JP2000507086A - エキスポートキャリヤーの活性を増加してアミノ酸を微生物によって産生する方法 - Google Patents

エキスポートキャリヤーの活性を増加してアミノ酸を微生物によって産生する方法

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Abstract

(57)【要約】 本発明はアミノ酸の微生物による産生方法に関する。この方法は、所望のアミノ酸を産生する微生物のエキスポートキャリヤー活性及び（又は）エキスポート遺伝子発現を増加することを伴う。本発明によれば、単一特異的遺伝子が一定のアミノ酸のエキスポートに関与することが分り、それに基づいて目的のアミノ酸を産生する微生物のエキスポート遺伝子発現及び（又は）エキスポートキャリヤー活性の調節された増加を伴うアミノ酸の微生物による産生方法が、初めて開発された。この方法から得られる、エキスポートキャリヤーの増加された発現又は活性は、分泌割合を増加し、そして所望のアミノ酸のトランスポート（輸送）を増加する。

Description

【発明の詳細な説明】 エキスポートキャリヤーの活性を増加してアミノ酸を微生物によって産生する 方法 本発明は、請求の範囲１ないし２０記載のアミノ酸の微生物による産生方法、 請求の範囲２１ないし２６記載のエキスポート（export）遺伝子、請求の範囲２ ７及び２８記載の調節遺伝子、請求の範囲２９及び３０記載の遺伝子構造、請求 の範囲３１ないし３３記載のベクター、請求の範囲３４ないし４０記載の形質転 換細胞、請求の範囲４１及び４２記載の膜たん白質並びに請求の範囲４３ないし ４８記載の使用方法に関する。 アミノ酸は、極めて産業上重要であり、アミノ酸の使用は多様である：すなわ ちたとえばＬ-リジン、たとえばＬ-スレオニン、及びＬ-トリプトファンは飼料 添加物として、Ｌ-グルタミン酸塩は調味料として、Ｌ-ロイシン及びＬ-チロシ ンは医薬業界で、Ｌ-アルギニン及びＬ-イソロイシンは薬剤として、あるいはＬ -グルタミン酸塩及びＬ-フエニルアラニンはファインケミカルズの合成用出発化 合物として必要とされる。 この種々のアミノ酸製造の好ましい方法は、微生物によるバイオテクノロジー 法である。というのはこの方法で各アミノ酸の生物学的に有効かつ光学的に活性 な形が直ちに得られ、簡単かつ価格上有利な粗物質を使用することができるから である。微生物としてたとえばコリネバクテリウムグルタミクム(Corynebacteri umglutamicum)及びその同属菌ｓｓｐ．フラブム(flavum)及びｓｓｐ．ラクトフ ェルメンタム(lactofermentum)(Liebel等、Int J System Bacteriol（1991）41: 255-260)及び大腸菌及びその同属菌を使用する。 しかしこの菌は、一般にアミノ酸を増殖に必要な量でしか産生しないので、過 剰のアミノ酸は産生されず、分離もされない。これは細胞内でアミノ酸のバイオ 合成が簡単な方法で調節されるということに基づく。したがって生成物産生をコ ントロールメカニズムの遮断によって増加させる種々の方法はすでに公知である 。この方法に於ては、たとえばアミノ酸相似体を、バイオ合成の有効な調節を遮 断するために使用する。Ｌ-チロシン-及びＬ-フエニルアラニン相似体に耐性で あるコリネバクテリウム菌株を使用する方法が開示されている（特開昭５１−１ ９０３７号及び第５３−３９５１７号公報）。同様にＬ-リジン-又はＬ-スレオ ニン相似体に対して耐性の細菌をコントロールメカニズムを阻害するために使用 することが記載されている（ヨーロッパ特許第０２０５８４９号明細書、英国特 許公開第２１５２５０９号公報）。 更に、組換えＤＮＡ-法によって産生された微生物も公知である。この際、同 様にバイオ合成の調節は、もはやフィードバック阻害しない鍵酵素をコードする 遺伝子をクローン化し、発現することによって抑えられる。したがって、たとえ ばプラスミド-コードされたフィードバック-耐性アスパルタートキナーゼを有す る組換えられた、Ｌ-リジン産生細菌は公知である（ヨーロッパ特許第０３８１ ５２７号明細書）。同様にフィードバック-耐性プレフエナートデヒドロゲナー ゼを有する組換えられた、Ｌ-フエニルアラニン産生細菌も記載されている（特 開昭６１−１２４３７５、ヨーロッパ特許第０４８８４２４号明細書）。更にア ミノ酸合成のフィードバックセンスティブ酵素をコードしない遺伝子の過発現に よっても増加されたアミノ酸収量が得られる。したがってリジン産生は、ジヒド ロピコリナートシンターゼの高められた合成によって改良される（ヨーロッパ特 許第０１９７３３５号明細書）。スレオニンデヒドラターゼの高められた合成も 改良されたスレオニン産生が得られる（ヨーロッパ特許公開第０４３６８８６号 公報）。 アミノ酸産生を増加するための他の試みは、主要物質代謝の細胞の第一代謝物 質の改良された供給に向けられる。したがって組換え法によって得られる、トラ ンスケトラーゼの過発現が、Ｌ-トリプトファン、Ｌ-チロシン、又はＬ-フエニ ルアラニンの改良された生成物産生を可能にすることは公知である（ヨーロッパ 特許公開第０６００４６３号公報）。更に、コリネバクテリウム中でのホスホエ ノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性の還元は、芳香族アミノ酸の改良された 産生を生じる（ヨーロッパ特許第０３３３１１４５号公報）。 生産性を増加するための多様な試みは、アミノ酸のサイトゾル合成の制限を抑 えることに全部が向けられている。しかし他の制限としては、原則的に細胞内で 産生されるアミノ酸の培地へのエキスポートも挙げられる。したがって個々の出 発物、これらのエキスポート及びそれによってアミノ酸産生の経済上の効果を改 良することがある。コリネー細菌での細胞透過性をビオチン欠乏、洗剤-又はペ ニシリン処理によって増加する。しかしこの排出を助けることは専らグルタミン 酸塩産生の場合に必要であり、一方他のアミノ酸の合成はこの方法で改良されな い。化学的又は物理的変異によって分泌系の活性が高められる菌株も増殖する。 これによってたとえば改良された分泌活性によって特にＬ-リジン産生に適する コリネバクテリウムグルタミクム-菌株が得られる（ドイツ特許第４，２０３， ３２０号明細書）。 全体として、細胞内で産生されたアミノ酸の分泌を増加するための、従来すべ て行われた試みからは、アミノ酸の増加された流出が選ばれた適応しない又は非 特異的な方法に基づいてたまたましか達成されないことが分かる。ドイツ特許出 願第１９５２３２７９．８−４１号明細書中に唯一、細胞内で産生されたアミノ 酸の分泌が極めて適切に増加され、その際アミノ酸のインポート(import)をコー ドする遺伝子の発現が増加することが記載されている。細胞インポートたん白質 はアミノ酸のエキスポートに対して使用するという知見に基づくこの処理法と、 微生物は本来過剰でないアミノ酸を産生し、分解するという事実から、アミノ酸 トランスポート（輸送）に特異的なエキスポート遺伝子又は-たん白質が全く存 在しないのではなく、細胞からアミノ酸が他のエキスポートシステムによって分 泌されることが示唆される。 従来公知のエキスポートシステムは、有毒な金属イオン、毒性抗生物質及び高 分子毒物をエキスポートする。このエキスポートシステムは比較的に複雑に構成 される：一般に膜たん白質は細胞質膜に関与するがこの膜はエキスポートの部分 反応にしか作用しないので、恐らく輸送に対して、更に細胞質外サポートたん白 質が必要である(Dinh，T.等、A family of extrcytoplasmic proteins that all ow transport of large molecules across the outer membranes of gram-negat ive bacteria．J．Bacteriol．1994，176:3825-3831)．更に、細胞外たん白質に 対するsec-依存エキスポートシステムに於て、少なくとも６つの異なるたん白質 成分がエキスポートに必要であることは知られている。従来の技術から、 アミノ酸のエキスポートに特有の、しかし従来知られていないシステムも同様に 種々のたん白質成分から成るか又は種々の遺伝子がアミノ酸のエキスポートに適 することが示唆される。このことに関しては、Vrljic等によって記載された(J B acterio（1995）177:4021-4027)、リジンエキスポートに欠点のある種々の変異 が指摘される。 今や、驚くべきことには、本発明者はアミノ酸のエキスポートに夫々たった１ つの特異的遺伝子が原因となっていることを見い出した。したがって本発明によ れば、対応するアミノ酸を産生する微生物のエキスポート遺伝子-発現及び（又 は）エキスポートキャリヤー-活性が適切に増加するアミノ酸の微生物による産 生方法が初めて実施される。この処理方法から生じる増加されたエキスポートキ ャリヤーの発現又は活性は、高められた分泌割合を生じるので、対応するアミノ 酸のエキスポートは増加する。この様に変化された微生物は培地中に対応するア ミノ酸の増加された割合を蓄積する。 エキスポートキャリヤー活性の増加のために、特にアミノ酸を産生する微生物 の内因性遺伝子活性を高める。酵素活性の増加は、たとえば触媒中心の変化によ って基質の変換が増加するか又は酵素阻害剤の作用を中止するかで達成される。 高められた酵素活性を、酵素合成の増加によって、たとえば遺伝子増幅によって 又は酵素-バイオ合成を抑制するファクターの流出によってを引き起こすことが できる。内因性遺伝子エキスポートキャリヤー活性を、内因性遺伝子エキスポー ト遺伝子の変異によって増加するのが好ましい。この様な変異は、古典的な方法 に従って、たとえばＵＶ-照射もしくは突然変異を引き起こす化学物質によって 生じさせられるか又は遺伝子工学法、たとえば欠失、挿入及び（又は）ヌクレオ チド交換によって任意に得られる。 エキスポート遺伝子-発現は遺伝子複写数の増加によって及び（又は）エキス ポート遺伝子-発現に積極的に影響を与える調節フアクターによって増加される 。したがって調節要素の強化は、特に転写シグナルが増加するように転写レベル で行われる。これはたとえば構造遺伝子に連結するプロモーター配列の変化によ ってプロモーターをその有効性の点で増加するか又はプロモーターを有効なプロ モーターによって完全に交換することによって行うことができる。転写の強化は エキスポート遺伝子に組み込まれた遺伝子の対応する影響によって、たとえば下 記に示すように行うこともできる。しかしその他に転写の強化は、たとえばｍ- ＲＮＡの安定性を改良することでも起り得る。 遺伝子複写数の増加のために、遺伝子構造又はベクター中にエキスポート遺伝 子を、好ましくは低い複写数を有するベクター中に組み込む。遺伝子構造は、特 にエキスポート遺伝子に属する調節遺伝子配列、好ましくは遺伝子発現を強化す る配列を含有する。調節遺伝子配列は、特に表１に記載されたアミノ酸配列又は その対立変種をコードするヌクレオチド配列又は表２によるヌクレオチド９５４ 〜８２のヌクレオチド配列又は実質上同一に作用するＤＮＡ配列を有する。対立 変種又は同一に作用するＤＮＡ配列は、特に機能誘導体を含む。この誘導体はヌ クレオチドの欠失、挿入及び（又は）置換によって対応する配列から得られる。 しかしこの場合、調節たん白質活性又は-機能が保たれるか又はそのうえ増加す る。したがって調節遺伝子配列の変異によって、調節たん白質の産生の効果は調 節すべきエキスポート遺伝子のＤＮＡに影響を与え、それによって転写は強化さ れ、遺伝子発現は増加する。更にエキスポート遺伝子に調節配列としていわゆる “エンハンサー”が組み込まれる。これはＤＮＡ-ポリメラーゼとＤＮＡとの改 良された交換作用によって高められたエキスポート遺伝子発現も生じさせる。 遺伝子構造中にエキスポート遺伝子を組み込むために、エキスポート遺伝子を コリネバクテリウム属の微生物-株から単離し、エキスポート遺伝子を有する遺 伝子構造で対応するアミノ酸を産生する微生物-株、特にコリネバクテリウムを 形質転換する。対応する輸送遺伝子の単離及び形質転換は慣用方法に従って行わ れる：コリネバクテリウムからの輸送遺伝子の単離及びクローニングの場合、た とえばエキスポート欠損変異の相同相補性の方法が適する（J Bacteriol（1995 ）177:4021-4027）。構造遺伝子の直接のクローニングが起り得ない場合、ベク ター配列の輸送遺伝子への挿入が先ず行われ、次いで“プラスミド-レスキュー ”によって不活性フラグメントの形で単離することができる。本発明による方法 に特にＣ．グルタミクム(glutamicum)ＡＴＣＣ１３０３２又はＣ．グルタミクム ssp.フラバム(flavum)ＡＴＣＣ１４０６７又はＣ．グルタミクムssp.ラクトフエ ルメンタム(lactofermentum)ＡＴＣＣ１３８６９が適する。遺伝子の単離及び 公知のベクターとのその試験管内組換え後、(Appl Env Microbiol（1989）55:68 4-688;Gene102（1991）93-98)、形質転換がアミノ酸を産生する菌株中でエレク トロポレーションによって(Liebl等（1989）FEMS Microbiol Lett 65:299-304) 又は接合によって行われる。転写に、低い複写数を有するベクターを使用するの が好ましい。宿主細胞として、対応するアミノ酸の合成で調節されない及び（又 は）主要物質代謝-代謝物質の高められた割合を含有するアミノ酸産生物を使用 するのが好ましい。 単離後、ヌクレオチド配列を有するエキスポート遺伝子が得られ、これは表３ に記載されたアミノ酸配列又はその対立変種をコードするか又は表２によるヌク レオチド１０１６ないし１７２５のヌクレオチド配列又は実質上同一に作用する ＤＮＡ-配列を有する。この場合も対立変種又は同一に作用するＤＮＡ-配列は、 特に調節配列で上述した意味中に含まれる。このエキスポート遺伝子を本発明に よる方法で使用するのが好ましい。 連結されるプロモーター含有又は不含あるいは組み込まれる調節遺伝子含有又 は不含エキスポート遺伝子に１種又はそれ以上のＤＮＡ-配列を前もって及び（ 又は）後から連結し、その結果として遺伝子は遺伝子構造中に含有される。 転換に適するプラスミド又はベクターがエキスポート遺伝子のクローニングによ わち染色体上での更なる複写形で得られる。この際遺伝子複写は相同組換えによ ってゲノムの任意の位置に及び（又は）プラスミドもしくはベクター上に組み込 まれる。 公知の機能の膜-たん白質をコードする多くの配列は、知られている。エキス ポート遺伝子、たとえば表２によるヌクレオチド１０１６〜１７２５のヌクレオ チド配列を有するエキスポートたん白質、たとえば表１によるアミノ酸配列を有 によって同定されたエキスポート遺伝子を、アミノ酸産生の改良のために本発明 の方法に従って使用することができる。 従来の技術から公知の膜たん白質は、一般に１２個、部分的に４個の経膜らせ んを有する。今や驚くべきことにアミノ酸のエキスポートに特有の適する膜たん 白質は６個の経膜らせんを有することを見い出した（たとえば表３に記載された エキスポートたん白質のアミノ酸配列参照、この際６個の経膜範囲は下線を引く ことによって見分けられる。）。したがってこの場合膜たん白質の従来まだ開示 されておらず、同時に新しいクラスが存在する。 実施例 ａ）エキスポート遺伝子のクローンニング化及びコリネバクテリウムグルタミク ムからの調節遺伝子のクローンニング Ｃ．グルタクムＲ１２７（FEMS Microbiol Lett（1989）65:299-304）から染 色体ＤＮＡを、Scharzer等(Bio/Technology（1990）9:84-87)に記載されている 様に単離する。これを制限酵素Sau 3Aで切断し、サッカロース-勾配-遠心分離、 たとえばSambrook等（Molecular Cloning，A laboratory manual（1989）Cold S pring Harbour Laboratory Press）に記載されている様に分離する。個々の分画 をゲル電気泳動でその大きさについて分析し、約６〜１０ｋｂのフラクメントサ イズの分画をベクターｐＪＣ１との連結に使用する。これにベクターｐＪＣ１を ＢａｍＨＩで線状化し、脱ホスホリル化する。 そのうちの５ｍｇを染色体６−１０ｋｂフラグメントと連結する。全連結物を用 いて、エキスポート欠損変異ＮＡ８(J Bacteriol（1995）177:4021-4027)をエレ クトロポラレーション(FEMS Microbiol Lett（1989）65:299-304)によって形質 転換する。形質転換体をＬＢＨＩＳ(FEMS Microbiol Lett（1989）65:299-304) 上で１ｍｌあたりカナマイシン１５μｇを用いて選択する。この形質転換体に広 範なプラスミド分析を行う。この際全体で４５００の得られたクローンのうちの ２００を個々に培養し、そしてそのプラスミド割合及び-サイズを測定する。検 査されたカナマイシン-耐性クローンのほぼ半分は、平均して８ｋｂの平均サイ ズの挿入断片を有する組み換えプラスミドである。したがって遺伝子バンク中で のＣ．グルタミクムに由来する各Ｘ-任意の遺伝子の存在については０．９６の 確立になる４５００の得られた形質転換体を、リジン分泌が再び獲得された ことについてすべて個々に調べる。更にVrljicにより示されたシステムをコリネ バクテリウムグルタミクム中でＬ-リジン分泌の誘発のために使用する（J Bacte riol（1995）177:4021-4027）。いわゆる鉱物培地-指示プレートを調製する。こ のプレートは１ｌあたり、２０ｇ(ＮＨ4)2ＳＯ4、５ｇ尿素、１ｇＫＨ2ＰＯ4、 １ｇ Ｋ2ＨＰＯ4、０．２５ｇ ＭｇＳＯ4× ７Ｈ2Ｏ、４２ｇモルホリノプロ パンスルホン酸、１ｍｌ ＣａＣｌ2（１ｇ／１００ｍｌ）、７５０ｍｌ蒸留水 、１ｍｌ Ｃｇ微量-塩、１ｍｌビオチン（２０ｍｇ／１００ｍｌ）、ｐＨ７． ４％グルコース１．８ｍｇプロトカテク酸、１ｍｇ ＦｅＳＯ4× ７Ｈ2Ｏ、１ｍｇ ＭｎＳＯ4× Ｈ2Ｏ、０．１ｍｇ ＺｎＳＯ4× ７Ｈ2 Ｏ、０．０２ｍｇ ＣｕＳＯ4、０．００２ｍｇ ＮｉＣｌ2６Ｈ2Ｏ、２０ｇ寒天-寒天、及び１０7細胞／ｍｌリジン-栄養要求Ｃ ．グルタミクム変異体４９／３を含有する。本来の４５００の形質転換体を、す べて個々につまようじを用いて指示プレート上に置く。夫々本来の非分泌ＮＡ８ (J Bacteriol（1995）177:4012-4027)及び出発菌株Ｒ１２７のコントロールを併 用する。リジン分泌を誘発するために更に５ｎＭ Ｌ-メチオニンのみを含有す る２つのプレート夫々に平行して植菌する。指示プレートを３０℃でインキュベ ートし、１５，２４及び４８時間後に調べる。全体で２９のクローンが得られ、 これはメチオニンが添加された指示-プレート上に指示菌株４９／３による増殖 域を示す。クローン分離し、ついで新たに、上述のように増殖域が再び維持され ることについて調べる。この方法で２つのクローンＮＡ８ｐＭＶ８−５−２４及 びＮＡ８ｐＭＶ６−３が得られ、これはリジンを分泌する能力を再び獲得する。 これらのクローンによって、プラスミド調製を、Sohwarzer等（Bio/Technolog y（1990）9:84-87）に記載されているように実施する。ＮＡ８中での再形質転換 によってＬ-リジン分泌のプラスミドに関係する作用を確認する。２つのプラス ミドに制限分析を行う。プラスミドｐＭＶ８−５−２４は、８．３ｋｂの挿入、 ｐＭＶ６−３は９．５ｋｂの挿入を有する。挿入の物理的地図を図１に示す。 ｂ）リジンエキスポートを再構成するＤＮＡ-フラグメントのサブクローニング プラスミドｐＭＶ６−３の挿入によって、特定の制限切断部位の利用で個々の サブクローンを調製する。３．７ｋｂ ＸｈｏＩ-フラグメント、２．３ｋｂ ＢａｍＨＩ-フラグメント及び７．２ｋｂ ＢａｍＨＩ-フラクメントを対応する 切断され、かつ処理されたベクターｐＪＣ１(Mol Gen Genet（1990）220:478-48 0)と連結する。連結生成物を用いて、直接Ｃ．グルタミクムＮＡ８を形質転換し 、形質転換体を上述の様にリジン分泌が再び獲得されることについて調べ、サブ クローンの存在をプラスミド調製及び制限分析によって確認する。この方法で最 も小さいサブクローンとしてプラスミドｐＭＶ２−３を有する菌株が得られる（ 図１）。リジンエキスポートを促進するこのフラグメントは、ｐＭＶ６−３から の２．３ｋｂ ＢａｍＨＩ-フラグメントを挿入として含有する。 ｃ）リジンエキスポート遺伝子lysE及びその調節lysGの配列 ２．３ｋｂ ＢａｍＨｉ-フラクメントのヌクレオチド配列化を、Sanger等の ジデオキシ-チェインターミネーター法に従って行い(Proc Natl Acad Sci米国（ 1977）74:5463-5467)、配列化反応を自動読取り配列化キット(Pharmacia，NJ米 国)を用いて行う。電気泳動分析は自動レーザー蛍光ＤＮＡ配列化装置(A.L.F.)( Pharmacia-LKB，Piscataway，NJ．米国)を用いて行われる。得られたヌクレオチ ド配列を、ドイツ癌中央研究所（ハイデルベルグ）のプログラムパケットＨＵＳ ＡＲ（リリース３．０）を用いて分析する。ヌクレオチド配列及び分析の結果を 表２に再度記載する。分析は配列されたＤＮＡ断片上に２つの完全にあいている 解読わくを生じる。ＯＲＦ１は長さ２３６アミノ酸を有するたん白質をコードし 、ＯＲＦ２は長さ２９０アミノ酸のたん白質をコードする。ＰＲＦ１に由来する たん白質は、疎水性アミノ酸の集積を示し、たとえばこれは耐膜性たん白質にと って特有である。プログラムＰＨＤ．ＨＴＭ（Protein Science（1995）4:521-5 33）を用いる疎水性及び親水性アミノ酸の分布の詳細な分析を、表３に示す。こ れからたん白質が６つの疎水性らせん領域を有し、これは膜を通過することが分 る。したがってこのたん白質はアミノ酸Ｌ-リジンの求められたエキスポーター である。それ故に対応する遺伝子を以下lysEと表示する。対応して表２中に印を つけた。ＯＲＦ２をＰＲＦ１に対向して転写する。配列分析は、ＯＲＦ１が１つ のファミリーとして集められた調節遺伝子と高い同一性を有することを示す(Ann Rev Microbiol（1993）597-626)。このファミリーの遺伝子は、種々 の異化又は同化処理に関与する遺伝子の発現を積極的に調節する。それ故に以下 、ＯＲＦ２をlysG(Govern＝調節する)として表示する。この相関性の故に、及び lysEはlysGとともにしかクローン化（ａ）参照）、サブクローン化（ｂ）参照） されないので、lysGはlysEの調節剤であり、したがってリジンエキスポートにも 関与する。遺伝子lysG及びこれに由来するアミノ酸配列を表２又は表１にも示す 。 ｄ）大腸菌に由来する未公知膜たん白質を配列比較によって同定 配列された範囲に由来するたん白質を機能に組み込むために、表３による確立 された配列を用いてすでに対応してＣ．グルタミクムからのリジンエキスポート のアミノ酸配列をドイツ癌中央研究所（ハイデルベルグ）でプログラノパケット ＨＵＳＡＲ（リリース３．０）の使用下で、すべてそこに保存されたＤＮＡ配列 に由来するたん白質-配列と比較する。大腸菌からの従来公知の機能の唯一配列 に対して３９．３％同一アミノ酸の高い相同性び６４．９％類似アミノ酸が生じ る。比較を図２に示す。大腸菌に由来する従来から特有ではない、あいている解 読わくは、この方法によってアミノ酸エキスポート遺伝子として同定される。 ｅ）細胞内蓄積Ｌ-リジンの増加されたエキスポート 菌株Ｃ．グルタミクムＮＡ８(J．Bacteriol（1995）177:4021-4027)を、プラ スミドｐＭＶ２−３で形質転換し、菌株のＬ-リジン分泌を比較する。これにＮ Ａ８及びＮＡ８ｐＭＶ２−３を、Vrljic等(J．Bacteriol（1995）177:4021-4027 )に記載されている様複合培地中で増殖し、醗酵培地ＣＧＸＩＩ(J Bacteriol 81 993 9 175:5595-5603)に夫々別々に植菌する。培地は更に５ｎＭ Ｌ-メチオニ ンを含有し、細胞内Ｌ-リジンバイオ合成を誘発する。１４０Ｕｐｍで反応振と う器で、３０℃で２４時間培養した後、細胞内部及び外部Ｌ-リジン測定を行う 。細胞内部測定のために、シリコーンオイル遠心分離を行う（Methods Enzymolo gy LV（1979）547-567）；アミノ酸の測定は、高圧液体クロマトグラフィーによ って行われる(J Chromat（1983）266:471-482)。この測定は、図３に示すように 、種々の時間で行われる。したがって使用された方法に対応して、ためられた細 胞内部Ｌ-リジンはｐＭＶ２−３によってますます分泌され、蓄積される。対応 して、予期に従って細胞内に存在するＬ-リジンは著しく減少する。 したがって検知されかつ作図されたエキスポーターの利用はＬ-リジン産生を対 応して改良するための方法である。 ｆ）lysE又はlysEGによるＬ-リジンの増加された蓄積 ｐＪＣ１中に配列された２３７４ｂｐ ＢａｍＨＩ-フラグメントを含有する サブクローンｐＭＶ２−３（図１参照）によって、配列情報に対応してlysEを有 する１１７３ｂｐ PvuII-HindIIフラグメントをｐＺ１(Appl EnV Microbiol（1 989）55:684-688)中で連結し、プラスミドplysEが得られる。このプラスミド及 びlysE lysGを有するプラスミドｐＭＶ２−３を、電気泳動によってＣ．グルタ ミクム菌株ｄ中に入れ、その際染色体域は欠失する。得られた菌株Ｃ．グルタミ クムｄ ｐＭＶ２−３、Ｃ．グルタミクムｐＪＣ１をｃ）に示した様に先ず複合 培地中で増殖し、次いで産生最小培地ＣＧＸII中で４％グルコースと５ｍＭＬ- メチオニンと共に培養し、プローブを蓄積されたＬ-リジンの測定のために取り 出す。図４から明らかな様に、LysElysGによってコントロールに比してリジン蓄 積の増加が得られる。plysEはこの方法によって、１３．２ｍＭ Ｌ-リジンに対 して極めて増加する蓄積4.8を生じる。 表及び図の説明 表１：ＤＮＡ-結合たん白質に典型的ならせん-ターン-らせんモチーフを有する コリネバクテリウム グルタミクムからのリジンエキスポーター調節剤のアミノ 酸配列。 表２（３頁）：Ｃ．グルタミクムからの、Ｌ-リジンエキスポーター及びリジン エキスポート-調節剤をコードする領域のヌクレオチド配列。 表３：同定された経膜らせんＴＭＨ１〜ＴＭＨ６を有する、コリネバクテリウム グルタミクムからのリジンエキスポーターのアミノ酸配列。 図１：ｐＭＶ６−３及びｐＭＶ８−５−２４中でクローニングによって得られた 図２：Ｃ．グルタクムからのLysEの導かれたアミノ酸配列（上段）と大腸菌か図３：Ｃ．グルタミクムＮＡ８を有するｐＭＶ２−３による増加されたリジンエ キスポート。上段；リジンの僅かなないし約１５０ｍＭの分泌及び細胞内蓄積を 有するコントロール。下段；ｐＭＶ２−３によって生じる高い分泌と約３０ｍＭ の細胞内のほんの僅かな蓄積。 図４：LysElysG（ｐＭＶ２−３）によるＣ．グルタミクム中でのリジン蓄積の増 加（中央カーブ）、及びlysE(plysE)に起因する蓄積（上側カーブ）。表 １表 ２表 ２（続き）表 ２（続き） 表 ３
【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９７年１２月１０日（１９９７．１２．１０） 【補正内容】 請求の範囲 １．アミノ酸の微生物による産生方法に於て、対応するアミノ酸を産生する微生 物の、対応するアミノ酸に特異的なエキスポートキャリヤー活性及び（又は） 対応するアミノ酸に特異的なエキスポート発現を増加させることを特徴とする 、上記方法。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:15） (72)発明者 ザーム・ヘルマン ドイツ連邦共和国、Ｄ―52428 ユーリッ ヒ、ヴェンデリヌスストラーセ、71

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．対応するアミノ酸を産生する微生物のエキスポートキャリヤー活性及び（又 は）エキスポート発現を増加させることを特徴とする、アミノ酸の微生物によ る産生方法。 ２．微生物の内因性エキスポートキャリヤー活性を増加させる、請求の範囲１記 載の方法。 ３．内因性エキスポート遺伝子の変異によって、高められたエキスポートー 活性 を有するキャリヤーを産生する、請求の範囲２記載の方法。 ４．エキスポートキャリヤーの遺伝子発現を遺伝子複写数の増加によって高める 、請求の範囲１ないし３のいずれかに記載の方法。 ５．遺伝子複写数の増加に、エキスポート遺伝子を遺伝子構造中に組み込む、請 求の範囲４記載の方法。 ６．エキスポート遺伝子を低い複写数を有するベクター中に組み込む、請求の範 囲５記載の方法。 ７．エキスポート遺伝子を、エキスポート遺伝子と同等の調節遺伝子配列を含有 する遺伝子構造中に組み込む、請求の範囲５又は６記載の方法。 ８．調節遺伝子配列が表１に記載したアミノ酸配列及びその対立変種をコードす るヌクレオチド配列を有する、請求の範囲７記載の方法。 ９．調節遺伝子配列が表２によるヌクレオチド９５４〜８２のヌクレオチド配列 又は実質上同一に作用するＤＮＡ-配列を有する、請求の範囲８記載の方法。 10．対応するアミノ酸を産生する微生物をエキスポート遺伝子含有遺伝子構造で 形質転換する、請求の範囲５ないし９のいずれかに記載の方法。 11．コリネバクテリウム属微生物をエキスポート遺伝子を含有する遺伝子構造で 形質転換する、請求の範囲１０記載の方法。 12．形質転換に、対応するアミノ酸合成に関与する酵素を制御しない微生物を使 用する、請求の範囲１０又は１１記載の方法。 13．形質転換に、主要物質代謝-代謝物の高められた割合を含有する微生物を使 用する、請求の範囲１０ないし１２のいずれかに記載の方法。 14．エキスポート遺伝子をコリネバクテリウム属の微生物-株から単離する、請 求の範囲４ないし１３のいずれかに記載の方法。 15．エキスポート遺伝子配列をすでに公知のエキスポート遺伝子の配列と比較し て同定する、請求の範囲１ないし１４のいずれかに記載の方法。 16．同定すべきエキスポート遺伝子配列に由来するアミノ酸配列を、表３中に記 載されたアミノ酸配列又はその対立変種と比較する、請求の範囲１５記載の方 法。 17．エキスポート遺伝子-発現を、転写シグナルの増強によって高める、請求の 範囲１ないし１６のいずれかに記載の方法。 18．エキスポート遺伝子として表３中に記載されたアミノ酸配列及びその対立変 種をコードするヌクレオチド配列を有する遺伝子を使用する、請求の範囲１な いし１７のいずれかに記載の方法。 19．エキスポート遺伝子として表２によるヌクレオチド１０１６ないし１７２５ のヌクレオチド配列又は実質上同一に作用するＤＮＡ-配列を有する遺伝子を 使用する、請求の範囲１８記載の方法。 20．Ｌ-リジンを産生するための、請求の範囲１ないし１９のいずれかに記載の 方法。 21．アミノ酸-エキスポートキャリヤーをコードするエキスポート遺伝子。 22．表３中に記載されたアミノ酸配列及びその対立変種をコードするヌクレオチ ド配列を有する、請求の範囲２１記載のエキスポート遺伝子。 23．表２によるヌクレオチド１０１６ないし１７２５のヌクレオチド配列又は実 質上同一に作用するＤＮＡ-配列を有する、請求の範囲２２記載のエキスポー ト遺伝子。 24．この同等の調節遺伝子配列を有する、請求の範囲２１ないし２３のいずれか に記載のエキスポート遺伝子。 25．調節遺伝子配列が表１中に記載されたアミノ酸配列及びその対立変種をコー ドするヌクレオチド配列を有する、請求の範囲２４記載のエキスポート遺伝子 。 26．調節遺伝子が表２によるヌクレオチド９５４ないし８２のヌクレオチド配列 又は実質的に同一に作用するＤＮＡ-配列を有する、請求の範囲２５記載の方 法。 27．アミノ酸-エキスポートキャリヤーをコードするエキスポート遺伝子の調節 に適したアミノ酸配列及びその対立変種をコードするヌクレオチド配列を有す る調節剤。 28．表２によるヌクレオチド９５４ないし８２のヌクレオチド配列又は実質上同 一に作用するＤＮＡ-配列を有する、請求の範囲２７記載の調節剤。 29．請求の範囲２１ないし２６のいずれかに記載のエキスポート遺伝子を含有す る遺伝子構造。 30．請求の範囲２７又は２８記載の調節遺伝子配列を含有する遺伝子構造。 31．請求の範囲２１ないし２６のいずれかに記載のエキスポート遺伝子、又は請 求の範囲２９記載の遺伝子構造を有するベクター。 32．低い複写数を有する、請求の範囲３１記載のベクター。 33．請求の範囲２７又は２８記載の調節遺伝子配列又は請求の範囲３０記載の遺 伝子構造を有するベクター。 34．複製可能な形で、請求の範囲２１ないし２６のいずれかに記載のエキスポー ト遺伝子又は請求の範囲２９記載の遺伝子構造。 35．請求の範囲３１又は３２記載のベクターを有する請求の範囲３４記載の形質 転換された細胞。 36．コリネバクテリウム属に属する、請求の範囲３４又は３５記載の形質転換さ れた細胞。 37．合成に関与するアミノ酸の酵素−これは形質転換される細胞に移行するエキ スホート遺伝子をコードするエキスポートキャリヤーによって細胞から排出さ れる−が制御されない請求の範囲３４ないし３６のいずれかに記載の形質転換 された細胞。 38．主要な物質代謝-代謝物の高められた割合を含有する、請求の範囲３４ない し３７記載の形質転換された細胞。 39．複製可能な形で請求の範囲２７又は２８記載の遺伝子配列又は請求の範囲３ ０記載の遺伝子構造を有する形質転換された細胞。 40．請求の範囲３３記載のベクターを有する、請求の範囲３９記載の形質転換さ れた細胞。 41．６つの経膜らせんを有する、アミノ酸のエキスポートに適する膜たん白質。 43．微生物のアミノ酸産生の増加にエキスポート遺伝子を使用する方法。 44．高められたエキスポートキャリヤー活性を有する酵素をコードする変異され たエキスポート遺伝子を使用する、請求の範囲４３記載の使用方法。 45．アミノ酸-産生する微生物をエキスポート遺伝子を含有する遺伝子構造で形 質転換する、請求の範囲４３又は４４記載の使用方法。 46．遺伝子構造が更に調節遺伝子配列を有する、請求の範囲４５記載の使用方法 。 47．エキスポート遺伝子をコリネバクテリウムから使用する、請求の範囲４３な いし４６のいずれかに記載の使用方法。 48．アミノ酸-産生する微生物としてコリネバクテリウムを使用する、請求の範 囲４３ないし４７のいずれかに記載の使用方法。
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