CN1220701A - 脂激酶 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及新脂激酶,它是PI3激酶家族的一部分。PI3激酶催化在肌醇中加入磷酸,产生肌醇单磷酸,二磷酸和三磷酸。已经暗示肌醇磷酸在调节细胞内发出信号级联中导致具有表达的变化,这种变化,在其它效应中可以导致细胞骨架的重排和调节细胞移动性。更具体地说,本发明涉及新型人PI3激酶,p110δ,它与p85反应,具有广泛的磷酸肌醇特异性,对与PI3激酶p110α相同的激酶抑制剂敏感。但是,与前面鉴定的修饰普遍表达方式的PI3激酶相反,p110δ选择性地在白细胞中表达。重要的是,p110δ在大多数测试的黑素瘤中显示增强的表达,所以在调节黑素瘤展示的移动特性中起重要作用。所以,鉴定增强或减弱p110δ活性的试剂可以阻止癌症的移动。

Description

脂激酶
本发明涉及属于PI3激酶(PI3K)家族的一部分的新脂激酶，更具体地说，特别涉及新脂激酶的各个方面，但不排外地涉及为了诊断或预测细胞的移动或入侵如癌细胞的转移对所述激酶的表达的鉴定；和为了增强、减弱或防止所述的移动或入侵以便分别增强或限制选定细胞的移动，从而干扰所述的表达或抑制所述激酶的试剂。
在同时审查中的专利申请WO93/21328中公开了酶的PI3激酶家族的总结。简言之，这类酶显示磷酸肌醇(下文中称为PI)3-激酶活性。根据细胞信息转导和细胞第二信使***方面知识的主要进展，已知PI3Ks在调节细胞功能方面起重要的作用。的确，已知的PI3Ks是处于正在增长数目的潜在信号蛋白的成员，这些信号蛋白与配体刺激或细胞转化激活的蛋白质-酪氨酸激酶相关。一旦这种相关成立，它们在细胞信号途径中提供重要的复合物，并朝着得出的结论发展。
PI3激酶催化在肌醇脂的肌醇环的3’-OH位置加入磷酸，产生单磷酸磷脂酰肌醇，二磷酸磷脂酰肌醇和三磷酸磷脂酰肌醇(Whitman等人，1988,Stephens等人1989和1991)。在有机物如各种各样的植物，粘质霉菌，酵母，果蝇和哺乳动物中已经鉴定了PI3激酶家族(Zvelebil等人，1996)。
在体内不同的PI3激酶产生不同的3’-磷酸肌醇脂。根据它们体外的脂底物的特异性可以区分三类PI3激酶。第一类酶具有广谱底物特异性，并且磷酸化Ptdlns,Ptdlns(4)P和Ptdlns(4,5)P2。第一类PI3激酶包括哺乳动物的p110α,p110β和p110γ(Hiles等人，1992；Hu等人，1993；Stephens等人，1994；Stoyanov等人，1995)。
p110α和p110β是密切相关的PI3激酶，它们与p85受体蛋白和结合GTP的Ras反应。
已经克隆了两个85千道尔顿(kDa)的亚基，p85α和p85β(Otsu等人，1992)。这些分子含有N-末端src同源-3(SH3)区，与两个富脯氨酸区侧接的断点簇(bcr)同源区和两个src同源-2(SH2)区。从p85α基因替代拼接产生或由不同于p85α/β的基因编码的缩短的p85蛋白质，都缺乏SH3区和bcr区，它们似乎是被独特的短N-末端所替代(Pons等人，1995；Inukai等人，1996；Antonetti等人，1996)。存在于所有p85分子中的SH2区，提供了具有与各种受体和其它细胞蛋白上的磷酸化酪氨酸残基反应的能力的杂二聚体p85/p110PI3Ks。与p110α和β相反，p110γ与p85不反应，而与p101受体蛋白结合(Stephens等人，1996)。p110γ的活性受到G蛋白亚基的刺激。
第二类PI3Ks含有至少在体外磷酸化Ptdlns和Ptdlns(4)P而不是Ptdlns(4,5)P2的酶(MacDougall等人，1995；Virbasius等人，1996，Molz等人，1996)。这些PI3Ks在C末端都含有C2区。第二类PI3Ks在体内作用仍未知。
第三类PI3K具有限制Ptdlns的底物特异性。这些PI3Ks与酵母Vps34P同源，Vps34P在酵母中参与了新形成的蛋白质从高尔基体运输到空泡，哺乳动物溶酶体的等当量(Stack等人，1995)。酵母和哺乳动物Vps34p存在于与Vps15p,150千道尔顿蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶的复合物中(Stack等人，1995；Volinia等人，1995；Panaretou等人，已提交并公开)。
Ptdlns(3)P作为构成物质存在于细胞中，它的水平在细胞外刺激下，很大程度上不改变。相反，Ptdlns(3,4)P2和Ptdlns(3,4,5)P3在休眠细胞中几乎不存在，但在各种生长因子的刺激下快速产生，暗示了很可能有第二信使的功能(Stephens等人，1993)。细胞生理中PI3Ks和它们的磷酸化脂的作用刚刚开始被理解。这些脂可以完成双重作用：除了发挥物理作用，在脂双层的弯曲部分有传递电荷的作用，它们同时具有与特异结合蛋白反应和调节它们的定位环境/或活性的能力。其中，这些脂的潜在的靶是蛋白质激酶如蛋白质激酶C同工型，蛋白质激酶N/Rho激活激酶和Akt/RAC/蛋白质激酶B(Toker等人，1994；Palmer等，1995；Burgering和Coffer,1995；Franke等人，1995；James等人，1996；Klippel等人，1996)。Akt/RAC/蛋白质激酶B似乎是在靶如p70 S6激酶和糖原合成酶激酶-3的上游(Chung等人，1994；Cross等人，1995)。PI3Ks同时通过调节核苷酸交换影响小GTP结合蛋白如Rac和Rab5的活性(Hawkins等人，1995；Li等人，1996)。最终，这些作用的联合可以引起细胞骨架的重排，DNA合成/有丝***，细胞生存和分化(Vanhaeseroeck等人，1996)。
本发明描述了哺乳动物新第一类PI3激酶，已经命名为p110δ。这一新PI3激酶是第一类PI3激酶家族的典型，因为它与p85α,p85β和p85γ结合。另外，它也与GTP-ras结合，但如p110α，不与rho和rac结合。它同时拥有与p110α和p110β同样的GTP广谱的磷酸肌醇脂底物特异性，它同时展示了蛋白质激酶活性和与p110α相似的药物敏感性。
但是，它的特点是组织分布的选择性。与普遍表达的p110α和p110β相反，p110δ在血液中白细胞群体中，如脾，胸腺，特别是外周血白细胞中表达特别高。除这一发现外，同时还发现p110δ在大多数黑素瘤中表达，但不是在任何黑素细胞中，黑素瘤的正常细胞对应物中。已知展示移动或入侵的组织中的p110δ的自然分布和p110δ在癌细胞中的表达，我们认为p110δ在细胞移动或入侵中起作用，所以这一脂激酶在癌细胞中的表达可以解释癌细胞的转移行为。
p110δ的另一个特点是它以依赖于Mn2+的方式自身磷酸化的能力。确实，已经显示自身磷酸化趋向于妨碍蛋白质脂激酶的活性。另外，p110δ含有独特的潜在蛋白：蛋白质反应元件，含有富脯氨酸区(如图1所示，位置292-311，其中20个氨基酸中的8个是脯氨酸)和亮氨酸拉链状区的碱性区(bZIP)(Ing等人，1994和Hirai等人，1996)。结合p85的PI3激酶之间的生化和结构的差异表示它们可以在体内完成独特的功能作用和/或受到特异地调节。
本发明公开了有关p110δ的人类起源的核酸分子和相应的氨基酸序列数据。利用这一信息，可以确定在各种组织类型中p110δ的表达，特别是确定它在癌组织中的表达，目的是诊断这样的组织的移动或入侵，预测潜在的次级肿瘤的发生。另外，同时可以提供妨碍p110δ的表达或选择性地干扰它的功能的试剂。例如，考虑本发明提供的序列资料，可以提供防止p110δ的表达的反义物质。
如上所述，本发明包括反义低聚核苷酸，它选择性地与编码PI3Kδ蛋白质的核酸分子结合，降低PI3Kδ基因的转录和/或翻译。在任何医疗条件下，需要减弱PI3Kδ基因产物的表达，包括减弱任何归因于PI3Kδ基因表达的肿瘤细胞表现型方面。以这种方式，反义分子可以用于减慢或终止肿瘤细胞表现型的这些方面。
如本发明所用，术语“反义低聚核苷酸”或“反义”描述了低聚核苷酸，即低聚核糖核苷酸，低聚脱氧核糖核苷酸，修饰的低聚核糖核苷酸，或修饰的低聚脱氧核糖核苷酸，它在生理条件下与含有特殊基因的DNA或与该基因的mRNA转录物杂交，从而抑制基因的转录和/或mRNA的翻译。设计反义分子使它在与靶基因杂交后干扰靶基因的转录或翻译。本领域普通技术人员能够识别反义低聚核苷酸的准确长度和它与靶的互补程度将取决于选定的特异靶，包括靶的序列和构成该序列的特殊碱基。优选的是反义低聚核苷酸的结构和排列，使它在生理条件下与靶选择性地结合，即在生理条件下在靶细胞中与靶序列杂交而不是任何其它序列。在如图9所示的DNA序列、等位的或同源的基因组的和/或DNA序列基础上，本领域的技术人员可以容易地选择和合成许多用于本发明的适当的反义分子中的任何一个。为了进行有效地选择和强有力地抑制，应该包括至少7个这种反义低聚核苷酸(Wagner等人，《自然生物技术》14:840-844,1996)，更优选地，至少15个与靶互补的连续的碱基。最优选地，反义低聚核苷酸含有20～30个碱基的互补序列。虽然可以选择与该基因或mRNA转录物的任何区域反义的低聚核苷酸，但是，优选的实施例中，反义低聚核苷酸对应于N-末端或5’上游位点如翻译起始，转录起始或启动子位点。另外，3’-未翻译区可以是靶。本领域同时可以使用mRNA拼接位点，但如果存在可替代的mRNA拼接，这不是本发明优选的。另外，优选地，反义靶击不存在mRNA次级结构(参见如Sainio等人，《细胞分子神经生物学》14(5):439-457,1994)并且没有结合蛋白质的位点。最后，虽然图9公开了cDNA序列，本领域普通技术人员能够容易地发现对应于图9的cDNA的基因组DNA。所以，本发明同时提供了与对应于图9的基因组DNA互补的反义低聚核苷酸。同样，不需要过度实验也可提供等位的或同源的DNAs和基因组DNAs的反义序列。
在一系列实施例中，本发明的反义低聚核苷酸可以由“自然”脱氧核糖核苷酸，核糖核苷酸，或任何它们的联合组成。因为在自然***中，通过核苷酸间磷酸二酯键合，自然核苷酸的5’末端和另一个自然核苷酸的3’末端可以共价连接。通过技术识别的方法可以制备这些低聚核苷酸，这些方法可以人工或通过自动合成仪进行。它们同时可以通过载体重组地产生。
但是，在优选的实施例中，本发明的反义低聚核苷酸也可以包括“修饰”低聚核苷酸。因为低聚核苷酸可以许多方式修饰，而不阻止它们与靶的杂交，而增强它们的稳定性或靶击性，或增强它们的治疗效果。
如本发明所用，术语“修饰低聚核苷酸”描述了这样的低聚核苷酸，其中(1)至少两个核苷酸通过合成的核苷酸间键合共价连接(即，除了核苷酸5’末端和另一个核苷酸的3’末端之间的磷酸二酯键外的键)和/或(2)与核酸不正常连接的化学基团已经共价地附着于低聚核苷酸上。优选的合成核苷酸间键是硫代磷酸酯，烷基磷酸酯，磷酸二硫代酯，磷酸酯，烷基硫代磷酸酯，磷酸酰胺，氨基甲酸酯，磷酸三酯，乙酰胺，肽和羧基甲基酯。
术语“修饰的低聚核苷酸”也包括含有共价修饰碱基和/或糖的低聚核苷酸。例如，修饰低聚核苷酸包括含有糖主链的低聚核苷酸，它们共价地附着于除了3’位置的羟基基团和5’位置的磷酸基团以外的低分子量的有机基团。这样修饰的低聚核苷酸可以包括2’-0-烷基化核糖基团。另外，修饰的低聚核苷酸可以包括如***糖的糖而不是核糖。修饰低聚核苷酸也可以包括碱基类似物，如C-5丙炔修饰碱基(Wagner等人，《自然生物技术》14:840-844,1996)。所以，本发明主要是含有修饰反义分子的药物制剂，它们在生理条件下与编码PI3Kδ蛋白质的核酸互补并杂交，以及药学可接受的载体。
反义低聚核苷酸可以作为部分药学成份给药。这样的药学成份可以包括与本领域已知的生理标准的和/或药学可接受的载体结合的反义低聚核苷酸。该成份应该是灭菌的并含有适于对病人给药的重量或体积单位的治疗有效量的反义核苷酸。术语“药学可接受”指不干扰活性成份的生物学活性的效果的非毒性物质。术语“生理可接受”指与生物学***如细胞，细胞培养物，组织或有机物相容的非毒性物质。载体的特点将取决于给药的途径。生理和药学可接受的载体包括稀释剂，填充剂，盐，缓冲液，稳定剂，增溶剂，和本领域已知的其它物质。
所以本发明的一个目的是鉴定新PI3激酶，以便提供预测细胞可能的移动或入侵的方法。
本发明的另一个目的是提供增强、减弱或防止p110δ的表达的试剂和/或干扰p110δ的功能的试剂，目的是分别增强、妨碍或阻止细胞的移动或入侵。
根据本发明的目的，提供了具有PI3激酶活性的分离的自身磷酸化的多肽。
所述多肽起源于血液中白细胞，并且典型地在黑素瘤中表达，所述的多肽更多是起源于人的。
另外，该多肽能够与哺乳动物的PI3激酶的p85亚基结合以便产生激活复合物。
更优选地是该多肽含有图1A显示的氨基酸序列或其同源序列，它的特点是有一个富脯氨酸区。
本发明中术语“同源”是覆盖相似特性或同样遗传特征的物质或具有那些本发明所述的特征的物质，这些特征可以在严格条件下鉴定，相应的核酸分子如图9显示的核酸分子杂交的蛋白质或物质。通常杂交条件包括50％甲酰胺，5×SSPE,5×Denhardts溶液，0.2％SDS,200微克/毫升变性的超声处理的鲱鱼***DNA和200微克/毫升酵母RNA，温度60℃(公开专利说明书WO93/21328中描述的条件)。
利用重组技术生产多肽，该多肽通常是起源于人的。
根据本发明的目的，提供了至少是本发明的多肽的一部分的抗体，该抗体可以是多克隆或单克隆的。
根据本发明的目的，提供了图9所示的核酸分子的全部或一部分，该分子编码具有PI3激酶活性的自身磷酸化多肽。
在提供了所述分子部分的情况下，将根据目的选择该部分，例如，选择具有激酶活性的部分用于随后使用的部分或最适于抗体产生的另一部分。
根据本发明的目的，提供了核酸构建体，该构建体含有本发明的核酸分子的全部或部分，其中后来的核酸分子是在控制序列的控制下和适当的读码框架中，以保证相应的蛋白质的表达。
根据本发明的目的，已经提供了利用本发明的构建体转化的宿主细胞，以便含有图9所示的核酸分子的全部或一部分，允许表达相应的多肽的全部或有意义部分。
这些宿主细胞是真核生物细胞，例如，昆虫细胞如来自利用杆状病毒病毒***的Spodoptera frugiperda种类的细胞。这一表达***在需要翻译后修饰的情况下是有益的。如果不需要这样的修饰，可以使用原核***。
根据本发明的目的，提供了诊断细胞移动的方法，包括检测所述细胞的样品中本发明多肽的表达。
进行研究后确定是否对应于本发明的多肽的mRNA在所述的细胞中表达，例如，通过利用PCR技术或Northern影印分析。为了鉴定所述的表达，可以使用任何其它常规技术。
根据本发明的目的，提供了鉴定有效地阻止本发明的多肽的活性的拮抗物的方法，包括利用本发明的多肽或其片断筛选这样活性的候选分子。
筛选可以包括人工技术如计算机辅助技术或常规实验室技术。
通过将已知天然地或通过转染表达本发明的多肽的细胞与适当的拮抗物接触，然后检测细胞的移动进行上面的方法。
本发明的方法可以包括竞争性结合测试，以便鉴定与本发明的多肽选择性地和理想地不可逆地结合的试剂。
根据本发明的目的，提供了有效地增强或阻止本发明的多肽的活性或表达的试剂的药学或兽医学成份，该成份已经配制用于药学或兽医学用途并且可选择地包括稀释剂，载体或赋形剂和/或是单位剂量形式。
根据本发明的目的，提供了控制细胞移动的方法，包括将所述细胞群体与拮抗剂或拮抗物或本发明的多肽接触，或与本发明的反义物质接触。
在所述的方法中，可以将细胞可替代地或另外地与本发明的多肽接触，为了增强多肽的有效水平，因此增加细胞的移动。
所述方法可以在体内或体外进行。
根据本发明的目的，提供了一种可有效地阻止本发明多肽的活性的试剂，用于控制细胞的移动性。
根据本发明的目的，提供了用于增强细胞的移动性多肽。
根据本发明的目的，提供修饰的反义低聚核苷酸，用于与本发明的核酸杂交。
下面参照附图，材料和方法，对本发明实施例进行详细描述，其中：
图1A显示了人p110δcDNA的已翻译的氨基酸序列。分别用开放和阴影盒表示富脯氨酸区和bZIP状区。图1Bp110δ与p110α和p110β的全长氨基酸序列的点图比较。将非保守序列基序底下划线。利用COMPARE程序进行点图比较(UWGCG包装：Devereux等人，1984)。图1C将与HR3侧接的p110δ氨基酸序列与p110α和p110β的同源区比较。氨基酸编号是p110δ。富脯氨酸区：用星指出了能够在p110δ中形成左旋多聚脯氨酸Ⅱ型螺旋的重要的脯氨酸。bZIP区：用箭头指出了亮氨酸拉链区的保留L/V/I残基。
图2为p110δ与p85和Ras的反应(A)单独用编码GST-p110δ的重组杆状病毒或与编码p85α,β或γ的病毒联合感染昆虫细胞。2天后，利用谷胱苷肽-琼脂糖从细胞溶菌物中亲和纯化GST-p110δ，洗涤，通过SDS-PAGE分析，并用考马斯蓝(Coomassie)染色。(B)从500微克人嗜中性细胞溶胶中免疫沉淀p110δ，并通过Western影印探测不同的p85同工型的存在，从Sf9细胞纯化rec=重组p85。(C)将GST-p110α/85α和GST-p110δ/85α(0.25微克)与指定量(微克)的GTP-或GDP-加载的V12-Ras一起温育，洗涤，利用所述的Western影印探测Ras的存在(Rodriguez-Viciana等人，1994,1996)。
图3A为体外p110δ的脂底物特异性。利用指定的底物在存在Mg2+时将GST-p110δ/p85α用于脂激酶测试。起点为同等的cpm点。图3B通过对GST-p110δ/p85α产生的Ptdlns磷酸化产物的HPLC分析，显示了p110δ(实线)的脱酰产物，甘油磷酸肌醇-3P和甘油磷酸肌醇-4P标准(点线)的洗脱时间。箭头指出了AMP和ADP控制的位置。
图4为p110δ的蛋白质激酶活性。(A)当存在Mn2+时，对在与指定的p85亚基的复合物中的GST-p110α或GST-p110δ进行体外蛋白质激酶反应，通过SDS-PAGE进一步分析，考马斯蓝染色和放射自显影，(B,C)对在PDGF受体磷酸肽珠上与p85α或β的复合物中的未标记的p110α和p110δ[野生型(WT)或激酶缺陷突变体(p110α-R916P和p110δ-R894P)]进行体外激酶反应和进一步如(A)所述分析。开放和关闭的箭头分别指p110和p85蛋白质。(B)中右边的组：p85α和p110δ的磷酸氨基酸分析。
图5为p110δ脂激酶活性对药物的敏感性。在缺乏渥曼青霉素(Wortmannin drug)时使p110δ/p85α(关闭的圆环)和p110α/p85α(开放的圆环)对活性的抑制正常化。这些数据点是3个实验的平均(±SE)。
图6为p110α,p110β和p110δ的表达的Northern影印分析。
图7为p110α和p110δ蛋白质表达的分析。每道中加载100微克总细胞溶菌物。在材料和方法中叙述的溶解缓冲液或含有2-巯基乙醇的Laemmli凝胶加载缓冲液中溶解血小板。PMBC(外周血液单核细胞)；PBL(外周血液淋巴细胞)。
图8为p110α和p110δ参与细胞因子发出信号。利用指定的细胞因子刺激Ba/F3(A)和MC/9(B)细胞系。来自对照未处理细胞的样品用Con标记。通过SDS-PAGE分离总的细胞溶菌物和p110α和p110δIPs以便制备重复的影印，参考是p110δ/85α(组a,b和d)或p110α/85α(组c和e)。利用4G10(抗-PTyr，组a)和抗p110α(组c)进行自然影印的免疫影印。影印随后剥离，用抗SHP2(A，组b)，抗kit(B，组b)，抗p110δ(组d)和抗p85抗体(组e)再探测。箭头指出了p170(IRS-2),p100和p70(SHP2)(A，组a)，和p150(c-kit)和p100(B，组b)的位置。
图9A～图9C为人的p110δ的cDNA序列。
图10表示用p110δ的亲和纯化抗体微注射的鼠巨嗜细胞的免疫荧光图像。用鬼笔环肽共轭的若丹明将巨嗜细胞骨架成像。
材料和方法
克隆p110δ
已经描述了小牛p110α和S.cerevisiae Vps34p之间的同源区基础上，通过RT-PCR，分离部分PI3激酶cDNA克隆的详细情况(Volinia等人，1995:MacDougall等人，1996)。通过这一途径从MOLT4细胞系产生了部分p110δcDNA片断，随后用于筛选低聚(dT)-引物U937 cDNA文库(Volinia等人，1995)。将互补的DNA EcoRⅠ-XhoⅠ克隆进用EcoRⅠ-XhoⅠ(Stratagene)消化的λZAPⅡ载体。在4百万个筛选的克隆中，发现6个开始时阳性噬菌斑，其中的3个在另外两轮筛选中仍然显示阳性。根据制造商(Stratagene)指导，通过体外切除制备pBluescript中的cDNA***。通过限制图谱和PCR鉴定***性的pBluescript克隆(05.1,09.1和011.1)，发现含有范围从4.4kb(011.1)到5.0kb(05.1,09.1)的***片断。将克隆09.1用于详细的鉴定。从它的***的选择图谱发现缺乏内部XhoⅠ位点，和存在2个内部EcoRⅠ位点，分别在离EcoRⅠcDNA***位点的223和3862个核苷酸(核苷酸1=图9的下面划线的核苷酸)。结果是，EcoRⅠ和XhoⅠ联合消化并将09.1***分成3个片断，进一步指出是EcoRⅠ片断Ⅰ(核苷酸1-222)，EcoRⅠ片断Ⅱ(核苷酸223-3861)和EcoRⅠ-XhoⅠ片断Ⅲ(大约核苷酸3862-5000)。利用Taq DyeDeoxy终止子循环测序***(ABI)对片断Ⅰ和Ⅱ的两条链测序，图9显示了完整的cDNA序列。发现了09.1***中跨越核苷酸195到3330的开放读码框架。框架中终止密码在位于有利于翻译起始的部分的潜在的起始密码之前(Kozak,1991)。产生了196个核苷酸的5’未翻译区(UT)和约2.2kb的3’UT。在测序的05.1,09.1和011.1克隆的5’末端，发现2个不同但相关的未翻译区，指出了存在至少两个不完全相同的信使RNAs。
构建p110δ的表达载体
所用的昆虫细胞转移载体是pVL1393(在Vitrogen中用于未标记的p110δ)和pAcG3X(GST-p110δ；Davies等人，1993)。在两个步骤中将p110δ的编码区亚克隆进这些载体。首先，通过接头将表达载体***在多克隆位点，以便含有p110δ的EcoRⅠ片断的部分序列，跨越起始密码(在核苷酸197；参见上面)到第二个EcoRⅠ位点(核苷酸223；参见上面)。在后者的EcoRⅠ位点中，亚克隆p110δ的EcoRⅠ片断Ⅱ，接着选择含有准确定向***的克隆。昆虫细胞载体的第一步是用BamHⅠ-EcoRⅠ切割，接着***下面的接头(接头Ⅰ)：GATCCCCACCATGCCCCCTGGGGTGGACTGCCCCATGG(有意义：5’-3’)(反义：5’-3’)AATTCCATGGGGCAGTCCACCCCAGGGGGCATGGTGGG
这一接头含有ATG与最适Kozak同感序列(Kozak1991)。进而，利用Vent DNA聚合酶(新英格兰实验室)，通过PCR制备p110δ的衍生物。从此将亚克隆进pBluescript-SK的p110δEcoRⅠ片断Ⅱ(进一步表示为pBluescript-p110δ-EcoⅡ)用作模板。在这些PCR反应中，除去了EcoRⅠ片断Ⅱ***的3’未翻译区，用于产生突变R894P的低聚核苷酸如下：有意义的突变低聚核苷酸=PRIMER1(下面划线的突变残基)=5’-GTGTGGCCACATATGTGCTGGGCATTGGCGATCCGCACAGCGACAACATCATGATCCG，反义=PRIMER 2=5’-GGCCCGGTGCTCGAGAATTCTACTGCCTGTTGTCTTTGGACACGTTGTGGGCC
利用引物2和有意义引物(PRIMER 3=5’-GTGTGGCCACATATGTGCTGGGCATTGGCG)进行平行的PCR，留下完整的野生型p110δ序列。利用NdeⅠ和XhoⅠ切割所有的PCR产物，亚克隆进而打开了NdeⅠ-XhoⅠ的pBluescript-p110δ-EcoⅡ并测序。然后将正确的克隆作为EcoRⅠ盒转移进入含有接头Ⅰ的打开EcoRⅠ的pVL1393，接着选择含有准确定向的***的克隆。
在昆虫细胞中表达p110δ
利用Lipofectin试剂(Gibco)与BaculoGold DNA(Pharmingen，圣迭戈，CA)共转染质粒DNA。分离重组噬菌斑，用确定的方法鉴定(Summers和Smith,1987)。
细胞培养物
将细胞在潮湿的5％CO2温育器中培养，用10％小牛胎盘血清，20微摩尔/升的2-巯基乙醇，100单位/毫升青霉素/链霉素，2毫摩尔/升谷氨酸补充的PRMI 1640培养基中。Ba/F3是依赖于鼠IL3的pre-B细胞系(Palacios和Steinmetz,1985)，MC/9是依赖于鼠IL3的肥大细胞系(Nabel等人，1981)。将Ba/F3和MC/9生长在起源于作为鼠IL3的来源的WEHI3B的10％(v/v)培养基中。FDMAC11/4.6(FD-6)骨髓始祖细胞是FDMAC11的原始突变体，它将在应答IL4以及IL3,GM-CSF和CSF-1中生长(Welham等人，1994a)。将这些细胞在3％(v/v)起源于AgX63/OMIL4细胞的IL4条件培养基(Karasuyama和Melchers,1988)生长。
脂激酶测试
基本上如Whitman等人(1985)所述进行脂激酶测试。脂激酶测试缓冲液是20毫摩尔/升Tris HCl,pH7.4,100毫摩尔/升NaCl和0.5毫摩尔/升EGTA。从希格玛购买脂。测试中ATP和Mg2+的最后浓度通常分别是0.5和3.5毫摩尔/升。而使用的脂的浓度是0.2～0.4毫摩尔/升。除非另有说明，激酶反应在37℃下，10分钟。用于反应产物的TLC分离的溶剂是丙烷-1-ol/2摩尔/升乙酸/5摩尔/升H3PO4(65∶35∶1)。利用Ptdlns作为底物，在40微摩尔/升ATP(最后)存在时，25℃下，进行药物对激酶的影响的测试10分钟。所有试管含有1％DMSO。通过对TLC分离的脂产物进行磷光成像(分子动力学)分析定量活性。
HPLC分析
将通过重组p110α磷酸化Ptdlns制备的[32P]-Ptdlns3P，和通过在0.5％NP-40存在时用A431膜转换Ptdlns产生的[32P]-Ptdlns4P用作标准。通过PartisphereSAX柱(Whatman国际标准)上的离子交换HPLC，利用1摩尔/升(NH4)2HPO4对水(0～25％B；60分钟)的线性梯度，以1毫升/分钟的速度洗脱分离用甲胺脱酰脂产生的甘油磷酸肌醇。通过在线检测器(Reeve Analytical,Glasgow)检测放射活性高峰。通过在254纳米的吸光值检测作为内部对照加入的ADP和ATP核苷酸标准以保证各道之间的一致性。
体外蛋白质磷酸化测试和对脂激酶活性的影响
将沉淀的蛋白质在37℃，在蛋白质激酶测试缓冲液(20毫摩尔/升Tris.HCl(pH7.4),100毫摩尔/升NaCl,0.5毫摩尔/升EGTA,50微摩尔/升ATP和1毫摩尔/升MnCl2.4H2O,5-10微居里[γ-32P]ATP/毫升)中温育30分钟。通过加入SDS-PAGE样品缓冲液终止反应。通过SDS-PAGE和放射自显影分析反应产物。在如所述的(Jelinek和Weber,1993)Hunter薄层电泳***(CBS科学公司，Del Mar,CA)上进行磷酸氨基酸分析。
小GTP-结合蛋白与PI-3K的体外反应
如所述(Rodriguez-Viciana等人，1995,1996)进行ras,rac和rho与GST-PI3K的结合。
抗体，免疫沉淀和免疫影印
已经叙述过小牛p85α(U1,U13)和p85β(T15)的单克隆抗体(End等人，Reif等人，1993)。在我们的实验室开发了抗小牛p85γ的单克隆抗体(Ⅰ2)。伦敦大学学院的P.Shepherd博士提供了抗GST-人p85α(AA5-321)的兔多克隆抗血清。产生了抗p110δ的C末端肽(C)KVNWLAHNVSKDNRQ1044和抗人p110α的N-末端肽(CGG)SVTQEAEEREEFFDETRR88的兔多克隆抗血清。为了产生直接抗p110δ的磷酸化形式的抗体，在肽合成过程中在丝氨酸残基上磷酸化肽序列1044。Roya Hooshmand-Rad博士(瑞士，Uppsala,Ludwig癌症研究院)提供了人p110α的C末端(KMDWIFHTIKQHALN)的抗血清。在与Acti凝胶(SterogeneBioseparations,Arcadia,CA)或AF-氨基-ToyoPearl TSK凝胶(Tosho公司，日本)偶联的肽上亲和纯化抗体。发现抗体对它们特异的PI3K是有特异性的(对下面在Sf9细胞中表达的PI-3K的组测试：小牛p110α，人p110β(C.Panaretou和R.S.；未公开的结果)，人p110γ(Stoyanov等人，1995),p110δ，PI-特异3-激酶(Volinia等人，1995)。在非可(Ficoll)梯度中纯化外周血液细胞(Lymphoprep；Nycomed,Oslo，挪威)。通过所述的超声波处理(Wienties等人，1993)制备嗜中性细胞溶胶。溶解缓冲液是1％Triton-X100，150毫摩尔/升NaCl，1毫摩尔/升EDTA，1毫摩尔/升NaF，1毫摩尔/升NaVO3，1毫摩尔/升DTT，1毫摩尔/升PMSF，0.27TIU/毫升抑酶肽和10微摩尔/升的亮抑酶肽。在一些实验中，加入1毫摩尔/升二丙基氟磷酸和27毫摩尔/升的Na-p-甲苯磺酰-L-赖氨酸氯甲基酮(盐酸盐)。用于细胞因子实验的溶解缓冲液是50毫摩尔Tris.HCl,pH7.5,10％(v/v)甘油，1％(v/v)NP-40,150毫摩尔/升NaCl,100微摩尔/升钼酸钠，500微摩尔/升氟化钠，100微摩尔/升正钒酸钠，1毫摩尔/升EDTA,40微克/毫升PMSF,10微克/毫升抑酶肽，10微克/毫升亮抑酶肽，0.7微克/毫升抑胃酶肽，1毫摩尔/升DIFP，1毫摩尔/升TLCK。如上所述(Welham和Schrader,1992)在2×107个细胞/毫升时沉淀和溶解细胞因子刺激细胞，除在进一步分析之前，使溶菌物在4℃，在微量溶化microfuge中澄清5分钟。如上所述(Welham等人，1994a)进行免疫沉淀，根据制造商的说明，PDGF-受体肽(YpVPMLG)与Acti凝胶偶联。将p110δ的C末端抗血清用于免疫沉淀和免疫影印。对于p110α，将C和N末端抗血清分别用于免疫沉淀和Western影印分析。
如上所述(Laemmli,1970；Welham和Schrader,1992；Welham等人，1994a)进行SDS-PAGE和免疫影印。将下面浓度的抗体用于免疫影印：0.1微克/毫升的抗磷酸酪氨酸单克隆抗体4G10；0.25微克/毫升的抗p110α和p110δ；1∶4000的抗p85；0.4微克/毫升的抗-c-kit(Santa Cruz生物技术，sc-168)，0.1微克/毫升的抗SHP(Santa Cruz生物技术，sc-280)和1∶1000的抗IRS-2(M.White博士，Joslin Diabetes中心，Boston,MA，赠送)。
使用0.05微克/毫升的山羊和抗鼠和山羊抗兔辣根过氧化物酶共轭抗体(Dako，丹麦)。利用ECL***(Amersham)显影免疫影印。剥离影印，如上所述再探测(Welham等人，1994a)。
用p110δ和p110α的抗体注射CSF-1刺激的鼠巨嗜细胞
将鼠巨嗜细胞系BAC1用于抗体微注射实验。p110δ的肽多克隆抗体是特异于肽1044的C末端(p17材料和方法所述)，或肽序列(C)R222KKATVFRQPLVEQPED238。在微注射之前亲和纯化多克隆血清，使用浓度为0.5-5毫克/毫升。人的p110α的对照肽多克隆抗血清如材料和方法p17所述。在微注射之前，Bac1细胞远离集落刺激因子1(CSF)24小时。然后将抗体注射进入缺乏CSF1的细胞，并在观察用鬼笔环肽共轭若丹明微注射的Bac1细胞的细胞骨架之前与CSF1接触10-15分钟，(如Allen等人1997所述制备和观察细胞)。
细胞刺激
如上所述(Welham和Schrader,1992)用不同的生长因子刺激细胞除了将细胞在刺激之前以2×107个/毫升再悬浮于无血清的RPMI中。lan Clark-Lewis博士(不列颠哥伦比亚大学，温哥华)提供了化学合成的鼠IL3和IL4。从R&D欧洲***(Abingdon,Oxon)购买重组鼠SCF。前面已经使生长因子的浓度和刺激的持久性(SCF2分钟，IL3和IL410分钟)最佳化，以便得到受体和细胞底物的最大水平的酪氨酸磷酸化。如下所示，10微克/毫升IL3(Welham和Schrader,1992)，10微克/毫升IL4(Welham等人，1994a)和50微克/毫升SCF(M.J.W.,未公开的观察结果)。
Northern影印分析
将人polyA+RNA(Clontech)的Northern影印与pBluescript克隆09.1的任意引物标记的EcoRⅠ片断Ⅱ杂交。然后进行剥离和利用下面顺序的探针再探测：来自人p110α的内部EcoRⅠ-XhoⅠ2.1kb片断(Volinia等人，1994)和人p110β的EcoRⅠ-XhoⅠ5kbcDNA(C.Panaretou；未公开的结果)。
利用上面叙述的材料和方法，能够叙述新脂激酶特别是已经命名为p110δ的PI3激酶的数据。现在叙述与这一激酶相关的数据，目的是将p110δ与PI3激酶组的其它成员比较，以便比较和对照它们有关的特点。
结果
p110δ的克隆
将根据小牛p110α和S.cerevisiae Vps34p的激酶区中的保守氨基酸序列(GDDLRQD和FHI/ADFG)基础上的简并引物用于与来自人MOLT4 T细胞白血病的mRNA的RT-PCR反应。得到与其它已知人PI3K同源但不同的部分cDNA。将这一PCR片断用作探针筛选U937单细胞文库和分离对应的全长克隆(详情参见图9所示材料和方法)。序列分析披露了潜在的开放读码框架，该框架以框架内终止密码开始。还发现潜在的起始密码位于有益于翻译起始的区域(Kozak,1991)。这一3135个核苷酸的开放读码框架预测了一个计算的分子量119,471道尔顿的1044个氨基酸的蛋白质(图1A)。将氨基酸序列与其它PI3K的比较表明这一蛋白质与人p110β的关系最近(58％的完全相同性；Hu等人，1993)，与人p110α(41％的相同性；Volinia等人，1994)，人G-蛋白质调节p110γ(35％相同性；Stoyanov等人，1995)和人vps34p类似物(28％相同性；Volinia等人，1995)的差别较大。本发明叙述的新PI3K将进一步表示为p110δ。
高度严格的点图比较表示在p85-结合区(p110α的AA20-140；Dhand等人，1994)以及C-末端PI-激酶(PIK)区(HR2)和催化核心(p110α的AA529-末端，Zvelebil等人，1996)中p110α,β和δ同源性很高。在p85结合位点和HR2之间发现另外一个跨越p110δ的AA370-470的高度序列同源的区域。这一区域含有所称的HR3特征(WxxxLxxxlxlxDLPR/KxAxL)，它在所有p85结合PI3Ks和p110γ中是保守的。在p110α和p110β/γ之间不同的序列的N-末端的大部分区域与p110α中定义的区域交迭，足够用于Ras结合(p110α中AA133-314；Rodriguez-Viciana等人，1996)。在p110δ中鉴定了另外两个结构基序。第一个是富脯氨酸区(图1B，图1C)，它的分子模型表明它可以形成左旋多聚脯氨酸Ⅱ型螺旋，具有与SH3区反应的潜力(未显示数据)。在相应的区域中，p110α和p110β缺乏重要的脯氨酸允许相同的折叠。第二个基序是碱性区，亮氨酸拉链状区(bZIP)，紧接着HR3的C末端(图1B，图1C)。bZIP区存在于p110δ和p110β[也在果蝇p110(Leevers等人，1997)]中，这一区的碱基成份在p110α中较不明显(图1C)。p110δZIP区的模型表明L/V/I残基的排列容易接纳螺旋结构的形成，能形成卷曲螺旋二聚体蛋白拉链复合物(数据未显示)。
p110δ与p85受体和Ras蛋白结合
为了证实对于比较氨基酸序列的预测，即p110δ可以结合p85亚基，在昆虫细胞中p110δ作为谷胱苷肽-S-转移酶(GST)融合蛋白，与编码p85α,p85β和p85γ的重组杆状病毒一起表达[后者是与p55PIK,p55α和p85/AS53(Pons等人，1995；Inukai等人，1996；Antonetti等人，1996)同源的55千道尔顿的小牛p85同工型]。正如图2A所示，所有p85受体亚型与来自共感染细胞的GST-p110δ有效地共纯化。
过去还没有人提出是否不同的Ⅰ类p110纯化亚基在体内显示与不同p85受体蛋白的优先结合的问题。利用特异于p110δ的抗血清，我们发现p85α和p85β存在于来自不同白血细胞的p110δ免疫沉淀(图2B显示了人嗜中性粒细胞的数据；注意p85γ在白细胞中不表达)。p110α得到了同样的结果(数据未显示)。在这些免疫复合物中，同时观察到了与p85α抗体反应的45千道尔顿的蛋白质(图2B)。这一蛋白的特性目前仍未清楚，但它可能与前面叙述的45千道尔顿的蛋白质一样存在于来自各种组织的p85和p110IPs中(Pons等人，1995)。
p110α和p110β已经显示与Ras-GTP反应(Kodaki等人，1995；Rodriguez-Viciana等人，1994和1996)。这一反应需要的区位于这些PI3Ks的AA133和134之间(Rodriguez-Viciana等人，1996)。尽管在这一区，p110α和p110β的序列保守性较低(图1C)，如p110δ，某些明显重要的氨基酸是保守的，以依赖于GTP的方式在体内与Ras反应(图2C)。
p110δ结合ras，但不结合rac或rho
对GST-p110δ/p85α的温育发现保留了结合GTP的野生型ras或致癌性V12-ras(图2C)。这与加载GDP的ras，或A38-ras，功能性死亡ras突变体的情况不同。与p110α相似，没有证实rho和rac的结合(数据未显示)。
p110δ的脂激酶活性
当Mg2+存在时进行测试，发现p110δ磷酸化Ptdlns,Ptdlns4P和Ptdlns(4,5)P2(图3A)。HPLC分析证实这些脂在D3位置磷酸化(图3B)。体内的底物优先性是Ptdlns＞Ptdlns4P＞Ptdlns(4,5)P2(数据未显示)。在存在Mn2+时的脂激酶活性比存在Mg2+(在浓度范围0.25到16毫摩尔/升中测试，数据未显示)时低。从Sf9细胞中分离的p110δ的特异活性比p110α低2-5个因数(数据未显示)。总结到一起，从这些数据可以确定p110δ是真正的Ⅰ类PI3K。
p110δ不磷酸化p85但自身磷酸化
已经证实p85亚基是p110α催化亚基依赖于Mn2+的磷酸化底物(Carpenter等人，1993；Dhand等人，1994)。相反，在各种体外条件下，GST-p110δ不能磷酸化共表达的p85α,p85β或p85γ(图4A显示了部分数据；在存在Mg2+或不存在Mn2+时没有看到活性)。p85γ缺乏SH3区，这一分子没有被p110δ磷酸化引起了对p85α/βSH3区与p110δ富脯氨酸区的分子内反应锁住了p110δ有效地磷酸化p85分子的可能性的争论。为了排除昆虫细胞体内共表达过程中，p110δ已经完全磷酸化p85，在固定的GST-p110δ中加入了外源纯化的p85α。在洗掉过量的p85后，发现结合的p85被p110α，而不是p110δ有效地磷酸化(数据未显示)。当存在Mn2+时，对在与p85α或p85β的复合物中的未标记的p110δ进行体外激酶测试时，p110δ自身磷酸化[(图4B)，注意在固定的GST-p110δ中非常缺乏这一活性(图4B)]。在p110α/p85复合物中没有观察到这样的磷酸化，其中又一次发现p85被磷酸化(图4B)。磷酸氨基酸分析表明对p110δ的磷酸化发生在丝氨酸上(图4B)。观察到p110α对p85的磷酸化和p110δ的自身磷酸化大大地依赖于Mn2+，而存在Mg2+时只有非常弱的磷酸化(数据未显示)。p110δ的自身磷酸化导致脂激酶活性减弱。
为了排除观察到的p110δ的磷酸化是由于共沉淀的蛋白质激酶引起的可能性，产生了激酶缺陷p110δ突变体。这是通过将p110δ中的精氨酸894转换脯氨酸产生p110δ-R894P完成的。突变的精氨酸残基位于激酶区的保守DRX3NX12-13DFG基序中，可能是催化环的一部分如在蛋白质激酶中(Taylor等人，1992,Zvelebil等人，1996)。已经发现在小牛p110α(R916P)中的相似的突变完全破坏了催化活性(Dhand等人，1994)。正如从图4C中可以明了，在昆虫细胞中表达的p110δ-R894P不再在p110δ的沉淀中磷酸化，表明后者确实有自身磷酸化能力。同样，发现p110δ-R894P失去了脂激酶活性(数据未显示)。
我们已经生产了p110δ的磷酸化形式的多克隆抗血清。将C末端肽序列1044中的丝氨酸残基1033磷酸化并用于免疫兔。特异于磷酸化肽的抗血清使我们能够确定p110δ在体内磷酸化，并在细胞因子刺激的基础上，增强这种磷酸化(结果未显示)。
p110δ催化活性的药物敏感性
发现p110α和δ脂激酶活性展示了对渥曼青霉素和LY294002的抑制性的相似的敏感性(图5)，IC50为5纳摩尔/升(对渥曼青霉素)和0.5微摩尔/升(对LY294002)。同样，纳摩尔/升范围的渥曼青霉素也抑制p110δ的自身磷酸化活性(数据未显示)。
p110δ的组织分布
通过对人组织的polyA+RNA的Northern影印分析研究了p110δ的表达方式，并与p110α和p110β进行比较。发现在血液白细胞群体即脾，胸腺，特别是外周血液白细胞(后者含有所有白细胞，只有除去大部分红细胞)中约6kb的一个信使mRNA种类的表达特别高(图6)。在一些Northern影印实验中，观察到另外一个约5kb的p110δ的信使(数据未显示)。在大多数检测的其它组织中发现p110δ信使RNA的低水平表达，虽然难于排除血细胞污染对这一p100δmRNA信号有影响的可能性。同时发现在大部分检测的组织中表达了p110α和p110β(图6)。
然后将特异于p10α和δ的抗体用于在蛋白质水平测试PI3K的表达。在测试不同鼠组织时，发现脾和胸腺中110千道尔顿的蛋白质与p110δ反应，但不是在任何其它测试的组织中(图7)。这一方式很大程度上证明了如上所述的Northern影印分析的数据。同时发现p110δ存在于原始的和转化的白细胞中，独立于它们的分化时期(图7)。在原始血细胞中，淋巴和骨髓细胞群体对p110δ是阳性的，而血小板是阴性(图7)。T(如Jurkat,HPB All)和B(如Raji.HFB1)细胞系表达p110δ(图7)。在Rat-1,Nlh 3T3和瑞士3T3成纤维细胞中，LS174T和COLO 320HSR结肠腺癌，A431上皮样癌，ECC-1子宫内膜癌和HEp-2喉癌中没有发现110千道尔顿的p110δ(图7)，在CHO中国仓鼠卵巢，POC小细胞肺癌细胞系，猪和牛主动脉内皮细胞，MDA-MB-468胸腺癌，和原始的人肌肉和成纤维细胞中也没有发现(数据未显示)。总之，p110δ似乎是选择性地在白细胞中进行表达。
与p110δ相反，在进行研究的大部分组织和细胞系中，包括白细胞中发现p110α。
将抗p110δ多克隆抗体微注射进CSF-1刺激的鼠巨嗜细胞
通过鼠巨嗜细胞系，含有p110δ和p110α的抗血清的Bac1的一系列微注射实验进一步研究p110δ的可能功能。在微注射之前，剥去Bac1细胞的CSF124小时。CSF1剥离使细胞准备好在随后与CSF1接触时***并变得可移动。将亲和纯化的抗p110δ多克隆抗体微注射进剥离Bac1细胞的CSF1，接着与CSF1接触10～15分钟。
微注射的Bac1细胞显示了明显的细胞形态学变化。正常的细胞膜皱褶消失，发生了细胞质收缩。利用鬼笔环肽-若丹明共轭物可见微注射的Bac1细胞的细胞骨架，图10显示这样的细胞的代表性样品，显示打乱的细胞骨架排列。抗p110α的注射不产生等同的效应。
有意义的是，阴性占优势的小GTP结合蛋白rac,N17RAC的表达显示了相似的表现型。这表明p110δ可能是参与细胞骨架形成和细胞移动发出同样的信号级联中的部分。
p110δ参与细胞因子发出信号
在白细胞中，已经暗示结合p85的PI3Ks参与各种发出信号过程包括通过细胞因子和补充的受体，整合蛋白，Fc受体，B和T细胞抗原受体和它们的辅助分子如CD28发出信号(Stephens等人，1993；Fry,1994)。所以，很明显，大量发出信号过程潜在地与p110δ相关。关键问题是能否同时含有其它Ⅰ类PI3K的细胞中发生p110δ与上面提到的发出信号/受体复合物的选择性偶联，给出了不同的p110s似乎是与同样的p85同工型复合的观察结果(图2B)。我们在白细胞的各种类型中可操作的细胞因子信号转导过程中已经提出过这一重要问题。
细胞因子的不同家族通过拥有共同的gp130,β或γ链的受体的分立的类型或通过含有内在的酪氨酸激酶活性的受体转导信号(Taga和Kishimoto,1995)。然而还没有报道通过gp130发出信号的细胞因子激活PI3K，已经证实了对应于通过共同的β链(如IL3)，共同的γ链(如IL4)或通过酪氨酸激酶受体(如c-kit，结合干细胞因子(SCF))发出信号的细胞因子激活结合p85的PI3K(Wang等人，1992；Gold等人，1994)。我们检测了在依赖于细胞因子的白细胞系中IL3,IL4和SCF与p110δ和p110α的偶联能力。我们发现了特异地用于刺激细胞因子的含有磷酸酪氨酸的蛋白质的相同方式以便与p110α和p110δ抗体共沉淀(图8，组a)。在IL3-和IL4-反应的Ba/F3 pre-B和骨髓始祖FD-6细胞系(图8A；FD-6的数据未显示)中，IL-3处理在p110α/δIPs中诱导了未知的100千道尔顿的蛋白质和70千道尔顿的酪氨酸磷酸酶，SHP2的出现(图8A，组b)。通过免疫影印表明IL4刺激时共沉淀的170千道尔顿的蛋白质(图8A，组a)是IRS-2，这些细胞中IL4-诱导的磷酸化的主要底物(数据未显示)。图8B显示了在MC/9肥大细胞中有相似的分析结果。在SCF刺激后，p110α和p110δIPs含有未鉴定的100千道尔顿酪氨酸磷酸化蛋白质以及鉴定为c-kit，SCF受体的150千道尔顿的蛋白质(图8B，组a和b)。这些数据表明在吸收到各种活化的细胞因子受体复合物中时p110α和p110δ没有显示明显的差异。另外，至少两个结合p85的PI3K类的成员在细胞因子发信号中的意义暴露了前面没有识别的这些细胞因子受体的下游信号转导途径的复杂性。
在鼠和人黑素瘤细胞系中表达PI3激酶p110亚基
在各种鼠和人黑素瘤细胞系中进一步研究p110δ的表达。黑素瘤的特征是与这一癌症相关的积极的移动性特征。通过分析在鼠和人细胞系范围内相对丰富的p110δ蛋白质研究了p110δ参与移动的可能性。利用Western影印评估p110α和β以及p110δ的水平。将J774，一个鼠细胞系用作鼠Western影印的对照。将新生儿黑素细胞用作人Western影印的对照。表1表明了在鼠和人起源的黑素瘤细胞系两个对照中p110α和β是构成性地表达的。有意义的是，当与鼠黑素瘤细胞系相比，鼠对照细胞系J744显示明显减弱的p110δ水平。但是，在人新生儿黑素细胞中发现可检测的p110δ水平。这可以通过这些人对照细胞的特性解释。p110δ在这些对照细胞中的表达可以通过这些细胞在人皮肤中相对新的移动所以在这些细胞中可以存在残留的p110δ的水平来解释。成人的黑素细胞在皮肤中的停留延长，p110δ的水平可以减弱到与它们的最终分化相称的不可检测的水平。
我们已经叙述了新的人p110亚基，p110δ，它是PI3激酶家族的一部分。p110δ显示了限制表达的方式，只在白细胞群体，特别是外周血液白细胞中有明显的积累水平。这些细胞的移动特性使我们得出，PI3激酶家族的这一成员可能通过细胞骨架的再组成参与了调节细胞的移动。有关鼠和人黑素瘤细胞系的数据是有意义的，但关于人黑素瘤缺乏说服力。对人正常黑素细胞和人黑素瘤进行活组织检查将可以解决这一问题。
  表1鼠黑素瘤中p110亚基的表达
    细胞系     特征   δ  α β     参考文献
鼠
J744 对照   - + + 本研究
黑-c 黑素瘤   - + +
黑-pI 黑素瘤   - + + Wilson等人1989
黑-aTu-2d 黑素瘤   - + + Wilson等人1989
Mel-ab 黑素瘤  +/- + + Dooley等人1988
Mel-ab-LTR-Ras2 黑素瘤   + + + Dooley等人1988
Mel-ab-LTR-Ras3 黑素瘤   + + + Dooley等人1988
Mel-ab-pMT 黑素瘤   + + + Dooley等人1988
B16F1 黑素瘤(弱移动性)   + + + Fidler等人1975
B16F10 黑素瘤(高移动性)   + + + Fidler等人1975
表1续人黑素瘤中p110亚基的表达
    细胞系     特征 δ  α  β     参考文献
人
A375P 黑素瘤(弱移动性) - + + Easty等人1995
A375M 黑素瘤(高移动性) + + + Easty等人1995
WM164 黑素瘤 + + + Easty等人1995
WM451 黑素瘤 + + + Easty等人1995
DX3 黑素瘤(弱移动性) + + + Ormerod等人1986
DX3-LT5.1 黑素瘤(高移动性) - + + Ormerod等人1986
对照(人新生儿黑素细胞) 原始细胞 + + + 本研究
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Claims (29)

1．分离的自身磷酸化多肽，或其片断，具有图1显示的氨基酸序列，或其同源物或类似物代表的PI3激酶活性，可选择地通过至少一个氨基酸残基的缺失，替代和附加修饰，在血液白细胞和/或黑素瘤中显示选择性表达。
2．根据权利要求1所述的分离多肽，其特征在于所述多肽能够与至少一个哺乳动物p85受体多肽结合。
3．根据权利要求1和2所述的分离多肽，其特征在于所述多肽的特征是含有35～45％的脯氨酸含量的区域。
4．根据权利要求3所述的分离多肽，其特征在于所述的富脯氨酸区域理想地在图1显示的蛋白质序列数据的292～311位置，但可以在相当的PI3激酶的同源/类似位点。
5．根据权利要求1～4所述的分离多肽，其特征在于所述多肽是哺乳动物起源和人起源。
6．编码权利要求1～5所述的多肽的分离核酸分子。
7．根据权利要求6所述的分离核酸分子，其特征在于核酸序列是cDNA或基因组DNA。
8．根据权利要求6和7所述的分离核酸分子，其特征在于所述分子在克隆重组载体中。
9．根据权利要求6～8所述的分离核酸分子，其特征在于所述分子或其部分，适于权利要求1～5所述的多肽的重组表达。
10．利用权利要求8或9所述的本发明的构建体转染或转化的宿主细胞，其特征在于所述构建体特异于权利要求1～5所述的整个或部分多肽的重组合成。
11．根据权利要求8所述的宿主细胞系，其特征在于所述细胞系是昆虫细胞系。
12．根据权利要求8和9所述的重组表达多肽或根据权利要求1～5所述的分离多肽在生产p110δ抗体中的用途。
13．根据权利要求12所述的抗体或其部分，其特征在于所述抗体是单克隆。
14．根据权利要求1～5所述的多肽的组织特异表达的鉴定方法，包括确定相关多肽和/或编码它的mRNA和/或cDNA的存在。
15．根据权利要求14所述的方法，其特征在于所述方法包括将至少两个适于与至少一个本发明的核酸分子的选定部分杂交的核酸分子引物与所述cDNA结合。
16．根据权利要求14或15所述的方法，其特征在于所述方法包括提供利用所述引物至少扩增和纯化权利要求6～11所述的核酸分子的一部分的条件。
17．根据权利要求14所述的方法，其特征在于所述方法包括利用权利要求12或13所述的抗体检测所述的多肽，其中使用方法包括ELISA,Western影印，免疫沉淀或免疫荧光。
18．鉴定有效地调节权利要求1～5所述的多肽的激酶活性的试剂的方法，包括将多肽与具有调节作用的试剂体外或体内接触，然后观察所述多肽的激酶活性。
19．根据权利要求18所述的方法，其特征在于利用计算机辅助模拟或方便的实验室技术筛选潜在的拮抗剂。
20．根据权利要求18或19所述的方法，其特征在于将表达权利要求1～5所述的多肽的细胞与潜在的拮抗物接触，观察所述细胞的移动性。
21．一种有效地调节本发明多肽活性的试剂的药学/兽医学成份。
22．根据权利要求21所述的药学/兽医学成份，它可选择地包括稀释剂，载体或赋形剂和/或是单位剂量形式。
23．控制细胞移动的方法，包括将细胞群体与权利要求1～4所述的多肽或其拮抗物或拮抗剂接触。
24．根据权利要求23所述的方法，其特征在于将细胞与本发明的多肽接触增强了细胞的移动性。
25．有效地阻止权利要求1～5所述的多肽的活性的试剂在控制细胞移动中的用途。
26．根据权利要求1～5所述的多肽增强细胞移动的用途。
27．适于与权利要求6～9所述的核酸杂交的反义低聚核苷酸。
28．根据权利要求27所述的反义低聚核苷酸，其特征在于所述的低聚核苷酸如本文所述修饰。
29．一种含有根据权利要求27或28所述的反义低聚核苷酸的药学/兽医学成份。
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