KR100463415B1 - 세균내ｄｎａ 또는 ｒｎａ로부터 리포폴리사카라이드를제거하는 방법 - Google Patents

세균내ｄｎａ 또는 ｒｎａ로부터 리포폴리사카라이드를제거하는 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR100463415B1
KR100463415B1 KR10-2001-0078665A KR20010078665A KR100463415B1 KR 100463415 B1 KR100463415 B1 KR 100463415B1 KR 20010078665 A KR20010078665 A KR 20010078665A KR 100463415 B1 KR100463415 B1 KR 100463415B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
dna
lipopolysaccharide
supernatant
rna
precipitate
Prior art date
Application number
KR10-2001-0078665A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20030048684A (ko
Inventor
고형곤
김연향
전용감
송후근
박완제
Original Assignee
씨제이 주식회사
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 씨제이 주식회사 filed Critical 씨제이 주식회사
Priority to KR10-2001-0078665A priority Critical patent/KR100463415B1/ko
Publication of KR20030048684A publication Critical patent/KR20030048684A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100463415B1 publication Critical patent/KR100463415B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
    • C07H1/06—Separation; Purification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

본 발명은 세균에서 DNA를 분리정제할 경우 혼입되어서 제거하기 어려운 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharides, LPS)를 제거하는 방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 알콜 농도의 변화에 따른 리포폴리사카라이드 및 DNA의 침전율의 차이를 이용하여 박테리아 DNA 또는 RNA로부터 리포폴리사카라이드를 제거하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면 종래에는 DNA 또는 RNA와 리포폴리사카라이드의 폴리사카라이드로서의 공통성에 기인하여 세균의 DNA 또는 RNA로부터 분리가 어려웠던 것을 극복하고 간편하고 효율적으로 세균의 DNA 또는 RNA로부터 리포폴리사카라이드를 제거할 수 있다.

Description

세균내ＤＮＡ 또는 ＲＮＡ로부터 리포폴리사카라이드를 제거하는 방법{The preparation of LPS-free bacterial DNA}
본 발명은 세균에서 DNA를 분리정제할 경우 혼입되어서 제거하기 어려운 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide, LPS)를 제거하는 방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 알콜 농도의 변화에 따른 리포폴리사카라이드 및 DNA의 침전율의 차이를 이용하여 박테리아 DNA 또는 RNA로부터 리포폴리사카라이드를 제거하는 방법에 관한 것이다.
리포폴리사카라이드는 리피드 A(lipid A), 코어 폴리사카라이드(core polysaccharide), O-특이적 폴리사카라이드 사이드 체인(O-specific polysaccharide side chain)으로 구성된다.
LPS는 열에 안정하며 강한 항원성을 나타낸다. 그 분자량은 10 kDa의 기본 단위로 여러 개의 복합체를 이루어 그 크기는 10,000 kDa까지 다양하며 화학구조상 양쪽 친화성 복합물이다.
리포폴리사카라이드는 동물에서 염증반응을 일으키며, 대부분은Salmonella와E.coli와 같은 그람 음성균의 세포벽 바깥막 (outermembrane) 에 존재한다. 리포폴리사카라이드 중 이러한 염증반응의 원인인 독성을 갖는 부분은 지질부분으로서 이것을 엔도톡신이라고 부른다. 엔도톡신이 인체에 유입되면 발열, 백혈구수의 변화, 혈관 응고, 종양괴사, 저혈압, 쇼크 등이 일어나며, 또한 엔도톡신은 IL-1, IL-6, IL-8, TNF등의 각종 cytokine의 생산, 면역계 보체 활성화, 혈액응고 활성화 등을 일으키고, B 세포에 마이토젠(mitogen)으로서 폴리클로날 (ployclonal) 분화와 B세포 증식, Ig M, Ig G 항체 생성을 증가시킨다.
이러한 엔도톡신을 함유하는 리포폴리사카라이드는 DNA 또는 RNA를 세균으로부터 분리할 경우 혼입된다. DNA 또는 RNA가 질병의 치료방법으로서 임상적으로 널리 시도되고 있는 현 시점에서 리포폴리사카라이드가 혼입된 DNA 또는 RNA로부터 리포폴리사카라이드를 제거하는 것이 필수적일 것이다.
엔도톡신으로부터 단백질을 분리하는 방법에는 초원심 분리방법, 크로마토그래피에 의한 분리방법 등이 학계에 보고되어 있으나, DNA 또는 RNA로부터 리포폴리사카라이드를 효과적으로 제거하는 방법은 보고된 바 없다. 이는 DNA 및 RNA의 구조는 넓은 범위로 볼 때, 폴리사카라이드(데옥시리보오스 혹은 리보오스의 폴리머) 의 범주에 포함될 수 있으며 리포폴리사카라이드 또한 폴리사카라이드로서 그 성질이 유사하기 때문이다.
다만, 실험실 수준의 연구규모로 엔도톡신을 제거하는 방법이 존재하지만, detoxi gel column을 사용하는 방법이 고작이다(Tibtech. 1999. 4, 17권, 169-174). 또한 핵산 함유 제제를 반투막에 접촉시키면서 한번 또는 여러 번 통과시켜 핵산분자는 멤브레인에 의해 보유되고 더 낮은 분자량을 갖는 물질은 멤브레인을 통과 및/또는 멤브레인에 흡착될 수 있어서 본질적으로 엔도톡신이 없는 핵산용액을 수득하는 것에 특징이 있는 핵산제제로부터 엑도톡신을 분리하는 방법이 보고되어 있다 (특허공개 2000-69943).
그러나 이러한 방법은 대량의 DNA를 정제하기에는 많은 문제점을 갖고 있으며, 경제적 측면에서 제품의 생산에서 가격인상의 요인이 될 수 있다.
이에 본 발명자들은 박테리아 DNA를 질병치료에 적용 시, DNA의 제조 과정 중 혼합되는 리포폴리사카라이드가 포유동물의 면역체계에 영향을 미칠 수 있음을 인식하고, 이 엔도톡신의 주요 구성성분이 리포폴리사카라이드임을 고려하여 이의 제거를 위하여 노력하였다.
그 결과, 넓은 의미의 폴리사카라이드인 DNA 또는 RNA가 알코올에서 침전반응이 일어난다는 종래의 알려진 사실(Molecular cloning, A laboratory manual, 2판, E10~E11)과 리포폴리사카라이드 또한 알코올에서 침전반응이 일어난다는 본 발명자에 의해 새롭게 발견된 사실을 인지하고, 이러한 리포폴리사카라이드 및 DNA 또는 RNA의 침전율이 알코올의 농도에 따라 달라짐을 발견하게 되어 박테리아의 DNA로부터 리포폴리사카라이드를 제거하는 방법을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 주된 목적은 알코올 농도의 변화에 따른 침전율의 차이를 이용하여 DNA 또는 RNA로부터 리포폴리사카라이드를 제거하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기의 방법으로 리포폴리사카라이드가 제거된 DNA 또는 RNA를 의약품의 원료로 사용하는 방법을 제공하는데 있다.
도 1은 실시예 1의 A 및 B에서의 박테리아의 DNA로부터 에탄올의 함량에 따라 리포폴리사카라이드를 제거하는 처리과정을 도식화 한 것이다.
도 2는 실시예 1의 A 및 B에서의 박테리아의 DNA로부터 에탄올의 함량에 따라 리포폴리사카라이드를 제거하는 처리과정의 각 단계에서 생성된 침전물의 리포폴리사카라이드와 DNA의 함량을 측정하여 도시한 그래프이다.
도 3은 실시예 2의 반복처리과정을 포함하는 리포폴리사카라이드의 제거 처리과정의 각 단계에서 측정한 DNA의 순도, 그 함량 및 리포폴리사카라이드의 존재여부에 대해 나타낸 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 알코올 농도의 변화에 따른 리포폴리사카라이드 및 DNA 또는 RNA의 침전율의 차이를 이용하여 박테리아 DNA 또는 RNA로부터 리포폴리사카라이드를 제거하는 방법을 제공한다.
상기 방법에서 알코올은 바람직하게는 메탄올, 에탄올, 또는 이소프로판올이며 가장 바람직하게는 에탄올이다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기의 방법으로 리포폴리사카라이드가 제거된 DNA 또는 RNA를 의약품의 원료로 사용하는 방법을 제공한다.
이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.알코올은 폴리뉴클레오티드를 침전시키는 특성을 갖는다. 폴리뉴클레오티드를 침전시키는 알코올은 또한 리포폴리사카라이드를 침전시키는 특성도 갖는다. 알코올이 폴리뉴클레오티드와 리포폴리사카라이드를 모두 침전시키는 특성을 지니고 있지만, 물질은 각각 자신 고유의 침전상수를 갖는다.
본 발명은 뉴클레오티드와 리포폴리사카라이드의 침전상수의 차이를 이용한 분별침전 (differential precipitation) 의 원리에 따라 세균의 DNA 또는 RNA로부터 리포폴리사카라이드를 제거하는 방법을 제공하는 것이다.
여기서 알코올은 메탄올, 에탄올, 이소프로판올이 바람직하며 가장 바람직하게는 에탄올이다.
원리와 적용방법은 매우 간단하며 편리하다. 리포폴리사카라이드는 DNA 또는 RNA와 같이 (-)전하를 띄고 있으며, 그 크기도 다양하고, 수용액 상태에서는 혼재해 있어서 분리가 불가능하나, 에탄올의 농도에 따라 DNA와는 다른 침전율을 보인다.
가장 바람직한 경우에 해당하는 알코올이 에탄올인 경우에는 박테리아로부터 분리한 DNA 또는 RNA 시료에 대하여
1 ~ 30 부피 %가 되도록 에탄올을 상기 시료에 가한 뒤 5,000 ~ 15,000 rpm으로, 1초 ~ 72시간동안, 0oC ~ 30oC에서 원심분리한 뒤 상등액을 취하는 제 1단계;
31 ~ 50 부피 %가 되도록 에탄올을 제 1단계에서 취한 상등액에 가한 뒤 1단계와 같은 범위의 원심분리 조건에서 원심분리한 뒤 상등액을 취하는 제 2단계;
51 ~ 100 부피 %가 되도록 에탄올을 제 2단계에서 취한 상등액에 가한 뒤 1단계와 같은 범위의 원심분리 조건에서 원심분리한 뒤 상등액을 취하는 제 3단계;
100 ~ 1000 부피 %가 되도록 에탄올을 제 3단계에서 취한 상등액에 가한 뒤 1단계와 같은 범위의 원심분리 조건에서 원심분리한 뒤 침전물을 취하는 제 4단계를 포함하는 것을 특징으로하여 DNA 또는 RNA로부터 리포폴리사카라이드를 분리한다.
상기 각 단계의 처리과정에서 원심분리를 하지 않고 처리할 수도 있다.
이 경우 상기 제 1 단계 및 2 단계에 있어서 원심분리하여 제거된 침전물은 리포폴리사카라이드의 침전물에 해당하며, 제 3 단계에서 원심분리하여 제거되는 침전물은 리포폴리사카라이드와 DNA 또는 RNA가 혼합된 침전물에 해당하고, 마지막으로 제 4 단계에서 원심분리하여 취하는 침전물은 순수하게 DNA 또는 RNA 만이 존재하는 침전물이다.
상기 방법에 있어서, 보다 바람직하게는 상기 제 3단계에서 얻어지는 침전물을 녹여서 희석하고 다시 상기 제 1단계 내지 4단계까지의 공정을 반복적으로 행하여 DNA 또는 RNA의 수율을 높일 수도 있다.
또한 상기 방법에 있어서, 제 1 내지 4 단계의 공정을 행하기 전에 우선 클로로포름, 에테르 또는 페놀을 가하여 온도범위 -70oC~ 30oC 에서 1초 ~ 72시간 동안 방치하고 5,000~15,000 rpm으로 1초~72시간동안 0oC~ 30oC에서 원심분리하여 클로로포름층, 에테르층 또는 페놀층을 제거하는 공정을 더 포함하는 것이 바람직하다. 제거된 클로로포름층, 에테르층 또는 페놀층에는 DNA는 존재하지 않고 리포폴리사카라이드가 용해되어 있어 이러한 공정을 거침으로서 리포폴리사카라이드를 제거하는데 더 도움이 되는 것이다. 상기 처리공정에서도 원심분리 공정을 생략할 수도 있다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명은 리포폴리사카라이드가 제거된 DNA 또는 RNA를 의약품의 원료로 사용하는 방법을 제공한다. 각종 질병, 예를 들어 간암, 뇌암, 대장암, 췌장암, 폐암, 간암, 위암, 소장암, 식도암, 전립선암, 유방암, 혈액암, 림프암, 피부암, 각종 종양, 혈관생성억제 질병, 척수종양, 자궁암, 백혈병, 흉선암, 신경종양, 식도암, 항문암, 난소암, 폐암 등을 포함한 각종 모든 암을 치료하기 위하여 박테리아 DNA 또는 RNA를 이용한 의약품이 제조되고 있으며, 이러한 의약품을 제조하기 위한 원료로서 DNA 또는 RNA를 사용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 것 일뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 실시예로 한정되는 것은 아니다.
(실시예)
실시예 1
A. 박테리아의 파쇄 및 유전자의 분리
박테리아의 유전자 DNA를 분리하기 위하여, 10~12 시간 배양한 후, 박테리아를 5,000 rpm, 4oC에서 20 분간 원심분리하여 회수하였다. 회수한 박테리아(25 gram)를 500 ml의 TEN (10 mM Tris, 1 mM EDTA, 0.1M NaCl) 완충용액으로 씻어주고, 5,000 rpm, 4oC에서 30 분간 원심분리하여 회수하였다. 회수한 박테리아에 TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA) 완충용액을 넣고 완전히 현탁시킨 후, 1% sodium dodecyl sulfate (SDS)와 프로틴아제 K (proteinase K)를 넣었다. 여기에 리소짐을 넣고 30분간 방치한 후, 1% Hexadecyl trimethyl ammonium bromide (CTAB) 용액을 넣어 37oC에서 방치하였다. 여기에 동일 부피의 클로로포름을 넣어 4oC에서 하루동안 방치하고, 12,000 rpm, 4oC에서 30분간 원심분리하여 클로로포름층을 제거하였다. 이어서 클로로포름에 의한 추출을 2회 더 실시하였다. 여기에 200부피%의 에탄올을 넣어 리포폴리사카라이드가 혼입된 DNA를 침전시킨 뒤, 침전물을 TE (10 mM Tris, 1mM EDTA) 완충용액에 녹여 유전자 DNA를 분리하였다.
B. 박테리아 DNA로부터 LPS의 분리
실시예 1에서 분리된 DNA시료에 대하여 30 부피%의 에탄올과 1/3 부피의 10M 아세트산암모늄를 넣고, 4oC에서 방치한 뒤, 12,000 rpm, 4oC에서, 30분간 원심분리하여 침전물과 분리하여 상등액을 1차 회수하였다. 1차 회수된 상등액에 최초시료에 대하여 에탄올 농도가 50부피%가 되도록 가하고 4oC에서 방치한 뒤, 12,000 rpm, 4oC에서 30 분간 원심분리하여 침전물과 분리하여 상등액을 2차 회수하였다. 이어 2차 상등액에 최초시료에 대하여 에탄올 농도가 100부피%가 되도록 가하고 4oC에서 방치한 뒤, 12,000 rpm, 4oC에서 30 분동안 원심분리하여 침전물과 분리하여상등액을 3차 회수하였다. 이어 3차 상등액에 최초시료에 대하여 에탄올 농도가 200부피%가 되도록 가하고 4oC에서 방치한 뒤, 12,000 rpm, 4oC에서 30 분간 원심분리하여 상등액을 버리고 침전물을 얻었다. 회수된 침전물을 리포폴리사카라이드가 없는 TE (10mM Tris, 1mM EDTA)에 녹였다.
상기 A 및 B의 처리과정을 보다 간략하고 명확히 나타내기 위해 각 단계를 도 1에 도시하였다.
C. DNA의 정량
상기 A 및 B의 각 처리단계에서 생성된 침전물에 함유된 DNA의 함량을 측정하였다. 구체적으로는 상기 각 단계에서 생성된 침전물을 리포폴리사카라이드가 없는 TE (10mM Tris, 1mM EDTA)에 녹였다. 침전물을 녹인 용액의 일부를 희석하여 260nm에서 흡광도를 측정하여 정량하였다. 흡광도 수치로부터 DNA의 양을 계산하는 방법은 다음과 같다.
DNA의 양(㎍/ml) = O.D.260nmx 50 (㎍/ml) x 희석 배수
D. 리포폴리사카라이드의 정량
상기 A 및 B의 세포 미정제물 및 각 단계에서 생성된 침전물에 함유된 리포폴리사카라이드의 함량을 측정하였다. 리포폴리사카라이드는 Limulus Amebocyte Lysate kit (BioWhittaker) 로 측정하였다. 구체적으로는 상기 각 단계에서 생성된 침전물을 리포폴리사카라이드가 없는 TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA) 에 녹였다.
리포폴리사카라이드의 함유 정도를 측정하고자 상기 A 및 B의 각 처리단계에서 생성된 침전물을 용해한 시험용액과 리포폴리사카라이드 표준 용액을 각각 순차적으로 희석하여 37oC에서 미리 데운 96 웰 플레이트 (well plate) 에 각각 50 ㎕씩 넣었다. 이어 색소생산성 용액 (chromogenic solution) 을 50 ㎕씩 넣고 37oC에서 10분간 방치한 뒤, 기질 (substrate) 용액을 넣어 37oC에서 발색시켰다. 6분 경과 후, 반응을 정지용액 (stop solution) (25 % 빙초산) 으로 정지시킨 뒤, 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준용액의 리포폴리사카라이드 함유량은 27 EU/ml 이다.
흡광도 수치로부터 리포폴리사카라이드의 양을 계산하는 방법은 다음과 같다.
LPS의 양 (EU/ml) = ( ΔO.D.405nm- y 절편) / 기울기
ΔO.D.405nm :시험용액의 흡광도 값 - 리포폴리사카라이드가 없는 물의 흡광도의 값
N: 사용되어진 표준용액의 수
x (EU/ml): 표준용액의 리포폴리사카라이드의 농도
y: 표준 용액의 평균 ΔO.D.405nm의 값
Σx (EU/ml): 표준용액의 리포폴리사카라이드의 농도의 합
Σy : 표준용액의 평균 ΔO.D.405nm값의 총합
Sx: x의 표준 편차 =
Sy: y의 표준 편차 =
y-절편: Σy/N - (Σx/N x 기울기)
기울기: (Sy/Sx)r
r: ((NΣxy-(Σx)(Σy))/(N(N-1)SxSy)
상기 실시예 1의 C 및 D에서 상기와 같은 방법으로 측정된 DNA의 양 및 리포폴리사카라이드의 양을 하기의 표 1에 나타내었다.
엔도톡신의 측정치 (EU/mg DNA) DNA 회수량(mg)
세포 미정제물 >1012 N.D.1
클로로포름 처리 클로로포름 처리 N.D. 2 N.D. 2
*200 % 에탄올 침전물 0.54 x 103 70.6
에탄올 침전 30 % 에탄올 침전물 71 0.47
50 % 에탄올 침전물 37.5 0.35
100 % 에탄올 침전물 4.7 4.52
200 % 에탄올 침전물 0 7.9
N.D. = not determined : 시험해보았으나, 측정이 불가능함.
N.D.1: 세포미정제물내의 불순물 (단백질, 지질, 당 등)이 많아서 측정이 안됨.
N.D.2: 클로로포름처리 후 상태는 잔여분의 클로로포름으로 인해 측정이 안됨.
* : 클로로포름처리 후의 용액내의 함유된 DNA와 리포폴리사카라이드의 량을측정하기 위해서 200 부피%의 에탄올 침전하여 TE에 침전물을 녹인후, 측정하였슴.
실시예 2
반복 처리과정을 포함하는 리포폴리사카라이드의 제거방법
박테리아의 파쇄 및 유전자의 분리
박테리아의 유전자 DNA를 분리하기 위하여, 10~12시간 배양한 후, 박테리아를 5,000 rpm, 4oC에서 20 분간 원심분리하여 회수하였다. 회수한 박테리아(75g)를 1000 ml의 TEN (10 mM Tris, 1 mM EDTA, 0.1M NaCl) 완충용액으로 씻어주고, 5,000 rpm, 4oC에서 30분간 원심분리하여 회수하였다. 회수한 박테리아에 TE(10 mM Tris, 1 mM EDTA) 완충용액을 넣고 완전히 현탁시킨 후, 1% sodium dodecyl sulfate (SDS) 와 프로틴아제 K (proteinase K)를 넣었다. 여기에 리소짐을 넣고 30분간 방치한 후, 1% 헥사데실 트리메틸 암모늄 브로마이드(Hexadecyl trimethyl ammonium bromide)(CTAB) 용액을 넣어 37oC에서 방치하였다. 여기에 동일 부피의 클로로포름을 넣어 4oC에서 하루동안 방치하고, 12,000 rpm, 4oC에서 30분동안 원심분리하여 클로로포름층을 제거하였다. 이어서 클로로포름에 의한 추출을 2회 더 실시하였다. 여기에 200부피%의 에탄올을 넣어 리포폴리사카라이드가 혼입된 DNA를 침전시킨 뒤, TE (10mM Tris, 1mM EDTA) 완충용액에 녹인 후, 에탄올을 이용한 리포폴리사카라이드의 반복처리과정을 하기 B에서와 같이 하였다 .
B. 박테리아 DNA로부터 LPS의 분리
상기 A에서 분리된 DNA시료에 대하여 30 부피%의 에탄올과 1/3 부피의 10M 아세트산암모늄를 넣고, 4oC에서 방치한 뒤, 12,000 rpm, 4oC에서, 30분간 원심분리하여 침전물과 분리하여 상등액을 1차 회수하였다. 1차 회수된 상등액에 최초시료에 대하여 에탄올 농도가 50부피%가 되도록 가하고 4oC에서 방치한 뒤, 12,000 rpm, 4oC에서 30 분간 원심분리하여 침전물과 분리하여 상등액을 2차 회수하였다. 이어 2차 상등액에 최초시료에 대하여 에탄올 농도가 100부피%가 되도록 가하고 4oC에서 방치한 뒤, 12,000 rpm, 4oC에서 30 분동안 원심분리하여 침전물과 분리하여 상등액을 3차 회수하였다. 이어 3차 상등액에 최초시료에 대하여 에탄올 농도가 200부피%가 되도록 가하고 4oC에서 방치한 뒤, 12,000 rpm, 4oC에서 30 분간 원심분리하여 상등액을 버리고 침전물을 얻었다. 침전물을 리포폴리사카라이드가 없는 TE (10mM Tris, 1mM EDTA) 에 녹였다.
C. LPS 제거의 반복적인 처리과정: 도3의 (2), (3), (4)
도3의 (2)과정
상기의 에탄올 농도가 100부피%가 되어 침전된 침전물을 TE(10 mM Tris, 1mM EDTA)에 녹이고 에탄올 농도가 50부피%가 되도록 가하고 4oC에서 방치한 뒤, 12,000 rpm, 4oC에서 30 분간 원심분리하여 상등액을 다시 1차 회수하였다. 이어 1차 상등액에 최초시료에 대하여 에탄올 농도가 100부피%가 되도록 가하고 4oC에서 방치한 뒤, 12,000 rpm, 4oC에서 30 분동안 원심분리하여 상등액을 2차 회수하였다. 이어 2차 상등액에 최초시료에 대하여 에탄올 농도가 200부피%가 되도록 가하고 4oC에서 방치한 뒤, 12,000 rpm, 4oC에서 30 분간 원심분리하여 상등액을 회수하고 침전물을 얻었다. 침전물을 리포폴리사카라이드가 없는 TE(10mM Tris, 1mM EDTA) 에 녹였다.
도3의 (3)과정
상기 과정의 100부피%의 침전물을 회수하여 TE (10mM Tris, 1mM EDTA) 에 녹이고 에탄올 농도가 50부피%가 되도록 가하고 4oC에서 방치한 뒤, 12,000 rpm, 4oC에서 30 분간 원심분리하여 상등액을 다시 1차 회수하였다. 이어 1차 상등액에 최초시료에 대하여 에탄올 농도가 100부피%가 되도록 가하고 4oC에서 방치한 뒤, 12,000 rpm, 4oC에서 30 분동안 원심분리하여 상등액을 2차 회수하였다. 이어 2차 상등액에 최초시료에 대하여 에탄올 농도가 200부피%가 되도록 가하고 4oC에서 방치한 뒤, 12,000 rpm, 4oC에서 30 분간 원심분리하여 상등액을 회수하고 침전물을 얻었다. 침전물을 리포폴리사카라이드가 없는 TE (10mM Tris, 1mM EDTA) 에 녹였다.
도3의 (4)의 과정
DNA량과 리포폴리사카라이드가 혼입되어 있는 에탄올 100부피%의 침전물을 다시 회수하여 TE (10mM Tris, 1mM EDTA) 에 녹이고 에탄올 농도가 75부피%가 되도록 가하고 4oC에서 방치한 뒤, 12,000 rpm, 4oC에서 30 분간 원심분리하여 침전물과 분리하여 상등액을 다시 1차 회수하였다. 이어 1차 상등액에 최초시료에 대하여 에탄올 농도가 90부피%가 되도록 가하고 4oC에서 방치한 뒤, 12,000 rpm, 4oC에서 30 분동안 원심분리하여 침전물과 분리하여 상등액을 2차 회수하였다. 이어 2차 상등액에 최초시료에 대하여 에탄올 농도가 200부피%가 되도록 가하고 4oC에서 방치한 뒤, 12,000 rpm, 4oC에서 30 분간 원심분리하여 상등액을 버리고 침전물을 얻었다. 침전물을 리포폴리사카라이드가 없는 TE (10mM Tris, 1mM EDTA) 에 녹였다
상기 실시예 2의 C 에서의 각 단계에서 회수된 침전물을 리포폴리사카라이드가 없는 TE (10mM Tris, 1mM EDTA) 에 녹이고 DNA의 양 및 리포폴리사카라이드의 양을 측정하여 도 3에 나타내었다.
D. 각 단계의 침전물에 함유된 DNA의 질량, 순도 및 LPS의 유무측정
상기의 B, 및 C의 각 처리단계에서 생성된 침전물에 함유된 DNA의 질량과 그 순도 및 LPS의 혼입유무에 대해 시험하였다. DNA의 질량과 LPS의 혼입유무를 측정하는 방법은 상기 실시예 1의 C 및 D에서와 동일한 방법으로 행하였다.
DNA의 순도는 260 nm 파장의 광선에서 측정한 흡광도 대한 280 nm 파장의 광선에서 측정한 흡광도의 비율(260/280nm)로 측정하였다. 그 비율이 1.8 내지 2.0이면 순수한 DNA라고 할 수 있다.
상기의 측정 결과를 도 3에 나타내었다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 종래에는 DNA 또는 RNA와 리포폴리사카라이드의 폴리사카라이드로서의 공통성에 기인하여 세균의 DNA 또는 RNA로부터 분리가 어려웠던 것을 극복하고 간편하고 효율적으로 세균의 DNA 또는 RNA로부터 리포폴리사카라이드를 제거할 수 있다.

Claims (7)

  1. 박테리아 DNA 또는 RNA 시료에 알코올을 가하여 침전되는 LPS를 제거하고 상등액을 취한 다음, 그 상등액에 알코올을 추가로 더 가하여 침전되는 LPS를 제거하고 상등액을 취하는 과정을 알코올이 상기 시료에 대하여 30-100부피%가 될 때까지 반복하는 단계;
    그리하여 획득된 상등액에 알코올이 상기 시료에 대하여 100-1000 부피%가 되도록 알코올 더 부가함으로써 형성되는 DNA 또는 RNA 침전물을 취하는 단계를 포함하는, 박테리아 DNA 또는 RNA로부터 리포폴리사카라이드를 제거하는 방법.
  2. 삭제
  3. 제 1항에 있어서, 상기 알코올은 바람직하게는 메탄올, 에탄올, 또는 이소프로판올인 것을 특징으로 하는 박테리아 DNA 또는 RNA로부터 리포폴리사카라이드를 제거하는 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 알코올을 박테리아 DNA 또는 RNA 시료에 대하여
    1~30부피%가 되도록 알코올을 상기 시료에 가한 뒤, 5,000~15,000 rpm으로 1초 ~ 72 시간동안, 0oC~30oC 에서 원심분리한 뒤 상등액을 취하는 제 1단계;
    31~50부피%가 되도록 제 1단계에서 취한 상등액에 가한 뒤 1단계와 같은 범위의 원심분리 조건에서 원심분리한 뒤 상등액을 취하는 제 2단계;
    51~100부피%가 되도록 제 2단계에서 취한 상등액에 가한 뒤 1단계와 같은 범위의 원심분리 조건에서 원심분리한 뒤 상등액을 취하는 제 3단계;
    100~1000부피%가 되도록 제 3단계에서 취한 상등액에 가한 뒤 1단계와 같은 범위의 원심분리 조건에서 원심분리한 뒤 침전물을 취하는 제 4단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 박테리아 DNA 또는 RNA로부터 리포폴리사카라이드를 제거하는 방법.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 3단계에서 얻어지는 침전물을 희석하여 다시 상기 제 1단계 내지 4단계까지의 처리과정을 행하고 이때 제 3단계에서 다시 얻어지는 침전물을 가지고 동일한 처리과정을 반복적으로 행하여 DNA 또는 RNA의 수율을 높이는 것을 특징으로 하는 박테리아 DNA 또는 RNA로부터 리포폴리사카라이드를 제거하는 방법.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 알코올로 리포폴리사카라이드를 제거하기 전에, 클로로포름, 에테르 또는 페놀을 가하여 -70oC~30oC에서 1초~72시간동안 방치하고 5,000~15,000rpm으로, 1초~72시간동안, 0~30oC에서 원심분리하여 클로로포름층, 에테를층 또는 페놀층을 제거함으로써 리포폴리사카라이드를 제거하는 것을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 삭제
KR10-2001-0078665A 2001-12-12 2001-12-12 세균내ｄｎａ 또는 ｒｎａ로부터 리포폴리사카라이드를제거하는 방법 KR100463415B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2001-0078665A KR100463415B1 (ko) 2001-12-12 2001-12-12 세균내ｄｎａ 또는 ｒｎａ로부터 리포폴리사카라이드를제거하는 방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2001-0078665A KR100463415B1 (ko) 2001-12-12 2001-12-12 세균내ｄｎａ 또는 ｒｎａ로부터 리포폴리사카라이드를제거하는 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20030048684A KR20030048684A (ko) 2003-06-25
KR100463415B1 true KR100463415B1 (ko) 2004-12-23

Family

ID=29574550

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR10-2001-0078665A KR100463415B1 (ko) 2001-12-12 2001-12-12 세균내ｄｎａ 또는 ｒｎａ로부터 리포폴리사카라이드를제거하는 방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR100463415B1 (ko)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0395201A (ja) * 1989-06-12 1991-04-19 Merck & Co Inc グラム陰性多糖類から細菌内毒素を除去するための方法
US5707812A (en) * 1996-08-06 1998-01-13 Vical Incorporated Purification of plasmid DNA during column chromatography
WO2000073318A1 (en) * 1999-05-28 2000-12-07 Bio Science Contract Production Corporation Methods of dna purification and purified dna
US6194562B1 (en) * 1998-04-22 2001-02-27 Promega Corporation Endotoxin reduction in nucleic acid purification
US6197553B1 (en) * 1994-07-15 2001-03-06 Merck & Co., Inc. Method for large scale plasmid purification

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0395201A (ja) * 1989-06-12 1991-04-19 Merck & Co Inc グラム陰性多糖類から細菌内毒素を除去するための方法
US6197553B1 (en) * 1994-07-15 2001-03-06 Merck & Co., Inc. Method for large scale plasmid purification
US5707812A (en) * 1996-08-06 1998-01-13 Vical Incorporated Purification of plasmid DNA during column chromatography
US6194562B1 (en) * 1998-04-22 2001-02-27 Promega Corporation Endotoxin reduction in nucleic acid purification
WO2000073318A1 (en) * 1999-05-28 2000-12-07 Bio Science Contract Production Corporation Methods of dna purification and purified dna

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
논문(폴리마이신 β-agarose gel을 사용하여 DNA로 부터 lipopolysaccharide(LPS)를 제거하기 위한 개선된 방법),1996 *

Also Published As

Publication number Publication date
KR20030048684A (ko) 2003-06-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109790561B (zh) 利用基本上不含凝固蛋白原的鲎阿米巴样细胞溶解物检测内毒素的方法
Mäkelä et al. Enterobacterial common antigen
US11559552B2 (en) Methods and compositions for purification or isolation of microvesicles and exosomes
US9829483B2 (en) Methods of isolating extracellular vesicles
Bray et al. Chemistry of tissues: 2. Polysaccharides showing blood group A-specificity and the nature of the constituent units of the stable carbohydrate residue of the A substance from pepsin
US20210245074A1 (en) Methods And Compositions For Purification Or Isolation Of Microvesicles And Exosomes
WO2007068830A1 (fr) Distinction des meningites bacteriennes et virales
AU2003250270A1 (en) Method for identifying and extracting endotoxin
KR100463415B1 (ko) 세균내ｄｎａ 또는 ｒｎａ로부터 리포폴리사카라이드를제거하는 방법
Wang et al. Inositol metabolism regulates capsule structure and virulence in the human pathogen Cryptococcus neoformans
CN115369112B (zh) 去内毒素质粒提取用结合液及试剂盒及质粒提取方法
Scott et al. The Recovery and Characterization of Acid Glycosaminoglycans in Normal Human Urine: Influence of a Circadian Rhythm
FI74475C (fi) Foerfarande foer framstaellning av nya, ur klebsiella pneumoniae extraherade glykoproteiner.
KR20010039228A (ko) 인삼뿌리 추출물의 산성다당류 분획과 그 제조방법
JP7469336B2 (ja) β－グルカン組成物およびその用途
US20220305405A1 (en) System and method for isolation of intact extracellular vesicles with near-single-vesicle resolution coupled with on-line characterization
CN114432294A (zh) 一种5-去甲川陈皮素及其制备方法与应用
EP1695085B1 (de) Verfahren zum nachweis von endotoxin
US20060078569A1 (en) Method for recovery of photo-inhibited immunological activity
KR102262992B1 (ko) 리포폴리사카라이드 추출용 용매 및 이를 이용한 리포폴리사카라이드 추출 방법
CN111870998A (zh) 一种串联凝集素亲和柱纯化海参多糖装置及其使用方法
US2741653A (en) Method of isolating nucleoproteins
CN113274488B (zh) 一种特异性预防真菌感染的寡糖疫苗及其制备方法
WO2013072393A2 (de) Neues verfahren zur identifizierung von spezifischen markersequenzen für prostatakrebs
KR102390925B1 (ko) 나노포어를 이용한 병원성 미생물의 검출 방법 및 검출키트

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E90F Notification of reason for final refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
J201 Request for trial against refusal decision
AMND Amendment
B701 Decision to grant
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20091001

Year of fee payment: 6

LAPS Lapse due to unpaid annual fee