JPH02458A - 発酵法によるl―イソロイシンの製造法 - Google Patents
発酵法によるl―イソロイシンの製造法Info
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- JPH02458A JPH02458A JP33137487A JP33137487A JPH02458A JP H02458 A JPH02458 A JP H02458A JP 33137487 A JP33137487 A JP 33137487A JP 33137487 A JP33137487 A JP 33137487A JP H02458 A JPH02458 A JP H02458A
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、スレオニンデアミナーゼ遺伝子が組み込まれ
ている組換えDNA、改組換えDNAを有するスレオニ
ン生産菌を用いるL−イソロイシンの製造法PC関する
ものである。
ている組換えDNA、改組換えDNAを有するスレオニ
ン生産菌を用いるL−イソロイシンの製造法PC関する
ものである。
発酵法によFIL、−イソロイシンを製造しIうとする
場合、野性味は殆んど菌体外にL−イソロイシン全生産
しないので、野性味に人工的に突然変異を生起せしめて
L−イソロイシン生前能を付与する方法がとられてhる
。L−イソロイシン生産能を有する人工変異株としては
、ブレビバクテリウム4又はコリネバクテリウム属、又
はセラチア属のし一イソロイシンの7)タコ9ニストに
耐性金回する変異株等が従来より知られている。その内
容はL−イソロイシン生産に関与する牛イ#索であると
ころのスレオニンデアミナーゼが末端生産物であるし一
インロイシ/およびL−イソロイシンの7)タゴニスト
によるフィードバック阻害を受はニ〈〈なった変異株を
用いるものである。
場合、野性味は殆んど菌体外にL−イソロイシン全生産
しないので、野性味に人工的に突然変異を生起せしめて
L−イソロイシン生前能を付与する方法がとられてhる
。L−イソロイシン生産能を有する人工変異株としては
、ブレビバクテリウム4又はコリネバクテリウム属、又
はセラチア属のし一イソロイシンの7)タコ9ニストに
耐性金回する変異株等が従来より知られている。その内
容はL−イソロイシン生産に関与する牛イ#索であると
ころのスレオニンデアミナーゼが末端生産物であるし一
インロイシ/およびL−イソロイシンの7)タゴニスト
によるフィードバック阻害を受はニ〈〈なった変異株を
用いるものである。
ところが、上記のし一イソロイシン生産菌の限界は、ス
レオニンデアミナーゼ全コードする遺伝子がrノ五当り
1個であることで、いかにフィトバック阻害を解除して
も酵素自身の最大活性には自ずから限界がある。
レオニンデアミナーゼ全コードする遺伝子がrノ五当り
1個であることで、いかにフィトバック阻害を解除して
も酵素自身の最大活性には自ずから限界がある。
更に、従来のし一イソロイシン生産菌は、L−4ンCl
イシンの前駆体であるし一スレオニン(Q 生産供給を
微生物自体のもつ1セツトのR云子鮮から生成される酵
素群に依存しており、前述しtスレオニンデアミナーゼ
と同様の限界を有している。
イシンの前駆体であるし一スレオニン(Q 生産供給を
微生物自体のもつ1セツトのR云子鮮から生成される酵
素群に依存しており、前述しtスレオニンデアミナーゼ
と同様の限界を有している。
本発明は、L−イソロイシンの生合成系の代謝調節機構
の人為的制御もしくは打破によって成立している従来の
L−イソロイシン生産方法の限界のひとつである生合成
系酵素の分子数の制限、即ち、遺伝子数の制限という欠
点を解決する方法を提示するものである。
の人為的制御もしくは打破によって成立している従来の
L−イソロイシン生産方法の限界のひとつである生合成
系酵素の分子数の制限、即ち、遺伝子数の制限という欠
点を解決する方法を提示するものである。
具体的には、L−イソロイシン生合成系のキイ酵素であ
るスレオニンデアミナーゼの遺伝子数の増強全目的とし
、更にその結果起るであろうL−イソロイシンの前駆体
でらるL−スレオニンの需要増に対しては、L−スレオ
ニンの生合成系に関する酵素の遺伝子数が増強され、L
−スレオニンの生産力が向上している微生物を活用する
。即ち、両生合成系の遺伝子数がともに増加した微生物
を育成して、L−イソロイシン全製造する方法を明らか
にするものである。
るスレオニンデアミナーゼの遺伝子数の増強全目的とし
、更にその結果起るであろうL−イソロイシンの前駆体
でらるL−スレオニンの需要増に対しては、L−スレオ
ニンの生合成系に関する酵素の遺伝子数が増強され、L
−スレオニンの生産力が向上している微生物を活用する
。即ち、両生合成系の遺伝子数がともに増加した微生物
を育成して、L−イソロイシン全製造する方法を明らか
にするものである。
本発明者らは、上記問題点について鋭意検討の結果、エ
シェリヒアiamより得次スレオニンデアミナーゼをコ
ードするDNA断片を組み込んだ自律増殖可能なグラス
きド又はファージをエシェリヒア コリ属細菌又はコリ
ネホルムのグルタミン酸生産菌(グレピパクテリクム・
ラクトファーメンタムなど)に保有せしめる事によって
得られるし一イソロイシン生産能を有する微生物を培養
することにより、従来の発醪法よりも高い収率でL−イ
ソロイシンを生産できることを見い出し友。
シェリヒアiamより得次スレオニンデアミナーゼをコ
ードするDNA断片を組み込んだ自律増殖可能なグラス
きド又はファージをエシェリヒア コリ属細菌又はコリ
ネホルムのグルタミン酸生産菌(グレピパクテリクム・
ラクトファーメンタムなど)に保有せしめる事によって
得られるし一イソロイシン生産能を有する微生物を培養
することにより、従来の発醪法よりも高い収率でL−イ
ソロイシンを生産できることを見い出し友。
スレオニンデアミナーゼ遺伝子を含ムDN人断片は、エ
シェリヒア コリ細菌の染色体DNAより得る事ができ
る。このようにスレオニンデアミナーゼ遺伝子を含むD
NA断片等遺伝情報を担り友DNAf:与えるものをD
NA供与菌と称する。
シェリヒア コリ細菌の染色体DNAより得る事ができ
る。このようにスレオニンデアミナーゼ遺伝子を含むD
NA断片等遺伝情報を担り友DNAf:与えるものをD
NA供与菌と称する。
DNA供与菌としては、イソロイシン7)タゴニスト耐
’Lftどの変異を付与することにより、L−イソロイ
シンまたは七の前駆体の生合成活性が高まっ几ような変
異株を用いれば更によい。イソロイシン7)タゴニスト
の例としては、α−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸、ア
ミノヘキシルイソ吉草酸、イソロイシンハイドロキサメ
ート、グリシル−L−ロイシン等があるaまた、ここで
いうイソロイシンの前駆体としては、スレオニン、2ケ
ト酪酸、2アセト2ヒドロキシ酪酸、2.3ジヒドロキ
シ3メチル吉草酸、2ケト3メチル吉草酸などをさす。
’Lftどの変異を付与することにより、L−イソロイ
シンまたは七の前駆体の生合成活性が高まっ几ような変
異株を用いれば更によい。イソロイシン7)タゴニスト
の例としては、α−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸、ア
ミノヘキシルイソ吉草酸、イソロイシンハイドロキサメ
ート、グリシル−L−ロイシン等があるaまた、ここで
いうイソロイシンの前駆体としては、スレオニン、2ケ
ト酪酸、2アセト2ヒドロキシ酪酸、2.3ジヒドロキ
シ3メチル吉草酸、2ケト3メチル吉草酸などをさす。
スレオニンデアミナーゼ遺伝子を得るKri、DNA供
与菌より染色体DNAを分離後、適当にこれを切断し、
得られ几染色体DNA断片を適当なプラスミド″1次は
、ファージベクターに挿入し友後。
与菌より染色体DNAを分離後、適当にこれを切断し、
得られ几染色体DNA断片を適当なプラスミド″1次は
、ファージベクターに挿入し友後。
この組換えゲラスミrをエシェリヒア コリのスレオニ
ンデアミナーゼ欠損株に導入し、スレオニンデアミナー
ゼ生産能を獲得した形質転換株を採取すればよい。
ンデアミナーゼ欠損株に導入し、スレオニンデアミナー
ゼ生産能を獲得した形質転換株を採取すればよい。
スレオニンデアミナーゼ遺伝子をエシェリヒアコリ菌体
、内で自律複製できるベクタープラスミドま九はファー
ジ上に挿入してエシェリヒア フリDNA受容菌に導入
すれば、L−イソロイシン生産能の向上した株を得るこ
とができる。
、内で自律複製できるベクタープラスミドま九はファー
ジ上に挿入してエシェリヒア フリDNA受容菌に導入
すれば、L−イソロイシン生産能の向上した株を得るこ
とができる。
スレオニンデアミナーゼ遺伝子として、野性型のものを
用いることができるし、更に変異株の遺伝子を用いるこ
ともできる。変異株遺伝子としては、L−イソロイシン
によるフィードバック阻害の程度が軽減され几スレオニ
ンデアミナーゼをコードするように変異され友ものが特
に好ましい。
用いることができるし、更に変異株の遺伝子を用いるこ
ともできる。変異株遺伝子としては、L−イソロイシン
によるフィードバック阻害の程度が軽減され几スレオニ
ンデアミナーゼをコードするように変異され友ものが特
に好ましい。
変異型の遺伝子を得るには、DNA供与菌を変異処理し
てもよいが、スレオニンデアミナーゼ遺伝子tベクター
プラスミドに挿入後、得られた組換えDNAをDNA受
容菌に導入し得られた形J:i転換株を変異処理し次男
が変異型遺伝子が得られる可能性が高い。更に、上記m
pえDNA自体を生体外で変異処理すれば、変異型遺伝
子が得られる効率が最も高い。
てもよいが、スレオニンデアミナーゼ遺伝子tベクター
プラスミドに挿入後、得られた組換えDNAをDNA受
容菌に導入し得られた形J:i転換株を変異処理し次男
が変異型遺伝子が得られる可能性が高い。更に、上記m
pえDNA自体を生体外で変異処理すれば、変異型遺伝
子が得られる効率が最も高い。
L−イソロイシンによるフィードバック阻害の程度がよ
り軽減されたスレオニンデアミナーゼをコードず、る変
異型遺伝子を選別する方法は、DNA供与−及び上記組
換えDNAが導入された形質転換株のいずれの場合も、
また組換えDNAを変異処理し几ときは、変異処理し次
組換えDNAをDNA受容菌に導入して形5に転換株を
得几後、L−イソロイシンの7)タゴニストに耐性を獲
得し7t DNA供与菌又トま形′j!i転換株を選別
すればよい。
り軽減されたスレオニンデアミナーゼをコードず、る変
異型遺伝子を選別する方法は、DNA供与−及び上記組
換えDNAが導入された形質転換株のいずれの場合も、
また組換えDNAを変異処理し几ときは、変異処理し次
組換えDNAをDNA受容菌に導入して形5に転換株を
得几後、L−イソロイシンの7)タゴニストに耐性を獲
得し7t DNA供与菌又トま形′j!i転換株を選別
すればよい。
7)タゴニストに耐性?l!得し吏DNA供与菌又は形
質転換株がL−インロイシ/によるフィードバック1君
害の程度がより軽減さnlこスレオニンデアミナー+J
をコードする實異型遣云子を有するものであることfc
確認するためには、L−イソロイシンの7)タゴニスト
に耐性全獲(ユしたDNA供与1又lゴ形質転換株より
適宜酵素層を訓製し、L−スレオニアf基質として植々
の濃度のL−イソロイシ/の存在下に上記酵素液による
2ケト酪酸の生成量を測定する6高揚度のし一イソロイ
シンの存在下でも2ケト酪酸の生成活性が旨い酵素液が
L−イソロイシンによるフィードバック阻害の程度がエ
リq減されたスレオニンデアミナーゼを含πする。
質転換株がL−インロイシ/によるフィードバック1君
害の程度がより軽減さnlこスレオニンデアミナー+J
をコードする實異型遣云子を有するものであることfc
確認するためには、L−イソロイシンの7)タゴニスト
に耐性全獲(ユしたDNA供与1又lゴ形質転換株より
適宜酵素層を訓製し、L−スレオニアf基質として植々
の濃度のL−イソロイシ/の存在下に上記酵素液による
2ケト酪酸の生成量を測定する6高揚度のし一イソロイ
シンの存在下でも2ケト酪酸の生成活性が旨い酵素液が
L−イソロイシンによるフィードバック阻害の程度がエ
リq減されたスレオニンデアミナーゼを含πする。
DNA供与菌、形質転換株又は組換えDNAに変異全厚
えるには、N−メチル−N−二トローN−二トロソグア
ニジン又は亜硫酸等の変異誘起剤にDNA供与菌、形質
転換株又は組換えDNAを晒すかあるいはJ)NA供与
菌、形質転換株又は組換えDNAにX線、紫外線、γ線
等を照射する等の方法がある。
えるには、N−メチル−N−二トローN−二トロソグア
ニジン又は亜硫酸等の変異誘起剤にDNA供与菌、形質
転換株又は組換えDNAを晒すかあるいはJ)NA供与
菌、形質転換株又は組換えDNAにX線、紫外線、γ線
等を照射する等の方法がある。
尚、このような遺伝子に変異を与える方法は。
スレオニンr7きナーゼ以外のいかなる遺伝子について
も効率よい変異方法として利用できる。また宿主がエシ
ェリヒア コリ以外の例えばコリネホルム・グルタミン
酸生産菌、バチルス・ズブチリス等であっても、上記の
遺伝子に変異を与える方法は、利用できる。
も効率よい変異方法として利用できる。また宿主がエシ
ェリヒア コリ以外の例えばコリネホルム・グルタミン
酸生産菌、バチルス・ズブチリス等であっても、上記の
遺伝子に変異を与える方法は、利用できる。
ま九、スレオニア f 7 ?ナーゼ遣云子のプロモー
ターオペレーターとして、宿主菌野性型のものを用いる
こともできるし、更にプロモーターオペレーターのg、
真珠由来のものを用いることもできる。また更に、すで
に他種遺伝子を効率良く発現することが知らnでいる強
力なプロモーター?使用する事も可能である。1比、プ
ロモーターオペレーターDNAt−t、他生物由来もし
くは化学的に合成され友ものであってもよい。また、プ
ラスミド上で得らnた変異型スレオニンデアミナーゼは
、再びイa主染色体へ導入することも可能であって、ま
九他の生物由来もしくは化学的疋合成され九遺伝子の場
合も同様の操作を行うことができる。
ターオペレーターとして、宿主菌野性型のものを用いる
こともできるし、更にプロモーターオペレーターのg、
真珠由来のものを用いることもできる。また更に、すで
に他種遺伝子を効率良く発現することが知らnでいる強
力なプロモーター?使用する事も可能である。1比、プ
ロモーターオペレーターDNAt−t、他生物由来もし
くは化学的に合成され友ものであってもよい。また、プ
ラスミド上で得らnた変異型スレオニンデアミナーゼは
、再びイa主染色体へ導入することも可能であって、ま
九他の生物由来もしくは化学的疋合成され九遺伝子の場
合も同様の操作を行うことができる。
更に、L−イソロイシンの前駆体であるし一スレオニン
を培地に添加することにより、L−イソロイシン全増産
させることも可能であり、ま定、L−スレオニンの生産
を増強するようなプラスミドもしくはファージ1例えば
、スレオニンオイロンf:帯同するプラスミドもしくは
ファージと野性型もしくは変異型のスレオニンデアミナ
ーゼ遺伝子を帯同するプラスミドもしくはファージトラ
同−m抱内に共存でせることも宵月である。
を培地に添加することにより、L−イソロイシン全増産
させることも可能であり、ま定、L−スレオニンの生産
を増強するようなプラスミドもしくはファージ1例えば
、スレオニンオイロンf:帯同するプラスミドもしくは
ファージと野性型もしくは変異型のスレオニンデアミナ
ーゼ遺伝子を帯同するプラスミドもしくはファージトラ
同−m抱内に共存でせることも宵月である。
以下、実施例に基づき、本発明の詳細な説明する。
実施例1
(1) 染色体J)NA ノv4製
E、 coil KI2 ’fr 100 mlのM9
カデミノ酸培地(グルコース51 、 NHCL 11
、 Na□HPO4611゜KH2PO431、Mg
SO4”7H20247Q 、 NaC4O,5g 。
カデミノ酸培地(グルコース51 、 NHCL 11
、 Na□HPO4611゜KH2PO431、Mg
SO4”7H20247Q 、 NaC4O,5g 。
カザミノ酸511JK含む)に植菌し、37℃で約3時
間振盪培養金行い、対数増殖期の菌体金集めた。この菌
体19をり/チーム・SDSで溶菌させたのちフェノー
ル法により染色体DNA ’i抽出精製し最終的に10
1に9のDNA全得念。
間振盪培養金行い、対数増殖期の菌体金集めた。この菌
体19をり/チーム・SDSで溶菌させたのちフェノー
ル法により染色体DNA ’i抽出精製し最終的に10
1に9のDNA全得念。
(2) ベクターDNAのEJR製
くフタ−としてpBR322(4363bp )を用い
、そのDNAを常法に従い調製した。
、そのDNAを常法に従い調製した。
(3)染色体DNAのベクターへの挿入(1)で得友染
色体DN人10μgと(2)で得たベクターDNA 1
μIを制限エンドヌクレアーゼC1a Iで完全に切断
し、両者をT 4 DNAライr−スで結合しto(4
) スレオニンデアミナーゼ遺伝子のクローニングス
レオニンデアミナーゼ活性全欠損しているE、 coi
l K12 AJ 12349 (FERM P−95
74)(L−イソロイシン要求株として作成しfc)を
受容菌として用いfc6 形質転険法としては、ChCt2処理による方法を用い
t0形ff!を転換体として7)ピシリン抵抗性でかつ
、イソロイシン非要求性金持った株を1採得7t、これ
全AJ 12351 (FERM P−9576)と命
名し友。
色体DN人10μgと(2)で得たベクターDNA 1
μIを制限エンドヌクレアーゼC1a Iで完全に切断
し、両者をT 4 DNAライr−スで結合しto(4
) スレオニンデアミナーゼ遺伝子のクローニングス
レオニンデアミナーゼ活性全欠損しているE、 coi
l K12 AJ 12349 (FERM P−95
74)(L−イソロイシン要求株として作成しfc)を
受容菌として用いfc6 形質転険法としては、ChCt2処理による方法を用い
t0形ff!を転換体として7)ピシリン抵抗性でかつ
、イソロイシン非要求性金持った株を1採得7t、これ
全AJ 12351 (FERM P−9576)と命
名し友。
(5) 形質転換株のプラスミド解析上述のAJ 1
2351 (FIRM P−9576)株よりリゾチー
ム・SO8により溶菌液を得、グクスミドoNAta几
。アガロースダル電気泳動によりプラスミドDN人を分
析し九ところ、pBR322より大きなプラスミドであ
り几。Ctal により切断したところ、2.3kbの
DNA断片が挿入されている事が明らかとなり次。この
プラスミドをpILVA 1と命名Lf。
2351 (FIRM P−9576)株よりリゾチー
ム・SO8により溶菌液を得、グクスミドoNAta几
。アガロースダル電気泳動によりプラスミドDN人を分
析し九ところ、pBR322より大きなプラスミドであ
り几。Ctal により切断したところ、2.3kbの
DNA断片が挿入されている事が明らかとなり次。この
プラスミドをpILVA 1と命名Lf。
(6)再形質転換
(5)で得られ次プラスミドを再びE、 aoli K
12AJ 12349 (PgRM P−9574)に
形質転換し念。7)ピシリン耐性で選択した形質転換体
は全てL−イソロイシンの要求性をも失っていた。よっ
て、上述の2.3kbのDNA断片上にスレオニンデア
ミナーゼ遺伝子が存在している事が明らかである。
12AJ 12349 (PgRM P−9574)に
形質転換し念。7)ピシリン耐性で選択した形質転換体
は全てL−イソロイシンの要求性をも失っていた。よっ
て、上述の2.3kbのDNA断片上にスレオニンデア
ミナーゼ遺伝子が存在している事が明らかである。
(7)形質転換株のスレオニンデアミナーゼ活性被検株
をM9培地50m1で、37℃、16時間培養した菌体
から超音波処理により溶菌液全v4製し、これを32.
OOOxg、20分間遠心して上溝を得几。この上清全
粗酵素液として用い、10mMトリス塩rII塩、8Q
rnM L−スレオニンを含む反応液中で酵素反応を
行い、生じt2−ケト酪酸を2.4ジニトロフエールヒ
ドクゾンで発色させて波長570 nmで定量した。表
−1にその測定結果を示す。この結果、 pILVA
−IKスレオニンデアミナーゼ遺伝子がクローン化され
た事が明らかとなり友。
をM9培地50m1で、37℃、16時間培養した菌体
から超音波処理により溶菌液全v4製し、これを32.
OOOxg、20分間遠心して上溝を得几。この上清全
粗酵素液として用い、10mMトリス塩rII塩、8Q
rnM L−スレオニンを含む反応液中で酵素反応を
行い、生じt2−ケト酪酸を2.4ジニトロフエールヒ
ドクゾンで発色させて波長570 nmで定量した。表
−1にその測定結果を示す。この結果、 pILVA
−IKスレオニンデアミナーゼ遺伝子がクローン化され
た事が明らかとなり友。
(8) 組換えプラスミド中のスレオニンデアミナー
ゼ遺伝子のコードするスレオニンデアミナーゼのL−イ
ソロイシンによるフィードバック阻害の解除 <47でりa−ニングし几スレオニンデアミナーゼ遺伝
子は、フィードバック阻害が解除されていない野性様の
ものであったので、フィードバック阻害の解除を以下の
方法で行った。
ゼ遺伝子のコードするスレオニンデアミナーゼのL−イ
ソロイシンによるフィードバック阻害の解除 <47でりa−ニングし几スレオニンデアミナーゼ遺伝
子は、フィードバック阻害が解除されていない野性様の
ものであったので、フィードバック阻害の解除を以下の
方法で行った。
(1) スレオニンデアミナーゼ遺伝子を含ム2.3
kbのDNA断片を持つプラスミドpILVA lを保
持するT2. eolj K12 AJ 12351(
FERM P−9576)をlo!ILlのL−プロス
(バクトトリグトylOj’+イーストエキストラクト
5 JF + NAC251*グルコースlyをllに
含む。p)17.2 )で培養し、対数増殖期の菌体を
得、遠心により集菌して1/IQ彊の10mMトリス−
10mM ? Oン酸緩衝液(pH5,2)I/CM濁
し友。2005m1/MlのN−メチル−N−ニトロ−
N−ニトロソグアニシンを37℃で30分作用させ遠心
により集菌し、L−プロス10m1K再懸濁し、37℃
で16時間培養した。培養後、前記(2)で述べ元方法
によりプラスミドDNA1取得し、E。
kbのDNA断片を持つプラスミドpILVA lを保
持するT2. eolj K12 AJ 12351(
FERM P−9576)をlo!ILlのL−プロス
(バクトトリグトylOj’+イーストエキストラクト
5 JF + NAC251*グルコースlyをllに
含む。p)17.2 )で培養し、対数増殖期の菌体を
得、遠心により集菌して1/IQ彊の10mMトリス−
10mM ? Oン酸緩衝液(pH5,2)I/CM濁
し友。2005m1/MlのN−メチル−N−ニトロ−
N−ニトロソグアニシンを37℃で30分作用させ遠心
により集菌し、L−プロス10m1K再懸濁し、37℃
で16時間培養した。培養後、前記(2)で述べ元方法
によりプラスミドDNA1取得し、E。
aollK12^J 12349(1i’lJM P−
9574)に形質転換し几、7)ピシリン耐性の形質転
換体を10−グリシル−L−ロイシンと7)ピシリンを
含むM9培地にレプリカレ、7)ピシリン耐性かつグリ
シル−L−ロイシン耐性の株を26株得た。
9574)に形質転換し几、7)ピシリン耐性の形質転
換体を10−グリシル−L−ロイシンと7)ピシリンを
含むM9培地にレプリカレ、7)ピシリン耐性かつグリ
シル−L−ロイシン耐性の株を26株得た。
このうちの1株の持つプラスミドをpILVAS−1と
名付け、前記(2)で述べ次男法によりpILVAS−
lDNA i得皮。このプラスミドf E、 coll
Kl 2AJ 12349 (FIRM P−957
4) l’c再形質転換し、得られ友7)ピシリン耐性
コロニーのうち、100株についてグリシル−し−ロイ
シン耐性ヲ調べたところ。
名付け、前記(2)で述べ次男法によりpILVAS−
lDNA i得皮。このプラスミドf E、 coll
Kl 2AJ 12349 (FIRM P−957
4) l’c再形質転換し、得られ友7)ピシリン耐性
コロニーのうち、100株についてグリシル−し−ロイ
シン耐性ヲ調べたところ。
これらはいずれも抵抗性を獲得してい7t、この菌株1
kAJ 12352 (FERM P−9577)と命
名する。従って。
kAJ 12352 (FERM P−9577)と命
名する。従って。
組換えプラスミドpILVAs−1は、グリシル−し−
ロイシン耐性が付与され九スレオニンデアミナーゼ遺伝
子をもつ事が明らかとなつ几。次に、先九述べ几方法に
より、スレオニンデアミナーゼ活性をL−イソロイシン
存在下で測定した。結果を表−2に示す。
ロイシン耐性が付与され九スレオニンデアミナーゼ遺伝
子をもつ事が明らかとなつ几。次に、先九述べ几方法に
より、スレオニンデアミナーゼ活性をL−イソロイシン
存在下で測定した。結果を表−2に示す。
表−2
菌株
L−イソロイシンなし L−イソロイシンlrnMAJ
12351(F’ERM P−9576) 1
00 % OSAJ 12352(FE
RM P−9577) 100% 12
0チ表−2の結果、plLVAs−1上のスレオニンデ
アミナーゼ遺伝子がコードするスレオニンデアミナーゼ
遺伝子tiL−イソロイシンによるフィードバック阻害
が解除されており、この方法によりプラスミド上の遺伝
子の改良がなされたと認められる。
12351(F’ERM P−9576) 1
00 % OSAJ 12352(FE
RM P−9577) 100% 12
0チ表−2の結果、plLVAs−1上のスレオニンデ
アミナーゼ遺伝子がコードするスレオニンデアミナーゼ
遺伝子tiL−イソロイシンによるフィードバック阻害
が解除されており、この方法によりプラスミド上の遺伝
子の改良がなされたと認められる。
(9) スレオニンデアミナーゼ遺伝子の転写量の増
加(8)テ得ら′rLft、 pILVAs −1ノ2
.3kb C1h l 7 ラfメントの両端に合成り
amHI ’J 7カー全導入し、pACYC184(
文献: Chang、A、C,Y、、 Cohen、S
、C,。
加(8)テ得ら′rLft、 pILVAs −1ノ2
.3kb C1h l 7 ラfメントの両端に合成り
amHI ’J 7カー全導入し、pACYC184(
文献: Chang、A、C,Y、、 Cohen、S
、C,。
J、Bacts+rJsl、134 1141(19
78) の BamHI fイトに導入し7t、挿入
方向を異にするプラスミド1に2種得た。
78) の BamHI fイトに導入し7t、挿入
方向を異にするプラスミド1に2種得た。
コレラッグラス? )’ pILVAS−Ylもしくは
pILVAs−Y2 ’ii−保持し7t E、 co
il K12株(7) スL/ オニ/デアミナーゼ活
性を前記(7)の方法で測定し友。
pILVAs−Y2 ’ii−保持し7t E、 co
il K12株(7) スL/ オニ/デアミナーゼ活
性を前記(7)の方法で測定し友。
結果を表−3に示す。
表−3
^J12352(F餠ffl P−9577)
115E、 coil K12(plL
vAs−Yl) 1 250L
call K12(pILVAs−Y2)
1 08表−3の結果からpILVAs−
Yl上のスレオニンデアミナーゼ遺伝子はpACYo
184上のテトラサイクリン耐性遺伝子のプロモーター
により強く発現している事が確認された。ま几pACY
C184の系統のプラスミドはpBR322及び、それ
由来のプラスミドと共存させる事が可能なのでスレオニ
ンオペロン′1tpBR322に組込んだプラスミドと
共存させる事ができると期待され、L−イソロイシンの
生産量向上が期待できる。
115E、 coil K12(plL
vAs−Yl) 1 250L
call K12(pILVAs−Y2)
1 08表−3の結果からpILVAs−
Yl上のスレオニンデアミナーゼ遺伝子はpACYo
184上のテトラサイクリン耐性遺伝子のプロモーター
により強く発現している事が確認された。ま几pACY
C184の系統のプラスミドはpBR322及び、それ
由来のプラスミドと共存させる事が可能なのでスレオニ
ンオペロン′1tpBR322に組込んだプラスミドと
共存させる事ができると期待され、L−イソロイシンの
生産量向上が期待できる。
α1 宿主染色体への変異型スレオニンデアミナーゼ遺
伝子の導入 L−イソロイシンの生産のためにプラスミド上だけでは
なく染色体上にも前記(8)で得友フイードパクク阻害
の解除され几遺伝子を以下の方法で導入した。
伝子の導入 L−イソロイシンの生産のためにプラスミド上だけでは
なく染色体上にも前記(8)で得友フイードパクク阻害
の解除され几遺伝子を以下の方法で導入した。
(1) E、 coll K12 MM383 (p
otA” )株へのプラスミドの導入 MM383は、pBR322,pAcYc184等のプ
ラスミド保持に必要なpotA遺伝子の温度感受性変異
株である。この株に常法によってプラスミドpILV人
5−Yl e導入し、30℃でクロラムフェニコール耐
性株を得元。
otA” )株へのプラスミドの導入 MM383は、pBR322,pAcYc184等のプ
ラスミド保持に必要なpotA遺伝子の温度感受性変異
株である。この株に常法によってプラスミドpILV人
5−Yl e導入し、30℃でクロラムフェニコール耐
性株を得元。
形質転換株を30℃で培養後、42cでクロラムフェニ
コール耐性株を選択した。これらは全てプラスミドを失
ってい九ので染色体上に変異型スレオニンデアミナーゼ
遺伝子が組み込まれたものと思わt″L7t65j!際
、全ての株がグリシル−L−ロイシンに耐性であっ友。
コール耐性株を選択した。これらは全てプラスミドを失
ってい九ので染色体上に変異型スレオニンデアミナーゼ
遺伝子が組み込まれたものと思わt″L7t65j!際
、全ての株がグリシル−L−ロイシンに耐性であっ友。
組換え体をクロラムフェニコール非存在下で42℃で培
養した。対数増殖期の初期にクロラムフェニコールを加
えて更[30分培養した。この時少数存在するクロラム
フェニコール感受性株は増殖を停止するが、生存してい
る。その後に7)ピシリンを加えて増殖を続けているク
ロラムフェニコール耐性株を殺し友。増殖を停止してい
るクロラムフェニコール感受性株は、7ンピシリンの影
響を受けにくいので、この過程でクロラムフェニコール
感受性株を効率良く濃縮する事ができる。
養した。対数増殖期の初期にクロラムフェニコールを加
えて更[30分培養した。この時少数存在するクロラム
フェニコール感受性株は増殖を停止するが、生存してい
る。その後に7)ピシリンを加えて増殖を続けているク
ロラムフェニコール耐性株を殺し友。増殖を停止してい
るクロラムフェニコール感受性株は、7ンピシリンの影
響を受けにくいので、この過程でクロラムフェニコール
感受性株を効率良く濃縮する事ができる。
レグリカ法によりクロラムフェニコール耐性を失っ几株
t−100株選び、それらのグリシル−L−ロイシン耐
性度を調べ九ところ、52株が耐性であっ几ので、これ
らのうち1株より常法に従いPl、7ア、−ジ溶菌液を
得た。
t−100株選び、それらのグリシル−L−ロイシン耐
性度を調べ九ところ、52株が耐性であっ几ので、これ
らのうち1株より常法に従いPl、7ア、−ジ溶菌液を
得た。
(i+ 前記中で得られたP1ファーゾとスレオニン
生産菌AJ 11332(FIRM P−4898)
より調製したP1ファーゾ溶菌液から、AJ 123
50(FERM P −9575)(m@を一、 tr
p 、 A)[Vr、 GL’、 Vat’ ) t−
得た。
生産菌AJ 11332(FIRM P−4898)
より調製したP1ファーゾ溶菌液から、AJ 123
50(FERM P −9575)(m@を一、 tr
p 、 A)[Vr、 GL’、 Vat’ ) t−
得た。
αη 各形質転換株のL−イソロイシン生産能(10で
得られたAJ 12350 CFERM P−9575
) K (9)で得うレfcplLVAs−Yl トス
レオニンオペロンを持つpAJ294 (%開昭55−
131397に記載のAJ 11334 (FIRM
P−4900)のプラスミド)を導入した。形質転換体
は7)ピシリ/、クロ2ムフエニコール耐性で選択した
。こj、をAJ 12353 (F’liRMP−95
78)と命名する。
得られたAJ 12350 CFERM P−9575
) K (9)で得うレfcplLVAs−Yl トス
レオニンオペロンを持つpAJ294 (%開昭55−
131397に記載のAJ 11334 (FIRM
P−4900)のプラスミド)を導入した。形質転換体
は7)ピシリ/、クロ2ムフエニコール耐性で選択した
。こj、をAJ 12353 (F’liRMP−95
78)と命名する。
プラスミドを持九ない人J 12350 (FIJM
P−9575)全対バαとして、L−イソロイシン生産
培地(3チグルコース、1%(NH4)2So410.
2チKl(2PO4eO,I To MgSO44H2
0+ 2 ppm Fe ff1)イオy 、 2 p
pmMnQOイオン、 1 pi/rdfイアミンー塩
酸塩、100μ1iltnl L−メチオニン、 30
0 ttl/rnlL −)リグトファン) 201n
lft500rnlの肩付フラスコに入れたものに、被
検菌株を植えつけ、30℃にて72時間振盪培養し友。
P−9575)全対バαとして、L−イソロイシン生産
培地(3チグルコース、1%(NH4)2So410.
2チKl(2PO4eO,I To MgSO44H2
0+ 2 ppm Fe ff1)イオy 、 2 p
pmMnQOイオン、 1 pi/rdfイアミンー塩
酸塩、100μ1iltnl L−メチオニン、 30
0 ttl/rnlL −)リグトファン) 201n
lft500rnlの肩付フラスコに入れたものに、被
検菌株を植えつけ、30℃にて72時間振盪培養し友。
培養後、遠心上清中のL−イソロイシンを液体クロマト
グラフィーにより定量した。また、培養時に前駆体とし
てL−スレオニンを1チ添加した結果も合わせ、表−4
に示した。
グラフィーにより定量した。また、培養時に前駆体とし
てL−スレオニンを1チ添加した結果も合わせ、表−4
に示した。
叛−4
菌 株
L−イソロイシンCn?/dt )
AJ12350(F庫爛P−9575)
8AJ12353(FERM P−9578)
38実施例2 (1)スレオニンデアミナーゼ遺伝子のサブクローニン
グ 7)ピシリン耐性とクロラムフェニコール耐性とをマー
カーに持ち、E、 eoliとルビバクテリウム属細菌
の両方で複製可能なシャトルベクターpDR1120(
10kb )と、実施例1の(9)で得られたpILV
AS−Ylとをそれぞれ制限酵素BamHIで切断し、
両切断物をT 4 DNAリガーゼで結合してE、co
目に12 AJ 12349 (FERM P−957
4)を形質転換した。
8AJ12353(FERM P−9578)
38実施例2 (1)スレオニンデアミナーゼ遺伝子のサブクローニン
グ 7)ピシリン耐性とクロラムフェニコール耐性とをマー
カーに持ち、E、 eoliとルビバクテリウム属細菌
の両方で複製可能なシャトルベクターpDR1120(
10kb )と、実施例1の(9)で得られたpILV
AS−Ylとをそれぞれ制限酵素BamHIで切断し、
両切断物をT 4 DNAリガーゼで結合してE、co
目に12 AJ 12349 (FERM P−957
4)を形質転換した。
7)ピシリン耐性かつクロラムフェニコール耐性で、L
−イソロイシンの要求性を失った形質転換体を選択して
プラスミドDNAを調製し、 Bam)tIで切断して
解析を行ったところ、pDR1120に2.3 kbの
B amHI断片が挿入されていることが明らかとなっ
た。このシラスミドをpDRIA4と命名した。
−イソロイシンの要求性を失った形質転換体を選択して
プラスミドDNAを調製し、 Bam)tIで切断して
解析を行ったところ、pDR1120に2.3 kbの
B amHI断片が挿入されていることが明らかとなっ
た。このシラスミドをpDRIA4と命名した。
pDRIA4を用いて再びE、colI K12 AJ
12349 (FERMp−9574) e形質転換
して、7)ピシリン耐性かつクロラムフェニコール耐性
の形質転換体を選択すると、それらは全てL−イソロイ
シンの要求性k 失ッテイfc。従ッテ、p DRI
A4には、pJLVAs−Yl由来のスレオニンデアミ
ナーゼ遺伝子がクローン化されていることが明らかとな
った。
12349 (FERMp−9574) e形質転換
して、7)ピシリン耐性かつクロラムフェニコール耐性
の形質転換体を選択すると、それらは全てL−イソロイ
シンの要求性k 失ッテイfc。従ッテ、p DRI
A4には、pJLVAs−Yl由来のスレオニンデアミ
ナーゼ遺伝子がクローン化されていることが明らかとな
った。
(2)組み換えプラスミドのブレビバクflJウム・フ
ラバムへの導入 (1)で得られたpDRLA4で、グレピパクテリウム
・フラバムAJ 1510 及ヒ、グレビパクテリヮム
・フラパAKMし、L−スレオニンの生産性を有する菌
株TB−1を形質転換し、クロラムフェニコール耐性形
質転換体を選択しfc0形/JIt転換法は、特開Vg
61−149082に記載さ扛ているプトログラスト法
によった。
ラバムへの導入 (1)で得られたpDRLA4で、グレピパクテリウム
・フラバムAJ 1510 及ヒ、グレビパクテリヮム
・フラパAKMし、L−スレオニンの生産性を有する菌
株TB−1を形質転換し、クロラムフェニコール耐性形
質転換体を選択しfc0形/JIt転換法は、特開Vg
61−149082に記載さ扛ているプトログラスト法
によった。
得られた形質転換体をそれぞれAJ 12358(FE
RM ”7)−9764)、AJ 12359(FER
M 7) −(VTA夕 )と命名した。
RM ”7)−9764)、AJ 12359(FER
M 7) −(VTA夕 )と命名した。
(3)形ti転換林のスレオニンデアミナーゼ活性と、
そのし−イソロイシンによるフィードバック阻鈎 グルコース100 、S’ 、 (NH4)2804
451、KH2))0411 、 MgSO4’7H2
019%FeSO410I!9、MnSO410’9、
ビタミンB、0.3!、ピオチン0゜1■、豆端縮有機
態怒累150ダを1j中に含む培地で、形質転換株AJ
1235B (FERM 1’−’?’l14
)と、対照としてAJ 15104 <2)に記載し
た方法によってpDRl 12011′形質転換した株
及びAJ 1510とを、31.5℃、12時間培養し
た後、実施例1の(7)に記載した方法でスレオニンデ
アミナーゼの活性を測定し、また、同活性のし一イソロ
イシンによる阻害金側足した。結果を衣−5及び表−6
に示す。
そのし−イソロイシンによるフィードバック阻鈎 グルコース100 、S’ 、 (NH4)2804
451、KH2))0411 、 MgSO4’7H2
019%FeSO410I!9、MnSO410’9、
ビタミンB、0.3!、ピオチン0゜1■、豆端縮有機
態怒累150ダを1j中に含む培地で、形質転換株AJ
1235B (FERM 1’−’?’l14
)と、対照としてAJ 15104 <2)に記載し
た方法によってpDRl 12011′形質転換した株
及びAJ 1510とを、31.5℃、12時間培養し
た後、実施例1の(7)に記載した方法でスレオニンデ
アミナーゼの活性を測定し、また、同活性のし一イソロ
イシンによる阻害金側足した。結果を衣−5及び表−6
に示す。
衣
困
休
AJ 1510
AJ 1510/pDR1120
AJ 1510/pDRIA4
(AJ 12358)
ΔA370/’%’−i日/′m1n
84.5
88.2
438.8
表
人J 1510/pDR1120
AJ 1510/pDRIA4
(AJ 12358)
100%
100%
24%
73チ
(4ン形質転換林での、前駆体からL−イソロイシンへ
の転換 形質転換株AJ 12358 (FERM″7)−’?
7δ4 )と、対照としてAJ 1510 K(2
)に記載した方法によってpDR1120イ形質転換し
た株及びAJ 1510とを、(3)に記載した培地に
L−ホモセリン1011/l 又はL−スレオニン10
9/l k添加した培地で、31.5℃、48時間培養
した後、遠心上清中のL−イソロイシンの蓄積を測定し
た。結果を餞−7に示す。
の転換 形質転換株AJ 12358 (FERM″7)−’?
7δ4 )と、対照としてAJ 1510 K(2
)に記載した方法によってpDR1120イ形質転換し
た株及びAJ 1510とを、(3)に記載した培地に
L−ホモセリン1011/l 又はL−スレオニン10
9/l k添加した培地で、31.5℃、48時間培養
した後、遠心上清中のL−イソロイシンの蓄積を測定し
た。結果を餞−7に示す。
表 −7
AJ 1510/pDR1120
0,7
0、i
AJ 1510/’PDRIA4
(AJ 12358)
7.5
7.5
(5)形質転換株のL−イソロイシン生成形質転換法人
J、 12358 (FERM 各q’714)及び
AJ 12359 (F酵財 y−qq6タ )と
、対照として人J 1510及びTB −1%(2)に
記載した方法によッテpDR1120−C”形質転換し
文法と、AJ 1510及びTB −1とを、(3)に
記載した培地で、グルコース全完全て消費するまで培養
し、線心上溝中のし一イソロイシンの蓄積を液体クロマ
トグラフィーで副足し友0M来を表−8に示す。
J、 12358 (FERM 各q’714)及び
AJ 12359 (F酵財 y−qq6タ )と
、対照として人J 1510及びTB −1%(2)に
記載した方法によッテpDR1120−C”形質転換し
文法と、AJ 1510及びTB −1とを、(3)に
記載した培地で、グルコース全完全て消費するまで培養
し、線心上溝中のし一イソロイシンの蓄積を液体クロマ
トグラフィーで副足し友0M来を表−8に示す。
弄 −8
AJ 1510
AJ 1510/pDR1120
TB −1
21,0
TB −1/pDR1120
18,0
次−8の粕来より、pDRIA4の尋人によってブレビ
バクテリウム・フラバムにおけるL−イソロイシンの生
産性か、顕著に増大することが明らかとなった。
バクテリウム・フラバムにおけるL−イソロイシンの生
産性か、顕著に増大することが明らかとなった。
以上述べた如く、本発明は、DNA組換え技術を利用す
ることにより、L−イソロイシンの生産性を向上させた
もので、工莱化か大いに期待されるものでおる。
ることにより、L−イソロイシンの生産性を向上させた
もので、工莱化か大いに期待されるものでおる。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 (1)スレオニンデアミナーゼ遺伝子を組み込んだ自律
増殖可能なプラスミド又はファージ。 (2)スレオニンデアミナーゼ遺伝子がE.coli由
来の遺伝子である特許請求の範囲第(1)項記載のプラ
スミド又はファージ。 (3)スレオニンデアミナーゼ遺伝子が野性型遺伝子で
ある特許請求の範囲第(1)項記載のプラスミド又はフ
ァージ。 (4)スレオニンデアミナーゼ遺伝子が変異遺伝子であ
って、フィードバック阻害が解除されている遺伝子であ
る特許請求の範囲第(1)項記載のプラスミド又はファ
ージ。 (5)スレオニンデアミナーゼ遺伝子が本来の、もしく
は他遺伝子のプロモーター支配下にある遺伝子である特
許請求の範囲第(1)項記載のプラスミド又はファージ
。 (6)スレオニンデアミナーゼ遺伝子が本来の、もしく
は他遺伝子のテトラサイクリン耐性遺伝子のプロモータ
ー支配下にある遺伝子である特許請求の範囲第(1)項
記載のプラスミド又はファージ。 (7)特許請求の範囲第(1)項から第(6)項記載の
プラスミド又はファージを保有する微生物。 (8)微生物がE.coliである特許請求の範囲第(
7)項記載の微生物。 (9)微生物がスレオニンを生産するE.coliであ
る特許請求の範囲第(7)項記載の微生物。 (10)微生物がイソロイシン及びバリンの生合成系の
リプレッションが解除されたE.coliである特許請
求の範囲第(7)項記載の微生物。 (11)微生物がコリネホルムのグルタミン酸生産菌で
ある特許請求の範囲第(7)項記載の微生物。 (12)微生物がスレオニンを生産するコリネホルムの
グルタミン酸生産菌である特許請求の範囲第(7)項記
載の微生物。 (13)微生物がブレビバクテリウムである特許請求の
範囲第(7)項記載の微生物。 (14)微生物がブレビバクテリウム・ラクトファーメ
ンタムである特許請求の範囲第(7)項記載の微生物。 (15)微生物がブレビバクテリウム・フラバムである
特許請求の範囲第(7)項記載の微生物。 (16)微生物がコリネバクテリウム・グルタミクムで
ある特許請求の範囲第(7)項記載の微生物。 (17)微生物がスレオニンを生産するブレビバクテリ
ウムである特許請求の範囲第(7)項記載の微生物。 (18)微生物がスレオニンを生産するブレビバクテリ
ウム・ラクトファーメンタムである特許請求の範囲第(
7)項記載の微生物。 (19)微生物がスレオニンを生産するブレビバクテリ
ウム・フラバムである特許請求の範囲第(7)項記載の
微生物。 (20)微生物がスレオニンを生産するコリネバクテリ
ウム・グルタミクムである特許請求の範囲第(7)項記
載の微生物。 (21)プラスミド上のスレオニンデアミナーゼ遺伝子
を染色体上に転移させた微生物。(22)微生物がE.
coliである特許請求の範囲第(21)項記載の微生
物。 (23)微生物がブレビバクテリウム・ラクトファーメ
ンタムである特許請求の範囲第(21)項記載の微生物
。 (24)微生物がブレビバクテリウム・フラバムである
特許請求の範囲第(21)項記載の微生物。 (25)微生物がコリネバクテリウム・グルタミクムで
ある特許請求の範囲第(21)項記載の微生物。 (26)微生物がL−スレオニンの生産能を高めるよう
なプラスミドもしくはファージを保有している特許請求
の範囲第(7)項又は/及び第(21)項記載の微生物
。 (27)プラスミドがE.coliのスレオニンオペロ
ンを帯同している特許請求の範囲第(26)項記載の微
生物。 (28)プラスミドが特許請求の範囲第(1)項記載の
プラスミドと共存可能である特許請求の範囲第(26)
項及び第(27)項に記載されているプラスミド。 (29)特許請求の範囲第(7)項から第(26)項ま
での菌株を培養し、培養液からL−イソロイシンを単離
することを特徴とするL−イソロイシンの製造法。 (30)特許請求の範囲第(7)項から第(26)項ま
での微生物をスレオニンを含有する培地で培養し、培養
液からL−イソロイシンを単離することを特徴とするL
−イソロイシンの製造法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP62331374A JP2536570B2 (ja) | 1987-10-12 | 1987-12-25 | 発酵法によるl―イソロイシンの製造法 |
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP25700387 | 1987-10-12 | ||
JP62-257003 | 1987-10-12 | ||
JP62331374A JP2536570B2 (ja) | 1987-10-12 | 1987-12-25 | 発酵法によるl―イソロイシンの製造法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH02458A true JPH02458A (ja) | 1990-01-05 |
JP2536570B2 JP2536570B2 (ja) | 1996-09-18 |
Family
ID=26543007
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP62331374A Expired - Lifetime JP2536570B2 (ja) | 1987-10-12 | 1987-12-25 | 発酵法によるl―イソロイシンの製造法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2536570B2 (ja) |
Cited By (52)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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