JP3828193B2 - 蛍光結像システム及び蛍光結像方法 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は概略的には蛍光結像システム及び蛍光結像方法に関し、より特定的には、励起(excitation)波長又は発光(emission)検出波長又は両者を連続的にチューニング可能な蛍光結像のための方法及び装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
バイオテクノロジーの分野においては、センシティブで、非同位体のラベルとして通常は蛍光色素(fluorescent dyes)が用いられている。これらのラベルは、悪性腫瘍からＤＮＡシーケンス内の特定の染色体までの範囲の様々な細胞構造を識別し配置するために用いられる。一つの応用は、フルオレセンス・イン・シツ(in situ)・ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）であり、最初にＤＮＡプローブで特定の染色体領域に取りつき、次いで顕微鏡を用いてプローブを結像する。
【０００３】
蛍光でラベル化されたサンプルを読み取るための様々な装置が設計されてきた。一般に、蛍光でラベル化されたサンプルを読み及び又は結像するように設計された装置は、一つ以上の励起波長で発光する少なくとも一つの光源と一つ以上の蛍光波長を検出する手段を必要とする。
Proc. Natl. Acad. Sci. USA: Genetics, 89 (February 1992)に掲載のThomas Tied et al.による論文"Simultaneous Visualization of Seven Different DNA Probes by In Situ Hybridization Using Combinatorial Fluorescence and Digital Imaging Microscopy,"において、著者は結合プローブ・ラベリングスキームを記載している。この開示された技術は、所定数の蛍光色素を用いて同時に検出される目標シーケンスの数を増大させる。特に、著者はわずか３つの蛍光色素を用いて７つのプローブまでを同時に分析することを開示している。
【０００４】
米国特許第5,290,419 号には、タイムシェアを基本として動作する２つ以上の励起光源によりサンプルを照射する多色蛍光分光分析器が記載されている。バンドパスフィルター、イメージ分割用プリズム、バンドカットオフフィルター、波長分散プリズム及びダイクロイックミラーが用いられて、特定の発光波長を選択的に検出する。
【０００５】
米国特許第5,213,673 号には、一つ以上の光源によりサンプルを照射する多色電気泳動パターン読み取り装置が記載されている。この光源は個別に使用されるか又は単一の光源に結合される。サンプルの照射から得られた蛍光を分離して複数の蛍光波長にするために光学フィルターが使用されている。
米国特許第5,190,632 号には、2 つ以上の蛍光物質を励起できる光の混合を生成するために一つ以上の光源が使用される多色電気泳動パターン読み取り装置が記載されている。波長により蛍光を分離するために光学フィルターと回折格子の両方が用いられている。
【０００６】
米国特許第5,062,942号には、蛍光像が複数の仮想的な像に分離される蛍光検出装置が記載されている。仮想的な像を波長により分離するために、バンドパスフィルターが使用されている。
Gastrointestinal Endoscopy 36 (2) (1990) 105-111に掲載の、Cothren et al.による論文"Gastrointestinal Tissue Diagnosis by Laser-Induced Fluorescence Spectroscopy at Endoscopy" において、著者は、生きている組織からオートフルオレセンスを学習するために用いられる内視鏡システムを記載している。励起光源は３７０ナノメータの波長の単色である。照射された組織により発光された蛍光を集光するために光学フィルターが使用される。発光スペクトルはゲートされた光学的マルチチャネル分析器に結合された結像スペクトログラフを用いて集光される。類似のオートフルオレセンスシステムが、Lasers in Medical Science 2 (41) (1987) 41-49 に掲載のAnderson et al. による"Autofluorescence of Various Rodent Tissue and Human Skin Tumour Samples" に記載されている。
【０００７】
上記の蛍光分光分析器は多くの実行上の不利益をこうむる。例えば、システムのすべての励起波長の選択は非常に限定されており、それらのいずれもユーザに如何なる特別の励起波長をも特定する能力を与えない。したがって、これらのシステムによりユーザが蛍光ラベルの励起を最適化できるようにはならない。さらに、従来技術のシステムは、興味ある波長の検出全体にわたって連続的にチューニング可能であることとは反対に、概して離散的な波長帯域における蛍光の検出をする。励起と発光の検出の波長を連続的に行う能力がないと、ユーザは蛍光応答をピーク化することができない。
【０００８】
従来技術の蛍光分光分析器において検出波長の連続的なチューニング能力の欠如は、選択された蛍光ラベルが外部環境の効果によってスペクトルのシフトが生ずる場合に特に問題である。例えば、幾つかの蛍光プローブは溶剤の極性に対して感度を表す。本明細書における溶剤は様々なバイオモレキュラ構造（例えば、細胞、膜、たんぱく質、その他）の内部領域を含む。この現象は、大きい励起状態ダイポールモーメントを持つ蛍光プローブにおいて一般に観察される。蛍光スペクトルのシフトの他の一般に観察される原因は、多くの蛍光ラベルのｐＨ感度である。一般に、ｐＨ感度はプローブのπ電子システムにおける再構成の結果である。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
以上から、励起及び発光検出の波長の全体にわたり連続的にチューニング可能な蛍光分光分析器が望ましいことは明らかである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明はルックアップテーブル及び／又は信号ピーキングシステムと結合した、連続的にチューニング可能な蛍光検出装置を提供する。その装置のチューニング能力は、照射サブアセンブリ及び／又は発光検出サブアセンブリを連続波長内の任意の波長にチューニングする能力にある。
【００１１】
放射アセンプリのチューニング部と発光検出部は、分散要素、フィルター、又は干渉計を利用し得る。前者の例はプリズム及び格子である。後者の例は短路フィルター、長路フィルター、ノッチフィルター、可変フィルター、音響光学的フィルター、偏光フィルター、連続的にフィルムの厚さを変化させることに基づく干渉型フィルター、チューニング可能液晶フィルターである。干渉計の例はファブリペローエタロン及び一般のパス干渉計である。
【００１２】
本発明の一態様においては、ルックアップテーブルは、ユーザにより提供されたアプリケーションデータに基づいて、最適の放射波長、発光検出波長、及び各々の関係付けられた帯域を決定する。アプリケーションデータは、所期のサンプルのサポート又は分離マトリックスと共に、使用されるべき色素(dye) ／ステイン(stain) ／蛍光色素(fluorochrome)といった情報を含む。本発明の他の態様においては、ルックアップテーブルは装置内の要素の各々に依存する波長に関する情報を含む。この情報を用いて、ユーザは装置内の任意の波長変動を補償できる。
【００１３】
多くの蛍光色素（fluorescent dyes) 、ステイン、及び蛍光色素に対して励起及び発光波長の両者は周知であるが、様々な要因によりこれらの波長のスペクトルのシフトが生じる。本発明においては、ユーザは放射サブアセンブリ及び／又は発光検出サブアセンブリをチューニングすることによりこれらのスペクトルのシフトを補償できる。
【００１４】
本発明の好ましい態様による蛍光検出装置は、およそ３００ナノメータからおよそ７００ナノメータの発光をするキセノンランプを使用する。波長の大きい範囲をカバーするために、多数の光源が使用され得る。分散要素と結合したフィルターホイ−ルを用いることにより、ユーザはサンプルに入射した放射線の波長を光源の動作帯域内の任意の波長にチューニングできる。スリットを用いて励起放射線の帯域を調整する。照射されたサンプルから放出された蛍光は、フィルターホイールとSAGNAC干渉計を備えたチューニング部を通過した後にＣＣＤ検出器アレイ上に結像される。本態様においては、ユーザはシステムの動作パラメータのすべてを手動でセットできるか、又は特定の蛍光色素又はプローブに基づいてシステムがパラメータを自動的にセットできる。初期動作パラメータを選択した後に、ユーザはシステムをこの形態で動作させるか、または励起源及び発光検出システムの波長及び帯域を変化させることにより、検出した蛍光信号をピーク化することができる。システムをピーク化することは手動又は自動のいずれによっても可能てある。異なる波長で検出された蛍光信号は、好ましい形態における光学的系列の各要素の波長依存性に対して自動的に訂正される。
【００１５】
本発明の特徴及び利益は、本明細書の残りの部分及び図面を参照するとよりよく理解できる。
【００１６】
【発明の実施の形態】
図１は本発明の一実施例の機能ブロック図である。サンプル１は蛍光又は蛍光色素又はプローブにより処理された様々な物質の任意の一つでよい。サンプル１はまた、オートフルオレセンスを表すサンプルでもよい。光源２からの光はサンプル１を照射する前にチューニング部３及び集光光学系４を通過する。好ましい実施例における光源２の波長領域は、およそ２５０ナノメータ（即ち、紫外線放射）から２マイクロメータ（即ち、赤外線）までである。サンプル１からの蛍光は、イメージング（結像）光学系６及びチューニング部７を通過した後に検出器５にイメージ化される。
【００１７】
チューニング部３及び７の制御はユーザインタフェース８において開始される。例えば、ユーザはマニュアル又は自動の制御を選択できる。マニュアルモードにおいては、ユーザは装置の動作パラメータを定義する。これらのパラメータは励起波長、検出波長、励起及び検出の両者の帯域幅、及び出力データの形態を含む。自動モードにおいては、ユーザは使用される蛍光プローブを特定する。システムは、次いで、アプリケーションテーブル１０を用いてその特定のプローブのための適当なインストルメントパラメータを、コンピュータ９を介して選択する。アプリケーションテーブル１０は、各特定のプローブ又は色素のために最適の励起及び発光波長を特定するルックアップテーブルを含んでいる。他の自動モードにおいては、ユーザは、コンピュータがピーキングアルゴリズム１１を用いてシステムをピーク化することを可能にするある種のパラメータを選択する。例えば、ユーザはユーザインタフェース８に励起及び発光波長を入力する。システムは、システムの性能を最適化するために、コントローラ１２を介してこれらのパラメータ及び帯域を微細チューニングする。
【００１８】
好ましい実施例においては、検出器５からの信号はＡＤ変換器１３によりディジタル信号に変換される。モニタ１４上にサンプルのイメージが再構成される。ユーザは表示すべきイメージのタイプをユーザインタフェース８を介して特定する。例えば、ユーザは多数の異なる波長のプローブを単一のイメージに結合する復号イメージを選択できる。ユーザはまた、特定のプローブが特別の色に人工的に関係付けられている、使用されるべき人工的なカラーシステムを特定することができる。他の人工的なカラーシステムにおいては、ユーザは特定の発光強度のための特定の色を指定することができる。モニタ１４はまた、蛍光情報と結合した白色光又はサンプル１の「真の」イメージの結合を表示することができる。モニタ１４は又、サンプル１の特定の点のための分光情報を表すことができる。このモードにおいては、励起及び発光検出波長は走査されてサンプルの分光分析を可能にする。この走査モードにおいては、波長は波長の範囲の全体にわたって変化できるか、システムが特定の波長の集合にわたって走査できる。
チューニング可能励起光源
図２は本発明の一実施例による励起光源の概略図である。本実施例においては、キセノンのアークランプが光源２０として用いられる。充満ガスを変化させることにより、異なる波長帯域が可能であり、その材料はランプのエンベロープを備えている。集光器２１は光源２０の出力を集光する反射要素である。興味ある波長帯域を大まかに選択するためにフィルターホイール２２が使用され，励起光源を興味ある波長に微細にチューニングするために分散要素２３が用いられる。分散要素２３により入射光が分散された後、サンプル１を照射する前に、可変スリット２４及び集光光学系２５を通過する。サンプル１に入射する放射の帯域は可変スリット２４におけるギャップ幅により制御される。要素２２−２４はステップモータ（図示せず）により制御される。
【００１９】
単一のキセノンランプにより達成できる波長よりも広い波長を選択することが望ましい場合、多数の光源が使用できる。図３及び４は２つの異なるマルチ光源の形態を示している。図３において、波長λ₁ で動作するレーザ４１からの放射線と波長λ₂ で動作するレーザ４２からの放射線とは、光源２０からの広いスペクトル放射線に結合される。各々の光源はビームスプリッタ４３を用いて結合される。この形態では、光源２０からの光は、エネルギースループットを最大にするために、コリメート光学系４４を介して送出される。図３における光路は光ファイバ（図示せず）と置き換えることが可能である。
【００２０】
図４において、光源４１、４２及び２０からの放射線は図５に示す形態におけるように、単一のビームに結合されない。この形態においては、ユーザ（又は自動モードにおいてはシステム）が適当な波長又は波長帯域を決定する。選択された光源からの光は光ファイバ５０又は単純な光学系の操作により分散要素２３に向けられる。
【００２１】
標準的なプリズムは変角の関数として非線型であり、この結果むしろ複雑な光学装置の設計となる。分散要素２３としてプリズムを用いる場合、図５に示すペリンブローカ(Pellin-Broca) プリズムのような、一定変角の分散プリズムを用いることが好ましい。このタイプのプリズムにおいては、ある単色光線はそのプリズムを通過して最初に入射角から９０°の変角で出射する。他の全ての波長は異なる角度でそのプリズムから出射するであろう。図５におけるイメージの平面に対して垂直な軸に沿ってそのプリズムを回転させることにより、入射光線は異なる入射角を有することになり、異なる波長成分が９０°の変角でそのプリズムから出射することになろう。このタイプのプリズムは、システムが固定角度で動作でき波長はプリズムを回転させることによりチューニングできるので、明らかに装置の設計を簡単化する。
【００２２】
分散要素２３のために格子も又使用できる。図６は格子７０、折りたたみ鏡７１、入口及び出口スリット７２、及び開口部７３を備える波長分散システムの一形態を示す。波長は格子７０を回転させることによりチューニングされる。このシステムの帯域は格子の溝の間隔、開口部の直径、及び開口部と格子との間の距離の関数である。好ましい形態においては、興味ある波長領域に依存して遠隔的に選択可能であり、従って装置の動作帯域全体で充分な放射パワーを保証する多数の格子が用いられる。
【００２３】
励起光源をチューニングする他のアプローチは光学的フィルターを使用することである。図７において、フィルターホイール８０は短路エッジを有する一連のフィルターを含み、フィルターホイール８１は長路エッジを有する一連のフィルターを含む。従って、波長及び帯域はフィルターの選択により決定される。例えば、４５０ｎｍの短いパスフィルターと４７０ｎｍの長いパスフィルターを選択することにより、４６０ｎｍに中心がある２０ｎｍの帯域が選択される。波長が連続的にチューニング可能であることを保証するために、フィルターホイール８０及び８１は特別のフィルターの選択を可能にするように回転するだけではなく、軸８２のまわりを回転させられる。これにより、フィルターは光学軸８３に関して傾斜する。フィルターが軸から離れるように傾斜すると、それらの波長特性は徐々に変化する。
【００２４】
波長をチューニングする他のアプローチは可変フィルターを使用することである。環状の可変フィルターは単に、フィルムの厚さが基板上の角度位置に関してリニアに変化する干渉フィルターである。環状の可変フィルターを用いる実施例はフィルターホイール８０及び８１が環状可変フィルターで置き換えられていることを除き、図７に示される形態に外観が似ている。各フィルターホイール及び軸８２に沿った傾斜の位置に依存して、任意の波長が選択できる。
【００２５】
本発明の他の実施例においては、励起波長をチューニングするためにファブリペローエタロンのチューニング可能フィルターを用いることができる。この実施例においては、概略的には、バンドパスフィルターを用いて不要な波長の大部分を除去することが好ましい。次いで微細チューニングがファブリペローシステムを用いて行われる。このシステムの変形においては、ファブリペローエタロンの干渉フィルターの中に強誘電性液晶装置が挿入され得る。この設計では高スループットとシステムの高速微細チューニングが可能である。
【００２６】
本発明の他の実施例においては、サンプル１は一つ以上の波長帯域で同時に照射され得る。これにより、多数の蛍光プローブが同時に励起されることが可能になる。各波長帯域の完全なチューニング可能性を獲得するための好ましい形態が図８に示されている。アークランプ（光源）２０からの放射線は、ビームスプリッタ９０により、興味ある帯域の全体にわたってほぼ等しい強度の２つのパス９１及び９２に分割される。パス９１は、例えば一連のフィルターホイール９３といった波長チューニング部を通過する。パス９２は、チューニング用ミラー９５により偏向された後に同様の一連のフィルターホイール９４を通過する。ミラー９６及びビームスプリッタ９７はパス９１と９２を同軸ビームに結合する。
【００２７】
図８に示した形態に対する多数の変形が存在する。第１に、アークランプ（光源）２０を２つより多い光路に分割することが可能であり、それによりサンプルを２つより多い異なる波長帯域により照射することが可能になる。第２に、これに代わる形態では、各々がそれ自体のチューニング部を有する多数の光源を用いる。図８に示したシステムよりも複雑であるが、このアプローチは各波長帯域内のより多くのエネルギーがサンプルに入射することを可能にする。第３に、システムは上記のチューニング部の任意のもので設計できる。第４に、各チューニング部内に存在する個々の光路が単一のパスに結合される必要はない。それらは、しかしながら、サンプル１の同一部を照射しなければならない。第１に、そのシステムは多数の光源を有し各光源のためのチューニング部が波長帯域の特定部のみをカバーするようにすることにより単純化できる。例えば、システムは、２５０から４００ナノメータ、４００から７００ナノメータ、及び７００から２０００ナノソータをそれぞれカバーする３つの光源／チューニング部の組み合わせを持つことができる。さらに、単純なカットオフフィルターを用いて興味ある帯域の外の放射線を除去することによりチューニング部は単純化される。
チューニング可能な発光検出
好ましい実施例においては、本発明の発光検出部によりユーザは、蛍光の検出すべき波長と帯域の両者を選択できる。この特徴によりによりユーザは、多くの蛍光信号を区別できるとともに、バックグラウンド照射のような様々な光源から漏れてくるノイズや励起光源からの散乱放射を除去できる。
【００２８】
図９は検出システムの機能ブロック図を示す。サンプル１０１からの蛍光は集光光学系１０２及び帯域フィルターホイール１０３を通過する。帯域フィルターホイール１０３は不要な放射線の大部分を除去する。一実施例においては、帯域フィルターホイール１０３は、各々がおよそ１００ナノメータの通過帯域を有する一連のフィルターから選ばれた一つのフィルターである。帯域フィルターホイール１０３により不要な放射線の大部分が除去された後に、放射線は検出器１０５に入射する前に波長チューニング部１０４を通過する。発光検出波長をチューニングする手段として、励起光源のための波長チューニング方法の任意のものが適用可能である。上記したものと類似の技術を用いて一つより多い波長帯域における発光を同時に検出することも又可能である。
【００２９】
発光検出システムの一実施例を図１０に示す。サンプル１０１からの蛍光は集光光学系１０２により集光される。上記したように、不要な波長スペクトルの大部分の除去のために帯域フィルターホイール１０３が用いられる。システムを特定の波長にチューニングするために、ビームスプリッタ１０６とチューニング用ミラー１０７を有するSAGNAC干渉計が用いられる。干渉計の光路差を制御することにより波長の選択が行われる。チューニング可能スリット１０８は帯域を制御する。光学系１０９は選択された発光を検出器１０５上に集光する。
【００３０】
図１０に示したように、ビームスプリッタ１０６は入射光を２つの分離したビームに分割する。これらのビームは検出器１０５のアレイにおいて干渉パターンを形成する。検出器１０５のアレイの各ピクセルにおけるパターンの強度は光路の相違によって変化する。光路の相違に対する強度を測定することにより、インターフェログラムが形成される。検出器１０５のアレイの各々のピクセルにおける波長スペクトルを回復するために、各インターフェログラムのフーリエ変換が計算される。フーリエ変換はコンピュータ９を用いて計算される。
【００３１】
図１１は図１０に示した干渉計に代えて本発明により用いられることができる干渉計７００のモノリシックな形態を示す。このモノリシックな干渉計は、振動、ミスアラインメント、及び熱効果に対して、他の形態の干渉計よりも強い。この形態の干渉計はまた、非常に大きい受入れ角度を有する。
干渉計７００はビームスプリッタコーティング７０５の平面に沿って第２のガラス片７０３に接着された第１のガラス片７０１を備えている。光はパス７０５に沿って干渉計に入射する。この光線がビームスプリッタコーティング７０５に衝突すると、その光線は２つ光線に分割され、一つの光線はパス７０９に沿い、他の光線はパス７１１に沿う。干渉計ミラー（複数）７１３により反射された後、光線は距離７１７だけ分離されたパス７１５に沿ってオプティックを表す。
検出器
本発明の一実施例においては、検出器１０５は電荷結合装置（ＣＣＤ）アレイである。図１２は本実施例においてサンプル１が光源２０により照射され、この場合光源の放射線はまず光学系２５により集光されていることを示している。サンプル１からの発光は光学系１０９により検出器１０５のアレイ上に集光され焦点化される。図１２はシステムの波長のチューニング能力についてはなにも示していない。本実施例においては、サンプルと検出器１０５により検出された像との間に１対１の対応がある。こうしてサンプル１の第１の部分は第１のピクセル上に結像され、サンプルの第２の部分は第２のピクセル上に結像され、等となる。
【００３２】
図１３は検出システムの他の実施例を示す。この実施例においては、光学系１０９はサンプル１の第１の部分からの発光を単一の検出器１０５上に焦点化する。検出器１０５は、興味ある波長に対して感度があるＣＣＤ、光電子倍増管、又は他の任意の検出器でよい。焦点化用の光学系１０９又はサンプル１のいずれかを走査することにより、サンプル１の異なる部分がシリアルに検出器１０５上に焦点化される。コンピュータ９は次いで、モニタ１５上に表示できるサンプル１の像を再構成する。
【００３３】
図１４は検出システムの第３の実施例を示す。この実施例においては、光源２０からの放射線は光学系２５によってサンプル１の小部分の上に焦点化される。この部分の蛍光により放出された放射線は次いで光学系１０９により捕獲されかつ検出器１０５上に焦点化される。サンプル１はラスタ走査されて、全体の像がシリアルに捕獲され記録される。この実施例は、励起放射線と発光した蛍光の両方が焦点化されるので、弱いプローブが用いられる場合に特に有益である。
ルックアップテーブル
ルックアップテーブル１０（図１）は多くの機能を提供する。第１に、ルックアップテーブル１０はユーザに、特定の実験的形態（即ち、特定のプローブ又は色素、特定の分離マトリックス又はサンプルサポート、その他）に対する最適システム動作パラメータ（即ち、励起及び放出波長、励起及び放出帯域、その他）にかんして指示することができる。第２に、ルックアップテーブル１０はコンピュータ９との結合によりシステム内の変動を補償するために用いることができる。例えば、ユーザはサンプル内の２つの異なる蛍光物質の量を区別することを要求する場合がある。ユーザはこれら２つの異なる物質の相対的な強さに単純に依存するという誤りを犯しがちである。これは、光源から検出器までの一連の光学的要素の各々が波長依存性をある程度表しがちだからである。この変化する情報のすべてはルックアップテーブルの中にプログラム化され得る。次いで、必要であれば、システムはこれらの変化に対する最小イメージを自動的に訂正する。
ピーキング
ピーキングアルゴリズム１１（図１）はコンピュータ９と関係して動作して、システムの出力を最適化する。ピーキングは本発明の一つの特徴であり、ユーザが、蛍光スペクトルのシフトの結果得られる、ラベルの環境に関する感度を補償することを可能にする。実際には、ユーザは励起及び放出検出波長と各々の帯域に対する初期設定を選択するか、ユーザはシステムに選択された色素またはプローブ（ルックアップテーブル１０に含まれる情報に依存して）に基づいてこれらの設定を自動的に選択させる。ユーザがユーザインタフェース８を通してその信号がピークとなるべきであると選択すると、システムはピーキングアルゴリズム１１を用いて自動的にその信号をピークにする。好ましい実施例においては、ピーキングアルゴリズム１１はフィードバックループの単純な集合である。光源の波長、放出検出波長、及び光源と検出システムの両者の帯域が初期設定値のまわりを変化していく間、検出器１０５からの信号はモニタされる。このピーキングプロセスは設定された回数だけ実行されるか、又は前回の設定において測定された信号対雑音比と今回「ピークにされた」設定において測定されたものとの差が、その差がある予め定められた値より小さくなると自動的に停止するプロセスとともにモニタされる。
システム出力
好ましい実施例においては、ユーザは様々な出力形態から選択できる。第１に、サンプルの像をモニタ１４上に表示することができる。この像は、単一波長における蛍光の測定、いくつかの波長において測定された発光の結合、又は蛍光発光とサンプルの単一の「白色光」像との結合の結果であり得る。第２に、サンプルの「有色」バージョンが生成できる。このバージョンにおいては、ユーザは各放出波長に対する特定の色を指定できる。これは、２つの異なるフローブが極めて接近しており、ユーザが２つの間を容易に区別できる場合に特に有用である。第３に、サンプルの分光写真分析をモニタ１４上で又は分離したプロッタ／プリンタ上で生成し提供することができる。この分光写真分析は、サンプル全体に対して、又はサンプルの小部分に対して行うことができる。第４に、システムはユーザに、信号収集中に通常収集される任意の情報を提供できる。例えば、システムは、プローブの集合に対する自動的に選択された初期設定値を、同じプローブのためのピークにされた値とともに、ユーザに示すことができる。第５に、前回の測定結果がシステムのメモリから削除されていないと仮定して、現在の測定からの結果は前回の測定からの結果と比較されることができる。
フルオレセンス・イン・シツ・ハイブリダイゼーションに対する道具の応用
フルオレセンス・イン・シツ・ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）は中期染色体及び間期核におけるＤＮＡ系列を視覚化するための重要な技術となってきた。この方法は今や遺伝子の位置測定の研究のために研究所において日常的に使用されている。例えば、ＦＩＳＨは遺伝子を特定の染色体領域にマップしたり、クローンを染色体に沿って配列してクローンの類似物を生成又は確証するために用いられる。より最近では、ＦＩＳＨは様々な染色体異常を検出するために、医療現場に応用されて来ている。
【００３４】
ＦＩＳＨにおける最近の努力はプローブ技術の開発に集中している。現在、プローブは、テレオミア(teleomeres)、又は単一コピー遺伝子といった、様々な染色体領域に利用可能である。これらのプローブは、分子細胞遺伝学において大きな有用性を有し、一例としては、染色体を列挙する研究において、染色体の動原体(centromere)において、繰り返すDNA から得られる動原体用の特定プローブの使用である。しばしばこれらの繰り返すシーケンスは特定の染色体に特有であり、従って、一つの細胞に含まれる所与の染色体の多数のコピーを決定するために使用される。さらに、染色体ペイントと称するプローブのクラスが最近入手可能になった。このタイプのプローブは、所与の染色体の全長に対して多少とも均一に掛け合わせる（hybridize)ので、染色体の構造を決定するために非常に有用である。細胞の染色体の補体(complements) 、転座(translocations)といった構造的異常を決定し、マーカ染色体のオリジンを同定するために、ペイントが用いられる。
【００３５】
ＦＩＳＨにおいてＤＮＡプローブをラベルするために、ビオチン又はジゴキシゲニンのようなハプテンが酵素反応を用いてＤＮＡに取り込まれる間接的方法を含む、多数の方法が利用可能である。中期染色体の広がり又は間核にハイブリダイゼーションを続けることにより、蛍光ラベルが免疫学的方法の使用によってハイブリッドに取り付けられる。より最近では、蛍光色素がプローブ内に直接取り込まれて中間ステップの使用なしで検出される。標準ＦＩＳＨ色素はフルオレセン、ローダミン、テキサスレッド、及びカスケードブルーを含む。異なるプローブに異なるハプテン又は蛍光色素をラベルすることによりマルチプローブＦＩＳＨ分析が達成できる。
【００３６】
ＦＩＳＨのための有用な色素の数は比較的限定されている。所与の実験においてイメージ化できるプローブの数を増やすために、結合的な蛍光のアフローチが開発されてきた。結合的アプローチにおいては、蛍光レポータグループが単独で又は結合して用いられる。下記の表は３つの蛍光レポータＡ、Ｂ、及びＣが７個までのプローブに対して如何に使用できるかを示している。検出可能なプローブの数は４つのフルオロフォア(fluorophores)に対しては１５個まで、５個の色素では２６個まで増加できる。
【００３７】
【表１】

【００３８】
図１５はＦＩＳＨ分析に適切な本発明の実施例における光学系列の一つの態様を示す。本実施例においては、励起光は連続的にチューニング可能ではなく、励起光は選択された蛍光色素を同時に励起するために必要な離散的な波長帯域にフィルタされる。
光源２０１から発光された光はまず光学的な広帯域のフィルター２０３を通過する。フィルター２０３は不要な放射線の大きい帯域を除去するために用いられる。例えば、蛍光色素が赤外線（ＩＲ）放射によっては励起されないと仮定して、ＩＲ放射を除去するためにフィルター２０３が用いられる。この光は次いで、主に必要な励起波長を通過させるフィルター２０４を通過する。この光は次に、不要な波長を通過させている間に選択された蛍光色素を励起するのに必要な波長を反射するビームスプリッタ２０５に入射する。反射した放射線はついで光路２０７に沿って通過し、集光光学系２０９を通って、サンプル２１１に入射する。この入射光は様々なプローブ上の蛍光色素を発光させ、発光された蛍光がパス２１３に続く。また、パス２１３に続くのはサンプル２１１により散乱された光である。発光された蛍光を正確に測定するために、散乱された放射線は除去されなければならない。サンプル２１１を離れてパス２１３に続く光はビームスプリッタ２０５に入射する。ビームスプリッタ２０５の反射コーティングは、選択された蛍光色素の励起に必要な波長を反射し、他の全ての放射線を通過させるように設計されているので、ビームスプリッタ２０５は発光された蛍光を通過させている間、散乱光をパス２１３から離れるように反射することにより除去する。発光された蛍光はさらにフィルター２１５を用いてフィルタリングされる。この時点で、光はスペクトル分析に使うことができる。発光された蛍光が適切にフィルターされた後、発光された蛍光シペクトルの間をスペクトル的に区別するための、分散要素、フィルター、及び干渉系の技術を含む、前述した技術の任意のものを用いることができる。
【００３９】
前述したように、様々な出力形式が本発明とともに使用できる。ＦＩＳＨ分析のために、同定されたプローブは個々に見ることも、全ての同定プローブを同時に見ることを含めて様々な組み合わせで見ることもできる。従って、少なくとも５つの異なる色素が用いられる場合、同定された各染色体を伴うＦＩＳＨ核型をつくることができる。多くのプローブは多数の色素（即ち、単一のプローブ内の色素の組み合わせ）を含むので、提供される像を単純化するためにシュードーカラーリングを用いることができる。このスキームにおいては、各プローブは容易に区別可能な色を割り当てられている。例えば、７つのプローブを形成するために３つの色素が用いられる場合、プローブのうちの４つは色素のいくつかの組み合わせによって形成される。多数の色素を有するものを含む各プローブに個々の色素をを割り当てることにより、ユーザに提供される像は極めて単純で直接的なものとなる。像を強調し且つ強度のプロフィール（例えば、異なる測定強度に割り当てられた異なる色）を提供するために、コンピュータも又使用できる。
【００４０】
図１６及び１７は７個の異なる蛍光色素のそれぞれに対する正規化された蛍光励起及び発光スペクトルである。前述したように、サンプルからの励起光の強度のレイリー散乱の故に、好ましいアプローチは、発光波長帯域の選択された領域においては高いスループットを示しながら、励起波長を充分にブロックできるフィルターを設計することである。そのようなフィルターは、励起と発光の波長の間でスペクトルのシフトがあるので可能である。しかしながら、蛍光色素の数、従って可能なプローブの数が増大すると、そのようなフィルターを設計することの困難性もまた増大する。
【００４１】
図１８は図１５における励起フィルター２０４として使用可能な４つの異なる励起フィルターを示すグラフである。好ましくは、これら４つのフィルターは単一のサブストレートに適用して、それにより少なくとも４つの異なる色素の同時励起を可能にする。図１６−１８を比較すると、フィルター１００２により伝達される波長の帯域は、ＤＡＰＩの発光スペクトルに重大な干渉をすることなくＤＡＰＩを励起するために使用できることを示している。同様に、フィルター１００４がＦＩＴＣとともに使用できる。フィルター１００６はＣｙ３とＣｙ３＋＋の両者を励起するために使用されるが、そのフィルター１００６はＣｙ３の発光スペクトルと一致していることに着目される。従ってフィルター１００６はＣｙ３＋＋と共にのみの使用である。フィルター１００８はＣｙ５又はＣｙ５＋＋と共に使用されることができるが、Ｃｙ５＋＋と共に使用するのが最も適している。
【００４２】
図１９は図１５に示したビームスプリッタフィルター２０５及び発光フィルター２１５としての使用に適切な２つのフィルターの伝達曲線のグラフである。曲線１１０１はビームスプリッタである。この曲線を図１８に示した励起フィルターと比較すると、このフィルターは図１７に示した蛍光発光帯域を通過させるが曲線１００２、１００４、１００６、及び１００８を通過した波長帯域を反射することを示している。発光フィルター曲線１１０３は極めて狭い通過帯域を有する。従ってこのフィルターはＤＡＰＩ、ＦＩＴＣ、Ｃｙ３＋＋、及びＣｙ５＋＋を通過させる。
【００４３】
図２０は本発明の他の実施例を示す。このシステムはエピ蛍光／位相顕微鏡１２０１、励起源サブシステム１２０３、スペクトル分析システム１２０５、及び自動焦点、高速メタフェーズ発見システム１２０７を備えている。サブシステム１２０１は可視光源１２０９、光焦点化光学系１２１１、及び結像光学系１２１３を含んでいる。サンプル１２１５は、モータ駆動されるステージ１２１９に搭載されているスライド１２１７上に含まれる。サブシステム１２０３からの励起光をサンプル１２１５上に導入するために、ビームスプリッタ１２２１が用いられる。この実施例においては、光源１２２２からの光は、例えばプリズムのような分散要素１２２３を用いて分散される。光が分散された後、スリットプレート１２２４を用いてフィルタリングされる。スリットプレート１２２４上のスリットと興味ある波長との一致はサンプル１２１５を照射したときにシステムを通過する波長を決定する。プレート１２２４上のスタットの幅は帯域を決定する。ビームスプリッタ１２２１も又は、興味ある帯域のみを反射することにより励起光源の光をフィルタリングするために使用できる。励起プローブからの蛍光は干渉系１２２５と冷却ＣＣＤかめら１２２７を備えるスペクトル分析システムの中に入る。必要であれば、干渉計１２２５に入る前に、蛍光スペクトルはさらなるスペクトルフィルタリングのために追加のフィルター（図示せず）を通過させられることができる。ＣＣＤカメラ１２２７からのデータは処理のためにコンピュータ１２２９に送られる。必要であれば、興味ある領域を発見し、自動的に像を焦点化するためにサブシステム１２０９を用いることができる。サブシステム１２０９は半導体レーザ１２３１とＣＣＤカメラ１２３３を用いて焦点を決定する。レーザ１２３１からの光はフリップミラー１２３７を用いて光路１２３５に沿って送られる。反射レーザ光はビームスプリッタ１２３９を介してＣＣＤカメラ１２３３に入る。カメラ１２３３からの出力はステージ１２１９とともにコンピュータ１２２９により使用されてスライドの像を焦点化する。この同じシステムは又興味ある可能性のある領域の発見のためにも使用され得る。
本発明によれば、少なくとも一つのラベル化された染色体領域を含むサンプルを保持するステージと、ラベル化された染色体領域を励起して、第２の波長帯域内で蛍光を発光させるのに必要な第１の波長帯域内でサンプルを放射線により照射するための光源と、波長を第２の波長帯域内でスペクトル的に解像するスペクトルディスクリミネータと、解像された波長内で蛍光を検出し、検出した蛍光の強度に依存する複数の出力信号を生成する検出器と、出力信号からラベル化された染色体領域の像を構成するイメージャーとを備えた、ラベル化された染色体領域の結像装置が提供される。この場合、光源とサンプルとの間に挿入され、第１の波長帯域内の放射線のみをサンプルに照射させるフィルターと、データプロセッサとを更に備え、スペクトルディスクリミネータは干渉計であり、インターフェログラムが干渉計とデータプロセッサによるフーリエ変換とにより生成されてラベル化された染色体領域の各々のスペクトルシグネチャーを再生し、データプロセッサはラベルを同定するためにスペクトルシグネチャーを所定のスペクトルシグネチャーのライブラリと比較するようにした。
更に、本発明によれば、複数のラベル化された染色体領域の同時結像方法であって、光源によりサンプルを照射し、この場合、サンプルはラベル化された染色体領域の少なくとも２つを含み、ラベル化された染色体領域のラベルは互いに区別可能であり、照射はラベル化された染色体領域の各々のラベルを同時に励起し、励起されたラベルは各区別可能なラベルに対する波長帯域を含むある波長グループ内で蛍光を発するようにする段階と、波長グループ内の波長をスペクトル的に解像する段階と、解像された波長内の蛍光を検出器により検出し、検出器は検出された蛍光の強度に依存する複数の出力信号を生成するようにする段階と、ラベル化された染色体領域の像を出力信号から構成する段階とを備えた、複数のラベル化された染色体領域の同時結像方法が提供される。
この場合、光源をフィルタリングして、ラベルを励起するために適切な放射線のみでサンプルを照射する段階と、サンプルが光源により照射された後に、サンプルにより放出された放射線をフィルタリングして、波長グループ内の放射線のみを通過させる段階と、サ ンプルのインターフェログラムを、スペクトル的解像段階を実行する干渉計を用いて生成する段階と、インターフェログラムをフーリエ変換する段階と、サンプルに含まれる各ラベルに対してスペクトルシグネチャーを決定する段階と、各ラベルを同定するために各スペクトルシグネチャーを所定のスペクトルシグネチャーのライブラリと比較する段階とを備える。
【００４４】
当業者に理解されるように、本発明はその本質的特徴から逸脱することなく他の形態で実施することができる。例えば、フィルターホイールは励起又は発光検出チューニング部内に含ませる必要はない。したがって、本発明の好ましい実施例の開示は例示であり、本発明の範囲を限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一実施例の機能ブロック図である。
【図２】好ましい励起光源の概略図である。
【図３】マルチ光源形態の一実施例を示す図である。
【図４】マルチ光源形態の第２の実施例を示す図である。
【図５】ペリンブロカプリズムを示す図である。
【図６】格子を用いた波長分散システムを示す図である。
【図７】波長のチューニングを可能にするための二重フィルターホイールアプローチを示す図である。
【図８】サンプルを１つより大きい波長帯域で同時に照射できる励起光源の一実施例を示す図である。
【図９】検出システムの機能ブロック図である。
【図１０】検出システムの好ましい実施例を示す図である。
【図１１】モノリシックな干渉計を示す図である。
【図１２】検出システムの一実施例の機能ブロック図である。
【図１３】検出システムの他の実施例を示す図である。
【図１４】検出システムの第３の実施例を示す図である。
【図１５】ＦＩＳＨ分析に適切な本発明の実施例における光学的系列の一態様を示す図である。
【図１６】７つの異なる蛍光色素に対する正規化された蛍光励起スペクトルのグラフ図である。
【図１７】図１６に示した７つの蛍光色素に対する正規化された蛍光発光スペクトルのグラフ図である。
【図１８】４つの異なる励起フィルターを示すグラフである。
【図１９】ビームスプリッタフィルター及び発光フィルターとしての使用に適切な２つのフィルターの伝達曲線のグラフ図である。
【図２０】エピ蛍光／位相顕微鏡と、励起光源サブシステムと、スペクトル分散システムと、オートフォーカスで高速メタフェーズファインディングシステムを備えた本発明の他の実施例を示す図である。
【符号の説明】
１、１０１…サンプル
２…光源（第１波長領域励起源）
３…チューニング部（第１の波長セレクタ）
４…集光光学系（フォーカシング部）
５…検出器
６…イメージング光学系
７…チューニング部（第２の波長セレクタ）
８…ユーザインターフェース
９…コンピュータ（データプロセッサ）
１０…アプリケーションテーブル（ルックアップテーブル）
１１…ピーキングアルゴリズム
１２…コントローラ
１０３…フィルター（フィルタリング要素）

Claims (10)

1. ユーザが、色素のタイプ、蛍光色素のタイプ、ステインのタイプ、サンプルのサポート、及び分離マトリクスから選択されたアプリケーションパラメータの集合を特定できるようにするインターフェースと、
   前記アプリケーションパラメータの集合に基づいて結像システム動作パラメータの集合を指定するルックアップテーブルであって、前記動作パラメータは第１の主要波長及び該第１の主要波長に関係する第１の帯域幅を有する波長の第１の帯域と、第２の主要波長及び該第２の主要波長に関係する第２の帯域幅を有する波長の第２の帯域から選択されたものであるものと、
   第１の波長領域にわたって放射線を放出する励起源と、
   前記第１の波長領域から前記第１の主要波長を連続的にチューニング可能な方法で選択する第１の波長セレクタと、
   前記第１の主要波長の放射線をサンプル上に焦点化して、前記サンプルが第２の波長領域内の少なくとも一つの波長で蛍光を発するようにする、フォーカシングシステムと、
   前記第２の波長領域から前記第２の主要波長を連続的にチューニング可能な方法で選択する第２の波長セレクタと、
   前記第２の波長領域にわたって蛍光を検出可能で、前記蛍光の強度に依存する出力信号を生成する検出器と、
   前記出力信号に応答可能で、前記サンプルの画像を表示する表示装置とを備えた、蛍光結像システム。
2. データプロセッサをさらに備え、前記データプロセッサは、前記第１及び第２の波長セレクタを制御することにより前記第１及び第２の主要波長を変化させている間、前記出力信号をモニタするものであり、前記データプロセッサは前記出力信号に基づいて新たな第１の主要波長と新たな第２の主要波長を指定するものであり、前記データプロセッサは前記第１及び第２の波長セレクタに第１の主要波長帯域と第２の主要波長帯域を選択させるものである、請求項１記載の蛍光結像システム。
3. 前記第１及び第２の波長セレクタは、プリズム，回折格子、短路及び長路フィルター、可変フィルター、音響光学的フィルター、偏光依存型フィルター、連続的にフィルムの厚さを変化させることに基づく干渉型フィルター、ファブリーペローエタロンチューニング可能フィルター、チューニング可能液晶フィルター、共通パス干渉計、ＳＡＧＮＡＣ干渉計、及びモノリシック干渉計からなるグループから選択されたものである、請求項１記載の蛍光結像システム。
4. 前記サンプルと前記第２の波長セレクタとの間に挿入されたフィルタリング要素をさらに備え、前記フィルタリング要素は、帯域フィルター、ノッチフィルター、及び偏光依存型フィルターからなるグループから選択されたものである、請求項１記載の蛍光結像システム。
5. さらにデータプロセッサを備え、前記データプロセッサは前記出力信号のフーリエ変換を決定し、前記出力装置は前記フーリエ変換に応答するものである、請求項１記載の蛍光結像システム。
6. ダイタイプ、蛍光色素タイプ、ステインタイプ、サンプルタイプ、及び分離マトリクスからなるグループから選択されたアプリケーションパラメータの集合をルックアップテーブルに入力し、
   第１の連続波長範囲内の任意の波長である第１の主要波長、第２の連続波長範囲内の任意の波長である第２の主要波長、前記第１の主要波長に関連付けられた第１の帯域、及び前記第２の主要波長に関連付けられた第２の帯域からなるグループから選択された動作パラメータを前記ルックアップテーブルから受け取り、
   前記第１の連続波長範囲にわたって放射線を放出する励起源を活性化し、
   前記第１の主要波長を連続的にチューニング可能な方法で選択し、
   前記第１の帯域を選択し、
   前記第２の波長を連続的にチューニング可能な方法で選択し、
   前記第２の帯域を選択し、
   前記第２の主要波長における蛍光発光を含む前記第１の主要波長の放射線でサンプルを放射をし、
   前記蛍光発光を検出器アレイ上に焦点化し、
   前記蛍光発光から前記サンプルと１体１対応を有する前記サンプルの像を形成することを備える、蛍光像アナライザによる蛍光サンプルの結像方法。
7. 少なくとも一つのラベル化された染色体領域を含むサンプルを保持するステージと、
   前記ラベル化された染色体領域を励起して、連続的にチューニング可能な方法で選択された第２の波長帯域内で蛍光を発光させるのに必要な連続的にチューニング可能な方法で選択された第１の波長帯域内で前記サンプルを放射線により照射するための光源と、
   前記波長を前記第２の波長帯域内でスペクトル的に解像するスペクトルディスクリミネータと、
   前記解像された波長内で前記蛍光を検出し、前記検出した蛍光の強度に依存する複数の出力信号を生成する検出器と、
   前記出力信号から前記ラベル化された染色体領域の像を構成するイメージャーとを備えた、ラベル化された染色体領域の結像装置。
8. 前記光源と前記サンプルとの間に挿入され、前記第１の波長帯域内の放射線のみを前記サンプルに照射させるフィルターと、
   データプロセッサとを更に備え、前記スペクトルディスクリミネータは干渉計であり、インターフェログラムが前記干渉計と前記データプロセッサによるフーリエ変換とにより生成されて前記ラベル化された染色体領域の各々のスペクトルシグネチャーを再生し、前記データプロセッサは前記ラベルを同定するために前記スペクトルシグネチャーを所定のスペクトルシグネチャーのライブラリと比較するようにした請求項７記載の装置。
9. 複数のラベル化された染色体領域の同時結像方法であって、
   光源によりサンプルを照射し、この場合、前記サンプルは前記ラベル化された染色体領域の少なくとも２つを含み、前記ラベル化された染色体領域のラベルは互いに区別可能であり、前記照射は前記ラベル化された染色体領域の各々のラベルを同時に励起し、前記励起されたラベルは各区別可能なラベルに対する波長帯域を含む連続的にチューニング可能な方法で選択されたある波長グループ内で蛍光を発するようにする段階と、
   前記波長グループ内の前記波長をスペクトル的に解像する段階と、
   前記解像された波長内の前記蛍光を検出器により検出し、前記検出器は前記検出された蛍光の強度に依存する複数の出力信号を生成するようにする段階と、
   前記ラベル化された染色体領域の像を前記出力信号から構成する段階とを備えた、複数のラベル化された染色体領域の同時結像方法。
10. 前記光源をフィルタリングして、前記ラベルを励起するために適切な放射線のみで前記サンプルを照射する段階と、
    前記サンプルが前記光源により照射された後に、前記サンプルにより放出された放射線
    をフィルタリングして、前記波長グループ内の放射線のみを通過させる段階と、
    前記サンプルのインターフェログラムを、スペクトル的解像段階を実行する干渉計を用いて生成する段階と、
    前記インターフェログラムをフーリエ変換する段階と、
    前記サンプルに含まれる各ラベルに対してスペクトルシグネチャーを決定する段階と、
    各ラベルを同定するために各スペクトルシグネチャーを所定のスペクトルシグネチャーのライブラリと比較する段階とを備えた請求項９記載の方法。

Images