FR2516935A1

FR2516935A1 - Procede de preparation de derives de 3-hydroxy-ml-236b connus comme m-4 et m-4'

Info

Publication number: FR2516935A1
Application number: FR8219433A
Authority: FR
Inventors: Akira Terahara; Minoru Tanaka
Original assignee: Sankyo Co Ltd
Current assignee: Sankyo Co Ltd
Priority date: 1981-11-20
Filing date: 1982-11-19
Publication date: 1983-05-27
Also published as: JPH0371116B2; GB2111052B; ATA425182A; DE3242849A1; ES8402350A1; JPS5889191A; FI823978L; KR880002483B1; DK516182A; DK159328B; DE3242849C2; US4537859A; GB2111052A; NL194373C; CA1186647A; KR840002451A; CH651065A5; NL8204505A; FI823978A0; IT1191235B

Abstract

LA PRESENTE INVENTION EST RELATIVE A UN PROCEDE DE PREPARATION D'UN COMPOSE REPONDANT A LA FORMULE 1 : (CF DESSIN DANS BOPI) DANS LAQUELLEOH REPRESENTEOH OUOH, SES SELS ET ESTERS PHARMACEUTIQUEMENT ACCEPTABLES ET LES LACTONES A CYCLE FERME CORRESPONDANTES, CARACTERISE EN CE QU'ON MET UN COMPOSE DE ML-236B CHOISI PARMI L'ACIDE ML-236B CARBOXYLIQUE, SES SELS ET ESTERS ET LA LACTONE ML-236B CORRESPONDANTE EN CONTACT AVEC UNE ENZYME D'HYDROXYLATION PRODUITE PAR UN MICROORGANISME DU GENRE NOCARDIA; SI NECESSAIRE, ON SOUMET LE PRODUIT RESULTANT A UNE OU PLUSIEURS REACTIONS CHOISIES PARMI LES REACTIONS D'HYDROLYSE, DE SALIFICATION, D'ESTERIFICATION ET DE LACTONISATION; ET ON ISOLE LE PRODUIT DU MELANGE REACTIONNEL.

Description

La présente invention est relative à un procédé de préparation de certains

dérivés de 3-hydroxy-ML-236 B connus

comme M-4 et M-4 '; ainsi que des sels et esters de ces com-

posés. Le ML-236 B, qui peut exister sous la forme d'un acide

(connu comme "acide ML-236 B carboxylique") ou d'une lacto-

ne (connue comme "lactone ML-236 B") est décrit dans le bre-

vet britannique n 1 453 425 et, sous forme de lactone, répond à la formule: Oq<O O

CH 3

Ultérieurement, le brevet britannique n 1 555 831 a décrit divers sels et esters de ML-236 B Le ML-236 B ainsi

que ses sels et esters se sont révélés inhiber la biosyn-

thèse du cholestérol en concurrençant la 3-hydroxy-3-

méthylglutaryl coenzyme A réductase, qui est l'enzyme dé-

terminant le taux de biosynthèse du cholestérol; c'est ain-

si que ces composés se sont révélés présenter un très net

pouvoir de réduction des taux sériques de cholestérol.

Par la suite, certains dérivés de 3-hydroxy-ML-236 B

ont été isolés sous forme de produits du métabolisme ani-

mal de la lactone ML-236 B et on a découvert que des déri-

vés similaires étaient produits par l'hydroxylation enzy-

matique de la lactone ML-236 B ou de l'acide ML-236 B car-

boxylique ou ses sels ou esters, réalisée à l'aide de di-

vers microorganismes' appartenant aux genres Absidia, Cun-

ninghamella, Syncephalastrum, Streptomyces, Mucor, Rhizopus,

Zygorinchus, Circinella, Actinomucor, Gongronella, Phyco-

myces, Mortierella, Pycnoporus et Rhizoctonia Ces procédés sont décrits dans le brevet des E U A N O 4 346 227 déposé le 5 juin 1981 par A Terahara et M Tanaka et les composés ainsi obtenus sont décrits dans la demande de brevet comme M-4, M-4 ', Iso M-4 et Iso M-4 i Ces composés se sont avérés avoir un pouvoir d'inhibition de la biosynthèse du cholestérol qui est au moins comparable à et, dans certains, dépasse notablement celui de ML-236 B lui-même. C'est ainsi que le ML-236 B et ses dérivés, y compris

les composés de M-4 et M-4 ', sont utilisables en thérapeu-

tique pour le traitement de l'hyperlipémie et la prophyla-

xie de l'artériosclérose.

La Demanderesse a maintenant découvert qu'on peut

également préparer M-4 et M-4 ' à partir de ML-236 B et di-

vers dérivés de celui-ci, par traitement avec un microor-

ganisme du genre Nocardia, ou d'un extrait de ce dernier,

exempt de cellules, et contenant une enzyme L'utilisa-

tion de microorganismes dugenre Nocardia présente, par rapport à l'utilisation des microorganismes décrits dans

le brevet des E U A n 4 346 227, l'avantage que le com-

posé de ML-236 B utilisé comme substrat peut être présent

dans le milieu réactionnel en une concentration bien supé-

rieure à celle possible lorsqu'on utilise les microorganis-

mes selon les techniques antérieures Cela est d'autant plus surprenant que les composés de ML-236 B se sont avérés

posséder des propriétés antifongiques et antibiotiques.

Par consequent, la présente invention a pour objet un procédé de préparation d'un composé de formule (I):

HOOC< "H

H O

H 30 H, ( '

_I CH 3

HOO

3 C O

(dans laquelle ri OH représente OH ou,,,,,,,OH), de ses sels et esters pharmaceutiquement acceptables et les lactones à cycle fermé correspondantes, procédé consistant G à mettre un composé de MLB-236 B choisi parmi l'acide ML-236 B carboxylique répondant à la formule (II): HOOC,,ss 9 CH H i O

H 3 C 9 HA

CH 3 CH 3

ses sels et esters ainsi que la lactone ML-236 B correspon-

dante en contact avec une enzyme d'hydroxylation produite par un microorganisme du genre Nocardia; si nécessaire à

soumettre le produit résultant à une ou plusieurs réac-

tions choisies parmi les réactions d'hydrolyse, de salifi-

cation, d'estérification et de lactonisation; et à isoler

le produit du mélange réactionnel.

Le composé de formule (I) dans lequel V\S OH représen-

te -" OH est appelé acide M-4 carboxylique et les sels et

esters correspondants sont connus comme M-4 carboxylates.

Le composé de formule (I) dans lequel o Jxv OH représente tt,,,,,,,,,,,OH est appelé acide M-4 ' carboxylique et les sels

et esters correspondants sont appelés M-4 ' carboxylates.

Les lactones à cycle fermé-correspondant aux composés de formule (I) peuvent être représentées par la formule (Ia):

H

H 3 C "

9 H o Oa) CH 3 HO dans laquelle -j-r OH'représenteu-"OH ou,,,,,,,,OH

sont connues respectivement oeme lactone M-4 et lactone M-4 '.

La lactone à cycle fermé correspondant à l'acide ML-236 B carboxylique de formule (II) peut être représentée par la formule (I Ia): O OH

CH CH 3

'

et est connue comme lactone ML-236 B. Les espèces préferables du genre Nocardia à utiliser

dans le procédé suivant l'invention sont Nocardia autotro-

phica, Nocardia asteroides, Nocardia farcinica et Nocardia Qeliaca particulièrement Nocardia autotrophica Parmi ces espèces, les souches suivantes sont préférables: Nocardia autotrophica FERM P-6181 (SANK 62781) ; Nocardia autotrophica subsp canberrica subsp nov FERM

P-6182 (SANK 62881):

Nocardia autotrophica subsp amethystina subsp nov FERM

P-6183 (SANK 62981); ' -

Nocardia autotrophica IFO 12743 (SANK 91279);

Nocardia asteroides IFO 3424 (SANK 62065); -

Nocardia farcinica ATCC-3318 (SANK 64265) et

Nocardia coeliaca ATCC 17040 (SANK 63665).

Parmi les souches préférables ci-dessus, Nocardia autotrophica IFO 12743, Nocardia asteroides IFO 3424, Nocardia farcinica ATCC 3318 et Nocardia coeliaca ATCC 17040 sont toutes des souches connues qui sont librement

et publiquement accessibles à partir de la collection de-

culture appropriée, c'est-à-dire auprès de Institute for Fermentation, Osaka, Japon (IFO), ou American Type Culture Collection, E U A (ATCC) sous les numéros d'accession indiqués Les souches de Nocardia autotrophica identifiées par les numéros d'accession FERM P-6181, FERM P- 6182 et FERM

2516935.

P-6183 sont toutes de nouvelles souches du microorganisme,

récemment isolées à partir du sol et déposées le 16 octo-

bre 1981 auprès de Fermentation Research Institute,

Ibaraki-Ken, Japon (FERM).

Les propriétés morphologiques et physiologiques des microorganismes récemment isolés ont été déterminées en

utilisant des milieux classiques et les protocoles opéra-

toires décrits par Shirling et Gottlieb /International

Journal of Systematic Bacteriology 16, 313-340 ( 1966)7-

ainsi que plusieurs tests supplémentaires Les observations

des cultures ont été effectuées au bout de 2 semaines d'in-

cubation à 28 C Les noms-utilisés pour les couleurs sont

attribués d'après "Guide to Colour Standard" (manuel pu-

blié par Nippon Shikisai Kenkyusho, Tokyo, Japon) Les caractéristiques des cultures ont été comparées avec celles de diverses espèces connues d'actinomycètes décrites dans "The Actinomycetes, Vol 2 " par Waksman, "The ISP Report" par Shirling et Gottlieb, "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology", 8 ème édition, et autre littérature récente

concernant la taxonomie de la famille des Nocardiacées.

Les nouveaux microorganismes sont identifiés par leurs

numéros d'accession FERM.

Caractéristiques morphologiques

TABLEAU 1

FERM FERM FERM

P-6181 P-61821 P-6183

Morphologie des chaînes de spores RF r RF Ramification simple simple simple Fragmentation oui oui oui Structure superficielle des lisse Ilisse lisse hyphes segmentées (spores) Autres organes noeuds, noeuds néant

enchevê-

trements en forme de nids RF = rectus-flexibilis Croissance sur milieux taxonomiques Les nouvelles souches présentent toutes une bonne

croissance sur divers milieux.

La souche FERM P-6181 présente des nycéliums aériens bbncs sur culture allant du gris-jaunâtre au jaune orangé pâle. Dans certain milieux, on remarque la présence d'un pigment soluble marron-jaune pâle, mais seulement à un faible degré. La souche FERM P-6182 présente des mycéliums aériens

jaune-orangé pâle sur une culture marron-jàune-grisâtre.

On n'observe pas de pigment soluble.

La souche FERM P-6183 donne une culture blanc-brunâtre à jaune orangé pâle et on observe des taches violet-brun au fur et à mesure-que la culture s'effectue Des mycéliums aériens gris-brunâtre sont présents sur tous les-milieux,

sauf en-ce qui concerne le milieu levure-malt.

Les propriétés des cultures, au 14 ème jour de culture

à 28 C, sur divers milieux sont indiquées au tableau 2.

Les abréviations utilisées dans le tableau sont les sui-

vantes: G-= croissance AM = mycelium aérien R = envers

SP = pigment soluble.

TABLEAU 2

I Milieux FERM P-6181 FERM P-6182 FERM P-6183 i Gélose G {très bonne, très bonne, très bonne, blanc-: levure Ibrun-jaune marron marron, 12-9-8) à

malt lpâle ( 6-7-9) ( 6-4-1) marron-rouge-

H(ISP 2) grisâtre ( 4-3-5) AM abondant, i abondant, Traces, blanc

blanc blanc-brunâ-

i 1 tre ( 2-9-7) t R terne, jaune Marron ( 4-4-7) Blanc-marron ( 2-9-8)

orangé ( 8-8-8)' à marron-rouge-

j I {j i' |grisâtre ( 4-3-5) SP Marron-jaune Néant Néant

( 8-7-9)

v _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ t _ _ _ _ _ _ _ TABLEAU 2 (suite) i i Milieux FERM P-6181 FERM P-6182 FERM P-6183 Gélose G bonne, marron tres bonne, très bonne, marron farine pale ( 2-8-9) jaune orangé rouge foncé d'avoine pale ( 2-9-9) ( 4-3-4)

(ISP 3)

AM Passable, Abondant Passable, rose blanc marron-jaune pâle ( 2-8-4) pale ( 2-9-9) R marron-jaunâtre Marron-jaune violet-marron ( 4-7-9) pale ( 4-8-9) ( 3-3-2) i ( 332 SP marron jaune néant néant pale ( 4-8-9) Gélose G bonne, médiocre, très bonne, amidon/ ' gris jaunâtre gris- jaunatre violet-marron sel ( 2-9-10) ( 1-9-10) ( 3-3-2) minéral |iné 4)a AM Passable, abondant, bon, gris-marron I (S,blanc t jaune orangé vif ( 28-2) t' l,pale ( 2-9-9) :{ R jaune pâle jaune-orangé Marron-rouge foncée *i ? ( 3-9-10) pale ( 2-9-9) ( 4-3-4) ôSP nétnéant néant nant l Gélose G bonne, marron bonne, marron très bonne, marron: iglycérine/ |pâle ( 2-8-9) jaune grisâtre pâle ( 2-9-9) à asparagine ( 4-5-7) violet-marron

(ISP 5) ( 3-3-2)

l ISP 5 AM i abondant, abondant abondant, blanc blanc blanc-marron

( 1-8-6)

Rmarron-jaune marron ( 4-4-6) jaune-orangé pâle

pale ( 6-8-9) ( 2-9-9) a marron-

rouge grisâtre

( 4-3-6)

SP marron-jaune néant n(ant pâle ( 6-9-11) Gélose G très bonne, très bonne, bonne, marron Tyrosine jaune orangé marron-jaune grisâtre ( 4-6-6) (ISP 7) pale ( 3-8-8) grisâtre ( 5-5-J AM abondant, abondant, traces, blanc blanc blanc-marron

( 2-9-7)

R gris jaunâtre marron vif jaune orangé pale ( 1-9-10) ( 6-5-7) ( 2-9-9) à violet marron ( 3-3-2) SP marron-jaune néant pâle ( 6-7-9) nant TABLEAU 2 (suite) Milieux FERM P-6181 FERM P-6182 FRM P-6183

_____ ____ ____ _____ __P _ 618 _ FER P-6182 '

Gélose G bonne, marron médiocre, médiocre, jaune ' saccharose jaune pâle marron-jaune forangé pâle ( 2-9-9 ' nitrate ( 2-9-9) pâle ( 2-9-9) :' AM:' Passable, abondant, -passable, blanc : blanc blanc-marron

( 2-9-7)

R gris jaunâtre Blanc-marron jaune orangé pâle

( 1-9-10) ( 1-9-6) ( 2-9-9)

SP néant néant neant Gélose G: très -bonne, S bonne, marron très bonne, jaune glucose/ jaune orangé I jaune grisatre orangé pâle ( 2-9-9;) asparagine pâle ( 2-9-9) ( 4-5-7) a violet marron t

:,, N ( 3-3-2)

I i AM Passable, abondant, Passable, blanc blanc blanc-marron {vif ( 1-76) I' Rj marron-jaune marron-rouge jaune orangé pale

pâle ( 4-8-9) grisatre ( 2-9-9) a marron-

( 4-3-6) rouge grisâtre

( 4-3-6) -

SP marron-jaune néant néant pale ( 4-8-9) Gélose G bonne, gris trèsbonne, bonne jaune orangé nutritive jaunâtre marron-jaune pale ( 2-9-9) l ( 2-910) j pale ( 6-8-9) AM passable, jaune orangé traces, blanc; i blanc| pâle ( 2-9-9) R gris jaunâtre, marron-jaune jaune orangé pâle f* a( 4-9- 10) J pâle ( 6-8-9) ( 2-9-9) SP néant néant néant Gélose Gl médiocre, l médiocre, médiocre, jaune eau gris jaunâtre incolore orangé pale i ( 1-910) j ( 2-9-9): AMI passable,blanc abondant,blan passable, blanc l R gris jaunâtre -jaune orangé jaune orangé pale ( 1-9-10) pâle ( 2-9-9) ( 2-9-9) r SPI) néant néant n nt

____________________________________ ________________________________ _________________________________ _______________________________________

- TABLEAU 2 (suite) Milieu FERM P-6181 FERM P-6182 FERM P-6183 Géiose G médi ocre, mdiocre, médiocre, jaune extrait de gris jaunâtre incolore orangé pâle pomme de ( 1-9-10) ( 2-9-9) terre/carotte AM passable, passable, passable, blanc blanc t blanc i R lgris jaunâtre jaune orangé jaune orangé pale I: ( 1-9-10) pâle ( 2-9-9) ( 2-9-9) SPIéant néant néant Propriétés physiologiques Les propriétés physiologiques des nouvelles souches sont indiquées au tableau 3 Le test pour la formation de pigment mélanoique est effectué dans trois milieux, comme suit: Milieu 1: bouillon tryptone-extrait de levure (ISP 1) Milieu 2: gélose peptone- extrait de levure-fer (ISP 6) Milieu 3: gélose à la tyrosine (ISP 7)

TABLEAU 3

= négative + = positive NG = pas de croissance

FERM FERM FERM |

______________ _ P-6181 P-61821 P-61831

Réduction des nitrates Hydrolyse de l'amidon Décomposition de l'urée + + Résistance à la lysozyme + _ Formation de pigment mélanique Milieu 1 Milieu 2 Milieu 3 | Production d'acide à partir de J arabinose + + xylose + + i raffinose + NG f __ _ _ __ _l__ _l__ _ Utilisation des hydrates de carbone les est est + 20 Analyse Analyse

L'utilisation des hydrates de carbone par les nouvel-

souches est indiquée au tableau 4 Le milieu utilisé la gélose PridhamGottlieb (ISP 9) et la détermination

effectuée au bout de 14 jours de culture à 28 C.

TABLEAU 4

FERM t FERM FERM j) P-6181 i P-6182 i P-6183 D-Glucose + + I + DArabinose + l + l - XD-Xylose + + i L + D-Fructose + L-Rhamnose + + Inositol A+ + + I Saccharose i+ I i I Raffinose + D-Mannitol + Témoin l I = utilisé de la paroi + =légèrement cellulaire utilisé = non utilisé On effectue des analyses chromatographiques sur papier sur des hydrolysats acides de chacune des trois nouvelles souches, suivant le protocole opératoire de B Becker et al.

/Applied Microbiology, 13, 236 ( 1965)7 et celui de M P Le-

chevalier et al /T The Actinomycetales" par H Prauser, 311, 1970)/ On trouve de l'acide méso-2,6-diaminopimélique dans les parois cellulaires et on trouve de l'arabinose et

du galactose comme constituants saccharidiques de la cel-

lule entière, ce qui confirme que chacune des souches a

des constituants cellulaires de type IV-A.

Les résultats de ces études taxonomiques démontrent

que toutes les souches appartiennent au genre Nocardia.

Parmi les espèces connues de Nocardia, les caractéristiques des nouvelles souches sont le plus voisines de celles de Nocardia autotrophica /International Journal of Systematic Bacteriology, 30, 337 ( 1980)7 à l'exception seulement des différences indiquées au tableau 5 Dans ce tableau, les symboles et abréviations ont les mêmes significations

qu'aux tableau 1 à 4 correspondants.

TABLEAU 5

l ô,I -J Nocardia TEST FERM P-6181 FERM P-6182 FERM P-6183autotrophica Couleurs AM blanc' de blanc à de blanc a de blanc à de la jaune orange gris-bruna jaune pâle culture pale tre G de gris marron violet de jaune pâle

jaunâtre à jaune marron à gris jaunâ-

ljaune grisatre tre orangé pale, t' Décomposition de l'urée + + + Résistance a i la lysozyme + _

À, ': , I

Production d'acide à partir de: arabinose + + + xylose + + +

raffinose + NG -

Utilisation de: arabinose + + + xylose + + + rhamnose + + + saccharose + + raffinose + + La souche FERM P-6181 et Nocardia autotrophica se ressemblent des points de vue de leurs caractéristiques morphologiques, de culture et physiologiques, et on en conclut que cette souche appartient a l'espèce Nocardia autotrophica.

La souche FERM P-6182 diffère de Nocardia autotrophi-

ca des points de vue de sa décomposition de l'urée, de sa résistance à la lysozyme, de sa production d'acides à

partir d'hydrates de carbone et de son utilisation des hy-

drates de carbone Toutefois, ces différences ne sont pas suffisantes pour que la souche FERM P-6182 soit considérée comme une espèce nouvelle; de ce fait, elle est considérée

comme une nouvelle sous-espèce de Nocardia autotrophica.

En conséquence, cette souche a été nommée Nocardia auto-

trophica subsp canberrica subsp nov La souche FERM P-6183 diffère de Nocardia autotrophica des points de vue de la coloration de sa culture et de son utilisation du rhamnose, du saccharose et du raffinose. De même, ces différences ne sont pas suffisantes pour que cette souche soit considérée comme une espèce nouvelle, et de ce fait, elle est considérée comme une sous-espèce de

Nocardia autotrophica Elle a été appelée Nocardiae auto-

trophica subsp amethystina subsp nov,.

Comme c'est le cas pour toutes les souches microbien-

nes, les nouvelles souches FERM P-6181, FERM P-6182 et FERM P-6183 ont des propriétés instables et sont aisément mutées par des agents de mutation'artificiels comme les rayonnements ultraviolets, les ondes électromagnétiques haute fréquence, les rayonnements nucléaires et les agents de mutation chimiques Tous mutants obtenus à partir de ces souches et possédant les activités souhaitées peuvent

être utilisés dans le procédé suivant la présente inven-

tion.

Parmi les divers microorganismes du genre Nocardia

utilisables dans le procédé suivant l'invention, sont par-

ticulièrement préférables à utiliser les trois nouvelles souches, c'est-àdire Nocardia autotrophica FERM P-6181, Nocardia autotrophica subsp canberrica FERM P-6182 ou

Nocardia autotrophica subsp amethystina FERM P-6183.

L'hydroxylation enzymatique suivant la présence inven-

tion peut être effectuée en mettant le composé de ML-236 B en contact avec le microorganisme choisi du genre Nocardia ou avec un extrait enzymatique de celui-ci, exempt de cellules. Ce procédé suivant l'invention est de préférence mis en oeuvre suivant un choix de trois manières différentes: (a) on ajoute le composé de ML-236 B de départ au milieu de culture au cours de la culture du microorganisme utflisé pour la conversion, puis on poursuit la culture; (b) on recueille une culture du microorganisme utilisé pour la conversion et on met les cellules recueillies en contact avec le composé de ML-236 B de départ; ou (c) on prépare un extrait enzymatique exempt de cellules à partir des cellules du microorganisme utilisé pour la conversion, et on met cet extrait en contact avec le com-

posé de ML-236 B de départ.

La culture de l'organisme du genre Nocardia utilisé pour la conversion peut être effectuée par des moyens classiques, dans un milieu de culture classique contenant

des agents nutritifs bien connus à utiliser avec ces micro-

organismes C'est ainsi que, comme on le sait bien, ces

milieux de culture contiennent des sources de carbone assi-

milable et d'azote assimilable et, souvent, de sels miné-

raux Comme exemples de sources de carbone assimilable on citera le glucose, le saccharose, l'amidon, la glycérine, la gelée de millet, la mélasse et l'huile de soja Comme exemples de sources d'azote assimilable on citera les matières solides du soja (y compris la farine grossière et la farine de soja), le germe de blé, les extraits de viande, la peptone, la liqueur de macération de mais, la levure séchée ainsi que des sels d'ammonium comme le

sulfate d'ammonium Si nécessaire, on peut également in-

clure des sels minéraux comme le chlorure de sodium, le chlorure de potassium, le carbonate de calcium ou des phosphates On peut également utiliser, en les associations appropriées, d'autres additifs capables de favoriser là

production d'enzymes d'hydroxylation La technique de cul-

ture particulièrement utilisée n'est pas critique pour le

procédé suivant l'invention et on peut faire appel à tou-

tes techniques classiquement utiliser pour la culture de

microorganismes dans le procédé suivant la présente in-

vention D'une façon générale, il va de soi que les tech-

niques sont choisies en fonction de leur efficacité indus-

trielle C'est ainsi qu'une culture liquide est générale-

ment préférable et qu'une culture profonde convient le

mieux du point de vue industriel.

La culture est normalement effectuée en milieu aérobie et à une température de 20 à 370 C, de préférence de 26 à

280 C.

On opère suivant (a) en ajoutant le composé de ML-236

B de départ au milieu de culture, au cours de la culture.

Le point précis, au cours de la culture, o le composé de départ est ajouté varie suivant l'installation utilisée pour la culture, la composition du milieu, la température du milieu de culture et autres facteurs, mais il se situe de préférence au moment o le pouvoir d'hydroxylation du microorganisme commence à croître et habituellement 2 ou 3 jours après le début de la culture du microorganisme La

quantité de composé de ML-236 B ajoutée représente de préfé-

rence de 0,01 à 5,0 % du poids du milieu et, mieux, de 0,05

à 0,5 %, par exemple de 0,05 à 0,1 % en poids Après l'ad-

dition du composé de ML-236 B, on poursuit la culture en milieu aérobie, normalement à une température comprise dans les limites précitées La culture est normalement poursuivie pendant un laps de temps de 3 à 5 jours après l'addition du composé de ML-236 B. Lorsqu'on opère suivant (b) , on effectue tout d'abord la culture du microorganisme dans des conditions permettant d'obtenir son pouvoir d'hydroxylation maximum; ce pouvoir atteint habituellement un maximum entre 4 et 5 jours après

le début de la culture, bien que ce laps de temps soit va-

riable, suivant la nature et la température du milieu,

l'espèce du microorganisme et autres facteurs On peut sur-

veiller le pouvoir d'hydroxylation de la culture en préle-

vant des échantillons de la culture à des intervalles de

temps appropriés, en déterminant le pouvoir d'hydroxyla-

tion des échantillons en les mettant en contact avec un composé de ML-236 B dans des conditions normalisées et en déterminant la quantité de composé de M-4 et M-4 ' obtenue et en portant ce pouvoir en fonction du temps, sur un graphique Lorsque le pouvoir d'hydroxylation a atteint son point maximum, on arrête la culture et on recueille les cellules microbiennes Pour ce faire, on peut soumettre la culture à une séparation centrifuge, à une filtration ou autre mode de séparation similaire connu Les cellules entières du microorganisme à utiliser pour la culture qui sont ainsi recueillies, sont de préférence ensuite lavées à l'aide d'un liquide de lavage approprié, comme du sérum physiologique ou une 'solution tampon appropriée.

La mise en contact des cellules recueillies du micro-

organisme du genre Nocardia avec le composé de ML-236 B

est généralement effectuée dans un milieu aqueux, par exem-

ple dans une solution tampon de phosphate ayant un p H de 5 à 9 La température de réaction est de préférence de 20

à 450 C et, mieux, de 25 à 30 'C La concentration du compo-

sé de ML-236 B dans le milieu réactionnel est de préférence

de 0,01 à 5,0 % en poids Le temps de réaction est de pré-

férence de 1 à 5 jours, bien qu'il puisse varier quelque peu suivant la concentration du composé de ML-236 B dans le

mélange réactionnel, la température 'de réaction, le pou-

voir d'hydroxylation du microorganisme (qui, bien entendu,

peut varier d'une espèce à l'autre et, comme indiqué ci-

dessus, dépend du temps de culture) et autres facteurs.

* L'extrait enzymatique exempt de cellules utilisé dans le mode opératoire (c) peut être obtenu en désintégrant par des moyens physiques ou chimiques les cellules entières du microorganisme obtenu comme décrit-en (b), par exemple par broyage ou traitement aux ultra-sons, afin d'obtenir une masse cellulaire désintégrée, ou par traitement à l'aide d'un agent tensio-actif ou d'une enzyme pour obtenir une solution cellulaire L'extrait exempt de cellules résultant est ensuite mis en contact avec le composé de ML-236 B de départ, dans les mêmes conditions que celles décrites à

propos de (b) ci-dessus.

Une fois terminée la réaction de conversion effectuée suivant n'importe laquelle des modes opératoires ci-dessus, on peut directement isoler, séparer ou purifier le composé cherché, par des moyens classiques Par exemple, on peut effectuer une séparation et une purification en filtrant le mélange réactionnel, en extrayant le filtrat résultant

à l'aide d'un solvant organique non miscible à l'eau (com-

me le sulfate d'éthyle), en distillant le solvant de l'ex-

trait, en soumettant le composé brut résultant à une chro-

matographie sur colonne (par exemple sur gel de silice ou

alumine) et en éluant la colonne à l'aide d'un éluant ap-.

proprié.

Lorsque le composé de M-4 ou M-4 ' converti par le mi-

croorganisme n'est pas la forme souhaitée de ce composé, on peut soumettre le produit de la réaction de conversion à une ou plusieurs autres réactions, notamment d'hydrolyse, de salification, d'estérification ou de lactonisation, par des procédés classiques, comme décrit plus en détail

ci-après Ces réactions supplémentaires peuvent être ef-

fectuées avant ou pendant les étapes de séparation et de purification décrites ci-dessus, de preférence au cours

de ces étapes.

L'enzyme d'hydroxylation active dans le procédé sui-

vant l'invention n'a pas d'effet par elle-même sur le groupe carboxy du composé de ML-236 B et il s'ensuit que, toutes choses étant égales d'ailleurs, la lactone ML-236 B donnerait -la lactone M-4 et/ou M-4 ', l'acide ML-236 B carboxylique donnerait l'acide 14-4 et/ou M-4 ' carboxylique

et un sel ou ester de l'acide ML-236 B carboxylique donne-

rait le même sel ou ester de l'acide M-4 et/ou M-4 ' carbo-

xylique Toutefois,-cela peut être affecté par d'autres facteurs, notamment par le p H du mélange réactionnel, d'une manière qui est prévisible par les lois ordinaires de la chimie. Le composé de départ de type ML-236 B peut être l'acide ML-236 B carboxylique libre de formule (II), sa lactone correspondante de formule (I Ia) ou un de ses sels (par exemple de métal, d'aminoacide ou d'amine) ou esters (en

particulier un ester alcoylique).

Les sels métalliques préférables sont les sels avec des métaux alcalins comme le sodium ou le potassium, des sels avec des métaux alcalinoterreux comme le calcium, ou des sels avec d'autres métaux comme le magnésium, luminium, le fer, le zinc, le cuivre, le nickel ou le colbalt, parmi lesquels

de métaux alcalins, de métaux alcalino-terreux, de magné-

sium et d'aluminium sont préférables, les sels de sodium,

de calcium et d'aluminium étant très préférables.

Les aminoacides préférables, pour obtenir des sels d'aminoacides sont desaminoacides basiques comme l'argi- nine, la lysine, l'histidine, l'acide d, >-diaminobutyrique

ou l'ornithine.

Les amines préférables, pour obtenir des sels d'ami-

nes, sont, entre autres, la t-octylamine, la dibenzylamine,

la dichlorohexylamine, la morpholine, des esters alcoyli-

ques de D-phénylglycine et de D-glucosàmine.

Les esters de ML-236 B sont de préférence les esters

alcoyliques comme les esters méthylique, éthylique, propy-

lique, isopropylique, butylique, isobutylique ou pentylique parmi lesquels l'ester méthylique est préférable Toutefois

on peut éventuellement utiliser d'autres esters.

Parmi les substances de départ de type ML-236 B, les sels de métaux alcalins, par exemple les sels de sodium ou de potassium, sont particulièrement préférables, le sel

de sodium étant très préférable, car la Demanderesse a dé-

couvert qu'il fournit la meilleure conversion du composé de ML-236 B en le composé de M-4 ou M-4 ' souhaité

Lorsque le produit obtenu par l'hydroxylation enzyma-

tique suivant la présente invention est un sel de l'acide

carboxylique de formule (I), on peut obtenir-l'acide car-

boxylique libre lui-même en ajustant le p H du filtrat à une valeur de 4 ou moins, de préférence à une valeur de 3 à 4 On peut utiliser tout acide organique ou minéral, tant

qu'il n'a pas d'effet nuisible sur le composé cherché.

Comme exemples des nombreux acides qui conviennent, on ci-

tera l'acide trifluoroacétique, l'acide acétique, l'acide chlorhydrique et l'acide sulfurique Cet acide carboxylique peut lui-même être le produit souhaité ou peut être, et est de préférence, soumis à des réactions ultérieures, comme décrit ci-dessous, éventuellement après des traitements

comme des traitements d'extraction, de lavage et de déshy-

dratation.

On peut obtenir des sels-métalliques des acides car-

boxyliques de formule (I) en mettant un hydroxyde, carbo-

nate ou composé réactif similaire du métal choisi, dans un solvant aqueux, en contact avec l'acide carboxylique de formule (I) Le solvant aqueux utilisé est de préférence de l'eau, ou peut être un mélange d'eau et d'un solvant organique, de préférence un alcool (comme le méthanol ou l'éthanol), une cétone (comme l'acétone), un hydrocarbure aliphatique (comme l'hexane) ou un ester (comme l'acétate

d'éthyle) La Demanderesse préfère particulièrement utili-

ser un mélange de solvant organique hydrophile et d'eau.

Ces réactions sont normalement effectuées à température ambiante, mais peuvent éventuellement être effectuées en chauffant.

On peut-obtenir des sels d'amines des acides carboxy-

liques de formule (I) en mettant une amine, dans un solvant aqueux, en contact avec l'acide carboxylique de formule (I) Comme exemples de solvants appropriés, on citera

l'eau et des mélanges d'eau et d'alcools (comme le métha-

nol ou l'éthanol), d'éthers (comme le tétrahydrofuranne), de nitriles (comme l'acétonitrile) ou de cétones (comme

l'acétone); la Demanderesse préfère particulièrement utili-

ser de l'acétone aqueuse-comme solvant pour cette réaction.

La réaction est de préférence effectuée à un-p H de 7 à 8,5 et de préférence à une température inférieure ou égale à la température ambiante, et mieux à une température de 5 à C La réaction est immédiatement menée à bonne fin On peut également dissoudre un sel métallique de l'acide car -boxylique de formule (I) (qui peut avoir été obtenu comme décrit ci-dessus) dans un solvant aqueux, puis ajouter un

sel d'acide minéral (par exemple le chlorhydrate) de l'ami-

ne souhaitée, en utilisant les mêmes conditions réaction-

nelles que lorsqu'on fait réagir l'amine elle-même sur l'acide carboxylique de formule ( 1), et le produit cherché

est ensuite obtenu par une réaction d'échange de sels.

On peut obtenir des sels d'aminoacides des acides car-

boxyliques de formule (I) en mettant un aminoacide en solu-

tion aqueuse en contact avec l'acide carboxylique de for-

mule (I) Comme exemples de solvants aqueux appropriés, on citera l'eau et des mélanges d'eau et d'alcools (comme le

méthanol ou l'éthanol) ou d'éthers (comme le tétrahydrofu-

ranne) Il est préférable d'effectuer la réaction en chauf-

fant, par exemple à une température de 50 à 60 'C -

On peut obtenir des esters, de préférence des esters alcoyliques, des acides carboxyliques de formule (I) en mettant l'acide carboxylique de formule (I) en contact avec un alcool approprié Il est préférable d'effectuer cette réaction en présence d'un catalyseur acide, par exemple d'un acide minéral (comme l'acide chlorhydrique ou

l'acide sulfurique), d"un acide de Lewis (comme le triflu-

orure de bore) ou d'une résine échangeuse d'ions Le sol-

vant utilisé pour cette réaction n'est pas critique, tant qu'il n'affecte pas la réaction; comme exemples de solvants appropriés on citera le benzène, le chloroforme et les éthers On peut également obtenir le produit cherché en mettant l'acide carboxylique de formule (I) en contact avec un diazoalcane dans lequel le fragment alcane peut

êt're substitué ou insubstitué Cette réaction est habitu-

ellement effectuée en mettant l'acide en contact avec une solution éthérée du diazoalcane On peut encore obtenir

l'ester en mettant un sel métallique de l'acide carboxyli-

que de formule ( 1) en contact avec un halogénure, de pré-

férence un halogénure d'alcoyle, dans un solvant approprié;

les solvants préférables sont notamment le diméthylforma-

mide, le tétrahydrofuranne, le diméthylsulfoxyde et l'acé-

tone Toutes les réactions de préparation d'esters sont de préférence effectuées environ à la température ambiante, bien que, si nécessaire du fait de la nature du système réactionnel, les réactions puissent être effectuées en chauffant. On peut obtenir les lactones des acides carboxyliques de formule (I) en mettant l'acide carboxylique de formule (I) en contact avec une quantité catalytique d'un acide, qui peut être organique ou minéral La Demanderesse préfère utiliser des acides organiques et minéraux comme l'acide

trifluoracétique, l'acide chlorhydrique et l'acide sulfu-

rique Il est preferable d'effectuer cette réaction à en-

viron la température ambiante.

Comme exemples des sels et esters des composés de M-4

et M-4 ' obtenus par le procédé suivant l'invention on ci-

tera ceux indiqués plus hauts comme sels et esters du

ML-236 B utilisé comme substance de départ.

Les dérivés de M-4 et M-4 ' ainsi obtenus peuvent être isolés, séparés ou purifiés par des moyens classiques, par exemple par adsorption sur un véhicule (comme du carbone activé ou du gel de silice), ou par chromatographie

d'échange d'ions, ou par filtration sur gel en utilisant-

une colonne de Sephadex-(marque commerciale), ou par ex-

traction à l'aide d'un solvant organique comme un éther,

l'acétate d'éthyle ou le chloroforme; on peut éventuelle-

ment, et c'est normalement préférable, faire appel à une association de ces techniques Les isomères M-4 et M-4 ' peuvent être séparés l'un de l'autre soit après la fin de la réaction de conversion, soit à tout point approprié au cours des réactions ou au

cours des processus précités de séparation ou de purifi-

cation. Les exemples non limitatifs suivants sont donnés à

titre d'illustration de l'invention.

EXEMPLE 1

Des cellules de Nocardia autotrophica subsp amethys-

tina FERM P-6183 sont inoculées à partir d'une culture in-

clinée, à l'aide d'une boucle en platine, dans une série de 20 Erlenmeyers de 500 ml contenant chacun 100 ml d'un

milieu de culture ayant la composition suivante (les pour-

centages sont exprimés en poids/volume): Glucose 1,0 % Peptone 0,2 % Extrait de viande 0,1 % Extrait de levure 0,1 % Liqueur de macération de mais 0,3 % Eau de la ville le reste (p H non ajusté) On effectue une culture secouée à 26 C et 220 tours/ minute pendant 2 jours au bout desquels on ajoute du

ML-236 B carboxylate de sodium jusqu'à obtention d'une con-

centration finale de 0,05 % pds/vol On continue à incuber à 26 C et 220 tours/minute pendant encore 5 jours. Une fois la culture terminée, on filtre le mélange réactionnel et on amène le p H du filtrat à 3 par addition d'acide trifluoracétique On extrait le filtrat acidifié, trois fois, en utilisant chaque fois 1 litre d'acétate d'éthyle, obtenant ainsi des extraits contenant un mélange d'acide M-4 carboxylique et d'acide M-4 'carboxylique On prélève des échantillons de ces extraits qu'on soumet à une chromatographie en couche mince (CCM) sur plaque de gel de silice Art 5715 (fournie-par Merck & Co Inc) en développant à l'aide d'un mélange 50:50:3 en volume de benzene, d'acétone et d'acide acétique Le Rf de l'acide

M-4 carboxylique est de 0,45 et le Rf de l'acide M-4 ' car-

boxylique est de 0,46.

On lave la totalité du reste de l'extrait à l'aide d'une solution saturée de chlorure de sodium, après quoi on ajoute une quantité équimolaire d'une solution éthérée

de diazométhane, à température ambiante On laisse le mé-

lange reposer pendant 30 minutes, puis on évapore à sec

sous pression réduite.

On introduit le résidu dans une colonne Lobar (Si 60,

fournie par Merck & Co Inc, dimension A) et on élue en-

suite à l'aide d'un mélange 1/1 en volume de benzène et

d'acétate d'éthyle On obtient des fractions séparées con-

tenant du M-4 carboxylate de méthyle et du M-4 ' carboxylate de méthyle On concentre ces fractions par évaporation sous pression réduite, obtenant ainsi 320 mg de M-4 carboxylate de méthyle et 11 mg de M-4 ' carboxylate de méthyle, tous

deux sous la forme d'huiles incolores.

Dans le mode opératoire décrit ci-dessus, 'en rempla-

çant le diazométhane par d'autres diazoalcanes appropriés, on peut obtenir d'autres esters d'acide M-4 carboxylique

et d'acide M-4 ' carboxylique.

Propriétés physiques du M-4 carboxylate de méthyle

Spectre de R M N (dans du deutérochloroforme, en utili-

sant le tétraméthylsilane comme étalon interne, à 200 M Hz) ppm: -0,88 ( 3 H, triplet, J = 7,3 Hz); 0,89 ( 3 H, doublet, J = 6,5 Hz); 1,12 ( 3 H, doublet, J = 6,8 Hz); 1,1-1,7 ( 10 H, multiplet); 2,34 ( 1 H, sextuplet, J = 7 Hz); 2,3-2,5 ( 2 H, multiplet); 2,49 ( 2 H, doublet, J = 6,4 Hz); 2, 58 ( 1 H, multiplet); 3,72 ( 3 H, singulet); 3,78 ( 1 H, multiplet); 4,25 ( 1 H, quintuplet, J = 7 Hz); 4,40 ( 1 H, multiplet); ,42 ( 1 H, multiplet); ,56 ( 1 H, multiplet); ,90 ( 1 H, doublet de doublets, J = 9, 8 et 5,6 Hz);

5,99 ( 1 H, doublet, J = 9,8 Hz).

Spectre de Masse

Après silylation à l'aide de N,O-bis(triméthylsilyl)-

trifluoroacétamide, on effectue la mesure en utilisant un instrument de type D-300 fabriqué par Nihon Electronic Co.

M/e: 654 (M), 552, 462, 372, 290, 272, 233, 231.

Spectre d'absorption U V (éthanol) \max nm:

230,1, 237,3, 246,4.

-1 Spectre d'absorption I R (film mince) max cm

3400, 2950, 1730.

Chromatographie en couche mince (C C M) Sur plaque de gel de silice Art 5717, fabriquée par Merck & Co Inc, en utilisant un mélange 1/1 en volume de benzène et d'acétone comme solvant de développement:

Rf = 0,88.

Propriétés physiques du M-4 ' carboxylate de méthyle

Spectre de R M N (dans du deutérochloroforme, en utili-

sant le tétraméthylsilane comme étalon interne, à 60 M Hz) ppm: 3,70 ( 3 H, singulet) ,50 ( 1 H, large singulet) ,75 ( 1 H, large singulet) 5,90 ( 1 H, quadruplet)

6,01 ( 1 H, doublet).

Spectre d'absorption U V (méthanol) Xmax nm:

230, 238, 246.

-1 Spectre d'absorption I R (film mince)-max cm: Max

3400, 1730.

Spectre de masse

Après silylation à l'aide de N,O-bis(triméthylsilyl)-

M/e: 654 (M+).

Analyse élémentaire Calculé pour C 24 H 3807: C, 65,73 %; H, 8,73 % Trouvé 65,66 8,79

EXEMPLE 2

On opère comme décrit à l'exemple 1, obtenant ainsi 2 litres d'un mélange réactionnel de conversion On amène

le p H de ce mélange à 3,0 par addition d'acide trifluoracé-

tique, puis on extrait le mélange trois fois, chaque fois à l'aide d'un litre d'acétate d'éthyle, obtenant ainsi une fraction contenant à la fois de l'acide M-4 carboxylique

et de l'acide M-4 ' carboxylique.

On lave cet extrait à l'aide d'une solution saturée de chlorure de sodium, puis on sèche sur sulfate de sodium

anhydre On ajoute une quantité catalytique d'acide tri-

fluoracétique afon de réaliser la lactonisation On lave

le mélange résultant à l'aide d'une solution aqueuse d'hy-

drogénocarbonate de sodium a 5 % pds/vol, puis on sèche

sur sulfate de sodium anhydre et on évapore à sec, obte-

nant ainsi une fraction de lactone.

On introduit cette fraction de lactone dans une co-

lonne Lobar (Si 60, Merck & Co Inc; dimension A) et on élue à l'aide d'un mélange 7/3 en volume de benzène et d'acétone, obtenant ainsi des fractions séparées contenant de la lactone M-4 et de la lactone M-4 ' On recristallise séparément ces fractions dans l'acétate d'éthyle, obtenant

ainsi 270 mg de lactone M-4 et 8 mg de lactone M-4 '.

Propriétés physiques de la lactone M-4

Spectre de R M N (dans du deutérochloroforme; en utili-

sant du tétraméthylsilane comme étalon interne, à 100 M Hz) ppm: 4,38 ( 1 H, multiplet) 4,41 ( 1 H, multiplet) 4,62 ( 1 H, multiplet) ,41 ( 1 H, multiplet) ,58 ( 1 H, multiplet) ,90 ( 1 H, quadruplet)

6,01 ( 1 H, doublet).

Spectre d'absorption U V (méthanol) X max nm:

230, 236,7, 244,6.

Spectre d'absorption I R (film mince) max cm 1:

3400, 2950, 1725.

C C M.

Sur plaque de gel de silice Art 5715 (Merck & Co Indc et en utilisant un mélange 50/50/3 en volume de benzène,

d'acétone et d'acide acétique comme solvant de développe-

ment: Rf = 0,62.

Propriétés physiques de la lactone M-4 ' Spectre de R M N (deutérochloroforme; tétraméthylsilane comme étalon interne, à 100 M Hz); i ppm: 4,25 ( 1 H, multiplet) 4,60 ( 1 H, multiplet) 5,50 ( 1 H, multiplet) ,75 ( 1 H, multiplet) ,90 ( 1 H, multiplet)

6,01 ( 1 H, doublet).

Spectre d'absorption U V (méthanol) X nm: max

230, 237, 245.

Spectre d'absorption I R (K Br) max cm-:

3500, 1720.

Spectre de masse:

M/e: 406 (M), 304, 286.

Pouvoir rotatoire:

22 D = + 310,9 (c = 0,66, méthanol).

Point de fusion: 141-143 C Analyse élémentaire: Calculé pour C 23 H 3406: C, 67,95 %; H, 8,43 % Trouvé 68,05 % 8,37 %

C.C M.

Sur plaque de gel de silice Art 5715 (Merck & Co Inc)

en utilisant un mélange 1/1 en volume de benzène et d'acé-

tone comme solvant de développement:

Rf = 0,64.

EXEMPLE 3

On opère comme décrit à l'exemple 1, jusqu'à et y compris l'extraction à l'aide de 3 portions aliquotes d'acétate d'éthyle, obtenant ainsi un extrait contenant à la fois de l'acide M-4 carboxylique et de l'acide M-4 ' carboxylique. On transfère immédiatement après cet extrait dans une solution d'hydrogénocarbonate de sodium à 5 % pds/vol et on amène le p H du mélange à 7,0 par addition d'acide chlorhydrique 2 N On fait adsorber le mélange sur une colonne Diaion HP-20 (Mitsubishi Chemical Industries) On

lave la colonne à l'eau, puis on élue à l'aide d'une solu-

tion aqueuse d'acétone à 50 % vol/vol, obtenant ainsi une

fraction contenant du M-4 carboxylate de sodium On lyo-

philise cette fraction, ce qui fournit 200 mg de M-4 car-

boxylate de sodium.

Propriétés physiques du M-4 carboxylate de sodium Spectre de R M N (deutérométhanol; tétraméthylsilane comme étalon interne, à 200 M Hz) F ppm: 0,91 ( 3 H, triplet, J = 7,5 Hz) 0,92 ( 3 H, doublet, J = 7 Hz) 1,12 ( 3 H, doublet, J = 7 Hz) 1,1-1,8 ( 1 OH, multiplet) 2,25 ( 1 H, doublet de doublets, J = 15 et 7,6 Hz) 2,34 ( 1 H, doublet de doublets, J= 15 et 5,5 Hz) 2,2-2,4 ( 3 H, multiplet) 2,48 ( 1 H, multiplet) 3,68 ( 1 H, multiplet) 4,07 ( 1 H, multiplet) 4,28 ( 1 H, multiplet) ,36 ( 1 H, multiplet) ,48 ( 1 H, doublet de doublets, J = 3 et 2 Hz) ,88 ( 1 H, doublet de doublets, J = 9,6 et 5,3 Hz)

5,98 ( 1 H, doublet, J = 9,8 Hz).

Spectre d'absorption U V (méthanol) A max nm:

230,0, 237,2, 245,0.

-1 Spectre d'absorption I R (K Br) -max cm

3400, 2900, 1725, 1580.

C C M:

sur plaque de gel de silice Art 5715 (Merck & Co Inc) en utilisant un mélange 50/50/3 en volume de benzène,

d'acétone et d'acétate d'éthyle comme solvant de dévelop-

pement: RF = 0,45.

EXEMPLE 4

On opère comme décrit aux exemples 1 à 3, mais en utilisant la souche Nocardia autotrophica FERM P-6181 à la place de Nocardia autotrophica subsp amethystina FERM P-6183: on obtient: 150 mg de M-4 carboxylate de méthyle; 37 mg de M-4 ' carboxylate de méthyle; 140 mg de lactone M-4; 30 mg de lactone M-4 '; et 110 mg de M-4 carboxylate

de sodium Dans chaque cas, les produits ont des proprié-

tés identiques à celles des composés respectifs obtenus

aux exemples 1 à 3.

EXEMPLE 5

On inocule de pleines boucles d'une culture de Nocardia autotrophica subsp canberrica FERM P-6182 dans une série de 20 Erlenmeyers de 500 ml contenant chacun ml d'un milieu ayant la composition suivante (les pourcentages sont exprimés en pds/vol): Glycérine 0,5 % Saccharose 2,0 % Farine de soja 1,0 % Levure pressée 1,0 % Liqueur de macération de mais 0, 5 % Chlorure de cobalt 0,001 % Eau de la ville le restant

(p H 7,0).

On poursuit une culture secouée à 26 C à 220 tours/ minute pendant 2 jours au bout desquels on ajoute du ML-236 B carboxylate de sodium jusqu'à une concentration finale de 0,05 % pds/vol On continue ensuite la culture à 26 C et 220 tours/minute pendant encore cinq jours On filtre le mélange réactionnel de conversion et on amène le p H du filtrat à 3,0 par addition d'acide chlorhydrique On extrait le mélange trois fois, chaque fois à l'aide d'un

litre d'acétate d'éthyle, obtenant ainsi un extrait conte-

nant à la fois de l'acide M-4 carboxylique et de l'acide M-4 ' carboxylique, que la C C M démontre être identiques

aux produits respectifs de l'exemple 1.

On traite ensuite cet extrait comme décrit à l'exem-

ple 1, obtenant ainsi 180 mg de M-4 carboxylate de méthyle

et 110 mg de M-4 ' carboxylate de méthyle.

EXEMPLE 6

On opère comme décrit à l'exemple 5, jusqu'à et y compris la préparation de l'extrait contenant de l'acide M-4 carboxylique et de l'acide M-4 ' carboxylique Puis on traite cet extrait comme décrit à l'exemple 2, obtenant

ainsi 170 mg de lactone M-4 et 90 vmg de lactone M-4 '.

EXEMPLE 7

On inocule de pleines boucles d'une culture de Nocar-

dia autotrophica subsp amethystina FERM P-6183 dans une série de 10 Erlenmeyers de 500 ml contenant chacun 100 ml

d'un milieu ayant la composition suivante (les pourcenta-

ges sont exprimés en pds/vol): Glucose 1,0 % Peptone 0,2 % Extrait de viande 0,1 % Extrait de levure 0,1 % Eau de la ville le restant (p H non ajusté) On effectue une culture secouée à 26 C et 220 tours/ minute pendant 5 jours, après quoi on recueille des cel- lules microbiennes entières par séparation centrifuge On

lave les cellules recueillies à l'aide d'une solution tam-

pon de phosphate 0,1 M (p H 7,0), puis on les recueille à

nouveau et les met en suspension dans 900 ml d'uneosolu-

tion tampon de phosphate 0,1 M A cette suspension on ajou-

te du ML-236 B carboxylate de sodium jusqu'à obtention d'une concentration de 0,5 g/100 ml, et on fait incuber le mélange à 26 C et 220 tours/minute pendant 5 jours Au bout de ce temps, on filtre le mélange de conversion et on amène son p H à 3,0 par addition d'acide chlorhydrique On extrait le mélange trois fois, chaque fois à l'aide d'un

litre d'acétate d'éthyle, obtenant ainsi un extrait conte-

nant de l'acide M-4 carboxylique et de l'acide M-4 ' car-

boxylique identifiés par C C M et démontrés comme étant

identiques aux produits respectifs de l'example 1.

EXEMPLE 8

On opère comme décrit à l'exemple 2, mais en utili-

sant les microorganismes indiqués au tableau 6 La quanti-

té de lactone M-4 obtenue est indiquée au tableau.

TABLEAU 6

EXEMPLE 9

* On inocule des cellules de Nocardia autotrophica subsp amethystina subsp P-6183 d'une culture inclinée, à l'aide d'une boucle de platine, dans une série de 20 Erlenmeyers de 500 ml contenant chacun 100 ml d'un milieu Quantité (mg) de Microorganismes M-4 lactone I I Nocardia farcinica ATCC 3318 7 Nocardia coeliaca ATCC 17040 5 Nocardia autotrophica IFO 12743 10 Nocardia asteroides IFO 3424 15

de culture ayant la composition indiquée à l'exemple 7.

On procède à une culture secouée à 26 C et 220 tours/minu-

te pendant 2 jours au bout desquels on ajoute du ML-236 B

carboxylate de sodium jusqu'à obtention d'une concentra-

tion finale de 0,4 % pds/vol On poursuit l'incubation

à 26 C et 220 tours/minute pendant encore 5 jours.

On opère ensuite comme décrit à l'exemple 2, obtenant

ainsi 2,9 g de lactone M-4.

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Claims

REVENDICATIONS 1 Procédé de préparation d'un composé répondant à la formule (I): HCCC je, n H.O H 3 CC 9 HI () dans laquelle OH représente s OH ou,,,,",,,OH, ses sels et esters pharmaceutiquement acceptables et les lac- tones à cycle fermé correspondantes, caractérisé en ce qu'on met un composé de ML-236 B choisi parmi l'acide ML-236 B carboxylique, ses sels et esters et la lactone ML-236 B correspondante en contact avec une enzyme d'hydro- xylation produite par un microorganisme du genre Nocardia; si nécessaire, on soumet le produit résultant à une ou plusieurs réactions choisies parmi les réactions d'hydro- lyse, de salification, d'estérification et de lactonisa- tion; et on isole le produit du mélange réactionnel. 2 Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'on met le composé de ML-236 B en contact avec l'enzy- me en cultivant un microorganisme du genre Nocardia dans. un milieu contenant ledit composé de ML-236 B. 3 Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'on met le composé de ML-236 B en contact avec l'enzy- me en mettant des cellules entières d'un microorganisme du genre Nocardia en contact avec ledit composé de ML-236 B. 4 Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le composé de ML-236 B est mis en contact avec l'enzy- me en mettant le composé en contact avec un extrait enzyma- tique exempt de cellules d'un microorganisme du genre Nocardia. 5.Procdé suivant l'une queloonque des revendications 1 à 4,caractérisé en ce que le microorganisme est une espèce choisie parmi Nocardia autotrophica, Nocardia asteroides, Nocardia farcinica et Nocardia coeliaca. 6 Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 4,caractérisé en ce que le microorganisme est choisi parmi: Nocardia autotrophica FERM P-6181, Nocardia autotrophica subsp. canberrica FERI P-6182, Nocardia autotrophica subsp ame- thystina FERM P-6183, Nocardia autotrophica IFO 12743, Nocardia asteroides IFO 3424, Nocardia farcinica ATCC 3318 et Nocardia coeliaca ATCC 17040. 7 i Prcc-dé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 4,caractérisé en ce que le microorganisme est choisi parmi: Nocardia autotrophica FERM P-6181, Nocardia autotrophica subsp. canberrica FERM P-6182, Nocardia autotrophica subsp ame- thystina FERM P-6183, Nocardia autotrophica IFO 12743, et Nocardia asteroides IFO 3424. 8.Procédé suivant l'ure quelconque des revendications 1 à 4,caractérisé en ce que le microorganisme est choisi parmi: Nocardia autotrophica FERM P-6181, Nocardia autotrophica subsp. canberrica FEI 4 P-6182, et Nocardia autotrophica subsp. amethystina FERM P-6183. 9 Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'on obtient un composé de M 1-4 dans lequel J\AJ OH repré- sente _ OH. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'on obtient un composé de M-4 ' dans lequel \f J\ OH représente ',',,,,' OH. 11 Procédé suivant l'une quelconque des revendications

1 à 10, caractérisé en ce qu'on obtient le sel de sodium

dudit composé de formule (I).