JP2000515385A - Ｐｅｇ存在下でのカラムクロマトグラフィーを使用するプラスミドｄｎａの精製 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 凝集剤を用いた沈殿とカラムクロマトグラフィーによりプラスミドＤＮＡを精製する方法が提供される。短鎖重合アルコール、好ましくはポリエチレングリコール又は他のＤＮＡ凝集剤がカラムクロマトグラフィーの前にＤＮＡサンプルに加えられる。この短鎖重合アルコール又は凝集剤はプラスミドＤＮＡの分離を更に向上させ、そして大規模な精製、特に医薬品としてのプラスミドＤＮＡの製造に使用できる。

Description

【発明の詳細な説明】 ＰＥＧ−沈殿及びカラムクロマトグラフィーによるプラスミドＤＮＡの精製 発明の技術分野 本願発明はカラムクロマトグラフィー中でプラスミドＤＮＡを精製する方法、 特に遺伝子治療及び遺伝子免疫化における医薬品等級としての使用に適したプラ スミドＤＮＡを大規模に処理する方法に関するものである。 発明の背景 ここで引用する全ての参考文献はこれから明示するように参考文献として取り 入れる。微生物細胞からプラスミドＤＮＡを分離する従来技術は小規模レベル又 は実験室レベルの調製に対してのみ適したものである。広く使用されている技術 の一つは、プラスミドを含む微生物細胞のアルカリによる細胞溶解及び酢酸によ る中和を含み、これにより宿主ゲノムＤＮＡ及びタンパク質は沈殿させられ、遠 心により取り除かれる。残ったプラスミドＤＮＡはエタノールで沈殿され、塩化 セシウム／エチジウムブロミド（ＣｓＣｌ／ＥｔＢｒ）密度勾配遠心にかけられ る。エチジウムブロミドはプラスミドＤＮＡをスーパーコイル状、直鎖状及びニ ックのある環状形状のものに分け、そして所望する形状のものが回収される。残 余のエチジウムブロミドはブタノールによる抽出で除かれ、ＤＮＡはエタノール により沈殿させる。宿主細胞タンパク質はフェノールによる抽出の繰り返しによ り取り除かれ、次にＤＮＡは沈殿されそしてイソアミルアルコール／クロロホル ムによる抽出の繰り返しによりフェノールは取り除かれる。 プラスミドＤＮＡの分離及び精製に使用されるこれらの一般的実験法は製造方 法には適していない。まして、これらの方法は遺伝子治療又は遺伝子免疫化にお ける医薬品等級としての使用に適したプラスミドＤＮＡの生産には適していない 。密度勾配遠心は規模を拡張できないし、エチジウムブロミドは突然変異原であ ることが知られているし、フェノールは有害な化学物質であり、そしてこの方法 は労働集約的である。 組換プラスミドＤＮＡを大規模に精製するための最近の努力はポリエチレング リコール（ＰＥＧ）を使用した示差沈殿法、そしてイオン交換及び／又はサイズ 排除クロマトグラフィーに向けられている。Ｈｏｒｎら、Hum.Gene.Ther.,6:565 -573,1995;PCT出願 No．WO95/21250。この方法を使用したプラスミドＤＮＡの 収率は一般的に約５０％である。PCT出願 No．WO96/02658は細菌細胞の溶解、 陰イオン交換クロマトグラフィー及び逆相ＨＰＬＣを含む大規模なプラスミドＤ ＮＡの精製を開示している。しかし、プラスミドＤＮＡのクロマトグラフィーに よる精製の主な問題は、所望の生産物が鋭いピークではなく、広い尾を引いたス メアとして溶出され、そして通過物中に現れることであり、従って溶解成分から の分離が妨げられる。 ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、三価陽イオン（例えば、ヘキサミンコバ ルト（ＩＩＩ）、スペルミジン）、アルコール及びポリビニルピロリジンを含む 多くの試薬は、ＤＮＡ分子が伸張したコイル状から緻密な球状に凝集するのを促 進させる。吉川ら、J.Am.Chem.Soc.,118:929-930,1996;皆川ら Biopolymers,34 ;555-558,1994;Arscottら Biopolymers,30:619-630,1990及びLermanら Proc.N atl.Acad.Sci.U.S.A.,68;1886-1890,1971。ポリエチレングリコールのＤＮＡ分 子を凝集させる能力は、６．０Ｍで転移点になり（吉川ら）、１.９−１０.０Ｍ ＰＥＧ濃度（皆川ら）で起こるようである。すなわち、低いＰＥＧ濃度では、 ＤＮＡ分子は伸張したコイル状態で存在し、高いＰＥＧ濃度ではＤＮＡ分子は小 さな球状の状態に縮んでいる（皆川ら）。 カラムクロマトグラフィー中でプラスミドＤＮＡを精製する方法へのニーズは 存在する。遺伝子治療及び遺伝子免疫化における医薬やワクチンに使用されるの に十分精製されたプラスミドＤＮＡが大規模な量で必要性なことから、このニー ズは、特に緊急である。発明の概要 本願発明の一つの態様は、カラムクロマトグラフィーを使用して生物学的混合 物からプラスミドＤＮＡを精製する改良方法であり、 この混合物にポリエチレングリコールを加える工程、及び、 この混合物からこのＤＮＡをクロマトグラフィーにより分離する工程、 を含む改良方法である。 好ましくは、このポリエチレングリコールは約０．１から約４％（ｗ／ｖ）の 間の量、更に好ましくはポリエチレングリコールは約１％（ｗ／ｖ）の量で加え られる。この好ましい態様の一つの特徴は、ポリエチレングリコールは約７，０ ００から約９，０００の平均分子量を有しており、もうとつの特徴は、ＰＥＧが ＰＥＧ−８０００である。この態様は更に分離する工程が陰イオン交換クロマト グラフィーであることを含む。 本願発明は宿主細胞不純物からプラスミドＤＮＡを精製する方法において、 このプラスミドＤＮＡと宿主細胞夾雑物を含む溶液に、カラムクロマトグラフ ィー中に宿主細胞不純物からプラスミドＤＮＡを分離させるのに十分量のポリエ チレングリコールを加える工程、及び、 カラムクロマトグラフィーを行い、これによりプラスミドＤＮＡが宿主細胞不 純物から精製されるようにする工程、 を含む方法も更に提供する。 好ましくは、ポリエチレングリコールの量は、約０．１から約４％（ｗ／ｖ） の間の量、更に好ましくはポリエチレングリコールは約１％（ｗ／ｖ）の量で加 えられる。この好ましい態様の一つの特徴によれば、ポリエチレングリコールは 約７，０００から約９，０００の平均分子量を有しており、もうとつの特徴によ れば、ＰＥＧはＰＥＧ−８０００である。この態様は更にこのカラムクロマトグ ラフィーが陰イオン交換クロマトグラフィーであることを提供する。 本願発明のもう一つの態様は細胞溶解物の夾雑物からプラスミドＤＮＡを精製 する方法において、 このプラスミドＤＮＡと分解夾雑物を含む溶液に、このＤＮＡを凝集させるの に十分量のＤＮＡ凝集剤を加える工程、及び、 この凝集剤を含む溶液をクロマトグラフィーカラムに通過させ、これによりこ の溶解夾雑物からこのプラスミドＤＮＡを精製する工程、 を含む方法である。 好適には、凝集剤はポリエチレングリコール、好ましくは約７，０００から約 ９，０００の平均分子量を有しているもの、更に好ましくはＰＥＧ−８０００で ある。好ましくは、ポリエチレングリコールの量は約０．１から約４％（ｗ／ｖ ）の間の量、更に好ましくは、この量は約１％（ｗ／ｖ）である。この態様は、 クロマトグラフィーカラムが陰イオン交換クロマトグラフィーカラムであること を含む。 好適な態様の詳細な説明 本願発明はカラムクロマトグラフィー中にプラスミドＤＮＡを精製する方法を 提供することである。短鎖重合アルコール、好ましくはポリエチレングリコール 、またはもう一つのＤＮＡ凝集剤はカラムクロマトグラフィーにかける前にＤＮ Ａサンプルに加えられる。短鎖重合アルコール又は凝集剤はプラスミドＤＮＡの 分離を改善し、大規模な精製に、特に医薬品等級としてのプラスミドＤＮＡの製 造に使用できるかもしれない。 宿主細胞の夾雑物からクロマトグラフィーによりプラスミドＤＮＡを精製する 際の大きな問題点は、所望の生産物がはっきりしたピークというよりむしろ広が った不純物として抽出され、そして通過物に現れることであり、従ってこれらの 夾雑物からプラスミドＤＮＡの分離を妨げることである。本願発明の方法はこの 問題を解決する。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような短鎖重合アルコー ルまたはもう一つのＤＮＡ凝集剤の存在で、プラスミドＤＮＡははっきりしたピ ークになって抽出され、そして、通過物には現れず、従って精製を促進させ、収 率を増加させる。 特別な理論により制限されることなく、クロマトグラフィーカラムへのプラス ミドＤＮＡの均一な結合は、ＤＮＡ分子が伸張したコイル状態から緻密な球状態 に凝集したことから起こるのかもしれない。プラスミドＤＮＡはスーパーコイル 状、直鎖状及びニックを持つ環状形状の混合で存在する。イオン交換カラムにＤ ＮＡサンプルを供することにより、多種類のプラスミドＤＮＡは、異質な形態で そして異なった相対結合係数でクロマトグラフィーマトリックスへ結合するもの と見ることができる。伸張したコイルの緻密は球状への収縮は、より均質な形態 でそして類似の結合係数で陰イオン交換マトリックスへ結合するのを増大させる 原因であるかもしれない。多種類のＤＮＡ凝集剤は、本願のクロマトグラフィー の方法によりプラスミドＤＮＡの精製を促進させるものとして、従って予期する ことができる。 ポリエチレングリコールの存在下でクロマトグラフィーカラムへのプラスミド ＤＮＡの結合の増大を説明するであろうもう一つの理論は、配座型への疎水性相 互作用の貢献である。多種類の試薬により疎水性相互作用が崩されることで、Ｄ ＮＡ分子はより均質な形態でそして類似の結合係数でクロマトグラフィーマトリ ックスへ結合するのを促進させる配座型になると想定することができるかもしれ ない。疎水性相互作用を媒介する化学試薬も本願発明で有用なものとして当然想 定することができる。 ポリエチレングリコールのような短鎖重合アルコール及びプラスミドＤＮＡを 精製の目的のために均質なものとして機能させる他のＤＮＡ凝集剤の使用は、イ オン交換クロマトグラフィーに限定されるものではない。これはサイズ排除クロ マトグラフィー、クロマトフォーカシング、アフィニティークロマトグラフィー 、疎水性相互作用クロマトグラフィー及び逆相クロマトグラフィーを含む他のク ロマトグラフィー方法に拡張できる。確かに、この方法は、例えばダイアフィル トレーション、ウルトラフィルトレーション及びろ過一般の他の精製方法にも広 く拡張でき、多様なプラスミドＤＮＡ種を一種類のものとして機能させることに より、ＲＮＡ、タンパク質及び他の夾雑物からのプラスミドＤＮＡの分離は促進 される。 本願発明の方法は、プラスミドＤＮＡの高い生産物回収率を含む多くの利点を 提供することができる。これらの方法を使用するＤＮＡの収率はクロマトグラフ ィー工程に対して少なくとも９０％である。更に、この発明は、人への使用に十 分な精製純度のプラスミドＤＮＡを大規模な量で生産するのに適用可能である。 プラスミドＤＮＡは一般的に微生物の発酵物の構成成分から分離される。酵母 細胞及び細菌細胞を含む多種多様な微生物細胞が、本願発明の方法の使用に適し ていることは当業者には明かである。好ましい微生物発酵は細菌発酵である。好 ましい細菌発酵は大腸菌発酵である。微生物発酵物は使用される細菌の成長に適 するいかなる液体培地中でも生育させることができる。 本願発明の方法により精製されるＤＮＡプラスミドはいかなる染色体外ＤＮＡ であってもよい。プラスミドは実質的にいかなる大きさ又は性質であってもよい ということは当業者には明かである。これらのプラスミドは高コピー数、低コピ ー数のもの又は制御できないプラスミドであってもよい。これらは、選択できる 遺伝子、ポリリンカー、複製開始点、プロモーター、エンハンサー、リーダー配 列、ポリアデニル化部位及び終結配列を含む遺伝子要素の領域を含む。プラスミ ドは基本的にはいかなる起源の人の遺伝子及び動物のものを含むことができる。 プラスミドＤＮＡを含む微生物細胞は発酵培養液から最初に収集され、細胞ペ ーストを生じさせる。液体培養液から細胞を収集するいかなる従来方法も適用で きる。そのような方法は遠心、ろ過及び沈殿法を含む。 次は、細胞溶解である。典型的には、細胞は緩衝液中に懸濁される。我々は細 胞壁を弱くするいかなる酵素処理も奨励しない。これは、使用しなければならな い動物の酵素はこれらの方法により生産されるプラスミドＤＮＡの受容者に感染 する動物ウイルスを保持するかもしれないからである。 細胞破片及び他の不純物は遠心、ろ過、沈殿のような標準的な方法により次に 取り除かれる。我々は珪藻土でろ過することにより結果として生じる上清の不純 物を取り除く。珪藻土によるろ過もこの上清に関して宿主ＲＮＡの濃度を減少さ せる。 この後、プラスミドＤＮＡは適当な条件下で沈殿剤を使用して不純物を取り除 いた上清から沈殿させ、収集されそして緩衝液中に再懸濁させることができる。 次に、我々は、プラスミドＤＮＡを妨害するものとして宿主ＲＮＡ、タンパク質 及びリポ多糖をこの目的に好適な条件下で沈殿剤により沈殿させる。最後に、ろ 過物は収集され、そしてプラスミドＤＮＡはこれらの好適な条件下で沈殿試薬を 使用することにより再度沈殿される。次は、カラムクロマトグラフィーである。 ＤＮＡペレットはカラムクロマトグラフィーに先立ちカラム緩衝液中に再懸濁 させる。この緩衝液はポリエチレングリコールまたはもう一つのＤＮＡ凝集剤を 、単独でまたは組み合わせて含む。典型的には、ＤＮＡ溶液中のＰＥＧの濃度は 約０．１から約４％（ｗ／ｖ）、好ましくは約１％（ｗ／ｖ）である。もし、Ｐ ＥＧの濃度が０．１％（ｗ／ｖ）以下の場合、プラスミドＤＮＡの結合の増加は 起こらない。もしＰＥＧ濃度が４％（ｗ／ｖ）以上の場合、ＤＮＡは溶液から沈 殿しはじめる。ＰＥＧ−８０００に対しては、約０．１％から約４％の範囲は、 １．７×１０^-4Ｍから６．７×１０^-3Ｍのモル濃度に対応する。 プラスミドＤＮＡはＤＮＡサンプルと同様の緩衝液で平衡化した陰イオン交換 カラムに供された。多種多様な入手可能な陰イオン交換マトリックスは、POROS 陰イオンレジン、Qiagen、Toso Hass、Sterogene、Spherodex、Nucleopac及びフ ァルマシアから得られるものを含むが、これらに限定されず、本願発明に使用す るのに適している、このカラムはベッド容量の数倍の緩衝液で洗浄される。通過 するピークは実質的にプラスミドを含まず、このことはカラムマトリックスにほ とんど完全にＤＮＡが結合していることを示す。これとは反対に、ポリエチレン グリコールを含まない緩衝液を使用するときはプラスミドＤＮＡは通過する部分 に存在する。 プラスミドＤＮＡはポリエチレングリコールを含む緩衝液中で１段階の塩溶出 によりカラムから溶出される。カラムフラクションはアガロースゲル電気泳動に よりプラスミドＤＮＡが分析される。プラスミドＤＮＡを含むフラクションはプ ールされ、沈殿させられ、再懸濁させられ、そして更なる処理のためゲルろ過カ ラムに供される。最後にカラムで精製されたＤＮＡは究極的最終的な組成、無菌 フィル、最終品に調製される。 イオン交換カラムから溶出されたプロファイルは異なるＤＮＡ調製物に対応す る。この成功は下記の実施例４に示す大規模なＤＮＡの調製に拡張することがで きる。こうように、ＤＮＡ凝集剤がカラム緩衝液中に存在する場合に、再現可能 なクロマトグラフィーによる精製が達成される。 本願方法において多くのＤＮＡ凝集剤を使用することは予期できる。そのよう な試薬は、炭素を１〜４個有する短鎖重合アルコール（例えばポリエチレングリ コール）、３価の陽イオン（例えばヘキサミンコバルト（ＩＩＩ）、スペルミジ ン）、短鎖アルコール（例えばメタノール、エタノール、イソプロパノール）及 び他のポリマー（例えばポリビニルピロリドン）を含むが、これに限定されるも のではない。平均分子量が７，０００〜９，０００であるポリエチレングリコー ルが好ましく、そして平均分子量が８，０００であるポリエチレングリコール、 ＰＥＧ−８０００が本願発明で使用するのに特に好ましいが、他の平均分子量を 有するポリエチレングリコールも更に子期できる。これらは例えば、ＰＥＧ−２ ００、ＰＥＧ−５００、ＰＥＧ−１０００、ＰＥＧ−８０００及びＰＥＧ−１０ ，０００を含む。ここで述べる方法で使用する特定のＤＮＡ凝集剤の好ましい選 択及び量は、例えば、実施例１〜５に述べる実験を行い、そしてコントロール試 験を行う一方で、試験変数に科学的方法論を適用することにより、当該技術分野 の当業者によって容易に決定することができる。 プラスミドＤＮＡは、以下の実施例で述べるように細菌細胞溶解及びカラムク ロマトグラフィーにより分離された。 実施例１ 小規模な細菌細胞溶解及びプラスミドの回収 大腸菌細胞を含むＶＣＬ−１００５Ｇ／Ａ、約５０グラムを使用した。プラス ミドＤＮＡ（ＶＣＬ−１００５Ｇ／Ａ）はｐＢＲ３２２プラスミドに由来した。 これは約５，０００ｂｐの大きさであった。これはカナマイシン耐性タンパク質 （Ｔｎ９０３）をコードする遺伝子を発現した。これは、ＨＬＡ−Ｂ７と呼ばれ るクラス１の主要組織適合性遺伝子複合体のＨ鎖（ヒト ＨＬＡ−Ｂ７ ｃＤＮ Ａ）及びＬ鎖（チンパンジー β−２ ミクログロブリン ｃＤＮＡ）タンパク 質もコードした。これらの２つのタンパク質は、バイシストロニック ｍＲＮＡ で発現された。このｍＲＮＡの真核細胞転写は３’ロングターミナルリピート（ ＬＴＲ）由来のラウス肉腫瘍ウイルスプロモーター配列及びウシ成長ホルモン遺 伝子由来の転写終結／ポリアデニル化シグナル配列に依存した。Ｈ鎖の真核細 胞発現は５’キャップ依存性タンパク質翻訳開始部位より調節された。Ｌ鎖の発 現は、脳心筋炎ウイルス由来のキャップ非依存性翻訳エンハンサー（ＣＩＴＥ） 配列によって調節された。細菌細胞におけるこのプラスミドの複製は細菌性複製 開始点の存在下で調節された。 プラスミドＤＮＡを含む細胞は６１ｍＭグルコース、５０ｍＭ ＥＤＴＡを含 む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、３００ｍｌ中に懸濁した。溶解は １％ＳＤＳを含む０．２Ｎ ＮａＯＨ、６００ｍｌを添加し、そして８分間イン キュベートした後に生じた。細胞破片は３Ｍ酢酸カリウム、ｐＨ５．０、４５０ ｍｌにより沈殿させ、そして８分間インキュベートした。溶解物中に残る細胞破 片はセライト ハイフロ スーパーセル（Celite Hyflo Super cel,flux calcined ,Celite Corp.,Lompoc，CA）１３０ｇを加えることで取り除かれ、そして真空下 でブフナーフィルター(Buchner filter)中でセライト プレコート Ａ／Ｅフィル ターデイスク（Celite pre-coated A/E filter disk，Gelman Sciences，Ann Ar bor,MI）を通過させた。ろ過物はワットマン＃４フィルターカップ(Whatman#4 f ilter cup)で微粒子を取り除き、そして１．６ＭＮａＣｌ中に３０％ＰＥＧを最 終的に８％ＰＥＧ濃度となるよう加えることより、プラスミドＤＮＡを沈殿させ た。このサンプルは４−８℃で一晩攪拌された。 プラスミドＤＮＡは６，０００×ｇで４０分間遠心することにより集めた。こ のペレットは１０分間乾燥され、５０ｍｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ− ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁させた。同量の５Ｍ酢酸アンモ ニウムをサンプルに加え、そして氷上で１５分間インキュベートした。サンプル は２，０００×ｇで３０分間遠心された。上清中のプラスミドＤＮＡは０．６容 量の−２０℃のイソプロパノールを加えることで沈殿させた。−２０℃で２時間 インキュベートした後、サンプルは２，０００×ｇで３０分間遠心された。ＤＮ Ａペレットは１０分間乾燥され、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含むＴＥ、３０ｍｌ中 に懸濁された。 プラスミドＤＮＡはＰＥＧの存在及び不存在の両方で、下記に述べるように陰 イオン交換クロマトグラフィーに供された。 実施例２ 陰イオン交換クロマトグラフィー 実施例１に従って調製した３０ｍｌのプラスミドＤＮＡを２つに分けた。その サンプルの一つに固体のＰＥＧ−８０００を最終濃度で１％（ｗ／ｖ）となるよ うに加えた。ＰＥＧ−８０００は他の１５ｍｌのサンプルには加えなかった。Ｑ −セファロース（登録商標）ファーストフロー(Fast Flow)陰イオン交換クロマ トグラフィーカラム（ファルマシア、Piscataway,NJ）(5.0X5.0cm)はファルマシ ア バイオパイロット（登録商標）システムを使用して圧力充填された。このカ ラムは、ＰＥＧ−８０００を含む緩衝液Ａ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ ８．０、０．７Ｍ ＮａＣｌ、１ｍ ＭＥＤＴＡ）または緩衝液Ａで平衡化された 。各１５ｍｌのアリコートはそれぞれこのバイオパイロットスーパーループにか けられた。ＰＥＧを含むサンプルをかけた後、４倍のベット容量のＰＥＧを含む 緩衝液Ａで洗浄した。コントロールサンプル（ＰＥＧなし）がかけられた後、４ 倍のベット容量の緩衝液Ａで洗浄した。通過ピークを集め、アガロースゲルでの 分析のため保存した。このＤＮＡはその後、ＰＥＧを含むＤＮＡサンプルに対し てはＰＥＧ−８０００を含む１００％緩衝液Ｂ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、 ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）を、コントロールＤＮＡサンプルに対しては緩 衝液Ｂ（ＰＥＧなし）を、４ベット容量用いてカラムから溶出した。５０ｍｌの フラクションを得た。通過物及び緩衝液Ｂで洗浄後に溶出したフラクションの両 方はエチジウムブロミドの存在下、０．８％アガロースゲル電気泳動により分析 した。結果は１％ＰＥＧの存在下で、ほぼすべてのＤＮＡサンプルがカラム上に 保持され、実質的に通過物中にＤＮＡは存在しないことを示した。これに対して 、ＰＥＧ−８０００の不存在では、カラムからプラスミドＤＮＡがかなり漏出し 、そこではプラスミドＤＮＡは多様な夾雑物とともに通過物中に溶出され、ＤＮ Ａの完全な結合は得られていないことを示した。ＰＥＧ−８０００の存在により 、プラスミドＤＮＡの回収率を２０％と少ないものから一般的には８０％まで改 善した。 大規模なプラスミドの精製は以下に述べるように行った。 実施３ 大規模な細菌細胞溶解及びプラスミドの回収 細胞含む５００ｇのＶＣＬ−１００５Ｇ／Ａを８ガロンのＡＳＭＥ ３１６Ｔ で溶解した。細胞は、６１ｍＭグルコース、５０ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、３Ｌ中に懸濁した。１％ＳＤＳを含む０．２Ｎ ＮａＯＨ、 ６Ｌを加え、そして８分間インキュベートした後、溶解が起こった。細胞破片は ３Ｍ酢酸カリウム、ｐＨ５．０、４．５Ｌを使用し、そして８分間インキュベー トすることにより沈殿させた。溶解中の細胞破片は６７５ｇのセライト ハイフ ロ スーパーセル(Celite Hyflo Super cell，flux calcined)を加え、そして７c ell SP50 カートリッジ(CUNO，Inc.，Meriden,CT)を含む Cuno 8ZP1P316Tステ ンレス カートリッジ ホルダーを加圧下で通過させた。不純物を取り除いた溶解 物は濃縮され、そして、６FT²PTQK TFFカートリッジ(Millipore Corp.，Bed for d，MA)を使用して緩衝液の交換を行った。７０１Ｓポンプ（Watson Marlow,Inc. ,Wilmington,MA）は４Ｌ／ｍｉｎの流速で使用した（チューブは3/8”ID Master flex Pharmed）。６倍容量に減少させ、そして２容量の１ｍＭＥＤＴＡを含む１ ０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０でダイアフィルトレーションを行った。 プラスミドＤＮＡは、１．６Ｍ ＮａＣｌ中で、４℃で一晩、ゆっくり攪拌し つつ、３０％ＰＥＧ−８０００を最終濃度で８％と成るように加えることにより 、不純物を除いた溶解物から沈殿させた。プラスミドＤＮＡは、Jouan KR4 22遠 心器を使用して、６，０００×ｇで４０分間遠心することにより集めた。ペレッ ト化したプラスミドＤＮＡを４００ｍｌ ＴＥ中に懸濁し、そして等量の５Ｍ酢 酸アンモニウムを加えた。この溶液は完全に混合、氷上で１５分間インキュベー トし、そして６，０００×ｇで２０分間遠心した。プラスミドＤＮＡは、−２０ ℃の最上級の２−プロパノール（Fisher）、０．６倍容量を加えることにより、 上清から沈殿させた。−２０℃で最低２時間インキュベートした後、沈殿したＤ ＮＡは、Jouan KR4 22遠心器を使用して６，０００×ｇで２０分間で、ペレット 化した。このペレットは１％ＰＥＧ−８０００を含む緩衝液Ａ、３００ｍｌ中 に再懸濁された。２６０ｎｍの吸光度により決定される最終的なプラスミド濃度 は約４ｍｇ／ｍｌであり、核酸の全体量は１．３ｇであった。 プラスミドＤＮＡは下記に述べるように陰イオン交換クロマトグラフィーに供 された。 実施例４ 陰イオン交換クロマトグラフィー ファルマシアＢＰＥ １００／５００カラムは、製造業者の指示に従いファル マシア バイオパイロット（登録商標）システムを使用して圧力充填された。最 終的なカラムの大きさは１０×１３ｃｍであり、ベット容量は約１，０００ｍｌ であった。このカラムは１％ＰＥＧ−８０００を含む緩衝液Ａを４容量用いて３ ５ｍｌ／ｍｉｎの流速で平衡化した。実施例３に従って調製された部分的に精製 されたプラスミドＤＮＡは、０．４５μｍ滅菌アクロディスク シリンジフィル ター(sterile Acrodisc syringe filter,Gelman Sciences)を通し、バイオパイ ロット スーパーループをかけた。サンプルをカラムにかけた後、３倍ベット溶 量の緩衝液Ａで洗浄した。通過したピークは２Ｌのローラーボトル(roller bott le)に集め、ゲル分析用に保存した。このＤＮＡは次に、追加的な２倍のベット 容量に対して、１％ＰＥＧ−８０００を含む１００％緩衝液Ｂを２倍のベット容 量を用いてカラムから溶出させた。フラクション（４５ｍｌ）は１００％緩衝液 Ｂへのステップの後に集められた。クロマトグラフィーの後、カラムは１カラム 容量の２Ｍ ＮａＣｌで洗浄され、そして２カラム容量の１Ｍ ＮａＯＨで洗浄さ れた。フラクションと通過物は、０．８％アガロースゲルによる電気泳動により 分析され、プラスミドＤＮＡを含むフラクションはプールされ、そして０．６容 量の冷却２−プロパノールで沈殿された。 実施例２で得られた結果と同様に、通過物には基本的にプラスミドＤＮＡは存 在しなかった。プラスミドＤＮＡは塩勾配（緩衝液Ｂ）の工程の適用後にのみ溶 出された。 １％ＰＥＧ−８０００の存在下で陰イオン交換クロマトグラフィーにより得ら れたプラスミドＤＮＡは下記に述べるようにゲルろ過クロマトグラフィーにより 更に精製された。 実施例５ ゲルろ過クロマトグラフィー ファルマシアＢＰＥ １００／９５０ゲルろ過カラムはSEPHACRYL（登録商標 ）S-1000 バイオパイロット システムを使用して圧力充填された。最終的なカラ ムの大きさは、１０×８５ｃｍであり、ベット容量は約６．５Ｌであった。実施 例４からイソプロパノールで沈殿させたプラスミドＤＮＡは、６，０００×ｇで ２０分間遠心することより集められ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、１５０ ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡに懸濁させ、０．２２μｍ滅菌酢酸セルロース アクロディスク シリンジ フィルター(sterile cellulose acetate Acrodisc s yringe filter)を通過させた。このＤＮＡをカラムにかけた。このカラムのラン ニング緩衝液は１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡであり、流速は８ｍｌ／ｍｉｎであった。フラクション（４５ｍｌ） は集められ、０．８％アガロースゲル電気泳動により分析された。大部分がスー パーコイルであるＤＮＡを含むフラクションはプールされ、２倍容量の冷エタノ ールにより沈殿された。 本願発明は詳細な説明に記載したこれらの態様のみに限定されるものではない ことを注意すべきである。本願発明の精神を含むいかなる態様もこの範囲内にあ るものと考慮すべきである。しかしながら、この発明は下記の請求の範囲によっ てのみ限定される。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】平成１０年７月２７日（１９９８．７．２７） 【補正内容】 明細書 ＰＥＧ存在下でのカラムクロマトグラフィーを使用するプラスミドＤＮＡの精製 発明の技術分野 本願発明はカラムクロマトグラフィー中でプラスミドＤＮＡを精製する方法、 特に遺伝子治療及び遺伝子免疫化における医薬晶等級としての使用に適したプラ スミドＤＮＡを大規模的に処理する方法に関するものである。 発明の背景 微生物細胞からプラスミドＤＮＡを分離する従来技術は小規模レベル又は実験 室レベルの調製に対してのみ適したものである。広く使用されている技術の一つ は、プラスミドを含む微生物細胞のアルカリ細胞溶解及び酢酸中性化を含み、こ れにより宿主ゲノムＤＮＡ及びタンパク質は沈殿させられ、遠心により取り除か れる。残ったプラスミドＤＮＡはエタノールで沈殿され、塩化セシウム／エチジ ウムブロミド（ＣｓＣｌ／ＥｔＢｒ）密度勾配遠心にかけられる。エチジウムブ ロミドはプラスミドＤＮＡをスーパーコイル状、直鎖状及びニックのある環状形 状のものに分け、そして所望する形状のものが回収される。残余のエチジウムブ ロミドはブタノールによる抽出で除かれ、ＤＮＡはエタノールにより沈殿される 。宿主細胞タンパク質はフェノールによる抽出の繰り返しにより取り除かれ、次 にＤＮＡの沈殿そしてイソアミルアルコール／クロロホルムによる抽出の繰り返 しによりフェノールは取り除かれる。プラスミドＤＮＡの分離及び精製に使用さ れるこれらの一般的実験法は製造方法には適していない。まして、これらの方法 は遺伝子治療又は遺伝子免疫化における医薬品等級としての使用に適したプラス ミドＤＮＡの生産には適していない。密度勾配遠心は規模を拡張できないし、エ チジウムブロミドは突然変異原であると知られており、フェノールは有害な化学 物質であり、この方法は労働集約的である。 組換えプラスミドＤＮＡを大規模的に精製する最近の努力はポリエチレングリ コール（ＰＥＧ）を使用した示差沈殿、そしてイオン交換及び／又はサイズ排除 クロマトグラフィーに向けられている。Ｈｏｒｎら、Hum.Gene.Ther.,6:565-573 ,1995;PCT出願 No．WO95/21250。この方法を使用したプラスミドＤＮＡの収率 は一般的に約５０％である。PCT出願 No．WO96/02658は細菌細胞の溶解、陰イ オン交換クロマトグラフィー及び逆相ＨＰＬＣを含む大規模なプラスミドＤＮＡ の精製を開示している。ＤＥ４３２１９０４Ａ１はカオトロピックの塩の存在下 または１Ｍ以上の塩濃度を有する溶液の存在下で、シリカまたはガラスクロマト グラフィーを使用して核酸混合物を分離する方法を教示している。しかし、プラ スミドＤＮＡのクロマトグラフィーによる精製の主な問題は、所望の生産物が鋭 いピークではなく、広い尾を引いたスメアとして抽出され、そして通過物中に現 れることであり、従って溶解成分からの分離が妨げられる。 ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、三価陽イオン（例えば、ヘキサミンコバ ルト（ＩＩＩ）、スペルミジン）、アルコール及びポリビニルピロリジンを含む 多くの試薬は、ＤＮＡ分子が伸張したコイル状から緻密な球状に凝集するのを促 進させる。吉川ら、J.Am.Chem.Soc.,118:929-930,1996;皆川ら Biopolymers,34 ;555-558,1994;アルスコットら Biopolymers,30:619-630,1990及びラーマンら Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,68;1886-1890,1971。ポリエチレングリコールの ＤＮＡ分子を凝集させる能力は、６．０Ｍで転移点になり（吉川ら）、１．９− １０．０Ｍ ＰＥＧ濃度（皆川ら）で起こるようである。すなわち、低いＰＥＧ 濃度では、ＤＮＡ分子は伸張したコイル状態で存在し、高いＰＥＧ濃度ではＤＮ Ａ分子は小さな球状の状態に縮んでいる（皆川ら）。 請求の範囲 １．細胞溶解物の夾雑物からプラスミドＤＮＡを精製する方法にあって、 （ａ）溶解物を調製する工程、 （ｂ）前記溶解物から不純物を取り除くことにより、不純物を取り除いた溶解 物を生成させる工程、 （ｃ）前記不純物を取り除いた溶解物に短鎖重合アルコールを加える工程、 （ｄ）クロマトグラフィーマトリックスに前記溶解物を接触させることにより 、前記不純物を取り除いた溶解物中に存在するプラスミドＤＮＡを１Ｍ濃度以下 の塩を含む緩衝液で平衡化した前記カラムクロマトグラフィーマトリックスに結 合させる工程、及び、 （ｅ）前記クロマトグラフィーマトリックスに溶離剤を接触させるより、前記 プラスミドＤＮＡを溶出させる工程、 を含む方法。 ２．前記クロマトグラフィーマトリックスが約０．７Ｍの塩濃度の存在下で平衡 化されている請求項１に記載の方法。 ３．細胞溶解物の夾雑物からプラスミドＤＮＡを精製する方法にあって、 （ａ）溶解物を調製する工程、 （ｂ）前記溶解物から不純物を取り除くことにより、不純物を取り除いた溶解 物を生成する工程、 （ｃ）前記不純物を取り除いた溶解物に短鎖重合アルコールを加える工程、 （ｄ）非ガラスクロマトグラフィーマトリックスに前記溶解物を接触させるこ とにより、前記不純物を取り除いた溶解物中に存在するプラスミドＤＮＡを前記 非ガラスカラムクロマトグラフィーマトリックスに結合させる工程、及び、 （ｅ）前記非ガラスクロマトグラフィーマトリックスに溶離剤を接触させるこ とにより、前記プラスミドＤＮＡを溶出させる工程、 を含む方法。 ４．前記非ガラスクロマトグラフィーマトリックスが陰イオン交換クロマトグラ フィーマトリックスである請求項３に記載の方法。 ５．プラスミドＤＮＡの収率が９０％と同等か、または９０％以上である請求項 １又は２に記載の方法。 ６．前記調製工程が塩基希釈溶液及び洗浄剤による溶解である請求項１又は２に 記載の方法。 ７．前記不純物を取り除く工程が珪藻土を用いたろ過である請求項１又は２に記 載の方法。 ８．前記短鎖重合アルコールがポリエチレングリコールである請求項１又は２に 記載の方法。 ９．前記ポリエチレングリコールが約０．１から約４％（ｗ／ｖ）の間の量で加 えられる請求項８に記載の方法。 １０．前記ポリエチレングリコールが約１％の量で加えられる請求項９に記載の 方法。 １１．前記ポリエチレングリコールが約７，０００から約９，０００の平均分子 量を有する請求項８に記載の方法。 １２．前記ポリエチレングリコールがＰＥＧ−８０００である請求項１１に記載 の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 マークェット，マグダ アメリカ合衆国，92037 カリフォルニア, ラ ホラ，アベニーダ デ ラス オンダ ス 8540

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．カラムクロマトグラフィーを使用して生物学的混合物からプラスミドＤＮＡ を精製する方法であって、 前記混合物に短鎖重合アルコールを加える工程、及び、 前記混合物からクロマトグラフィーにより前記ＤＮＡを分離する工程、 を含む改良された方法。 ２．前記短鎖重合アルコールがポリエチレングリコールである請求項１に記載の 方法。 ３．前記ポリエチレングリコールが約０．１から約４％（ｗ／ｖ）の間の量で加 えられる請求項２に記載の方法。 ４．前記ポリエチレングリコールが約１％（ｗ／ｖ）の量で加えられる請求項３ に記載の方法。 ５．前記ポリエチレングリコールが約７，０００から約９，０００の平均分子量 を有する請求項２に記載の方法。 ６．前記ポリエチレングリコールがＰＥＧ−８０００である請求項５に記載の方 法。 ７．前記分離工程が陰イオン交換クロマトグラフィーである請求項１に記載の方 法。 ８．宿主細胞不純物からプラスミドＤＮＡを精製する方法であって、 前記プラスミドＤＮＡと宿主細胞不純物を含む溶液に、カラムクロマトグラフ ィー中に前記宿主細胞不純物から前記プラスミドＤＮＡを分離させるのに十分な 量の短鎖重合アルコールを加える工程、及び、 前記カラムクロマトグラフィーを行い、これにより前記宿主細胞不純物から前 記プラスミドＤＮＡを精製する工程、 を含む方法。 ９．前記短鎖重合アルコールがポリエチレングリコールである請求項８に記載の 方法。 １０．前記ポリエチレングリコールが約０．１から約４％（ｗ／ｖ）の間の量で 加えられる請求項９に記載の方法。 １１．前記ポリエチレングリコールが約１％（ｗ／ｖ）の量で加えられる請求項 １０に記載の方法。 １２．前記ポリエチレングリコールが約７，０００から約９，０００の平均分子 量を有する請求項９に記載の方法。 １３．前記ポリエチレングリコールがＰＥＧ−８０００である請求項１２に記載 の方法。 １４．前記クロマトグラフィーが陰イオン交換クロマトグラフィーである請求項 ８に記載の方法。 １５．細胞溶解物の夾雑物からプラスミドＤＮＡを大規模に精製する方法であっ て、 前記プラスミドＤＮＡと溶解物の夾雑物を含む溶液に、前記プラスミドＤＮＡ を凝集させるのに十分量のＤＮＡ凝集剤を加える工程、及び、 前記凝集剤を含む前記溶液をクロマトグラフィーカラムに通過させ、これによ り前記溶解物の夾雑物から前記プラスミドＤＮＡを精製する工程、 を含む方法。 １６．前記凝集剤が短鎖重合アルコールである請求項１５に記載の方法。 １７．前記短鎖重合アルコールがポリエチレングリコールである請求項１６に記 載の方法。 １８．前記ポリエチレングリコールが約０．１から約４％（ｗ／ｖ）の間の量で 加えられる請求項１７に記載の方法。 １９．前記ポリエチレングリコールが約１％（ｗ／ｖ）の量で加えられる請求項 １８に記載の方法。 ２０．前記ポリエチレングリコールが約７，０００から約９，０００の平均分子 量を有する請求項１７に記載の方法。 ２１．前記ポリエチレングリコールがＰＥＧ−８０００である請求項２０に記載 の方法。 ２２．前記クロマトグラフィーが陰イオン交換クロマトグラフィーである請求項 １５に記載の方法。