HRP20030652A2 - Method of treating of demyelinating diseases or conditions - Google Patents

Description

Pozadina izuma

Multipla skleroza (MS) je degenerativna i upalna neurološka bolest koja zahvaća središnji živčani sustav, a povezana je sa stvaranjem neuronskih plakova i poremećenim provođenjem impulsa kroz živac zbog demijelinizacije (gubitak mijelina). Slično tome, opsežna demijelinizacija se često vidi kod ozljede leđne moždine i cerebrovaskularnog inzulta (Bunge i sur., 1993; Blight i DeCrescito, 1986; Pendlebury i sur., 2000).

Osnovno proučavanje fiziologije širenja akcijskog potencijala u mijeliniziranim vlaknima pokazuje da je blok u provođenju kod demijeliniziranih vlakana djelomično nastao zbog pojave aminopiridin-osjetljivih kalijevih kanala na područjima gubitka mijelina (Bever 1996).

Akcijski potencijali se šire duž normalnih mijeliniziranih živčanih vlakana procesom salutatorne kondukcije, nastale zbog protoka natrija nastalog otvaranjem voltažnih natrijevih kanala u Ranvierovom čvoru. Na taj način, na početku električne stimulacije, natrijevi (Na+) ioni ulaze u neuron, dovodeći do njegove pozitivne nabijenosti. Kada pozitivni naboj neurona dosegne kritičnu razinu, dolazi do «depolarizacije».

Depolarizacija omogućava pozitivnim jezgrama iona da prolaze kroz neuron, uzduž aksona i u okončinu živca. Kako bi se neuron vratio u prethodno stanje, višak pozitivnog naboja mora biti uklonjen. To se postiže izlaskom kalijevih iona (kasnije «K+») kroz kalijeve kanale. Kada je mijelin prekinut, javljaju se na aksolemi voltažni kalijevi kanali koji se otvaraju prilikom depolarizacije. Protok kalija, suprotan protoku natrija, smanjuje amplitudu i trajanje akcijskog potencijala, uzrokujući na taj način poremećaj provođenja smanjenjem distalnih učinkovitih gustoća protoka. Navedeni poremećaji provođenja su povezani sa simptomima koji dovode do smanjenja sposobnosti, uključujući slabost mišića. Blokiranjem isticanja K+ kroz kalijeve kanale, neuron ostaje depolariziran duže vrijeme i lakše se ponovno stimulira. Zbog toga se vjeruje da su blokatori kalijevih kanala korisni u liječenju bolesti i stanja koja dovode do poremećaja prijenosa akcijskog potencijala, kao što su MS, Traumatska ozljeda mozga (kasnije «TBI») i ozljeda leđne moždine (kasnije «SCI»).

Blokatori kalijevih kanala, kao što je 4-amino piridin (kasnije «4-AP»), povećavaju trajanje i amplitudu akcijskog potencijala u demijeliniziranim vlaknima i poboljšavaju širenje potencijala in vitro (Bostock i sur, 1978; 1981; Targ i Kocsis, 1985; 1986; Shi i Blight, 1997), pospješuju otpuštanje neurotransmitora (Bostock i sur, 1981; Hirsh i Quandt, 1993; Sherratt i sur, 1980), i pospješuju mišićnu kontraktilnost (Agoston i sur, 1982; Savage i sur, 1985). Navedena zapažanja upućuju da blokatori kalijevih kanala, kao što je 4-AP, mogu uspostaviti provođenje u demijeliniziranim vlaknima kod bolesnika oboljelih od MS. Dobiveni rezultati u kliničkim ispitivanjima nadalje podupiru prijedlog da liječenje aminopiridinom poboljšava simptome kod nekih MS bolesnika (Jones i sur 1983; Stefoski i sur, 1987; Daviš i sur, 1990; van Diemen i sur, 1992; Bever i sur, 1994; Schwid i sur, 1997).

Za 4-AP je isto tako otkriveno da učinkovito djeluje na liječenje neuroloških stanja uključujući SCI, smanjenje kronične boli i spasticiteta kod SCI bolesnika, Alzheimerovu bolest, post-polio sindrom, mijasteniju gravis, Huntingtonovu bolest, poremećaje pamćenja vezane uz dob, post-traumatske, post-inzultne ili post-toksične sindrome koji utječu na pamćenje ili kognitivne sposobnosti, te disautonomiju (Wurtman RJ i Buyukuysal R, 1989; Hansebout RR i Blight A, 1996; Hansebout RR i Blight A 1994). Kliničke studije o primjeni Fampiridina-SR kod dugoročno prisutne ozljede leđne moždine su započete (Potter i sur, 1998a, b), no nisu odoljele pitanjima oko štetnosti primjene 4-AP u općoj populaciji bolesnika (Multipla Skleroza, Cognos Studija #51, Izvori odluka, Listopad, 1999; str.77-8). Nekoliko je ispitivanja pokazalo da pojedinačne doze AP-4 mogu obnoviti pojedine funkcije kod SCI bolesnika kada se primjenjuju godinu dana ili duže nakon ozljede (Potter i sur, 1998a, b; Qiao i sur, 1997; Hayes i sur, 1993; 1994). Isto su tako uočeni pozitivni učinci nakon kroničnog doziranja. Klinički značajna funkcionalna poboljšanja su zapažena u 16 od 16 bolesnika nakon 3 mjeseca dnevne peroralne doze od 30 mg/kg 4-AP kod bolesnika sa SCI tijekom 2 godine ili više. Neki bolesnici prethodno klasificirani kao potpuna ozljeda, su reklasificirani na razinu nepotpune ozljede (Segal i sur, 1999). Svi su bolesnici pokazali neki nivo poboljšanja u barem nekoj od neuroloških ili plućnih funkcija nakon 3 mjeseca dnevnog peroralnog liječenja s 4-AP (30 mg/kg, ili približno 0.5 mg/kg). Niža doza se nije pokazala djelotvornom.

Kao što je prethodno navedeno, 4-AP blokira kalijeve kanale, učinkovito produžavajući trajanje akcijskog potencijala. Na nesreću, navedeni mehanizam kojim blokatori kalijevih kanala dovode do poboljšanja simptoma bolesti i stanja koja dovode do poremećaja prijenosa akcijskog potencijala, isto tako mogu imati epileptogeno djelovanje. U stvari, 4-AP je poznato sredstvo koje izaziva konvulzije kod životinja i ljudi. Na taj način korisnost 4-AP kao terapijskog sredstva za liječenje MS, TBI i SCI je ugrožena njegovim pro-konvulzivnim djelovanjem i drugim neželjenim nuspojavama. Nemir, konfuzija i generalizirani toničko-klonički grčevi su zapaženi pri višim dozama od O.8 mg/kg (Bali i sur, 1979; Bever i sur, 1994). Van Diemen i sur (1993) je iznio da magnituda poboljšanja simptoma kod bolesnika oboljelih od MS (definirana težnjom za poboljšanjem finih pokreta) značajno je povezana sa razinom 4-AP u serumu, (33-75 ng/ml iznosila je peroralna doza neophodna za značajno poboljšanje simptoma). Unatoč tome, nuspojave (parestezija/disestezija, vrtoglavica/blaga opijenost, te čak nestabilnost u hodu) uočene su pri istim dozama. U drugom ispitivanju na ljudima, Bever i sur. (1994) uočili su grand mal napadaj pri razini u serumu od 104 ng/ml. Obje skupine istraživača su predložile da više doze i razine u serumu vjerojatno će uzrokovati veće poboljšanje kod bolesnika oboljelih od MS koji reagiraju na niže doze 4-APa. Na taj način je ograničena učinkovitost 4-APa dozama i nuspojavama.

Zabrinutost zbog nuspojava povezanih sa visokom razinom 4-AP u serumu dovela je do nastanka oblika s produženim otpuštanjem (Fampridine-SR) (Masterson JG i Myers M, 1994; 1996a; 1996b). Fampridine-SR je trenutno u Fazi 2 kliničkih ispitivanja za MS. Bolesnici u prethodnim kliničkim ispitivanjima Fampridina-SR su pokazali poboljšanje različitih funkcija. Ovisno o pojedincu, navedena poboljšanja su obuhvaćala poboljšanje funkcije mokraćnog mjehura, crijeva i seksualne funkcije, povećanu lakoću pokreta i osjeta, te smanjenje mišićnog spasticiteta, umora i kronične boli.

Drugi pristup eliminacije neželjenih učinaka povezanih sa 4-AP obuhvaća istovremenu primjenu 4-AP i blokatora voltažnih natrijevih kanala. Blokatori natrijevih (Na+) kanala blokiraju utok Na+ iona i smanjuju osjetljivost neurona na depolarizaciju. Navedeno značajno smanjuje neuronsku podražljivost. U stvari, zabilježeno je da istovremena primjena blokatora voltažnih natrijevih kanala i 4-AP sprječava pojavu konvulzija induciranih s 4-AP kod miševa (Yamaguchi i Rogawski, 1992). 4-AP ne posjeduje sposobnost blokiranja natrijevih kanala.

Spojevi korišteni u postupcima opisanim u zahtjevima prikazanog izuma, mogu se sintetizirati postupcima otkrivenim u United States Patent Br. 4,970,218. Svi patenti i druge publikacije ovdje citirane su obuhvaćene referencama.

Poznato je da određeni spojevi u dosegu prikazanog izuma mogu izazvati o naponu ovisnu blokadu natrijevih kanala in vitro i in vivo (Tang i sur, 1995; 1998; Tang i Kongsamut, 1996). Blokatori voltažnih natrijevih kanala učinkovitije djeluju u stanju stanične depolarizacije. Navedeni spojevi imaju mali ili uopće nemaju učinak na prijenos signala u normalnom neuronu, no dopuštaju blokadu natrijevih kanala tijekom epileptičkih napadaja, ozljede glave ili ishemije. Mnogi od navedenih agensa su cerebroprotektivni u životinjskim modelima navedenih patoloških stanja (Madge i sur, 1998).

Bez namjere da se ograničavaju teorijom, kalijevi kanali su isto tako mogući agensi za liječenje neuropatske boli i boli ovisne o citokinima, uključujući artritičnu bol. Sweitzer i sur (1999) su predložili da aktivacija mikroglije i otpuštanje citokina imaju značajnu ulogu u hiperalgeziji nakon bilo upale ili ozljede perifernog živca. Za blokatore kalijevih kanala, kao što je 4-AP, zabilježeno je da blokiraju aktivaciju mikroglije kod štakora, miša i čovjeka (Eder, 1998). Pyo i sur (1997) su uočili da 4-AP može smanjiti otpuštanje nitrita iz aktivirane mikroglije, ukazujući da se ponašanje boli može regulirati navedenim mehanizmom. Pored toga, uočeno je da 4-AP smanjuje lipopolisaharidima (LPS) induciranu proizvodnju NO iz murinih makrofaga (Lowry i sur, 1998). Primjena LPS kod miševa isto je tako korištena kao model za identifikaciju anti-artritične djelotvornosti nekoliko različitih agensa različitih mehanizama djelovanja (Mcllay i sur, 2001). Razvijeno je nekoliko eksperimentalnih modela koji obuhvaćaju konstrikciju ishijadikusa ili L5 ili L6 spinalnog živca kako bi se istražila neuropatska bol (Bennett i Xie, 1988; Seltzer i sur, 1990; Kim i Chung, 1992).

Sažetak izuma

Otkriveno je sada da spojevi formule I posjeduju sposobnost blokade kalijevih kanala. Jedinstvena kombinacija blokirajućeg djelovanja na kalijeve i natrijeve kanale ukazuje na korisnost navedenih spojeva kao terapijskih agensa za liječenje demijelinizirajućih bolesti ili stanja. Na primjer, korisni su u liječenju MS, SCI, TBI (traumatska ozljeda mozga) i inzulta. Navedeni spojevi predstavljaju sigurnije terapijsko sredstvo od 4-AP budući da 4-AP blokira samo kalijeve kanale što dovodi do neželjenih nuspojava u obliku nemira, konfuzije i epileptičkih napadaja. Spojevi formule I su isto tako korisni u rehabilitaciji nakon inzulta, liječenju iritacije i disfunkcije mokraćnog mjehura, liječenju visceralne, kemokinima inducirane boli (uključujući artritičnu bol) i neuropatske boli.

Detaljan opis izuma

Spojevi formule I predstavljaju jedinstvenu komibnaciju blokirajućeg djelovanja i na natrijeve i na kalijeve kanale. Navedeni spojevi su korisni u liječenju demijelinizirajućih bolesti i stanja kao što su multipla skleroza, ozljede leđne moždine, traumatske ozljede mozga i inzult. Spojevi su isto tako korisni u rehabilitaciji nakon inzulta, u liječenju iritacije i disfunkcije mokraćnog mjehura, liječenju visceralne, kemokinima inducirane boli (uključujući artritičnu bol) i neuropatske boli.

[image]

u kojoj

m predstavlja 0, 1 ili 2;

n predstavlja 0, 1 ili 2;

p predstavlja 0 ili 1;

svaki R nezavisno predstavlja vodik, halogen, trifluorometil, C1-C6alkil, C1-C6alkenil, C1-C6alkanoil, benziloksi, hidroksi, nitro ili amino;

svaki R1 nezavisno predstavlja vodik, C1-C6alkil, C1-C6alkenil, C1-C6alkanoil, halogen, cijano, -C(O)C1-C6alkil, -C1-C6alkilenCN, -C1-C6alkilenNR'R" u kojem R' i R" međusobno nezavisno predstavljaju vodik ili C1-C6alkil, -C1-C6alkilenOC(O)C1-C6alkil, ili -CH-(OH)R4 u kojem R4 predstavlja vodik ili C1-C6alkil;

R2 je vodik, C1-C6alkii po izboru supstituiran halogenom, hidroksi ili benziloksi skupinom, C1-C6alkenilom, C1-C6alkinilom, -CO2C1-C6alkil, ili -R5-NR'R" u kojem R5 predstavlja C1-C6alkilen, C1-C6alkenilen ili C1-C6alkinilen, a R1 i R" su međusobno nezavisni vodik, C1-C6alkil ili na drugi način, skupina -NR'R" u cijelosti predstavlja 1-pirolidinil; a

R3 predstavlja vodik, nitro, amino, halogen, C1-C6alkoksi, hidroksi ili C1-C6alkil.

Definicije:

1) Demijelinizacijske bolesti: Kao što se ovdje koristi, Demijelinizacijske bolesti predstavljaju bolesti u kojima je primarno došlo do oštećenja mijelina. Mogu se podijeliti u dvije glavne skupine: stečene bolesti i nasljedne metaboličke bolesti.

Multipla skleroza (MS) pripada skupini stečenih bolesti. MS se obično pojavljuje između 20. i 50. godine života. MS napada bijelu tvar središnjeg živčanog sustava. U njezinim uobičajenim manifestacijama (90% svih slučajeva), karakterizirana je izmjenom perioda relapsa/remisije, a tijekom vremena period remisije postaje sve kraći. Simptomi obuhvaćaju bilo koju kombinaciju spastične parapareze, nestabilnosti u hodu, diplopije i inkontinencije.

Skupina nasljednih metaboličkih bolesti obuhvaća osam identificiranih leukodistrofija: metakromatsku leukodistrofiju, Refsumovu bolest, adrenoleukodistrofiju, Krabbeovu bolest, fenilketonuriju, Canavanovu bolest, Pelizaeus-Merzbacherovu bolest i Alexanderovu bolest. Prvih šest su poremećaji odlaganja. Nedostatak ili promjenjena funkcija enzima uzrokuju toksično nakupljanje kemijskih supstanci. Etiologija Pelizaeus-Merzbacher i Alexanderove bolesti, s druge strane, još uvijek nije poznata.

Klinički tijek nasljednih demijelinizirajućih poremećaja, koje se obično manifestiraju nakon rođenja i u ranom djetinjstvu, izrazito je loš. U početku normalna djeca gube, uz brzu progresiju, vid, sluh, govor i pokretnost. Prognoza je smrt unutar nekoliko godina.

2) Demijelinizirajuća stanja - Kao što se ovdje koristi, demijelinizirajuća stanja su stanja u kojima se javlja nepotpuna mijelinizacija. Navedena demijelinizirajuća stanja obuhvaćaju, no nisu ograničena na, ozljede leđne moždine, traumatsku ozljedu mozga i inzult.

3) Ozljeda leđne moždine (SCI) - Kao što se ovdje koristi, SCI je definirana kao ozljeda leđne moždine koja dovodi do gubitka funkcija kao što su pokretljivost ili osjet.

4) Traumatska ozljeda mozga (TBI) - Kao što se ovdje koristi, traumatska ozljeda mozga je definirana kao

ozljeda koja rezultira oštećenjem mozga. Ozljeda glave može nastati na jedan od dva načina:

• Zatvorena ozljeda glave nastaje kada se glava u pokretu naglo zaustavi, kao na primjer kod udarca u vjetrobransko staklo, ili kada je došlo do udarca tupim predmetom koji je uzrokovao udaranje mozga u koštanu površinu unutrašnjosti lubanje. Zatvorena ozljeda glave može isto tako nastati bez izravne vanjske traume glave, ako dolazi do dođe do brzog kretanja mozga prema naprijed ili natrag, kao na primjer kada osoba doživi vipleš.

• Penetrirajuća ozljeda glave nastaje kada predmet, kao na primjer metak, velikom brzinom prodire u lubanju.

Obje, zatvorena i penetrirajuća ozljeda mozga mogu rezultirati lokaliziranom i proširenom, ili difuznom ozljedom mozga. Nastale nesposobnosti mogu obuhvatiti gubitak pamćenja i emocionalne poremećaje, poteškoće u motorici, uključujući paralizu, i oštećenje pet osjeta. Pored toga, mnogi bolesnici umiru od zadobivenih ozljeda.

Danas se liječenje bazira na održavanju što je moguće manje oštećenja tijekom 24 sata nakon ozljede. Kada netko pretrpi ozljedu mozga, rezultirajuća oštećenja su veća od početne traume koja ih je uzrokovala. Slijedi kaskada «sekundarne ozljede». Vlastiti imunološki odgovor mozga dovodi do oticanja i nakupljanja tekućine, a ozljeđene živčane stanice otpuštaju neurotransmitor glutamat koji se ubrzo nakuplja do nivoa koji je toksičan za okolne neurone.

5) Rehabilitacija nakon inzulta - Kao što se ovdje koristi, rehabilitacija nakon inzulta je definirana kao intervencija koja rezultira oporavkom funkcija koje su bile izgubljene nakon preboljelog inzulta (moždanog udara).

6) Inzult (moždani udar) - Kao što se ovdje definirano, inzult nastaje kada krvni ugrušak blokira krvnu žilu ili arteriju, ili kada se krvna žila rasprsne, prekidajući protok krvi u određeni dio mozga. Kada dođe do inzulta, odumiru stanice u zahvaćenom području. Doktori nazivaju područje mrtvih stanica infarktom. Navedene stanice obično odumiru unutar nekoliko minuta do nekoliko sati nakon početka inzulta. U inzultu, mjerila demijelinizacije kao što je omjer magnetizacijskog transfera (MTR) u uskoj su vezi sa oštećenjem aksona, a koje ukazuje na motorički deficit (Pendlebury i sur, 2000).

7) Alil ili alkilen - Ako drugačije nije navedeno ili indicirano, naziv «Alkil» ili «alkilen» označava razgranati ili ravni lanac alkilne ili alkilenske skupine, u skladu s formulom, karakterizirane brojem atoma ugljika u alkilu, npr., C1-C6alkil označava jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest atoma ugljika u razgranatom ili ravnom lancu alkila ili alkilena, ovisno o slučaju, ili bilo koji njihov raspon, na primjer, no bez ograničenja na, C1-2, C1-3, C1-4, C1-5, C2-3, C2-4, C2-5, C2-6, C3-4, C3-5, C3-6, C4-5, C4-6, C5-6, itd.

8) C1-C6alkoksi - Ako drugačije nije navedeno ili indicirano, naziv C1-C6alkoksi označava ravni ili razgranati lanac alkoksi skupine koji sadrži od 1 do 6 atoma ugljika. Primjeri navedenog obuhvaćaju metoksi, etoksi, n-proksi, izopropoksi, n-butoksi, izo-butoksi, sek-butoksi, t-butoksi, te ravni i razgranati lanac pentoksi i heksoksi.

9) Halogen - Ako drugačije nije navedeno ili indicirano, naziv halogen bi trebao označavati fluor, klor, brom ili jod.

10) C1-C6alkanoična kiselina - Ako drugačije nije navedeno ili indicirano, naziv C1-C6alkanoična kiselina bi trebala označavati karboksilnu kiselinu u kojoj je karboksilna skupina vezana na vodik ili alkilnu skupinu koja sadrži od l do 5 atoma ugljika.

11) C1-C6alkanoil - Naziv C1-C6alkanoil bi trebao označavati skupinu nastalu uklanjanjem hidroksilne skupine iz karboksilne skupine C1-C6alkanoične kiseline, te na taj način obuhvaća na primjer formil, acetil i slično. Nazivi alkanoil, alkenoil i alkinoil bi trebali označavati skupine dobivene uklanjanjem hidroksilne skupine iz karboksilne skupine alkanoične kiseline, alkenoične kisline i alkinoične kiseline. Tako na primjer, linolenska skupina porijeklom iz linolenske kiseline predstavlja primjer alkenoila kao što je prethodno definirano.

12) «Farmaceutski prihvatljive soli» označavaju bilo kiselinsku adicijsku sol ili bazičnu adicijsku sol koja je kompatibilna terapiji indiciranoj kod bolesnika.

13) «Farmaceutski prihvatljiva kiselinska adicijska sol» je bilo koja ne-toksična organska ili anorganska kiselinska adicijska sol osnovnih spojeva prikazanih Formulom I ili bilo kojeg njezinog međuprodukta. Primjeri anorganskih kiselina koje tvore prikladne soli obuhvaćaju klorovodičnu, bromovodičnu, sulfatnu i fosfatnu kiselinu i kisele soli metala kao što je natrijev monohidrogen ortofosfat i kalijev hidrogen sulfat. Primjeri organskih kiselina koje tvore prikladne soli obuhvaćaju mono-, di-i tri-karboksilne kiseline. Primjeri navedenih kiselina su, na primjer, octena, glikolna, mliječna, piruvatna, malonska, jantarna, glutamatna, mravlja, malična, vinska limunska, askorbinska, maleinska, hidroksimaleinska, benzojeva, hidroksibenzojeva, feniloctena, cimetna, salicilna, 2-fenoksibenzojeva, p-toluensulfonska kiselina i sulfonske kiseline kao što su metansulfonska kiselina i 2-hidroksietansulfonska kiselina. Mogu se pripraviti bilo mono- ili di-kiselinske soli, a navedene soli mogu biti ili u hidratiranom, solvatiranom ili jako anhidroznom obliku. Općenito, kiselinske adicijske soli navedenih spojeva su bolje topljive u vodi i različitim hidrofilnim organskim solventima, a u usporedbi s njihovim slobodnim osnovnim oblicima pokazuju više točke taljenja.

14) «Farmaceutski prihvatljiva bazična adicijska sol» označava ne-toksične organske ili anorganske bazične adicijske soli spojeva Formule (I) ili bilo kojeg njihovog međuprodukta. Primjeri su hidroksidi alkalijskih metala ili zemno-alkalijskih metala kao što su natrijev, kalijev, kalcijev, magnezijev ili barijev hidroksid; amonijak, te alifatski, aliciklički ili aromatski organski amini kao što je metilamin, trimetilamin i pikolin. Kriteriji za odabir odgovarajuće soli bit će poznati osobi iz struke.

15) «Stereoizomeri» je općeniti pojam za sve izomere pojedinačnih molekula koje se razlikuju samo u orijentaciji njihovih atoma u prostoru. Obuhvaćene su zrcalne slike izomera (enantiomeri), geometrijski (cis/trans) izomeri, te izomeri spojeva s više od jednim kiralnim centrom koji nisu zrcalna slika jedan drugoga (dijastereoizomeri).

16) «Bolesnik» označava toplokrvnu životinju, kao što su na primjer štakori, miševi, psi, mačke, zamorci, te primate kao što su ljudi.

17) «Liječiti» ili «liječenje» označava smanjenje simptoma, uklanjanje uzroka simptoma bilo privremeno ili trajno, ili sprječavanje ili usporavanje pojave simptoma određenog poremećaja ili stanja.

18) «Terapijski učinkovita količina» označava učinkovitu količinu spoja za liječenje određenog poremećaja, bolesti ili stanja.

19) «Farmaceutski prihvatljivi nosač» predstavlja netoksični solvent, disperzant, ekscipijens, adjuvans ili drugo sredstvo pomiješano s aktivnim sastojkom koje omogućava nastanak farmaceutskog pripravka, tj., nastanak oblika za doziranje prikladnog primjeni kod bolesnika. Jedan primjer navedenog nosača predstavlja farmaceutski prihvatljivo ulje koje se uobičajeno koristi za parenteralnu primjenu.

20) «Neuropatska bol» označava bol nastalu zbog oštećenja živčanog sustava. Oštećenje živca može biti otkriveno ili neotkriveno. Primjeri neuropatske boli obuhvaćaju post-herpetičnu neuralgiju, bolnu dijabetičku neuropatiju, fantomsku bol udova i središnju bol nakon inzulta.

21) «Iritacija i disfunkcija mokraćnog mjehura» označava stanja kao što je intersticijski cistitis i hiperaktivni mokraćni mjehur. Hiperaktivni mokraćni mjehur je posebno medicinsko stanje karakterizirano simptomima koji obuhvaćaju učestalo mokrenje, hitan nagon na mokrenje i stres inkontinenciju, slučajno istjecanje urina koje nastaje nakon snažne iznenadne potrebe za uriniranjem. Dijagnoza hiperaktivnog mokraćnog mjehura se donosi u odsustvu lokalnih patoloških stanja ili povezanih metaboličkih stanja, u prisustvu simptoma koji se mogu pripisati kontrakcijama mokraćnog mjehura koje nisu pod utjecajem volje zbog prekomjerne aktivnosti detruzorskog mišića. Intersticijski cistitis (IC) je kronično upalno stanje zida mokraćnog mjehura, koje često prođe nedijagnosticirano.

Spojevi formule I mogu učinkovito poboljšati učestalost i stupanj oporavka kod akutne ozljede leđne moždine, te kod dugoročne ozljede leđne moždine. Posjeduju svojstva o primjeni ovisnih blokatora natrijevih kanala i blokatora voltažnih kalijevih kanala in vivo. Predstavljaju sigurnije terapijsko sredstvo u odnosu na 4-AP. Osobito su prikladni spojevi u kojima R predstavlja vodik, halogen, trifluorometil, ili C1-Cealkil; R1 predstavlja vodik ili C1-C6alkil; R2 predstavlja vodik ili C1-C6alkil; R3 predstavlja vodik ili C1-C6alkil ili halogen; a p je 0. Daljnji prikladni spojevi su oni u kojima je amino skupina vezana na položaj 4 piridinske skupine.

Još su više povoljni spojevi formule II [isto tako ovdje poznati kao HP 184 ili N-(3-fluoro-4-piridinil)-N-propil-3-metil-1H-indol-1-amin] i formule III (isto tako poznati ovdje kao «8183).

[image]

[image]

HP-184 se dobro podnosi u mikromolarnim koncentracijama u mozgu jedan sat nakon ip administracije 30 mg/kg HP 184 kod štakora (Smith i sur, 1996).

Jedinstvena kombinacija o primjeni ovisnih natrijevih kanala i voltažnih kalijevih kanala isto tako razlikuje spojeve prikazanog izuma od blokatora «čistih» natrijevih kanala kao što su karbamazepin i fenitoin. Navedena sredstva su uspješno korištena za ublažavanje «pozitivnih» simptoma MS (bolni tonički grčevi i dizestezija). Unatoč tome, ona pogoršavaju negativne simptome (paraliza i hipestezija) (Sakurai i Kanazawa, 1999). Spojevi prikazanog izuma pospješuju neuronsku funkciju na način da blokiraju kalijeve kanale. To omogućava funkcionalni oporavak. Trenutno se vjeruje, da su blokatori natrijevih kanala korisni u liječenju bolnih simptoma i/ili kao neuroprotektivna sredstva. No, ne očekuje se od njih poboljšanje rehabilitacijskih napora.

U liječenju bolesnika oboljelog od prethodno navedenog stanja ili bolesti, spoj formule (I) se može primjeniti u bilo kojem obliku ili na bilo koji način koji će omogućiti bioraspoloživost spoja u terapijski učinkovitim količinama, uključujući peroralnu primjenu, sublingvalnu, bukalnu, supkutanu, intramuskularnu, intravenoznu, transdermalnu, intranazalnu, rektalnu, lokalnu primjenu i slično. Osoba iz struke koja se bazi pripravljanjem formulacija može odrediti valjani oblik i način primjene ovisno o pojedinim karakteristikama spoja odabranog za liječenje stanja ili bolesti, stadiju bolesti, stanju bolesnika i drugim relevantnim okolnostima. Na primjer, vidi Remingtonove Farmaceutske znanosti, 18. izdanje, Mack Publishing Co. (1990), a ovdje su obuhvaćene referencama.

Spojevi Formule I se mogu primjeniti pojedinačno ili u obliku farmaceutskog pripravka u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim nosačima, a udio i priroda kojih su određeni topljivošću i kemijskim svojstvima odabranog spoja, načina primjene, standardom farmaceutske prakse i drugim relevantnim kriterijima.

Spojevi prikazanog izuma se mogu primjeniti peroralno, na primjer, u obliku tableta, dragea, kapsula, eliksira, suspenzija, otopina, sirupa, oblata, žvakačih guma i slično, a mogu sadržavati jedan ili više od slijedećih adjuvansa: sredstva za vezanje kao što je mikro-kristalinična celuloza, guma tragakant ili gelatina; ekscipijense kao što su škrob ili laktoza, sredstva za razgradnju kao što je alginična kiselina, Primogel, kukuruzni škrob i slično; lubrikanse kao što je magnezijev stearat ili Sterotex; glidanse kao što je koloidni silikonski dioksid; te zaslađivače kao što su sukroza ili saharin, ili se mogu dodati sredstva za poboljšanje okusa kao što su pepermint, metil salicilat ili okus naranče. Kada je dozažni oblik kapsula, može sadržavati, pored prethodno navedenih sredstava, tekući nosač kao što je polietilen glikol ili masno ulje. Drugi jedinični oblici doziranja mogu sadržavati različite materijale koji modificiraju fizički oblik dozažne jedinice, na primjer, kao sredstva za oblaganje. Tako tablete ili pilule mogu biti obložene šećerom, šelakom, ili drugim enteričnim sredstvima za oblaganje. Sirup može sadržavati, pored navedenih spojeva, sukrozu kao zaslađivač i određene konzervanse, boje i sredstva za bojenje i poboljšanje okusa.

Spojevi Formule (I) prikazanog izuma mogu se isto tako primjeniti lokalno, a u tom slučaju nosač može prikladno sadržavati otopinu, masnu ili gel bazu. Baza, na primjer, može sadržavati jedan ili više od slijedećih spojeva, petrolatum, lanolin, polietilen glikole, pčelinji vosak, mineralno ulje, diluense kao što su voda i alkohol, te emulzifikatore i stabilizatore.

Otopine ili suspenzije mogu isto tako sadržavati jedan ili više od slijedećih adjuvansa: sterilne diluense kao što je voda za injekcije, fiziološka otopina, fiksacijska ulja, polietilen glikole, glicerin, propilen glikol ili druge sintetske solvente; antibakterijska sredstva kao što su benzilni alkohol ili metil paraben; antioksidanse kao što su askorbinska kiselina ili natrijev bisulfit; kelirajuća sredstva kao što je etilen diamintetraoctena kiselina; pufere kao što su acetati, citrati ili fosfati i agense za prilagođavanje toničnosti kao što su natrijev klorid ili dekstroza. Parenteralni pripravci se mogu pohraniti u ampule, jednokratne štrcaljke ili bočice koje sadrže više doza.

Jako lipofilni esteri, amidi i karbamati prikazanog izuma mogu se primjenjivati kao sredstva s produženim otpuštanjem kod sisavaca tijekom nekoliko dana ili od približno jednog do četiri tjedna kada dolaze u obliku depot preparata, kao na primjer, kada se injiciraju u prikladno odabranom farmaceutski prihvatljivom ulju. Prikladna su ulja biljnog porijekla kao što je sezamovo ulje, ulje pamučnih klica, kukuruzno ulje, kokosovo ulje, sojino ulje, maslinovo ulje i slično, ili su sintetski esteri masnih kiselina i polifunkcionalnih alkohola kao što su glicerol ili propilenglikol.

Depot pripravci prikazanog izuma se pripravljaju otapanjem jako lipofilnog estera, amida ili karbamata prikazanog izuma u farmaceutski prihvatljivom ulju pod sterilnim uvjetima. Ulje je odabrano kako bi se postiglo otpuštanje aktivnog sastojka tijekom željenog vremenskog perioda. Prikladno ulje se može jednostavno odrediti na osnovi već poznatih u struci pripravaka ili bez pretjeranog eksperimetniranja će ga odrediti osoba iz struke.

Raspon doze pri kojoj spojevi Formule I imaju terapijski učinak može varirati ovisno o pojedinoj bolesti ili stanju koje se liječi, njegovoj težini, bolesniku, obliku primjene, prisustvu popratnih bolesti od kojih bolesnik boluje, te drugim lijekovima koje bolesnik istovremeno uzima. Općenito, spojevi Formule I će djelovati terapijski u dozama između približno 0.001 mg/kg tjelesne težine bolesnika/dan do otprilike 100 mg/kg tjelesne težine bolesnika/dan.

Slijedeći primjeri su isključivo ilustrativne prirode i nije im namjera ograničiti na bilo koji način opseg prikazanog izuma.

PRIMJER JEDAN

DOKAZ IN VIVO BLOKADE VOLTAŽNIH NATRIJEVIH KANALA

Postupci: Eksperimentalni postupak se temelji na metodi Bachauss i sur. (1992). Muški CD-1 miševi težine od 35 do 40 g su anestezirani kloral hidratom (400 mg/kg). Pod operativnim mikroskopom, 3 mm vertikalna incizija kože je učinjena 2 mm iza desne orbite. Temporalni mišić je odmaknut i mala kraniotomija je izvedena kako bi se izložila dura (tvrda moždana ovojnica). Dura je incidirana i odmaknuta, a distalni dio desne srednje karotidne arterije je izložen. Arterija je okludirana uzvodno od glavne bifurkacije bipolarnom elektrokoagulacijom finim forcepsom. Volumen infarkta je izmjeren 24 sata kasnije primjenom 2% otopine trifenil-tetrazolijeva klorida. U navedenoj eksperimentalnoj paradigmi, HP 184 je peroralno primjenjen jedan sat prije okluzije kod miševa koji su taj dan primili obrok (10 po skupini). Smanjenje volumena infarkta je procjenjeno usporedbom s miševima koji su primili 1% octenu kiselinu, vehikl. Rezultati su prikazani u Tabeli 1.

Tabela 1. Neuroprotektivno djelovanje HP 184 kod pMCAO mišjeg modela inzulta.

[image]

Neuroprotektivno djelovanje zabilježeno kod mišjeg modela sa trajno okludiranom srednjom karotidnom arterijom (pMCAO) u skladu je s in vivo blokadom voltažnih natrijevih kanala u navedenoj dozi i vremenu.

PRIMJER DVA

UČINAK HP 184 NA EDEM NASTAO FOTOTROMBOTIČNOM CEREBRALNOM LEZIJOM KOD ŠTAKORA

Racionalnost ispitivanja/cilj:

Tromboembolijski inzult je treći uzrok smrti u zemljama zapada. Uzrokovan je krvnim ugruškom ili trombom u raspadanju koji je nastao bilo unutar cerebralne cirkulacije bilo u srcu ili velikim krvnim žilama, te je zatim donesen u cerebralnu cirkulaciju. Protok krvi je u zatim prekinut i razvija se ishemijska lezija, s edemom, nekrozom i apoptozom tkiva. Edem je štetan budući da komprimira mozak, pospješuje ishemiju, kao i ližu stanice i mehaničku ozljedu. Liječenje sa HP 184, zajedničkim blokatorom Na+/K+ kanala, je proučavano obzirom na učinak koji ima na edem mozga.

Postupak:

Muški Sprague Dawley štakori (180 - 200 g bw) su anestezirani kloralnim hidratom (400 mg/kg ip) i stavljeni u stereotaktični aparat. Koža je otvorena kako bi se prikazala lubanja i hladno svijetlo (Bioblock 150W) je stavljeno u kontakt sa desnom stranom lubanje ispred lambde. Boja, bengalsko crvenilo (10 mg/kg iv u fiziološkoj otopini) je primjenjena intravenozno i odmah je započeto osvjetljavanje lubanje koje je nastavljeno tijekom 5 minuta. Koža je zatim zašivena preko lubanje i životinja je vraćena u kavez. Dvadeset i četiri sata nakon fototrombotične lezije životinje su primile HP 184 koji se sastoji od 1% tweena u vodi intravenskim putem u dozi od O, 10, ili 20 mg/kg tjelesne težine volumena 5 ml/kg. Jedan sat kasnije, životinje su žrtvovane dekapitacijom i uklonjen im je mozak (vidi dodatak protokolu). Osnovni uzorci su uzeti na mjestu lezije i na kontralateralnoj strani, primjenom 6 mm svrdla (odvijač). Sadržaj vode je određen mokrom težinom tkiva/suhom težinom tkiva, a edem je izražen kao % suviška vode na lediranom uzorku u usporedbi sa uzorkom iz kontralateralne hemisfere kod svakog štakora.

Rezultati - Prikazani u Tabeli 2

Tabela 2

[image] Stats: ANOVA plus Tukey-Kramer **=p<0.001

HP 184 je pokazao statistički zančajno (22%) smanjenje edema u desnom cerebralnom korteksu jedan sat nakon iv primjene u dozi od 20 mg/kg i 25 sati nakon fototrombotične lezije.

PRIMJER TRI

UČINAK HP 184 NA VELIČINU LEZIJE I NEUROLOŠKU FUNKCIJU NAKON PROLAZNE FOKALNE CEREBRALNE ISHEMIJE KOD ŠTAKORA.

Racionalnost ispitivanja/cilj: u navedenom ispitivanju HP 184 je primjenjen 1 sat nakon početka ishemije na modelu prolazne fokalne cerebralne ishemije kod štakora. Izmjereni parametri su bili veličina lezije i neurološka funkcija.

Postupci: Muški Sprague-Dawley štakori [Iffa Credo, France] težine približno 220-240 g su anestezirani halotanom (1.4%) u smjesi dušičnog oksida-kisika (70:30). Obje zajedničke karotidne arterije (CCAs) su izolirane. Lijeva arterija cerebri medija (MCA) izložena temporalnom kraniotomijom okludirana je mikroklipom, a istovremeno su okludirane CCA tijekom 1 sata. Obje temperature tjelesna i cerebralna su održavane na normotermiji. Nakon kirurškog zahvata životinje su vraćene u kaveze u prostoriji temperature od 24°C do 26°C.

HP 184, otopljen u 1% tweena (u injektibilnoj sterilnoj vodi), je primjenjen u dozi od 10 i 20 mg/kg iv 1 sat nakon početka ishemije, a štakori iz kontrolne skupine su primili vehikl u skladu s istim protokolom. 24 sata nakon ishemije, neurološka funkcija je ispitana na slijepo, primjenom skale procjene od 9 bodova.

SKALA STUPNJEVANJA KORIŠTENA ZA ISPITIVANJE NEUROLOŠKE FUNKCIJE

[image]

Nakon toga su štakori žrtvovani i mozak je uklonjen. Svježi rezovi su učinjeni na matriksu mozga i obojeni 2% trifenil tetrazolijevim kloridom na temperaturi od 37°C tijekom 5 minuta. Rezovi su zatim pohranjeni u 10% formalinu na 4°C tijekom 24 sata. Područja infarkta su izmjerena analizatorom slike (Leica Q500).

Rezultati: Ishemija je izazvala nastanak cerebralnih lezija i u korteksu i u striatumu (Vidi Sliku 1 koja prikazuje učinak HP 184 na oštećenje mozga u koncentracijama od 10 i 20 mg/kg primjenjenim u iv bolus injekciji 1 sat nakon MCA okluzije). HP 184 u dozi od 10 mg/kg iv značajno je snizio, za 41% (p<0.05) moždane ozljede. Navedeno sniženje je značajno u korteksu (-45%, p<0.05).

PRIMJER ČETIRI

MJERENJE BLOKADE KALIJEVOG KANALA

Postupci

PC12 stanice (ATCC, Rockville, MD) su uzgojene u Dulbecco modificiranom Eagle mediju obogaćenom sa 10% fetalnim bovinim serumom (GIBCO PRL Grand Island, NY). Protok kroz kalijev kanal je mjeren primjenom standardnih elektrofizioloških protokola zakrpe i hvataljke kao što je prethodno detaljno opisano (Rampe i sur., 1998).

Rezultati i diskusija

Protoci kroz kalijev kanal su oblikovani primjenom stezaljke u 200 msec pulsevima do postizanja potencijala od +40 mV od vrijednosti potencijala u mirovanju od -80 mV. Navedeni protokol je rezultirao produženim, prema van usmjerenim protokom. Primjena HP 184 (10 μM) je smanjila amplitudu navedenog protoka i pojačala stupanj raspada. Kada je protok izmjeren na kraju pulsa, HP 184 reducirana amplituda protoka iznosila je 75 ±4% (n = 4). Rezultati su u skladu sa zapažanjem da HP 184 djeluje kao antagonist voltažnih K+ kanala blokadom aktiviranog stanja.

PRIMJER PET

IN VIVO DOKAZ POJAČANE MIŠIĆNE FUNKCIJE

Cilj: Uočeno je da anorganska boja rutenijsko crvenilo (RuR) blokira protok kroz voltažne Ca+2 kanale u različitim staničnim vrstama, uključujući mišje osjetne neurone (Duchen, 1992), sinaptosome i neuromuskularne preparate (Hamilton i Lundy, 1995; Tapi i Velasco, 1997). Nadalje, RuR blokira otpuštanje neurotransmitora u moždanim sinaptosomima (Meza-Ruiz i Tapia, 1978; Tapia i Meza-Ruiz, 1977) i neuromsukularnoj ploči (Alnaes i Rahamimoff, 1975; Person i Kuhn, 1979). In vivo, intraperitonealna (ip) primjena RuR uzrokuje flacidnu paralizu kod miševa (Tapia i sur, 1976), a navedeni učinak je antagoniziran 4-aminopiridinom (4-AP), blokatorom voltažnog K+ kanala (Tapia, 1982). Tapia i Velasco (1997) su dali pregled učinaka RuR in vivo i in vitro, te predložili da se RuR veže na Ca+2 mjesta u membranama živčanih završetaka. Studije vezanja su ukazivale da RuR selektivno blokira N-vrstu Ca+2 kanala, a navedeni kanali reguliraju utok Ca+2 neophodan za otpuštanje neurotransmitora. Navedeni autori su isto tako predložili da ip primjena RuR može biti eksperimentalni model Eaton-Lambert sindroma mijastenije gravis, autoimune bolesti karakterizirane blokadom Ca+2 utoka i ACh otpuštanja kao posljedice vezanja protutijela na N-vrstu Ca+2 kanala. U skladu s navedenom mogućnošću, zabilježeno je da 4-AP smanjuje slabost mišića i održava neuromuskularni prijenos kod bolesnika (Lundh i sur, 1977a; 1977b; 1979; McEvoy i sur, 1989; Asien i sur, 1995).

Sposobnost i 4-aminopiridina (4-AP) i gvanidina da antagoniziraju RuR-om izazvanu flacidnu paralizu vjerojatno nastaje zbog njihove sposobnosti pospješenja otpuštanja neurotransmitora (Lundh, 1978; Lundh i Thesleff, 1977; Tapia i Stiges, 1982). U svakom slučaju, Tapia i suradnici (Tapia i Stiges, 1982) su uočili da RuR blokira otpuštanje nastalo djelovanjem 4-AP u sinaptosomima.

In vitro, HP 184 pojačava otpuštanje neurotransmitora različitim mehanizmom od onog pod utjecajem 4-AP. U visokim koncentracijama, 4-AP pospješuje i električki stimulirano i spontano otpuštanje, no navedeni učinci su ovisni o kalciju. Nasuprot tome, HP 184 pospješuje samo o kalciju neovisno spontano otpuštanje neurotransmitora (Smith i sur, 1993). Isto tako je postavljena hipoteza da spontano otpuštanje ima funkcionalnu ulogu in vivo (Smith i sur, 1996).

Cilj slijedećeg ispitivanja je bio određivanje da li HP 184 i 4-AP mogu antagonizirati paralizirajuće djelovanje RuR-a nakon istodobne injekcije.

Postupci i rezultati: Skupinama od 4 do 5 miševa (CD-1; Charles River; 25-35 grama) su odvojeno, no istovremeno injicirani ip rutenijsko crvenilo i vehikl (1% glacijalna octena kiselina), rutenijsko crvenilo i 4-AP, ili rutenijsko crvenilo i HP 184. Spoj poznat kao «8183» je isto tako testiran u navedenom primjeru. Počevši sa 15 minuta nakon injiciranja, miševi su stavljeni u blizinu «flagpol» aparata i bilježena je njihova sposobnost da nose vlastitu tjelesnu težinu (tj., da se zadrže na flagpolu, a ne padnu). Rezultati su prikazani kao broj miševa koji su mogli nositi vlastitu tjelesnu težinu naspram ukupnog broja testiranih miševa. Navedeni rezultati su prikazani u Tabeli 3. Sva ispitivanja su izvršena između 14 sati i 16.30 sati.

TABELA 3

[image]

Zaključak:

Oba lijeka 4-AP (ip) i HP 184 (ip) antagoniziraju flacidnu paralizu induciranu ip primjenom RuR-a. To upućuje da HP 184 pospješuje prijenos signala neuronima in vivo, vjerojatno blokadom K+ kanala. Isto je tako moguće, kao i za 4-AP, da HP 184 pospješuje neuronsku transmisiju, budući da in vitro ispitivanjima na moždanim rezovima ukazuju na povećano otpuštanje neurotransmitora u mozgu (Smith i sur, 1993; 1996).

Doze difenilhidantoina (DPH) i riluzola (RIL), blokatora natrijevih kanala, ispitivane u navedenom eksperimentalnom modelu već su prethodno pokazale neuroprotektivno djelovanje u modelima fokalne ishemije (Rataud i sur, 1994; O'Neill i sur, 1997). Njihova neučinkovitost u ispitivanom modelu govori u prilog objašnjenju da sposobnost HP 184 antagoniziranja RuR-om inducirane flacidne paralize vjerojatno nije posljedica in vivo blokade natrijevih kanala. To je i uočeno s kliničke strane. Negativni simptomi MS (gubitak pokreta) obično se pogoršavaju primjenom blokatora natrijevih kanala (Sakurai i Kanazawa, 1999).

PRIMJER ŠEST

MODELI BOLESTI PRIGNJEČENJA LEĐNE MOŽDINE

Racionalnost ispitivanja i Cilj: Gruner & Yee (1999) su pokazali da, 25 dana nakon ozljede leđne moždine, 4-AP pospješuje mMEP koji slijedi nakon postupne ozljede leđne moždine kod štakora. Primjenom identičnih postupaka, izmjerena su funkcionalna ponašanja. Navedena ponašanja su pokazala korelaciju s minimalnim mMEP-om. Cilj navedenih ispitivanja je dvostruki:

1) odrediti da li HP 184 može umanjiti motorički deficit srednjeg intenziteta uzrokovan prignječenjem leđne moždine ako se primjeni u akutnoj fazi, te usporediti njegovu djelotvornost s djelotvornošću metilprednizolon sukcinata (MPSS) i

2) odrediti da li bi HP 184 mogao poboljšati motoričku funkciju kod štakora s dugoročnom (25 dana) ozljedom leđne moždine srednjeg intenziteta, te usporediti njegov učinak s učinkom 4-aminopiridina (4-AP).

Akutno liječenje - i.p. primjena

Leđna moždina ženki štakora je podvrgnuta laminektomiji (sham, n=12) ili je prignječenja do promjera od 1.4 mm (5 skupina, n=12 svaka). Normalni promjer leđne moždine iznosi približno 2.5 mm. Navedena kompresija predstavlja umjerenu ozljedu karakteriziranu početnim rezultatima hoda otvorenog polja od 1.5 do 2.5 na Skali Hoda Otvorenog Polja. Definicije za Skalu Hoda Otvorenog Polja (OFT) su slijedeće:

0.0 bez spontanih pokreta

0.7 minimalan pokret

1.0 pokret u kuku i/ili koljenu (ne u skočnom zglobu)

1.3 aktivan pokret u kuku i koljenu, ne u skočnom zglobu

1.7 upitan pokret u skočnom zglobu

2.0 pokret noge u sva tri velika zgloba

2.3 pokušaj podupiranja

2.7 podupiranje samo pri stajanju

3.0 aktivno podupiranje, nekoordinirani korak

3.3 intermitentni pokušaji kooridniranog koraka

3.7 nedostatak kontrole skočnog zgloba ili stopala, hod na zglobovima prstiju ili medijalnom stranom stopala

4.0 koordinacija prednjih i stražnjih udova pri koračanju

4.3 poboljšano podupiranje stražnjim nogama, abdomen nije nisko uz zemlju

4.7 jedan ili dva nožna prsta zaostaju, blaga nestabilnost kod okretanja pri punoj brzini

5.0 normalan korak i osnovno držanje, bez gubitka ravnoteže kod brzih okretanja, bez zaostajanja prstiju

Liječenje lijekom

Unutar 15 minuta nakon prignječenja (dan 1) , štakori svrstani u HP 184 skupinu primili su injekcije od 20, 10, 5 ili 0 mg/kg HP 184 u vehiklulu 1% glacijalne octene kiseline. Navedena primjena je ponovljena 2. 13. dan. MPSS, u drugu ruku, je primjenjen u dozi od 30 mg/kg ip 15 minuta, 2 sata, 4 sata i 6 sati nakon ozljede prvog dana. Raspored doziranja MPSS je opisan kao optimalan u literaturi i oponaša doziranje kod ljudi. MPSS je trenutno jedini lijek odobren za liječenje ozljeda leđne moždine kod ljudi. Slika 2 prikazuje bihevioralne rezultate (OFT) različitih terapijskih skupina tijekom vremena. Normalan preoperativni broj bodova iznosi 5. Stupanj i opseg poboljšanja za obje dozažne skupine, 20 i 5 mg/kg, su značajno različiti u odnosu na štakore liječene vehiklom. Svaka točka predstavlja srednju vrijednost plus sem od 8-12 štakora.

Akutno liječenje - po primjena

Ponovno, su leđne moždine ženki štakora podvrgnute laminektomiji ili prignječene na promjer od 1.4 mm. U HP 184 skupinama, štakori su primili per os dozu 5 do 10 minuta prije prignječenja, a zatim jedanput dnevno tijekom 2. i 3. dana. MPSS je doziran kao što je prethodno opisano. Bihevioralni rezultati (OFT) su prikazani na Slici 3. Normalan preoperativni broj bodova iznosi 5.

Stupanj i opseg oporavka su poboljšani uz sve doze, uključujući i 10 mg/kg skupinu, kada se usporede sa skupinom liječenom vehiklom. Svaka točka predstavlja srednju vrijednost plus sem od 12 štakora.

ISPITIVANJE KRONIČNOG PRIGNJEČENJA

Leđne moždine ženki štakora su izložene laminektomiji ili prignječenju do promjera od 1.6 mm. Navedeno oštećenje predstavlja blažu ozljedu, i podešeno je da rezultira OFT rezultatima od 4.0 nakon 25 dana bez liječenja. Odabran je prikazani model kako bi se dobio isti stupanj motoričkog oštećenja kao što su opisali Gruner i Yee (1999), koji su pokazali da 4-AP inducira poboljšanja minijaturnog potencijala završne ploče stražnje noge. Navedeni postupak i trajanje neliječene ozljede su isto tako pokazali da dolazi do demijelinizacije. Bihevioralni rezultati (OFT) su prikazani na Slici 4. Slika 4 prikazuje srednje i standardne pogreške skupina primjenom definicija Skale hoda otvorenog polja koje su prethodno navedene.

U navedenom ispitivanju, OFT rezultati su nešto viši (4.3-4.5), ostavljajući malo mjesta za poboljšanje. Korištenjem svakog štakora kao vlastite kontrole, zabilježeno je konzistentno poboljšanje nakon jedanput na dan primjene HP 184, 26, 27. i 28 dan. Konzistentno poboljšanje je isto tako zabilježeno nakon ip primjene jedanput na dan 0.6 mg/kg 4-AP. Statističke razlike su se temeljile na promjenama za svakog štakora posebno (svaki je štakor bio sam sebi kontrola) primjenom Mann-Whitney U-testa. Svi bihevioralni testovi, 1. dan, 2. dan i 3. dan su primjenjeni 3 sata nakon gavaže. Nikakav lijek nije primjenjen 3. dan (kao prvi dan kada se lijek počeo davati računa se 0. dan). Statističkom analizom je dobiveno slijedeće:

20 mg/kg - značajno poboljšanje od 3 sata do 3. dana (p= 0.002) u usporedbi s kontrolom liječenom vehiklom

10 mg/kg - značajno poboljšanje 30 minuta i 3 sata do 12 sati (p= 0.014) u usporedbi s kontrolom liječenom vehiklom

3 mg/kg - značajno poboljšanje 30 minuta do 6 sati, odnosno do 1. dana (p= 0.0027) u usporedbi s kontrolom liječenom vehiklom

4-AP - značajno poboljšanje 90 minuta do 3 sata i 12 sati do 2.dana (p= 0.0027) u usporedbi s kontrolom liječenom vehiklom

Tabela 4 prikazuje promjene rezultata svake skupine od perioda prije primjene prve doze do tri sata nakon treće uzastopne dnevne doze.

[image]

Slika 5 prikazuje promjene rezultata, normalizirane za svakog štakora. Graf prikazuje zabilježene promjene nakon tri uzastopna dana doziranja (od perioda prije doziranja do tri sata nakon treće uzastopne dnevne doze) s bilo 0.6 mg/kg 4-AP (i.p.), 20 ili 10 ili 3 mg/kg (p.o.). Laminektomija se odnosi na patvorenu skupinu. Prosječna vrijednost ± sem za svaku skupinu (n=12) je prikazana na Slici 5.

UČINKOVITOST PRI DUGOROČNOJ OZLJEDI LEĐNE MOŽDINE

Trideset i pet dana nakon ozljede leđne moždine umjerenog stupnja, oralna primjena 3 mg/kg HP 184 (po) je pospješila motorički oporavak nakon jednokratne doze, a primjenjene dnevne doze tijekom slijedeća 4 dana su rezultirale kontinuiranim i održanim poboljšanjem procjenjenim na osnovi prethodno opisanih definicija Testa hoda otvorenog polja. 4-AP u dozi od 0.6 mg/kg (ip) pokazao je sličnu učinkovitost. Tablični prikaz rezultata oba ispitivanja kronične ozljede leđne moždine (lijekovi su prvi puta primjenjeni 25 dana nakon blage ozljede prignječenja leđne moždine i 35 dana nakon umjerenog prignječenja leđne moždine) donesen je u Tabeli 5.

TABELA 5

[image]

Kao što je gore prikazano, HP 184 primjenjen u dozi od 3 mg/kg/dnevno oralnom gavažom od 35 do 41. dana nakon umjerenog prignječenja, doveo je do značajnog poboljšanja. Zabilježeno je u prikazanoj studiji da je bilo više mijelina na mjestu ozljede kod štakora s povredom leđne moždine koji su primili HP 184. Navedeni podaci predstavljaju dokaz u skladu s tvrdnjom da HP 184 ili pospješuje remijelinizaciju ili smanjuje napredovanje procesa demijelinizacije.

Daljnja ispitivanja su sprovedena sa ciljem određivanja najniže učinkovite doze HP 184 u modelu umjerenog kroničnog (35 dana nakon ozljede) oštećenja dvostruko slijepog, placebo i pozitivno kontroliranog dizajna. Učinci HP 184 prethodno zapaženi pri dozi od 3 mg/kg, po, potvrđeni su primjenom 4AP (0.6 mg/kg, ip) kao pozitivnom kontrolom. Nadalje, ispitan je učinak svih liječenja na mijelinsko bojenje histološki.

(1) Bihevioralna procjena

Stotinu i pedeset odraslih ženki Wistar štakora, težine 250 do 300 g, dobivenih iz Charles River uzgoja smješteno je u McMaster sveučilišni centar medicinskih znanosti (HSC) središnji životinjski dio (GAF) tijekom najmanje jednog tjedna. Tijekom navedenog vremena izloženi su testovima izvođenja koji su dolje opisani, kako be se osiguralo da su upoznati s njima. Štakori su obrađivani svaki dan tijekom 2 tjedna prije kirurškog zahvata.

Štakori su anestezirani primjenom izoflurana (3-5%): O2 (1 L/min) u prikladno opremljenoj kirurškoj Sali u CAF-u. Temgesic (0.03 mg/kg tjelesne težine, supkutano (SQ)) je primjenjen prije kirurškog zahvata radi smanjenja boli. Leđne moždine su prignječene (komprimirane) sa 3.5 mm širokom modificiranim peanom (Blight 1991, postupak revidiran u Rathbone laboratoriju). Peani su zatvoreni tako da je ostavljen razmak od 1.4 mm tijekom 15 sekundi, koji je doveo do razine ozljede koja odgovara srednjem nivou (umjerena) na Gruner skali (1996). Kompresivna ozljeda je na drugi način dobivena prema postupku koji je opisao Blight (1991).

Životinje su praćene kako bi se odredilo ponašanje zbog boli uzrokovane infekcijom mokraćnog sustava ili retencijom urina. Bol je liječena Tynenolom (0.8 mg/10 gm tjelesne težine oralno primjenjenog).

Kako bi se spriječila urinarna infekcija, ordinirana je Septra (Trimetoprim-Sulfometoksazol) peroralno (4.5 ml u 300 ml vode) l dan prije i 5 dana nakon operacije, a primjenjena je i manualna ekspresija mokraćnog mjehura. U slučaju infekcija, tj. bilo koje infekcije mokraćnog sustava, na koju ukazuje zamućeni ili krvavi urin, Baytril (enrofloxacin, 7 mg/kg b.w.) je injiciran supkutano (SQ) dva puta dnevno.

Promjene u lokomotornom ponašanju i segmentnim refleksima su procjenjene 5 tjedana nakon ozljede. Životinje su ispitivane tijekom testa hoda otvorenog polja, a procjenjeni su položaj stražnje noge i orijentacija stopala. Procjena je izvršena 2, 7, 14, 21, 28 i 35 dan nakon operativnog zahvata. 35. dan nakon operativnog zahvata, ne dolazi više gotovo do nikakvog daljnjeg spontanog oporavka. Zbog toga je liječenje započeto 35. dan. HP 184 je otopljen u steriliziranoj, deioniziranoj obrnutoj osmozi izloženoj vodi zakiseljenoj ledenom octenom kiselinom (0.1 ml kiseline na 10 ml vode). 4-AP (Sigma, molekulske težine 94.12; Jankowska E. i sur, 1982; Gruner i sur., 1999) je otopljen u fiziološkoj otopini (0.6 mg/kg b.w.) i primjenjen je i.p. injekcijom.

Jedna skupina štakora (vehikl kontrola-1) primila je vehikl oralom gavažom. Bihevioralno ispitivanje je učinjeno neposredno prije primjene gavaže i tri sata kasnije. Zatim su štakori skarificirani 35. dan. Svi su drugi štakori primili bilo HP 184 oralnom gavažom (0.3, l ili 3 mg/kg ovisno o skupini) ili 4-AP (0.6 mg/kg, i.p.) ili vehikl (vehikl kontrola-2) jedanput dnevno 35. do 42. dana nakon operativnog zahvata. Tijekom navedenih dana izvedeni su bihevioralni testovi neposredno prije provođenja gavaže, te 3 i 24 sata nakon. Zatim je izvršena perfuzija 43. dan nakon zadnjeg bihevioralnog ispitivanja.

Video snimanje bihevioralnog ispitivanja primjenom Hi-8, je izvršeno 35 i 43. dan nakon kirurškog zahvata.

Statističke analize su učinjene na Macintosh kompjutoru primjenom GB-Stat ppc 6.5.2. Bihevioralni rezultati su analizirani Kruskal-VJallis neparametrijskom analizom varijance (ANOVA). Post hoc usporedbe su učinjene primjenom Mann-Whitney U testova.

Pregled oporavka lokomotorne sposobnosti otvorenog polja je procjenjen srednjim OFT rezultatima za svaku pojedinu skupinu, a dobivene vrijednosti su prikazane na Slikama 6a i 6b. Navedeni rezultati pokazuju da ponašanje životinja liječenih sa HP 184 ili 4-AP se značajno razlikovalo od ponašanja životinja kontrolne skupine koje su primile vehikl. ANOVA za ponavljana mjerenja pokazuje učinak liječenja (p<0.01) od 35. do 42. dana.

Rezultati pokazuju da i 4-AP i HP 184 imaju pozitivan učinak, dovodeći do poboljšanja rezultata bihevioralnog testiranja nakon umjerene kronične kompresije leđne moždine. Iako su sve tri koncentracije HP 184 imale pozitivan učinak, najbolji je oporavak lokomotorne funkcije zapažen pri dozi od 3 mg/kg HP 184, potvrđujući time već uočeni učinak HP 184 u navedenoj dozi. Prikazani rezultati isto tako upućuju da najniža doza (0.3 mg/kg) koncentracije HP 184 isto tako ne znači da je to i najniža učinkovita doza HP 184 u navedenom primjeru.

Histološke studije leđne moždine

Ispitivanje koje je provedeno kako bi se utvrdilo da li HP 184 utječe na količinu mijelina kod štakora sa umjerenom dugoročnom ozljedom prignječenja leđne moždine kada je primjenjen dugo nakon nastanka ozljede.

Leđne moždine štakora iz prethodno opisanih ispitivanja procjene korištene su u ovoj studiji.

21. dan nakon operacije, eksperimentalni pacijenti su duboko anestezirani natrijevim pentobarbitalom (50-60 mg/kg tjelesne težine, i.p.) i perfundirani transkardijalno - prvo sa 100 mL 0.05M fiziološke otopine puferirane fosfatom (PBS) koja sadrži 0.1% heparina, a zatim sa 300-500 mL 4% paraformaldehida (PFA). Segmenti T9 do Li leđne moždine su izvađeni, zatim krio-zaštićeni u 30% otopini sukroze i zamrznuti na -70°C u 10.24% polivinilnom alkoholu i 4.26% polietilen glikolu.

Segment svake moždine uključujući mjesto lezije plus 10 mm rostralno i kaudalno od mjesta lezije je pohranjen u Tkivni Tek medij. Serijski rezovi su longitudinalno izrazani u 20 μm intervalima na kriostatu. Svaki treći rez je obojen sa luksolskim brzim modrilom na mijelin. Procjena je izvršena promatračima koji nisu bili upoznati sa ispitivanim uzorcima (slijepi pokus), na kodiranim slajdovima. Rezovi su ispitivani pod svjetlosnim mikroskopom obzirom na veličinu demijelinizacije (područje koje nije obojeno luksolskim brzim modrilom).

Za određivanje maksimalno demijeliniziranih područja moždine, cijeli rez je digitaliziran na fotografijama primjenom Zeiss mikroskopa. Opseg demijelinizacije je izmjeren na središtu lezije primjenom kompujuteriziranog Bioquant BQ-TCW98 programa za analizu slike, a mjerio ga je istraživač kojem je nepoznata terapijska skupina.

Statistička analiza je izvedena na Macintosh kompjutoru primjenom GB-Stat ppc 6.5.2. Histološki rezultati su analizirani Kruskal-Wallis ne parametričnom analizom varijance (ANOVA). Post hoc usporedbe su izvedene primjenom Mann-Whitney U-testova.

Opseg demijelinizacije za šest eksperimentalnih skupina (0.3, 1, ili 3 mg/kg tj. težine ovisno o skupini, bilo 4-AP 0.6 mg/kg ili kao kontrola 112 vehikl) prikazan je na Slici 7. Stupci predstavljaju broj piksela demijeliniziranog područja u centru prignječenja. (**P<0.001, *P<0.05, Kruskal-Wallis ne parametrična analiza varijance (ANOVA)) Kvantitativni rezultati su pokazali da moždine životinja liječenih s HP 184 ili 4-AP su imale značajno veća mijelinizirajuća područja od onih kontrolne skupine kod kojih je primjenjena fiziološka otopina. Odnosno, moždine životinja koje su primile injekcije vehikla, imale su značajno veća područja demijelinizacije u usporedbi sa životinjama koje su primale HP 184 ili 4-AP.

Histološka analiza je pokazala da i HP 184 (u sve tri koncentracije) i 4-AP imaju dobar učinak na mijelinizaciju, što je u skladu s rezultatima bihevioralnog ispitivanja. Od navedenih skupina, životinje liječene sa dozom 3 mg/kg HP 184 pokazuju najmanje demijelinizacije. Zbog toga, HP 184 izgleda da dovodi do remijelinizacije u stadiju dugo nakon ozljede leđne moždine. Malo je vjerojatno da podaci upućuju samo na smanjenje stope gubitka mijelina, budući da nije zabilježena razlika u veličini demijelinizacije u dvije kontrolne skupine, kontrola 1 i kontrola 2, procijenjene na početku i na kraju ispitivanja.

PRIMJER 7

UČINAK INTRAVENOZNO PRIMJENJENOG HP 184 NA IRITACIJU MOKRAĆNOG MJEHURA KOD ŠTAKORA

Prikazano ispitivanje pokazuje učinak intravenoznoprimjenjenog HP 184 u KCl modelu opisanom od Fraser i sur (2001). Fraser i sur su kombinirali liječenje protamin sulfatom, za koji se mislilo da oštećuje funkciju stanične barijere ureteralnog kišobrana, i fiziološke koncentracije KCl u urinu (500 mM). Učinci intravenozno primjenjenog HP-184 su uspoređivani sa samim vehiklom (n=4/skupini) u studiji odgovora na kumulativno doziranje uretanom anesteziranih štakora sa akutnom iritacijom mokraćnog mjehura. Kontinuirana otvorena cistometrija, kojom se mjeri punjenje i pražnjenje mokraćnog mjehura tijekom kontinuirane infuzije, korištena je za određivanje učinka lijeka na iritaciju mokraćnog mjehura. Kada je mjehur iritiran, češće se kontrahira tijekom istog intervala punjenja zbog preosjetljivosti C-vlakana aferentnih živaca. Slika 8 prikazuje o dozi ovisno smanjenje učestalosti kontrakcija mokraćnog mjehura od vrijednosti iritacije prije primjene lijeka u usporedbi sa učinkom samog vehikla. Analiza varijance za ponavljana mjerenja upućuje da sam vehikl nije imao učinka, no HP-184 je značajno smanjio učestalost kontrakcija mokraćnog mjehura kod iritiranih mokraćnih mjehura na način ovisan o dozi (P=0.0019).

PRIMJER 8

UČINAK HP 184 NA RAZINU PROIZVODNJE NO U MIŠEVA

Miševima je injicirano 30 mg/kg HP 184 (ip) 30 minuta prije LPS (3 mg/kg, ip). Miševi su žrtvovani 5 sati nakon LPS injekcije i sakupljena je plazma. Razine nitrata su određene primjenom Griess testa. Skupine su se sastojale od 9 do 10 miševa svaka. Kao što je prikazano grafički na Slici 9, HP 184 inhibira proizvodnju NO. Nakon jednosmjerne ANOVA, samo s LPS liječenjem su zabilježene statistički značajne razlike u odnosu na liječenje vehiklom.

PRIMJER 9

HP 184 U MODELU NEUROPATSKE BOLI

Odraslim mužjacima Sprague-Dawley štakora je učinjena konstrikcija L6 živca kako bi se postiglo kronično oštećenje živca. Nakon oporavka od operativnog zahvata (3 do 7 dana nakon operacije) životinjama je ispitivan prag pri kojem dolazi do povlačenja zahvaćene šape nakon mehaničkog podražaja. To je ostvareno primjenom kalibriranih von Frey monofilamenata na plantarnu površinu svake stražnje šape. Samo životinje sa 50% smanjenjem u pragu povlačenja šape na kojoj je izvedena ligacija živca su uključene u ispitivanje i nasumce su svrstane u jednu od 6 skupina: tri skupine su primile jednu od tri doze HP 184 (0.3, 3 i 20 mg/kg, po), četvrta skupina je primila jednokratnu dozu drugog spoja pod nazivom MDL (10 mg/kg, ip), peta skupina je primila gabapentin (90 mg/kg, se), a šesta skupina je primila samo vehikl. Bihevioralno testiranje je provedeno 45 minuta nakon primjene gabapentina (90 mg/kg, se), i 3 sata nakon HP 184, MDL i vehikla. Različiti rezultati praga povlačenja šape sa podvezanim živcem i intaktne šape su izračunati za svaku životinju posebno, a dobivene razlike su ispitane ANOVA sa skupinom kao glavnim faktorom. Rezultati su prikazani na Slici 10. Grafovi prikazuju Prosjek (± SEM) razlike praga povlačenja lijeve (podvezane) minus desne (normalne) šape prije i nakon prve primjene lijeka (akutna faza studije). Statistička analiza ukazuje na o dozi ovisno smanjenje L5 ligacijske mehaničke hiperalgezije izazvano primjenom HP 184 u dozi od 20 mg/kg i jasni obrat hiperalgezije primjenom gabapentina u dozi od 90 mg/kg. Analiza je izvršena između/unutar ponavljanih mjerenja ANOVA. Nakon toga je uslijedila post hoc usporedba (LSD) na skupini X utjecaja vremena na ispitivanje vrijednosti praga povlačenja prije i nakon primjene lijeka.

Skupina: F(5,43) = 8.18, p<0.001

Vrijeme: F(1.43) = 47.34, p<0.001

Skupina X vrijeme: F(5,43) = 9.25, p<0.001

U skupini životinja liječenih vehiklom, postoji značajna razlika u pragovima mehaničkog povlačenja između dvije šape.

Reference

Agoston S, Bowman WC, Houwertjes MC, Rodger IW, Savage AO. Izravno djelovanje 4-aminopiridina na kontraktilnost brzo-kontrahirajućih mišića kod mačke. Clin Exp Pharm Physiol 1982; 9: 21-34.

Aisen ML, Sevilla D, Gibson G, Kutt H, Blau A, Edelstein L, Hatch J i Blass J (1995) 3,4-Diaminopiridin u liječenju amiotrofične lateralne skleroze. J Neurol Sci. 129:21-24.

Alnaes E i Rahaminoff R (1975) O ulozi mitohondrija u otpuštanju transmitora iz završetaka motoričkih živaca. J. Physiol (Lond) 248:285-306.

Backhauss C, Karkoutlγ C, Welsch M, i Krieglstein J (1992): Mišji model fokalne cerebralne ishemije za odabir neuroprotektivnih učinaka lijekova. J Pharmacological Meth. 27:27-32.

Bali AP, Hopkinson RB, Farrell ID (1979): Ljudski botulizam izazvan Klostridijom botulini tip E: Birminghamsko otkriće Q.J. Med. 48-473-491.

Behrmann DL, Bresnahan JC, Beattie MS, Shah Br. Ozljeda leđne moždine uzrokovana trajnim mehaničkim pomakom moždine štakora: bihevioralna i histološka analiza. J. Nurotrauma, 9:197-217, 1992.

Bennett GJ i Xie YK (1998) Periferna mononeuropatija kod štakora izaziva poremećaje osjećaja boli nalik onima zapaženim kod ljudi. Pain. 33:87-107.

Bever CT (1996) Aminopiridini u udžbeniku Multiple skelroze, ed SD Lick, Marcel Dekker, str. 429-42.

Bever CT, Jr., Young D, Anderson PA, Krumholz A, Conway K, Leslie J, Eddington N, Plaisance Kl, Panitch HS, Dhib-Jalbut S. Učinci 4-aminopiridina kod bolesnika sa multiplom sklerozom: rezultati randomiziranog, placebo kontroliranog, dvostruko slijepog, koncentracija kontroliranog, unakrsnog ispitivanja. Neurol 1994; 44: 1054-1059.

Blight AR i DeCrescito V. Morfometrijska analiza eksperimentalno izazvane ozljede leđne moždine kod mačke: povezanost intenziteta ozljede i preživljavanja mijeliniziranih aksona. Neuroscience 1986: 19: 321-41.

Blight AR. Morfologija kronične ozljede leđne moždine kod mačke: Analiza mijeliniziranih aksona uzimanjem uzastopnih uzoraka. Neuroscience, 10: 521-543, 1983.

Blight AR. Morfometrijska analiza modela ozljede leđne moždine kod zamoraca, s bihevioralnim dokazom odgođene sekundarne patologije. J Neurol Sci, 103: 156-171, 1991.

Bostock H, Sherratt RM, Sears TA. Nadvladavanje poremećaja prijenosa impulsa u demijeliniziranim živčanim vlaknima produženjem akcijskih potencijala. Nature 1978; 274: 385-387.

Bostock H, Sears TA, Sherratt RM. Učinci 4-aminopiridina i tetraetilamonijevih iona na normalna i demijelinizirana živčana vlakna sisavaca. J Physio(Lond) 1981; 314: 301-315.

Bunge RP, Puckett WR, Bercerra JL, Marcillo A, Quencer RM. Zapažanja o patologiji ozljede leđne moždine kod ljudi. Pregled i klasifikacija 22 nova slučaja s detaljima iz slučaja kronične kompresije moždine s opsežnom fokalnom demijelinizacijom. In: Seil FJ, ed. Advances in neurologγ, vol 59, New York: Raven Press, 1993: 75-89.

Davis FA, Stefoski D, Rush J. Peroralno primjenjen 4-aminopiridin poboljšava kliničke znakove multiple skleroze. Ann Neurol 1990; 27: 186-192.

Duchen, MR (1992) Ca+2-ovisne promjene energetike mitohondrija u jednostrukim disociranim mišjim senzoričkim neuronima. Biochem J. 283: 41-50.

Eder C (1998) lonski kanali u mikrogliji (moždani makrofagi) Am.J.Physiol. 275 (Cell Physiol. 44): C327-C342.

Fraser MO, Chuang Y, Lavelle JP, Yoshimura N, de Groat WC, Chancellor MB (2001) pouzdan, nedestruktivan životinjski model intersticijskog cistitisa: intravezikalni protamin sulfat u niskoj dozi kombiniran sa fiziološkim koncentracijama kalijeva klorida. Urology 57 (Suppl 1): 112.

Gruner JA i Yee AK (1999) 4-Aminopiridin pojačava pobuđene motoričke potencijale nakon postupne ozljede prignječenjem leđne moždine kod štakora. Brain Res. 816: 446-56.

Gruner JA, Wade CK, Menna G i Stokes BT. Mioelektrični pobuđeni potencijali u usporedbi s lokomotoričnim oporavkom kod kroničnih ozljeda leđne moždine u štakora. J. Neurotrauma, 10:327-347, 1993.

Gruner JA, Yee AK, Blight AR. Histološka i funkcionalna procjena eksperimentalno izazvane ozljede leđne moždine: dokaz postupnog odgovora na stupnjevitu kompresiju. Brain Res., 729:90-101, 1996.

Gruner JA, Yee AK. 4-Aminopiridin pospješuje motoričke pobuđene potencijale nakon postupne kompresivne ozljede leđne moždine kod štakora. Brain Res. Jan 23; 816(2): 446-56, 1999.

Hamilton, MG i Lundy PM (1995) Učinak rutenijskog crvenila na voltažne Ca+2 kanale. JPET 273:940-947.

Hayes KC, Blight AR, Potter PJ, Allatt RD, Hsieh JT, Wolfe DL, Lam S, Hamilton JT. Pretkliničko ispitivanje 4-aminopiridina kod bolesnika sa kroničnom ozljedom leđne moždine. Paraplegia 1993; 31: 216-224.

Hayes KC, Potter PJ, Wolfe DL, Hsieh JT, Delaney GA, Blight AR. 4-Aminopiridin-osjetljivi neurološki deficiti kod bolesnika sa ozljedom leđne moždine. J Neurotrauma 1994; 11: 433-446.

Hirsh JK, Quandt FN. Aminopiridinska blokada kalijevih kanala kod mišjih stanica neuroblastoma. J Pharmacol Exp Ther 1993; 267: 604-611.

Hockfield S. Carolson S, Evans C, i sur. Odabrani postupci istraživanja uzoraka protutijela i nukleinskih kiselina. USA: Cold Sprint Harbour Laboratorγ Press, str. 125-130, 1993.

Jankowska E, Lundberg A., Rudomin P i Sykova E. Učinci 4-Aminopiridina na prijenos sinapsom leđne moždine mačke. Brain Research, 240: 117-129, 1982.

Jones RE, Heron JR, Foster DH, Snelgar RS, Mason RJ. Učinci 4-aminopiridina kod bolesnika sa multiplom sklerozom. J Neurol Sci 1983; 60: 353-362.

Kerasidis H, Mrathall JR i Gale K. Bihevioralna procjena funkcionalnog deficita kod štakora sa kontuzivnom ozljedom leđne moždine. J. Neurosci. Methods, 20: 167-179, 1987.

Lowry MAR, Goldbert JI i Belosevic M (1998) Indukcija sinteze dušičnog oksida (NO) u murinim makrofazima zahtijeva aktivnost kalijevih kanala. Clin Exp Immunol 111:597-603.

Lundh H (1978) Učinci 4-aminopiridina na neuromuskularni prijenos signalal. Brain Res. 153:307-318.

Lund H i Thesleff S (1977) Način djelovanja 4-aminopiridina i gvanina na transmitor iz završetaka motoričkog živca. Eur. J. Pharmacol. 42:411-12.

Lundh H, Nilsson O, Rosen I. 4-Aminopiridin - novi lijek ispitan u liječenju Eaton-Lambertova sindroma. J Neurol Neurosurg Psγchiat 1977; 40: 1109-1112.

Lundh H, Leander S, Thesleff S (1977): Antagonizam paralize proizvedene botulinum toksinom kod štakora. J. Neurol. Sci. 32:29-43.

Kim SH i Chung JM (1992) Eksperimentalni model periferne neuropatije proizvedene segmentalnom ligacijom spinalnog živca kod štakora. Pain 50:355-363.

Madge DJ (1998): Natrijevi kanali: posljednja dostignuća i terapijske mogućnosti, In Annual Reports in Medicinal Chemistry, Volumen 33 (Bristol JA glavni urednik, Academic Press, San Diego), str. 51-60.

McEvoy KM, Mindebank AJ, Daube JR i Low P (1989): 3,4-Diaminopiridin u liječenju Lambert-Eatonova mijasteničnog sindroma (N.Engl.J.Med. 321:1567-71.

Mcllay LM, Halley F, Souness JE, McKenna J, Benning V, Birrell M, Burton B, Belvisi M, Collis A, Constan A, Foster M, Hele D, Jayyosi Z, Kelley M, Maslen C, Miller G, Ouldelhkim MC, Page K, Phipps S, Pollock K, Porter B, Ratcliffe AJ, Redford EJ, Webber S, Slater B, Thybaud V, Wilsher N (2001) Otkriće RPR 200765A, inhibitora p38 MAP kinaze koji pokazuje dobru oralnu anti-artritičnu učinkovitost. Bioorg Med Chem 9: 537-54.

Meza-Ruiz G i Tapia R (1978) [3H]GABA otpuštanje u sinaptosomalnim frakcijama nakon intrakranijalne primjene rutenijskog crvenila. Brain Res. 154: 163-166.

O'Neill MJ, Bath CP, Dell CP, Hicks CA, Gilraore J, Ambler SJ, Ward MA, Bleakman D (1997): Učinci inhibitora Ca2+ i Na+ kanala in vitro i u globalnoj cerebralnoj ishemiji in vivo. Eur J Pharmacol 332(2): 121-31 RIL 10 mg/kg reference

Pendlebury ST, Lee MA, Blamire AM, Styles P i Matthews PM (2000) Koreliranje markera magnetske rezonance aksonalne ozljede i demijelinizacije u motoričkom oštećenju nakon inzulta i multiple skleroze. Magn. Reson. Imaging 18:369-78.

Person RJ i Kuhn JA (1979) Depresija spontanog i ionoforski induciraneg otpuštanja transmitora rutenijskim crvenilom na neuromuskularnoj ploči. Brain Res. Buli 4: 669-674.

Potter PJ, Hayes KC, Hsieh JT, Delaney GA, Segal JL. Održano poboljšanje neurološke funkcije ozljede leđne moždine kod bolesnika liječenih 4-aminopiridinom: tri slučaja. Spinal Cord 1998a; 36:147-155.

Potter PJ, Hayes KC, Segal JL, Hsieh JT, Brunnemann SR, Delaney GA, Tierney DS i Mason D (1988b): Randomizirano, dvostruko slijepo, unakrasno ispitivanje fampridina-SR (4-aminopiridin s produženim otpuštanjem) kod bolesnika sa nepotpunom ozljedom leđne moždine. J. Neurotrauma 15: 837-49.

Pyo H, Chung S, Jou I, Gwag B i Joe EH (1997) Ekspresija i funkcija vanjskih K+ kanala inducirana lipopolisaharidima u mikrogliji. Mol Cells 7:610-614.

Qiao J, Haγes KC, Hsieh JT, Potter PJ, i Delaneγ GA (1997): Učinci 4-aminopiridina na inducirane motoričke potencijale uz prisutnu ozljedu leđne moždine. J Neurotrauma 14:135-49.

Rampe, D., Murawsky, M.K., Grau, J. i Lewis, E.W. Antipsihotik sertindol predstavlja antagonist visokog afiniteta za kalijeve kanale u ljudskom srcu HERG. J. Pharmacol. Exp. Ther. 286: 788-793, 1998.

Rataud J, Bebarnot F, Mary V, Pratt J i Stutzmann JM (1994): Komparativno ispitivanje blokatora voltažnih natrijevih kanala u fokalnoj ishemiji i električnim konvulzijama kod glodavaca. Neuro Sci Lett. 172:10-23.

Sakurai M i Kanazawa I (1999) Pozitivni simptomi u multiploj sklerozi: njihovo liječenje blokatorima natrijevih kanala, lidokainom i meksiletinom. J Neurol. Sci. 162:162-168.

Saruhashi Y i Young W. Učinak mianserina na lokomotornu funkciju nakon torakalne hemisekcije leđne moždine kod štakora. Expl Neurol., 129:207-216, 1994

Savage AO. Usporedba učinaka 4-dimetilaminopiridina i 4-aminopiridina na izolirane pripravke srčanog i skeletnog mišića. Arch Internat Pharmacodynam Therapie 1985;273:262-276.

Schwid SR, Petrie MD, McDermott MP, Tierneγ DS Mason DH i Goodman AD (1997): Kvantitativna procjena produženog otpuštanja 4-aminopiridina za simptomatsko poboljšanje multiple skleroze. Neurology 48:817-21.

Segal JL, Pathak MS, Hernandez JP, Himber PL, Brunnemann SR i Charter RS (1999): Neškodljivost i učinkovitost 4-aminopiridina kod ljudi s ozljedom leđne moždine: Dugoročno, kontrolirano ispitivanje. Pharmacotherapy 19:713-723.

Seltzer Z, Dubner R i Shir Y (1990) Novi bihevioralni model poremećaja neuropatske boli proizveden kod štakora s djelomičnom ozljedom ishijadikusa. Pain 43:205-218.

Sherratt Z, Bostock H, Sears TA. Učinci 4-aminopiridina na normalna i demijelinizirana živčana vlakna sisavaca. Nature 1980; 283: 570-572.

Shi R, Blight AR. Različiti učinci niskih i visokih koncentracija 4-aminopiridina na provođenje aksonima kod normalne i ozljedene leđne moždine. Neurosci 1997; 77:553-562.

Smith, C.P., A.T. Woods, Corbett, R., S.M.Chesson, G.M.Bores, W.W.Petko, J.E.Roehr i S.Kongsamut. Serotoninergička aktivnost HP 184; Da li spontano otpuštanje ima značaj? Neurochemical Research 21:573-583, 1996.

Smith, C.P., L.R. Brougham, F.P. Huger, L. Daviš, J.T. Klein i R.C. Effland. HP 184 [N-(n-propil)-N-(3-fluoro-4-piridinil) -1H-3-metilindol-1-amin hidroklorid].: In vitro spontano otpuštanje acetilkolina (ACh) i norepinefrina (NE). Drug Dev. Res. 30:203-212, 1983.

Stefoski D, Davis FA, Faut M, Schauf CL. 4-Aminopiridin poboljšava kliničke znakove multiple skleroze. Ann Neurol 1987; 21: 71-77.

Sweitzer SM, Colburn RW, Rutkowski M i DeLeo JA (1999) Akutna periferna upala inducira umjerenu aktivaciju glije i spinalnu ekspresiju IL-1β u skladu s ponašanjem štakora u boli. Brain Res. 829:209-221.

Tang L i Kongsamut S (1996) Inhibicija ovisna o učestalosti otpuštanja neurotransmitora besipridinom i HP 184. Eur J Pharmacol 300:71-74.

Tang L., Huger, F.P., Klein, J.T., Daviš, L., Martin, L., Shimshock, S., Effland, R.C., Smith, C.P. i Kongsamut, S. (1998) Derivati 4-aminopiridina: Obitelj novih modulatora voltažnih natrijevih kanala. Drug Dev. Res., 44: 8-13.

Tang L., C.P. Smith i S. Kongsamut. Besipridin inhibira učinke veratridina na voltažne natrijeve kanale. Br J. Pharmacol 116:2468-2472, 1995.

Tapia R i Velasco I (1997) Rutenijsko crvenilo kao sredstvo za ispitivanje kalcijevih kanala, neuronske smrti i funkcije neuralnih puteva. Neurochem Int 30:137-147.

Tapia R i Meza-Ruiz G (1977) Inhibicija rutenijskim crvenilom o kalciju ovisnog otpuštanja [3H]GABA u frakcijama sinaptosoma. Brain Res. 126:160-166.

Tapia R, Meza-Ruiz G, Duran L i Drucker-Colin RD (1976) Konvulzije ili flacidna paraliza inducirana rutenijskim crvenilom ovisno o načinu primjene. Brain Res. 116:101-109.

Tapia R i Stiges M (1982) Učinak 4-aminopiridina na otpuštanje transmitora u sinaptosomima. Brain Res. 250:291-9.

Tapia R (1982) Antagonizam rutenijskim crvenilom inducirane paralize kod miševa, 4-aminopiridinom, gvanidinom i lantanom. Neurosci Lett 35:615-623.

Targ EF, Kocsis JD. 4-Aminopiridin dovodi do oporavka provođenja u demijeliniziranom ishijadičnom živcu štakora. Brain Res 1985; 328: 358-361.

Targ EF, Kocsis JD. Karakteristike akcijskog potencijala demijeliniziranog ishijadičnog živca štakora nakon primjene 4-aminopiridina. Brain Res 1986; 363: 1-9.

van Diemen HA, Poiman CH, van Dongen TM, van Loenen AC, Nauta JJ, van Walbeek HK, Koetsier JC. Učinak 4-aminopiridina na kliničke znakove multiple skelroze: randomizirano, placebo kontrolirano, dvostruko slijepo, unakrsno ispitivanje. Ann Neurol 1992; 32: 123-130.

van Diemen HA, Poiman CH, van Dongen MM, Nauta JJ, Strijers RL, van Loenen AC, Bertelsmann FW, Koetsier JC. 4-Aminopiridin inducira funkcionalno poboljšanje kod bolesnika sa multiplom sklerozom: neurofiziološka studija. J. Neurol Sci 1993; 116: 220-226.

Yamaguchi S i Rogawski MA (1992): Učinci antikonvulzivnih lijekova na 4-aminopiridinom inducirane epileptičke napadaje kod miševa. Epilepsy Res. 11:9-16.

Patenti:

Effland RC, Klein JT, Daviš KL Olsen GE; U.S.Patent Br. 4,970,218 pod nazivom «N-(Piridinil)-1H-indol-1-amini».

Hansebout RR i Blight AR; U.S. Patent Br. 5,545648 pod nazivom «Primjena 4-aminopiridina na smanjenje kronične boli i spasticiteta kod bolesnika sa ozljedom leđne moždine».

Hansebout RR i Blight AR; W0 94/14439 pod nazivom «Primjena 4-aminopiridina u liječenju neuroloških stanja».

Huger, F.P., Kongsamut, S., C.P.Smith & L. Tang. US Patent Br. 5,776,955 pod nazivom «Primjena nesupstituiranih i supstituiranih N-(pirol-1-il)piridinamina kao antikonvulzivnih agensa».

Kongsamut, S., C.P. Smith & A.T. Woods; U.S. Patent Br. 5,356,910 pod nazivom «Primjena N-(Piridinil)-1H-indol-1-amina u liječenju opsesivno kompulzivnog poremećaja».

Kongsamut, S., C.P. Smith & A.T. Woods; U.S. Patent Br. 5,356,910 pod nazivom «Primjena N-(Piridinil)-1H-indol-1-amina za pripravljanje medikamenta namjenjenog liječenju opsesivno kompulzivnih poremećaja».

Masterson JG i Myers M; US Patent Br. 5,370,879 pod nazivom «Formulacije i njihova primjena u liječenju neuroloških bolesti».

Masterson JG i Myers M; US Patent Br. 5,580,580 pod nazivom «Formulacije i njihova primjena u liječenju neuroloških bolesti».

Masterson JG i Myers M; US Patent Br. 5,540,938 pod nazivom «Formulacije i njihova primjena u liječenju neuroloških bolesti».

Wurtman RJ i Buyukysal R; W0 89/09600 pod nazivom «Postupak i pripravak za liječenje neuroloških poremećaja».

Claims (33)

1. Postupak liječenja demijelinizirajućih bolesti, naznačen time, da obuhvaća primjenu terapijski učinkovite količine spoja formule I kod bolesnika kojemu je liječenje neophodno [image] u kojoj m predstavlja 0, 1 ili 2; n predstavlja 0, 1 ili 2; p predstavlja 0 ili 1; svaki R nezavisno predstavlja vodik, halogen, trifluorometil, C1-C6alkil, C1-C6alkenil, C1-C6alkanoil, benziloksi, hidroksi, nitro ili amino; svaki R1 nezavisno predstavlja vodik, C1-C6alkil, C1-C6alkenil, C1-C6alkanoil, halogen, cijano, -C(O)C1-C6alkil, -C1-C6alkilenCN, -C1-C6alkilenNR'R" u kojem R' i R" međusobno nezavisno predstavljaju vodik ili C1-C6alkil, -C1-C6alkilenOC(O)C1-C6alkil, ili -CH-(OH)R4 u kojem R4 predstavlja vodik ili C1-C6alkil; R2 je vodik, C1-C6alkil po izboru supstituiran halogenom, hidroksi ili benziloksi skupinom, C1-C6alkenilom, C1-C6alkinilom, -CO2C1-C6alkil, ili -R5-NR'R" u kojem R5 predstavlja C1-C6alkilen, C1-C6alkenilen ili C1-C6alkinilen, a R' i R" su međusobno nezavisni vodik, C1-C6alkil ili na drugi način, skupina -NR'R" u cijelosti predstavlja 1-pirolidinil; a R3 predstavlja vodik, nitro, amino, halogen, C1-C6alkoksi, hidroksi ili C1-C6alkil, ili njihove farmaceutski prihvatljive soli.

2. Postupak u skladu sa zahtjevom 1, naznačen time, da R predstavlja vodik, halogen, trifluorometil ili C1-C6alkil; R1 je vodik ili C1-C6alkil; R2 je vodik ili C1-C6alkil; R3 je vodik, C1-C6alkil ili halogen; a p predstavlja 0.

3. Postupak u skladu sa zahtjevom 1, naznačen time, da je demijelinizirajuća bolest multipla skleroza.

4. Postupak u skladu sa zahtjevom 2, naznačen time, da sadrži spoj slijedeće formule [image]

5. Postupak u skladu sa zahtjevom 4, naznačen time, da je demijelinizirajuća bolest multipla skleroza.

6. Postupak liječenja demijelinizirajućih stanja, naznačen time, da obuhvaća primjenu terapijski učinkovite količine spoja iz zahtjeva 1 kod bolesnika kojemu je navedeno liječenje neophodno.

7. Postupak u skladu sa zahtjevom 6, naznačen time, da R predstavlja vodik, halogen, trifluorometil, ili C1-C6alkil; R1 je vodik ili C1-C6alkil; R2 je vodik ili C1-C6alkil; R3 je vodik, C1-C6alkil ili halogen; a p predstavlja 0.

8. Postupak u skladu sa zahtjevom 6, naznačen time, da demijelinizirajuće stanje predstavlja ozljedu leđne moždine.

9. Postupak u skladu sa zahtjevom 6, naznačen time, da demijelinizirajuće stanje predstavlja ozljedu mozga nastalu traumom.

10. Postupak u skladu sa zahtjevom 6, naznačen time, da demijelinizirajuće stanje predstavlja cerebrovaskularni inzult.

11. Postupak u skladu sa zahtjevom 7, naznačen time, da sadrži spoj slijedeće formule [image]

12. Postupak u skladu sa zahtjevom 11, naznačen time, da demijelinizirajuće stanje predstavlja ozljedu leđne moždine.

13. Postupak u skladu sa zahtjevom 11, naznačen time, da demijelinizirajuće stanje predstavlja ozljedu mozga uzrokovanu traumom.

14. Postupak u skladu sa zahtjevom 11, naznačen time, da demijelinizirajuće stanje predstavlja cerebrovaskularni inzult.

15. Postupak rehabilitacije nakon preboljelog inzulta, naznačen time, da obuhvaća primjenu terapijski učinkovite količine spoja iz zahtjeva l bolesniku kojemu je navedeno liječenje neophodno.

16. Postupak u skladu sa zahtjevom 14, naznačen time, da R predstavlja vodik, halogen, trifluorometil, ili C1-C6alkil; R1 je vodik ili C1-C6alkil; R2 je vodik ili C1-C6alkil; R3 je vodik, C1-C6alkil ili halogen; a p predstavlja 0.

17. Postupak u skladu sa zahtjevom 16, naznačen time, da sadrži spoj slijedeće formule [image]

18. Postupak blokiranja kalijevih kanala, naznačen time, da se primjenjuje kod bolesnika kod kojih je neophodno sprovesti liječenje primjenom terapijski učinkovite količine spoja iz zahtjeva 1.

19. Postupak u skladu sa zahtjevom 18, naznačen time, da R predstavlja vodik, halogen, trifluorometil, ili C1-C6alkil; R1 je vodik ili C1-C6alkil; R2 je vodik ili C1-C6alkil; R3 je vodik, C1-C6alkil ili halogen; a p predstavlja 0.

20. Postupak u skladu sa zahtjevom 19, naznačen time, da sadrži spoj slijedeće formule [image]

21. Postupak u skladu sa zahtjevom 2, naznačen time, da sadrži spoj slijedeće formule [image]

22. Postupak u skladu sa zahtjevom 7, naznačen time, da sadrži spoj slijedeće formule [image]

23. Postupak u skladu sa zahtjevom 22, naznačen time, da demijelinizirajuće stanje predstavlja ozljedu leđne moždine.

24. Postupak u skladu sa zahtjevom 22, naznačen time, da demijelinizirajuće stanje predstavlja ozljedu mozga uzrokovanu traumom.

25. Postupak u skladu sa zahtjevom 22, naznačen time, da demijelinizirajuće stanje predstavlja cerebrovaskularni inzult.

26. Postupak liječenja neuropatske boli, naznačen time, da obuhvaća primjenu terapijski učinkovite količine spoja iz zahtjeva l kod bolesnika kojemu je navedeno liječenje neophodno.

27. Postupak u skladu sa zahtjevom 26, naznačen time, da sadrži spoj slijedeće formule: [image]

28. Postupak liječenja iritacije mokraćnog mjehura, naznačen time, da obuhvaća primjenu terapijski učinkovite količine spoja iz zahtjeva 1 kod bolesnika kojemu je navedeno liječenje neophodno.

29. Postupak u skladu sa zahtjevom 28, naznačen time, da sadrži spoj slijedeće formule: [image]

30. Postupak liječenja prekomjerno aktivnog mokraćnog mjehura, naznačen time, da obuhvaća primjenu terapijski učinkovite količine spoja iz zahtjeva 1 kod bolesnika kojemu je navedeno liječenje neophodno.

31. Postupak u skladu sa zahtjevom 30, naznačen time, da sadrži spoj slijedeće formule: [image]

32. Postupak liječenja kemokinima inducirane boli, naznačen time, da obuhvaća primjenu terapijski učinkovite količine spoja iz zahtjeva 1 kod bolesnika kojemu je navedeno liječenje neophodno.

33. Postupak u skladu sa zahtjevom 32, naznačen time, da sadrži spoj slijedeće formule [image]