CN110643559B

CN110643559B - 提高l-色氨酸生产效率的转运载体基因在大肠杆菌中的应用

Info

Publication number: CN110643559B
Application number: CN201911013678.2A
Authority: CN
Inventors: 谢希贤; 熊博; 赵春光; 郭小炜; 门佳轩; 魏爱英
Original assignee: Ningxia Eppen Biotech Co ltd; Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Ningxia Eppen Biotech Co ltd; Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2019-09-03
Filing date: 2019-10-23
Publication date: 2021-11-12
Anticipated expiration: 2039-10-23
Also published as: WO2021042460A1; ZA202203348B; KR20220061146A; JP7475434B2; JP2022547432A; EP4026896A4; EP4026896A1; CN110643559A; BR112022003571A2; US20220411835A1

Abstract

本发明涉及一种转运蛋白编码基因及利用含有该基因的菌株高效生产L‑色氨酸的方法。具体的，通过在大肠杆菌基因组上异源表达来自枯草芽孢杆菌的ywkB基因可增强菌株L‑色氨酸生产效率，利用该菌株进行摇瓶发酵可在24h内积累L‑色氨酸15.2g/L，相比对照菌株提高了35％。

Description

提高L-色氨酸生产效率的转运载体基因在大肠杆菌中的应用

技术领域

本发明涉及代谢工程和生物技术，具体涉及一个来源于枯草芽孢杆菌的代谢物转运载体基因，该基因能有效提高大肠杆菌L-色氨酸工程菌的氨基酸生产效率。

背景技术

色氨酸作为一种对生物体生长发育有重要调节作用，同时有良好抗抑郁、促进睡眠等药理功效的氨基酸，在食品、医药、动物饲料等行业中发挥着重要作用。随着对该氨基酸研究的进一步深入，其应用领域将会更广泛，这势必会使色氨酸的市场需求量急剧上升，因此寻求一种更高效、廉价的色氨酸生产工艺逐渐受到人们的重视。目前，其生产方法包括化学合成法、酶反应法以及微生物直接发酵法，直接发酵法是以葡萄糖等低价原料为底物通过发酵直接生产L-色氨酸的一种方法，该方法具有易于操控、成本低、产率高、周期短、环境污染小等优势，但是对微生物内环境以及各代谢途径之间平衡关系的研究仍不透彻，使得微生物发酵法的产率较低。而且就L-色氨酸合成而言，其合成途径较长、所需前体物质较多，因此若要实现产量的进一步提高，则需要采用代谢工程手段对微生物代谢网络进行***的改造。

目前，代谢工程技术被广泛应用于工业菌株的改造中。代谢工程主要是利用DNA重组、CRISPR/Cas9介导的基因编辑等技术对直接参与氨基酸合成的途径酶、关键的限速酶以及不直接参与氨基酸合成的调节因子进行优化，除这些策略外，增强菌株目的产物转运能力也可以有效提高氨基酸生产效率。

现已报道了多种氨基酸分泌蛋白的编码基因，他们均能有效提升菌株的生产能力。例如，增加赖氨酸分泌基因lysE的表达能提高棒状杆菌属赖氨酸产生菌的生产能力(WO9723597A2)。增强rhtB基因能使细菌对L-高丝氨酸的耐受增加(欧洲专利申请EP994190A2)。rhtC基因的额外拷贝能提高L-高丝氨酸、L-苏氨酸和L-亮氨酸的产量(欧洲专利申请EP1013765A1)。yahN、yeaS、yfiK和yggA基因的额外拷贝能提高L-谷氨酸、L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-丙氨酸等产量(欧洲专利申请EP 1016710A2)。

在芳香族氨基酸生产菌中报道最广泛的转运蛋白是由大肠杆菌自身基因yddG所编码的。其中，Vera Doroshenko等以大肠杆菌MG1655为出发菌株，分别以质粒或基因组整合的方式表达不同强度的yddG基因。经过试管发酵实验验证，L-色氨酸的积累量为0.6μg/mL，L-苯丙氨酸的积累量为30000μg/mL。刘双平等人通过基因工程手段将yddG基因以质粒形式导入宿主大肠杆菌中。发酵实验证明，含有yddG基因的菌株L-苯丙氨酸胞外转运能力提高，最终L-苯丙氨酸的产量达到62g/L。还有研究以大肠杆菌色氨酸生产菌株SV164(pGH5)为亲代菌株，将由较强启动子控制的yddG基因导入细胞，获得SV164PL-yddG(pGH5)菌株。该菌株在20×200mm试管中，37℃下振摇培养48h，最终L-色氨酸产量为4.17g/L，相比出发菌提高12％左右。

从上述案例可以发现，过表达yddG基因能增强工程菌株对芳香族氨基酸的耐受能力，但该基因所编码的膜蛋白对不同芳香族氨基酸的亲和力差异较大，转运效果欠佳，且该基因源于大肠杆菌，因此容易受到菌体的自身调控而无法发挥出高效的转运功能，所以很难满足工业生产的要求。

发明内容

本发明的目的是提高L-色氨酸生产菌株的生产效率并利用该菌株生产L-色氨酸。为了实现上述目的，本发明将来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis subsp)的代谢物转运蛋白的编码基因ywkB(Gene ID:936875)转入宿主菌后提高宿主菌合成L-色氨酸的产率。ywkB是一种膜蛋白编码基因，其编码产物是假定代谢物转运体，属于生长素外排载体族(TC 2.A.69)，它不直接参与L-色氨酸的合成，而当该基因被引入到L-色氨酸生产菌株中时，能有效降低胞内终产物浓度，解除终产物对代谢途径酶的反馈抑制，使更多碳流向目的氨基酸合成途径，最终提高产品产量。

本发明提供技术方案之一：一种生产L-色氨酸的基因工程菌，以ywkB基因修饰宿主菌，所述的基因工程菌较宿主菌具有生产L-色氨酸更高产量的活性。

根据本发明的基因工程菌，所述的ywkB基因来自枯草芽孢杆菌，所述的修饰是将ywkB基因修饰到yeep假基因位点上。

根据本发明的基因工程菌，所述宿主菌是可生产L-色氨酸的宿主细菌，具体细菌种类并无特殊限定，只要它有生产L-色氨酸的能力或者它能获得这种能力；示例性的，所述的宿主菌可以是具有L-色氨酸生产功能的原核细菌，例如是具有L-色氨酸生产能力的革兰氏阴性菌；进一步的，所述的宿主菌是具有L-色氨酸生产能力的大肠杆菌；例如，所述的宿主菌指L-色氨酸生产菌E.coli TRP 03，(该菌株以大肠杆菌W3110为出发菌进行的基因改造，与E.coli TRP 03(中国专利CN 108753860 A)为同一菌株)。

根据本发明的基因工程菌，所述的ywkB基因为编码如下多肽序列的核苷酸序列：

(A)包括序列表SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白质；

(B)对序列表SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列进行缺失、替换、***一个或几个氨基酸修饰后所得的序列的蛋白质，其仍具有可提高菌株生产L-色氨酸以及L-色氨酸结构类似物(如5-羟基色氨酸等)产量的功能；

(C)与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列具有至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少96％，97％，98％，99％％同源性，来源于枯草芽孢杆菌且具有代谢物转运蛋白功能的蛋白(metabolite transporter)。

根据本发明的基因工程菌，本发明中所述的以ywkB基因修饰宿主菌是指将其导入宿主菌中。

将编码基因导入宿主菌的方法包括但不限于本领域技术人员所熟悉的基因工程手段，如利用同源重组的方式将目的基因导入宿主菌；或者是利用表达核酸构建体的方式将目的基因导入宿主菌，所述的表达核酸构建体具体可以是本领域技术人员熟悉的能够在原核宿主菌中进行表达的常见质粒；或者是利用基因编辑的手段将目的基因***到宿主的染色质中。

根据本发明的基因工程菌，其中所述ywkB基因位于强启动子的控制之下，示例性的，所述强启动子为BBa_j23101启动子或BBa_j23106启动子。

具体的，本发明的修饰为，利用大肠杆菌CRISPR/Cas9基因编辑技术将转运蛋白编码基因ywkB引入至E.coli TRP 03中，更进一步，是将BBa_j23106启动子控制的该基因整合至yeep假基因位点上。

所述ywkB基因的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。

所述ywkB基因的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。

所述BBa_j23106启动子的核苷酸序列如SEQ ID No：3所示。

本发明的技术方案之二：一种构建生产L-色氨酸的基因工程菌的方法，所述方法包括，在宿主菌中，整合ywkB基因，获得较宿主菌具有生产L-色氨酸更高产量的活性的基因工程菌。

根据本发明的构建方法，其中所述的整合是将ywkB基因修饰到yeep假基因位点上，示例性的，所述的整合是通过CRISPR-Cas9基因编辑的手段进行。

根据本发明的构建方法，以天津科技大学实验室保藏的E.coli TRP 03色氨酸生产菌为出发菌，整合ywkB基因，具体如下：

(1)合成ywkB整合基因片段：构建yeep假基因的上下游同源臂片段、ywkB基因片段以及BBa_j23106启动子序列，所述ywkB整合基因片段包括yeep基因上游同源臂、yeep基因下游同源臂、BBa j23106启动子片段、ywkB基因片段；

(2)用CRISPR/Cas9技术将ywkB整合基因片段在E.coli TRP 03中表达。

根据本发明的构建方法，其中所述的ywkB基因序列是编码如下多肽序列的核苷酸序列：

(A)包括序列表SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白质；

本发明的技术方案之三，一种由如上所述的构建生产L-色氨酸的基因工程菌的方法所获得的基因工程菌。

本发明的技术方案之四，一种生产L-色氨酸的方法，该方法包括利用如上所述的本发明方案之一的基因工程菌或方案之二的方法获得的基因工程菌发酵生产L-色氨酸的步骤。

根据本发明的生产L-色氨酸的方法，其包括如下步骤：

1)菌种活化：

2)制备种子液；

3)发酵培养。

示例性的，其中

步骤1)采用斜面培养：取-80℃保藏菌种划线接种于活化斜面，37℃培养12h，并传代一次；

步骤2)采用摇瓶种子培养：用接种环刮取一环斜面种子接种于装有30mL种子培养基的500mL三角瓶中，九层纱布封口，37℃，200rpm培养8-10h；

步骤3)采用摇瓶发酵培养：按10-15％(v/v)接种量接种到装有发酵培养基的500mL三角瓶中(终体积为30mL)，九层纱布封口，37℃，200r/min振荡培养，发酵过程中通过补加氨水维持pH在7.0-7.2；补加60％(m/v)葡萄糖溶液维持发酵进行(以苯酚红做指示剂，发酵液颜色不再变化时即视为缺糖，缺糖时补加1-2mL 60％(m/v)葡萄糖溶液，使发酵液中的葡萄糖浓度为初始值20-40g/L)；发酵周期22-26h。

本发明具有如下优点和有益效果：

本发明将来源于枯草芽孢杆菌的转运载体编码基因ywkB引入L-色氨酸工程菌株，显著地提高了目的产物的产量，且由于该基因来自于枯草芽孢杆菌，因此不会受到工程菌的调控，更容易发挥功能，具有广阔的应用前景；本发明提供的含有ywkB基因的L-色氨酸工程菌株在摇瓶发酵24h后可积累L-色氨酸15.2g/L，相比出发菌株提高了35％，显示出工业化生产L-色氨酸的潜力。

附图说明

图1：(a)pREDCas9质粒图谱，(b)pGRB质粒图谱。

图2：BBa_j23106-ywkB基因片段构建及验证电泳图。其中：M：1kb DNA marker；1：上游同源臂；2：ywkB；3：下游同源臂；4：重叠片段；5：阳性菌鉴定片段；6：原菌对照。

图3：HPLC测定L-色氨酸标准曲线。

图4：摇瓶发酵L-色氨酸产量。

具体实施方式

实施例1：E.coli TRP 05菌株构建

1.基因编辑的方法

本发明中采用的基因编辑方法参照文献(Li Y,Lin Z,Huang C,et al.Metabolicengineering of Escherichia coli using CRISPR–Cas9 meditated genomeediting.Metabolic engineering,2015,31:13-21.)进行，该方法所用的两个质粒图谱见附图1。其中pREDCas9携带gRNA表达质粒pGRB的消除***，λ噬菌体的Red重组***及Cas9蛋白表达***，奇霉素抗性(工作浓度：100mg/L)，32℃培养；pGRB以pUC18为骨架，包括启动子J23100，gRNA-Cas9结合区域序列和终止子序列，氨苄青霉素抗性(工作浓度：100mg/L)，37℃培养。

该方法的具体步骤如下：

1.1 pGRB质粒构建

构建质粒pGRB的目的是为了转录相应的gRNA，从而与Cas9蛋白形成复合体，并通过碱基配对和PAM识别目的基因靶位点，实现目的DNA双链断裂。采用包含靶序列的DNA片段与线性化的载体片段重组的方法构建pGRB质粒。

1.1.1靶序列设计

使用CRISPR RGEN Tools设计靶序列(PAM:5’-NGG-3’)

1.1.2包含靶序列的DNA片段的制备

设计引物：5’-线性化载体末端序列(15bp)-酶切位点-靶序列(不包括PAM序列)-线性化载体末端序列(15bp)-3’及其反向互补的引物，通过单链DNA的退火制备包含靶序列的DNA片段。反应条件：预变性95℃，5min；退火30-50℃，1min。退火体系如下：

退火体系

1.1.3线性载体的制备

载体的线性化采用反向PCR扩增的方法。

1.1.4重组反应

重组体系如下表。所用重组酶均为

II One Step Cloning Kit系列的酶，重组条件：37℃，30min。

重组体系

1.1.5质粒的转化

取10μL反应液，加入到100mL DH5α化转感受态细胞中，轻轻混匀后冰浴20min，42℃热激45-90s，立即冰浴2-3min，加入900μL SOC，于37℃复苏1h。8000rpm离心2min，弃部分上清，留200μL左右将菌体重悬后涂布到含有100mg/L氨苄青霉素的平板，将平板倒置，于37℃过夜培养。待平板长出单菌落后通过菌落PCR鉴定，挑选阳性重组子。

1.1.6克隆鉴定

将PCR阳性菌落接种至含有100mg/L氨苄青霉素的LB培养基中过夜培养后保菌，提取质粒，酶切鉴定。

1.2重组DNA片段的制备

用于敲除的重组片段由需敲除基因的上下游同源臂组成(上游同源臂-下游同源臂)；用于整合的重组片段以整合位点的上下游同源臂及待整合的基因片段组成(上游同源臂-目的基因-下游同源臂)。利用引物设计软件primer5，以待敲除基因或待整合位点的上下游序列为模板，设计上下游同源臂引物(扩增长度约400-500bp)；以待整合基因为模板，设计整合基因的扩增引物。通过PCR的方法分别扩增上下游同源臂和目的基因片段后，再经过重叠PCR制备重组片段。PCR所用DNA聚合酶购自TaKaRa公司，包括高保真的PrimeSTAR HSDNA Polymerase和PCR产物携带粘性末端的Ex.taq DNA Polymerase，其PCR的体系和方法如下表：

HS酶PCR扩增体系

菌落PCR的体系如下表：

Ex.taq酶PCR扩增体系

重叠PCR的体系如下表：

HS酶重叠PCR扩增体系

注：模板由上下游同源臂的扩增片段和目的基因等摩尔组成，且总量不超过10ng。

Ex.taq酶重叠PCR扩增体系

PCR反应条件：预变性(95℃)5min；然后进行30轮循环：变性(98℃)10s，退火((Tm-3/5)℃)15s，72℃延伸(此酶活力1min延伸约1kb)；72℃继续延伸10min；维持(4℃)。

1.3质粒和重组DNA片段的转化

1.3.1 pREDCas9的转化

利用电转的方法将pREDCas9质粒电转至W3110的电转感受态中，将菌体复苏培养后涂布于含奇霉素的LB平板上，32℃过夜培养。抗性平板上生长单菌落用鉴定引物进行菌落PCR,筛选阳性重组子。

1.3.2含pREDCas9的目的菌株电转化感受态制备

32℃培养至OD₆₀₀＝0.1～0.2时，添加0.1M的IPTG(使其终浓度为0.1mM)，继续培养至OD₆₀₀＝0.6～0.7时进行感受态制备。添加IPTG的目的是使pREDCas9质粒上的重组酶诱导表达。感受态制备所需培养基及制备过程参照常规标准操作。

1.3.3 pGRB和重组DNA片段的转化

将pGRB和供体DNA片段同时电转化至含有pREDCas9的电转感受态细胞中。将电转化后复苏培养的菌体涂布于含氨苄青霉素和奇霉素的LB平板上，32℃过夜培养。用上游同源臂上游引物和下游同源臂的下游引物，或设计专门的鉴定引物，进行菌落PCR验证，筛选阳性重组子并保菌。

1.4质粒的消除

1.4.1 pGRB的消除

将阳性重组子置于含有0.2％***糖的LB培养基中过夜培养，适量稀释后涂布于含有奇霉素抗性的LB平板上，32℃过夜培养。对点含有氨苄青霉素和奇霉素抗性的LB平板，挑选氨苄青霉素平板不生长，奇霉素抗性平板生长的单菌落保菌。

1.4.2 pREDCas9质粒的消除

将阳性重组子转接到无抗性的LB液体培养基中，42℃过夜培养，适量稀释后涂布于无抗性的LB平板上，37℃过夜培养。对点含有奇霉素抗性和无抗性的LB平板，挑选奇霉素抗性平板不生长，无抗性平板生长的单菌落保菌。

2.L-色氨酸工程菌株E.coli TRP 05的构建

2.1 ywkB基因合成

⑴采用PCR技术以E.coli W3110基因组为模板，根据yeep假基因序列，在基因两端设计上游同源臂引物(yeep-up-S、yeep-up-A)和下游同源臂引物(yeep-down-S、yeep-down-A)，扩增获取yeep上下游同源臂；

⑵根据GENBANK上公布的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis subsp.subtilisstr.168)假定代谢物转运蛋白ywkB的基因序列设计PCR引物(ywkB-S、ywkB-A)，BBa j23106启动子序列设计在ywkB基因上游引物中，用HS酶扩增其片段。

⑶以步骤⑴、⑵获得的扩增片段为模板通过重叠PCR获得BBa j23106-ywkB基因的整合片段，所述片段由yeep基因上游同源臂、yeep基因下游同源臂、BBa j23106启动子片段、ywkB基因片段组成。

2.2 ywkB基因整合

⑴构建pGRB-yeep:按照1.1所述的方法制备包含靶序列的pGRB质粒，具体为根据1.1.2的方法设计引物，pGRB-yeep-S和pGRB-yeep-A，然后通过退火获得包含靶序列的DNA片段；按照1.1.3的方法将质粒pGRB线性化，接着按照1.1.4的方法制备获得包含靶序列质粒pGRB-yeep；

⑵制备E.coli TRP 03的感受态细胞；

⑶菌株E.coli TRP 05的获得：按照1.3所述的方法，即分别将pREDCas9质粒转化E.coli TRP 03后筛选过阳性克隆，然后再次制备含有pREDCas9质粒的E.coli TRP 03的感受态，电转入pGRB-yeep和2.1节步骤⑶制备的重组DNA片段，平板培养12-16h后进行菌落PCR验证，筛选阳性重组子并保菌；按照1.4节所述的方法，分别将质粒pGRB-yeep和pREDCas9消除，最终经过PCR鉴定筛选获得菌株E.coli TRP 05并保存于-80℃。

其中，BBa_j23106 ywkB基因整合片段的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见附图2。其中，上游同源臂的长度应为512bp，下游同源臂的长度应为513bp，BBa_j23106 ywkB基因片段的长度应为1040bp，BBa_j23106 ywkB基因整合片段的全部长度应为2065bp，PCR验证时，阳性菌PCR扩增片段长度应为2065bp，原菌PCR扩增片段长度应为1396bp。

3.菌株改造过程中所涉及的引物见下表：

实施例2：利用大肠杆菌基因工程菌摇瓶发酵生产L-色氨酸

利用大肠杆菌基因工程菌进行摇瓶发酵生产L-色氨酸的一种具体操作如下：

斜面培养：取-80℃保藏菌种划线接种于活化斜面，37℃培养12h，并传代一次；

摇瓶种子培养：用接种环刮取一环斜面种子接种于装有30mL种子培养基的500mL三角瓶中，九层纱布封口，37℃，200rpm培养8-10h；

摇瓶发酵培养：按10-15％(v/v)接种量接种到装有发酵培养基的500mL三角瓶中(终体积为30mL)，九层纱布封口，37℃，200r/min振荡培养，发酵过程中通过补加氨水维持pH在7.0-7.2；补加60％(m/v)葡萄糖溶液维持发酵进行(以苯酚红做指示剂，发酵液颜色不再变化时即视为缺糖，缺糖时补加1-2mL 60％(m/v)葡萄糖溶液，使发酵液中的葡萄糖浓度为初始值20-40g/L)；发酵周期22-26h；

发酵液中L-色氨酸浓度测定：收集发酵液1mL，13000rpm离心1min，收集上清液。使用去离子水将收集上清液稀释至一定倍数(稀释至0.1-0.5g/L)，经0.22μm微孔过滤后用液相检测L-色氨酸含量，其色谱条件为：色谱柱Kromasil C18柱(250mm×460mm,5μm)，流动相为10％乙腈溶液，流速1.0mL/min，柱温40℃，检测波长278nm，进样量为20μL，出峰时间约为3.5min，根据其峰面积按绘制的标准曲线计算得到发酵液中L-色氨酸的浓度；

L-色氨酸标准曲线的绘制：分别取L-色氨酸浓度为0.1g/L，0.3g/L，0.5g/L，0.6g/L，1g/L的溶液，按照上述色谱条件用液相测定得到相应浓度的L-色氨酸对应的峰面积，绘制得到L-色氨酸浓度与其峰面积的相关标准曲线如图3所示。

活化斜面培养基组分为：葡萄糖1-3g/L，胰蛋白胨5-10g/L，牛肉膏5-10g/L，酵母提取物2-5g/L，NaCl 2-5g/L，琼脂15-30g/L，其余为水，pH 7.0-7.2，121℃高压蒸汽锅灭菌20min；

种子培养基组分为：葡萄糖20-40g/L，(NH₄)₂SO₄ 1-5g/L，KH₂PO₄ 1-5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5-2g/L，酵母提取物2-5g/L，FeSO₄·7H₂O 1-3mg/L，MnSO₄·H₂O 1-3mg/L，V_H 0.1-0.5mg/L，V_B1 0.5-1.0mg/L，微量元素混合液1-3ml/L，苯酚红15-30g/L，其余为水，pH 7.0-7.2，115℃高压蒸汽锅灭菌15min；

发酵培养基组分为：葡萄糖20-40g/L，(NH₄)₂SO₄ 2-6g/L，KH₂PO₄ 1-5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5-2g/L，酵母提取物1-5g/L，FeSO₄·7H₂O 30-60mg/L，MnSO₄·7H₂O 1-5mg/L，，V_H0.1-0.5mg/L，V_B1 0.5-1.0mg/L，微量元素混合液1-3ml/L，苯酚红15-30g/L，其余为水，pH7.0-7.2，115℃高压蒸汽锅灭菌15min；

微量元素混合液组分为：Na₂MoO₄·2H₂O 2.5g/L，AlCl₃·6H₂O 2.5g/L，NiSO₄·6H₂O 2.5g/L，CoCl₂·6H₂O 1.75g/L，CaCl₂·2H₂O 10g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.5g/L，CuCl₂·2H₂O0.25g/L，H₃BO₃ 0.125g/L。

利用上述构建的L-色氨酸工程菌株E.coli TRP 05进行摇瓶发酵，以天津科技大学代谢工程实验室保存的L-色氨酸工程菌株E.coli TRP 03同等条件发酵作为对照，其实验结果如图4所示，L-色氨酸工程菌株E.coli TRP 03积累L-色氨酸达11.2g/L，E.coli TRP05积累L-色氨酸达15.2g/L，相比对照菌提高了35％。

<110> 宁夏伊品生物科技股份有限公司天津科技大学

<120> 提高L-色氨酸生产效率的转运载体基因在大肠杆菌中的应用

<210> 1

<211> 993

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis subsp. subtilis 168）

<400> 1

TTGAGCATCT TAGATATCTT AATCCTCCTG GCGCCGATCT TCTTTGTTAT CGTGCTGGGT 60

TGGTTTGCAG GACATTTTGG AAGTTATGAT GCCAAGTCGG CAAAAGGGGT AAGTACGTTA 120

GTAACGAAAT ACGCACTTCC AGCTCACTTT ATCGCTGGTA TTTTGACAAC TTCCAGAAGT 180

GAATTTTTAT CACAAGTACC TTTAATGATT TCTTTAATTA TTGGGATTGT TGGTTTCTAT 240

ATCATCATTC TTTTGGTTTG CAGATTTATA TTCAAGTATG ATTTAACGAA CTCATCTGTA 300

TTTTCTTTGA ACTCTGCACA GCCGACATTC GCATTTATGG GTATCCCGGT ATTGGGAAGC 360

TTATTCGGAG CGAATGAAGT TGCGATTCCG ATCGCGGTCA CAGGTATCGT GGTTAACGCG 420

ATTCTTGATC CGCTCGCGAT CATTATCGCT ACTGTTGGTG AGTCTTCTAA GAAAAACGAA 480

GAGAGTGGCG ACAGCTTCTG GAAGATGACA GGAAAATCAA TCCTGCATGG TCTTTGTGAG 540

CCGCTTGCAG CTGCTCCGTT AATCAGTATG ATCTTGGTGC TGGTTTTCAA TTTCACTCTT 600

CCTGAGCTGG GTGTTAAAAT GCTTGATCAG CTTGGAAGCA CAACATCTGG TGTTGCTCTC 660

TTCGCTGTTG GTGTTACCGT TGGTATTCGT AAAATTAAAC TCAGTATGCC GGCTATCGGT 720

ATTGCGTTAC TAAAAGTTGC GGTTCAGCCT GCGTTAATGT TCCTGATTGC TCTTGCTATC 780

GGACTTCCAG CTGACCAAAC AACAAAAGCA ATCCTTCTTG TTGCATTCCC TGGTTCTGCC 840

GTTGCAGCCA TGATTGCGAC TCGTTTCGAG AAACAAGAAG AAGAAACTGC AACTGCGTTT 900

GTGGTCAGTG CGATTCTGTC ATTGATTTCA CTTCCAATCA TTATCGCGCT TACTGCGTAA 960

CAAAAAAAGC TCCCTTTAAG GGAGCTTTTT GCT 993

<210> 2

<211> 319

<212> PRT

<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis subsp. subtilis 168）

<400> 2

MSILDILILL APIFFVIVLG WFAGHFGSYD AKSAKGVSTL VTKYALPAHF IAGILTTSRS 60

EFLSQVPLMI SLIIGIVGFY IIILLVCRFI FKYDLTNSSV FSLNSAQPTF AFMGIPVLGS 120

LFGANEVAIP IAVTGIVVNA ILDPLAIIIA TVGESSKKNE ESGDSFWKMT GKSILHGLCE 180

PLAAAPLISM ILVLVFNFTL PELGVKMLDQ LGSTTSGVAL FAVGVTVGIR KIKLSMPAIG 240

IALLKVAVQP ALMFLIALAI GLPADQTTKA ILLVAFPGSA VAAMIATRFE KQEEETATAF 300

VVSAILSLIS LPIIIALTA* 319

<210> 3

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

TTTACGGCTA GCTCAGTCCT AGGTATAGTG CTAGCAGGAA ACAGACC 47

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

GGTCAGGAGG TAACTTATCA GCG 23

<210> 5

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

CTGCTAGCAC TATACCTAGG ACTGAGCTAG CCGTAAAATG GCAGGGCTCC GTTTT 55

<210> 6

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

AGGTATAGTG CTAGCAGGAA ACAGACCTTG AGCATCTTAG ATATCTTAAT CCTCC 55

<210> 7

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

AAATCCAGTT CAGCAAAAAG CTCCCTTAAA GGG 33

<210> 8

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

TTTTTGCTGA ACTGGATTTT CTTCTGAACC TGT 33

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ACGATGTCAG CAGCCAGCA 19

<210> 10

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

AGTCCTAGGT ATAATACTAG TACAGAATAT TCGCGAAAAA AGTTTTAGAG CTAGAA 56

<210> 11

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

TTCTAGCTCT AAAACTTTTT TCGCGAATAT TCTGTACTAG TATTATACCT AGGACT 56

Claims

1.一种生产L-色氨酸的基因工程菌，其特征在于，以ywkB基因修饰宿主菌，所述的宿主菌是具有L-色氨酸生产能力的大肠杆菌，所述的基因工程菌较宿主菌具有生产L-色氨酸更高产量的活性，所述的ywkB基因来自枯草芽孢杆菌，所述的修饰是将ywkB基因修饰到yeep假基因位点上，所述的ywkB基因为编码如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的核酸。

2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述的宿主菌为E.coli TRP 03。

3.如权利要求1-2任一项所述的基因工程菌，其中ywkB基因是通过同源重组、表达载体或基因编辑的手段引入宿主菌。

4.如权利要求3所述的基因工程菌，其中所述的表达载体为质粒。

5.如权利要求3所述的基因工程菌，其中所述的基因编辑的手段是指利用CRISPR-Cas9方法将所述氨基酸序列编码基因引入宿主菌的染色体。

6.如权利要求1-2任一项所述的基因工程菌，其中所述ywkB基因位于强启动子的控制之下。

7.如权利要求6所述的基因工程菌，其中所述的强启动子为BBa_j23101启动子或BBa_j23106启动子。

8.如权利要求7所述的基因工程菌，其中所述BBa_j23106启动子的序列如SEQ ID NO:3所示。

9.一种构建生产L-色氨酸的基因工程菌的方法，其特征在于，在宿主菌中整合ywkB基因，获得较宿主菌具有生产L-色氨酸更高产量的活性的基因工程菌，其中所述的整合是将ywkB基因修饰到yeep假基因位点上，所述的宿主菌是具有L-色氨酸生产能力的大肠杆菌，所述的ywkB基因为编码如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的蛋核酸。

10.如权利要求9所述的方法，其中所述的大肠杆菌为E.coli TRP03色氨酸生产菌。

11.根据权利要求9-10任一项所述的方法，所述的整合是通过CRISPR-Cas9基因编辑的手段进行。

12.根据权利要求11所述的方法，所述的CRISPR-Cas9基因编辑的手段包括：

(1)合成ywkB整合基因片段：构建yeep假基因的上下游同源臂片段、ywkB基因片段以及BBa_j23106启动子序列，所述ywkB整合基因片段包括yeep基因上游同源臂、yeep基因下游同源臂、BBa j23106启动子片段和ywkB基因片段；

(2)用CRISPR/Cas9技术将ywkB整合基因片段在E.coli TRP 03中表达。

13.生产L-色氨酸的方法，该方法包括利用权利要求1-8任一项所述的基因工程菌或权利要求9-12任一项所述的方法获得的基因工程菌发酵生产L-色氨酸的步骤。

14.如权利要求13所述的生产L-色氨酸的方法，其包括如下步骤：

1)菌种活化：

2)制备种子液；

3)发酵培养。