FI95654B - Menetelmä veren hyytymistekijän VIII ja von Willebrand-tekijän kompleksin konsentraatin valmistamiseksi kokoplasmasta - Google Patents

Description

1 95654

Menetelmä veren hyytymistekijän VIII ja von Willebrand -tekijän kompleksin konsentraatin valmistamiseksi koko-plasmasta 5 Keksintö koskee menetelmää veren hyytymistekijän VIII ja von Willebrand -tekijän kompleksin ominaisaktiivi-suudeltaan korkean konsentraatin valmistamiseksi kokoveri-plasmasta.

Hemofilia A:n hoito injektoimalla tekijää VIII on 10 yleinen käytäntö ja vaatii hyvin puhtaiden valmisteiden käyttöä toisaalta viruskontaminaatioriskien vähentämiseksi ja toisaalta siitä syystä, että injektointeja täytyy toistaa usein ja mahdolliset jäännösepäpuhtaudet voisivat indusoida potilaalle vaarallisia immuunireaktioita.

15 Teollisuudessa on jo käytössä muutamia menetelmiä ihmisplasman käsittelemiseksi tekijä Villin puhditamisek-si. Tällaisiin menetelmiin kuuluvat proteiiniepäpuhtauk-sien seostaminen käyttämällä erilaisia kemiallisia aineita, geelipermeaatiokromatografia, immuuniaffiniteettikro-20 matografia, ioninvaihtokromatografia ja näiden eri menetelmien erilaiset yhdistelmät.

Koska plasmassa on läsnä vain pieni määrä tekijää VIII, on puhdistusprosessin saanto tärkein ratkaistava ongelma. Lisäksi tekijä VIII on epästabiili proteiini ja 25 proteiini, jonka veren muut tekijät voivat aktivoida; aktivoidussa tilassa se kuitenkin menettää terapeuttisen arvonsa, ja puhdistusmenetelmät ja lopullinen annostus tulee siten sopeuttaa tämän ongelman mukaan.

Tämän hakemuksen tekijä on jo kehittänyt puhdis-30 tusmenetelmän, jossa käytetään ioninvaihtokromatografiaa, jota kuvataan FR-patenttihakemuksessa 8 807 530 ja joka mahdollistaa tekijä Villin puhtausasteeltaan korkean konsentraatin valmistuksen.

Tässä menetelmässä, samoin kuin muidenkin valmista-35 jien käyttämissä menetelmissä, käytettävä lähtömateriaali • 2 95654 on plasman kylmäsaostettu fraktio. Tämä kylmäsaostusvaihe johtaa siihen, että tekijästä VIII häviää 30 - 40 %, joka osa jää supernatanttiin.

Siksi olisi edullista kehittää valmistusmenetelmä, 5 jossa lähdetään kokoplasmasta, jota ei ole kylmäsaostettu, jotta rajoitettaisiin tekijä VIII -häviöitä. Lisäksi tällainen menetelmä merkitsisi hyvin edullista yksinkertaistusta riittämättömästi varustetuille tuotantokeskuksille, joissa voi olla vaikea tehdä kylmäsaostusta.

10 Tästä syystä tämän hakemuksen tekijä on kehittänyt yksinkertaisen menetelmän puhtaan tekijä VIII:n erottamiseksi kokoplasmasta, joka antaa mahdollisuuden valmistaa hyvin puhdasta stabiilia konsentraattia ja joka antaa e-rittäin hyvän saannon.

15 Siten keksintö koskee menetelmää tekijän VIII kon sentraatin valmistamiseksi kokoplasmasta. Tämä menetelmä sisältää esipuhdistuksen protrombiinikompleksin rakenneosien (tekijät II, VII, IX ja X) poistamiseksi ja puhdistuksen anioninvaihtokromatografiällä, joka geelin ja elu-20 ointipuskurin valinnan kautta antaa mahdollisuuden valmistaa hyvin puhdasta tekijän VIII ja von Willebrand -tekijän kompleksia.

Tätä menetelmää voidaan, lisäpuhdistusvaiheen jälkeen, käyttää myös muiden plasmaproteiinien, kuten fibri-25 nogeenin, fibronektiinin, albumiinin, immunoglobuliinien ja antitrombiini III:n puhdistettujen liuosten valmistamiseen.

Menetelmä kehitettiin käyttämällä ihmisplasmaa, mutta se on yhtä hyvin sovellettavissa eläinperäiseen 30 plasmaan.

Tämän keksinnön mukainen menetelmä antaa siten mahdollisuuden käyttää lähtöaineena kokoplasmaa, ts. plasmaa, joka on joko tuoretta tai pakastettua sen säilyttämiseksi mutta kylmäsaostamatonta. Tämä plasma on edullisesti otet-35 tu talteen antikoagulantin tai stabilointiliuoksen läsnä 3 95654 ollessa. Tavallisesti käytetään sitraatti-dekstroosi-fos-faattiseosta; siihen voidaan lisätä tai se voidaan korvata millä tahansa tekijän VIII spesifisellä stabilointiaineella.

5 Seosta, joka sisältää 0,2-2 yksikköä/ml heparii- nia, 1-5 mmol/1 EDTAa ja 1 - 10 mmol/1 CaCl2:a, ja johon lisätään mahdollisesti glukoosia pitoisuudeksi 5-60 g/1, voidaan edullisesti käyttää plasmalähtöaineen stabilointi-liuoksena.

10 Tämän keksinnön mukainen menetelmä käsittää ensim mäisen esipuhdistusvaiheen, jossa yhdistetään saostus ba-riumkloridilla ja adsorbointi alumiinihydroksidigeelille.

Bariumkloridikäsittely tehdään edullisesti plasmalle, jonka pH säädetään arvoon 6,5, lisäämällä sekoittaen 15 IM bariumkloridiliuosta, kunnes saavutetaan loppupitoi-suus 0,08 mol/1, jota käsittelyä seuraa sentrifugointi lämpötilassa 5 - 10 eC saostuneiden proteiinien poistamiseksi, ja ottamalla sitten talteen supernatantti. Saostuneet proteiinit voidaan edullisesti ottaa talteen protrom-20 biinikompleksin tai sen rakenneosien valmistamiseksi.

Sitten supernatantti saatetaan kosketukseen 3-%risen alumiinihydroksidigeelin kanssa pH:n ollessa 6,5, joka geeli adsorboi proteiiniepäpuhtausjäännökset; tätä käsittelyä seuraa jäähdytys lämpötilaan 5 - 8 °C kryos-25 taatissa, sentrifugointi lämpötilassa 5 °C ja supernatan-tin talteenotto, joka pidetään lämpötilassa 5 - 8 °C.

Tästä supernatantista täytyy poistaa suolat, mikä voidaan tehdä joko ultrasuodatuksella seuraavaan kromato-grafiavaiheeseen käytettävän täyttöpuskurin läsnä ollessa, 30 johon on lisätty 0,5-2 yksikköä/ml hepariinia, tai kro-matografisesti Sephadex G25:llä samassa puskurissa.

Sitten tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä tehdään erotus anioninvaihtokromatografisesti. Tämän hakemuksen tekijä on jo FR-patenttihakemuksessa 8 807 530 kuvan-35 nut etuja, jotka hän on havainnut olevan hartsityypillä, • 4 95654 jonka ioninvaihtokyky on alhainen ja huokoset kooltaan suuria, joka viimeinen ominaisuus mahdollistaa hyvin suurikokoisten molekyylien pidätyksen. Tämä pitkittynyt pidätys mahdollistaa lievästi hydrofobisten sidosten muodos-5 tumisen hartsin kanssa, ja puskurin ionivahvuuden valinta mahdollistaa kiinnittyneiden molekyylien selektiivisen desorption.

Tämän tyyppisiä hartseja on kaupallisesti saatavana yleisnimellä Fractogel. Siten voidaan käyttää DEAE-Fracto-10 gel 650:ä® ja T- tai D-MAE-Fractogeliä (Merck). Näitä samoja hartseja on nykyisin saatavana muodossa, jota toimittaja kuvaa ilmauksella "lonkeroimaista tyyppiä olevat hartsit". Niiden matriisin rakenne on muunnettu positiivisten varausten kiinnittymispinnan suurentamiseksi, mikä 15 voi suosia geelin kapasiteetin kasvua.

Kromatografiapylvään täyttöpuskuri on natriumsit-raatti- ja natriumkloridipohjäinen puskuri, jonka pH on säädetty arvoon 7 ja sisältää edullisesti kalsiumkloridia pitoisuutena 0,5-6 mmol/1, lysiiniä suunnilleen pitoi-20 suutena 2-4 g/1 ja glysiiniä pitoisuutena 8-11 g/1. Toteutettaessa menetelmää tämän puskurin natriumkloridipi-toisuutta suurennetaan ennalta määrätyllä tavalla.

Keksinnön mukaista puhdistusmenetelmää toteutettaessa injektoidaan edellä kuvattu esipuhdistettu valmiste 25 kromatografiakolonnille. Määrätyissä olosuhteissa (0,11 mol/1 NaCl) kolonni pystyy sitomaan hyvin suurikokoisia molekyylejä, kuten von Willebrand -tekijän ja tekijän VIII kompleksin, ja päästää fibrinogeenin, albumiinin, immuno-globuliinit, antitrombiini III:n ja fibronektiinin virtaa-30 maan ulos suodokseen.

Tämän keksinnön erään edullisen suoritusmuodon mukaisesti, jonka päämääränä on saavuttaa tekijä VIII:n optimaalinen talteenottoteho, kromatografiakolonnin eluoin-tiin käytettävän puskurin ionivahvuutta nostetaan vain 35 kerran, vastaamaan natriumkloridipitoisuutta 0,27 mol/1.

• 11 5 95654

Keksinnön erään toisen suoritusmuodon mukaisesti tätä elu-ointivaihetta edeltää esipesu, joka tehdään nostamalla ionivahvuus vastaamaan natriumkloridipitoisuutta 0,13 mol/1, jolloin fibronektiini poistuu.

5 Näissä olosuhteissa desorboidun ja eluoidun tekijän VIII ja von Willebrand - tekijän kompleksin ominaisaktii-visuus on vähintään 5-10 yksikköä/mg. Menetelmän kokonaissaanto on vähintään 350 yksikköä/litra kokonaisplasmaa ja voi olla vähintään 500 yksikköä/1, kun alkuperäiseen 10 plasmaan lisätään edellä kuvattua stabilointiseosta.

Myöhemmän käyttötarkoituksena mukaan tälle tekijän VIII ja von Willebrand -tekijän kompleksin liuokselle voidaan tehdä lisäpuhdistus ja erityisesti väkevöinti toisella kromatografisella käsittelyllä. Kuten edellinenkin tämä 15 voidaan tehdä DEAE- tai T/D-MAE-Fractogelillä tai muilla hartseilla; muita kantajia, kuten dekstraanisulfaattia, immobilisoitua amino-heksyylikantajaa, immobilisoitua he-pariinia, sulfopropyylihartseja ja affiniteetti- tai im-muunihartseja voidaan myös käyttää.

20 Tämä lisäkromatografiavaihe toteutetaan samassa peruspuskurissa kuin edellinen kromatografiavaihe. Keksinnön erään edullisen suoritusmuodon mukaisesti, jonka päämääränä on mahdollisimman pitkälle konsentroidun tekijän VIII valmistaminen, tämä lisäkromatografiakäsittely toteu-25 tetaan samanlaisissa olosuhteissa kuin ensimmäinen, ts. yhdellä desorptiovaiheella nostamalla puskurin ionivahvuus vastaamaan NaCl-pitoisuutta 0,27 mol/1. Keksinnön erään toisen suoritusmuodon mukaisesti tehdään puskurin ionivah-vuuden ensimmäinen nosto arvoon 0,13 mol/1 proteiiniepä-30 puhtausjäännösten poistamiseksi ja toinen nosto, arvoon 0,27 mol/, jotta saadaan talteen tekijän VIII ja von Willebrand -tekijän kompleksin hyvin puhdas konsentraatti, jonka ominaisaktiivisuus on tällöin vähintään 10 - 20 yksikköä/mg.

« 6 95654

Kolonnin ensimmäisen suodoksen muut proteiinit, kuten immunoglobuliinit, albumiini, antitrombiini III, fibrinogeeni ja fibronektiini, voidaan myös puhdistaa ja konsentroida tavanomaisin kromatografisin menetelmin.

5 Tämän keksinnön mukainen menetelmä sisältää myös tavanomaisella menetelmällä tehtävän virusten inaktivoin-nin. Kun käytetään kemiallista ainetta, esimerkiksi tehdään käsittely liuottimella/pinta-aktiivisella aineella, on viisasta tehdä tällainen käsittely ennen yhtäkään kro-10 matografiavaihetta, niin että viimeksi mainittu takaa in- aktivointiaineiden poiston.

Tekijän VIII ja von Willebrand -tekijän kompleksin konsentraatit ja muiden plasmaproteiinien konsentraatit, jotka on valmistettu käyttämällä edellä kuvattua menetel-15 mää, ovat myös tämän keksinnön kohteena.

Mainitut konsentraatit formuloidaan farmaseuttisten standardien mukaisesti ja niitä voidaan käyttää terapia-tarkoituksiin .

Seuraavat esimerkit valaisevat keksinnön kahta suo-20 ritusmuotoa sen suojapiiriä kuitenkaan rajoittamatta.

Esimerkki 1 Käytetään tuoretta plasmaa (250 ml) tai pakastettua plasmaa, joka on sulatettu ja saatettu lämpötilaan 22 -25 eC; plasma on kerätty antikoagulantin/stabilointiaineen 25 (esimerkiksi sitraatti-dekstroosi-fosfaattiseoksen) läsnä ollessa ja sen pH on säädetty arvoon 6,5 etikkahapolla.

a) Esipuhdistus

Lisätään 20 ml 1 M bariumkloridiliuosta peristalt-tisella pumpulla pH:n ollessa 6,5, kunnes saavutetaan lop-30 pupitoisuus 0,08 mol/1. Bariumkloridiliuosta lisätään no peudella 4-8 ml/min, ja seosta sekoitetaan sitten huoneenlämpötilassa 15 min.

Sitten seosta sentrifugoidaan 20 min pyörimisnopeudella 2700 min"1 lämpötilassa 8 °C ja otetaan talteen su-35 pernatantti.

< k li 7 95654

Supernatantti adsorboidaan sitten alumiinihydroksi-digeelille [Alhydrogel Eurobio, 3 % Al(OH)3:a], jota käytetään 2,3 g/1 plasmaa. pH säädetään arvoon 6,5 ja lämpötila lasketaan arvoon 5 eC kryostaatissa. Seosta sentrifugoi-5 daan lämpötilassa 5 °C 20 min pyörimisnopeudella 2700 min-1, otetaan talteen supernatantti ja säilytetään se lämpötilassa 5 °C.

Tämä käsittely antaa mahdollisuuden poistaa pro-trombiinikompleksin komponentit (tekijät II, VII, IX ja 10 X), jotka voidaan ottaa talteen ja puhdistaa tunnetuin menetelmin.

Erityisen tyydyttäviä tuloksia voidaan saada aikaan yhdistämällä nämä kaksi käsittelyä, koska pelkkä Alhydro-gel-käsittely ei mahdollista protrombiinin ja muiden 15 PPSB:n komponenttien täydellistä poistamista ja pelkässä bariumkloridikäsittelyssä jää jäljelle jonkin verran tekijää X, protrombiinia ja ennen kaikkea tekijää VII.

Siten talteen otetusta supernatantista poistetaan suolat joko ultrasuodatuksella seuraavan kromatografiavai-20 heen (katso jäljempänä) puskurin läsnä ollessa, johon on lisätty 1 yksikkö/ml hepariinia, tai käsittelemällä kromatografisesta Sephadex G25:llä samassa puskurissa.

Sitten tehdään tavanomainen virusten inaktivointi-käsittely liuottimella/pinta-aktiivisella aineella 6 tun-25 tia lämpötilassa 24 °C. (tätä käsittelymenetelmää kuvataan EP-hakemusjulkaisussa 0 131 740.) b) Kromatografinen puhdistus

Esipuhdistetulle dialysoidulle supernatantille tehdään kromatografiapuhdistusvaihe. Käytetään K26/30-kolon-30 nia (Pharmacia, Uppsala, Ruotsi), jonka läpimitta on 2, cm ja tehollinen korkeus 30 cm, josta 10 cm täytetään DEAE-Fractogel-TSK 650f® -hartsilla (Merck).

Kolonnin täyttämiseen ja näytteen liuottamiseen käytettävän puskurin koostumus on seuraava: 10 mmol/1 nat-35 riumsitraattia; 1 mmol/1 kalsiumkloridia, 9 g/1 glysiiniä; e 95654 3 g/1 lysiiniä. Tähän puskuriin lisätään natriumkloridia siten, että loppupitoisuudeksi tulee 0,11 mol/1 ja pH-ar-voksi 7.

Näyte ruiskutetaan kolonnille nopeudella 100 ml/h.

5 Kolonni huuhdotaan täyttöpuskurilla adsorboitumat- tomien proteiinien, joita ovat fibrinogeeni, albumiini, immunoglobuliinit, antitrombiini III ja fibronektiini, samoin kuin virusten inaktivointiaineiden poistamiseksi.

Tekijän VIII ja von Willebrend -tekijän kompleksi 10 desorboidaan sitten nostamalla puskurin ionivahvuus vastaamaan natriumkloridipitoisuutta 0,27 mol/1.

Tällä menetelmällä saadun tekijän VIII liuoksen ominaisaktiivisuus on 5 - 10 ky/mg ja puhdistushyötysuhde laskettuna kolonnille injektoidun plasman suhteen on 60 -15 80 %.

Kyseisten kahden tekijän, tekijän VIII ja von Willebrand -tekijän suhteen havaitaan aina olevan lähellä arvoa 1 yksikkö/1 yksikkö, jolloin viimeksi mainitun tekijän määrä ilmoitetaan ristosetiinikofaktoriyksikköinä.

20 Tämän tekijää VIII sisältävän liuoksen puhtausas tetta voidaan parantaa vielä hieman kromatografisella li-säerotusvaiheella, joka mahdollistaa tuotteen väkevöinnin. Käytetään esimerkiksi toista DEAE-Fractogel-kolonnia samoissa täyttöolosuhteissa kuin edellä ja esihuuhtelu teh-25 dään NaCl-pitoisuudella 0,13 mol/1, jolloin proteiniepä- puhtausjäännökset poistuvat. Puskurin ionivahvuus noste taan sitten vastaamaan NaCl-pitoisuutta 0,27 mol/1 hyvin puhtaan ja väkevöidyn tekijän VIII ja von Willebrand -tekijän kompleksin desorboimiseksi ja eluoimiseksi.

30 Toinen kromatografinen väkevöintivaihe voidaan kor vata ultrasuodatuksella.

Tämän keksinnön tavanomaisen suoritusmuodon mukaisesti ensimmäinen kromatografinen puhdistusvaihe toteutetaan DEAE-Fractogel-hartsilla. Oikein hyviä tuloksia on 35 kuitenkin saavutettu myös uusilla Merckin markkinoimilla

II

9 95654 hartseilla, kuten TMAE-Fractogelillä (TMAE = trimetyyli-aminoetyyli) tai DMAE-Fractogelillä (DMAE = dimetyyliami-noetyyli), joilla on vastaavat ominaisuuet kuin DEAE-Frac-togelillä. Voidaan myös käyttää uusia "lonkeromaista" 5 tyyppiä olevia hartseja, joita on kehittänyt Merck ja jotka W. Muller esitteli Tukholmassa kesäkuussa 1989 kokouksessa Conference on Liquid Chromatography.

Esimerkki 2

Keksinnön eräs toinen suoritusmuoto mahdollistaa 10 myös fibrinogeenin ja fibronektiinin konsentraattien valmistuksen, samalla kun tekijän VIII ja von Willebrand -tekijän konsentraattia saadaan heikommalla saannolla ja omi-naisaktiivisuudeltaan hieman parempana.

Menetelmä on samanlainen kuin esimerkin 1 mukainen 15 siihen vaiheeseen asti, jossa tekijän VIII ja von Willebrand -tekijän kompleksi eluoidaan ensimmäisestä DEAE-Fractogel-kolonnista.

Pylväs ei pidätä fibrinogeenia, antitrombiini III:a, albumiinia eikä immunoglobuliineja ja ne voidaan 20 ottaa talteen suodoksen mukana.

Tekijän VIII ja von Willebrand -tekijän kompleksi voidaan puhdistaa ja väkevöidä toisella kromatografisella erotusvaiheella, joka toteutetaan DEAE-Fractogel-kolonnil-la ja käyttämällä täyttöpuskuria, jonka ionivahvuus vastaa 25 natriumkloridipitoisuutta 0,17 mol/1, niin etteivät pro-teiiniepäpuhtausjäännökset jää kolonniin; ionivahvuuden nosto vastaamaan natriumkloridipitoisuutta 0,27 mol/1 mahdollistaa tekijän VIII ja von Willebrand -tekijän kompleksin desorboinnin ja eluoinnin. Ominaisaktiivisuudeksi saa-30 daan täten 10 - 20 ky/mg.

Fibrinogeeni ja fibronektiini voidaan sitten puhdistaa ja konsentroida käyttämällä tunnettuja kromatogafi-sia menetelmiä, jolloin saadaan liuoksia, jotka ovat laadultaan terapeuttiseen käyttöön soveltuvia ja joita kuva-35 taan FR-patenttihakemuksessa 8 807 530.

ίο 95654

Plasman muut proteiinit voidaan puhdistaa ja väke-vöidä käyttämällä tavanomaisia fraktiointimenetelmiä.

Esimerkki 3

Puhdistustehoa voidaan vielä parantaa stabiloimalla 5 alkuperäinen plasma, kuten sulatettu ja lämpötilaan 25 °C saatettu plasma, lisäämällä seuraavaa seosta: 1 yksikkö/ml hepariinia, 2 mmol/1 eli 0,74 g/l EDTAa, 6 mmol/1 eli 0,67 g/l kalsiumkloridia. Tähän seokseen voidaan vielä lisätä glukoosia pitoisuudeksi 5-60 g/l.

10 pH alennetaan arvoon 6,5 lisäämällä etikkahappoa.

Sitten toteutetaan esimerkin 1 tai 2 mukaiset puh-distusvaiheet.

Näissä olosuhteissa puhdistusprosessin kokonaissaanto on 55 - 65 % tekijän VIII aktiivisuudesta ominais-15 aktiivisuuden ollessa 10 - 30 FVIII:C-yksikköä/mg proteiinia.

II

Claims (16)

1. Menetelmä tekijän VIII ja von Willebrand -tekijän kompleksin stabiilin, ominaisaktiivisuudeltaan korkean 5 konsentraatin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että kokoplasma esipuhdistetaan tekemällä kaksoiskäsittely säästämällä bariumkloridilla ja adsorboimalla alumiinihydroksidilla ja supernatantti puhdistetaan kromatografisesti anioninvaihtogeelillä, joka mahdollistaa hyvin suuriko-10 koisten molekyylien pidättymisen ja mahdollistaa fibrino- geenin, albumiinin, immunoglobuliinien, antitrombiini III:n ja fibronektiinin virtaamisen ulos suodokseen, ja mahdollisesti kromatografiasuodoksessa oleville proteiineille tehdään lisäpuhdistus ja konsentrointi, ja mahdol-15 lisesti tehdään tavanomainen virusten inaktivointikäsit- tely käyttämällä liuotinta/pinta-aktiivista ainetta ennen mitään kromatografiavaihetta.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kokoplasma on tuore tai 20 pakastettu plasma.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että plasmaan lisätään stabiloin-tiseosta, joka sisältää 0,2 - 2 yksikköä/ml hepariinia, 1-5 mmol/1 EDTAa ja 1 - 10 mmol/1 CaCl2:a.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että stabilointiseos sisältää lisäksi 5-60 g/1 glukoosia.

5. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että esipuhdistus 30 käsittää seuraavat vaiheet: a) saostus bariumkloridilla, jota seuraa sentrifu-gointi ja supernatantin talteenotto, b) adsorbointi alumiinihydroksidigeelille, jota seuraa sentrifugointi kylmässä ja supernatantin talteenot- 35 to, • 12 95654 c) suolanpoistokäsittely.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että saostus bariumkloridilla tehdään lisäämällä sekoittaen liuosta, joka sisältää 1 mol/1 5 bariumkloridia, pH:n ollessa 6,5 ja sitä seuraa sentrifu-gointi lämpötilassa 5 - 10 °C ja supernatantin talteenotto.

7. Patenttivaatimuksen 5 tai 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että adsorbointi alumiinihydroksi- 10 digeelille tehdään käyttämällä 3-%:ista geeliä pH:n ollessa 6,5 ja sitä seuraa nopea jäähdytys lämpötilaan 5 °C, sentrifugointi lämpötilassa 5 °C ja supernatantin talteenotto.

8. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 5-7 mukai- 15 nen menetelmä, tunnettu siitä, että suolanpoisto käsittely tehdään ultrasuodattamalla seuraavassa kromato-grafiavaiheessa käytettävän kolonnintäyttöpuskurin läsnä ollessa, johon on lisätty hepariinia.

9. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 5-7 mukai- 20 nen menetelmä, tunnettu siitä, että suolanpoisto käsittely tehdään kromatografisesti Sephadex G25 -pylväällä seuraavassa kromatografiavaiheessa käytettävässä kolon-nintäyttöpuskurissa, johon on lisätty hepariinia.

10. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-9 mu-25 kainen menetelmä, tunnettu siitä, että kromatograf iageeli on vinyylipolymeerityyppinen geeli, johon on kiinnitetty DEAE- tai T- tai D-MAE-tyyppisiä ryhmiä, edullisesti Fractogel.

11. Patenttivaatimuksen 1 tai 10 mukainen menetel-30 mä, tunnettu siitä, että kromatografiakolonnin täyttöpuskuri on natriumsitraatti- ja kalsiumkloridipoh-jainen puskuri, joka sisältää glysiiniä ja lysiiniä, johon on lisätty natriumkloridia pitoisuudeksi 0,11 mol/1 ja jonka pH on säädetty arvoon 7, jolloin puskuri sisältää 35 edullisesti 8-11 g/1 glysiiniä ja 2 - 4 g/1 lysiiniä. » II 13 95654

12. Patenttivaatimuksen 1, 10 tai 11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että puskurin ionivahvuus nostetaan vastaamaan natriumkloridipitoisuutta 0,27 mol/1 tekijän VIII ja von Willebrand -tekijän kompleksin desor- 5 boimiseksi kromatografiakolonnista.

13. Patenttivaatimuksen 1, 10 tai 11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että puskurin ionivahvuus nostetaan vastaamaan natriumkloridipitoisuutta 0,13 mol/1, jolloin fibronektiini poistuu, ja sitten vastaamaan nat- 10 riumkloridipitoisuutta 0,27 mol/1 tekijän VIII ja von Willebrand -tekijän kompleksin desorboimiseksi kromatografiakolonnista .

14. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-13 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kromato- 15 grafiakolonnista desorboidulle tekijän VIII ja von Wille brand -tekijän kompleksille tehdään lisäpuhdistus ja kon-sentrointi kromatografisesti, jolloin kromatografinen li-säkäsittely tehdään edullisesti ioninvaihtohartsilla, joka on DEAE- tai T/D-MAE-Fractogel, immobilisoitu amino-hek- 20 syyli-, immobilisoitu hepariini-, dekstraanisulfaatti- tai sulfopropyylihartsi, tai affiniteetti- tai immuuniaffini-teettihartsilla.

15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lisäkromatografia tehdään 25 puskurilla, jonka natriumkloridipitoisuus on säädetty arvoon 0,11 mol/1, ja ionivahvuutta nostetaan kaksi kertaa peräkkäin, vastaamaan ensin natriumkloridipitoisuutta 0,13 mol/1 ja sitten 0,27 mol/1.

16. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, 30 tunnettu siitä, että lisäkromatografia tehdään puskurilla, jonka natriumkloridipitoisuus on säädetty arvoon 0,17 mol/1, ja ionivahvuutta nostetaan kerran vastaamaan natriumkloridipitoisuutta 0,27 mol/1. 14 95654