように実施し、ＰＤＧＦレセプターペプチド（ＹｐＶＰＭＬＧ）は、製造元の指示にしたがってアクチゲルに結合した。ｐ１１０δに対するＣ末端抗血清は、免疫沈降およびイムノブロッティングの両者に使用した。ｐ１１０ αに関しては、ＣおよびＮ末端抗血清を免疫沈降およびウエスターンブロット分析にそれぞれ使用した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびイムノブロッティングは、既報（レムリ、１９７０年；ウエルハムおよびシュラダー、１９９２年；ウエルハムら、１９９４年ａ）のように実施した。抗体は、イムノブロッティングの際下記の濃度で使用した：４Ｇ１０、抗ホスホチロシンモノクローナル抗体では０．１μｇ／ｍｌ；抗ｐ１１０αおよびｐ１１０δでは０．２５μｇ／ｍｌ；抗ｐ８５では１：４０００；抗ｃ−ｋｉｔ（サンタ・クルス・バイオテクノロジー、ｓｃ―１６８）では０．４ μｇ／ｍｌ；抗ＳＨＰ（サンタ・クルス・バイオテクノロジー、ｓｃ―２８０）では０．１μｇ／ｍｌ；および抗ＩＲＳ―２（Ｍ．ホワイト博士、ジョスリン・ディアベテス・センター、マサチューセッツ州ボストンの贈与）では１：１０００。ヤギ抗マウスおよびヤギ抗ウサギ西洋わさびペルオキシダーゼ結合抗体（ダコ、デンマーク国）の両者は、０．０５μｇ／ｍｌの濃度で使用した。イムノブロットは、ＥＣＬシステム（アマーシャム）を用いて展開した。ブロットはストリップし既報（ウエルハムら、１９９４年ａ）のように再プローブ分析した。ｐ１１０δおよびｐ１１０αに対する抗体のＣＳＦ―１刺激マウスマクロファージ注入マウスマクロファージ細胞系ＢＡＣ１を、抗体マイクロインジェクション実験に使用した。ｐ１１０δに対するペプチド性ポリクローナル抗体は、Ｃ末端ペプチド１０４４（１７ページの材料および方法に記載）またはペプチド配列（Ｃ）Ｒ２２２ＫＫＡＴＶＦＲＱＰＬＶＥＱＰＥＤ₂₃₈を指向するものであった。ポリクローナル血清は、マイクロインジェクション前にアフィニティー精製し、０．５―５ｍｇ／ｍｌの濃度で使用した。対照のヒトｐ１１０αに対するペプチド性ポリクローナル抗血清は材料および方法の１７ページに記載したものである。マイクロインジェクション前に、Ｂａｃ１細胞をコロニー刺激因子１（ＣＳＦ１）から２４時間枯渇させた。ついで抗体をＣＳＦ１枯渇細胞に注入し、１０―１５分間ＣＳＦ１にさらし、マイクロインジェクション細胞の細胞骨格をファロイジン抱合ローダミンで発色させた（細胞の調製および発色はアレンら１９９７年の報告のように行う）。細胞刺激種々の成長因子による細胞の刺激は、刺激前に細胞を血清欠乏ＲＰＭＩに２× １０⁷／ｍｌに再懸濁した以外は、既報（ウエルハムおよびシュラダー、１９９２年）のように行った。化学合成したマウスＩＬ３およびＩＬ４は、イアン・クラーク−ルイス博士（ユニバーシティ・オブ・ブリティッシュ・コロンビア、バンクーバー）の好意により提供された。組換マウスＳＣＦはＲ＆Ｄシステムヨーロッパ（アビングドン、オックスフォード）から購入した。成長因子の濃度および刺激期間（ＳＣＦでは２分間；ＩＬ３およびＩＬ４では１０分間）はレセプターおよび細胞基質のチロシン燐酸化レベルが最高になるようにあらかじめ最適化した。これらは次の通りであった：ＩＬ３では１０μｇ／ｍｌ（ウエルハムおよびシュラダー、１９９２年）；ＩＬ４では１０μｇ／ｍｌ（ウエルハムおよびシュラダー、１９９４年ａ）およびＳＣＦでは５０ｎｇ／ｍｌ（Ｍ．Ｊ．Ｗ．未発表の観察結果）。ノザーンブロット分析ヒトポリＡ⁺ＲＮＡ（クローンテク）のノザーンブロットをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔクローン０_9.1のランダムプライムラベルＥｃｏＲＩ断片ＩＩとハイブリダイズさせた。ついで、下記のプローブを用いてストリッピングおよび再プローブ分析を実施した：ヒトｐ１１０αから得た内部ＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩＩ２．１ｋｂ断片（ボリニアら、１９９４年）およびヒトｐ１１０βのＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ５ｋｂｃＤＮＡ（Ｃ．パナレトゥ、未発表の結果）。上記の材料および方法を使用して、我々は、新規なリピドキナーゼ、特に我々がｐ１１０δと命名したＰＩ３キナーゼを報告するデータを明確化することができた。このキナーゼに関するデータを、ｐ１１０δをＰＩ３キナーゼ群の他の構成員と比較してそれぞれの特性を対比し対照する目的で、次に記載する。結果ｐ１１０δのクローニングウシｐ１１０αのキナーゼドメインおよびＳ．セレビシアエＶｐｓ３４ｐ中の保存されたアミノ酸配列（ＧＤＤＬＲＱＤおよびＦＨＩ／ＡＤＦＧ）に基づく縮重プライマー（degenerate primers）を、ヒトＭＯＬＴ４Ｔ白血病細胞のｍＲＮＡと共にＲＴ―ＰＣＲに使用した。相同性はあるが他の既知ヒトＰＩ３Ｋと異なる部分的ｃＤＮＡが得られた。このＰＣＲ断片を、Ｕ９３７単球ライブラリーのスクリーニングおよび対応全長クローンの単離用プローブとして使用した（詳細は、材料および方法ならびに図９参照）。配列分析の結果、枠内停止コドンに先行するオープンリーディングフレームが明らかになった。開始コドンもまた翻訳開始に好ましい形で存在することがわかった（コザック、１９９１年）。この３１３５ヌクレオチドのオープンリーディングフレームは、計算上、分子量１１９，４７１ダルトンをもつアミノ酸１０４４個の蛋白質である（図１Ａ）。他のＰＩ３Ｋとのアミノ酸の比較は、この蛋白質がヒトｐ１１０βに最も関連性が大きく（相同性５８％、フーら、１９９３年）、ヒトｐ１１０α（相同性４１％、ボリニアら、１９９４年）、ヒトＧ蛋白質調節ｐ１１０γ（相同性３５％、ストヤノフら、１９９５年）およびヒトｖｐｓ３４ｐ類似体（相同性２８％、ボリニアら、１９９５年）には近くないことを示した。ここに記載する新規ＰＩ３Ｋはｐ１１０δ命名された。高緊縮度（high stringency）のドットプロットによる対比（図１Ｂ）は、ｐ１１０α、βおよびδがｐ８５領域（ｐ１１０αのＡＡ２０―１４０：ダンドら、１９９４年）ならびにＰＩキナーゼ（ＰＩＫ）ドメイン（ＨＲ２）のＣ末端および触媒性コアー（ｐ１１０αのＡＡ５２９―終点、ズベレビルら、１９９５年）で相同性が高いことを示す。ｐ１１０δのＡＡ３７０―４７０に広がる別の高配列ホモロジー領域が、ｐ８５結合部位とＨＲ２の間に見られた。この領域は、すべてのｐ８５結合ＰＩ３Ｋ類およびｐ１１０γで保存されているいわゆるＨＲ３サイン（ＷｘｘｘＬｘｘｘＩｘＩｘＤＬＰＲ／ＫｘＡｘＬ）を含んでいる。ｐ１１０αとｐ１１０β／γ間の配列が最も異なるＮ末端側の領域は、Ｒａｓへの結合に十分としてｐ１１０αにおいて定義された領域と重なる（ｐ１１０αのＡＡ１３３―３１４：ロドリゲ−ビシアナら、１９９６年）。別の２個の構造的モチーフがｐ１１０δ中に同定された。第１のものは、分子モデリングがＳＨ３ドメインと相互作用する潜在性をもつ左巻きポリプロリンＩＩ型ヘリックスを形成しうる（データは記載せず）ことを示す、プロリンリッチ領域（図１Ｂ、Ｃ）である。この対応する領域で、ｐ１１０αとｐ１１０βには類似の屈曲を許容する決定的なプロリンがない。第２のモチーフは、ＨＲ３のＣ末端に続く塩基性領域であるロイシンジッパー（ｂＺＩＰ）様ドメインである（図１Ｂ、Ｃ）。ｂＺＩＰ領域は、ｐ１１０αおよびｐ１１０βの両者（またドロソフィアｐ１１０（リーバーズら、１９９７年））に存在するが、他方このドメインの塩基性成分はｐ１１０αでは顕著でない（図１Ｃ）。ｐ１１０δＺＩＰ領域のモデリングは、そのＬ／Ｖ／Ｉ残基の配置がコイル対コイル（coiled-coil）２量体蛋白質ジッパー複合体を形成しうるヘリックス構造に容易に適応することを示す（データは記載せず）。ｐ１１０δはｐ８５アダプターおよびＲａｓ蛋白質に結合するｐ１１０δがｐ８５サブユニットに結合し得るという、アミノ酸配列比較からの予測を証明するために、ｐ１１０δを、ｐ８５α、ｐ８５βまたはｐ８５γ（最後のはｐ５５ＦＩＫ、ｐ５５αおよびｐ８５／ＡＳ５３と相同的な５５ｋＤａウシｐ８５アイソフォームである（ポンスら、１９９５年；イヌカイら、１９９６年；アントネッティら、１９９６年））をコードする組換え体バキュロウイルスと一緒にグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）―融合蛋白質として昆虫細胞で発現させた。図２Ａから明らかなとおり、ｐ８５アダプターサブタイプはすべて、ＧＳＴ−ｐ１１０δとともに、同時感染細胞から効率的に同時精製された。異なるクラスＩｐ１１０触媒サブユニット類がインビボで異なるｐ８５アダプター蛋白質に対して結合の優先性を示すか否かという問題は、これまでに取り上げられたことがない。ｐ１１０δに特異的な抗血清を用いることにより、我々はｐ８５αおよびｐ８５βの両者が種々の白血球からのｐ１１０δ免疫沈降物中に存在することを見出した（図２Ｂはヒト好中球に関するデータを示す。ｐ８５γ は白血球では発現されないないことに注意）。ｐ１１０αの場合にも同様の結果が得られた（データは記載せず）。これらの免疫複合体では、ｐ８５α抗体との反応性を示す４５ｋＤａ蛋白質も観察された（図２Ｂ）。この蛋白質の性質は現時点では不明であるが、様々な組織からのｐ８５およびｐ１１０ＩＰ類に存在することが以前に報告されている４５ｋＤａ蛋白質に類似したものであるかも知れない（ポンスら、１９９５年）。ｐ１１０αおよびｐ１１０βは、Ｒａｓ−ＧＴＰと相互作用することが示されている（コダキら、１９９５年；ロドリゲス−ビシアナら、１９９４年および１９９６年）。この相互作用に必要とされる領域は、これらのＰＩ３Ｋ類のＡＡ１３３および３１４間に存在する（ロドリゲス−ビシアナら、１９９６年）。この領域におけるｐ１１０αおよびｐ１１０βとの配列保存性が比較的低いにもかかわらず（図１Ｃ）、ｐ１１０δはインビトロにおいてＧＴＰ−依存的にＲａｓと相互作用しないのであるから、ある種の一見重大なアミノ酸が保存されている（図２Ｃ）。ｐ１１０６はｒａｓに結合するが、ｒａｃまたはｒｈｏにはしないＧＳＴ−ｐ１１０δ／ｐ８５αのインキュベーションにより、ＧＴＰ−結合野生型ｒａｓまたは発癌性Ｖ１２−ｒａｓは保持されることが見出された（図２Ｃ）。これは、ＧＤＰ−付着ｒａｓまたは機能的に死んだｒａｓ突然変異体であるＡ３８−ｒａｓの場合には当てはまらない。ｐ１１０αの場合と同様、ｒｈｏおよびｒａｃの結合は全く立証され得なかった（データは記載せず）。ｐ１１０δのリピドキナーゼ活性Ｍｇ²⁺の存在下で試験すると、ｐ１１０δは、ＰｔｄＩｎｓ，ＰｔｄＩｎｓ４ＰおよびＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ₂を燐酸化することが見出された（図３Ａ）。ＨＰＬＣ分析により、これらの脂質はＤ３位が燐酸化されることが確認された（図３Ｂ）。インビトロでの基質優先順位は、ＰｔｄＩｎｓ＞ＰｔｄＩｎｓ４Ｐ＞ＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ₂であった（データは記載せず）。Ｍｇ²⁺の存在下よりもＭｎ²⁺の存在下の方がリピドキナーゼ活性は低かった（０．２５〜１６ミリモルの濃度範囲にわたって試験した；データは記載せず）。Ｓｆ９細胞から単離したｐ１１０δの比活性は、ｐ１１０αの場合よりも係数２−５の率で低かった（データは記載せず）。考え合わせると、これらのデータは、純粋なクラスＩＰＩ３Ｋとしてのｐ１１０δを確立するものである。ｐ１１０δは、ｐ８５を燐酸化しないが、自己燐酸化するｐ８５サブユニットは、ｐ１１０α触媒サブユニットによるＭｎ²⁺依存的燐酸化に関する基質であることが報告されている（カーペンターら、１９９３年；ダーンドら、１９９４年）。対照的に、ＧＳＴ−ｐ１１０δは、様々なインビトロ条件下で同時発現されたｐ８５α、ｐ８５βまたはｐ８５γを燐酸化しなかった（図４Ａに示された部分データ；Ｍｇ²⁺またはＭｎ²⁺のいずれの存在下でも活性は全く見られなかった）。ｐ８５γはＳＨ３ドメインを欠いており、ｐ１１０δ によるこの分子の燐酸化が存在しないということは、ｐ８５α／βＳＨ３ドメインとｐ１１０δプロリンリッチ領域との分子間相互作用によってｐ８５分子がロックされることにより、ｐ１１０δによる効果的な燐酸化が行われ得るという可能性に対する反証となる。ｐ１１０δが昆虫細胞におけるインビボ共発現中にｐ８５を既に完全に燐酸化してしまう余地を与えないようにするために、外来性精製ｐ８５αを固定化ＧＳＴ−ｐ１１０δに加えた。過剰のｐ８５を洗浄除去後、結合ｐ８５は、この場合もｐ１１０δによってではなくｐ１１０αによって、効果的に燐酸化されていることが見出された（データは記載せず）。８５αまたはｐ８５βとの複合体を形成している非標識ｐ１１０δをＭｎ²⁺の存在下でインビトロキナーゼアッセイにかけると、ｐ１１０δは自己燐酸化した（図４Ｂ。この活性が固定化ＧＳＴ−ｐ１１０δに大部分存在しないことに注意（図４Ｂ））。このような燐酸化はＰ１１０α／ｐ８５複合体には見られず、そこではまたもやｐ８５が燐酸化されていることが見出された（図４Ｂ）。ホスホアミノ酸分析は、ｐ１１０δ上の燐酸化がセリンで行われることを示した（図４Ｂ）。ｐ１１０ αによるｐ８５の燐酸化およびｐ１１０δの自己燐酸化は両方とも、主としてＭｎ²⁺依存的であり、Ｍｇ²⁺の存在下での燐酸化は非常に弱いものに過ぎないことが観察された（データは記載せず）。ｐ１１０δの自己燐酸化は、リピドキナーゼ活性の低化をもたらした。観察されたｐ１１０δの燐酸化が同時沈降したプロテインキナーゼによるものであるという可能性を排除するため、キナーゼ欠損ｐ１１０δ突然変異体を生成させた。これは、ｐ１１０δ中のアルギニン８９４をプロリンに変換することにより行われ、ｐ１１０δ−Ｒ８９４Ｐが生成した。突然変異したアルギニン残基は、プロテインキナーゼの場合と同様触媒ループの一部であると思われる、キナーゼドメインの保存されたＤＲＸ₃ＮＸ_12-13ＤＦＧモチーフに位置する（テイラーら、１９９２年；ツヴェレビルら、１９９６年）。ウシｐ１１０α（Ｒ９１６Ｐ）における類似した突然変異は、触媒活性を完全に破壊することが知られている（ダーンドら、１９９４年）。図４Ｃから明らかなように、昆虫細胞で発現されたｐ１１０δ−Ｒ８９４Ｐはもはやｐ１１０δの沈降物では燐酸化されず、このことは、後者が実際に自己燐酸化能力を有することを示す。同様に、リピドキナーゼ活性は、ｐ１１０６−Ｒ８９４Ｐにより失われることが見出された（データは記載せず）。我々は、ｐ１１０δの燐酸化形態に対するポリクローナル抗血清を製造した。Ｃ−末端ペプチド配列１０４４を、セリン残基１０３３で燐酸化し、ウサギの免疫化に使用した。燐酸化ペプチドに対する抗血清は、我々が、ｐ１１０δがインビボで燐酸化され、サイトカイン刺激時にこの燐酸化が強化されることを確立するのを可能にした（結果は記載せず）。ｐ１１０δ触媒活性の薬剤感受性ｐ１１０αおよびδリピドキナーゼ活性は、ウォルトマンニン（wortmannin）およびＬＹ２９４００２による阻害に対して類似した感受性を呈し（図５）、ＩＣ₅₀は５ｎＭ（ウォルトマンマニンの場合）および０．５μＭ（ＬＹ２９４００２の場合）であった。同様に、ｐ１１０δの自己燐酸化活性はまた、ナノモル範囲でウォルトマンマニンにより阻害された（データは記載せず）。ｐ１１０δの組織分布ヒト組織のポリＡ⁺ＲＮＡのノザーンブロット分析によりｐ１１０δの発現パターンを調べ、ｐ１１０αおよびｐ１１０βの場合と比較した。約６ｋｂの単一メッセンジャーｍＲＮＡ種は、白血球集団、すなわち脾臓、胸腺および特に末梢血白血球（最後のは白血球を全て含み、赤血球の大多数のみが除去されている）で特に高度に発現されることが見出された（図６）。若干のノザーンブロット実験の中には、ｐ１１０δに関する別の−５ｋｂメッセンジャーが観察される場合もあった（データは記載せず）。低レベルのｐ１１０δメッセンジャーＲＮＡの発現は検査された殆どの他の組織からも見出されたが、血液細胞汚染がこのｐ１１０δｍＲＮＡシグナルに関与しているという可能性を排除するのは困難である。ｐ１１０αおよびｐ１１０βもまた、検査されたほとんどの組織で発現されることが見出された（図６）。次いで、ｐ１１０αおよびδに特異的な抗体を用いて、蛋白質レベルでのこれらのＰＩ３Ｋの発現を検定した。異なるラット組織を試験すると、ｐ１１０δ抗体との反応性を示す１１０ｋＤａ蛋白質が脾臓および胸腺からは見出されたが、試験した他の組織のいずれからも見出されなかった（図７）。このパターンは上記ノザーンブロット分析のデータを大いに確認するものである。ｐ１１０６はまた、１次および形質転換白血球の両方においてそれらの分化段階とは無関係に存在することが見出された（図７）。１次血液細胞では、リンパ系および脊髄細胞集団はｐ１１０６に関して陽性であり、血小板の場合はそうではなかった（図７）。Ｔ（例えば、ジャーカット、ＨＰＢＡ１１）およびＢ（例えば、ラージ、ＨＦＢ１）細胞系両方ともｐ１１０δを発現していた（図７）。１１０ｋＤａのｐ１１０δは、ラット−１、ＮＩＨ３Ｔ３およびスイス３Ｔ３線維芽細胞、ＬＳ１７４ＴおよびＣＯＬＯ３２０ＨＳＲ結腸腺癌、Ａ４３１類表皮癌、ＥＣＣ−１子宮内膜癌腫およびＨＥｐ−２喉頭癌腫（図７）からもＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）、ＰＯＣ小細胞肺癌細胞系、ブタおよびウシ大動脈内皮細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８胸部腺癌、および１次ヒト筋肉および線維芽細胞からも見出されなかった（データは記載せず）。結論として、ｐ１１０δは白血球細胞において選択的に発現されると思われる。ｐ１１０δとは対照的に、ｐ１１０αは、白血球を含め、調査された組織および細胞系のほとんどで見出された（図７）。ＣＳＦ−１刺激マウスマクロファージへの抗ｐ１１０δポリクローナル抗体のマイクロインジェクションマウスマクロファージ細胞系、Ｂａｃｌに対するｐ１１０δおよびｐ１１０α に対する抗血清の一連のマイクロインジェクション実験により、さらにｐ１１０ δが有する機能を調べた。マイクインジェクション前に、Ｂａｃｌ細胞に２４時間ＣＳＦ１を枯渇させた。ＣＳＦ１枯渇は、細胞の***を開始させ、それに続いてＣＳＦ１に暴露されると運動性にする。アフィニティー精製抗ｐ１１０δポリクローナル抗体を、ＣＳＦ１枯渇Ｂａｃｌ細胞へマイクインジェクションした後、１０−１５分間ＣＳＦ１に暴露した。マイクインジェクションされたＢａｃｌ細胞は、細胞形態の著しい変化を示す。正常な細胞膜波うち運動は消失し、細胞質収縮が起こる。マイクインジェクションＢａｃｌ細胞の細胞骨格はファロイジン−ローダミンコンジュゲートを用いて可視化したが、図１０は、無秩序な細胞骨格配置を示すこのような細胞の代表的試料を示す。抗ｐ１１０αを注入しても、均等な効果は生じない。興味深いことに、優性−陰性（dominant-negative）小ＧＴＰ−結合蛋白質ｒａｃであるＮ１７ＲＡＣの発現により類似の表現型が示される。これは、ｐ１１０ δが、細胞骨格組織化および細胞運動性に関与し得る同一のシグナル伝達カスケードの一部であり得ることを示唆している。ｐ１１０δはサイトカインシグナル伝達に関与している白血球では、ｐ８５−結合性ＰＩ３Ｋは、サイトカインおよび補体レセプター類、インテグリン類、Ｆｃレセプター類、ＢおよびＴ細胞抗原レセプター類および例えばＣＤ２８のようなそれらの付属分子を介したシグナル伝達を含む多様なシグナル伝達事象に関与している（スティブンズらにより概説、１９９３年；フライ、１９９４年）。従って、多数のシグナル伝達プロセスがｐ１１０δに結びつく可能性があるのは明らかである。種々のｐ１１０が同じｐ８５アイソフォームと複合体を形成しているように見えた観察を前提にすると（図２Ｂ）、上述のシグナル伝達／レセプター複合体へのｐ１１０δの選択的カップリングが他のクラスＩＰＩ３Ｋをも含む細胞で起こるか否かは重大な疑問である。我々は、様々なタイプの白血球で機能的に作用している、サイトカインシグナル伝達の状況におけるこの重要な疑問を取り上げることにした。種々のファミリーのサイトカインが、共通のｇｐ１３０、βまたはγ鎖を共有する別々の種類のレセプター、または固有チロシンキナーゼ活性を伴うレセプターを介してシグナルを伝達する（タガおよびキシモトにおいて概説、１９９５年）。ｇｐ１３０を介するサイトカインシグナル伝達によるＰＩ３Ｋ活性化については報告されていないが、共通のβ鎖（例えば、ＩＬ３）、共通のγ鎖（例えば、ＩＬ４）またはチロシンキナーゼレセプター（幹細胞因子（ＳＣＦ）と結合するｃ−ｋｉｔのような）を介するサイトカインシグナル伝達に応答したｐ８５− 結合性ＰＩ３Ｋの活性化については立証されている（ワングら、１９９２年；ゴールドら、１９９４年）。我々は、サイトカイン依存性白血球細胞系において、ＩＬ３、ＩＬ４およびＳＣＦがｐ１１０δおよびｐ１１０αにカップリングする能力について調べた。刺激に使用されるサイトカインに特異的な同一パターンのホスホチロシン含有蛋白質が、ｐ１１０αおよびｐ１１０δ抗体と同時沈降することが見出された（図８、パネルａ）。ＩＬ−３およびＩＬ−４応答性Ｂａ／Ｆ３プレＢおよび骨髄前駆ＦＤ−６細胞系（図８Ａ；ＦＤ−６に関するデータは記載されていない）では、ＩＬ３−処置により、１００ｋＤａの未知蛋白質および７０ｋＤａ蛋白質チロシンホスファターゼであるＳＨＰ２のｐ１１０α／δＩＰにおける出現が誘導された（図８Ａ、パネルｂ）。ＩＬ４刺激時に同時沈降した１７０ｋＤａ蛋白質（図８Ａ、パネルａ）は、イムノブロッティングによりＩＲＳ−２、すなわちこれらの細胞におけるＩＬ４誘導燐酸化の主たる基質であることが示された（データは記載せず）。図８Ｂは、ＭＣ／９マスト細胞における同様の分析の結果を示す。ＳＣＦ刺激後、ｐ１１０αおよびｐ１１０δＩＰは両方とも、未同定の１００ｋＤａチロシン−燐酸化蛋白質およびｃ−ｋｉｔとして同定された１５０ｋＤａ蛋白質のＳＣＦレセプターを含んでいた（図８Ｂ、パネルａおよびｂ）。まとめて考えると、これらのデータは、ｐ１１０αおよびｐ１１０δが様々な活性化サイトカインレセプター複合体へのリクルートにおいて見かけ上の差異は全く示さないことを示している。さらに、ｐ８５−結合性ＰＩ３Ｋ類の少なくとも２構成員がサイトカインシグナル伝達に係わるということは、これらのサイトカインレセブターの下流のシグナル伝達経路が以前には認識されていなかった複雑さを有することを示している。マウスおよびヒト黒色腫細胞系におけるＰＩ３キナーゼｐ１１０サブユニットの発現ｐ１１０δの発現をさらに様々なマウスおよびヒト黒色腫細胞系で調べた。黒色腫特有の特徴は、この癌に伴う転移の攻撃的な性質である。マウスおよびヒト細胞系の領域におけるｐ１１０δ蛋白質の相対存在量を分析することにより、ｐ１１０δが転移に関与する可能性を調べた。ｐ１１０αおよびβならびにｐ１１０δのレベルの評価にウェスターンブロットを使用した。マウス細胞系Ｊ７７４を、マウスウエスタンブロットの陽性対照として用いた。新生児メラニン細胞をヒトウエスタンブロットに関する対照として使用した。表１は、ｐ１１０αおよびβがマウスおよびヒトの両起源の対照および黒色腫細胞系の両方で構成的に発現されることを示している。興味深いことに、マウス対照細胞系Ｊ７４４は、マウス黒色腫細胞系と比べてｐ１１０δの著しいレベル低下を示す。しかしながら、検出可能レベルのｐ１１０δは、ヒト新生児メラニン細胞から見出される。これは、これらのヒト対照細胞の性質により説明され得る。これらの対照細胞におけるｐ１１０δの発現は、ヒトの皮膚におけるこれらの細胞の比較的最近の遊走により説明され得るため、ｐ１１０δの残余レベルがこれらの細胞に存在し得る。成人のメラニン細胞は皮膚における長い滞留性を有し、ｐ１１０δのレベルはそれらの終末分化と相応した検出不可能なレベルに低減化され得る。我々は、ＰＩ３キナーゼファミリーの一部である新規なヒトｐ１１０サブユニット、ｐ１１０δについて記載してきた。ｐ１１０δは制限された発現パターンを示し、白血球集団および特に末梢血白血球においてのみ顕著なレベルに蓄積している。これらの細胞の運動性により、我々は、ＰＩ３キナーゼファミリーのこの構成員が細胞骨格再組織化を介して細胞運動性の調節に関与しうることを提案するに至った。マウスおよびヒト黒色腫細胞系に関するデータは興味深いが、ヒト黒色腫については確定的ではない。これは正常ヒトメラニン細胞およびヒト黒色腫の組織生検を用いることにより、解決されるであろう。表１マウス黒色腫におけるｐ１１０サブユニットの発現表１の続きヒト黒色腫におけるｐ１１０サブユニットの発現参考文献アントネッティ、Ｄ.Ａ．、アルゲンステッド、Ｐ．およびカーン、Ｃ．Ｒ．（１９９６）「インスリンレセプター基質Ｉは、筋肉および脳においてホスファチジルイノシトール３−キナーゼの調節サブユニットの２種の新規スプライス変異体に結合する。」モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー、１６、２１９５−２２０３。バーガリング、Ｂ．Ｍ．Ｔ．およびコファー、Ｐ．Ｊ．（１９９５）「ホスファチジルイノシトール−３−ＯＨキナーゼシグナル伝達におけるブロテインキナーゼＢ（ｃ−Ａｋｔ）」、ネイチャー、３７６、５９９−６０２。カーペンター、Ｃ．Ｃ．、オーガー、Ｋ．Ｒ．、ダックワース、Ｂ．Ｃ．、ホウ、Ｗ．−Ｍ．、シャフハウゼン、Ｂ．およびカントリー、Ｌ．Ｃ．（１９９３）「堅固に会合したセリン／スレオニンブロテインキナーゼは、ホスホイノシチド３−キナーゼ活性を調節する」、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー、１３、１６５７−１６６５。チュング、Ｊ．Ｋ．、グラマー、Ｔ．Ｃ．、レモン、Ｋ．Ｐ．、カズラウスカス、Ａ．およびブレニス、Ｊ．（１９９４）「ホスファチジルイノシトール−３ 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【手続補正書】【提出日】平成１１年２月３日（１９９９．２．３）【補正内容】請求の範囲１．図１に示すアミノ酸配列又はその相同体若しくはその類似体で示され、所望により少なくとも１個のアミノ酸残基が欠失、置換又は付加により修飾されてもよいＰＩ３キナーゼ活性を有する自己燐酸化ポリペプチドで、かつ、白血球および／または黒色腫中で選択的に発現されることを特徴とする自己燐酸化ポリペプチド、又は、その断片。２．ポリペプチドが少なくとも１個の哺乳類ｐ８５アダプターポリペブチドと会合する能力をもつ請求の範囲第１項記載のポリペブチド。３．ポリペプチドが３５〜４５％のプロリン含量をもつドメインで特徴づけられている請求の範囲第１又は２項に記載のポリペプチド。４．プロリンリッチドメインが理想的には図１に示すプロテインの配列データの２９２〜３１１位にあるか、均等なＰＩ３キナーゼ中の相同的／類似の部位であってもよい請求の範囲第３項に記載のポリペプチド。５．ポリペプチドが哺乳類由来のものであり、好ましくはヒト由来のものである請求の範囲第１〜４項のいずれかに記載のポリペプチド。６．請求の範囲第１〜５項のいずれかに記載のポリペプチドをコードする核酸。７．核酸の配列がｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡによるものである請求の範囲第６項記載の核酸。８．核酸がクローン化した組換え体ベクター中にある請求の範囲第６又は７項に記載の核酸。９．核酸またはその一部が、請求の範囲第１〜５項のいずれかに記載のポリペプチドの組換えによる発現に適しているものである請求の範囲第６〜８項のいずれかに記載の核酸。１０．請求の範囲第１〜５項のいずれかに記載のポリペプチドの全部またはその一部を組換えにより合成するための請求の範囲第８または９項記載の発明の構築物を用いてトランスフェクションあるいは形質転換した宿主細胞。１１．宿主細胞のセルラインが昆虫細胞系である請求の範囲第８項記載の宿主細胞系。１２．ｐ１１０αに対する抗体産生のための、請求の範囲第８又は９項に記載の組換え体から発現したポリペプチドまたは請求の範囲第１〜５項のいずれかに記載のポリペプチドの使用。１３．該抗体がモノクローナルである、請求の範囲第１２項記載の抗体またはその一部。１４．関連するポリペプチド並びに／またはそれをコードするｍＲＮＡおよび／若しくはｃＤＮＡのいずれかまたは両者の存在を検出・測定することからなる請求の範囲第１〜５項のいずれかに記載のポリペプチドの組織特異的な発現の同定方法。１５．ｃＤＮＡが本発明の核酸の少なくとも１個の選択された部分にハイブリダイズするに適した少なくとも２種の核酸分子プライマーを結合することからなる請求の範囲第１４項に記載の方法。１６．前記のプライマーを使用して、請求の範囲第６〜１１項のいずれかに記載の核酸の少なくとも一部を増幅または精製するための条件を提供することからなる請求の範囲第１４または１５項に記載の方法。１７．ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、免疫沈降または免疫蛍光を含む方法により、前記ポリペプチドを検出するために請求の範囲第１２または１３項に記載の抗体を使用することからなる請求の範囲第１４に記載の方法。１８．ポリペプチドをインビトロまたはインビボで調節作用をもつ可能性のある被検物にさらし、次いで該ポリペプチドのキナーゼ活性を観察することからなる請求の範囲第１〜５項のいずれかに記載のポリペプチドのキナーゼ活性の調節に有効な剤の同定方法。１９．潜在的拮抗剤をコンピューター化モデリングまたは従来の実験室的手法を使用してスクリーニングすることからなる請求の範囲第１８項に記載の方法。２０．請求の範囲第１〜５項のいずれかに記載のポリペプチドを発現する細胞において、潜在的拮抗剤にさらし、該細胞の運動性をモニターすることからなる請求の範囲第1８または１９項に記載の方法。２１．本発明のポリペプチドの活性の調節に有効な剤を含有してなる医薬または獣医薬組成物。２２．所望により希釈剤、担体または賦形剤を含有し、および／または単位用量形態である請求の範囲第２１項に記載の医薬または獣医薬組成物。２３．細胞の集団を請求の範囲第１〜４項のいずれかに記載のポリペプチドまたはその拮抗薬もしくはその作用薬にさらすことからなる細胞の運動性の制御方法。２４．細胞の運動性が、細胞を本発明のポリペプチドにさらすことにより増強される請求の範囲第２３項に記載の方法。２５．細胞の運動性の制御のための、請求の範囲第１〜５項のいずれかに記載のポリペプチドの活性のブロックに有効な剤の使用。２６．細胞の運動性増強のための、請求の範囲第１〜５項のいずれかに記載のポリペプチドの使用。２７．請求の範囲第６〜９項のいずれかに記載の核酸にハイブリダイズするに適したアンチセンスオリゴヌクレオチド。２８．該オリゴヌクレオチドが本明細書に記載のように修飾されている請求の範囲第２７項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。２９．請求の範囲第２７または２８項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有してなる医薬／獣医薬組成物。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 45/00 Ａ６１Ｋ 48/00 48/00 Ａ６１Ｐ 35/00 Ａ６１Ｐ 35/00 Ｃ０７Ｋ 16/40 Ｃ０７Ｋ 16/40 Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 9/12 Ｇ０１Ｎ 33/15 ＺＣ１２Ｑ 1/68 33/50 ＺＧ０１Ｎ 33/15 33/53 Ｄ 33/50 Ｃ１２Ｐ 21/08 33/53 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者マイケル・デレク・ウォーターフィールド英国ロンドン，Ｗ１Ｐ８ＢＴ，ライディング・ハウス・ストリート，91番，コートール・ビル，ルートヴィヒ・キャンサー・リサーチ

Claims

【特許請求の範囲】１．図１に示すアミノ酸配列又はその相同体若しくはその類似体で示され、所望により少なくとも１個のアミノ酸残基が欠失、置換又は付加により修飾されてもよいＰＩ３キナーゼ活性を有し、かつ、白血球および／または黒色腫中で選択的に発現性を示す自己燐酸化ポリペプチド、又は、その断片。２．ポリペプチドが少なくとも１個の哺乳類ｐ８５アダプターポリペプチドと会合する能力をもつ請求の範囲第１項記載のポリペプチド。３．ポリペプチドが３５〜４５％のプロリン含量をもつドメインで特徴づけられている請求の範囲第１又は２項に記載のポリペプチド。４．プロリンリッチドメインが理想的には図１に示すプロテインの配列データの２９２−３１１位にあるか、均等なＰＩ３キナーゼ中の相同的／類似の部位であってもよい請求の範囲第３項に記載のポリペプチド。５．ポリペプチドが哺乳類由来のものであり、好ましくはヒト由来のものである請求の範囲第１〜４項のいずれかに記載のポリペプチド。６．請求の範囲第１〜５項のいずれかに記載のポリペプチドをコードする核酸。７．核酸の配列がｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡによるものである請求の範囲第６項記載の核酸。８．核酸がクローン化した組換え体ベクター中にある請求の範囲第６又は７項に記載の核酸。９．核酸またはその一部が、請求の範囲第１〜５項のいずれかに記載のポリペプチドの組換えによる発現に適しているものである請求の範囲第６〜８項のいずれかに記載の核酸。１０．請求の範囲第１〜５項のいずれかに記載のポリペプチドの全部またはその一部を組換えにより合成するための請求の範囲第８または９項記載の発明の構築物を用いてトランスフェクションあるいは形質転換した宿主細胞。１１．宿主細胞のセルラインが昆虫細胞系である請求の範囲第８項記載の宿主細胞系。１２．ｐ１１０δに対する抗体産生のための、請求の範囲第８又は９項に記載の組換え体から発現したポリペプチドまたは請求の範囲第１〜５項のいずれかに記載のポリペプチドの使用。１３．該抗体がモノクローナルである、請求の範囲第１２項記載の抗体またはその一部。１４．関連するポリペプチド並びに／またはそれをコードするｍＲＮＡおよび／若しくはｃＤＮＡのいずれかまたは両者の存在を検出・測定することからなる請求の範囲第１〜５項のいずれかに記載のポリペプチドの組織特異的な発現の同定方法。１５．ｃＤＮＡが本発明の核酸の少なくとも１個の選択された部分にハイブリダイズするに適した少なくとも２種の核酸分子プライマーを結合することからなる請求の範囲第１４項に記載の方法。１６．前記のプライマーを使用して、請求の範囲第６〜１１項のいずれかに記載の核酸の少なくとも一部を増幅または精製するための条件を提供することからなる請求の範囲第１４または１５項に記載の方法。１７．ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、免疫沈降または免疫蛍光を含む方法により、前記ポリペプチドを検出するために請求の範囲第１２または１３項に記載の抗体を使用することからなる請求の範囲第１４に記載の方法。１８．ポリペプチドをインビトロまたはインビボで調節作用をもつ可能性のある被検物にさらし、次いで該ポリペプチドのキナーゼ活性を観察することからなる請求の範囲第１〜５項のいずれかに記載のポリペプチドのキナーゼ活性の調節に有効な剤の同定方法。１９．潜在的拮抗剤をコンピューター化モデリングまたは従来の実験室的手法を使用してスクリーニングすることからなる請求の範囲第１８項に記載の方法。２０．請求の範囲第１〜５項のいずれかに記載のポリペプチドを発現する細胞において、潜在的拮抗剤にさらし，該細胞の運動性をモニターすることからなる請求の範囲第１８または１９項に記載の方法。２１．本発明のポリペプチドの活性の調節に有効な剤を含有してなる医薬または獣医薬組成物。２２．所望により希釈剤、担体または賦形剤を含有し、および／または単位用量形態である請求の範囲第２１項に記載の医薬または獣医薬組成物。２３．細胞の集団を請求の範囲第１〜４項のいずれかに記載のポリペプチドまたはその拮抗薬もしくはその作用薬にさらすことからなる細胞の運動性の制御方法。２４．細胞の運動性が、細胞を本発明のポリペプチドにさらすことにより増強される請求の範囲第２３項に記載の方法。２５．細胞の運動性の制御のための、請求の範囲第１〜５項のいずれかに記載のポリペプチドの活性のブロックに有効な剤の使用。２６．細胞の運動性増強のための、請求の範囲第１〜５項のいずれかに記載のポリペプチドの使用。２７．請求の範囲第６〜９項のいずれかに記載の核酸にハイブリダイズするに適したアンチセンスオリゴヌクレオチド。２８．該オリゴヌクレオチドが本明細書に記載のように修飾されている請求の範囲第２７項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。２９．請求の範囲第２７または２８項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有してなる医薬／獣医薬組成物。