HRP20020880A2

HRP20020880A2 - New pharmaceutical composition

Info

Publication number: HRP20020880A2
Authority: HR
Inventors: Apollon Papadimitriou
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 2000-05-15
Filing date: 2002-11-07
Publication date: 2004-12-31
Also published as: EP1525889A1; WO2001087329A8; NO20025450D0; HK1056683A1; UY26704A1; ME00673B; ECSP10004352A; HRP20020880B1; IL152659A; JP3967594B2; TWI288643B; TWI288644B; AR092919A2; DE60109625D1; KR20050121762A; MXPA02011303A; EP1311285B1; AU6593401A; SI1311285T1; AU784091B2

Description

Predloženi izum odnosi se na tekući farmaceutski pripravak koji obuhvaća protein eritropoetin, višestruko nabijeni anion u farmaceutski prihvatljivom puferu prikladnom za održavanje pH otopine u rasponu od oko 5.5 do oko 7.0, i moguće jedan ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijensa. Taj je pripravak posebno koristan za profilaksu i liječenje bolesti povezanih s eritropoezom.

Eritropoeza je proizvodnja crvenih krvnih stanica koja se zbiva radi nadoknađivanja uništenja stanica. Eritropoeza je kontrolirani fiziološki mehanizam koji omogućuje da dovoljno crvenih krvnih stanica bude raspoloživo za odgovarajuću oksigenaciju tkiva. Humani eritropoetin (hEPO) koji nastaje prirodno proizvodi se u bubregu te je humoralni plazma faktor koji potiče produkciju crvenih krvnih stanica (Carnot,P i Deflandre,C (1906) C.R.Acad.Sci.143:432; Erslev,AJ (1953 Blood 8:349; Reissmann,KR (1950) Blood 5:372; Jacobson,LO, Goldwasser,E, Freid,W and Pizak,LF (1957) Nature 179:6331-4). Humani EPO koji nastaje prirodno potiče dijeljenje i diferencijaciju eritroidnih progenitora u koštanoj srži te svoje biološko djelovanje izvodi povezivanjem receptora na eritroidne prekurzore (Krantz,BS (1991) Blood 77:419).

Eritropoetin se proizvodi biosintetički primjenom tehnologije rekombinantne DNA (Egrie, JC, Strickland, TW, Lane, J et al. (1986) Immunobiol. 72:213-224) i produkt je kloniranog humanog EPO gena umetnutog i umnoženog u stanicama tkiva ovarija kineskog hrčka (CHO stanice). Primarna struktura prevladavajućeg, potpuno obrađenog oblika hEPO ilustrirana je na SEQ ID N0:1. Postoje dva disulfidna mosta između Cys7-Cys161 i Cys29-Cys33. Molekulska masa polipeptidnog lanca EPO bez šećernih skupina je 18,236 Da. U nedirnutoj EPO molekuli, približno 40% molekulske mase čine ugljikohidratne skupine koje glikosiliraju protein na glikosilacijskim mjestima na proteinu (Sasaki,H, Bothner,B, Dell,A i Fukuda,M (1987) J.Biol.Chem.262:12059).

Zbog toga što je humani eritropoetin bitan u stvaranju crvenih krvnih stanica, hormon je koristan u liječenju krvnih poremećaja karakteriziranih niskom ili defektnom proizvodnjom crvenih krvnih stanica« Klinički, EPO se upotrebljava primjerice u liječenju anemije kod pacijenata s kroničnim zatajivanjem bubrega (CRF) (Eschbach,JW, Egri,JC, Downing,MR et al. (1987JNEJM 316:73-78; Eschbach, JW, Abdulhadi,MH, Browne, JK et al. (1989) Ann. Intern. Med-.111:992; Egrie, JC, Eschbach, JW, McGuire, T, Adamson, JW (1988) Kidney Intl. 33:262; Lim, VS, Degowin,RL, Zavala,D et al. (1989) Ann. Intern. Med. 110:108-114) te kod pacijenata oboljelih od AIDS-a i karcinoma podvrgnutih kemoterapiji (Danna, RP, Rudnick, SA, Abels, RI In:MB, Garnick, ed. Erythropoietin in Clinical Applications - An International Perspective, New York, NY:Marcel Dekker; 1990:str. 301-324).

Poznati farmaceutski pripravci imaju najmanje jedan od sljedećih nedostataka:

- oni su liofilizati. Osim složenog načina proizvodnje, liofilizati imaju nedostatak da se prije injektiranja ljudima moraju rekonstituirati. To .otežava rad medicinskom osoblju, što je nepogodno i nosi rizik pogrešnog rukovanja farmaceutskim proizvodom;

- kao aditiv sadrže humani serum albumin. Kako je humani serum albumin produkt dobiven iz humane tjelesne tekućine, postoji rizik virusnih infekcija preko kontaminirajućih tvari u albuminskom pripravkuo Također su moguće alergijske reakcije;

- svi eritropoetinski pripravci trenutno dostupni na tržištu nestabilni su na povišenim temperaturama, tj. iznad temperature hladnjaka što je obično između 2 i 8°C. Prema tome, moraju se čuvati u hladnjaku (2-8°C) i ne mogu se čuvati na sobnoj temperaturi (oko 20°C). To dovodi do povećanja troškova, uzrokovanog čuvanjem i transportom na niskim temperaturama i također uzrokuje poteškoće u radu s lijekom. Nestabilno u ovom kontekstu znači da čuvanje na povišenim temperaturama, npr. 25°C, dulje vrijeme (tj. nekoliko mjeseci, ili više od 6 mjeseci) dovodi do razgradnje proteina. Razgradnja u ovom kontekstu opisuje fizičke promjene (npr. agregacija ili denaturiranje) i kemijske promjene (npr. oksidacija ili općenito modifikacija kemijskih veza) molekule proteina za koje je poznato da naročito dolaze na povišenim temperaturama (oko 8°C). Čuvanje proteina blizu ili iznad njegove prijelazne temperature (koja se također naziva i temperatura taljenja) dovodi do odmatanja proteina, tj. izgubljena je izvorna struktura i biološka aktivnost polipeptida. Temperatura prijelaza snažno je povezana s temperaturnom stabilnosti proteina i ovisna je okolišu proteina (npr. pH, soli, ionska jakost, tvar za puferiranje, itd.). Na primjer, denaturiranje može dovesti do agregacije molekula eritropoetina, tj. oblikovanja dimera (kovalentnih ili nekovalentnih), agregata višeg reda te čak i partikulata (tvari u obliku sitnih čestica). To dovodi do smanjene moći lijeka te nakon injektiranja ljudima može izazvati neželjene štetne pojave.

Prema tome, problem u osnovi predloženog izuma je pribaviti pripravak koji može umanjiti ili spriječiti gore spomenute nedostatke.

Prema predloženom izumu, problem je riješen pribavljanjem farmaceutskog pripravka koji obuhvaća protein eritropoetin, višestruko nabijeni anorganski anion u otopini pufera pH od oko 5.5 do oko 7.0, i moguće jedan ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijensa.

Neočekivano je pronađeno da se formuliranjem eritropoetina u tom pripravku poboljšava stabilnost na temperaturama iznad temperature hladnjaka (2-8°C) , osobito na sobnoj temperaturi (tj. ispod 25°C), čak i na višim temperaturama, npr. 40°C. To znači da se pripravak na dulje vrijeme može pohraniti bez hlađenja, bez da značajno izgubi moć djelovanja i bez da se značajno razgradi.

Ako drugačije nije navedeno, sljedeće definicije iznesene su radi ilustracije i definiranja značenja i dosega različitih pojmova koji se rabe radi opisivanja ovog izuma.

Pojam «višestruko nabijeni anion» odnosi se na anorganski anion koji ima dva ili više negativnih naboja po molekuli, npr. sulfat SO42-, ili fosfatni anion, tj. hidrogenfosfat HPO42-. Višestruko nabijeni anorganski anion može se dodati u obliku odgovarajuće soli, npr. natrijeve soli, kalijeve soli i njihovih smjesa, i/ili u obliku puferne tvari, npr. fosfatnog pufera.

Pojam «izoosmolalna ili izotonična» odnosi se na otopinu koja može biti pomiješana s tjelesnim fluidima bez djelovanja na njihove sastavne dijelove. Otopine koje su izotonične s krvi, kao što je natrijev klorid 0.9%, imaju isti osmotski tlak kao serum i ne utječu na membrane crvenih krvnih stanica. Općenito, otopine izotonične s krvi su oko 290 mosm/kg H2O.

Pojam «jaka anorganska kiselina» odnosi se na anorganske kiseline koje pokazuju 20 do 100% disocijaciju u 1N otopini, npr. H2SO4.

Pojam «farmaceutski prihvatljiv» kako se ovdje rabi znači da su pufer ili soli prihvatljivi u pogledu toksičnosti.

Pojam «razrjeđivač» znači sastojak u medicinskom pripravku koji nema farmakološko djelovanje, ali je farmaceutski neophodan ili poželjan* Primjerice, razrjeđivač može biti tekućina za otapanje lijeka(ova) koji se trebaju injektirati, npr. voda.

Pojam «otapala» odnosi se na tekućinu koja drugu tvar zadržava u otopini, tj. otapa je, npr. voda.

Pojam «konzervansi» odnosi se na tvar dodanu farmaceutskom pripravku radi sprječavanja razvoja bakterija, npr. benzalkonij klorid ili benzil alkohol.

Pojam «poliol» odnosi se na bilo koju tvar s višestrukim hidroksilnim skupinama, uključujući polihidroksilne alkohole i karbohidrate. Polihidroksilni alkoholi uključuju takve spojeve kao što su sorbitol, manitol ili glicerol. Karbohidrati su cikličke molekule koje mogu imati keto ili aldehidnu skupinu, kao što je sukroza ili trehaloza.

Pojam «eritropoetin» ili «protein eritropoetin» odnosi se na protein čije je biološko djelovanje in vivo poticanje stanica koštane srži na proizvodnju retikulocita i crvenih krvnih stanica i bira se iz skupine koja obuhvaća humani eritropoetin i analogone definirane ispod.

Pojam «pegilirani eritropoetin» (Peg-EPO ili PEG-EPO) odnosi se na eritropoetin kovalentno vezan s jednim do tri polietilenska derivata kako je opisano ispod.

Pojam «naprava» odnosi se na patent za određenu namjenu. U predloženom izumu namjena je omogućiti, poduprijeti ili olakšati davanje tekućeg farmaceutskog pripravka.

Opis crteža

Slika 1: Primarna struktura humanog EPO (165 amino kiselina)(SEQ ID N0:1).

Slika 2: Primarna struktura humanog EPO (166 amino kiselina)(SEQ ID N0:2).

Slika 3: Utjecaj pH na termalnu stabilnost. Na dijagram je unesena je prijelazna temperatura u odnosu na pH.

Slika 4: Utjecaj ionske jakosti na termalnu stabilnost. Na dijagram je unesena je prijelazna temperatura u odnosu na koncentraciju fosfata.

Slika 5: Ovisnost termičke stabilnosti o vrsti pufera.

Slika 6 prikazuje da je sulfat također prikladan pufer/aditiv na niskim pH (npr. pH 6.2), dok je fosfat manje prikladan na pH 6.2 u odnosu na pH 7.5. To pokazuje da sulfat održava termalnu stabilnost visokom, čak i na niskim pH.

Slika 7: Ovisnost agregacije peg-EPO na pH. Uzorci Peg-EPO nakon toplinskog udara (kako je gore opisano) analizirani su pomoću SDS-PAGE. Proteini su obojeni srebrom. Stupac 1: standardna molekulska masa. Stupac 2: pH 5. Stupac 3: pH 5, reducirano. Stupac 4: pH 6. Stupac 5: pH 6, reducirano. Stupac 6: pH 6.5. Stupac 7: pH 6.5, reducirano. Stupac 8: pH 7. Stupac 9: pH 7, reducirano. Stupac 10: peg-EPO, bez udara.

Slika 8 prikazuje da uporaba 1 mg/ml acetilcisteina kao antioksidansa sprječava oblikovanje agregata uslijed toplinskog udara. Agregacija pegEPO uslijed toplinskog udara (20 min 80oC): Stupac 1: pegEPO na pH 7.5, bez udara; Stupac 2: pegEPO na pH 7.5, udar; Stupac 3: pegEPO na pH 6.2, udar; Stupac 4: pegEPO na pH 6.2, udar, reducirano; Stupac 5: pegEPO na pH 7.5, + 1 mg/ml N-acetil-cisteina, udar; Stupac 6: pegEPO na pH 7.5, 4-1 mg/ml N-acetil-cisteina, udar, reducirano.

Slika 9: Sadržaj sialne kiseline (NANA) uzoraka peg-EPO u novim formulacijama, pohranjenih šest mjeseci na različitim temperaturama.

Slika 10: Ispitivanje bioaktivnosti uzoraka peg-EPO na miševima, nakon 6 mjeseci pohrane na različitim temperaturama u 10 mM natrijevom fosfatu, 40 inM natrijevom sulfatu, 3% (w/v) manitolu, pH 6.2.

Slika 11: Preklapanje «size exclusion» kromatograma peg-EPO uzoraka pohranjenih 6 mjeseci u 10 mM natrijevom fosfatu, 40 mM natrijevom sulfatu, 3% (w/v) manitolu, pH 6.2 (od dna do vrha: pufer, početni materijal, 4°C, 25°C, 30°C i 40°C) .

Posebno, predloženi izum odnosi se na tekući farmaceutski pripravak koji obuhvaća protein eritropoetin, višestruko nabijeni anorganski anion u farmaceutski prihvatljivom puferu prikladnom za održavanje pH otopine u rasponu od oko 5.5 do oko 7.0 i moguće jedan ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenasa.

U povoljnom ostvarenju, pripravak je tekuća otopina, npr. vodena otopina. U povoljnom ostvarenju izuma, gornji farmaceutski pripravci su izotonične otopine.

Povoljno je da se anion bira između aniona jakih anorganskih kiselina, kao što je H2SO4, H3PO4 ili limunska kiselina. Prema tome, povoljni anioni biraju se iz skupine koja obuhvaća sulfat, fosfat i citrat, osobito sulfat ili fosfat, a najpovoljniji je sulfat. Koncentracija višestruko nabijenog anorganskog aniona može varirati između 10 i 200 mmol/l, npr. za sulfatni anion između 10 i 200 mmol/l.

Pufer koji se rabi u predloženom izumu za održavanje pH u rasponu od 5.5 do oko 7.0, posebno u rasponu od 5.8 do 6.7, naročito u rasponu od 6.0 do 6.5, a najpovoljnije na oko pH 6.2, može biti uobičajeni pufer organskih ili anorganskih kiselina (npr. fosfatni pufer, arginin/H2SO4/Na2SO4 pufer, ili bilo koji farmaceutski prihvatljiv puferski sistem). U povoljnom ostvarenju, pripravak obuhvaća fosfatni ili arginin/H2SO4/Na2SO4 pufer, osobito 10 do 50 mmol/1 fosfatnog pufera. Kombinacije tih puferskih sustava su također dio predloženog izuma, pH vrijednost može se podesiti s odgovarajućom bazom, npr. NaOH u fosfatnom puferu i odgovarajućom kiselinom, npr. sulfatnom kiselinom u argininskom puferu, redom.

Pripravci iz predloženog izuma mogu obuhvaćati jedan ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijensa. Ti farmaceutski prihvatljivi ekscipijensi mogu se birati između farmaceutski prihvatljivih soli, razrjeđivača i/ili otapala i/ili konzervansa, itd., npr. sredstava za toničnost (sredstava za izotoničnost), poliola, antioksidansa ili neionskih deterdženata. Primjeri takvih tvari su natrijev klorid, kalcijev klorid, sorbitol, manitol, glicerol, saharoza, trehaloza, acetilcistein, polisorbat 20, polisorbat 80, ili pluronic F68.

U povoljnom ostvarenju iz predloženog izuma farmaceutski pripravci mogu sadržavati poliol koji se bira iz skupine koja obuhvaća manitol, sorbitol, glicerol, trehalozu i saharozu, poželjno manitol. Koncentracija poliola može varirati između 1 i 10% (w/v).

Primjeri antioksidansa su cistein, metionin, acetilcistein ili askorbinska kiselina, poželjno metionin. Antioksidansi se mogu obično dodati pri koncentraciji između 0.01 i 0.5% (w/v) ili, npr. u slučaju metionina pri koncentraciji od 1-20 mM.

Također, gore opisani pripravci mogu obuhvaćati sredstvo za izotoničnost od oko 0.01 do oko 0.9% w/w. Ti spojevi

poznati su u struci; primjeri tih sredstava su natrijev klorid ili natrijev sulfat. U povoljnom ostvarenju predloženog izuma pripravci su izotonične otopine. Gornji pripravak također može sadržavati neionski deterdžent kao što je polisorbat 20, polisorbat 80 ili pluronic F68, osobito pluronic F68, npr. sve do 1% (w/v), poželjno sve do 0.1% (w/v), npr. 0.001 do 0.01 % (w/v) .

Gornji pripravak također može sadržavati dodatne soli, npr. sve do 1 mmol/l CaCl2.

Predloženi izum naročito je koristan za pripravljanje farmaceutskih pripravaka koji obuhvaćaju eritropoetin kao farmaceutski aktivnu tvar. Pojam «eritropoetin» ili «protein eritropoetin», ili «EPO» je kako slijedi: pojmovi se posebno odnose na glikoprotein, npr. humani eritropoetin, npr. s aminokiselinskom sekvencom iznešenoj u (SEQ ID N0:1) ili (SEQ ID N0:2), ili aminokiselinskom sekvencom koja im je supstancijalno homologna, čija se biološka svojstva odnose na poticanje proizvodnje crvenih krvnih stanica te poticanje dijeljenja i diferencijacije eritroidnih progenitora u koštanoj srži. Kako se ovdje rabe, ti pojmovi obuhvaćaju takve proteine modificirane namjernim, kao na primjer, na položaju izravne mutageneze, ili slučajnim mutacijama. Ti pojmovi također obuhvaćaju analogone s od l do 6 dodatnih položaja glikosilacije, analogone s najmanje jednom dodatnom aminokiselinom na karboksi terminalnom kraju glikoproteina pri čemu dodatna aminokiselina uključuje bar jedan položaj glikosilacije te analogone koji imaju aminokiselinsku sekvencu koja uključuje premještaj bar jednog mjesta glikosilacije. Ti pojmovi obuhvaćaju i prirodno i rekombinantno proizvedeni humani eritropoetin.

Kako je detaljnije izneseno ispod, pripravljanje i pročišćavanje EPO dobro su poznati u struci. Pod eritropoetinom se smatra prirodni ili rekombinantni protein, poželjno humani, kako je dobiven iz uobičajenih izvora kao što su tkiva, proteinskom sintezom, staničnom kulturom s prirodnim ili rekombinantnim stanicama. Obuhvaćen je bilo koji protein koji djeluje kao eritropoetin, kao što su muteini ili drugačije modificirani proteini. Rekombinantni EPO može se pripraviti ekspresijom u CHO-, BHK- ili HeLa staničnim linijama, tehnologijom rekombinantne DNA ili endogenom aktivacijom gena. Ekspresija proteina, uključujući endogenom aktivacijom gena, dobro je poznata u struci i iznesena je, primjerice u U.S. Patentima Br. 5,733,761, 5,641,670 i 5,733,746 te u međunarodnoj patentnoj prijavi br. WO 93/09222, WO 94/12650, WO 95/31560, WO 90/11354, WO 91/06667 i WO 91/09955, čiji sadržaj je ovdje uključen referencom. Povoljne EPO vrste za pripravljanje eritropoetinskih glikoproteinskih produkata su humane EPO vrste. Povoljno je da je EPO vrsta humani EPO s aminokiselinskom sekvencom iznešenom u SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2, povoljnije s aminokiselinskom sekvencom SEQ ID N0:1.

Nadalje, eritropoetin može biti glikoproteinski analogon s 1 do 6 dodatnih mjesta za glikosilaciju. Do glikosilacije proteina s jednom ili više oligosaharidnih skupina dolazi na specifičnim mjestima duž polipeptidnog skeleta i uvelike utječe na fizička svojstva proteina kao što je stabilnost proteina, lučenje, substanična lokalizacija te na biološku aktivnost. Glikosilacija je obično dvojaka. 0-vezani oligosaharidi vezani su na serinske ili treoninske dijelove, a N-vezani oligosaharidi vezani su na asparaginske dijelove. Jedna vrsta oligosaharida pronađenog i na N-vezanim i O-vezanim oligosaharidima je N-acetilneuraminska kiselina (sialna kiselina), familija amino šećera koji sadrže 9 ili više ugljikovih atoma. Sialna kiselina obično je terminalni dio i na N-vezanim i na O-vezanim oligosaharidima, i zbog toga što nosi negativan naboj, daje kiselinska svojstva glikoproteinu. Humani eritropoetin, koji ima 165 aminokiselina, sadrži tri N-vezana i jedan O-vezani oligosaharidni lanac koji čini oko 40% ukupne molekulske mase glikoproteina. N-vezana glikosilacija događa se na asparaginskim dijelovima lociranim na položajima 24, 38 i 83, a O-povezana glikosilacija odvija se na serinskom dijelu lociranom na položaju 126. Oligosaharidni lanci modificirani su terminalnim sialno-kiselinskim dijelovima. Enzimatsko uklanjanje svih sialno-kiselinskih dijelova s glikosiliranog eritropoetina rezultira gubitkom aktivnosti in vivo, ali ne i aktivnosti in vitro, jer sialiranje eritropoetina sprječava njegovo vezanje, i daljnje uklanjanje, pomoću veznog proteina jetre.

Pojam «eritropoetin» iz predloženog farmaceutskog pripravka uključuje analogone humanog eritropoetina s jednom ili više promjena u aminokiselinskom slijedu humanog eritropoetina što rezultira povećanjem broja mjesta za vezanje sialne kiseline. Ti glikoproteinski analogoni mogu nastati na položaju izravne mutageneze uz dodatke, uklanjanja, ili supstitucije aminokiselinskih dijelova koji povećavaju ili djelomično izmijenjuju mjesta dostupna za glikosilaciju. Analogoni glikoproteina koji imaju razine sialne kiseline veće od onih pronađenih u humanom eritropoetinu nastali su dodavanjem mjesta glikosilacije koja ne poremećuju sekundarnu ili tercijarnu konformaciju potrebnu za biološku aktivnost. Glikoproteini iz predloženog izuma također uključuju analogone s povišenim razinama ugljikohidratnog vezanja na mjestu glikosilacije što obično uključuje supstituciju jedne ili više aminokiselina u blizini N-vezanog ili O-vezanog mjesta. Glikoproteini iz predloženog izuma također uključuju analogone koji imaju jednu ili više aminokiselina koje se protežu od karboksi terminalnog kraja eritropoetina i donose još najmanje jedno dodatno ugljikohidratno mjesto. Eritropoetinski proteini iz predloženog pripravka također uključuju analogone koji imaju aminokiselinski slijed koji uključuje premještaj najmanje jednog mjesta za glikosilaciju. Takav premještaj mjesta glikosilacije uključuje uklanjanje jednog ili više mjesta glikosilacije u humanom eritropoetinu i dodavanje jednog ili više mjesta glikosilacije koje se ne pojavljuje prirodno. Povećanje broja ugljikohidratnih lanaca na eritropoetinu, i prema tome broja sialnih kiselina po molekuli eritropoetina može dati povoljna svojstva kao što je povećana topljivost, veća otpornost na proteolizu, smanjena imunogenost, povećano vrijeme poluživota u serumu i povećana biološka aktivnost. Analogoni eritropoetina s dodatnim mjestima glikosilacije detaljnije su izneseni u Europskoj Patentnoj Prijavi 640 619, Elliot, objavljenoj 1. ožujka 1995.

U povoljnom ostvarenju, farmaceutski pripravak iz predloženog izuma obuhvaća eritropoetinske proteine s aminokiselinskim slijedom koji uključuje najmanje jedno dodatno mjesto glikosilacije kao što su, ali ne ograničujući na, eritropoetini koji obuhvaćaju sekvencu humanog eritropoetina modificiranu modifikacijama koje se biraju između sljedećeg:

Asn30Thr32;

Asn51Thr53;

Asn57Thr59;

Asn69;

Asn69Thr71;

Ser68Asn69Thr71;

Val87Asn88Thr90;

Ser87Asn88Thr90;

Ser87Asn88Gly89Thr90;

Ser87Asn88Thr90Thr92;

Ser87Asn88Thr90Ala162;

Asn69Thr71Ser87Asn88Thr90;

Asn30Thr32Val87Asn88Thr90;

Asn89Ile90Thr91;

Ser87Asn89Ile90Thr91;

Asn136Thr138;

Asn138Thr140;

Thr125; i

Pro124Thr125.

Označavanje koje se ovdje rabi za aminokiselinsku sekvencu znači da je (su) položaj(i) odgovarajućeg nemodificiranog proteina (npr. hEPO SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2) naznačen brojem u eksponentu promijenjen u aminokiselinu(e) koja neposredno prethodi pojedinom broju u eksponentu.

Eritropoetinski protein također može biti analogon s najmanje jednom dodatnom aminokiselinom na karboksi terminalnom kraju glikoproteina, pri čemu aminokiselina uključuje najmanje jedno mjesto glikosilacije. Dodatna aminokiselina može sadržavati peptidni fragment dobiven iz karboksi terminalnog kraja humanog korionskog gonadotropina. Poželjno je da je glikoprotein analogon izabran iz skupine koju čine: (a) humani eritropoetin koji ima aminokiselinsku sekvencu Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln (SEQ ID NO:3) koja se proteže od karboksi kraja; (b) analogon (a) koji dalje uključuje Asn30Thr32Val87Asn88Thr90EPO.

Protein eritropoetin također može biti analogon s aminokiselinskim slijedom koji uključuje premještaj barem jednog mjesta glikosilacije. Promjena može uključivati uklanjanje bilo kojeg N-vezanog ugljikohidratnog položaja u humanom eritropoetinu te dodavanje N-vezanog ugljikohidratnog mjesta na položaju aminokiseline 88 u sekvenciji humanog eritropoetina. Poželjno je da je glikoprotein analogon izabran iz skupine koja sadrži Gln24 Ser87 Asn88 Thr90 EPO; Gln38 Ser87 Asn88 Thr90 EPO; i Gln83 Ser87 Asn88 Thr90 EPO.

Posebno, protein eritropoetin iz predloženog farmaceutskog pripravka kako je gore opisan može također uključiti njegove pegilirane derivate. Pegilirani derivati eritropoetina i njihovo pripravljanje poznati su u struci i opisani su primjerice u EP-A-539,161, EP-A-605,963, WO 93/25212, WO 94/20069, WO 95/11924, US Patent br. 5,56, EP-A-584,876, WO 92/16555, WO 94/28024, WO 97/04796, US Pat. Br. 5,359,030 i 5,681,811, US Patent Br. 4,179,337, Japanski Patent, WO 98/32466, US Patent Br. 5,324,650. Povoljno ostvarenje pegiliranih eritropoetinskih vrsta odnosi se na derivate kako su ispod opisani.

Prema tome, predloženi izum također se odnosi na konjugat eritropoetina, spomenuti konjugat obuhvaća protein eritropoetin kako je gore opisano koji ima najmanje jednu slobodnu aminoskupinu i biološko djelovanje in vivo poticanja stanica koštane srži na proizvodnju retikulocita i crvenih krvnih stanica i bira se iz skupine koja obuhvaća humani eritropoetin i njegove analogone koji imaju sekvencu humanog eritropoetina modificiranu dodavanjem od 1 do 6 mjesta glikosilacije ili premještanjem barem jednog mjesta glikosilacije; spomenuti eritropoetin kovalentno je vezan s «n» poli (etilenglikol) skupinama formule -CO-(CH2)x- (OCH2CH2)m-OR uz to da -CO (tj. karbonil) iz svake poli(etilenglikol) skupine oblikuje amidnu vezu s jednom od spomenutih aminoskupina; pri čemu je R niži alkil; x je 2 ili 3; m je od oko 450 do oko 900; n je od 1 do 3; i n i m su odabrani tako da molekulska masa konjugata bez eritropoetina glikoproteina bude od 20 kilodaltona do 100 kilodaltona. Izum nadalje donosi farmaceutske pripravke koji sadrže ovdje opisane konjugate u kojima je postotak konjugata u kojima n iznosi 1 najmanje devedeset posto, osobito devedesetdva posto ili naročito devedesetšest posto svih konjugata iz pripravka.

Posebno, gornji konjugati mogu se prikazati formulom (I)

P-[NHCO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR]n(I)

pri čemu je P dio proteina eritropoetina kako je ovdje opisano (tj. bez aminoskupine ili aminoskupina koje oblikuju amidnu vezu s karbonilom prikazanim u formuli I), ima biološko djelovanje in vivo poticanja stanica koštane srži na proizvodnju retikulocita i crvenih krvnih stanica; pri čemu je R niži alkil; x je 2 ili 3; m je od oko 450 do oko 900; n je od 1 do 3; i n i m su odabrani tako da molekulska masa konjugata bez eritropoetina glikoproteina bude od 20 kilodaltona do 100 kilodaltona.

Kako se ovdje rabi, «niži alkil» znači linearnu ili razgranatu alkilnu skupinu s jedan do šest ugljikovih atoma. Primjeri nižih alkilnih skupina uključuju metil, etil i izopropil. U skladu s izumom, R je bilo koji niži alkil. Povoljni su konjugati u kojima je R metil.

Simbol «m» predstavlja broj etilenoksidnih dijelova (OCH2CH2) u poli(etilenoksid) skupini. Jedna PEG (polietilenglikol) podjedinica etilenoksida -(OCH2CH2)- ima molekulsku masu od oko 44 daltona. Stoga molekulska masa konjugata (bez molekulske mase EPO) ovisi o broju «m». U konjugatima ovog izuma «m» je u rasponu od oko 450 do oko 900 (što odgovara molekulskoj masi od oko 20 do oko 40 kDa), poželjno je da m bude od oko 650 do oko 750 (što odgovara molekulskoj masi od oko 30 kDa). Broj m izabran je tako da rezultirajući konjugat iz ovog izuma ima fiziološko djelovanje koje se može usporediti s nemodificiranim EPO, čije djelovanje može biti jednako, jače ili djelomično u usporedbi s odgovarajućim djelovanjem nemodificiranog EPO. Molekulska masa «oko» određenog broja znači da se ona kako je određena uobičajenim analitičkim metodama nalazi unutar prihvatljivog raspona oko tog broja. Broj «m» izabran je tako da molekulska masa svake poli(etilenglikol) skupine kovalentno vezane na eritropoetin glikoprotein bude od oko 20 kDa do oko 40 kDa, a poželjno je da iznosi oko 30 kDa.

U konjugatima iz ovog izuma, broj «n» je broj poli(etilenglikol) skupina kovalentno vezanih na slobodne aminoskupine (uključujući e-amino skupine aminokiseline lizina i/ili aminoterminalnu amino skupinu) eritropoetina proteina putem amidne(ih) veze(a). Konjugat iz ovog izuma može imati jednu, dvije ili tri PEG skupine po molekuli EPO. «n» je cijeli broj u rasponu od 1 do 3, poželjno je da «n» bude 1 ili 2, a naročito poželjno da «n» bude 1. Povoljni konjugat od gore opisanih konjugata obuhvaća spojeve u kojima x iznosi 2, m 650 do 750, n iznosi 1, a R je metil.

Spoj formule (I) može se pripraviti iz poznatog polimernog materijala:

[image]

u kojem su R i m kako su gore opisani, kondenziranjem spoja formule II s glikoproteinom eritropoetinom. Spojevi formule (II) u kojima x iznosi 3 su alfa-niži alkoksi, sukcinimidil esteri maslačne kiseline iz poli(etilenglikol)(niži alkoksi-PEG-SBA). Spojevi formule (II) u kojima x iznosi 2 su alfa-niži alkoksi, sukcinimidil esteri propionske kiseline iz poli(etilenglikol)(niži alkoksi-PEG-SPA). Može se primijeniti bilo koja uobičajena metoda reakcije aktiviranog estera s aminom kako bi se oblikovao amid. U gore opisanoj reakciji, prikazani sukcinimidil ester je izlazna skupina koja uzrokuje oblikovanje amida« Uporaba sukcinimidil estera kao što su spojevi formule II kako bi se proizveli konjugati s proteinima iznesena je u U.S. Patentu Br. 5,672,662, izdanom 30. rujna 1997 (Harris, et al.).

Humani EPO sadrži devet slobodnih amino skupina, amino-terminalnu amino skupinu i e-amino akupine od 8 lizinskih dijelova. Kada je reagens za pegiliranje kombiniran s SBA spojem formule II, pronađeno je da kod pH 7.5, omjera protein:PEG od 1:3, i reakcijske temperature od 20-25°C, proizvedene su smjese mono-, di- i u tragovima tri-pegilirane vrste. Kada je reagens za pegiliranje bio SPA spoj formule II, pri istim uvjetima, osim što je omjer proteina:PEG bio 1:2, proizvedene su primarno monopegilirane vrste. Pegilirani EPO može se davati kao smjesa, ili različite pegilirane vrste separirane kromatografijom kationske izmjene. Podešavanjem reakcijskih uvjeta (npr. omjer reagensa, pH, temperatura, koncentracija proteina, vrijeme reakcije itd.) mogu se mijenjati relativne količine različitih pegiliranih vrsta.

Farmaceutski pripravci kako su gore opisani također mogu sadržavati protein eritropoetin kako je gore definiran koji ima barem jednu slobodnu amino skupinu i biološko djelovanje in vivo poticanja stanica koštane srži na proizvodnju retikulocita i crvenih krvnih stanica i bira se iz skupine koja obuhvaća humani eritropoetin i njegove analogone koji imaju primarnu strukturu humanog eritropoetina modificiranu dodavanjem od l do 6 mjesta glikosilacije; spomenuti glikoprotein kovalentno je vezan na jednu do tri niži-alkoksi poli(etilenglikol) skupine, svaka poli(etilenglikol) skupina kovalentno je vezana na glikoprotein preko veziva formule -C(O)-X-S-Y- uz to da C(O) iz veziva oblikuje amidnu vezu s jednom od spomenutih amino skupina, X je -(CH2)k- ili -CH2(O-CH2-CH2)k-, k je od 1 do 10, Y je

[image]

prosječna molekulska masa svake poli(etilenglikol) skupine iznosi od oko 20 kilodaltona do oko 40 kilodaltona, a molekulska masa konjugata je od oko 51 kilodaltona do oko 175 kilodaltona.

Eritropoetinske vrste također se mogu prikazati formulom (III)

P-[NH-CO-X-S-Y-(OCH2CH2)m-OR]n (III)

pri čemu R može biti bilo koji niži alkil, a pod tim se smatra linearna ili razgranata alkilna skupina koja ima od jedan do šest ugljikovih atoma kao što je metil, etil, izopropil, itd. Povoljni alkil je metil. X može biti -(CH2)k- ili -CH2(O-CH2-CH2)k-, pri čemu je k od 1 do oko 10. Poželjno je da k bude od 1 do oko 4, a naročito povoljno je da k bude 1 ili 2. Najpovoljnije je da X bude -(CH2).

U formuli 1, Y je

[image]

osobito

[image]

naročito poželjno

[image]

U formuli (III), broj m izabran je tako da rezultirajući konjugat formule (III) ima fiziološko djelovanje koje se može usporediti s nemodificiranim EPO, čije djelovanje može biti jednako, jače ili djelomično u usporedbi s odgovarajućim djelovanjem nemodificiranog EPO. m predstavlja broj etilenoksidnih dijelova u jedinici PEG. Jedna PEG podjedinica -(OCH2CH2)- ima molekulsku masu od oko 44 daltona. Prema tome, molekulska masa konjugata (ne uzimajući molekulsku masu EPO) ovisi o broju m. Molekulska masa «oko» određenog broja znači da se ona kako je određena uobičajenim analitičkim metodama nalazi unutar prihvatljivog raspona oko tog broja, m je cijeli broj u rasponu od oko 450 do oko 900 (što odgovara molekulskoj masi od 20 do 40 kDa), poželjno je da m bude od oko 550 do oko 800 (oko 24 do 35 kDa), a najpovoljnije je da m bude od oko 650 do oko 700 (oko 29 do oko 31 kDa) .

U formuli (III), broj n je broj e-amino skupina aminokiseline lizina u proteinu eritropoetinu kovalentno vezanih na PEG jedinicu putem amidne veze. Konjugat iz ovog izuma može imati jednu, dvije ili tri peg jedinice po molekuli EPO. n je cijeli broj u rasponu od 1 do 3, povoljno je da n iznosi 1 ili 2, a povoljnije 1.

Povoljni eritropoetinski proteini formule (III) prikazani su formulama:

[image]

Najpovoljniji eritropoetinski glikoproteinski produkti prikazani su formulom:

[image]

pri čemu je u gornjim formulama n cijeli broj od 1 do 3; m je cijeli broj od 450 do 900; R je niži alkil; X je -(CH2)k- ili -CH2(O-CH2-CH2)k-, a P je dio eritropoetina glikoproteina bez amino skupine ili skupina koje oblikuju amidnu vezu s X.

Ostali povoljni eritropoetinski glikoproteinski produkti prikazani su formulama:

[image]

Još povoljniji eritropoetinski glikoproteinski produkti prikazani su formulom:

[image]

Eritropoetinski proteini mogu se pripraviti:

(a) kovalentnom reakcijom e-amino skupine aminokiseline lizina eritropoetinskog proteina prikazanog formulom P-[NH2]rw s bi-funkcionalnim reagensom prikazanim formulom Z-CO-X-S-Q, kako bi se oblikovao intermedijar s amidnom vezom prikazan formulom:

P-[NH-CO-X-S-Q]n

u kojoj je P eritropoetinski protein bez amino skupine koja oblikuje amidnu vezu; n je cijeli broj u rasponu od 1 do 3; Z je reaktivna skupina, npr. karboksilni-NHS ester; X je -(CH2)k- ili -CH2(O-CH2-CH2)k-, u kojoj je k od 1 do oko 10, a Q je zaštitna skupina, kao što je alkanoil, npr. acetil.

(b) kovalentnom reakcijom intermedijara s amidnom vezom iz koraka (a) s derivatom aktiviranog polietilen glikola predstavljenim formulom W-[OCH2CH2]m-OR, kako bi se oblikovao eritropoetinski glikoproteinski produkt prikazan formulom:

[image]

u kojoj je W sulfhidrilni reaktivni oblik Y; m je cijeli broj od oko 450 do oko 900; R je niži alkil, a Y je kako je gore definiran.

U ovom ostvarenju poželjno je da bi-funkcionalni reagens bude N-sukcinimidil-S-acetiltiopropionat ili N-sukcinimidil-S-acetiltioacetat, Z je N-hidroksi-sukcinimid, a derivat aktiviranog polietilen glikola W-[OCH2CH2]m-OR bira se iz skupine koja sadrži jodo-acetil-metoksi-PEG, metoksi-PEG-vinilsulfon i metoksi-PEG-maleimid.

Detaljnije, eritropoetinski proteini formule (III) mogu se pripraviti kovalentnim vezanjem tiolnih skupina na EPO («aktivacija») i vezanjem aktiviranog EPO s poli(etilenglikol)(PEG) derivatom. Prvi korak za pripravljanje pegiliranog EPO u skladu s predloženim izumom obuhvaća kovalentno vezanje tiolnih skupina preko NH2-skupina iz EPO. Aktivacija EPO izvedena je s bi-funkcionalnim reagensom koji nosi zaštićenu tiolnu skupinu i dodatnu reaktivnu skupinu, kao što su aktivni esteri (npr. sukcinimidil ester), anhidridi, esteri sulfonskih kiselina, halogenidi karboksilnih kiselina i sulfonskih kiselina, redom. Tiolna skupina zaštićena je skupinom koja je poznata u struci, npr. acetilnom skupinom. Ti bi-funkcionalni reagensi mogu reagirati s £-amino skupinama aminokiselina lizina oblikovanjem amidne veze. Prvi korak reakcije iznesen je ispod:

[image]

EPO, n i X su kako su gore definirani, a Z je reaktivna skupina koja je poznata u struci, npr. N-hidroksi-sukcinimid (NHS) supstituent formule

[image]

U povoljnom ostvarenju aktivacija s-amino akupine aminokiseline lizina izvodi se reakcijom s bi-funkcionalnim reagensom koji ima sukcinimidilnu skupinu. Bi-funkcionalni reagensi mogu nositi različite vrste spacera, npr. -(CH2)k- ili -CH2-(O-CH2-CH2-)k- skupine, pri čemu je k od 1 do oko 10, povoljno od 1 do oko 4, još povoljnije 1 ili 2, a najpovoljnije 1. Primjeri takvih reagensa su N-sukcinimidil-S-acetiltiopropionat (SATP) i N-sukcinimidil-S-acetiltioacetat (SATA)

[image]

NHS ester acetiltioalkil-karboksilne kiseline, kao

[image]

NHS-ester 2-(Acetiltio)-(etoksi)k-octene kiseline uz k kako je gore definiran.

Pripravljanje bi-funkcionalnog reagensa poznato je u struci. Prekurzori NHS-estera 2-(acetiltio)-(etoksi)k-octene kiseline opisani su u DE-3924705, dok je derivatizacija u acetiltio spoj opisana u March, J., Advanced Organic Chemistry, McGraw-Hill, 1977, 375-376. SATA je komercijalno dostupan (Molecular Probes, Eugene, OR, USA i Pierce, Rockford, IL).

Broj tiolnih skupina koje se moraju dodati molekuli EPO-a može se izabrati podešavanjem reakcijskih parametara, tj. koncentracije proteina (EPO) te omjera proteina/bi-funkcionalnog reagensa. Povoljno je da se EPO aktivira kovalentnim vezanjem od 1 do 5 tiolnih skupina po molekuli EPO, osobito od 1.5 do 3 tiolne skupine po molekuli EPO. Ti se rasponi odnose na statističku raspodjelu tiolne skupine u populaciji EPO proteina.

Reakcija se izvodi, na primjer, u vodenoj otopini pufera, pH 6.5-8.0, npr. u 10 mM kalijevog fosfata, 50 mM NaCl, pH 7.3. Bi-funkcionalni reagens se može dodati u DMSO. Po završetku reakcije, poželjno nakon 30 minuta, reakcija se zaustavi dodatkom lizina. Višak bi-funkcionalnog reagensa može se odvojiti u struci poznatim metodama, npr. dijalizom ili kolonskom filtracijom. Prosječan broj tiolnih skupina dodan EPO-u se može odrediti fotometrijskim metodama opisanim u, na primjer, Grasetti, DoRo i Murray, J.F. u J. Appl. Biochem. Biotechnol. 119, 41-49 (1967).

Gornja reakcija praćena je kovalentnm vezanjem aktiviranog polietilen glikolnog (PEG) derivata« Prikladni PEG derivati su aktivirane PEG molekule s prosječnom molekulskom masom od oko 20 do oko 40 kDa, posebno od oko 24 do oko 35 kDa, a naročito oko 30 kDa.

Aktivirani PEG derivati poznati su u struci i opisani, na primjer, u Morpurgo, M. et al. J. Bioconj. Cheiru (1996) 7,stranica 363 ff za PEG-vinilsulfon. PEG vrste linearnog i razgranatog lanca prikladne su za pripravljanje spojeva Formule 1. Primjeri reaktivnih PEG reagensa su jodo-acetil-metoksi-PEG i metoksi-PEG-vinilsulfon:

[image]

Primjena tih jodo-aktiviranih tvari poznata je u struci i opisana npr. u Hermanson, G.T., Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego (1996) str. 147-148.

Najpovoljnije je da se PEG vrste aktiviraju primjenjujući maleimid (alkoksi-PEG-maleimid), kao što je metoksi-PEG-maleimid (MW 30000; Shearwater Polymers, Inc.). Struktura alkoksi-PEG-maleimida je kako slijedi:

[image]

pri čemu su R i m kako su gore definirani, poželjno

[image]

Reakcija vezanja s alkoksi-PEG-maleimidom zbiva se nakon in situ cijepanja tiolne zaštitne skupine u vodenoj otopini pufera, npr. 10 mM kalijevog fosfata, 50 mM NaCl, 2 mM EDTA, pH 6.2. Cijepanje zaštitne skupine može se izvesti, na primjer, s hidroksialaminom u DMSO na 25°C, pH 6.2, oko 90 minuta. Za modifikaciju PEG molarni omjer aktiviranog PEG/alkoksi-PEG-maleimida trebao bi biti od oko 1:3 do oko 1:6, poželjno 1:4. Reakcija se može zaustaviti dodavanjem cisteina i reakcijom preostalih tiolnih(-SH) skupina s N-metilmaleimidom ili drugim odgovarajućim spojevima koji mogu stvarati disulfidne veze. Zbog reakcije bilo koje preostale tiolne skupine sa zaštitnom skupinom kao što je N-metilmaleimid ili druga prikladna zaštitna skupina, EPO glikoproteini u konjugatima tog izuma mogu sadržavati takve zaštitne skupine. Općenito, ovdje opisani postupak proizvest će smjesu molekula koje imaju varirajući broj tiola zaštićenih različitim brojem zaštitnih skupina, zavisno o broju aktiviranih tiolnih skupina na glikoproteinu koje nisu konjugirane s PEG-maleimidom.

Dok N-metilmaleimid oblikuje isti tip kovalentne veze kada se koristi za blokiranje preostalih tiolnih skupina na pegiliranom proteinu, disulfidni spojevi će intermolekularnom reakcijom izmjene sulfid/disulfid blokirajući reagens vezati preko disulfidnih mostova. Poželjni blokirajući reagensi za taj tip reakcije blokiranja su oksidirani glutation (GSSG), cistein i cistamin. Dok se s cisteinom u pegilirani protein ne unosi dodatni naboj, primjena GSSG ili cistamina kao blokirajućih reagensa rezultira dodatnim negativnim ili pozitivnim nabojem.

Daljnje pročišćavanje spojeva Formule 1, uključujući odvajanje mono-, di- i tri-pegiliranih EPO vrsta, može se izvesti u struci poznatim metodama, npr. kolonskom kromatografijom.

Poželjno je da pripravak koji uključuje pegilirani derivat eritropoetina sadrži najmanje devedeset posto mono-PEG konjugata, tj. u kojima n iznosi l, mogu se pripraviti kako je pokazano u primjeru 5. Obično su mono-PEG konjugati eritropoetinskih glikoproteina poželjni jer su skloni imati veću aktivnost nego di-PEG konjugati. Postotak mono-PEG konjugata kao i omjer mono- i di-PEG vrsta može se kontrolirati udruživanjem širih frakcija oko elucijskog vrha kako bi se smanjio postotak mono-PEG ili užih frakcija radi povećanja postotka mono-PEG u pripravku. Oko devedeset posto mono-PEG konjugata dobra je ravnoteža donosa i aktivnosti. Ponekad, poželjni mogu biti pripravci u kojima je, na primjer, najmanje devedesetdva posto ili najmanje devedesetšest posto konjugata mono-PEG (n iznosi 1). U ostvarenju iz ovog izuma postotak konjugata u kojima n iznosi 1 je od devedeset posto do devedesetšest posto.

Pripravci u skladu s predloženim izumima mogu obuhvaćati 10 do 10000 μg proteina eritropoetina po ml kako je gore definirano o Povoljno je da pripravci obuhvaćaju 10 do 1000 μg, npr. 10, 50, 100, 400, 800 ili 2500 μg po ml.

Nadalje, pripravci u skladu s predloženim izumom mogu obuhvaćati 10 μg do 10000 μg proteina eritropoetina po ml, 10-200 mmol/l sulfata, 10 do 50 mmol/l fosfata, pH 6.0 do 6.5. Taj pripravak također može obuhvaćati sve do 20 mM metionina, 1-5% poliola (w/v), sve do 0.1% pluronic F68 (w/v) i moguće sve do 1 mM CaCl2« Primjer ovog pripravka obuhvaća 10 μg do 10000 μg eritropoetina proteina po ml, 40 mmol/l sulfata, 10 mmol/l fosfata, 3% manitola (w/v), 10 mM metionina, 0.01% pluronic F68 (w/v), pH 6.2.

U daljnjem ostvarenju predloženog izuma, pripravak može obuhvaćati 10 μg do 10000 μg proteina eritropoetina po ml, 10 do 100 mmol/l NaCl, 10 do 50 mmol/l fosfata pH 6.0 do 7.0, moguće 1-5% (w/v) poliola. Nadalje, taj pripravak može obuhvaćati sve do 20 mM metionina, sve do 0.1% pluronic F68 (w/v) i moguće 7.5 μmol/l CaCl2. Posebno, taj pripravak može obuhvaćati 10 μq do 10000 μg proteina eritropoetina po ml, 100 mmol/l NaCl, 10 mM metionina, 0.01% pluronic F68 (w/v), i 10 mmol/l fosfata, pH 7.0.

Predloženi izum također se odnosi na gornji pripravak koji obuhvaća 10 μg do 10000 μg eritropoetina proteina po ml, 10 do 50 mmol/l arginina, pH 6 do 6.5, 10 do 100 mmol/l natrijevog sulfata. Dodatno, taj pripravak može obuhvaćati sve do 20 mM metionina, sve do 0.1% pluronic F68 (w/v), moguće sve do 1 mmol/l CaCl2 i moguće 1-5% (w/v) poliola. Posebno, taj pripravak može obuhvaćati 10 μg do 10000 μg proteina eritropoetina po ml, 40 mmol/l arginina, pH 6.2, 30 mmol/l natrijevog sulfata, 3% manitola (w/v), 10 mM metionina, 0.01% pluronic F68 (w/v) i moguće 1 mmol/l CaCl2.

Povoljno ostvarenje iz predloženog izuma odnosi se na pripravke koji obuhvaćaju 10 do 10000 μg/ml eritropoetina, poželjno 25 do 2500 μg/ml eritropoetina, i

a) 10 mM matrijevog/kalijevog fosfata, 100 mM NaCl, pH 7.0 ili

b) 10 mM natrijevog fosfata, 120 mM natrijevog sulfata, pH 6.2 ili

c) 10 mM natrijevog fosfata, 40 mM natrijevog sulfata, 3% manitola (w/v), pH 6.2 ili

d) 10 mM natrijevog fosfata, 40 mM natrijevog sulfata, 3% manitola (w/v), 10 mM metionina, 0.01% pluronic F68 (w/v), pH 6.2 ili

e) 40 mM arginina, 30 mM natrijevog sulfata, 3% manitola (w/v), pH 6,2 ili

f) 40 mM arginina, 30 mM natrijevog sulfata, 3% manitola (w/v), 10 mM metionina, 0.01% pluronic F68 (w/v), pH 6.2.

U najpovoljnijem ostvarenju, pripravci obuhvaćaju količinu proteina eritropoetina od 50, 100, 400, 800 ili 2500 μg/ml. Najpovoljniji pripravci obuhvaćaju bilo 10 mM natrijevog fosfata, 40 mM natrijevog sulfata, 3% manitola (w/v), 10 mM metionina, 0.01% pluronic F68 (w/v), pH 6.2 ili 40 mM arginina, 30 mM natrijevog sulfata, 3% manitola (w/v), 10 mM metionina, 0.01% pluronic F68 (w/v), pH 6.2.

Pripravci iz predloženog izuma mogu biti u obliku praha osušenog raspršivanjem.

Nadalje, izum se odnosi na pripravak koji je liofilizat ili prah osušen raspršivanjem pripravaka kako su gore opisani. Pripravak se može rekonstituirati kako bi oblikovao tekuću otopinu dodavanjem otapala, npr. vode, ili se može izravno primijeniti npr. pomoću inhalatora ili uređaja za transdermalnu primjenu.

Izum također obuhvaća proces pripravljanja pripravka kako je gore opisan, koji obuhvaća miješanje proteina eritropoetina s otopinom koja obuhvaća višestruki, negativno nabijen anion i moguće jednog ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijensa kako je gore definirano.

Dodatno, predloženi izum odnosi se na uporabu pripravka kako je gore definiran za pripravljanje lijekova korisnih za liječenje ili sprječavanje bolesti povezanih s anemijom u pacijenata s kroničnim zatajenjem bubrega (CRF), AIDS-om i/ili za liječenje pacijenata oboljelih od karcinoma podvrgnutih kemoterapiji. To uključuje metodu liječenja ili sprječavanja bolesti uključujući anemiju u pacijenata s kroničnim zatajenjem bubrega (CRF), AIDS-om te pacijenata oboljelih od karcinoma podvrgnutih kemoterapiji koja obuhvaća korak davanja pripravka pacijentu kako je gore definirano.

Daljnje ostvarenje iz predloženog izuma odnosi se na uređaje za lokalno i sistemsko neprekidno otpuštanje koje obuhvaća pripravak kako je gore definiran. To može biti bilo koja vrsta umetka koja omogućuje kontrolirano otpuštanje eritropoetina koji obuhvaća pripravak kako je gore opisan, kao npr. polimerne mikro- ili nano-čestice. Gore opisani pripravak također može biti dostupan u prethodno napunjenoj štrcaljki ili bilo kojem drugom uređaju za primjenu, kao npr. uređaj za injektiranje bez igle ili uređaj za inhaliranje.

Pripravak iz izuma može biti dostupan kao jedinična doza za injekcijsko ili intravenozno davanje. S druge strane, pripravak iz ovog izuma može se pohraniti bilo u tekućim ili krutim oblicima, a zatim podijeliti u jedinične oblike doziranja za injekcijsko ili intravenozno davanje. Prema tome, tekući pripravak iz ovog izuma može biti prisutan u količinama malim kao što je 0.3 ml za uporabu kao jedna doza. S druge strane, volumen pripravka iz ovog izuma može biti velik 60 litara kada je pohranjen prije raspodjele u pakirane oblike doziranja. S obzirom njegovu poboljšanu stabilnost, pripravak iz ovog izuma može biti pohranjen u velikim spremnicima kako bi se kasnije premjestio u ambalaže prikladne za distribuciju liječnicima, pacijentima i bolnicama.

Injekcijska otopina iz ovog izuma može se davati takvim uobičajenim injekcijskim napravama kao što su štrcaljke koje općenito dopuštaju davanje od 0.3 ml do 20 ml ovog pripravka kao jedne jedinične doze. S druge strane, pripravak iz ovog izuma može se davati injekcijom pomoću ampula koje sadrže ovaj pripravak bilo kao liofilizat ili prah osušen raspršivanjem koji se zatim prije injektiranja rekonstituira na uobičajeni način. S druge strane, zbog stabilnosti pripravaka iz ovog izuma, pripravci mogu biti podijeljeni u jedinični oblik doziranja kao što je fijala koja sadrži oko 0.3 ml do oko 10 ml ovog pripravka. Dodatno, pripravci iz ovog izuma mogu se davati intravenozno pomoću intravenoznih paketića. Ti paketići sadrže oko 20 ml do oko 500 ml otopine ovisno o periodu unutar kojeg se otopina mora dati pacijentu. U skladu s ovim izumom, tekuća otopina iz ovog izuma može se pohraniti u spremnike iz kojih se dalje može odvajati u male ambalaže za doziranje za distribuciju liječnicima, bolnicama i pacijentima. Zbog stabilnosti pripravaka iz ovog izuma, ti pripravci mogu se pohraniti u takve spremnike predviđene za dulje čuvanje prije davanje.

Pripravak eritropoetina kao sastojak pripravaka kako su gore opisani ili kao početna točka za pripravljanje derivata eritropoetina kako je gore opisano detaljnije je opisan u primjerice U.S. Patentima br. 5,547,933 i 5,621,080, EP-B 0 148 605, Huang, S.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 2708-2712, EP-B 0 205 564, EP-B 0 209 539 i EP-B 0 411 678 kao i Lai, P.H. et al., J. Biol. Chem. 261 (1986) 3116-3121, i Sasaki, H. et al., J. Biol. Chem. 262 (1987) 12059-12076. Eritropoetin za terapeutske primjene može se proizvesti rekombinantnim načinima (EP-B 0 148 605, EP-B 0 209 539 i Egrie, J.C., Strickland, T.W., Lane, J. et al. (1986) Immunobiol. 72:213-224).

Metode ekspresije i pripravljanja eritropoetina u sredstvu bez seruma opisane su na primjer u WO 96/35718, objavljeno 14.studenog 1996. (Burg) i u Europskoj patentnoj prijavi br. 513 738, objavljeno 12.lipnja 1992. (Koch). Kao dodatak gore navedenim publikacijama, poznato je da se može izvesti fermentacija u sredstvu bez seruma rekombinantnih CHO stanica koje sadrže EPO gen. Takve metode opisane su na primjer u EP-A 0 513 738, EP-A 0 267 678 te u općem obliku u Kawamoto, T. et al., Analytical Biochem. 130 (1983) 445-453, EP-A 0 248 656, Kowar, J. i Franek, F., Methods in Enzymology 421 (1986) 277-292, Bavister, B., Expcology 271 (1981) 45-51, EP-A 0 481 791, EP-A 0 307 247, EP-A 0 343 635, WO 88/00967.

U EP-A 0 267 678 za čišćenje EPO-a, proizvedenog u kulturi bez seruma nakon dijalize opisan je postupak kromatografije na S-Sepharosi s ionskom izmjenom, preparativne HPLC reverznih faza na C8 koloni te kromatografije s gel filtracijom. S tim u vezi postupak kromatografije s gel filtracijom može se zamijeniti kromatografijom s ionskom izmjenom na S-Sepharosi brzog protoka. Također je preporučeno da se obojena kromatografija na koloni Blue Trisacryla provodi prije kromatografije s ionskom izmjenom.

Postupak čišćenja rekombinantnog EPO opisao je Nobuo, I. et al., u J. Biochem. 107 (1990) 352-359. Međutim, tim postupkom se EPO prije samog čišćenja obrađuje s otopinom Tween®20, fenilmetilsulfonil florida, etilmaleimida, pepstatina A, bakar-sulfata i oksaminske kiseline« Publikacije, uključujući WO 96/35718 izdana 14.studenog 1996. (Burg), iznosi postupak pripravljanja eritropoetina postupkom fermentacije bez seruma (EPOsf).

Specifična aktivnost EPO ili konjugata EPO u skladu s izumom može se odrediti različitim ispitivanjima koja su poznata u struci. Biološko djelovanje očišćenih EPO proteina predloženog izuma je takvo da je posljedica davanja EPO proteina injekcijom ljudima povećanje proizvodnje retikulocita i crvenih krvnih stanica u stanicama koštane srži u usporedbi s pacijentima koji nisu primili injekciju ili s kontrolnim skupinama pacijenata. Biološko djelovanje EPO proteina, ili njihovih fragmenata, dobivenih i očišćenih u skladu s ovim izumom može se ispitati metodama prema Annable, et al./ Buli. Wld. Hlth. Org. (1972) 47:99-112 i Pharm. Europa Spec. Issue Erythropoietin BRP Bio 1997(2). U Primjeru 6, ispitivanjem s normocitemičkim miševima, opisano je još jedno biološko ispitivanje aktivnosti EPO-a.

Izum će biti jasniji s obzirom na sljedeće primjere čija je svrha ilustrirati, ali ne ograničiti, izum kako je ovdje opisan.

PRIMJERI

PRIMJER 1:

Fermentacija i čišćenje humanog EPO-a

a) Pripravljanje inokuluma i fermentacija

Iz plinske faze spremnika za pohranjivanje u tekućem dušiku uzeta je jedna fijala Working Cell Blank, podrijetlom od stanične linije koja proizvodi EPO (može se upotrijebiti ATCC CRL8695, opisana u EP 411 678 (Genetics Institute)). Stanice su prenesene u staklenu bocu za uzgoj kulture i uzgajane u sredini koja je puferirana hidrogen karbonatom u vlažnom CO2 inkubatoru. Tipična sredstva bez seruma koja su korištena za proizvodnju inokuluma i fermentaciju, opisana su u Europskoj patentnoj prijavi 513 738, objavljenoj 12. lipnja 1992o (Koch), ili u WO 96/35718 objavljenoj 14. studenog 1996. (Burg), koja na primjer kao medij sadrži DMEM/F12 (npr. JRH Biosciences/Hazleton Biologics, Denver, US, redni broj 57-736) i dodatno natrijev hidrogenkarbonat, L+glutamin, D+glukozu, rekombinantni inzulin, natrijev selenit, diaminobutan, hidrokortizon, željezo (II) sulfat, asparagin, aspartinsku kiselinu, serin i stabilizator stanica sisavaca, kao npr. polivinil alkohol, metilcelulozu, polidekstran, poli(etilen glikol), Pluronic F68, plazma ekspander polygelin (HEMACCEL®) ili polivinil pirolidon (WO 96/35718).

Kulture su mikroskopski provjerene s obzirom na odsutnost kontaminirajućih mikroorganizama te su utvrđene gustoće stanica. Ti su pokusi provedeni na svakom stupnju cijepanja.

Nakon perioda početnog rasta, stanične kulture su razrijeđene svježim medijem do početne gustoće stanica te su podvrgnute drugom ciklusu rasta. Taj je postupak ponavljan sve dok nije dobiven volumen kulture od približno 2 l po staklenoj boci za uzgoj kulture. Nakon približno 12 podvostručenja od jedne litre ove kulture dobiveno je 5 litara kulture, koja je zatim upotrijebljena kao inokulum za 10-litarski uređaj za fermentaciju inokuluma.

Nakon 3-5 dana, kultura iz 10-litarskog uređaja za fermentaciju može se upotrijebiti kao inokulum za 100-litarski uređaj za fermentaciju inokuluma.

Nakon dodatnih 3-5 dana uzgoja, kultura u 100-litarskom uređaju za fermentaciju može se upotrijebiti kao inokulum za 1000-litarski proizvodni uređaj za fermentaciju.

b) Berba i odvajanje stanica

Primjenjen je šaržni postupak ponovnog punjenja, tj. kad je dosegnuta željena gustoća stanica, pobrano je približno 80% kulture. Ostatak kulture je nadopunjen svježim medijem za kulturu i uzgajan je do sljedeće berbe. Jedan ciklus proizvodnje sastojao se je od najviše 10 uzastopnih berbi: 9 djelomičnih berbi i 1 ukupne berbe na kraju fermentacije. Skupljanje je provedeno svaka 3-4 dana.

Određeni pobrani volumen je prenesen u ohlađenu posudu. Stanice su odstranjene centrifugiranjem ili filtracijom i odbačene. Supernatant, koji je nakon centrifugiranja sadržavao EPO, kontinuirano je filtriran i skupljan u drugu ohlađenu posudu. Tijekom čišćenja, svaka je berba posebno obrađena.

Tipičan postupak za čišćenje EPO proteina opisan je u WO 96/35718 (Burg), objavljenom 14. studenog 1996. Postupak čišćenja objašnjen je u nastavku.

a) Kromatografija s Blue Sepharosom

Blue Sepharosa (Pharmacia) sastoji se od slojeva Sepharose na čiju površinu je kovalentno vezana boja Cibatron blue. Budući da se EPO veže na Blue Sepharosu mnogo jače nego većina neproteinskih onečišćenja, nekih proteinskih nečistoća i PVA, u ovom stupnju može se povećati sadržaj EPO-a. Ispiranje kolone Blue Sepharose vrši se povećanjem koncentracije soli kao i pH vrijednosti.

Kolona je napunjena s 80-100 l Blue Sepharose, regenerirana s NaOH te uravnotežena s puferom za uravnoteživanje (natrij/kalcij-klorid i natrijev acetat). Napunjen je zakiseljeni i profiltrirani ferment supernatant. Nakon punjenja, kolona je najprije isprana s puferom sličnim puferu za uravnoteživanje koji je sadržavao veću koncentraciju natrijevog klorida, a zatim s puferom Tris-bazom. Produkt je eluiran s puferom Tris-bazom te skupljan kao jednostruka frakcija u skladu s prevladavajućim profilom eluiranja.

b) Kromatografija s Butyl Toyopearlom

Butyl Toyopearl 650 C (TosoHaas) je osnova na bazi polistirena na koju su kovalentno vezani alifatski butilni ostaci. Budući da se EPO na taj gel veže puno jače od većine nečistoća i PVA, mora se eluirati s puferom koji sadrži izopropanol.

Kolona je napunjena s 30-40 l Butyl Toyopearl 650 C, regenerirana s NaOH, isprana s puferom Tris-base te uravnotežena s puferom Tris-bazom koji je sadržavao izopropanol.

Eluat Blue Sepharose podešen je na koncentraciju izopropanola u koloni pufera za uravnoteživanje te stavljen u kolonu. Kolona je zatim isprana s puferom za uravnoteživanje s povećanom koncentracijom izopropanola. Produkt je eluiran s puferom za eluiranje (pufer Tris-baza s visokim sadržajem izopropanola) i skupljen kao jednostruka frakcija u skladu s prevladavajućim profilom eluiranja.

c) Kromatografija s Hydroxyapatite Ultrogel-om

Hydroxyapatite Ultrogel (Biosepra) sastoji se od hidroksiapatita koji je ugrađen u agaroznu osnovu radi poboljšanja mehaničkih svojstava. EPO ima nizak afinitet prema hidroksiapatitu te se stoga može eluirati pri nižim koncentracijama fosfata nego proteinske nečistoće.

Kolona je napunjena s 30-40 l Hydroxyapatite Ultrogel-a te regenerirana s puferom kalijevim fosfatom/kalcijevim kloridom i NaOH, a zatim s puferom Tris-bazom koji je sadržavao malu količinu izopropanola i natrijevog klorida.

Eluat koji sadrži EPO iz Butyl Toyopearl kromatografije stavljen je u kolonu. Kolona je redom isprana s puferom za uravnoteživanje i Tris-base puferom bez izopropanola i natrijevog klorida. Produkti su eluirani s Tris-base puferom koji je sadržavao nisku koncentraciju kalijevog fosfata te skupljeni kao jednostruka frakcija u skladu s prevladavajućim profilom eluiranja.

d) HPLC reverznih faza na Vydac-u C4

Materijal Vydac C4 (Vydac) za HPLC reverznih faza se sastoji od čestica silikagela, čija površina nosi C4-alkilne lance. Odvajanje EPO-a od proteinskih nečistoća temelji se na razlikama u jačini hidrofobnih interakcija. Ispiranje se provodi s gradijentom acetonitrila i razrijeđenoj trifluorooctenoj kiselini.

Preparativna HPLC izvedena je uporabom nehrđajuće čelične kolone (napunjene s 2.8 do 3.2 litre Vydac C4 silikagela). Eluat s Hydroxyapatite Ultrogel-a zakisljen je dodatkom trifluorooctene kiseline i napunjen u kolonu Vydac C4. Za ispiranje je korišten gradijent acetonitrila u razrijeđenoj trifluorooctenoj kiselini. Frakcije su skupljene i odmah neutralizirane s fosfatnim puferom. Skupljene su EPO frakcije koje su bile unutar granica IPC-a.

e) Kromatografija s DEAE Sepharose

Materijal DEAE Sepharose (Pharmacia) se sastoji od dietilaminoetilnih skupina (DEAE) koje su kovalentno vezane na površinu Sepharose slojeva. Vezanje EPO-a na DEAE skupine posredovano je ionskim interakcijama. Acetonitril i trifluorooctena kiselina prolaze kroz kolonu bez zadržavanja. Nakon ispiranja tih tvari, tragovi nečistoća se odstrane ispiranjem stupca s acetatnim puferom pri niskom pH. Kolona se zatim ispere s neutralnim fosfatnim puferom, a EPO se eluira s puferom povećane ionske jakosti.

Kolona je napunjena s DEAE Sepharosom brzog protoka. Volumen kolone podešen je tako da je osigurano punjenje EPO-a brzinom od 3-10 mg EPO/ml gel. Kolona je isprana s vodom i filterom za uravnoteživanje (natrijev/kalijev fosfat). Skupljene frakcije HPLC eluata napunjene su, a kolona isprana s puferom za uravnoteživanje. Kolona je zatim isprana s puferom za ispiranje (pufer natrij-acetat), a zatim isprana puferom za uravnoteživanje. EPO je zatim eluiran s kolone s puferom za eluiranje (natrijev klorid, natrijev/kalijev fosfat) te skupljen kao jednostruka frakcija u skladu s prevladavajućim profilom eluiranja.

Eluat s kolone DEAE Sepharose podešen je na određenu vodljivost. Dobivena ljekovita tvar je sterilno filtrirana u teflonske boce te pohranjena na -70°C.

PRIMJER 2:

Pegiliranje EPO s mPEG-SBA

EPO, pročišćen u skladu s procedurom bez seruma iz promjera 1 (EPOf), bio je homogen kako je određeno analitičkim metodama i pokazao je tipičnu izoformnu strukturu od 8 izoformi. Imao je specifičnu biološku aktivnost od 190,000 IJ/mg kako je određeno ispitivanjem s normocitemičkim miševima. Upotrijebljen je metoksi-PEG-SBA kao reagens za pegiliranje, koji je spoj formule II u kojoj je R metil; x iznosi 3; i m je od 650 do 750 (prosj. oko 680, odgovara prosječnoj molekulskoj masi od 30 kDa).

Reakcija pegiliranja

U sto miligrama EPOsf (9.71 ml 10.3 mg/ml EPOsf štok, 5.48 μmol) dodano je 10 ml 0.1M kalij-fosfat pufera, pH 7.5, koji je sadržavao 560 mg 30 kDa metoksi-PEG-SBA (16.5 μmol)(dobiven od Shearwater Polymers, Inc., Huntsville, Alabama) te je miješano 2 h na sobnoj temperaturi (20-23°C).

Konačna koncentracija proteina bila je 5 mg/ml, a omjer protein:PEG reagens 1:3. Nakon dva sata, reakcija je zaustavljena podešavanjem pH do 4.5 s ledenom octenom kiselinom i pohranjena na -20°C, dok nije bila spremna za pročišćavanje.

Pročišćavanje

1. Smjesa konjugata: Približno 28 ml SP-SEPHAROSE FF (sulfo-propil kation izmjenična smola) stavljeno je u AMICON staklenu kolonu (2.2 x 7.5 cm) i uravnoteženo s 20 mM acetatnog pufera, pH 4.5 pri brzini protoka od 150 ml/h. Šest mililitara reakcijske smjese koja je sadržavala 30 mg proteina peterostruko je razrijeđeno s puferom za uravnoteživanje i naneseno u kolonu. Neadsorbirani materijali isprani su s puferom, a adsorbirana smjesa konjugata PEG eluirana iz kolone s 0.175 M NaCl u puferu za uravnoteživanje. Nemodificirani EPOsf koji se još uvijek zadržao na koloni eluiran je s 750 mM NaCl. Kolona je ponovo uravnotežena u početnom puferu. Uzorci su analizirani s SDS-PAGE, a njihov stupanj pegiliranja određen. Pronađeno je da je 0.175 M NaCl eluat sadržavao količine mono- kao i di- i u tragovima tri-pegiliranih vrsta, dok je 750 mM NaCl eluat sadržavao nemodificirani EPOsf.

2. Di-PEG i Mono-PEG-EPOsf: Pročišćena smjesa konjugata eluirana iz kolone u prethodnom koraku četverostruko je razrijeđena s puferom i ponovno nanesena u kolonu te isprana kako je opisano. Di-PEG-EPOsf i Mono-PEG-EPOsf zasebno su eluirani iz kolone s 0.1M NaCl i 0.175 M NaCl, redom. Eluiranje je također provedeno sa 750 raM NaCl kako bi se eluirao svaki ostatak nemodificiranog EPOsf. Alternativno, reakcijska smjesa peterostruko je razrijeđena s acetatnim puferom i nanesena na SP-Sepharose kolonu (~0.5 mg protein/ml gela). Kolona je isprana, a adsorbirani mono-PEG-EPOsf, di-PEG-EPOsf i nemodificirani EPOsf eluirani su kako je opisano u prethodnom odjeljku.

Rezultati

PEG-EPOsf sintetiziran je kemijskim konjugiranjem linearne PEG molekule s brojem prosječne molekulske mase od 30 kDa. PEG-EPOsf dobiven je iz reakcije između primarnih amino skupina EPOsf i derivata sukcinimidil estera od 30 kDa PEG-maslačne kiseline, što je rezultiralo amidnom vezom.

Rezultati su sumirani u tablici 1. Pročišćena smjesa konjugata obuhvaćala je mono- i di-PEG-EPOsf nije sadržavala EPOsf kako je određeno pomoću SDS-PAGE analize. Smjesa konjugata obuhvaćala je 23.4 mg ili 78% početnog materijala. Kromatografsko odvajanje kationskom izmjenom mono- i di-PEG-EPOsf ukazalo je da omjer mono- i di-PEG u konjugatu bio gotovo 1:1. Po završetku reakcije, omjer pojedinih komponenata mono:di:nemodificirani bio je 40:38:20 (%). Ukupni donos bio je gotovo kvantitativan.

TABLICA 1: Ukupni rezultati pegiliranja EPOsf

[image]

PRIMJER 3:

Pegiliranje EPO s mPEG-SPA

Alikvot EPOsf drugačiji od korištenog u primjeru 2 reagirao je s 30 kDa metoksi-PEG-SPA (Shearwater Polymers, Inc., Huntsville, Alabama). Reakcija je izvedena pri omjeru proteina:reagensa od 1:2, a tehnike pročišćavanja bile su u skladu s primjerom 2. Prvo su proizvedene mono-pegilirane vrste.

PRIMJER 4:

Kovalentno vezanje tiolnih skupina na EPO

Ovaj primjer iznosi određivanje reakcijskih uvjeta za kovalentno vezanje tiolnih skupina na EPO. Kako bi se odredili uvjeti, različite količine reagensa koji sadrži blokiranu tiolnu skupinu, ovdje je to SATA ili SATP (otopljen u DMSO do 10 mg/ml), dodani su otopini EPO-a, ovdje je to 1 ml od 5 mg/ml EPO u 10 mM kalijevog fosfata, 50 inM NaCl, pH 7.3. Reakcija je miješana oko 30 minuta (25°C) te zaustavljena dodavanjem 1M otopine lizina na 10 mM. Višak SATA i SATP uklonjen je dijalizom s 10 mM kalijevog fosfata, 50 mM NaCl i 2 mM EDTA, pH 6.2. Nakon uklanjanja zaštitne acetilne skupine s hidroksilaminom, broj tiolnih skupina kovalentno vezanih na EPO određen je fotometrijski s ditiodipiridinom prema metodi opisanoj u Grasetti, D.R. i Murray, J.F., J. Appl. Biochem. Biotechnol. 119, stranica 41-49 (1967).

Broj kovalentno vezanih tiolnih skupina po molekuli EPO prikazan je ispod.

[image]

PRIMJER 5:

Modifikacija aktiviranog EPO s metoksi-PEG-maleimidom

A) Aktivacija EPO-a:

100 mg EPO-a proizvedenog u skladu s Primjerom 1 (190,000 IJ/mg kako je utvrđeno ispitivanjem s normocitemičkim miševima) aktivirano je sa SATA (molarni omjer: EPO/SATA=1/5) u skladu s Primjerom 2. Rezultirajući EPO («aktivirani EPO») koji je nosio kovalentno vezane blokirane tiolne skupine odvojen je od nusprodukata kao što je N-hidroksi-sukcinimid ili nereagirani SATA dijalizom kako je opisano u Primjeru 1. Dobivena je otopina 4.5 mg/ml aktiviranog EPO-a u 10 mM kalijevog fosfata, 50 mM NaCl, 2 mM EDTA, pH 6.2.

B) Pegiliranje aktiviranog EPO-a:

380 mg metoksi-PEG-maleimida «najpovoljnije strukture», gore ilustriranog (MW 30.000; Shearwater Polymers, Inc., Huntsville (Alabama, USA)) otopljeno je u gornjoj otopini koja je sadržavala 95 mg aktiviranog EPO (4.5 mg/ml u 10 mM kalijevog fosfata, 50 mM NaCl, 2 mM EDTA, pH 6.2). Rezultirajući molarni omjer između aktiviranog EPO i metoksi-PEG-maleimida u otopini bio je 1:4. Kovalentno vezane blokirane tiolne skupine aktiviranog EPO-a deblokirane su dodavanjem 1M vodene otopine hidroksilamina do 30 mM, pH 6.2 gornjoj otopini. Rezultirajući aktivirani EPO u reakcijskoj smjesi otopine sadržavao je slobodne tiolne (-SH) skupine. Deblokada tiolnih skupina zbila se odmah nakon reakcije vezanja između aktiviranog EPO-a koji je sadržavao slobodne tiolne (-SH) skupine i metoksi-PEG-maleimida 90 minuta (miješanje, 25°C). Reakcija vezanja zaustavljena je dodavanjem 0.2 M vodene otopine cisteina do 2 mM reakcijskoj smjesi. Nakon 30 minuta višak slobodnih tiolnih skupina aktiviranog EPO koji nije reagirao s metoksi-PEG-maleimidom blokiran je dodavanjem 0.5 M otopine N-metilmaleimida u DMSO kako bi se postigla koncentracija 5 mM. Nakon 30 minuta rezultirajuća reakcijska smjesa koja je sadržavala pegilirane EPO vrste dijalizirana je s 10 mM kalijevim fosfatom, pH 7.5 za ≥ 15 sati«

C) Pročišćavanje pegiliranih EPO vrsta:

Za odvajanje pegiliranih EPO vrsta iz reakcijske smjese, izveden je sljedeći postupak: 50 ml Q-Sepharose ff kolona uravnotežena je s 10 mM kalijevim fosfatom, pH 7.5. Reakcijska smjesa dobivena u koraku B) stavljena je u kolonu (brzina toka: 3 volumena kolone (CV) po satu). Kako bi se odvojio metoksi-PEG-maleimid reagens koji nije reagirao, kolona je isprana s 5 CV-a od 10 mM kalijevog fosfata, pH 7.5. Pegilirane EPO vrste odvojene su eluiranjem otopinom s rastućim gradijentom soli koji se sastojao od 5 CV pufera A (10 mM kaLijev fosfat, pH 7.5) i 5 CV pufera B (10 mM kalijev fosfat, 500 mM, pH 7.5) brzinom protoka od 3 CV po satu. Temeljeno na gradijentu NaCl, najprije su eluirane pegilirane EPO vrste (tri-, bi- i mono-pegilirane EPO vrste), a zatim nepegilirane EPO vrste. Frakcija eluata koja je sadržavala pegilirane EPO vrste (tri-, bi- i mono-pegilirane EPO vrste) skupljena je i filtrirana (sterilna filtracija s 0.2 μm filterom).

Sadržaj i čistoća tri-, bi- i mono-pegiliraneih EPO vrsta vrednovana je na Coomassie-obojenim SDS-PAA gelovima (Laemmli, Nature 227, 680-685 (1970)) dok su koncentracije proteina mjerene na 280 nm sukladno Beer-Lambertovom zakonu. Prividne molekulske mase EPO vrsta određene SDS-PAA elektroforezom bile su oko 68 kDa (mono-pegilirane EPO vrste), oko 98 kDa (di-pegilirane EPO vrste) te oko 128 kDa (tri-pegilirane EPO vrste).

Daljnje odvajanje tri-, di- i mono-pegiliranih EPO vrsta može se postići kromatografijom, npr. «size exclusion» kromatografijom (Superdex, pg 200; Pharmacia). Određivanje in vivo biološke aktivnosti eluata koji je sadržavao tri-, di- i mono-pegiliranih vrsta izvedeno je metodom opisanom ispod.

PRIMJER 6:

In-vivo djelovanje pegiliranog EPO određeno u testu s normocitemičkim miševima

Biološko ispitivanje s normocitemičkim miševima poznato je u struci (Pharm. Europa Spec. Issue Erythropoietin BRP Bio 1997 (2)) kao i metoda u monografiji eritropoetina iz Ph. Eur. BRP. Uzorci su razrijeđeni s BSA-PBS. Normalni zdravi miševi, stari 7-15 tjedana primili su subkutano 0.2 ml EPO-frakcije, koja je sadržavala tri-, di- ili mono-pegilirani EPO iz Primjera 2 ili 3. Tijekom perioda od 6 dana, uzeta je krv punkturom vene repa i razrijeđena tako da je 1 μl krvi bilo u 1 ml 0.15 μmol narančaste otopine akridina za bojenje. Vrijeme bojenja bilo je 3 do 10 minuta. Brojenje retikulocita izvršeno je mikrofluorimetrijski u protočnom citometru analizom histograma crvene fluorescencije. Brojevi retikulocita dani su kao apsolutni iznosi (na 30,000 analiziranih krvnih stanica). Za prikazane podatke, svaka skupina sastojala se je od 5 miševa dnevno, a miševima je uzeta krv samo jednom.

Miševima su u odvojenim pokusima davani jedna doza nemodificiranog EPO (25 ng EPO), smjesa PEG(SBA)-EPO iz primjera 2 (10 ng konjugata), mono- i di-pegilirani EPO iz primjera 2 (10 ng konjugata), PEG(SPA)-EPO iz primjera 3 (10 ng konjugata) i otopina pufera. Rezultati su prikazani u tablici 2. Rezultati pokazuju nadmoćno djelovanje i produljeno vrijeme poluživota pegiliranih EPO vrsta, koje se vidi po značajnom porastu količina retikulocita i u pomaku maksimalnog iznosa retikulocita primjenom iste doze po mišu (10 ng), u usporedbi s dozom od 25 ng za nemodificirani EPO.

[image]

PRIMJER 7:

Pripravljanje pretežno mono-PEG-EPO

Reakcija pegiliranja

U 100 mg (5.48 pmol) EPOsf u 100 inM kalij-fosfat pufera, pH 7.5, pripravljenog u skladu s primjerom 1, dodano je 329 mg (10.96 umol) 30 kDa PEG-SBA reagensa otopljenog u 3 ml 1 mM HCl. Dodano je toliko 100 mM kalij-fosfat pufera pH 7.5 da bi volumen reakcijske smjese bio 20 ml. Konačna koncentracija proteina bila je 5 mg/ml, a omjer protein:PEG reagens 1:2. Reakcijska smjesa miješana je 2 h na temperaturi okoline (20-22°C). Nakon 2h, reakcija je zaustavljena podešavanjem pH do 4.5 s ledenom octenom kiselinom i zamrznuta pohranjena na -20°C, dok nije bila spremna za pročišćavanje.

Pročišćavanje

Reakcijska smjesa iz prethodnog koraka razrijeđena 1:5 s 10 mM natrijevim acetatom, pH 4.5 i nanesena u 300 ml SP-Sepharose FF (sulfopropil kationska izmjenična smola) stavljenu u 4.2 x 19 cm kolonu. Kolona je prethodno uravnotežena s istim puferom. Kolonski efluenti praćeni su na 280 nm s Gilson UV monitorom i bilježeni s Kipp i Zonen uređajem. Kolona je isprana s 300 ml ili 1 slojem volumena pufera za uravnoteživanje kako bi se uklonio višak reagensa, reakcija nusprodukata i oligomerni PEG-EPO. Zatim je isprano s 2 sloja volumena 100 mM NaCl kako bi se uklonio di-PEG-EPO. Mono-PEG-EPO zatim je eluiran s 200 mM NaCl. Tijekom eluiranja mono-PEG-EPO, odbačen je prvi 50 ml proteinski pik, a mono-PEG-EPO skupljan kao 150 ml frakcija. Nemodificirani EPOsf koji je preostao na koloni eluiran je s 750 mM NaCl. Svi puferi za eluiranje načinjeni su u puferu za uravnoteživanje. Svi eluirani uzorci analizirani su s SDS-PAGE visokodjelotvornom «size exclusion» kromatografijom (SEC). Mono-PEG-EPO dio dobiven iz 150 ml frakcije, koja nije sadržavala količinu EPOsf koja se može detektirati, zatim je koncentriran do -4.5-7.5 mg/ml i diafiltriran u pufer za čuvanje, 10 mM kalijev-fosfat, 100 mM NaCl, pH 7.5. Koncentracija/diafiltriranje izvedeno je s Millipore Labscale™TFF System s ugrađenom 50 kDa podrezanom Millipore Pellicon XL Biomax 50 membranom na temperaturi okoline. Koncentrirani mono-PEG-EPO sterilno je filtriran i zamrznut pohranjen na -20°C.

Pegilirano je približno 75% EPOsf. Nakon pročišćavanja, ukupni donos bio je -30% mono-PEG-EPO bez EPOsf kojeg se može detektirati i oko 25% di-PEG-EPO. Ostatak proteina sačinjavali su oligomeri i nepegilirani EPOsf. Frakcija mono-PEG-EPO dobivena iz 150 ml frakcije sadržavala je približno 90% mono-PEG-EPO i približno 10% di-PEG-EPO.

PRIMJER 8:

Termostabilnost EPO i pegiliranog EPO u različitim formulacijama: Analiza pomoću DSC (diferencijalna skenirajuća kalorimetrija)

Općenito se uzima da temperatura prijelaza termalne denaturacije mjerena diferencijalnom skenirajućom kalorimetrijom je pouzdan pokazatelj termostabilnosti proteina. Otopine eritropoetina ili pegiliranog eritropoetina koncentracija između 0.6 i 1.2 mg/ml analizirane su različitim puferima sa ili bez stabilizatora pomoću Nano-DSC (Calorimetric Sciences Corporation, Utah, USA) pri brzini zagrijavanja od 2 K/min. Povišenje temperature prijelaza ukazuje na povišenje termalne stabilnosti proteina. Mjerene vrijednosti temperature ne smiju se uzimati kao apsolutne vrijednosti nego radije kao da predstavljaju razlike u stabilnosti pojedinih formulacija, jedne prema drugoj.

Kako bi se definirao optimalan pH formulacije, ispitivana je pH ovisnost o termalnoj denaturaciji pegiliranog eritropoetina u rasponu između 4 i 9. Uzorci proteina analizirani su u 30 mM Na2HPO4, 30 mM natrijevom citratu, 30 mM boratu. Slika 1 prikazuje plato maksimalne temperature prijelaza između oko pH 6 do oko pH 9 i oštar pad ispod pH 5.5. To ukazuje da optimalan pH maksimalne termalne stabilnosti leži iznad pH 5.5 (sl. 3).

Kako bi se ispitao učinak ionske jakosti, određena je ovisnost koncentracije fosfata o termalnoj denaturaciji. Slika 4 pokazuje da termalna stabilnost raste s porastom ionske jakosti formulacije.

Utjecaj vrste pufera također je ispitan pomoću DSC. Iz slike 5 može se vidjeti da su najpogodniji puferi ili aditivi za visoku termalnu stabilnost sulfat, citrat ili fosfat. Glicin, koji je upotrijebljen kao pufer u trenutno dostupnim formulacijama (vidi gore) nije jako pogodan.

Slika 6 prikazuje da je sulfat također prikladan pufer/aditiv pri niskom pH (npr. pH 6.2), dok je fosfat manje pogodan na pH 6.2 u usporedbi s pH 7.5. To pokazuje da sulfat održava visoku termalnu stabilnost, čak i na niskim pH. Taj izum dopušta formulaciju na pH između 6.0 i 6.5, bez ozbiljnih gubitaka termalne stabilnosti eritropoetina.

PRIMJER 9:

Agregacija EPO i peg-EPO pod termalnim udarom: Analiza pomoću SDS-PAGE (elektroforeza na natrij-dodecil-sulfat gelu)

Kako bi se ispitao učinak toplinskog udara na protein eritropoetin, uzorci u različitim formulacijama izloženi su toplinskom udaru (20 min 80°C) i analizirani elektroforezom na natrij-dodecil-sulfat gelu (SDS-PAGE) u redukcijskim (uz DDT u puferu uzorka) i neredukcijskim (bez DDT u puferu uzorka) uvjetima. Ova metoda omogućuje detekciju oblikovanja kovalentnog agregata. Kako je istaknuto iznad, oblikovanje agregata jedan je od glavnih načina razgradnje proteina te se stoga mora spriječiti u farmaceutskim formulacijama proteina. Za agregate koji se mogu detektirati u odsutnosti redukcijskog sredstva (npr. DTT) i koji se ne mogu detektirati u prisutnosti redukcijskog sredstva vrlo je vjerojatno da su oblikovani nepravilnim vezanjem preko disulfidnih mostova, i reakcijom oksidacije pod toplinskim udarom. Slika 5 prikazuje ovisnost pH o agregaciji pod toplinskim udarom. Ovaj pokus jasno pokazuje da je oblikovanje agregata potisnuto na pH ispod 6.5. Što je viši pH, veća je količina agregacije. Većina oblikovanih agregata može se reducirati obradom s uzorcima s redukcijskim sredstvom tijekom SDS-PAGE, što ukazuje da velik dio agregata nastalih pod termalnim udarom čine dimeri vezani preko disulfidnih mostova, oligomeri i agregati višeg reda. Sve u svemu, ovo pokazuje da se oblikovanje agregata uvelike može sprječiti održavanjem pH formulacije na ili ispod pH 6.5.

Slika 7: Ovisnost peg-EPO agregacije o pH. Peg-EPO uzorci nakon toplinskog udara (kako je gore opisano) analizirani su pomoću SDS-PAGE. Proteini su obojani srebrom. Stupac 1: molekulska masa standardna. Stupac 2: pH 5. Stupac 3: pH 5, reducirano. Stupac 4: pH 6. Stupac 5: pH 6, reducirano. Stupac 6: pH 6.5. Stupac 7: pH 6.5, reducirano. Stupac 8: pH 7. Stupac 9: pH 7, reducirano. Stupac 10: peg-EPO, bez udara.

Oblikovanje agregata također se može spriječiti uporabom antioksidansa. Slika 8 prikazuje da uporaba 1 mg/ml acetilcisteina kao antioksidansa sprječava oblikovanje agregata pod toplinskim udarom. Prema tome, korisno je upotrijebiti antioksidans, kao što je acetilcistein pri niskom pH, npr. pH 6.2, kako bi se spriječilo oblikovanje agregata pod toplinskim udarom.

Slika 6: Agregacija Peg-EPO može se spriječiti s pH 6.2 i/ili acetilcisteinom. Uzorci Peg-EPO nakon toplinskog udara (kako je gore opisano) analizirani su pomoću SDS-PAGE. Proteini su obojani srebrom. Stupac 1: peg-EPO, bez udara. Stupac 2: pH 7.5, udar. Stupac 3: pH 6.2, udar. Stupac 4: pH 6.2, udar, reducirano. Stupac 5: pH 7.5, 1 mg/ml acetilcistein, udar. Stupac 6: pH 7.5, 1 mg/ml acetilcistein, udar, reducirano.

PRIMJER 10:

Stabilnost peg-EPO u različitim formulacijama na 4, 25, 30 i 40°C

Pegilirani EPO u različitim formulacijama inkubiran je na različitim temperaturama. U naznačenim vremenskim točkama uzeti su uzorci te je procijenjena stabilnost visokodjelotvornom kromatografijom reverznih faza (rpHPLC), visokodjelotvornom «size exclusion» kromatografijom (SEC) i elektroforezom na natrij-dodecil-sulfat-poliakrilamidnom gelu (SDS-PAGE). Tablica 3 uspoređuje stabilnost peg-EPO u različitim formulacijama na različitim temperaturama. Ti podaci jasno pokazuju nadmoć ovdje izloženih formulacija s obzirom na regeneraciju proteina i agregaciju.

TABLICA 3: Stabilnost u različitim formulacijama na nekoliko temperatura

[image] * formulacije su:

formulacija A: 10 mM natrijev fosfat, 100 mM natrijev klorid, pH 7.5.

formulacija B: 10 mM natrijev fosfat, 40 mM natrijev sulfat, 3% (w/v) manitol, pH 6.2.

formulacija C: 10 mM natrijev fosfat, 100 mM NaCl, pH 7.0.

formulacija D: 10 mM natrijev fosfat, 120 mM natrijev sulfat, pH 6.2

formulacija E: 40 mM arginin, 30 mM natrijev sulfat, 3% manitol, 1 mM CaCl2, pH 6.2.

PRIMJER 11:

Optimizirane formulacije potiskuju oksidaciju metionina54 u EPO proteinu, metionin kao antioksidans

Pegilirani EPO u različitim formulacijama inkubiran je na različitim temperaturama. Nakon 6 mjeseci, uzeti su uzorci te je određen stupanj oksidacije metionina54, kako slijedi. Ukratko, uzorci EPO obrađeni su s endo-proteinazom LysC. Rezultirajući peptidi razdvojeni su kromatografijom reverznih faza* Izračunat je omjer oksidiranog peptida T8 (koji sadrži oksidirani metionin54) i peptida T8 (koji sadrži neoksidirani metionin54). Podaci su sumirani u tablici 4.

TABLICA 4: Stupanj oksidacije metionina54 iz EPO proteina u različitim formulacijama nakon šest mjeseci na naznačenoj temperaturi

[image] * formulacije su navedene ispod:

formulacija A: 10 mM natrijev fosfat, 100 mM natrijev klorid, pH 7.0.

formulacija C: 10 mM natrijev fosfat, 100 mM natrijev sulfat, 3% (w/v) manitol, 1 mM metionin, pH 6.2.

Ovi podaci jasno ukazuju da je poželjna formulacija iz predloženog izuma (10 mM natrijev fosfat, 100 mM natrijev sulfat, 3% (w/v) manitol, 1 mM metionin, pH 6.2) nadmoćna u odnosu na druge formulacije kao što je 10 mM natrijev fosfat, 100 mM natrijev klorid, pH 7.0 u pogledu stupnja oksidacije metionina54. Dodatak 1 ili 10 mM metionina u formulaciju očito potiskuje oksidaciju metionina54. Prema tome, metionin djeluje kao antioksidans i stabilizira EPO.

PRIMJER 12:

Sadržaj sialne kiseline peg-EPO u različitim formulacijama

Kako bi se analizirala cjelovitost ugljikohidratne strukture peg-EPO glikoproteina, standardnim tehnikama analiziran je sadržaj sialne kiseline uzoraka peg-EPO u optimiziranim formulacijama nakon 6 mjeseci čuvanja na različitim temperaturama. Ti podaci pokazuju da čuvanje proteina u novim formulacijama koje su ovdje opisane (slika 9) nije negativno utjecalo na cjelovitost ugljikohidratne strukture (slika 9).

PRIMJER 13:

Bioaktivnost pegiliranog EPO nakon čuvanja na povišenoj temperaturi kroz dulja vremenska razdoblja

Kako bi se dokazalo da čuvanje peg-EPO u 10 mM natrijevom fosfatu, 40 mM natrijevom sulfatu, 3% (w/v) manitolu, pH 6.2, negativno ne utječe na bioaktivnost in vivo, provedeno je standardno ispitivanje EPO na miševima (vidi primjer 6). Uzorci Peg-EPO čuvani 6 mjeseci u 10 mM natrijevom fosfatu, 40 mM natrijevom sulfatu, 3% (w/v) manitolu, pH 6.2, na naznačenoj temperaturi, nisu pokazali gubitak aktivnosti in vivo nakon čuvanja na 4, 25 i 30oC u usporedbi sa svježim referentnim standardom (sl. 10).

PRIMJER 14:

Sadržaj agregata peg-EPO nakon 6 mjeseci čuvanja na povišenoj temperaturi

Kako bi se analizirao sadržaj agregata u uzorcima peg-EPO nakon čuvanja na povišenoj temperaturi u 10 mM natrijevom fosfatu, 40 mM natrijevom sulfatu, 3% (w/v) manitolu, pH 6.2, uzorci su nakon 6 mjeseci uzeti i analizirani "siže exclusion" kromatografijom.

Na 4, 25 i 30°C nije se moglo detektirati agregate, što dokazuje stabilnost EPO u gore navedenim formulacijama. Slika 11 prikazuje pregled "siže exclusion" kromatograma,

Claims

1. Tekući farmaceutski pripravak, naznačen time, da uključuje protein eritropoetin, višestruko nabijeni anorganski anion u farmaceutski prihvatljivom puferu prikladnom za održavanje pH u rasponu od oko 5.5 do oko 7.0, i moguće jedan ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijensa.

2. Pripravak u skladu sa zahtjevom 1, naznačen time, da je vodena otopina.

3. Pripravak u skladu sa zahtjevima 1 do 2, naznačen time, da je izotonična otopina.

4. Pripravak u skladu sa zahtjevima 1 do 3, naznačen time, da je anion anion iz višestruko nabijene jake anorganske kiseline.

5. Pripravak u skladu sa zahtjevima 1 do 4, naznačen time, da se anion bira iz skupine koju čine sulfat, citrat ili fosfat.

6. Pripravak u skladu sa zahtjevima 1 do 5, naznačen time, da je anion sulfatni anion.

7. Pripravak u skladu sa zahtjevom 6, naznačen time, da uključuje 10 do 200 mmol/l sulfata.

8. Pripravak u skladu sa zahtjevima 1 do 7, naznačen time, da je pH 5.8 do 6.7.

9. Pripravak u skladu sa zahtjevom 8, naznačen time, da je pH 6.0 do 6.5.

10. Pripravak u skladu sa zahtjevom 9, naznačen time, da je pH oko 6.2.

11. Pripravak u skladu sa zahtjevima 1 do 10, naznačen time, da je pufer izabran iz skupine koju čine fosfatni ili arginin/H2SO4/Na2SO4 pufer.

12. Pripravak u skladu sa zahtjevom 11, naznačen time, da je pufer 10 do 50 mmol fosfatni pufer.

13. Pripravak u skladu sa zahtjevima 1 do 12, naznačen time, da pripravak obuhvaća jedan ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijensa.

14. Pripravak u skladu sa zahtjevom 13, naznačen time, da su jedan ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijensa izabrani iz skupine koju čine farmaceutski prihvatljive soli, razrjeđivači, otapala i konzervansi.

15. Pripravak u skladu sa zahtjevima 13 i 14, naznačen time, da su farmaceutski prihvatljivi ekscipijensa izabrani iz skupine koju čine sredstva za toničnost, polioli, antioksidanti i neionski deterdženti.

16. Pripravak u skladu sa zahtjevima 13 do 15, naznačen time, da je farmaceutski prihvatljivi ekscipijens poliol.

17. Pripravak u skladu sa zahtjevom 16, naznačen time, da je poliol izabran iz skupine koju čine manitol, sorbitol, glicerol, trehaloza i saharoza.

18. Pripravak u skladu sa zahtjevom 17, naznačen time, da je poliol manitol.

19. Pripravak u skladu sa zahtjevima 13 do 18, naznačen time, da uključuje antioksidans.

20. Pripravak u skladu sa zahtjevom 19, naznačen time, da je antioksidans metionin.

21. Pripravak u skladu sa zahtjevima 13 do 20, naznačen time, da uključuje do 1 mmol/l CaCl2.

22. Pripravak u skladu sa zahtjevima 15 do 21, naznačen time, da je neionski deterdžent polisorbat 80, polisorbat 20 ili pluronic F68.

23. Pripravak u skladu sa zahtjevom 22, naznačen time, da je neionski deterdžent pluronic F68.

24. Pripravak u skladu sa zahtjevima 22 ili 23, naznačen time, da pripravak uključuje do 1% (w/v) neionskog deterdženta.

25. Pripravak u skladu sa zahtjevima 22 do 24, naznačen time, da pripravak uključuje do 0.1% (w/v) neionskog deterdženta.

26. Pripravak u skladu sa zahtjevima 1 do 25, naznačen time, da je protein eritropoetin humani eritropoetin.

27. Pripravak u skladu sa zahtjevom 26, naznačen time, da je protein eritropoetin ekspresiran aktiviranjem endogenog gena.

28. Pripravak u skladu sa zahtjevima 26 do 27, naznačen time, da protein eritropoetin ima sekvencu aminokiselina iz SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2.

29. Pripravak u skladu sa zahtjevima 26 do 28, naznačen time, da protein ima sekvencu humanog eritropoetina modificiranu dodavanjem od 1 do 6 mjesta glikosilacije.

30. Pripravak u skladu sa zahtjevima 26 do 28, naznačen time, da protein eritropoetin ima sekvencu humanog eritropoetina modificiranu modifikacijom izabranom iz skupine koju čine: Asn30Thr32; Asn51Thr53; Asn57Thr59; Asn69; Asn69Thr71; Ser68Asn69Thr71; Val87Asn88Thr90; Ser87Asn88Thr90; Ser87Asn88Gly89Thr90; Ser87Asn88Thr90Thr92; Ser87Asn88Thr90Ala162; Asn69Thr71Ser 87Asn88Thr 90 ; Asn30Thr32Val87Asn88Thr90; Asn89Ile90Thr91; Ser87Asn89Ile90Thr91; Asn136Thr138; Asn138Thr140; Thr125; i Pro124Thr125.

31. Pripravak u skladu sa zahtjevima 26 do 30, naznačen time, da je sekvenca humanog eritropoetina modificirana premještanjem barem jednog mjesta glikosilacije.

32. Pripravak u skladu sa zahtjevom 31, naznačen time, da premještaj obuhvaća uklanjanje bilo kojeg N-povezanog glikosilacijskog mjesta u humanom eritropoetinu i dodavanje jednog N-povezanog glikosilacijskog mjesta na položaj 88 u sekvenci humanog eritropoetina.

33. Pripravak u skladu sa zahtjevom 31, naznačen time, da glikoprotein ima sekvencu humanog eritropoetina modificiranu modifikacijom izabranom iz skupine koju čine Gln24 Ser87 Asn88 Thr90; Gln38 Ser87 Asn88 Thr90 i Gln83 Ser87 Asn88 Thr90.

34. Pripravak u skladu sa zahtjevima 26 do 33, naznačen time, da je eritropoetin, kako je definiran bilo kojim od zahtjeva, pegiliran.

35. Pripravak u skladu sa zahtjevom 34, naznačen time, da je protein eritropoetin konjugiran, pri čemu spomenuti konjugat uključuje glikoprotein eritropoetin koji ima barem jednu slobodnu aminoskupinu i biološko djelovanje in vivo poticanja stanica koštane srži na proizvodnju retikulocita i crvenih krvnih stanica i bira se iz skupine koja obuhvaća humani eritropoetin i njegove analogone koji imaju sekvencu humanog eritropoetina modificiranu dodavanjem od 1 do 6 mjesta glikosilacije ili premještanjem barem jednog mjesta glikosilacije; spomenuti eritropoetin pritom je kovalentno vezan s «n» poli(etilenglikol) skupinama formule -CO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR s tim da -CO (tj. karbonil) iz svake poli (etilenglikol) skupine oblikuje amidnu vezu s jednom od spomenutih amino skupina; pri čemu je R niži alkil; x je 2 ili 3; m je od oko 450 do oko 900; n je od 1 do 3; te su n i m odabrani tako da molekulska masa konjugata bez glikoproteina eritropoetina bude od 20 kilodaltona do 100 kilodaltona.

36. Pripravak u skladu sa zahtjevom 35, naznačen time, da je protein eritropoetin dan formulom: P-[NHCO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR]n(I) gdje su m, n, x i R kao gore, a P je dio glikoproteina bez n amino skupine(skupina) koja oblikuje (koje oblikuju) amidnu vezu (amidne veze) s poli(etilenglikol) skupinom (skupinama).

37. Pripravak u skladu sa zahtjevom 36, naznačen time, da u formuli (I) x iznosi 2, m je 650 do 750, n je 1 i R je metil.

38. Pripravak u skladu sa zahtjevom 34, naznačen time, da je protein eritropoetin konjugiran, pri čemu spomenuti konjugat uključuje glikoprotein eritropoetin koji ima barem jednu slobodnu aminoskupinu i biološko djelovanje in vivo poticanja stanica koštane srži na proizvodnju retikulocita i crvenih krvnih stanica i bira se iz skupine koja obuhvaća humani eritropoetin i njegove analogone koji imaju sekvencu humanog eritropoetina modificiranu dodavanjem od 1 do 6 mjesta glikosilacije; pri čemu je spomenuti glikoprotein kovalentno vezan na jednu do tri niži-alkoksi poli(etilenglikol) skupine, svaka poli(etilenglikol) skupina kovalentno je vezana na glikoprotein preko veziva formule -C(O)-X-S-Y- s tim da C(O) iz veziva oblikuje amidnu vezu s jednom od spomenutih amino skupina, X je -(CH2)k- ili -CH2(O-CH2-CH2)k-, k je od 1 do 10, Y je [image] prosječna molekulska masa svake poli(etilenglikol) skupine iznosi od oko 20 kilodaltona do oko 40 kilodaltona, a molekulska masa konjugata je od oko 51 kilodaltona do oko 175 kilodaltona.

39. Konjugat iz zahtjeva 38, naznačen time, da ima formulu [image] pri čemu je n cijeli broj od 1 do 3; m je cijeli broj od 450 do 900; R je niži alkil; X je -(CH2)k- ili -CH2(O-CH2-CH2)k-, a P je dio glikoproteina eritropoetina bez amino skupine ili skupina koje oblikuju amidnu vezu s X.

40. Konjugat u skladu sa zahtjevom 39, naznačen time, da ima formulu [image] pri čemu je n cijeli broj od l do 3; m je cijeli broj od 450 do 900; R je niži alkil; X je -(CH2)k- ili -CH2(O-CH2-CH2)k-, a P je dio glikoproteina eritropoetina bez amino skupine ili skupina koje oblikuju amidnu vezu s X.

41. Pripravak iz zahtjeva 1 do 40, naznačen time, da sadrži 10 μg do 10000 μg proteina eritropoetina po ml.

42. Pripravak iz zahtjeva 1 do 41, naznačen time, da sadrži 10 μg do 10000 μg proteina eritropoetina po ml, 10-200 mmol/l sulfata i 10 do 50 mmol/l fosfata pH 6.0 do 6.5.

43. Pripravak iz zahtjeva 42, naznačen time, da sadrži do 20 mM metionina, 1-5% poliola (w/v), do 0.1% pluronic F68 (w/v) i moguće do 1 mM CaCl2.

44. Pripravak u skladu sa zahtjevom 42 ili 43, naznačen time, da sadrži 10 μg do 10000 μg proteina eritropoetina po ml, 40 mmol/l sulfata, 10 mmol/l fosfata. 3% manitola (w/v), 10 mM metionina, 0.01% pluronic F68 (w/v), pH 6.2.

45. Pripravak u skladu sa zahtjevima 1 do 41, naznačen time, da sadrži 10 μg do 10000 μg proteina eritropoetina po ml, 10 do 100 mmol/l NaCl, 10-50 mmol/l fosfata pH 6.0 do 7.0, moguće 1-5% poliola.

46. Pripravak iz zahtjeva 45, naznačen time, da sadrži do 20 mM metionina, do 0.1% pluronic F68 i moguće 7.5 μmol/l CaCl2.

47. Pripravak iz zahtjeva 45 ili 46, naznačen time, da sadrži 10 μg do 10000 μg proteina eritropoetina po ml, 100 mmol/l NaCl, 10 mM metionina, 0.01% pluronic F68 i 10 mmol/l fosfata, pH 7.0.

48. Pripravak iz zahtjeva 1 do 41, naznačen time, da sadrži 10 μq do 10000 μg proteina eritropoetina po ml, 10-50 mmol/l arginina, pH 6.0 do 6.5, 10 do 100 mmol/l natrijevog sulfata.

49. Pripravak iz zahtjeva 48, naznačen time, da sadrži do 20 mM metionina, do 0.1% pluronic F68, moguće do 1 mmol/l CaCl2 i moguće 1-5% poliola.

50. Pripravak iz zahtjeva 48 ili 49, naznačen time, da sadrži 10 μg do 10000 μg proteina eritropoetina po ml, 40 mmol/l arginina, pH 6.2, 30 mmol/l natrijevog sulfata, 3% manitola, 10 mM metionina, 0.01% pluronic F68 i moguće 1 mmol/l CaCl2 .

51. Pripravak u skladu sa zahtjevima 1 do 41, naznačen time, da sadrži 25 μg do 2500 μg/ml eritropoetina i a) 10 mM natrij/kalij fosfata, 100 mM NaCl, pH 7.0 ili b) 10 mM natrijevog fosfata, 120 mM natrijevog sulfata pH 6.2 ili c) 10 mM natrijevog fosfata, 40 mM natrijevog sulfata, 3% manitola, pH 6.2 ili d) 10 mM natrijevog fosfata, 40 mM natrijevog sulfata, 3% manitola, 10 mM metionina, 0.01 pluronic F68, pH 6.2 ili e) 40 mM arginina, 30 mM natrijevog sulfata, 3% manitola, pH 6.2 ili f) 40 mM arginina, 30 mM natrijevog sulfata, 3% manitola, 10 mM metionina, 0.01% pluronic F68, pH 6.2.

52. Pripravak iz zahtjeva 1 do 51, naznačen time, da je količina eritropoetina 50, 100, 400, 800 ili 2500 μg/ml.

53. Pripravak iz zahtjeva 52, naznačen time, da sadrži 10 mM natrijevog fosfata, 40 mM natrijevog sulfata, 3% manitola, 10 mM metionina, 0.01% pluronic F68, pH 6.2.

54. Pripravak iz zahtjeva 52, naznačen time, da sadrži 40 mM arginina, 30 mM natrijevog sulfata, 3% manitola, 10 mM metionina, 0.01% pluronic F68, pH 6.2.

55. Pripravak iz zahtjeva 1 do 51, naznačen time, da je liofilizat ili raspršivanjem osušeni prah.

56. Postupak za pripravljanje pripravka u skladu s bilo kojim od zahtjeva 1 do 54, naznačen time, da uključuje miješanje proteina eritropoetina s otopinom koja sadrži višestruko, negativno nabijeni anion i moguće jedan ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijensa.

57. Uporaba pripravka u skladu s bilo kojim od zahtjeva 1 do 54, naznačena time, da služi za pripravljanje lijekova korisnih za liječenje i sprječavanje bolesti povezanih s anemijom kod pacijenata s kroničnim zatajivanjem bubrega (CRF), AIDS-om i/ili za liječenje pacijenata s karcinomom koji su podvrgnuti kemoterapiji.

58. Metoda za liječenje i sprječavanje bolesti koje uključuju anemiju kod pacijenata s kroničnim zatajivanjem bubrega (CRF), AIDS-om i pacijente s karcinomom koji su podvrgnuti kemoterapiji, naznačena time, da obuhvaća korak davanja pacijentu pripravka kakav je naveden u bilo kojem od zahtjeva 1 do 54.

59. Naprava za lokalno i sustavno neprekidno otpuštanje, naznačena time, da uključuje pripravak u skladu s bilo kojim od zahtjeva 1 do 54.

60. Izum, naznačen time, kako je prethodno opisan.