HU200696B

HU200696B - Process for producing combined vaccine

Info

Publication number: HU200696B
Application number: HU871719A
Authority: HU
Inventors: Heinrich Dieter Luetticken; Eric Onno Rijke; Nicolaas Visser
Original assignee: Akzo Nv
Priority date: 1986-04-21
Filing date: 1987-04-17
Publication date: 1990-08-28
Also published as: ZA872532B; DE3786301D1; CA1287579C; US4788056A; DK196687A; EP0246680A1; DK196687D0; DE3786301T2; ES2058100T3; HUT43792A; JP2536751B2; EP0246680B1; JPS62267239A

Description

A találmány tárgya eljárás állatállomány immunizálására szolgáló kombinált vakcina előállítására.

A nagyüzemi állattenyésztő telepeken különösen fontos a vakcinálás ahhoz, hogy az állatállományt egészségesen tartsák.

Fokozottan érvényes ez az intenzív állattenyésztés körülményei között, amely nagy állomány sűrűséggel jár, ahol a vírus-, bakteriális- vagy parazita-fertőzés rövid időn belül az egész állományra kiterjedhet, és ez gyakran katasztrofális következményekkel jár.

Ezért, a fertőzés megelőzésére az állatállományt vákcinálják, például külön-külön többek között Escherichia coli (E. coli) fertőzéssel és herpesz vírus fertőzéssel, így az „Aujeszky kór-ként is megnevezett álveszettséggel (pseudorabies) szemben.

Az említett vakcinálást általában immunogén anyagnak élő (legyöngített vagy nem legyöngített) vagy elölt patogén formájában való beadásával végzik.

Gazdasági szempontból nyilvánvalóan vonzó, ha 20 az immunogén anyagot a különböző patogénekből kombinált egyetlen vakcinaként készítik el és ezt az egy vakcinát adják be.

Nem találták azonban lehetségesnek olyan kombinált vakcina készítését, amely stabil immunizáló ak- 25 tivitással bír mind az E. coli, mind a herpesz vírus okozta kórokkal szemben, és amely vakcina friss E. coli anyag és herpesz vírus anyag egyszerű egymáshoz adásával előállítható.

Nem várt módon azonban azt találtuk, hogy az 30 ilyen kombinált vakcina valójában előállítható.

A találmány tárgya ennek megfelelően olyan kombinált vakcina előállítása, amellyel egyidejűleg lehet végrehajtani az E. colival és a herpesz vírussal szembeni immunizálás végrehajtást

Közelebbről, a találmány szerint előállított vakcina immunogén E. coli anyagot és herpesz vírus anyagot tartalmaz, amelyek közül legalább az E. coli nem kívánt enzimaktivitása gátolt vagy döntően hiányzik.

Nem várt módon azt találtuk, hogy a kombinált 40 vakcinában jelen lévő vírus anyag immunogén aktivitása jelentősen megnövekszik akkor, ha az enzimaktivitást a két vakcinakomponens kombinálása előtt, alatt és/vagy után eltávolítjuk.

Ez valószínűleg különösen az E. coli anyagában 45 jelen lévő enzimek aktivitásával van összefüggésben. Anélkül, hogy biztonsággal megbízható magyarázatot tudnánk adni, azt feltételezzük, hogy a kombinált vakcina immunogén hatását főként az E. coli anyagából adódó proteolitikus enzimaktivitás érinti károsan. 50

Az E. coli anyaga, és kívánt esetben a vírus anyaga is enzimaktivitástól mentessé vagy lényegében mentessé tehető a kombinált vakcina készítését megelőzően. Ezt aktív vagy passzív úton érhetjük el.

Az enzimaktivitás passzív eltávolítása úgy törté- 55 rák, hogy a kombinált vakcina készítésére szánt E. coli anyagot önmagában megfelelően hosszú ideig tároljuk. Megfelelő például a 2-4 hét körüli tárolási idő 4 ’C körüli hőmérsékleten. Az előzőekben említett lehetséges magyarázattal összhangban arra követkéz- 60 telhetünk, hogy a tárolás alatt egy öregedési folyamat zajlik le, amelynek során a proteolitikus enzimek inaktiválódnak. Lehetőség van arra is, hogy az anyagot aktívan mentesítsük az enzimaktivitástól, például először az elkülönített anyagokat lényegében mentesít- 65 jük az enzimaktivitástól például kicsapással, (oszlop)kromatográfiás eljárással, centrifugálással, elektroforézissel vagy más biokémiai vagy mikrobiológiai elválasztási és tisztítási eljárásokkal vagy enziminhi5 bitor adagolásával az anyagot kellő ideig tárolva, nagy koncentrációjú idegen fehérje adagolásával például szénán vagy szérum fehérjék formájában vagy az enzimek denaturálásával.

Másképpen, vagy az előzőek mellett úgy is eljár10 hatunk, hogy az enzimaktivitást a kombinált vakcina készítése során vagy közvetlenül azt követően szűntetjük meg vagy csökkentjük jelentősen, például oly módon, hogy enziminhibitort vagy nagy koncentrációjú idegen fehérjét adunk a készítményhez vagy biokémiai vagy mikrobiológiai elválasztási módszerekkel vonjuk el az immunogén anyagokból az enzimaktivitást.

A találmány tárgyát különösen az olyan kombinált vakcinák előállítása képezi, amelyekben herpesz vírusként álveszettség vírus vagy marha herpesz vírus van.

Megfelelő enzimintúbitorok például az N-etil-maleimid, a monojód-acetát, a monojód-acetamid, a Trasylol, az EDTA, a fenil-metánszulfonil-fluorid (PMSF) és a tripszininhibiíorok, például az ún. „szójababn tripszininhibitor.

A vakcinához vagy a vakcinakomponensekhez adható megfelelő fehérjék például a szérumfehérjék, amelyeket az előzőekben már említettünk, teljes szérum vagy annak egyes komponensei formájában — például a szérum albuminok —, a tejfehérjék vagy a tojás fehéijéi.

A találmány szerint előállított vakcinákban E. coli vagy E. coli variánsok (spontán vagy indukált muE. coli) elkülönített antigén frakcióját alkalmazzuk. Sertés vakcina esetén például az alkalmazott antigén frakció az ún. K88-csilló antigént tartalmazza. Természetesen ilyen eltérő mikroorganizmusokkal előállított E. coli antigének is használhatók, amely mikroorganizmusok genetikai anyaga rekombináns eljárással olyképpen módosított, hogy kívánt esetben a mikroorganizmus megnövelt hozammal képes E. coli antigént termelni.

A találmány szerint előállított vakcina herpesz vírus anyaga előlt vagy élő, kívánt esetben legyöngített vírust tartalmaz, amelynek patogenitását és/vagy virulenciáját lecsökkentjük vagy megszűntetjük, adott esetben spontán vagy indukált mutációval vagy rekombináns DNS eljárással. Adott esettben az is lehetséges, hogy a kombinált vakcinában izolált immunogén vírus-anyagot alkalmazzunk.

Lehetséges például a találmány szerint olyan kombinált vakcina előállítása, amelyet sertésnek beadva egyidejűleg immunizálja a sertés utódait sertés hasmenés és álveszettség-vfrus vertőzés ellen.

A találmány szerint előállított vakcina az immunogén anyagon kívül a következő komponenseket tartalmazhatja:

— stabilizálószerek;

- segédanyagok, így alumíniumsók például A1(OH)3, AIPO4, Ah(SO4)3; cüD(PO4)2; szaporán; DDA [dimetil-dioktadecil-ammónium-bromid MW630, Kodak gyártmány; vakcinákban általában nedvesítőszerként és segédanyagként alkalmazzák

-2HU 200696 Β (Gall, D., Immunology H, 369, /1966/)], Ptoonic nemionos felületaktív szerek [BASF gyártmány, poIRoxi-etíléo) és poli(oxi-propilén) kopolimeijei egy OH(CHiKlW)y(CH-CH2O)x(CH2CH2O)yH

CH3 5 általános képletű, 1000-16000 molekulatömegű — x= 15-80, y= 0,5-230 — vegyülettel (Schmolka,

IR.; J. Am. Oü Chem. 110/1977/)]; Avridin (Pfizer gyártmány,N,N-diokIackcil-N,N-bisz(2-hidroxietü)-propán-diamin/Niblack, J.F.; J.Retkuloendot- 10 hel. Soc. 26, 655, /1979/); olaj a vizben típusú emulziók, kívánt esetben E vitaminnal, Ptoonic nemionos felületaktív szerekkel, avridinnel, dextrán-szulfáttal vagy hasonló anyagokkal együtt; víz az olajban típusú emulziók kívánt esetben Macollal (Marcol 52 az 15 Exxon cég gyártmánya, erősen finomított igen tiszta ásványolajok sora, amelyek az Amerikai Egyesült Államok gyógyszerkönyvének megfelelő minőségűek, az 52 szám a tennék fajlagos sűrűségét és viszkozitását jelöli), Polysorbat 80-nal (polioxi-etilén)- 20 szorbitán-mooo-9-oktadekanaát nemionos emulgeáló- és diszpergálószer, M= 428), poli(szorbitán-monooleál)-tal, szaponinnal; migliollal (Miglyol 812, a Dynamit Nobel cég terméke, frakciónál! kókuszdióotaj, M= 511, 8-10 szénatomoe zsírsavak elegye), 25 izopropil-mirisztáttal, izopropil-palmitáttal és hasonló anyagokkal együtt, vagy kapszulák formájában például zselatin vagy hidroxi-propil-metil-cellulóz kapszulák szaponinnal vagy anélkül;

- pufferek, így foszfát puffer, hidrogén-karbonát 30 puffer vagy írisz puffer, amelyek előnyösen 5-100 mől/l-esek;

1. Táblázat

- tartósítószerek, így tiomerzál, m- vagy o-krezo) (előnyösen 02-0,5% mennyiségben) vagy benzil alkohol (előnyösen 1-2% mennyiségben).

A kővetkezőkben a találmányt példákban mutatjuk be.

1.Példa

Annak érdekében, hogy meghatározzuk a kezeletlen E. coli antigén álveszettség vírusra gyakorolt negatív hatását, megmértük az álveszettség vírus fertőzőképességét azonos térfogatú E coli antigén jelenlétében.

Az E. coli antigént a következő módon állítjuk elő: E. colit tenyésztünk szokásos körülmények mellett kazán hidrolizáiumot és szorbitot tartalmazó tápközegben, a fermentorban az oxigénadagolást, a keverési intenzitást és a pH-t folyqamatosan állítva.

óra tenyésztés irtán a tenyésztést megszűntetjük, a fermentlevet 15 percen át60-65 *C hőmérsékleten tartjuk, majd lehűtjük és centrifugáljuk. A felülúszőban lévő antigént ultraszűréssel betöményítjük. A kapott antigén koncentrátumot 0,5% formaiin jelenlétében 16 órán át 37 'C-on tartjuk.

A frissen készített E. coli antigént az álveszettség vírussal 1 (kán át 37 ’C-on inkubáljuk, majd a vírust egyrétegű Verő sejteket tartalmazó mikrotiter lemezen 10-szeres hígításban titráljuk. A vfrus litert a talált citopatogén hatásból (CPE-kbőI) számítjuk.

Eredményeinket az 1. táblázatban ismertetjük. Az eredményekből látható, hogy az E coli anyag jelentős hatást fejt ki az álveszettség vfrus fertőzőképességére.

A vizsgálat sorszáma	Álveszettség vírus (ml)	E.coli ml	antigén típus	OoP^nl)	ÁTiter a kontrolihoz hasonlítva .
1.	0,5			527
2.	0,5	0,5	K88ab	3,05	222
3.	0,5	0,5	K88ac	2,53	2,74
4.	0,5	0,5	K99	4,79	0,48

2. Példa

Az E. coli és álveszettség vfrus kombináció hatása az álveszettség elleni védelemben az E. coli antigén (előkezelésével vagy anélkül

A példa azt igazolja, hogy a találmány szerinti kezelések nélkül az álveszettség antigén és E. coli antigén kombinációja nem eredményez hatásos vakcinakombinációt. Az álveszettség antigén hatásosságát egeret védő hatásával mérjük.

C 57 bllO törzsbe tartozó egereket vakcinátok csökkenő mennyiségű, 100,25, illetve 625 μΐ vakcinával, majd 4 hét múlva virulens álveszettség vírus törzzsel, a Phylaxia törzzsel fertőzzük meg őket Ennek eredményéből meghatározzuk az 50%-os védettséget nyújtó dózist (PDso). A vizsgálatok eredményét a 2. táblázatban ismertetjük.

-3HU 200696 Β

2. Táblázat

Gyártási szám	Álveszettség antigén	_E-_coli LTK88	Kezelés	PD50 (μΐ-ben)	Megjegyzés
3592	40%	5%	nincs	150	elvetve (250)
3633	40%	—	nincs	25,0	jó
4508	41%	4%	nincs	119,0	elvetve (^50)
4509	41%	—	10% marhaszérum	10,7	j<X<50)
4510	41%	4%	10% marhaszérum	28,0	jó(<50)
5087	25%	—	nincs	12,9	jó(S50)
5089	25%	12%	4% marhaszérum	40,7	jó(S50)
5091	25%	12%	200 egység trasyW	19,1	jó(á50)

Az eredményekből nyilvánvalóan látható, hogy az E. coli antigén kezelése nélkül a vakcina nem elégíti ki az álveszettség elleni vakcinával szemben támasztott követelményeket (PD50 £ 50 μΐ).

A találmány szerinti kezelés alkalmazását követően a kombinált vakcina kielégíti a fenti követelményt

3. Példa

Enziminhibitorok alkalmazása E. coli — álveszettség kombinált vakcinában

Az endogén proteáz-aktivitásokat különféle enziminhibitorok alkalmazásával számoljuk fel. Az alkal20 mázott inhibitorok példaként szolgálnak, nem zárják ki más inhibitorok alkalmazását

Az antigénnek az inhibitorok alkalmazását követően meglévő aktivitását standard ELISA teszttel mérjük. Eredményeinket a 3. táblázatban mutatjuk be.

3. Táblázat

Sorszám	Álveszettség antigén	E.coli antigén	Kezelés	ELISA eredmény % a kontrolihoz hasonlítva (N)
1.	+		—	101,0% (5)
2.	-	+	—	0% (3)
3.	+	+	—	53,0% (3)
4.	+	+	PMSF 5 mmól/1	92,9% (5)
5.	+	+	NMI 5 mmól/1	102,9% (4)
6.	+	+	MIA5mmóVml	93,9% (3) .
7.	+	+	TRAS 500 E/ml	94,5% (3)
8.	+	+	TI 3,7 mg/ml	97,5% (4)
9.	+	+	EDTA 45 mmól/1	95,3% (3)
10.	+	+	öregítés	102,5% (10)

PMSF: fenil-metánszulfonil-fluorid

NMI: N-ettl-maleimid

MIA: monojód-acetamid

TI: tripszin-inhibitor (szójabab)

TRAS: Trasylol = Aprotinin:proteáz-inhibitor

EDTA: etilén-diamin-tetraecetsav

Afenti enziminhibitorokkal az antigén anyagot éjszakán át 4 *C hőmérsékleten, pH 7,0 ±05 értéken kezeljük.

Atz Öregítést4 héten át 4 ’C hőmérsékleten tartással végezzük.

A 2. és 3. példában leírt kezeléseket külön E. coli antigén anyagon végezzük.

A fenti kezelésekkel az antigén anyag lényegében enzimmentessé vált

Kezelés nélkül az álveszettség antigén mérhető mennyisége 53%-ra csökken. A különböző — a 3. táblázatban feltüntetett — kezeléseket követően az antigénmennyiség legalább 93%-a megmarad (ezzel a teszttel mérve).

4. Példa

E. coli antigén találmány szerinti kezelése „öregítéssel

6-8 hetes Swiss albínó egereknek intramuszkulá50 risan különböző dózisú, 4,16, illetve 64 μΐ a 3. példában megadott módon öregített vakcinát adunk be. Ezt követően 4 héttel az állatokat a 2. példában ismertetett módon megfertőzzük. A vakcina álal kifejtett védőhatást azzal a dózissal fejezzük ki, amely 50%55 os védelmet nyújt (PDso). Az elfogadható vakcinával szemben támasztott követelmény az, hogy a PDso £ 50 μΐ értéknek feleljen meg.

Az E. coli komponens kiváltotta antitesteket a fenti egerek szérumában az antitest titer megállapítására szolgáló standard ELIS A teszttel mérjük. Minden érték hat szérumból mért eredmény átlaga. Eredményeinket a 4. táblázatban mutatjuk be.

-4HU 200696 Β

4. Táblázat

Gyártási szám	Álveszettség antigén	ILfioli antigén	PD»	Anti E. coli LT	ti tér (16 μΐ dózis) logzELISA K88ab K88ac	K99	987P
6704	+		5.4
6705	+		11,9
6706	+		193
6707		+		6,8	10,8	103	83	113
6708		+		6,5	10.8	103	8,8	113
6709		+		7,3	11,7	123	10,0	11,7
6710	+	+	16,1	63	123	123	9,0	123
6711	+	+	8,9	73	123	123	93	123
6712	+	+	23,6	73	113	11,7	9,0	123

A kombinált vakcina és az önmagában külön lévő 20

E. coli vakcina E. coli komponensre adott antitest titer értékei összemérhetők egymással. Az egerek álveszettség elleni védelmét ellenőrző vizsgálat alapján a kombinált vakcina kielégíti a követelményeket

Claims

1. Eljárás állatállomány immunizálására szolgáló kombinált vakcina előállítására, azzal jellemezve, bogy E. coli aktív immunogén anyagát és herpesz ví- 30 rus immunogén anyagát kombináljuk, legalább az E. coli immunegén anyagát enzimaktivitástól lényegében mentessé tesszük, és ldván esetben az immunogén anyagot a vakcinák készítésénél szokásosan használt stabilizálőszerek, segédanyagok, pufferoló 35 anyagok és tartósítószerek közül eggyel vagy többel elegyítjuük.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az E. coli anyagot és kívánt esetben a vírus anyagát a kombinálás előtt, alatt vagy után lényegé- 40 ben enzimaktivitástól mentessé tesszük.

3. Az 1-2. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az enzimaktivitás inaktiválását a következő eljárások közül eggyel vagy többel végezzük

a) az E. coli anyagot önmagában a benne lévő proteolitikus enzimek inaktiválódásáig tárolják,

b) az E. coli anyagból a benne lévő proteolitikus enzimeket a molekulatömeg, az elektromos töltés vagy a kötési jellemzők különbözősége alapján különítik el,

C.) enriminhihitnrt alkalmaznak,

d) az enzimeket denaturálják,

e) fehérje-anyagot adagolnak.

4. A3. igénypont szerinti eljárás, azzaljellemezve, hogy az enzimaktiválást az N-etil-maleimid, monojód-acetát, mooojőd-acetamid, trasylol, etilén-diamin-tetraecetsav, fenil-metán-szulfonil-fluorid inhibitorok és a tripszingátlók közül legalább egynek az alkalmazásával végezzük.