JPH09509415A - ワクチンアジュバントとしてのプロラクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、感染性疾病ワクチンに対する動物の免疫応答を増強するための組成物であって、プロラクチンからなる組成物に関する。好ましくは、該組成物はヒト・プロラクチンであり、ワクチン接種される動物もまたヒトである。さらに本発明は、感染性疾病ワクチンに対する動物の免疫応答を増強するための組成物であって、プロラクチンｃＤＮＡからなる組成物に関する。ヒト・プロラクチンｃＤＮＡが好ましい。

Description

【発明の詳細な説明】 ワクチンアジュバントとしてのプロラクチン発明の背景 ヒト、農業用家畜、スポーツ用動物および家庭のペットにおける疾病を予防す るためのワクチンの使用は通常の慣習であり、この慣習を拡張してこれらの患者 が対象となっているより広範な疾病をカバーするためにかなりの努力がなされて きたし、なされている。例えば、動物におけるウサギのワクチンの使用は、現在 では珍しくないことであり、他の疾病に対して動物を免疫するための適当なワク チンを得るための努力がなされている。 活性な免疫を行う過程においてしばしば出くわす１の問題は、引き続いておこ る攻撃に対する防御を提供し、あるいはこれらのレベルを長期間にわたり保持す る能力を維持するほど十分に抗体力価を上昇させるには、ワクチンに使用される 抗原が十分に免疫原性でないということである。もう１つの問題は、ワクチンが 、細菌およびウイルス感染に対する１次免疫防御である細胞により媒介される免 疫を包含することにおいて欠点を有する可能性があるということである。 より強力な体液性および／または細胞性応答を得るために、ワクチンに対する 患者の応答を増強する物質であるアジュバントを含有する処方としてワクチンを 投与することが通常行われている。最もよく使用されているワクチン用アジュバ ントは油性調製物およびアラムである。かかるアジュバントが機能する機構は理 解されておらず、特定のアジュバント調製物が一定の例において十分に有効であ るか否かは予想できない。 さらに、遺伝子治療の出現に伴い、遺伝子または「裸のＤＮＡ」をワクチンと して用いていくつかの成功が成し遂げられたことが報告されている。しかしなが ら、いくつかの慣用的ワクチンについては、得られた免疫応答は免疫感作を生じ させるには不十分であった。 したがって、一般的には動物用の、特にヒトにおけるワクチンを有効ならしめ るに適したさらに有効なアジュバント調製物に対する必要性がある。発明の概要 本発明は、感染性疾病ワクチンに対する動物の免疫応答を増強するための組成 物であって、プロラクチンからなる組成物に関する。好ましくは、該組成物はヒ ト・プロラクチンであり、ワクチン接種される動物もまたヒトである。 さらに本発明は、感染性疾病ワクチンに対する動物の免疫応答を増強するため の組成物であって、プロラクチンｃＤＮＡからなる組成物に関する。ヒト・プロ ラクチンｃＤＮＡが好ましい。 もう１つの態様において、本発明は、ワクチンとともに有効量のプロラクチン またはプロラクチンｃＤＮＡを同時投与することからなる、感染性疾病ワクチン に対する対象動物の免疫応答を増強する方法に関する。図面の簡単な説明 図１は、プロラクチン蛋白に関するアミノ酸配列を示す。 図２は、プロラクチンｃＤＮＡに関する核酸配列を示す。 図３は、ＢＳＡのみまたはＢＳＡ＋プロラクチンで免疫されたラットのウシ・ 血清アルブミン（ＢＳＡ）特異的抗体応答を示すグラフである。 図４は、ＢＳＡ＋プロラクチンに対してＢＳＡのみを与えられた４匹のラット 間における、１０１日目の時点におけるラット・ＰＢＬのＢＳＡ特異的増殖応答 の比較を示すグラフである。発明の詳細な説明 定義 本明細書に用いる「プロラクチン」は、組織培養から得られる、あるいは組み 換え法ならびに当業者に知られた他の方法により得られるポリペプチドであって 、この蛋白を特徴づけている活性スペクトルを示すポリペプチドをいう。該用語 は ヒト・プロラクチン（ｈＰＲＬ）のみならず、例えば、マウス、ラット、ウサギ 、霊長類、ブタおよびウシ・プロラクチンのごとき他の哺乳動物のプロラクチン も包含する。組み換えｈＰＲＬのアミノ酸配列を図１に示す。本発明においては 該組み換えＰＲＬ（ｒ−ＰＲＬ）が好ましい。 ｒ−ＰＲＬと呼ばれる「組み換えプロラクチン」は、好ましくはヒトプロラク チンであり、当業者により知られた組み換えＤＮＡ法により調製される無処理の プロラクチンに匹敵する生物学的活性を有するプロラクチンをいう。一般的には 、プロラクチンをコードする遺伝子をその無処理のプラスミドから切り出し、ク ローン化されるべきクローニングベクター中に挿入し、宿主生物の形質転換に用 いる。宿主生物は外来遺伝子を発現して発現条件下でプロラクチンを生産する。 本明細書の用語「アジュバント」はその慣用的な意味、すなわち、特定の抗原 に対する免疫応答を増強する能力という意味を有する。かかる能力は、免疫によ り媒介される防御の有意な増大により明白にされる。さらにそのうえ、用語「遺 伝学的アジュバント」は、上記定義のプロラクチン蛋白をコードするＤＮＡ配列 に相補的な配列からなるプロラクチンｃＤＮＡをいう。プロラクチンｃＤＮＡに 関する配列を図２に示す。一般的方法 最も慣用的には、筋肉内もしくは皮下注射または腹腔内注射によりアジュバン ト目的のプロラクチンを含有する処方を投与するが、他の投与方法も可能である 。 標準的な処方は液体で注射可なものであるかまたは適当な液体中に入れて注射 用懸濁液もしくは溶液とすることのできる固体のいずれかである。適当な賦形剤 は、例えば、水、セイライン、デキストロース、グリセロール、エタノール等で ある。湿潤剤、バッファーまたは乳化剤のごとき無毒の添加物を添加してもよい 。 持続的および連続的放出処方はかなりの種類があり、当業者により理解される ように、本発明方法において使用することができる。 プロラクチンをワクチンとは別に、あるいはワクチンと混合して投与すること ができる。プロラクチンをワクチンと混合する場合には、投与される組成物は、 病原体または抗原に対する特異的応答を誘導することにおいて有効な免疫原、お よび医薬上許容されるワクチン担体ならびに免疫を有効ならしめる量のプロラク チンを含有する。通常には、ワクチンを製造者の説明書に従って投与することが できる。他のアジュバントをワクチンとともに、あるいはプロラクチンと一緒に 投与してもよい。 典型的には、プロラクチンは、動物またはヒトのワクチンによって与えられる 、「弱い」（すなわち、レベル、程度、および／または持続期間において低下し た防御を提供する）と見なされている防御を増強するために用いられるであろう 。かかるワクチンの例は、例えば、シュードモナス（Pseudomonas）のごときバ クテリン、スタフィロコッカス内毒素（Staphylococcal Enterotoxin）、ストレ プトコッカス（Streptococci）、サイトメガロウイルス、ＨＩＶ、ボルデテラ（ Bordetella）のバクテリン、エシェリシア・コリ（Escherichia coli）のバクテ リン、ヘモフィルス（Haemophilus）のバクテリン、レプトスピラ症ワクチン、 モラキサラ・ボビス（Moraxella bovis）のバクテリン、パスツレラ（Pasteurel la）のバクテリンおよびビブリオ・フェトゥス（Vibrio fetus）のバクテリン、 ならびにウシ・呼吸器疾患（感染性ウシ・鼻気管炎、パラインフルエンザ−３、 呼吸器合胞体ウイルス）のワクチン、ウシ・ウイルス性下痢ワクチン、ウマ・イ ンフルエンザワクチン、ネコ・白血病ワクチン、ネコ・呼吸器疾患（鼻気管炎− カリチ肺炎ウイルス）のワクチン、イヌ・バルボウイルスワクチン、伝達性胃腸 炎ワクチン、仮性狂犬病ワクチン、および狂犬病ワクチンのごとき弱毒化または 死滅ウイルス製品である。 さらに、プロラクチンは免疫原に対する免疫応答を増強し、それによりアジュ バントとしての機能を果たしうるということを示すインビトロおよびインビボで のデータを我々が示したので、プロラクチン遺伝子の外部からの投与はインビボ でのプロラクチンの発現を引き起こし、慣用的手段または遺伝子接種のいずれに より投与されたとしても免疫原に対するアジュバントとして機能しうると考えら れる。プロラクチンｃＤＮＡをＤＮＡ運搬ビヒクル（例えば、プラスミドベクタ ー、リポソーム、ウイルスベクター）中に挿入することにより「遺伝学的アジュ バント」を作ることができよう。ペレグリニ,アイ（Pellegrini I.）ら、モレキ ュラー・エンドクリノロジー（Molec.Endocrinilogy）、第６巻、１０２３頁（ １９９２年）、マニアティス,ティー（Maniatis T.）ら、モレキュラー・クロー ニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Molecular Cloning:A Laboratory Man ual）、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・プレス（Cold Spring Harbo r Press）（１９８９年）およびフェルガー,ピー（Felger P.）ら、プロシーデ ィングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Proc.Natl.Ac ad.Sci.）、第８４巻、７４１３頁（１９９１年）により記載されたようにして これを行うことができよう。次いで、「遺伝学的アジュバント」を、適当な運搬 ビヒクル中の免疫原をコードしているｃＤＮＡまたは「裸の」ｃＤＮＡ（すなわ ち、ｃＤＮＡ単独）のいずれかとともに投与する。さらに、「遺伝学的アジュバ ント」を免疫原自体とともに投与することができよう。免疫原に応じて注射順序 が最適化されよう。すなわち、プロラクチンｃＤＮＡを免疫原または免疫原ｃＤ ＮＡと同時投与するか、またはそれらの投与よりも先に、あるいはそれらの投与 に引き続いて投与することができよう。プロラクチンｃＤＮＡを同じ運搬ビヒク ル中に挿入することができると考えられる。種々の投与経路を用いることができ よう。実施例１ 組み換えヒト・プロラクチン（ｒ−ｈＰＲＬ）の同時***促進性 フィコール・パーク（Ficoll Paque）（ファルマシア（Pharmacia））上の密 度勾配遠心分離により末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を正常ヒト・志願者から単離し た。ヘパリン処理した血液をリン酸緩衝化セイライン（ＰＢＳ）で３倍希釈し、 ２０００ｒｐｍで２０分遠心分離した。赤血球ペレットの表面上に存在する、白 血球からなる軟層を集め、等体積のＰＢＳで希釈した。希釈軟層をフィコール・ パーク上に重層し（１５ｍｌチューブ中、４ｍｌのフィコール・パーク上に６ｍ ｌの軟層）、１４００ｒｐｍで３０分遠心分離した。フィーコール−血漿界面に 見られるＰＢＬ層を集め、ＰＢＳで細胞を３回洗浄した。次いで、ＰＢＬを、 ギブコ（Gibco）から得た無血清ＡＩＭ−Ｖ培地中に２ｘ１０⁶個／ｍｌとなるよ う再懸濁し、丸底９６ウェルマイクロタイタープレートのウェル中に１００μｌ の体積（２ｘ１０⁵個ＰＢＬ／ウェル）として添加した。 最適量以下の用量のＴ細胞***促進剤であるコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ；０ .２μｇ／ｍｌ）５０μｌを、種々の濃度のｒ−ｈＰＲＬ（最終濃度０〜１００ ０ｎｇ／ｍｌ）５０μｌと一緒にして添加した。培養を３系で行った。３７℃、 ５％ＣＯ₂で７２時間細胞をインキュベーションし、トリチウム化チミジンの取 り込みにより増殖量を測定した。トリチウム化チミジン（０.５μＣｉ／ウェル ）をインキュベーションの最後の１８時間において添加し、スカトロン（Skatro n）９６ウェルハーベスターを用いて細胞をガラス繊維フィルター上に集めた後 、細胞に伴う放射活性をシンチレーション計数により測定した。 異なる個体からの細胞について得られた結果が下表１に示されており、ｒ−ｈ ＰＲＬは最適濃度以下のＣｏｎＡに対するＴリンパ球の増殖応答を増強すること ができたことが示されている。この同時***促進活性は、１〜１０ｎｇ／ｍｌの ｒ−ｈＰＲＬ濃度で最もよく観察された。 実施例２ ｒ−ｈＰＲＬによる抗原特異的増殖の促進 特異的抗原に対するヒト・Ｔ細胞の増殖応答を促進するｒ−ｈＰＲＬの能力を 試験するために、種々の濃度のｒ−ｈＰＲＬおよび大部分の個体が曝露される共 通の抗原であるストレプトキナーゼとともにＰＢＬをインキュベーションした。 ９６ウェル丸底マイクロタイタープレートのウェル中で３系で培養を行い、培養 物は、ＰＢＬ１００μｌ（２ｘ１０⁵個／ウェル）、ストレプトキナーゼ５０μ ｌ（最終濃度２５μｇ／ｍｌ）および種々の濃度（０〜１０００ｎｇ／ｍｌ）の ｒ−ｈＰＲＬ５０μｌからなっていた。３７℃、５％ＣＯ₂で６日間培養した後 のトリチウム化チミジンの取り込みにより増殖を測定した。 表２に示す結果は、１ｎｇ／ｍｌの濃度のｒ−ｈＰＲＬはストレプトキナーゼ により誘導される増殖を有意に促進したことを示す。 実施例３ 免疫原に対する免疫応答を増強させるることにおけるプロラクチンの効果 ２４匹の体重１５０グラムのオスのスプラグーダウリー（Sprague-Dawley）ラ ットを４群に分けた。対照群にはアラムと混合した１０μｇのＢＳＡを腹腔内注 射した。他の３群には１８０μｇのプロラクチン、３７５μｇのプロラクチンま たは７５０μｇのプロラクチンのいずれかとともに、アラムと混合した１０μｇ のＢＳＡを腹腔内注射した。４週間にわたって毎週尾の静脈から採血し、放射性 免疫吸着アッセイ（ＲＩＡ）によりＢＳＡに対する抗体について血清を評価した 。４回目の採血後、アラムと混合された１０μｇのＢＳＡを動物に追加注射した 。７週間の期間にわたって尾の静脈から採血して血清を得て、ＲＩＡによりＢＳ Ａに対する抗体の生成について血清を評価した。ＢＳＡ±ｒ−ｈＰＲＬで免疫されたラット由来の末梢血リンパ球のウシ・血清ア ルブミン（ＢＳＡ）特異的増殖 ＢＳＡで免疫されたラットの細胞応答に対するｒ−ｈＰＲＬの効果を測定する ために、ブースター免疫後１０１日目に屠殺した個々の動物から血液を集めた。 末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を集めるために、血液試料をリン酸緩衝化セイライン （ＰＢＳ）で４倍希釈し、２０００ｒｐｍで２０分遠心分離した。軟層を集め、 Ｔｒｉｓ−塩化アンモニウム溶解バッファーを添加し、次いで、３７℃で１０分 インキュベーションすることにより混入している赤血球を除去した。次いで、Ｐ ＢＬをＰＢＳで２回洗浄し、１００μｇ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌス トレプトマイシン、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓバッファー、２ｍＭ Ｌ−グルタミン 、５ｘ１０^-5Ｍ ２−メルカプトエタノールおよび５％熱不活性化子ウシ胎児血 清を補足したＲＰＭＩ１６４０培地中に５ｘ１０⁶個／ｍｌとなるよう再懸濁し た。平底９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルにＰＢＬを１００μｌの 体積（５ｘ１０⁵個／ウェル）として添加し、培地のみ（バックグラウンド対照 ）の存在下または１００μｌの体積中に添加された１０００μｇ／ｍｌのＢＳＡ の存在下で培養を行った。培養を３系で行った。３７℃、５％ＣＯ₂で ５日間培養した後のトリチウム化チミジンの取り込みにより増殖を測定した。 結果は、相対的に見て、ＢＳＡ＋１８０μｇ ｔｈＰＲＬで免疫されたラット のＰＢＬは、抗原のみで免疫されたラットからのＰＢＬよりも高レベルのＢＳＡ 特異的増殖を示したことを示す。この観察結果は、ｒ−ｈＰＲＬが免疫化抗原に 対する免疫応答の細胞成分を増加させる作用をしうることを示唆する。結果を下 表３にまとめ、図５および図６に示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 14/575 Ａ６１Ｋ 37/38 ＡＤＺ Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ ＡＥＫ Ｃ１２Ｐ 21/02 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 モスチッキ，リチャード アメリカ合衆国02159マサチューセッツ州 ニュートン・センター、コモンウェル ス・アベニュー436番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．感染性疾病ワクチンに対する動物の免疫応答を増強するための組成物であ って、プロラクチンからなる組成物。 ２．プロラクチンがヒト・プロラクチンである請求項１の組成物。 ３．動物がヒトである請求項１記載の免疫応答を増強するための組成物。 ４．プロラクチンが図１（配列番号：１）のアミノ酸配列の全部または一部か ら選択されるアミノ酸配列からなる請求項１の組成物。 ５．感染性疾病ワクチンに対する動物の免疫応答を増強するための組成物であ って、プロラクチンｃＤＮＡからなる組成物。 ６．プロラクチンがヒト・プロラクチンｃＤＮＡである請求項５の組成物。 ７．動物がヒトである請求項５記載の免疫応答を増強するための組成物。 ８．ｃＤＮＡが図２（配列番号：２）のｃＤＮＡ配列の全部または一部から選 択されるｃＤＮＡ配列からなる請求項５の組成物。 ９．感染性疾病ワクチンに対する対象動物の免疫応答を増強する方法であって 、有効量のプロラクチンをワクチンと一緒に投与することからなる方法。 １０．プロラクチンがヒト・プロラクチンである請求項９の方法。 １１．動物がヒトである請求項９記載の免疫応答を増強するための方法。 １２．プロラクチンが図１（配列番号：１）のアミノ酸配列の全部または一部 から選択されるアミノ酸配列からなる請求項９の方法。 １３．感染性疾病ワクチンに対する対象動物の免疫応答を増強する方法であっ て、有効量のプロラクチンｃＤＮＡをワクチンと一緒に投与することからなる方 法。 １４．プロラクチンがヒト・プロラクチンである請求項１３の方法。 １５．動物がヒトである請求項１３記載の免疫応答を増強するための方法。 １６．プロラクチンが図２（配列番号：２）のｃＤＮＡ配列の全部または一部 から選択されるｃＤＮＡ配列からなる請求項１３の方法。