JP4312381B2 - 濾過によるウイルス的に安全な因子viii溶液の調製方法 - Google Patents
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Description
本発明は、ウイルス上安全であって、高分子因子VIII−フォンビルブラント因子(vWF)複合体を含むまたは実質的に含まない高純度もしくは超高純度因子VIII溶液からvWFを実質的に含まない因子VIII溶液を濾過調製する方法に関する。
【0002】
因子VIIIは、血中における因子VIIIの欠陥または不在により引き起こされる先天性疾患である血友病A患者の治療に長年使用されてきた血中のタンパク質成分である。長い間、これらの患者の治療には因子VIII豊富な血漿濃縮物が使用されてきた。
【0003】
最もよく使用されていたのは濃縮物は寒冷沈降物および寒冷沈降から得られた精製濃縮物であった。通常、寒冷沈降物とは、低温血漿分画技術により冷凍のヒト血漿から得られる沈降物をいう。冷凍血漿を約−5℃〜−15℃の温度で軟化し、次いで攪拌しながら3℃を超えない温度まで徐々に再加熱する。このような条件下では、冷凍血漿は部分的に融解して液相と固相が得られ、次ぎに固相を遠心分離により回収すると寒冷沈降物が得られ、その後これを精製して十分純粋な因子VIII沈降物としなければならない。この寒冷沈降画分は実質的にフィブリノーゲン、フィブロネクチン、因子VIIIおよびフォンビルブラント因子(vWF)からなる。
【0004】
この寒冷沈降画分において、因子VIIIは一般にvWFと会合しており、vWFは複合化により因子VIIIを安定にする。
【0005】
長い間、この精製工程は実質的に特にフィブリノーゲンおよびフィブロネクチンといった所望でないタンパクを因子VIIIからから分離することに向けられてきた。
【0006】
しかしながら、血漿から因子VIIIの調製に関する本質的な問題の1つは元々その血液に含まれるウイルスを満足のいく収率で不活性化/除去する必要性であることが知られている。
【0007】
これらのウイルス粒子を網羅的リストを確立することは難しいが、特に種々の肝炎ウイルス、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎およびG型肝炎、または種々の型のエイズウイルス(HIV)が記載され得る。
【0008】
こうして加熱乾燥、低温殺菌または溶媒/界面活性剤処理など多くのウイルス不活性化技術が開発された。これら一連の技術はエンベロープウイルスに関しては比較的効果的であるが、裸のウイルス、特にB19パルボウイルスまたはA型肝炎ウイルスなどの小型のウイルスの不活性化もしくは除去は未だ主要な問題の1つである。
【0009】
より最近の技術では、小孔径膜のウイルス保持能を利用する。この技術はB19パルボウイルスまたはA型肝炎ウイルスなどの小型のウイルスに関しては事実上著しい効果を示し、低分子タンパク質に適用することができる。しかしながら、900kDよりも小さい使用排除限界は、高分子タンパク質または収量に大きな損失のない因子VIIIのようなタンパク質複合体の濾過を考慮することはできない。
【0010】
従って、例えば、特許公報WO96/00237には、少なくとも1種の高分子を含有する溶液におけるタンパク質の濾過性を向上させる方法が記載されており、この方法は全塩含量が関連する塩0.2Mから飽和まで変化する溶液を用いることにある。このような高塩含量の効果は濾過収率を高めることである。好ましくはこの濾過工程は注目される高分子の比活性がすでに極めて高い段階で用いられ、そうすれば非常に微細な構造を有するフィルターを用いて、非常に小さなウイルスを除去することができる。
【0011】
しかしながら、この公報は、因子VIII、特に通常vWFと会合して、このように高分子複合体を形成している血漿起源の因子VIIIなど分子量の極めて高い分子を含有する溶液の濾過を何ら意図するものではない。この公報は、平均分子量約170kDで、vWFを全く含まない欠損型の組換え因子VIIIの例を挙げている。例は総てその平均分子量が約55kDである因子IXに関するものであり、この文書は記載の方法が特にこのサイズの分子に適したものであり、フィルターの排除限界が大きくなるほど濾過される分子のサイズはわずかながら大きくならなければならないことを強調するものである。このように、因子IXに関して、使用したフィルターは70kDの排除限界を有する。
【0012】
従って、先に示したように、その起源により因子VIIIはそれを有意な大きさにする複合化形態とすることができ、この大きさは分子量については20,000kDに、粒子サイズについては数十ナノメーターに達し得る(>分子の主軸では106nm、Eppel et al., Langmuir 1993, 9, 2281-88, American Chemical Society)。現在のところ、この種の分子を満足に濾過し、例えば約18〜20nmの大きさのB19パルボウイルスのような小型のウイルスを同時に除去するのに利用できる手段はない。
【0013】
発明者らは今般、驚くことに、高分子因子VIII−vWF複合体を含むまたは実質的に含まない高純度または超高純度因子VIII含有溶液から、濾過により、ウイルス上安全で、高分子vWFを実質的に含まない因子VIII溶液が得られることを見出した。
【0014】
このため本発明の主題は、ウイルス上安全であって、高分子vWFを実質的に含まない因子VIIIを濾過により調製する方法であって、
高分子因子VIII−vWF複合体を含むまたは実質的に含まない、高純度または超高純度因子VIII含有溶液を調製し、
必要であれば、高分子因子VIII−vWF複合体の解離および高分子vWFが会合した因子VIIIを実質的に含まない溶液の作製を可能とする工程a)を任意に行い、
15nmの多孔性を有する親水性フィルターを通して、高分子vWFが会合した因子VIIIを実質的に含まない溶液を濾過する工程b)を行う
ことを特徴とする方法である。
【0015】
FVIII溶液の濾過による調製法により有利には、高分子vWF、特に15より大きいかまたは同等の重合度を有するvWFを実質的に含まない溶液の作製が可能となり、すなわちここでvWFは質的、量的双方において制御される。本発明の方法はまた、高分子タンパク質複合体の量を減らすので濾過収率を著しく高めることができ、満足のいく純度を有し、なおかつ同時に15nm以上の大きさのヒト病原性ウイルスの除去を確実とする溶液を得ることができる。
【0016】
高分子因子VIII−vWF複合体の解離を可能とする工程a)は、因子VIII開始溶液の起源および調製方法、すなわちその開始溶液中に高分子vWFが会合した因子VIIIが存在しているか存在していないかという条件によって必要であったり必要でなかったりする。
【0017】
FVIII−vFW複合体の解離は、解離を可能とするに十分な量で存在する少なくとも1種のカオトロピックイオンによって得られる。
【0018】
それらは好ましくは0.2Mから塩飽和までの塩水の形態で因子VIII溶液に導入される2価イオンであろう。
【0019】
限定されるものではないが例としては、CaCl2またはMgCl2が挙げられる。好ましくはCaCl2溶液が使用されよう。この溶液の濃度は好ましくは約0.35Mであろう。
【0020】
濾過に対する特殊な条件の他、解離に用いられる条件は、それに続く濾過収率に影響を及ぼすことが認められてる。これら一連の条件を規定するパラメーターは解離工程中では塩の特性とそれらの濃度であり、濾過工程中では圧力と温度である。
【0021】
驚くことに濾過収率は、濾過工程中の経膜圧をフィルター供給者により奨励されている奨励限界以下の極めて低い値まで低下させた場合に著しく向上する。
【0022】
また温度も濾過収量に少なからず影響を及ぼし、この温度の効果は低すぎても、あるいは高すぎてもvWFの多量体型の数を引き上げることはできない。有利には約35±5℃の温度が選択される。
【0023】
市販のまたは開発中で利用可能なウイルスフィルターのうち、例えばAsahi Chemical Industryから市販されているPlanova(登録商標)15N膜が挙げられる。
【0024】
この場合、このフィルターは0.3バールより低い圧力で、有利には0.2バールより低い圧力で使用することが好ましい。
【0025】
種々の濾過技術が使用できる。最も一般的な技術としては接線濾過または正面濾過法があり、同種のフィルターを用いて使用できる。
【0026】
精製された因子VIII開始溶液は、例えば血漿の寒冷沈降画分などの血漿画分から種々の方法で、あるいは組換え経路により調製できる。当業者に公知のあらゆる調製条件が使用できる。限定されるものではないがある様式として、本発明の方法を実施するために使用できる因子VIII予備精製溶液の作製を可能とする下記精製法が記載され得る:
【0027】
例えば特許EP−B−359 593、EP 0 343 275、US 4 743 680、WO 97/17370およびEP 0 173 242に記載の変法の1つによるイオン交換クロマトグラフィー。
【0028】
例えば特許出願公報WO 97/39033またはEP 0 286 323に、または文書Zimmerman and Fulcher, Thrombosis Res., Suppl. VII, p 58, 1987; Berntorp and Nilson, Thrombosis Res., Supp. VII, p 60, 1987に記載の変法の1つによるイムノアフィニティークロマトグラフィー。
【0029】
P.J. Fay (P.J. Fay et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA Vol. 79 p 7200-7204, 1982)により記載されたような解離または非解離媒質中でのゲル濾過クロマトグラフィー。
【0030】
特許出願公報WO 93/22337に記載されたような固定化ヘパリン上でのアフィニティークロマトグラフィー。
【0031】
典型的には血漿の寒冷沈降画分などの血漿画分からのイオン交換クロマトグラフィーによる精製は、エンベロープウイルスの不活性化を可能とするウイルス不活性化工程を含んでなる。種々のクロマトグラフィー系が使用でき、その吸着条件、次いでの因子VIII濃縮画分の溶出はその方法の結果としての収率に影響を及ぼし得る。マトリックスおよびイオン交換物質の特性は様々であり得る。例えばToso Haas Toyopearl−DEAE 650 Mゲルのような弱いイオン交換クロマトグラフィー系、または例えばQ−Sepharose Fast Flowゲル(Pharmacia Biotech)のような強いイオン交換クロマトグラフィーが例えば使用できる。開始溶液をイオン交換精製により調製する場合、高分子vWFが会合した因子VIIIが相当量含まれ、工程a)が必要である。
【0032】
工程a)における解離は溶出と同時に、あるいはもう1つの態様によれば溶出後に行うことができる。カオトロピック塩の存在下で行われる溶出の効果は、NaClなどの塩の存在下で行われる溶出に比べ溶出収率が高まることにあるが、同時に必要条件下でそれに続く濾過工程を行うのに必要な解離を確実にする。
【0033】
好ましい具体例によれば、イオン交換クロマトグラフィーによる精製の終了時に得られる因子VIII濃縮溶液は次いで工程a)の解離条件下、すなわちカオトロピックイオンの存在下で溶出される。
【0034】
因子VIII開始溶液の予備精製もまたヘパリン沈降法により得られる。この場合、血漿のヘパリン寒冷沈降画分は、ヘパリンの存在下で、約14℃〜約19℃の温度まで冷却、遠心しながら、例えば水酸化アルミニウムゲルに吸着させる。沈降上清に対して行われる第1のウイルス不活性化工程は、有利には欧州特許公報EP−A−0343275に記載されたような溶媒/界面活性剤処理により行うことができる。次いでイオンに交換クロマトグラフィーの前に沈降上清のpHおよび浸透圧を調節する。
【0035】
もう1つの具体例によれば、因子VIII開始溶液はイムノアフィニティーにより得られる。この場合、この開始溶液は高分子vWFが会合した因子VIIIを実質的に含まないものであり得る。従って高分子因子VIII−vWF複合体の解離を可能とする工程a)の使用は任意である。
【0036】
最後に、組換え因子VIIIの溶液から始めることも意図でき、これにはさらなるウイルス不活性化工程が必要となる可能性がある。工程a)を使用する必要はないであろう。
【0037】
因子VIII開始溶液は少なくとも50IU/mgと同等、好ましくは少なくとも100IU/mgと同等の比活性を有することが好ましく、溶液の濾過性は因子VIIIの比活性にともない高まる。
【0038】
示されたような比活性は因子VIIIを安定化させるために所望によるアルブミンの添加の前に示すことが意図される。
【0039】
さらに詳しくは、因子VIII濃度:Cが約2〜約100U/ml、好ましくは約10〜約50U/mlである開始溶液が使用される。
【0040】
因子VIII開始溶液のタンパク質含量は有利には約0.05〜約0.5mg/ml、好ましくは約0.1〜約0.5mg/mlであろう。
【0041】
このタンパク質含量はブラッドフォードタンパク質アッセイ法により求められる(アッセイキットはPierce社により市販)。
【0042】
一度濾過が行われてしまうと、濾過された因子VIIIおよびフォンビルブラント因子は、例えば透析により解離剤を除去した後に複合体の形態に再会合し、商業上の使用のために処方された因子VIII溶液は所望による凍結乾燥後工程の後に回収される。
【0043】
本発明の主題はまた、ウイルス上安全で、高分vWFを実質的に含まず、かつ、本発明の方法によって得ることができる因子VIII溶液にある。
【0044】
最後に、本発明は医薬製剤としての、さらに詳しくは血友病Aの治療のための、本発明に従って得られた溶液に関する。
【0045】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定することなく本発明を説明するものである。
【0046】
実施例1:血漿の寒冷沈降画分からの因子VIII溶液の濾過調製
因子VIII開始溶液の調製は、特許FR2 632 309の教示に従って行われ、その内容は引用することにより本明細書の一部とされる。
【0047】
血漿113.5lに相当する寒冷沈降物835gを室温で30分間攪拌しながらヘパリン処理をした水溶液(3IU/ml)に再溶解させる。因子VIIIおよびタンパク質豊富な溶液4217mlを、水酸化アルミニウムゲル90gへの吸着ならびに酸沈降(pH6.50)および温度を15〜19℃まで低下させることにより清澄化する。フィブリノーゲンおよびフィブロネクチン豊富な沈降物を遠心分離すると、ポリソルベート80およびリン酸トリ−n−ブチル(それぞれ適量1%および0.3%溶液)の添加によりpH7.1で少なくとも6時間、エンベロープウイルスが不活性化される清澄な中純度の因子VIII溶液が得られる。
【0048】
エンベロープウイルスについては、ウイルスが不活性化された因子VIII溶液5172mlを、緩衝塩溶液で予め平衡化した弱い陰イオン交換クロマトグラフィーゲル(TosoHaas Toyopearl−DEAE 650M)560mlに吸着させる。吸着させて2時間後、このゲルを浸透圧390mosm/kgであり、pH7.00に緩衝させた塩溶液で洗浄する。ゲルに吸着しない画分にはフィブリノーゲンが豊富である。次いで浸透圧を452mosm/kgまで上昇させることにより、フォンビルブランド因子が豊富な画分からゲルを溶出させる。さらにpHを6.0に変更し、イオン強度を高めることにより、濃縮され、因子VIIIに関して極めて高純度である画分が溶出する。次いで溶出した画分を濃度0.35Mおよび浸透圧1300±100mosm/kgにCaCl2で調節する。この画分は高含量のカルシウムの作用により、解離形態にある因子VIIIとフォンビルブランド因子の混合物からなる。
【0049】
+4℃で安定している溶液1260mlをただちに+35℃まで再加熱し、15nmの多孔性限界と0.12m2の表面積を有するBMN Planova(登録商標)15Nフィルターを用いる濾過によりウイルス除去工程を行う。濾過中、流量は膜内外の圧力が常に0.2バールより低くなるように保つ。因子VIIIの濾過後、さらに浸透圧1300mosm/kgの緩衝溶液210mlを膜を通して濾過し、病原性ウイルスを含まない因子VIII溶液1470mlを回収する。緩衝液によりフィルターの浸透圧およびpHを平衡にすることができ、この緩衝液は因子VIIIを濾過した後のフィルターの洗浄に使用される。得られた因子VIII溶液には重合度の非常高い(≧15)のフォンビルブランド因子は少ないが、透析後に因子VIIIを再合成するに十分な重合度≧5および≧10のフォンビルブランド因子を含んでいる。
【0050】
結果:
表1は本発明の方法の種々の工程において、得られた因子VIII量ならびに比活性(SA)、タンパク質含量および該工程からの収率を示している。
【0051】
【表1】
【0052】
実施例2:本条件は、血漿1330lに相当する寒冷沈降物10,000gを使用することを除き、実施例1のものと同一である。エンベロープウイルスにおいてウイルスが不活性化される因子VIII溶液13,700mlを濾過する。因子VIIIの濾過後、浸透圧1300mosm/kgの緩衝液2lを濾過し、病原性ウイルスを含まない因子VIII溶液15,700mlを回収する。用いられる濾過膜は、1.0m2の表面積を有するBMN Planova(登録商標)15N膜である。
【0053】
下記の表2は、血漿1330l当量の1.0m2の表面積を有するBMN Planova(登録商標)15N膜による濾過に関する、濾過方法の種々の工程において得られた因子VIII量ならびに比活性および該工程からの収率を示している。
【0054】
【表2】
【0055】
実施例3:血漿の寒冷沈降物から得られ、ヘパリン沈降により予備精製された画分からの因子VIII溶液の濾過調製
因子VIII開始溶液の調製は、米国特許4,743,680の教示に従って行われ、その内容は引用することにより本明細書の一部とされる。
【0056】
血漿92.2lに相当する寒冷沈降物678gを室温で30分間攪拌しながらヘパリン処理した水溶液(3IU/ml)に再溶解させる。因子VIIIおよびタンパク質豊富な溶液3424mlを実施例1のように清澄化する。
【0057】
実施例1と同一条件下でエンベロープウイルスに関してウイルスが不活性化された因子VIII溶液4200mlを、pH6.50で酸性化した後、緩衝液で予め平衡化した強い陰イオン交換クロマトグラフィーゲル(Pharmacia Biotech Q−Sepharose Fast Flow)300mlに吸着させる。吸着させて2時間30分後、そのゲルを浸透圧450mosm/kgを有し、pH6.50に緩衝させた塩水で洗浄する。ゲルに吸着しない画分にはフィブリノーゲンが豊富である。次いで浸透圧を581mosm/kgまで上昇させることにより、フォンビルブランド因子が多く含まれる画分からゲルを溶出する。さらにpHを6.0に変更し、イオン強度を高めることにより、濃縮されて、因子VIIIが極めて高純度である画分を溶出する。次いで溶出した画分を濃度0.35Mおよび浸透度1300±100mosm/kgにCaCl2で調節する。この画分は高含量のカルシウムの作用により、解離形態にある因子VIIIとフォンビルブランド因子の混合物からなる。
【0058】
+4℃で安定している溶液1280mlをただちに+35℃まで再加熱し、15nmの多孔性限界と0.12m2の表面積を有するPlanova 15N膜を通す実施例1と同様の濾過によりウイルス除去工程を行う。さらに浸透圧1300mosm/kgの緩衝溶液180ml容量を濾過し、病原性ウイルスを含まない因子VIII溶液1460mlを回収する。この因子VIII溶液には極めて高い重合度(≧15)のフォンビルブランド因子は少ないが、透析後に因子VIIIを再合成するに十分な重合度≧5および≧10のフォンビルブランド因子を含んでいる。
【0059】
結果:
下記の表3は、濾過方法の種々の工程における、得られた因子VIII量、タンパク質総量ならびに比活性(SA)および該工程からの収率を示している。
【0060】
【表3】
【0061】
実施例4:解離に用いられる塩の性質および濃度の作用としての因子VIII溶液のPlanova(登録商標)15N膜による濾過性の変化
結果:
下記の表4は、これらの種々のパラメーターの関数としての濾過収率の変化を示しており、この方法の他の操作条件は実施例1で定義されるものに帰する。
【0062】
【表4】
【0063】
解離剤の使用により、因子VIIIの濾過性を有意に高めることができる。濾過後、透析によりこれらの薬剤を除去することで、因子VIII−フォンビルブランド因子複合体の再会合が誘導される。得られた生成物を解析することでフォンビルブランド因子が因子VIIIと良好に結合することができることが明らかとなる。
【0064】
実施例5:温度および圧力パラメーターの関数としての因子VIII溶液のPlanova(登録商標)15N膜を通す濾過性の変化
下記の表5は、圧力および温度を変えて得られた濾過収率を示している。なお、解離に用いられた塩およびその濃度は変更していない。与えられた圧力では、温度を低下させると濾過収率の有意な低下が見られる。
【0065】
また図1では、経膜圧を非常に低い値まで低下させることで収率がかなり改善できることが明らかに示されている。
【0066】
【表5】
【0067】
実施例6:実施例1の濾過条件下における濾過系のウイルス保持力の試験
大きさが25〜30nmのファージΦx174をウイルスモデルとして用いる。膜およびその操作条件は実施例1および2に記載されたものである。
【0068】
結果:
下記表6の結果では、満足できるウイルス保持力が示されている。
【0069】
【表6】
【0070】
実施例7:本発明の方法による、因子VIII溶液中のvWF含量への影響
実施例1に記載される因子VIII溶液において、本発明の方法が用いられた前後でvWF含量およびvWF多量体プロフィールを比較した。
【0071】
得られた結果は下記表7に示されている。
【0072】
【表7】
【0073】
このように、実際に本発明の方法を用いることで、高分子vWFを実質的に含まない、特に重合度≧15の多量体を実質的に含まない因子VIII溶液が得られる。
【図面の簡単な説明】
【図1】 本系にかけられる圧力の関数としての、Planova(登録商標)15N膜による因子VIIIの濾過性の変化を示す曲線である。バールで表される圧力はx軸に示され、%で表される濾過収率(濾液のIU/mlで表されるFVIIIC活性と開始生成物のそれとの間の比率)はy軸に示されている。
Claims (23)
- ウイルス上安全な因子VIII溶液を濾過により調製する方法であって、
(a)因子VIII−vWFタンパク質複合体を含んでなる溶液を調製すること、
(b)解離させるのに十分な量のカオトロピックイオンにより、高分子因子VIII−vWF複合体を解離させる工程を行うこと、
(c)最大で15nmの多孔性を有する親水性フィルターを通して、該溶液を濾過する工程を行うこと、
を特徴とする方法。 - カオトロピックイオンが2価イオンである、請求項1記載の方法。
- 2価イオンがCa2+ イオンである、請求項2記載の方法。
- 2価イオンが0.2Mから塩飽和までの塩水の形態で加えられる、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 溶液がCaCl2溶液である、請求項4記載の方法。
- Ca2+イオンが0.35Mから飽和までのCaCl2溶液の形態で加えられる、請求項4または5のいずれかに記載の方法。
- 工程c)が35±5℃の温度で行われる、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 開始溶液が血漿画分、特に血漿の寒冷沈降画分、をイオン交換クロマトグラフィー精製することによって得られる、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- イオン交換クロマトグラフィーによる精製の終了時に得られる因子VIII濃縮画分が工程b)の解離条件下で溶出される、請求項8記載の方法。
- 因子VIII開始溶液が、血漿画分、特に血漿の寒冷沈降画分、をヘパリン沈降により予備精製することによって得られる、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 因子VIII開始溶液において、溶媒/界面活性剤処理によりウイルスが部分的に不活性化されている、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 因子VIII開始溶液が免疫精製された因子VIIIを含んでなる、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 因子VIII開始溶液が組換え因子VIIIを含んでなる、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 開始溶液が血漿由来である、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 開始溶液中の因子VIIIが少なくとも50IU/mgと同等の比活性を有する、請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法。
- 開始溶液中の因子VIIIが少なくとも100IU/mgと同等の比活性を有する、請求項15に記載の方法。
- 因子VIII開始溶液の因子VIII濃度Cが2〜100U/mlである、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法。
- 因子VIII開始溶液の因子VIII濃度Cが10〜50U/mlである、請求項17に記載の方法。
- 因子VIII開始溶液のタンパク質含量が0.05〜0.5mg/mlである、請求項1〜18のいずれか1項に記載の方法。
- 因子VIII開始溶液のタンパク質含量が0.1〜0.5mg/mlである、請求項19に記載の方法。
- 請求項1〜20のいずれか1項に記載の方法によって得られる、ウイルス上安全な因子VIII溶液。
- 医薬製剤としての請求項21記載の溶液。
- 血友病Aの治療のための医薬製剤としての請求項22記載の溶液。
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