KR102192307B1 - 유사 중간엽 줄기세포의 제조방법 및 이로부터 제조된 유사 중간엽 줄기세포 - Google Patents

유사 중간엽 줄기세포의 제조방법 및 이로부터 제조된 유사 중간엽 줄기세포 Download PDF

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Abstract

본 발명은 세포주 확립 후 70 계대 이하 배양된 인간 전분화능 줄기세포를 분화 유도하여 낭성 배상체를 선별하고, 상기 낭성 배상체를 세포투과성 3차원 배양삽입체 상에 로딩하여 유사 중간엽 줄기세포를 분리하고, 세포투과성 3차원 배양삽입체를 투과한 세포 중 단층 형태의 세포 군집만 분리 및 균일화하여, 항염증 효능 및 면역억제능을 가지는 유사 중간엽 줄기세포를 효과적으로 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한, 상기 제조방법에 의해 제조된 유사 중간엽 줄기세포, 상기 유사 중간엽 줄기세포를 포함하는 치료제 조성물 또는 전달체, 상기 유사 중간엽 줄기세포로부터 분비되는 유효성분 또는 엑소좀을 포함하는 질병의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

Description

유사 중간엽 줄기세포의 제조방법 및 이로부터 제조된 유사 중간엽 줄기세포{Method for manufacturing Mesenchymal like stem cells and mesenchymal like stem cells manufactured thereby}
본 발명은 인간 전분화능 줄기세포로부터 유사 중간엽 줄기세포를 제조하는 방법 및 상기 제조방법에 의해 제조된 유사 중간엽 줄기세포에 관한 것이다. 상세하게는, 전분화능 세포주 확립 후 70 계대 이하 배양된 인간 전분화능 줄기세포(Human pluripotent stem cell)를 이용하여, 이를 분화 유도한 다양한 형태의 배상체 중 낭성(Cystic) 배상체를 선별하고, 세포투과성 3차원 배양삽입체(3D culture unit) 상에 낭성 배상체를 로딩하여 유사 중간엽 줄기세포를 분리하고, 상기 분리된 유사 중간엽 줄기세포 중 단층(monolayer) 형태의 세포 군집만을 분리하고 단층 형태 세포 군집의 크기를 균일화하여 유사 중간엽 줄기세포를 제조한다. 이렇게 제조된 고순도의 유사 중간엽 줄기세포는, 항염증 효능 및 면역억제능을 갖고, CD90 및 SOX2를 95% 이상 발현한다. 또한, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된 유사 중간엽 줄기세포, 상기 유사 중간엽 줄기세포를 포함하는 치료제 조성물 또는 전달체, 상기 유사 중간엽 줄기세포로부터 분비되는 유효성분 또는 엑소좀을 포함하는 질병의 예방 또는 치료용 조성물 또는 화장료 조성물에 관한 것이다.
중간엽이란 배아 발생 중에 일어나는 상피-중간엽 이행(EMT, Epithelial to Mesenchyme Transition)에 의해 형성되는 중간층에 해당하는 중배엽의 조직을 통칭한다. 인간 배아줄기세포와 유도만능줄기세포는 이러한 초기 발생을 시험관 내에서 설명할 수 있는 유일한 세포이다. 인간 배아줄기세포와 유도만능줄기세포는 전분화능(pluripotency)을 갖기 때문에 다양한 기능을 갖는 세포의 원천으로써 사용할 수 있다.
현재 성체 유래 중간엽 줄기세포뿐만 아니라 인간 전분화능 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포 혹은 중간엽 전구세포에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다. 성체에서 중간엽 줄기세포와 같이 골수에 골을 형성할 수 있는 전구세포가 존재한다는 것이 최초로 알려진 후, 골수 외에도 치밀골, 말초혈액, 지방조직, 그리고 제대혈과 양막 등 태아의 조직에서 중간엽 줄기세포가 분리가 가능한 것으로 보고되었다.
이러한 성체 유래 중간엽 줄기세포는 세포치료에 유용하게 쓰일 수 있는 다양한 특성이 있다. 따라서, 실제 임상 치료에 있어 골, 연골 및 힘줄 등의 근골격계와 심근경색 및 혈관 손상 질환 등의 심혈관계에서부터, 급성 및 만성 폐손상 등의 호흡기계, 다발성경화증, 루프스 및 류머티즘성 관절염 등의 자가 면역계, 및 루게릭병, 파킨슨병 및 척추손상 등의 신경계 치료에까지 연장되어, 다양한 분야에서 세포치료에 관한 시도가 이루어지고 있다.
그러나, 일반적인 성체 중간엽 줄기세포는 배아줄기세포와 달리 시험관 내에서 장기간 계대 배양하는 경우, 불규칙한 증식능력을 나타내어 한 세포의 분열 능력이 40회를 넘지 못하는 것으로 알려져 있다. 실제 세포치료에 적용하는 성체 중간엽 줄기세포는, 7 계대 이하로 배양된 중간엽 줄기세포만을 활용하고 있다. 또한, 확립된 세포 계통이 없어 성체로부터 반복적인 세포 준비가 요구되어 연구에 한계가 있다.
이러한 한계를 극복하기 위해 인간 전분화능 줄기세포로부터 중간엽 줄기세포(Mesenchymal Stem Cell, MSC) 또는 간엽성 전구세포(Mesenchymal Progenitor)를 분리 및 배양하는 연구가 진행되고 있다. 기존에 알려진 인간 전분화능 줄기세포로부터 중간엽 줄기세포 또는 전구세포를 얻는 방법으로는, 원하는 표지인자(Marker)를 나타내는 세포를 유세포 분석기(Fluorescent activated cell sorter, FACS)를 통해 분리하는 방법과 분화 유도를 위해 다량 및 다종의 사이토카인(Cytokines)과 화학물질(Chemicals)을 처리하는 방법 등이 일반적으로 사용되고 있다.
그러나, 유세포 분석기를 이용하는 방법은 레이저를 사용하기 때문에 세포의 생존률을 저하시키고, 분리한 후 얻어지는 세포의 수가 적어 배양 기간이 증가하는 문제가 있다. 사이토카인과 화학물질 처리하는 방법은 지속적 처리에 의한 고비용 문제와 분화 증식 후 유전적 안정성 문제가 있다. 또한, 배아줄기세포의 전분화능을 효과적으로 제어하기 어려운 문제가 있다.
한편, 중간엽 줄기세포의 분리 및 증식 방법이 매우 다양하고 조직 및 세포의 기원에 따라 중간엽 줄기세포의 특성화에 대한 접근법이 상이하므로, 세계 줄기세포치료학회(International Society for Cell Therapy, ISCT)는 인간 중간엽 줄기세포를 정의하는 세 가지 기준을 제안하고 있다. 첫째, 인간 중간엽 줄기세포는 표준 배양 조건에서 유지될 때, 유착 증식성(plastic-adherent)이 있어야 한다. 둘째, 인간 중간엽 줄기세포의 표면 항원 분석 시, CD90, CD44, CD73, CD105는 95% 이상 발현되는 반면, CD45, CD34, CD14, CD19는 2% 이하로 발현되고, 미분화 조절 마커인 Oct3/4, Tra-1-60, Tra-1-81 및 면역거부항원인 HLA-DR(Human Leukocyte Antigen - antigen D Related)은 발현되지 않아야 한다. 셋째, 인간 중간엽 줄기세포는 시험관 내에서 조골세포(Osteogenic cell), 지방세포(Adipogenic cell) 및 연골세포(Chondrogenic cell)로 분화되어야 한다.
중간엽 줄기세포를 정의하는 대표적 마커인 CD90(Cluster of Differentiation 90)은 중간엽 줄기세포의 면역 조절과 관련된 주요한 요소다. CD90이 발현된 중간엽 줄기세포는 sHLA-G 및 IL-10을 상향조절하여 식물성혈구응집소(phytohemagglutinin, PHA)에 의해 활성화된 말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)의 증식을 억제하는 것으로 알려져 있다. HLA-G(human leukocyte antigen G)는 비고전적 MHC class I 유전자로 세포막 접합체 형태(HLA-G1, -G2, -G3, -G4)와 수용성 형태(sHLA-G5, -G6, and G7)로 존재하는데, NK 및 CD81+ T 세포의 세포독성 및 CD41+ T 세포의 활성에 영향을 미치는 선천적(innate) 및 적응성(adaptative) 세포반응에 대해 면역 관용 기능(tolerogenic functions)을 나타내는 것이 보고되었다. 현재, HLA-G는 면역 관용에 있어 중요한 역할을 담당하는 분자로 이해되고 있다. 나아가, HLA-G가 사이토카인의 분비 조절을 통해 단핵세포(decidual mononuclear cells)를 Th2(T helper type 2) 사이토카인 프로파일(profile)로 변환(modulation)시키는 기능을 갖는다고 알려져 있다. Th2 사이토카인 프로파일로의 변환은 면역 기능 억제와 관련되어 있다. Th2 사이토카인 중 하나인 IL-10은 항염증 효능 및 면역억제능 등의 광범위한 생물학적 기능을 가진다. 다수의 보고에 의하면 HLA-G와 IL-10의 연관성에 대해 IL-10이 HLA-G의 발현을 유도하고, HLA-G도 IL-10의 발현을 자극한다.
SOX2(Sex determining region Y-box 2)는 인간 배아줄기세포와 유도만능줄기세포에서 잘 알려진 핵심 전사인자로, 세포의 다능성 유지에 중요한 역할을 한다. SOX2가 일부 성체 줄기세포에서 발현되고, Wnt 신호전달(Wnt signaling) 가용성 억제제인 DKK1 과 cMyc의 조절을 통해 세포의 분화능과 증식에 중요한 영향을 미치는 것이 알려지면서, 인간 전분화능 줄기세포에서 발현하는 SOX2의 기능과 중간엽 줄기세포에서 발현하는 SOX2가 각기 다른 역할로 기능하고 있는 것으로 분리되어 간주된다.
현재, 줄기세포 치료제에 대한 생물학적 또는 임상적 관심은 주로 면역 억제 및 관용 등 세포의 특성에 기인하여 지속적으로 증가하고 있다. 본 발명의 인간 전분화능 줄기세포 유래 유사 중간엽 줄기세포는 CD90과 SOX2 각각을 동시에 95% 이상 발현하는 중간엽 줄기세포로서, 현재까지 보고된 바 없다. 이것은 해당 연구영역의 관심을 충족시키는 것뿐만 아니라 임상영역 관점에서도 충분한 의미가 부여될 수 있다.
세포 생존률을 높여 고순도 유사 중간엽 줄기세포를 생산, 인간 전분화능 줄기세포를 효과적으로 제어하고, 제조된 유사 중간엽 줄기세포의 유전적 안정성을 유지할 수 있는 중간엽 줄기세포의 제조방법의 개발이 요구된다.
본 발명은 세계 줄기세포치료학회에서 정하는 인간 중간엽 줄기세포로서의 최소한의 기준을 충족하는 유사 중간엽 줄기세포를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 (a) 세포주 확립 후 70 계대 이하 배양된 인간 전분화능 줄기세포를 준비하는 단계; (b) 상기 인간 전분화능 줄기세포를 분화 유도한 배상체 중 낭성 배상체를 선별하는 단계; (c) 상기 낭성 배상체를 세포투과성 3차원 배양삽입체 상에 로딩하여 유사 중간엽 줄기세포를 분리하는 단계; (d) 상기 세포투과성 3차원 배양삽입체를 투과한 세포 중 단층(monolayer) 형태의 세포 군집만을 분리하는 단계; 및 (e) 상기 단층 형태의 세포 군집을 가로와 세로 각각 100μm ~ 500μm 의 크기로 균일화하여 유사 중간엽 줄기세포를 배양하는 단계; 를 포함하고, 상기 유사 중간엽 줄기세포는, 항염증 효능과 면역억제능을 가지고, CD90 및 SOX2를 95% 이상 발현하는, 유사 중간엽 줄기세포의 제조방법 및 상기 제조방법에 의해 제조된 인간 전분화능 줄기세포 유래 유사 중간엽 줄기세포에 관한 것이다.
그러나, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않는다. 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 해당 기술 분야 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명의 유사 중간엽 줄기세포 제조방법에 의하면, 유사 중간엽 줄기세포를 고효율, 고순도로 분리, 배양 및 증식시킬 수 있다. 한편, 본 발명에 의한 유사 중간엽 줄기세포 제조방법에 의하는 경우, 인간 전분화능 줄기세포로부터 항염증 효능과 면역억제능을 가지고, CD90 및 SOX2를 95% 이상 고발현하는 신규한 인간 전분화능 줄기세포 유래 유사 중간엽 줄기세포를 제조할 수 있다.
본 발명의 제조방법에 의하여 제조된 유사 중간엽 줄기세포는 항염증 효능과 면역억제능을 나타낼 수 있다.
본 발명의 제조방법에 의하여 제조된 유사 중간엽 줄기세포는 특정 마커 발현 양상에 따른 항염증 효능과 면역억제능을 나타낼 수 있다.
본 발명의 제조방법에 의하여 제조된 유사 중간엽 줄기세포는 CD90 및 SOX2를 95% 이상 발현하고, 인간 중간엽 줄기세포로서의 최소한의 기준과 추가적인 특징을 동시에 나타낼 수 있다.
본 발명의 제조방법에 의하여 제조된 유사 중간엽 줄기세포는 이를 포함하는 치료제 조성물 또는 전달체로 적용될 수 있다.
본 발명의 제조방법에 의하여 제조된 유사 중간엽 줄기세포로부터 분비되는 유효성분 또는 엑소좀은 이를 포함하는 질병의 예방 또는 치료용 조성물 또는 화장료 조성물로 적용될 수 있다.
그러나, 본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 인간 전분화능 줄기세포(Human pluripotent stem cell) 유래 유사 중간엽 줄기세포의 제조방법이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 인간 전분화능 줄기세포 유래 유사 중간엽 줄기세포 제조시에, 인간 전분화능 줄기세포로부터 분화 유도한 다양한 형태의 배상체로부터 선별되는 낭성(Cystic) 배상체 형태를 나타낸다. 흰색 화살표로 표시된 배상체는 낭성 배상체이다. 도 2에 도시된 낭성 배상체에 있어서, 낭성(Cystic) 배상체는 다양한 형태의 배상체 중에서, 투명하고 밝은 부분이 배상체 내에 포함되어 관찰되는 배상체를 의미한다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 인간 전분화능 줄기세포 유래 유사 중간엽 줄기세포의 분리에 사용되는 세포투과성 3차원 배양삽입체(3D culture unit)이다. 상기 세포투과성 3차원 배양삽입체 상에 낭성 배상체를 로딩하여 유사 중간엽 줄기세포를 분리할 수 있다. 상기 세포투과성 3차원 배양삽입체를 이용함으로써, 선별된 낭성 배상체로부터 유사 중간엽 줄기세포를 고순도로 분리할 수 있다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 세포투과성 3차원 배양삽입체를 투과하여 초기 분리된 유사 중간엽 줄기세포의 군집의 이미지를 나타낸다. 또한, 그래프는 각 군집의 초기 분리 후, 디쉬에 부착하여(P0) 세포 표면 항원 발현을 비교 측정한 것이다. 세포투과성 3차원 배양 삽입체를 투과하여 초기 분리된 유사 중간엽 줄기세포의 군집은 다층(multilayer) 형태 또는 단층(monolayer) 형태 중 어느 하나 이상의 형태를 포함할 수 있다. 다만, 본 발명의 일 실시예에서는 단층 형태의 세포 군집만을 분리하여 배양한다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 유사 중간엽 줄기세포의 형태를 촬영한 이미지이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 유사 중간엽 줄기세포의 다양한 표면 항원 발현을 측정한 그래프이다. 본 발명에 따른 유사 중간엽 줄기세포는 CD90을 98.2%, CD44를 98.8%, CD73을 96.77% 및 CD105를 95.6%으로 고발현하고, CD45를 0.15%, CD34를 1.46%, CD14를 0.17% 및 CD19를 0.09% 저발현하고, Oct3/4를 0.2%, Tra-1-60를 0.08%, Tra-1-81를 0.03%로 저발현하고, HLA-DR를 0.08%으로 거의 발현하지 않으므로, 세계 줄기세포치료학회에서 정하는 인간 중간엽 줄기세포로서의 최소한의 기준을 충족하는 신규한 중간엽 줄기세포이다. 본 발명에 따른 유사 중간엽 줄기세포는 CD90을 고발현함과 동시에 SOX2을 99.37% 로 발현한다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 유사 중간엽 줄기세포의 지방세포(Adipogenic cell), 조골세포(Osteogenic cell), 연골세포(Chondrogenic cell) 및 근육세포(Myogenic cell) 로의 분화(differentiation) 특성을, 오일레드오(Oil Red O) 염색법, 알리자린 레드 에스(Alizarin red S) 염색법, 알시안블루(Alcian blue) 염색법 및 면역세포화학(immunocytochemistry) 염색법으로 염색하여 나타낸 이미지이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 유사 중간엽 줄기세포의 증식능(cumulative PDL(cPDL)) 및 세포크기(Cell size)를 골수 유래 중간엽 줄기세포(bone marrow mesenchymal stem cells, BM-MSC)의 증식능 및 세포크기와 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 유사 중간엽 줄기세포가 고순도로 분리된 것을 나타낸 그래프이다. 미분화 조절 마커로서 Oct4가 99% 이상 제거된 유사 중간엽 줄기세포(MMSC)를 확인할 수 있다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 유사 중간엽 줄기세포의 유전적 안정성을 GTG-banding과 SNP(single nucleotide polymorphisms) 분석을 통해 확인한 것을 나타낸다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 유사 중간엽 줄기세포의 조직 재생능을 세포의 이동정도에 따라 확인한 그래프와 이미지이다. 골수 유래 중간엽 줄기세포(BM-MSC)의 조직 재생능과 비교하여 확인한 그래프와 이미지이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 유사 중간엽 줄기세포의 인간제대정맥혈관내피세포(Human umbilical vein endothelial cell, HUVEC)와의 공배양에 따른 물질교환능을 나타낸다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 유사 중간엽 줄기세포의 직접적인 혈관형성능을 나타낸다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 유사 중간엽 줄기세포와 골수 유래 중간엽 줄기세포(BM-MSC)의 면역억제능 및 항염증 효능을 비교한 그래프이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른 유사 중간엽 줄기세포와 골수 유래 중간엽 줄기세포(BM-MSC)의 세포생존, 조직재생 및 세포사멸억제 기능성물질 분비능을 비교한 그래프이다.
도 16은 골수 유래 중간엽 줄기세포(BM-MSC)에 비하여 고발현하는, 본 발명의 일 실시예에 따른 유사 중간엽 줄기세포의 염증조절 관련 유전자를 나타낸다.
도 17은 골수 유래 중간엽 줄기세포(BM-MSC)에 비하여 고발현하는, 본 발명의 일 실시예에 따른 유사 중간엽 줄기세포의 면역억제능 관련 유전자를 나타낸다.
도 18은 본 발명의 일 실시예에 따른 유사 중간엽 줄기세포의 세포 용해물(cell lysate) 단백체를 분석하여, 골수 유래 중간엽 줄기세포(BM-MSC)에 비하여 고발현하는 단백체를 나타낸다.
도 19는 본 발명의 일 실시예에 따른 유사 중간엽 줄기세포의 세포 용해물(cell lysate) 단백체를 분석하여, 골수 유래 중간엽 줄기세포(BM-MSC)에 비하여 저발현하는 단백체를 나타낸다.
도 20은 본 발명의 일 실시예에 따른 유사 중간엽 줄기세포의 배양 상층액(culture supernatant) 단백체를 분석하여, 골수 유래 중간엽 줄기세포(BM-MSC)에 비하여 고발현하는 단백체를 나타낸다.
도 21은 본 발명의 일 실시예에 따른 유사 중간엽 줄기세포의 배양 상층액(culture supernatant) 단백체를 분석하여, 골수 유래 중간엽 줄기세포(BM-MSC)에 비하여 저발현하는 단백체를 나타낸다.
도 22는 배아줄기세포(hESC)의 계대 배양 횟수가 70회를 초과(P68+7 또는 P68+15)하는 경우, 유사 중간엽 줄기세포의 표면 항원의 발현 감소를 나타낸다. 특히, 배아줄기세포의 계대 배양 횟수가 70회를 초과할수록, 유사 중간엽 줄기세포의 표면 항원인 CD90의 발현이 현저히 감소한다.
도 23은 배아줄기세포(hESC)의 계대 배양 횟수(a(P68), b(P68+7), c(P68+15))에 따라 분리된 유사 중간엽 줄기세포로부터 분화 유도한 지방세포 및 조골세포의 유전자 발현의 PCR 전기영동 결과를 나타낸다.
이하에서, 첨부된 도면을 참조하여 실시예들을 상세하게 설명한다. 그러나, 실시예들에는 다양한 변경이 가해질 수 있어서 특허출원의 권리 범위가 이러한 실시예들에 의해 제한되거나 한정되는 것은 아니다. 실시예들에 대한 모든 변경, 균등물 내지 대체물이 권리 범위에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.
실시예에서 사용한 용어는 단지 설명을 목적으로 사용된 것으로, 권리 범위를 한정하려는 의도로 해석되어서는 안된다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
또한, 첨부 도면을 참조하여 설명함에 있어, 도면 부호에 관계없이 동일한 구성 요소는 동일한 참조부호를 부여하고 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다. 실시예를 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 실시예의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
또한, 실시예의 구성 요소를 설명하는 데 있어서, 제1, 제2, A, B, (a), (b) 등의 용어를 사용할 수 있다. 이러한 용어는 그 구성 요소를 다른 구성 요소와 구별하기 위한 것일 뿐, 그 용어에 의해 해당 구성 요소의 본질이나 차례 또는 순서 등이 한정되지 않는다.
어느 하나의 실시예에 포함된 구성요소와, 공통적인 기능을 포함하는 구성요소는, 다른 실시 예에서 동일한 명칭을 사용하여 설명하기로 한다. 반대되는 기재가 없는 이상, 어느 하나의 실시 예에 기재한 설명은 다른 실시 예에도 적용될 수 있으며, 중복되는 범위에서 구체적인 설명은 생략하기로 한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면,
유사 중간엽 줄기세포의 제조방법으로,
(a) 세포주 확립 후 70 계대 이하 배양된 인간 전분화능 줄기세포를 준비하는 단계;
(b) 상기 인간 전분화능 줄기세포를 분화 유도한 배상체 중 낭성 배상체를 선별하는 단계;
(c) 상기 낭성 배상체를 세포투과성 3차원 배양삽입체 상에 로딩하여 유사 중간엽 줄기세포를 분리하는 단계;
(d) 상기 세포투과성 3차원 배양삽입체를 투과한 세포 중 단층(monolayer) 형태의 세포 군집만을 분리하는 단계; 및
(e) 상기 단층 형태의 세포 군집을 가로와 세로 각각 100μm ~ 500μm 의 크기로 균일화하여 유사 중간엽 줄기세포를 배양하는 단계;
를 포함하고,
상기 유사 중간엽 줄기세포는, 항염증 효능과 면역억제능을 가지고, CD90 및 SOX2를 95% 이상 발현하는, 유사 중간엽 줄기세포의 제조방법이 제공된다.
일 측에 따르면, 상기 세포투과성 3차원 배양삽입체는, 나일론, 섬유, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 그래핀, 티타늄, 구리, 니켈, 은, 금 및 백금으로 이루어지는 군 중 어느 하나 이상으로 이루어질 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따르면,
유사 중간엽 줄기세포의 제조방법에 의해 제조된 인간 전분화능 줄기세포 유래 유사 중간엽 줄기세포에 있어서,
상기 유사 중간엽 줄기세포는, 골수 유래 중간엽 줄기세포에 비해 MMP-1 단백질 및 HGF 단백질을 고발현하고, 골수 유래 중간엽 줄기세포에 비해 CD95를 저발현하고, CD90 및 SOX2를 95% 이상 발현하는 것을 특징으로 하는, 유사 중간엽 줄기세포가 제공된다.
일 측에 따르면, 상기 유사 중간엽 줄기세포는, 골수 유래 중간엽 줄기세포에 비해 상기 MMP-1 단백질을 15배 이상 고발현하고, HGF 단백질을 2배 이상 고발현하는, 유사 중간엽 줄기세포가 제공된다.
일 측에 따르면, 상기 유사 중간엽 줄기세포는, 골수 유래 중간엽 줄기세포에 비해 CD95를 15배 이상 저발현하는, 유사 중간엽 줄기세포가 제공된다.
일 측에 따르면, 상기 유사 중간엽 줄기세포는, 골수 유래 중간엽 줄기세포에 비해 염증조절 유전자를 2배 내지 100 배 이상 고발현하고,
상기 염증조절 유전자는, Gata3, Adora2a, Gps2, Psma1, Pbk, Lrfn5, Cdh5, Apoe, Foxf1, Tek, Cx3cl1, Ptger4, Acp5, Bcr, Socs5 및 Mdk으로 이루어지는 군 중 어느 하나 이상인, 유사 중간엽 줄기세포가 제공된다.
일 측에 따르면, 상기 유사 중간엽 줄기세포는, Gata3, Adora2a 및 Gps2 유전자를 동시에 발현하는, 유사 중간엽 줄기세포가 제공된다.
일 측에 따르면, 상기 유사 중간엽 줄기세포는, 골수 유래 중간엽 줄기세포에 비해 면역억제능 유전자를 2배 내지 100배 이상 고발현하고, 상기 면역억제능 유전자는 Gata3, Gps2, Psma1, Apoe, Foxf1, Tek, Cx3cl1, Ptger4, Bcr, Socs5 및 Mdk으로 이루어지는 군 중 어느 하나 이상인, 유사 중간엽 줄기세포가 제공된다.
일 측에 따르면, 상기 유사 중간엽 줄기세포는, Gata3, Gps2 및 Psma1 유전자를 동시에 발현하는, 유사 중간엽 줄기세포가 제공된다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따르면,
유사 중간엽 줄기세포의 제조방법에 의해 제조된 인간 전분화능 줄기세포 유래 유사 중간엽 줄기세포를 포함하는 치료제 조성물로서,
상기 치료제 조성물은, 세포치료제 조성물, 세포유전자치료제 조성물, 조직공학치료제 조성물, 항염증치료제 조성물, 면역치료제 조성물, 암의 예방 또는 치료용 조성물 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 치료제 조성물이 제공된다.
일 측에 따르면, 상기 치료제 조성물은, 상기 유사 중간엽 줄기세포로부터 분비되는 유효성분 또는 엑소좀을 더 포함하는, 치료제 조성물이 제공된다.
일 측에 따르면, 상기 치료제 조성물은, 다발성경화증, 전신경화증, 급성 심근경색, 만성 심근경색, 만성 폐질환, 급성 폐질환, 크론병, 변실금, 이식편대숙주질환, 하지허혈질환, 버거씨병, 족부궤양, 루프스, 루마티즘성 관절염, 급성 및 만성 신우염, 염증성 방광염, 간질성 방광염, 저활동성방광, 과민성방광, 오십견, 회전근개손상 및 파열, 다양한 운동 등으로 인해 발생되는 근골격계 손상, 무릎연골손상, 이명증, 아토피성 피부염, 건선, 화상으로 인한 피부손상, 자외선 등으로 인한 피부손상, 망막병증을 포함하는 염증성 및 면역계 질환의 예방, 허혈성치매, 알츠하이머치매, 척수손상, 파킨슨씨병 및 중추신경계질환으로 이루어지는 군 중 어느 하나 이상의 질병의 예방 또는 치료를 위한 것인, 치료제 조성물이 제공된다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따르면,
유사 중간엽 줄기세포의 제조방법에 의해 제조된 인간 전분화능 줄기세포 유래 유사 중간엽 줄기세포를 포함하는 전달체로서,
상기 전달체는, 약학적 조성물을 담지하는 것을 특징으로 하는, 전달체가 제공된다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따르면,
유사 중간엽 줄기세포의 제조방법에 의해 제조된 인간 전분화능 줄기세포 유래 유사 중간엽 줄기세포로부터 분비되는 유효성분 또는 엑소좀을 포함하는, 질병의 예방 또는 치료용 조성물이 제공된다.
일 측에 있어서, 상기 질병은 다발성경화증, 전신경화증, 급성 심근경색, 만성 심근경색, 만성 폐질환, 급성 폐질환, 크론병, 변실금, 이식편대숙주질환, 하지허혈질환, 버거씨병, 족부궤양, 루프스, 루마티즘성 관절염, 급성 및 만성 신우염, 염증성 방광염, 간질성 방광염, 저활동성방광, 과민성방광, 오십견, 회전근개손상 및 파열, 다양한 운동 등으로 인해 발생되는 근골격계 손상, 무릎연골손상, 이명증, 아토피성 피부염, 건선, 화상으로 인한 피부손상, 자외선 등으로 인한 피부손상, 망막병증을 포함하는 염증성 및 면역계 질환의 예방, 허혈성치매, 알츠하이머치매, 척수손상, 파킨슨씨병 및 중추신경계질환으로 이루어지는 군 중 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따르면,
유사 중간엽 줄기세포의 제조방법에 의해 제조된 인간 전분화능 줄기세포 유래 유사 중간엽 줄기세포부터 분비되는 유효성분 또는 엑소좀을 포함하는, 화장료 조성물이 제공된다.
항염증 효능 및 면역억제능이 강화된 유사 중간엽 줄기세포의 제조
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른, (a) 세포주 확립 후 70 계대 이하 배양된 인간 전분화능 줄기세포를 준비하는 단계, (b) 상기 인간 전분화능 줄기세포를 분화 유도한 배상체 중 낭성 배상체를 선별하는 단계, (c) 상기 낭성 배상체를 세포투과성 3차원 배양삽입체 상에 로딩하여 유사 중간엽 줄기세포를 분리하는 단계, (d) 상기 세포투과성 3차원 배양삽입체를 투과한 세포 중 단층(monolayer) 형태의 세포 군집만을 분리하는 단계, (e) 상기 단층 형태의 세포 군집을 가로와 세로 각각 100μm ~ 500μm 의 크기로 균일화하여 유사 중간엽 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하고, 상기 유사 중간엽 줄기세포는, 항염증 효능과 면역억제능을 가지고, CD90 및 SOX2를 95% 이상 발현하는, 인간 전분화능 줄기세포 유래 유사 중간엽 줄기세포의 제조방법을 나타낸다.
도 1의 첫번째 이미지는 인간 전분화능 줄기세포(Human pluripotent stem cell)를 배양(culture)하고 유지(maintenance)하는 단계를 나타낸다. 상기 인간 전분화능 줄기세포는 세포주 확립 후 70 계대 이하 배양된 것이다. 도 1의 두번째 이미지는 배상체(embryoid body, EB) 형성 후, 낭성(cystic) 배상체를 선별하는 단계 및 선별된 낭성 배상체를 세포투과성 3차원 배양삽입체(3D culture unit)을 이용하여 분화시키는 단계를 나타낸다. 선별된 낭성 배상체는 세포투과성 3차원 배양삽입체 위에 로딩하여 세포투과성 3차원 배양삽입체를 통과하도록 한다. 도 1의 세번째 이미지는 낭성 배상체가 세포투과성 3차원 배양삽입체를 투과하여, 세포투과성 3차원 배양삽입체의 하측면으로 이동하는 것을 나타낸다. 도 1의 네번째 이미지는 세포투과성 3차원 배양삽입체를 투과한 세포를 수집하는 단계와 군집의 크기를 균일화하는 단계를 나타낸다. 수집한 세포 군집에서 다층(Multilayer) 형태의 군집(cluster)은 기계적(mechanically)으로 제거하고, 단층(Monolayer) 형태의 군집만을 마이크로 파이펫 팁(pipette tip)을 이용하여 균일한 크기로 잘라 선택적으로 배양한다. 도 1의 다섯번째 이미지는 CD90+ 및 SOX2+를 발현하는 유사 중간엽 줄기세포의 확립을 나타낸다.
본 명세서에서 사용하는 “인간 전분화능 줄기세포”는 미분화 상태의 세포로 인체를 이루는 모든 세포로 분화 가능한 줄기세포를 의미한다. 상기 인간 전분화능 줄기세포는, 인간 배아줄기세포(human Embryonic Stem Cell, hESC), 인간 체세포 핵치환 전분화능 줄기세포(human pluripotent stem cells via somatic cell nuclear transfer, SCNT-hPSC) 및 유도만능줄기세포(induced Pluripotent Stem Cell, iPSC) 중 어느 하나 이상일 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 "유사 중간엽 줄기세포"라는 용어는, 뼈, 연골, 지방, 근육세포를 포함하는 다양한 세포로 분화할 수 있는 다능성 중간엽 줄기세포(multipotent mesenchymal stem cell, MMSC)를 의미한다. 다시 말하면, “유사 중간엽 줄기세포”란, 수정란이 분열하여 생긴 중배엽에서 분화된 골수의 기질, 연골, 골조직, 지방조직 등에 존재하는 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell, MSC)와 유사한 기능을 갖는 세포를 의미한다. 즉, 본 발명의 유사 중간엽 줄기세포는 CD90및 SOX2등을 고발현함으로써 면역억제능, 항염증 효능 또는 다능성 유지력 등이 향상된 신규한 중간엽 줄기세포를 의미한다. 따라서, 본 명세서에서는 유사 중간엽 줄기세포와 중간엽 줄기세포라는 표현을 구분하여 사용한다.
본 명세서에서 n계대 또는 계대 n(passage n 또는 P n)은 모세포주를 n회 계대 배양한 것을 의미한다. 예컨대, 70 계대 또는 P 70은 모세포주를 70회 계대 배양한 세포주를 의미한다. 상기 n은 정수이다.
본 발명의 유사 중간엽 줄기세포의 제조에 사용되는 인간 전분화능 줄기세포는, 전분화능 세포주 확립 후 70 회 이하 계대 배양된 것을 사용하는 것을 특징으로 한다. 통상적으로, 전분화능 줄기세포를 이용하는 중간엽 줄기세포 제조에 있어서, 전분화능 줄기세포는 계대 제한 없이 그대로 이용한다. 전분화능 줄기세포를 계대 제한 없이 그대로 이용하는 경우, 제조된 중간엽 줄기세포의 표면 항원의 대부분은 일정하지 않은 비율로 저발현되었으며, 분화 효율이 매우 낮게 나타난다. 나아가, 제조된 중간엽 줄기세포가 CD90 또는 SOX2 95% 이상을 발현할 수 없다. 그러나, 본 발명과 같이 70 계대 이하의 인간 전분화능 줄기세포를 이용한 경우, 제조된 유사 중간엽 줄기세포의 표면 항원은 모두 일정한 비율로 95% 이상 고발현하였다. 특히, CD90 및 SOX2를 각각 95% 이상 발현하는, 유사 중간엽 줄기세포를 제조할 수 있다. 도 22에 의하면, 전분화능 줄기세포(예: 배아줄기세포(hESC))의 계대 배양 횟수가 70회를 초과(P68+7 또는 P68+15)하는 경우, 유사 중간엽 줄기세포의 표면 항원 중 CD90의 발현양이 급격하게 감소한다. 즉, 68 계대를 기준으로 하여, 계대 배양 횟수가 증가할수록 CD90의 발현이 25% 이하로 감소하고, CD44, CD73 및 CD105은 90% 이하로 발현한다. 또한, 전분화능 줄기세포의 계대 배양 횟수가 70회를 초과(P68+7 또는 P68+15)하는 경우, 유사 중간엽 줄기세포의 CD44, CD73 및 CD105의 발현이 불규칙하다. 반면, 70회 이하로 계대 배양된 전분화능 줄기세포로부터 제조된 유사 중간엽 줄기세포는, CD90을 98.2%, 9 CD44를 98.8%, CD73을 96.77% 및 CD105를 95.6%으로 고발현(도 6 참조)한다. 도 23에 의하면, a, b, c는 각각 P68, P68+7, P68+15으로 전분화능 줄기세포(예: 배아줄기세포(hESC))로부터 분리한 중간엽 줄기세포에서 분화 유도한 지방세포 및 조골세포의 유전자 발현의 PCR 전기영동 결과이다. 도 23에 도시된 바와 같이, 계대 배양 횟수가 70회 이하인 a(P68)에서, 지방세포(Adipogenic) 및 조골세포(Osteogenic)로 분화능이 우수하다. 반면, 계대 배양 횟수가 70회를 초과하는 b(P68+7), c(P68+15)에서는 지방세포 및 연골세포로 분화 효율이 낮아진다. 즉, 70 계대 이하의 전분화능 줄기세포를 사용함으로써 제조된 유사 중간엽 줄기세포는 증식능, 분화능, 유전적 안정성, 조직재생능, 물질교환능, 혈관형성능, 면역억제능 및 항염증 효능 등을 골수 유래 중간엽 줄기세포에 비하여 우수하게 유지할 수 있다. 또한, 70 계대 이하의 전분화능 줄기세포를 사용함으로써 제조된 유사 중간엽 줄기세포는 세포생존, 조직재생 및 세포사멸억제 기능성물질 분비능 등을 골수 유래 중간엽 줄기세포에 비하여 우수하게 유지할 수 있다.
더욱 바람직하게, 70 계대 이하의 전분화능 줄기세포를 사용하고, 세포 투과성 3차원 배양삽입체를 투과한 분화된 세포 군집 중에서 다층(Multilayer) 형태 군집은 제거하고 단층(Monolayer) 형태 군집만을 선별하여 일정한 크기로 기계적(mechanically)으로 균일화하여 배양함으로써 중간엽 줄기세포의 표면 항원을 95% 이상 발현한다. 특히, 중간엽 줄기세포의 표면 항원 중에서 CD90 및 SOX2를 각각 95% 이상 발현하는, 유사 중간엽 줄기세포를 제조할 수 있다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 인간 전분화능 줄기세포 유래 유사 중간엽 줄기세포 제조 시 사용되는 낭성(Cystic) 배상체의 형태를 나타낸다. 본 명세서에서 "낭성(Cystic) 배상체"는 다양한 배상체의 형태 중에서, 투명하고 밝은 부분이 배상체 내 포함되어 관찰되는 배상체 형태를 의미한다. 이러한 특징을 바탕으로 육안으로 낭성 배상체를 분리할 수 있다.
도 3은 인간 전분화능 줄기세포를 분화 유도한 배상체 중 선별된 낭성 배상체를 로딩하여 유사 중간엽 줄기세포를 분리하는데 이용되는 세포투과성 3차원 배양삽입체를 나타낸다.
본 명세서에서 사용된 용어 "세포투과성 3차원 배양삽입체"는 세포투과성 기구다. 즉, 배아줄기세포, 인간 전분화능 줄기세포 또는 체세포 핵치환 줄기세포 유래의 배상체로부터 유사 중간엽 줄기세포로 분화 배양을 유도하는 경우, 배아 발생 과정에서 일어나는 상피-중간엽 이행(Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT)이 자연스럽게 일어나도록 하는 기구를 의미한다. 즉, 세포투과성 3차원 배양삽입체를 이용하여 유사 중간엽 줄기세포를 고순도, 고효율로 분리하여 배양, 증식시킬 수 있다.
상기 세포투과성 3차원 배양삽입체는 세포배양용 배양 플레이트, 3차원 세포배양용 인서트(insert) 또는 나일론 또는 섬유성 재질의 메쉬(mesh) 등과 같은 세포투과성이 보장되는 인공 삽입체이다. 상기 세포투과성 3차원 배양삽입체는 바이오프린팅 기술로 제조될 수 있다. 상기 세포투과성 3차원 배양삽입체는 나일론, 섬유, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 그래핀, 티타늄, 구리, 니켈, 은, 금 및 백금으로 이루어진 군 중 어느 하나 이상으로 이루어 질 수 있다. 다만, 상기 세포투과성 3차원 배양삽입체는, 세포투과성이 보장되는 것이라면, 상기 재료에 한정되지 않는다.
또한, 상기 세포투과성 3차원 배양삽입체를 이용한 인간 전분화능 줄기세포 유래 배상체의 배양용 배지는 EGM2-MV, MCDB, DMEM, MEM-α, STEMPRO-MSC, MesenCult-MSC 배지를 사용할 수 있다. 바람직하게, 배양용 배지는 EGM2-MV, MCDB, DMEM 또는 MEM-α 배지를 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 세포투과성 3차원 배양삽입체를 이용한 인간 전분화능 줄기세포 유래 배상체 배양용 배지에는, 소태아혈청(Fetal bovine serum, FBS), 혈청대체물(Serum replacement, SR), 인간 혈청(Human Serum)및 인간 혈소판 용해물(Human platelet lysate, HPL)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 첨가물을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 첨가물은 1~20%의 FBS, 1~20%의 SR, 1~20%의 Human Serum 또는 1~20%의 HPL일 수 있다. 바람직하게, 상기 첨가물은 5% FBS 또는 2.5~5% HPL일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
도 4는 인간 전분화능 줄기세포 유래 유사 중간엽 줄기세포를 분리하는 단계에서 세포투과성 3차원 배양삽입체를 투과하여 세포투과성 3차원 배양삽입체 아래로부터 수집된 세포 군집별 특성을 나타낸 이미지 및 그래프이다. 도 4 도시된 바와 같이, 세포투과성 3차원 배양삽입체 아래로부터 수집된 세포 군집은 다층(Multilayer) 형태의 군집, 단층(Monolayer) 형태의 군집일 수 있다. 다층 및 단층 형태 군집을 함께 배양하거나 다층 형태 군집, 단층 형태 군집을 각각 배양한 결과, 단층 형태 군집만을 분리하여 배양한 세포에서, 중간엽 줄기세포를 나타내는 주요 표면 항원인 CD90, CD73, CD105의 발현이 일관성 있게 고발현되는 것을 확인할 수 있다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 유사 중간엽 줄기세포의 형태를 촬영한 이미지이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 유사 중간엽 줄기세포의 표면 항원 발현을 측정한 그래프이다. 도 6을 참고하면, 유사 중간엽 줄기세포의 표면 항원 CD90, CD44, CD73, CD105, SOX2가 95% 이상 발현된다. 반면, 유사 중간엽 줄기세포의 표면 항원 CD45, CD34, CD14, CD19는 2% 이하로 발현된다. 또한, 미분화 조절 마커인 Oct3/4, Tra-1-60, Tra-1-81 과 면역거부항원인 HLA-DR은 발현되지 않는다. 따라서, 본 발명의 유사 중간엽 줄기세포는 면역 조절 관련 마커인 CD90과 세포 다능성 유지 관련 마커인 SOX2를 각각 95% 이상 고발현하는 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포이다. 본 발명의 유사 중간엽 줄기세포는, 면역억제능 및 다능성 유지력 등이 향상된 신규한 중간엽 줄기세포임을 확인할 수 있다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 유사 중간엽 줄기세포의 다양한 중배엽성 세포로의 분화능(differentiation)을 나타내는 결과이다. 도 7을 참고하면, 유사 중간엽 줄기세포는 적절한 분화 환경에서 지방세포(Adipogenic cell), 조골세포 (Osteogenic cell), 연골세포(Chondrogenic cell)과 근육세포(Myogenic cell)로 분화가 가능하다. 이는 세계 줄기세포치료학회에서 정의하는 중간엽 줄기세포의 분화능 조건을 충족하는 것이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 유사 중간엽 줄기세포(MMSC)의 증식능 및 세포 크기를 골수 유래 중간엽 줄기세포(bone marrow MSC, BM-MSC)와 비교한 그래프이다. 도 8에서 cumulative PDL(cPDL)은 세포증식능을 나타낸다. 유사 중간엽 줄기세포는 4회 계대시 평균 16.13번 분열한다. 이때, 유사 중간엽 줄기세포의 크기는 13.6 μm이다. 골수 유래 중간엽 줄기세포에 비하여 유사 중간엽 줄기세포의 세포증식이 약 1.6배 빠르며, 세포의 크기는 약 0.8배 작은 것으로 확인하였다. 유사 중간엽 줄기세포는 세포증식능이 빠르고, 세포 크기가 작아 줄기세포 치료제 조성물로 활용될 경우 체내 부작용 가능성을 낮출 수 있으며, 치료 효과를 향상시킬 수 있다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 유사 중간엽 줄기세포가 고순도로 분리된 것을 나타낸 그래프이다. 도 9를 참고하면, 미분화 조절 마커인 Oct4가 99% 이상 제거된 유사 중간엽 줄기세포를 확인할 수 있다. 따라서, 본 발명의 제조방법에 따라 세포주 확립 후 70 계대 이하 배양된 인간 전분화능 줄기세포 유래 유사 중간엽 줄기세포를 분리 및 배양할 경우, 유사 중간엽 줄기세포 이외의 미분화세포가 혼재하지 않고 고순도로 분리 및 배양된 것을 확인할 수 있다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 유사 중간엽 줄기세포의 유전적 안정성을 GTG-banding과 SNP 분석을 통해 확인한 것을 나타낸다. 도 10을 참고하면, 3개의 배치번호 즉, MSP-0005, MSP-0006, MSP-0007 로 제조된 유사 중간엽 줄기세포 모두에서 염색체가 정상이고, SNP 이상이 관찰되지 않음을 확인되었다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 유사 중간엽 줄기세포의 세포 이동 정도 따른 조직 재생능을 확인한 그래프이다. 도 11을 참고하면, In vitro wound healing 분석을 통해 유사 중간엽 줄기세포의 세포 이동에 따른 조직재생능력이, 성체줄기세포인 골수 유래 중간엽 줄기세포에 비하여 약 3.5배 이상인 것을 확인하였다.
도 12은 본 발명의 일 실시예에 따른 유사 중간엽 줄기세포의 물질교환 능력을 나타낸다. 도 12를 참고하면, 인간제대정맥혈관내피세포(HUVEC)와 유사 중간엽 줄기세포를 공배양하여 세포간 물질교환능력을 확인하였다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 유사 중간엽 줄기세포의 혈관형성능력을 나타낸다. 도 13을 참고하면, 유사 중간엽 줄기세포를 마트리젤(Matrigel)상에서 배양하여 자발적인 혈관형성능력을 확인하였다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 유사 중간엽 줄기세포의 면역세포 증식억제능 및 항염증 효능을 나타낸다. 도 14를 참고하면, 면역세포인 단핵구 세포와 유사 중간엽 줄기세포를 공배양하여 면역세포의 강한 증식억제 효과를 확인하였다. 이것은 골수 유래 중간엽 줄기세포와 비교하여 유사 중간엽 줄기세포의 면역억제능 및 항염증 효능이 높은 것을 나타낸다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른 유사 중간엽 줄기세포의 세포생존, 조직재생 및 세포사멸억제 기능성물질 분비능을 나타낸 그래프이다.
도 15에 도시된 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 인간 전분화능 줄기세포 유래 유사 중간엽 줄기세포에 있어서, 골수 유래 중간엽 줄기세포에 비해 MMP-1 단백질 및 HGF 단백질을 고발현하고, 골수 유래 중간엽 줄기세포에 비해 CD95를 저발현하고, CD90 및 SOX2를 95% 이상 발현하는 것을 특징으로 하는, 유사 중간엽 줄기세포가 제공된다. 또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 상기 유사 중간엽 줄기세포는, 골수 유래 중간엽 줄기세포에 비해 상기 MMP-1 단백질을 15배 이상 고발현하고, 상기 HGF 단백질을 2배 이상 고발현 할 수 있다. 또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 유사 중간엽 줄기세포는, 골수 유래 중간엽 줄기세포에 비해 CD95를 15배 이상 저발현 할 수 있다.
도 15에 도시된 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 인간 전분화능 유래 유사 중간엽 줄기세포에서, 조직재생과 관련된 MMP-1(Matrix Metalloproteinase-1) 단백질은, 골수 유래 중간엽 줄기세포에 비해 약 16.9배 이상 높게 분비된다. 그리고, 유사 중간엽 줄기세포에서 세포 생존 및 증식과 관련된 HGF(Hepatocyte growth factor) 단백질은, 골수 유래 중간엽 줄기세포에 비해 약 2.5배 이상 높게 분비된다. 반면, 유사 중간엽 줄기세포에서 세포사멸과 관련된 CD95(Cluster Differentiation 95)는, 골수 유래 중간엽 줄기세포에 비해 약 15배 이상 낮게 발현됨을 확인하였다.
상기 “CD95(Cluster Differentiation 95)”는 FasR(Fas Receptor), APO-1(Apoptosis antigen 1), 또는 TNFRSF6(Tumor Necrosis Factor Receptor Superfamily Member 6) 등의 명칭으로도 알려져 있는 세포사멸 수용체(death receptor)이다. CD95는 세포 표면에 위치하여 CD95L(CD95 Ligand)로 알려진 리간드와의 상호작용에 의해 세포사멸을 유도한다. 구체적으로, 상기 CD95에 FasL(Fas Ligand) 또는 CD95L(CD95 Ligand)로 알려진 리간드가 결합하면 사망유도신호 전달복합체(Death-Inducing Signaling Complex, DISC)를 통해 세포사멸이 촉진된다. 즉, 줄기세포 또는 전구세포에서 상기 CD95가 과발현되는 경우, CD95L에 의한 세포사멸 신호전달이 활성화된다. 반면, 상기 CD95가 상대적으로 저발현되는 줄기세포는 세포자살 신호전달이 억제되어 우수한 세포생존율을 나타낼 수 있다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 인간 전분화능 유래 유사 중간엽 줄기세포에서, 골수 유래 중간엽 줄기세포에 비하여 고발현되는, 염증조절 관련 유전자를 나타낸다.
도 16에 도시된 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 인간 전분화능 유래 유사 중간엽 줄기세포에서, 골수 유래 중간엽 줄기세포에 비해 염증조절 유전자를 2배 내지 100 배 이상 고발현하고, 상기 염증조절 유전자는, Gata3, Adora2a, Gps2, Psma1, Pbk, Lrfn5, Cdh5, Apoe, Foxf1, Tek, Cx3cl1, Ptger4, Acp5, Bcr, Socs5 및 Mdk으로 이루어지는 군 중 어느 하나 이상인, 유사 중간엽 줄기세포가 제공된다. 또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, Gata3, Adora2a 및 Gps2 유전자를 동시에 발현하는, 유사 중간엽 줄기세포가 제공된다. 상기 염증조절 유전자는 염증억제와 관련이 있는 유전자로, 상기 유사 중간엽 줄기세포는 상기 염증조절 유전자를 고발현하여 항염증 효능 등이 골수 유래 중간엽 줄기세포에 비해 2 배 내지 100배 이상 높은 유사 중간엽 줄기세포이다. 도 16에 도시된 바와 같이, 유사 중간엽 줄기세포에서 Gata3 유전자가, 골수 유래 중간엽 줄기세포에 비하여 약 100배 이상 높게 발현된다. 또한, 유사 중간엽 줄기세포에서 Adora2a 및 Gps2 유전자는, 골수 유래 중간엽 줄기세포에 비하여 약 10배 이상 높게 발현된다. 또한, 유사 중간엽 줄기세포에서 Psma1, Pbk, Lrfn5m, Cdh5, Apoe 유전자는, 골수 유래 중간엽 줄기세포 대비 약 5배 이상 높게 발현된다. 또한, 유사 중간엽 줄기세포는 상기 염증조절 유전자 Gata3, Adora2a 및 Gps2유전자를 동시에 발현할 수 있다.
도 17은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 인간 전분화능 유래 유사 중간엽 줄기세포에서, 골수 유래 중간엽 줄기세포에 비하여 고발현되는, 면역억제능 관련 유전자를 나타낸다.
도 17에 도시된 바와 같이, 상기 유사 중간엽 줄기세포는, 골수 유래 중간엽 줄기세포에 비해 면역억제능 유전자를 2배 내지 100배 이상 고발현하고, 상기 면역억제능 유전자는 Gata3, Gps2, Psma1, Apoe, Foxf1, Tek, Cx3cl1, Ptger4, Bcr, Socs5 및 Mdk 중 어느 하나 이상인, 유사 중간엽 줄기세포가 제공된다. 또한, 상기 유사 중간엽 줄기세포는, Gata3, Gps2 및 Psma1 유전자를 동시에 발현하는, 유사 중간엽 줄기세포가 제공된다.
도 17에 도시된 바와 같이, 유사 중간엽 줄기세포에서 Gata3 유전자가 골수 유래 중간엽 줄기세포에 비하여 약 50배 내지 100배 이상 높게 발현된다. 또한, 유사 중간엽 줄기세포에서 Gps2 유전자가 골수 유래 중간엽 줄기세포에 비하여 약 5배 내지 10배 이상 높게 발현된다. 또한, 유사 중간엽 줄기세포에서 Psma1, Apoe 유전자가 골수 유래 중간엽 줄기세포에 비하여 약 5배 이상 높게 발현된다. 또한, 유사 중간엽 줄기세포는 상기 면역억제능 유전자 Gata3, Gps2 및 Psma1을 동시에 발현할 수 있다.
도 18은 본 발명의 일 실시예에 따른 유사 중간엽 줄기세포의 세포 용해물(cell lysate) 단백체를 분석하여, 골수 유래 중간엽 줄기세포에 비하여 고발현하는 단백체를 나타낸다. 도 18을 참고하면, 유사 중간엽 줄기세포는 Angiopoietin-4(ANGPT4), BMPR-1B(bone morphogenic protein receptor 1B), Activin B, Activin RII, CCR1, HCR(Human chemokine receptor CRAM-A isoform), ICAM-2(Intracellular adhesion molecule 2)를 골수 유래 중간엽 줄기세포에 비하여 약 2배 이상 높게 발현한다. 상기 유사 중간엽 줄기세포는 Angiopoietin-4와 BMPR-1B를 동시에 발현할 수 있다. 바람직하게, 상기 유사 중간엽 줄기세포는 골수 유래 중간엽 줄기세포에 비하여 Angiopoietin-4 및 BMPR-1B를 약 3배 이상 높게 발현할 수 있다. 더욱 바람직하게, 상기 유사 중간엽 줄기세포는 ANGPT4, BMPR-1B, Activin B, Activin RII, CCR1, HCR 및 ICAM-2 중 어느 하나 이상의 단백체를 골수 유래 중간엽 줄기세포에 비하여 약 2배 이상 높게 발현할 수 있다.
도 19는 본 발명의 일 실시예에 따른 유사 중간엽 줄기세포의 세포 용해물(cell lysate) 단백체를 분석하여, 골수 유래 중간엽 줄기세포에 비하여 저발현하는 단백체를 나타낸다. 도 19를 참고하면, 상기 유사 중간엽 줄기세포는 골수 유래 중간엽 줄기세포에 비하여 Angiogenin, Angiopoietin-2, CCR8, EDA-A2, IL-20를 약 2배 이상 낮게 분비할 수 있다. 상기 유사 중간엽 줄기세포는 Angiogenin 및 Angiopoietin-2를 동시 분비할 수 있고, 상기 Angiogenin 및 Angiopoietin-2를 골수 유래 줄기세포에 비하여 약 2배 이상 낮게 분비할 수 있다.
도 20은 본 발명의 일 실시예에 따른 유사 중간엽 줄기세포의 배양 상층액 (culture supernatant) 단백체를 분석하여, 골수 유래 중간엽 줄기세포에 비하여 고발현하는 단백체를 나타낸다. 도 20을 참고하면, 유사 중간엽 줄기세포는 GRO-a, IL-15R alpha, FasL, Activin RII, BMP-2, CCR2, CXCL14, FGFR4, uPA, MMP-20를 골수 유래 줄기세포에 비하여 약 2배 이상 높게 분비할 수 있다. 상기 유사 중간엽 줄기세포는 GRO-a와 IL-15R alpha를 동시에 분비할 수 있고, GRO-a와 IL-15R alpha를 골수 유래 줄기세포에 비하여 약 2배 이상 높게 분비할 수 있다. 상기 중간엽 줄기세포는 GRO-a, IL-15R alpha, FasL, Activin RII, BMP-2, CCR2, CXCL14, FGFR4 중 어느 하나의 단백체를 골수 유래 줄기세포에 비하여 약 2배 이상 높게 분비할 수 있다.
도 21은 본 발명의 일 실시예에 따른 유사 중간엽 줄기세포의 배양 상층액 (culture supernatant) 단백체를 분석하여, 골수 유래 중간엽 줄기세포에 비하여 저발현하는 단백체를 나타낸다. 도 21을 참고하면, 상기 유사 중간엽 줄기세포는 골수 유래 중간엽 줄기세포에 비하여 TIMP-2, Activin A, VEGF A, Follistantin-like 1, ErbB4m, Thrombospondin-1를 약 4배 이상 낮게 분비한다. 상기 유사 중간엽 줄기세포는 TIMP-2와 Activin A를 동시에 분비할 수 있고, TIMP-2와 Activin A를 골수 유래 중간엽 줄기세포에 비하여 약 5배 이상 낮게 분비한다.
본 발명의 유사 중간엽 줄기세포는 인간 말초혈 유래 단핵구 세포와 공배양 시 증식능을 억제시킬 수 있다. 보다 상세하게, 본 발명의 유사 중간엽 줄기세포는 인간 말초혈 유래 단핵구 세포와 공배양 시, 골수 유래 중간엽 줄기세포에 비하여 약 5 배 내지 약 8배 이상 증식을 억제시킬 수 있다.
본 발명의 유사 중간엽 줄기세포는 세포이동 및 수복능 평가에서 골수 유래 중간엽 줄기세포 대비 약 3.5배 이상 수복능이 높게 나타날 수 있다.
본 발명의 유사 중간엽 줄기세포는 세포생존 관련 유전자인 MMP-1 단백질을 골수 유래 중간엽 줄기세포에 비하여 약 15 배 내지 약 16배 이상 높게 분비할 수 있다. 또한, 상기 유사 중간엽 줄기세포는 세포성장 및 조직재생 관련 유전자인 HGF 단백질을 골수 유래 중간엽 줄기세포에 비하여 약 2배 이상 높게 분비할 수 있다.
본 발명의 유사 중간엽 줄기세포는 세포사멸 수용체인 CD95가 골수 유래 중간엽 줄기세포에 비하여 약 15배 이상 낮게 발현할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 제조방법으로 제조된 유사 중간엽 줄기세포를 포함하는 치료제 조성물로서, 상기 치료제 조성물은, 세포치료제 조성물, 세포유전자치료제 조성물, 조직공학치료제 조성물, 항염증치료제 조성물, 면역치료제 조성물, 암의 예방 또는 치료용 조성물 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 치료제 조성물이 제공된다. 또한, 상기 치료제 조성물은, 상기 유사 중간엽 줄기세포로부터 분비되는 유효성분 또는 엑소좀을 더 포함할 수 있다. 또한, 상기 치료제 조성물은, 다발성경화증, 전신경화증, 급성 심근경색, 만성 심근경색, 만성 폐질환, 급성 폐질환, 크론병, 변실금, 이식편대숙주질환, 하지허혈질환, 버거씨병, 족부궤양, 루프스, 루마티즘성 관절염, 급성 및 만성 신우염, 염증성 방광염, 간질성 방광염, 저활동성방광, 과민성방광, 오십견, 회전근개손상 및 파열, 다양한 운동 등으로 인해 발생되는 근골격계 손상, 무릎연골손상, 이명증, 아토피성 피부염, 건선, 화상으로 인한 피부손상, 자외선 등으로 인한 피부손상, 망막병증을 포함하는 염증성 및 면역계 질환의 예방, 허혈성치매, 알츠하이머치매, 척수손상, 파킨슨씨병 및 중추신경계질환 중 어느 하나 이상의 질병의 예방 또는 치료를 위한 것일 수 있다.
상기 유사 중간엽 줄기세포로부터 분비되는 유효성분 또는 엑소좀은, 면역억제능, 항염증 효능, 세포생존, 조직재생 또는 세포사멸억제 등과 관련된 기능성 물질을 모두 포함한다. 다만, 상기 치료제 조성물로서 기능성을 갖는 물질이라면, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에 따른 제조방법으로 제조된 유사 중간엽 줄기세포를 포함하는 전달체로서, 상기 전달체는, 약학적 조성물을 담지하는 것을 특징으로 하는, 전달체가 제공된다.
본 발명의 일 실시예에 따른 제조방법으로 제조된 유사 중간엽 줄기세포로부터 분비되는 유효성분 또는 엑소좀을 포함하는, 질병의 예방 또는 치료용 조성물이 제공된다. 또한, 상기 질병은 다발성경화증, 전신경화증, 급성 심근경색, 만성 심근경색, 만성 폐질환, 급성 폐질환, 크론병, 변실금, 이식편대숙주질환, 하지허혈질환, 버거씨병, 족부궤양, 루프스, 루마티즘성 관절염, 급성 및 만성 신우염, 염증성 방광염, 간질성 방광염, 저활동성방광, 과민성방광, 오십견, 회전근개손상 및 파열, 다양한 운동 등으로 인해 발생되는 근골격계 손상, 무릎연골손상, 이명증, 아토피성 피부염, 건선, 화상으로 인한 피부손상, 자외선 등으로 인한 피부손상, 망막병증을 포함하는 염증성 및 면역계 질환의 예방, 허혈성치매, 알츠하이머치매, 척수손상, 파킨슨씨병 및 중추신경계질환 중 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 제조방법으로 제조된 유사 중간엽 줄기세포로부터 분비되는 유효성분 또는 엑소좀을 포함하는 화장료 조성물이 제공된다.
본 발명의 인간 전분화능 줄기세포 유래 유사 중간엽 줄기세포는, 골수 유래 중간엽 줄기세포 대비 항염증 효능, 면역억제능 및 조직재생 능력이 향상된다.
실시예 1: 항염증 효능 및 면역억제능이 강화된 유사 중간엽 줄기세포의 분리 및 배양
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 인간 전분화능 줄기세포로부터 유사 중간엽 줄기세포를 분리하고 배양하는 과정을 모식화한 도면이다. 인간 전분화능 줄기세포는 세포주 확립 후 70회 이하 계대 배양된 것을 이용하였다. 세포주 확립 후 70회 이하 계대 배양된, 인간 전분화능 줄기세포를 37℃, 5% CO2 세포배양기에서 유지배양을 진행하였다. 유지배양 된 인간 전분화능 줄기세포는 단순 효소처리에 의해 배양 플레이트로부터 분리하였다. 그리고, 배상체 형성을 통해, 낭성(Cystic) 배상체만 선별하였다. 세포투과성 3차원 배양삽입체를 새로운 배양 플레이트(6 well plate)에 결합시키기 전, 배양 시 최초 1회에 한하여, 새로운 배양 플레이트에 먼저 2ml의 배양액을 넣었다. 그리고, 2ml의 배양액을 포함한 배양 플레이트에 세포투과성 3차원 배양삽입체를 결합시켰다. 그 후, 세포투과성 3차원 배양삽입체 내에 2ml의 배양액을 추가로 넣고, 선별된 낭성 배상체를 결합된 세포투과성 3차원 배양삽입체 위에 로딩하였다. 새로운 배양 플레이트에 넣은 배양액과 세포투과성 3차원 배양삽입체 내의 배양액은 EGM-2MV를 사용하였다. 낭성 배상체가 로딩된 세포투과성 3차원 배양삽입체 내의 배양액을 이틀동안 교체하지 않고 배상체를 배양하였다. 이후, 배양액을 제거하고, 세포투과성 3차원 배양삽입체 내에만 4ml의 배양액을 추가로 넣고, 매일 배양액을 교체하여 유사 중간엽 줄기세포로의 분화를 유도하였다.
실시예 2: 항염증 효능 및 면역억제능이 강화된 유사 중간엽 줄기세포의 분리 및 증식
상기 실시예 1에서 분리된 유사 중간엽 줄기세포에 있어서, 세포투과성 3차원 배양삽입체를 투과하여 세포투과성 3차원 배양삽입체의 아래로 이동한, 군집 형태의 세포를 분리하였다. 분리된 군집 중 다층(Multilayer) 형태의 군집은 기계적(mechanically)으로 제거하였다. 분리된 군집 중 단층(Monolayer) 형태의 군집만을 마이크로 파이펫 팁을 이용하여 가로 500μm 이하, 세로 500μm 이하의 크기로 잘라 균일화하여 선택적으로 배양하였다. 보다 바람직하게, 단층 형태의 군집은 가로와 세로 각각 100μm ~ 500μm의 크기로 균일화하여 유사 중간엽 줄기세포를 배양하였다. 5-7일 동안 배양 후, 군집으로부터 단일세포 형태로 뻗어 나오는 유사 중간엽 줄기세포만을 분리하고, 계대 배양하여 증식시켰다. 단일세포 분리 전, 단일세포 형태가 아닌 군집 및 상피세포 모양의 세포들은 마이크로 파이펫 팁으로 완전히 제거하였다. 분리된 단일세포는 새로운 배양 플레이트로 옮겨 계대 배양을 통해 증식을 유도하였다. 이때, 배양 배지는 EGM-2MV를 사용하였다.
구체적으로, 도 4에 도시된 바와 같이, 군집 형태의 유사 중간엽 줄기세포가 세포투과성 3차원 배양삽입체 아래로 이동하면, 세포투과성 3차원 배양삽입체를 배양 플레이트로부터 분리하였다. 분리된 세포투과성 3차원 배양삽입체의 아래로 이동한 군집 형태의 유사 중간엽 줄기세포를 수득한 후 다층(Multilayer) 형태의 군집은 기계적으로 제거하고, 단층(Monolayer) 형태의 군집의 크기를 균일화하여 선택적 배양을 실시하였다. 단층 형태의 군집으로부터 증식된 유사 중간엽 줄기세포는, 지속적인 계대 배양에 의하더라도, 세포의 형태 및 증식능이 유지되어, 세포의 형태 및 증식 등에 미치는 부정적 변화는 관찰되지 않았다.
실시예 3: 유사 중간엽 줄기세포의 표면 항원 발현 분석
상기 실시예 1과 2에 따라 제조된 유사 중간엽 줄기세포의 특성분석을 위해 유세포 분석기(Fluorescence Activated Cell Sorting, FACS)를 사용하여 줄기세포 특정 마커의 발현을 분석하였다.
구체적으로, 증식이 유도된 유사 중간엽 줄기세포를 TrypLE을 사용하여 단일세포화 하고, 5x105 cells/ml농도로 PBS(Phosphate Buffered Saline)에 부유시켰다. 각 세포에 Sox2, CD44, CD73, CD90, CD105, CD146, NG2, HLA-ABC, CD11b, CD11c, CD14, CD19, CD34, CD45, CD40, CD40L, CD80, CD86, CD95, CD133, KDR, Flt-1, Tie-2, HLA-DR. Oct3/4, Tra-1-81 및 Tra-1-60 항체를 첨가하여 45분간 실온에서 반응시켰다. 그리고, 각각의 세포에 대해 유세포 분석을 실시하였다. 핵 내부 단백질인 SOX2와 Oct3/4는 실온에서 5분 동안 0.1% triton X-100을 처리하여 세포막 투과화(permeabilization) 과정을 유도하였다. 그리고, 항체를 첨가하여 유세포 분석을 실시하였다. 그 결과를 하기 표 1과 도 6에 나타냈다.
유사 중간엽 줄기세포의 표면 항원 발현율
마커 SOX2 CD44 CD73 CD90 CD105 CD146 NG2
발현율 (%) 99.4 98.8 96.77 98.2 95.6 92.7 68.7
마커 HLA-ABC CD11b CD11c CD14 CD19 CD34 CD45
발현율 (%) 58.8 0.18 0.11 0.17 0.09 1.46 0.15
마커 CD40 CD40L CD80 CD86 CD95 CD133 KDR
발현율 (%) 0.45 0.05 1.22 0.04 10.3 0.16 0.26
마커 Flt-1 Tie-2 HLA-DR Oct3/4 Tra-1-81 Tra-1-60
발현율 (%) 4.46 0.98 0.08 0.2 0.03 0.08
상기 표 1과 도 6을 참고하면, 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 유사 중간엽 줄기세포는 중간엽 줄기세포 특이 마커인 CD44, CD73, CD90, CD105를 모두 95% 이상 발현하였다. 반면, CD45, CD34, CD14, CD19는 2% 이하로 발현하였다. 그리고, 미분화 조절 마커인 Oct3/4, Tra-1-60, Tra-1-81 및 면역거부항원인 HLA-DR의 발현이 거의 나타나지 않았다. 따라서, 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 유사 중간엽 줄기세포는, 세계 줄기세포치료학회에서 정의하고 있는 중간엽 줄기세포로서의 특성을 모두 가지고 있음을 확인하였다. 또한, 세계 줄기세포치료학회에서 성체 중간엽 줄기세포의 특성으로 정의하고 있지 않은 SOX2, CD146이 90% 이상 발현되고, CD95는 현저하게 낮게 발현되는 것으로 확인되었다. 본 발명에서 제조된 유사 중간엽 줄기세포는, 70회 이하로 계대 배양된 인간 전분화능 줄기세포로부터 분화 유도하기 때문에, 표 1의 표면 항원 발현 특성을 갖는 것으로 예측할 수 있다. 또한, 인간 전분화능 줄기세포를 분화 유도한 배상체 중 선별된 낭성 배상체만을 세포투과성 3차원 배양삽입체를 이용하여 분리하고 단층 형태의 세포 군집을 균일화하여 배양하기 때문에, 표 1의 표면 항원 발현 특성이 일정하게 유지된다. 특히, 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 유사 중간엽 줄기세포는 SOX2를 90%이상 발현하고 있어, 보통의 중간엽 줄기세포와는 상이하다.
실시예 4: 유사 중간엽 줄기세포의 분화능 분석
상기 실시예 1과 2를 통해 제조된 유사 중간엽 줄기세포의 다분화능을 확인하기 위해 세계 줄기세포치료학회에서 중간엽 줄기세포의 특징으로 정의하고 있는 조골, 지방 및 연골 세포로의 분화와 근육세포로의 분화를 유도하였다.
구체적으로, 제조된 유사 중간엽 줄기세포를 10% FBS, 5 μg/ml 인슐린, 1 μM 덱사메타손, 0.5 mM 이소부틸메틸크산틴 및 60 μM 인도메타신이 포함되는 저농도 글루코스 DMEM 배지에서 배양하였다. 또한, 10% FBS, 1 μM 덱사메타손, 10 mM β-글리세로포스페이트 및 60 μM 아스코르브산-2-인산을 포함하는 저농도 글루코스 DMEM 배지에서 배양하였다. 그리고, 각각 조골세포, 지방세포 및 연골세포로의 분화여부를 확인하였다. 상기 분화로 생성된 조골세포는 알리자린 레드 에스(Alizarin red S) 염색을 통해 분화여부를 확인하였다. 상기 분화로 생성된 지방세포는 오일레드오(Oil Red O) 염색을 통해 분화 여부를 확인하였다. 또한, 상기 분화로 생성된 연골세포는 알시안블루(Alcian blue) 염색을 통해 분화여부를 확인하였다.
또한, 근육세포로의 분화를 확인하기 위해, 제조된 유사 중간엽 줄기세포를 20% FBS, 1% 비필수아미노산, 1% 페니실린 설페이트, 0.1 mM β-머켑토에탄올을 포함하는 DMEM 배지에서 분화시켰다. 상기 분화된 근육세포에서, 평활근 특이적 마커인 αSMA가 발현함을 확인하였다.
따라서, 도 7에 도시된 바와 같이, 본 발명의 제조방법에 따라 제조된 유사 중간엽 줄기세포는 조골, 지방, 연골 및 근육세포로의 일정한 분화능을 나타내기 때문에, 이는 세계 줄기세포치료학회에서 제시한 중간엽 줄기세포의 특징을 만족하는 것이다.
실시예 5: 유사 중간엽 줄기세포의 증식능 및 세포 크기 분석
상기 실시예 1과 2를 통해 생산된 유사 중간엽 줄기세포의 증식능을 확인하기 위해, 3 계대에서 7 계대까지의 총 세포분열수를 확인하였다. 성체줄기세포인 골수 유래 중간엽 줄기세포와의 총 세포분열수를 함께 비교하였다. 그 결과는 하기의 표 2와 도 8에 나타냈다.
유사 중간엽 줄기세포의 증식능
세포 증식능 실험 반복수(R) 평균(Mean)
(times) 		최소(Min)
(times) 		최대(Max)
(times) 		표준편차
(STDV)
유사 중간엽 줄기세포(MMSC) 3 16.13 15.82 16.665 0.46
골수 유래 중간엽 줄기세포(BM-MSC) 3 10.17 10.06 10.26 0.10
표 2와 도 8과 같이 유사 중간엽 줄기세포는 3 계대에서 7 계대 동안 하나의 세포가 평균 16.13번 분열하였다. 반면, 골수 유래 중간엽 줄기세포는 평균 10.17번 분열한다. 따라서, 증식능에 있어 유사 중간엽 줄기세포가 우수하다는 점을 알 수 있다.
한편, 증식된 유사 중간엽 줄기세포의 세포 크기를 조사한 결과 표 3과 도 8에서 보는 바와 같이 유사 중간엽 줄기세포의 세포 크기는 평균 13.6±0.3 μm이다. 반면, 골수 유래 중간엽 줄기세포의 경우 세포 크기가 평균 17.7±0.4 μm이다. 따라서, 골수 유래 중간엽 줄기세포에 비하여 유사 중간엽 줄기세포의 크기가 상대적으로 작음을 확인하였다. 유사 중간엽 줄기세포의 크기가 상대적으로 작기 때문에, 세포치료제 적용 시 혈관으로 주입하는 경우 혈관폐쇄로 인한 폐색전증(Pulmonary embolism)의 발생가능성을 낮출 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 유사 중간엽 줄기세포는, 치료제 조성물로서, 세포치료제 조성물, 세포유전자치료제 조성물, 조직공학치료제 조성물, 항염증치료제 조성물, 면역치료제 조성물, 암의 예방 또는 치료용 조성물로 제공되어 치료의 효율을 높이고, 부작용의 발생가능성을 낮출 수 있다.
유사 중간엽 줄기세포의 세포 크기
세포 크기 실험 반복수(R) 평균(Mean)
(μm) 		최소(Min)
(μm) 		최대(Max)
(μm) 		표준편차
(STDV)
유사 중간엽 줄기세포(MMSC) 3 13.6 13.4 13.9 0.3
골수 유래 중간엽 줄기세포(BM-MSC) 3 17.7 17.3 18.1 0.4
실시예 6: 유사 중간엽 줄기세포의 고순도 분리
상기 실시예 1과 2를 통해 제조된 유사 중간엽 줄기세포는, 미분화 세포가 혼재되어 있지 않은 고순도 세포임을 확인하였다. 즉, 유지 및 증식 중인 유사 중간엽 줄기세포에 대해 미분화 조절 마커인 Oct4의 발현여부를 qPCR 방법을 통해 확인하였다. 그리고, 미분화 전분화능 줄기세포인 인간 배아줄기세포주(hESC)와 인간 피부 섬유아세포(hFF)를 비교분석 하였다. 그 결과, 도 9와 같이 미분화 조절 마커인 Oct4가 인간 배아줄기세포에서만 발현되었다. 본 발명의 제조방법에 따라 제조된 유사 중간엽 줄기세포에서는 인간 피부 섬유아세포(hFF)와 마찬가지로, 미분화 세포가 혼재되어 있지 않음을 확인할 수 있었다. 본 발명의 제조방법에 따라 제조된 유사 중간엽 줄기세포는, 미분화 세포의 발현이 검출되지 않고, 고순도로 분리된 세포임을 확인할 수 있다.
실시예 7: 유사 중간엽 줄기세포의 유전적 안전성 분석
한편, 유사 중간엽 줄기세포의 유전적 안전성 확인을 위해 염색체 분석과 SNP(Single Nucleotide Polymorphism) 분석을 실시하였다.
구체적으로, 염색체 분석을 위해, 100 μg/㎕농도의 콜히친 용액 20 ㎕가 함유된 10 ㎖ 배지 하에서, 유사 중간엽 줄기세포를 첨가한 뒤, 37 ℃에서 2시간 동안 방치하였다. 이 후, 500 rpm에서 5분간 원심분리한 뒤, 상층액을 제거하였다. 그리고, 0.075M KCl 저장액에 세포를 부유시킨 후, 37 ℃ 항온수조에서 25분간 방치하였다. 이 후, 고정액(methanol:glacial acetic acid=3:1, v/v)을 5방울 첨가한 뒤 1,200 rpm하에서, 8분간 원심분리 하였다. 이 후, 상층액을 제거하고, 고정액을 추가로 첨가하여, 상온에서 10분간 방치하는 과정을 2회 진행하였다. 이 후, 차가운 70% 에탄올에 침지한 슬라이드 글라스 상에 세포부유액을 한방울 적하시켰다. 이어서, 알콜램프를 이용하여 슬라이드의 건조를 유도하였다. 이어서, 5% Gimesa 용액에 12분간 염색을 진행하였다. 이어서, 증류를 이용하여 염색액을 제거하고 공기중 건조를 유도한 다음 광학현미경하에서 관찰하였다. SNP 분석은 전문검사기관에 위탁하여 Illumina SNP chip을 이용하여 염색체의 이상 유무를 확인하였다. 도 10과 같이, 3개 배치번호(batch number)로 제조된 유사 중간엽 줄기세포 모두에서 염색체가 정상이고, SNP 이상이 관찰되지 않았다. 따라서, 본 발명의 제조방법에 따라 제조된 유사 중간엽 줄기세포는 유전적으로 안정함을 입증하였다.
실시예 8: 유사 중간엽 줄기세포의 조직재생능 분석
상기 실시예 1과 2를 통해 제조된 유사 중간엽 줄기세포의 기능성 평가를 위해 다양한 분석을 시행하였다. 조직재생능을 분석하기 위해 세포이동능 분석(In vitro Cell Migration Assay)을 시행하였다. 조직재생능 분석에서 대조군 세포로 골수 유래 중간엽 줄기세포를 이용하였다.
구체적으로, 각 μ-디쉬 35mm에 유사 중간엽 줄기세포와 골수 유래 중간엽 줄기세포를 각각 3x104 cells/well 농도로 70㎕씩 분주하였다. 이어서, 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 배양하였다. 그 후, 배양 삽입체(culture-insert)을 제거하고, 10% DMEM 배지 2㎖를 첨가하였다. 그리고, 현미경으로 관찰하면서 세포의 이동 수를 측정하였다.
도 11에 도시된 바와 같이, 제조된 유사 중간엽 줄기세포의 이동능은 평균 67.51%로 나타났다. 본 발명의 제조방법에 따라 제조된 유사 중간엽 줄기세포의 이동능은, 골수 유래 중간엽 줄기세포에 비해 350%이상 높은 것으로 나타났다. 즉, 본 발명의 일 실시예에 의해 제조된 유사 중간엽 줄기세포는, 생체 내 투약 시 신속한 세포이동과 증식이 가능함을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 제조방법에 따라 제조된 유사 중간엽 줄기세포의 조직재생능력이 현저하게 높다는 것을 예측할 수 있다.
실시예 9: 유사 중간엽 줄기세포의 물질교환능과 혈관형성능 분석
상기 실시예 1과 2를 통해 제조된 유사 중간엽 줄기세포의 기능성 평가를 위한 다른 방법으로 물질교환능과 혈관형성능을 분석하였다.
구체적으로, 세포간의 상호작용을 분석하기 위해 사용되는 갭-정션(gap-juction)에 이동가능한 형광물질인 칼세인(calcein)을 활용하여, 물질교환능을 분석하였다. 우선, 혈관세포 중 하나인 인간제대정맥혈관내피세포(Human umbilical vein endothelial cell, HUVEC)에 칼세인 염색을 시행하였다. 그리고, Dil가 표지된 유사 중간엽 줄기세포와 37℃ 배양기에서 1시간 공배양을 시행하였다. 그리고, 형광현미경에서 분석하였다. 도 12에 나타낸 바와 같이 형광으로 표시된 HUVEC 세포와 적색으로 표시된 Dil-유사 중간엽 줄기세포는, 공배양을 거쳐 신속하게 물질이동이 이루어짐을 확인할 수 있었다. 48시간 후 유세포분석을 시행한 결과 물질교환이 이루어진 세포의 수는 46.15%로 확인되었다. 즉, 본 발명의 제조방법에 따른 유사 중간엽 줄기세포는 혈관세포 등과의 신속한 갭-정션 결합을 통해 유용물질 공급 등을 포함한 세포 간의 상호작용을 촉진할 수 있음을 나타낸다.
한편, 혈관형성능 분석을 위해서, 상온에서 해동시킨 마트리젤을 96 well 플레이트에 각각 50 ㎕씩 분주하였다. 그리고, 37℃에서 30분간 정치한 다음 단일 세포화된 유사 중간엽 줄기세포 1-2 x 104 cell을 마트리젤상에 시딩(seeding)한 후, 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 이후, 10% 포름알데하이드 고정액을 첨가하여 10분간 추가 배양하였다. 그리고, 10배의 현미경하에서 무작위로 3~5 곳을 관찰하면서 자발적 혈관형성(sponteneous tubule formation) 여부를 관찰하였다. 도 13에서와 같이 3 배치번호(batch number)의 유사 중간엽 줄기세포 모두가 마트리젤상에서 자발적 혈관형성이 이루어졌음을 확인할 수 있었다. 이는 실시예 1과 2를 통해 제조된 유사 중간엽 줄기세포는 자발적 혈관형성능을 보유하고 있음을 나타낸다. 즉, 상기의 특성은, 본 발명의 제조방법에 따라 제조된 유사 중간엽 줄기세포는 손상부위의 신생혈관 형성 촉진과 물질교환 작용이 가능함을 나타낸다.
실시예 10: 유사 중간엽 줄기세포의 면역세포의 증식 억제와 항염증 효능 분석
실시예 1과 2를 통해 제조된 유사 중간엽 줄기세포의 기능분석 중 하나로 면역세포와의 공배양을 통한 세포증식억제 및 항염증 관련 단백체의 발현을 분석하였다.
구체적으로, 실시예 1과 2에 따라 제조된 유사 중간엽 줄기세포와 골수 유래 중간엽 줄기세포를 각각 1,000, 2,000, 5,000 및 10,000개 준비하였다. 그리고, 말초혈에서 채취된 단핵구 세포(Peripheral Blood Mononuclear Cell: PBMC) 2x105 cell/well을 96 well 플레이트에서 5일 동안 공배양하였다. 각 실험군에 CFSE(Carboxy FLuorecein Succinimidyl Ester)를 표지하여 PBMC의 증식억제율(%)을 측정하였다. 그 결과는 하기의 표 4와 도 14에 나타냈다.
말초혈액 내 단핵구 세포와 공배양 시 유사 중간엽 줄기세포 수 증가에 따른 면역세포 증식 억제능
시험군 유사 중간엽 줄기세포 평균 (%) 최소 (%) 최대 (%) 표준편차
1 1,000 2.54 2.55 3.26 0.64
2 2,000 4.55 4.55 4.75 0.24
3 5,000 13.23 13.23 13.91 0.87
4 10,000 36.53 36.53 36.92 0.47
*말초혈액 내 단핵구 세포: 2 x 105 cell/well
상기 표 4와 도 14 와 같이, 유사 중간엽 줄기세포는 말초혈 단핵구 세포의 증식을 농도 의존적으로 억제하는 것을 확인할 수 있다. 즉, 본 발명의 유사 중간엽 줄기세포는, 증식억제 효과가 골수 유래 중간엽 줄기세포에 비해 월등히 높다. 따라서, 본 발명의 유사 중간엽 줄기세포의 면역억제능이 우수하다.
한편, 유사 중간엽 줄기세포의 유전체 및 단백체 분석을 통해, 항염증 작용 및 면역억제능과 관련된 유전자의 발현을 분석하였다. 그 결과, 대표적인 항염증 작용을 나타내는 Gata3, Adora2a와 Gps2가, 골수 유래 중간엽 줄기세포에 비하여 약 11배 내지 약 100배 이상 높게 발현되는 것으로 확인되었다. 따라서, 유사 중간엽 줄기세포는 골수 유래 중간엽 줄기세포에 비교하여 항염증 효능과 면역억제능이 우수하다.
실시예 11: 유사 중간엽 줄기세포의 기능성 유용물질의 분비능
실시예 1과 2에서 제조된 유사 중간엽 줄기세포의 기능성 분석을 위해 이들로부터 분비되는 유용물질의 농도를 측정하였다. 구체적으로, 제조된 유사 중간엽 줄기세포를 무혈청 상태의 DMEM 배지하에서 24시간 배양하였다. 그리고, 500 rpm 하에서 원심분리를 시행하고 상층부의 배지만을 회수하였다. 회수된 배지는 ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)법을 이용하여 MMP-1, HGF 및 CD95를 정량 분석하였다. 성체줄기세포와의 비교를 위해 골수 유래 중간엽 줄기세포를 비교 분석하여, 그 결과는 도 15에 나타냈다.
도 15와 같이, 대표적인 조직재생 관련 단백질인 MMP-1(Matrix metalloproteinase-1)의 농도는 유사 중간엽 줄기세포에서 20,953 pg/ml이고, 골수 유래 중간엽 줄기세포에서 1,237 pg/ml이었다. 즉, 유사 중간엽 줄기세포에서 골수 유래 중간엽 줄기세포에 비해, MMP-1가 약 16배 높게 분비되었다. 한편, 세포성장 및 증식관련 단백체인 HGF(Hepatic Growth Factor)의 농도는 유사 중간엽 줄기세포에서 1,360 pg/ml이고, 골수 유래 중간엽 줄기세포에서 534 pg/ml이었다. 즉, 유사 중간엽 줄기세포에서 골수 유래 중간엽 줄기세포에 비해, HGF 가 약 2.5배 이상 높게 분비되었다. 한편, 세포사멸을 유발하는데 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 CD95의 농도는, 유사 중간엽 줄기세포에서는 53 pg/ml이고, 골수 유래 중간엽 줄기세포는 800 pg/ml이다. 따라서, 유사 중간엽 줄기세포에서 골수 유래 중간엽 줄기세포에 비해, CD95가 약 15배 이상 낮게 발현되었다. 따라서, 본 발명에 의해 제조된 유사 중간엽 줄기세포는 기존 골수 유래 중간엽 줄기세포에 비해 조직재생 및 세포증식관련 단백질 분비능력이 우수하다. 그리고, 세포사멸 유발 단백질이 현저하게 낮게 발현되므로, 조직재생 및 세포의 생존능력이 매우 우수하다.
실시예 12: 분리 배양된 유사 중간엽 줄기세포의 염증조절 및 면역억제 관련 유전자 발현 특성 확인
실시예 1과 2에서 분리 배양된 유사 중간엽 줄기세포과 골수 유래 중간엽 줄기세포에 대해 Next Generation Sequence(NGS) 실시한 다음 NCBI GEO에서 발표된 데이터베이스를 기반으로 유전자 발현의 차이를 분석하였다.
구체적으로, 유사 중간엽 줄기세포와 골수 유래 중간엽 줄기세포의 유전자 발현을 비교하기 위하여 RNA sequencing(RNA-seq)을 실행하였다. 상기 두 가지 세포는 100 mm dish에 3X105/dish의 밀도로 분주하고, confluence 80% 시점에 분석에 사용하였다. RNA-seq을 위하여 세포의 total RNA를 추출하였으며, 모든 RNA 시료는 기준 이상의 고른 품질을 가지는 것으로 확인되었다. cDNA library는 TruSeq Stranded mRNA LT Sample Prep Kit(Illumina)의 표준절차를 준수하여 제작되었다. 상기 cDNA library는 TruSeq Stranded mRNA Sample Preparation Guide(Part #15031047 Rev. E)에 따라, NovaSeq 6000 System (Illumina) 상에서 서열분석 되었다. 각각의 RNA-seq 데이터는 세포당 3개의 시료를 이용하여 생성되었다(n = 3). 수득된 Illumina read 데이터에서 BBDuk(BBtools)을 이용하여 Phred quality score를 계산하고, 전체 데이터 중에 평균 Q30 이상의 데이터만을 사용하였다. 선별된 read 데이터는 Bowtie2를 이용하여, 참고 유전체 서열(hg19; genome database: USCS) 상으로 mapping 되었다(Langmead & Salzberg, 2012). Read 데이터의 계산은 Bedtools(https://bedtools.readthedocs.io/en/latest/)을 이용하였다. mapping 및 정량화는 각 시료 별로 진행되었다. 정량화된 유전자 발현 정보는 edgeR을 이용하여 quantile normalization 되었다(Robinson, McCarthy, & Smyth, 2010). 모든 데이터는 유사 중간엽 줄기세포와 골수 유래 중간엽 줄기세포의 비교를 위하여 분석되었다. 그 결과는 도 16과 17에 나타냈다.
도 16과 같이 염증조절 유전자 분석을 통해, 골수 유래 중간엽 줄기세포에 비해 약 2배 이상 높게 발현되는 유전자는, Gata3, Adora2a, Gps2, Psma1, Pbk, Lrfn5, Cdh5, Apoe, Foxf1, Tek, Cxcl1, Ptger4, Acp5, Bcr, Socs5와 Mdk로서 16종의 유전자가 확인되었다. 특히, Gata 3 유전자는 약 108배, Adora2a 유전자는 약 27.97배, Gps2 유전자는 약 11.02배로 발현되었다. 따라서, 유사 중간엽 줄기세포에서 골수 유래 중간엽 줄기세포에 비하여, 염증조절 유전자가 10배 이상 높게 발현되는 것으로 확인되었다.
한편, RNA-seq을 활용한 분석을 통해 면역억제능 관련 유전자 발현을 분석한 결과는 도 17에 나타냈다. 골수 유래 중간엽 줄기세포에 비해 2배 이상 높게 발현되는 유전자는 Gata3, Gps2, Psma1, Apoe, Foxf1, Tek, Cxcl1, Ptger4, Bcr, Socs5와 Mdk로서 11종이다. 특히, Gata 3 유전자는 108배, Adora2a 유전자는 11.02배로 발현되어, 골수 유래 중간엽 줄기세포에 비하여 10배 이상 높게 발현되는 것으로 확인되었다.
실시예 13: 분리 배양된 유사 중간엽 줄기세포의 세포 용해물 및 배양 상층액의 단백체 분석
실시예 1과 2에서 제조된 유사 중간엽 줄기세포의 세포 용해물(Cell lysate)과 배지에 대해 L507 antibody array를 활용하여 증감되는 단백체를 분석하였다.
구체적으로, 유사 중간엽 줄기세포와 골수 유래 중간엽 줄기세포의 세포용해물 및 배양 상층액의 단백질 조성을 비교하기 위하여 반정량적인 단백질 antibody array chip인 L507(RayBiotech)을 이용하였다. 세포 용해물 및 배양 상층액은 total RNA를 수득하는 시점에 함께 수득 되었다. L507 칩은 biotin labeling 기반으로 507종의 단백질을 분석하는 방식으로서, 유사 중간엽 줄기세포의 단백질 분석을 위하여 선택되었다. 분석을 위하여, 세포 용해물 및 배양 상층액의 단백질을 추출하였다. 그리고, BCA protein assay kit(Abcam)를 이용하여 단백질을 정량하였다(50 내지 200 μg 범위). 정량된 단백질은 동일한 양으로 분주되어 biotin labeling 되었다. 그리고, protein hybridization 되었다. Hybridization에 의한 형광 이미지는 streptavidin-cyanine3 conjugate를 이용하여 시각화 되며, GenePix 4100A Microarray Scanner (Molecular Devices)로 스캔되었다. 모든 데이터는 edgeR을 이용하여 quantile normalization 되었다. 그리고, GenePix Pro 7.0 software (Molecular Devices)를 이용하여 분석되었다. 모든 데이터는 유사 중간엽 줄기세포와 골수 유래 중간엽 줄기세포의 비교를 위하여 분석되었으며, 그 결과는 도 18, 도 19, 도 20 및 도 21에 나타냈다.
도 18과 같이, 유사 중간엽 줄기세포 용해물 단백체를 분석하였다. 유사 중간엽 줄기세포는 Angiopoietin-4 (ANGPT4), BMPR-1B(bone morphogenic protein receptor 1B), HCR(human chemokine receptor), Activin B, Activin RII, CCR1, ICAM-2(Intracellular adhesion molecule 2)를, 골수 유래 줄기세포 대비 약 2배 이상 높게 발현하였다. 반면, 도 19과 같이, Angiogenin(ANG), Angiopoetin-1(ANG-1), Angiopoetin-2(ANG-2), Bone morphogenic proteins receptor1A(BMPR1A), CXCR6(CXC-chemokine receptor6)를 포함한 15종 단백체는, 유사 중간엽 줄기세포에서 골수 유래 중간엽 줄기세포 대비 약 2배 낮게 발현되었다.
한편, 도 20과 같이, 배양 상층액에 대한 단백체를 분석하였다. 유사 중간엽 줄기세포는, GRO-a, IL-15R alpha, FasL, Activin RII, BMP-2, CCR2, CXCL14, FGFR4를 골수 유래 줄기세포에 비하여, 약 2배 이상 높게 분비하였다. 도 21과 같이, 유사 중간엽 줄기세포는, TIMP-2(Tissue inhibitor of methalloproteinases-2), ActivinA, VEGFA(Vascular endothelial factor), FSTL1(Follistantin-like 1), ErB4, Thrombospondin-1등은 낮게 발현하였다.
이상과 같이 실시예들이 비록 한정된 도면에 의해 설명되었으나, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기를 기초로 다양한 기술적 수정 및 변형을 적용할 수 있다. 예를 들어, 설명된 기술들이 설명된 방법과 다른 순서로 수행되거나, 및/또는 설명된 구성요소들이 설명된 방법과 다른 형태로 결합 또는 조합되거나, 다른 구성요소 또는 균등물에 의하여 대치되거나 치환되더라도 적절한 결과가 달성될 수 있다.
그러므로, 다른 구현들, 다른 실시예들 및 특허청구범위와 균등한 것들도 후술하는 청구범위의 범위에 속한다.

Claims (16)

  1. 유사 중간엽 줄기세포의 제조방법으로,
    (a) 세포주 확립 후 70 계대 이하 배양된 인간 전분화능 줄기세포를 준비하는 단계;
    (b) 상기 인간 전분화능 줄기세포를 분화 유도한 배상체 중 낭성 배상체를 선별하는 단계;
    (c) 상기 낭성 배상체를 세포투과성 3차원 배양삽입체 상에 로딩하여 유사 중간엽 줄기세포를 분리하는 단계;
    (d) 상기 세포투과성 3차원 배양삽입체를 투과한 세포 중 단층(monolayer) 형태의 세포 군집만을 분리하는 단계; 및
    (e) 상기 단층 형태의 세포 군집을 가로와 세로 각각 100μm ~ 500μm 의 크기로 균일화하여 유사 중간엽 줄기세포를 배양하는 단계;
    를 포함하고,
    상기 유사 중간엽 줄기세포는, 항염증 효능과 면역억제능을 가지고, CD90 및 SOX2를 95% 이상 발현하는, 유사 중간엽 줄기세포의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 세포투과성 3차원 배양삽입체는, 나일론, 섬유, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 그래핀, 티타늄, 구리, 니켈, 은, 금 및 백금으로 이루어지는 군 중 어느 하나 이상으로 이루어지는, 유사 중간엽 줄기세포의 제조방법.
  3. 제1항의 제조방법에 의해 제조된 인간 전분화능 줄기세포 유래 유사 중간엽 줄기세포에 있어서,
    상기 유사 중간엽 줄기세포는, 골수 유래 중간엽 줄기세포에 비해 MMP-1 단백질 및 HGF 단백질을 고발현하고, 골수 유래 중간엽 줄기세포에 비해 CD95를 저발현하고, CD90 및 SOX2를 95% 이상 발현하는 것을 특징으로 하는, 유사 중간엽 줄기세포.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 유사 중간엽 줄기세포는, 골수 유래 중간엽 줄기세포에 비해 상기 MMP-1 단백질을 15배 이상 고발현하고, HGF 단백질을 2배 이상 고발현하는, 유사 중간엽 줄기세포.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 유사 중간엽 줄기세포는, 골수 유래 중간엽 줄기세포에 비해 CD95를 15배 이상 저발현하는, 유사 중간엽 줄기세포.
  6. 제3항에 있어서,
    상기 유사 중간엽 줄기세포는, 골수 유래 중간엽 줄기세포에 비해 염증조절 유전자를 2배 내지 100 배 이상 고발현하고,
    상기 염증조절 유전자는, Gata3, Adora2a, Gps2, Psma1, Pbk, Lrfn5, Cdh5, Apoe, Foxf1, Tek, Cx3cl1, Ptger4, Acp5, Bcr, Socs5 및 Mdk으로 이루어지는 군 중 어느 하나 이상인, 유사 중간엽 줄기세포.
  7. 제3항에 있어서,
    상기 유사 중간엽 줄기세포는, Gata3, Adora2a 및 Gps2 유전자를 동시에 발현하는, 유사 중간엽 줄기세포.
  8. 제3항에 있어서,
    상기 유사 중간엽 줄기세포는, 골수 유래 중간엽 줄기세포에 비해 면역억제능 유전자를 2배 내지 100배 이상 고발현하고,
    상기 면역억제능 유전자는 Gata3, Gps2, Psma1, Apoe, Foxf1, Tek, Cx3cl1, Ptger4, Bcr, Socs5 및 Mdk 중 어느 하나 이상인, 유사 중간엽 줄기세포.
  9. 제3항에 있어서,
    상기 유사 중간엽 줄기세포는, Gata3, Gps2 및 Psma1 유전자를 동시에 발현하는, 유사 중간엽 줄기세포.
  10. 제3항의 유사 중간엽 줄기세포를 포함하는 치료제 조성물로서,
    상기 치료제 조성물은, 세포치료제 조성물, 세포유전자치료제 조성물, 조직공학치료제 조성물, 항염증치료제 조성물, 면역치료제 조성물, 암의 예방 또는 치료용 조성물 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 치료제 조성물.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 치료제 조성물은, 상기 유사 중간엽 줄기세포로부터 분비되는 유효성분 또는 엑소좀을 더 포함하는, 치료제 조성물.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서,
    상기 치료제 조성물은, 다발성경화증, 전신경화증, 급성 심근경색, 만성 심근경색, 만성 폐질환, 급성 폐질환, 크론병, 변실금, 이식편대숙주질환, 하지허혈질환, 버거씨병, 족부궤양, 루프스, 루마티즘성 관절염, 급성 및 만성 신우염, 염증성 방광염, 간질성 방광염, 저활동성방광, 과민성방광, 오십견, 회전근개손상 및 파열, 다양한 운동 등으로 인해 발생되는 근골격계 손상, 무릎연골손상, 이명증, 아토피성 피부염, 건선, 화상으로 인한 피부손상, 자외선 등으로 인한 피부손상, 망막병증을 포함하는 염증성 및 면역계 질환의 예방, 허혈성치매, 알츠하이머치매, 척수손상, 파킨슨씨병 및 중추신경계질환으로 이루어지는 군 중 어느 하나 이상의 질병의 예방 또는 치료를 위한 것인, 치료제 조성물.
  13. 제3항의 유사 중간엽 줄기세포를 포함하는 전달체로서,
    상기 전달체는, 약학적 조성물을 담지하는 것을 특징으로 하는, 전달체.
  14. 제3항의 유사 중간엽 줄기세포로부터 분비되는 유효성분 또는 엑소좀을 포함하는, 질병의 예방 또는 치료용 조성물.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 질병은 다발성경화증, 전신경화증, 급성 심근경색, 만성 심근경색, 만성 폐질환, 급성 폐질환, 크론병, 변실금, 이식편대숙주질환, 하지허혈질환, 버거씨병, 족부궤양, 루프스, 루마티즘성 관절염, 급성 및 만성 신우염, 염증성 방광염, 간질성 방광염, 저활동성방광, 과민성방광, 오십견, 회전근개손상 및 파열, 다양한 운동 등으로 인해 발생되는 근골격계 손상, 무릎연골손상, 이명증, 아토피성 피부염, 건선, 화상으로 인한 피부손상, 자외선 등으로 인한 피부손상, 망막병증을 포함하는 염증성 및 면역계 질환의 예방, 허혈성치매, 알츠하이머치매, 척수손상, 파킨슨씨병 및 중추신경계질환으로 이루어지는 군 중 어느 하나 이상인, 질병의 예방 또는 치료용 조성물.
  16. 제3항의 유사 중간엽 줄기세포로부터 분비되는 유효성분 또는 엑소좀을 포함하는, 화장료 조성물.

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