KR20130112031A - 피브리노겐의 생산 방법 - Google Patents

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옥타파마 아게
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Abstract

본 발명은 소량의 피브리노펩티드 A 및 피브로넥틴을 포함하고 바이러스 및 프리온을 포함하지 않는, 고순도의 원형 (native) 피브리노겐 농축물의 제조 방법 또는 과정에 관한 것이다.

Description

피브리노겐의 생산 방법{Process for production of fibrinogen}
응고인자 (clotting factor) I으로도 알려진, 피브리노겐은 지혈 (haemostasis) 및 상처 치유에 주요한 역할을 수행한다. 피브리노겐은 340.000 Da의 겉보기 분자량 (apparent molecular weight)으로 간에서 합성되는 당단백질이며, 이황화물 다리 (disulfide bridge)로 연결된 Aα, Bβ 및 γ로 지칭되는 동일하지 않은 폴리펩티드 체인 3쌍으로 각각 이루어진, 두개의 이량체 (dimer)로 구성된다. 이는 약 150-400 ㎍/ml의 농도로 혈류 내에서 순환한다. 혈관의 손상시, 혈소판이 활성화되고 플러그 (plug)가 형성된다. 피브리노겐은 활성화된 혈소판의 교차-결합 (cross-linking)에 기여함으로써 일차 지혈에 관여한다.
동시에, 응고 케스케이드의 활성이 개시된다. 종점으로, 트롬빈에 의한 피브리노펩티드 A 및 - 더 느린 속도로- 피브리노펩티드 B의 단백질 가수분해성 방출에 따라 피브리노겐은 피브린으로 전환된다. 가용성 (soluble) 피브린 모노머 (monomer)는 이중 가닥의 꼬인 원섬유 (fibril)로 조립된다. 후속적으로 이 원섬유는 측방향 (lateral manner)으로 배열되어, 더 두꺼운 섬유를 야기한다. 뒤이어 이 섬유는 FXIIIa에 의하여 피브린 그물망 (fibrin network)으로 교차결합되어, 활성화된 혈소판과 피브린의 상호작용으로 혈소판 플러그를 안정화시켜서, 안정된 응고를 야기한다.
장애 및 결핍
선천성 섬유소원결핍혈증 (Congenital afibrinogenaemia)는 환자가 피브리노겐의 부족 또는 기능 부전에 따라 불충분한 혈액 응고를 겪는, 희귀한 출혈 장애이다. 이 질병은 경미한 외상 (traumata) 후 또는 중재 시술 (interventional procedure) 중에 자발적인 출혈 또는 과다 출혈로 이어질 수 있다.
피브리노겐의 후천성 결핍은 선천성 섬유소원결핍혈증에 비하여 훨씬 더 일반적이며, 혈액 희석 (hemodilution) 또는 수술 중 실혈 (blood loss), 외상, 파종성 혈관내 응고 (disseminated intravascular coagulation, DIC) 또는 패혈증과 같은 기타 현상에 의해 유도될 수 있다.
피브리노겐 결핍은 신선동결혈장 (fresh frozen plasma) 또는 동결침전물 (cryoprecipitate)의 정맥내 주입에 의한 대체요법에 의해 혈장 중 약 1.5 내지 3 g/l의 정상 피브리노겐 수준으로 교정될 수 있다. 그러나, 이러한 치료는 병원균, 예를 들면 바이러스 또는 프리온을 환자에게 도입시킬 수 있고, 그에 따라 추가적인 장애를 발생시킬 수 있는 위험성을 갖는다. 따라서 안전한 방식으로 피브리노겐을 생리적 수준으로 회복시키기 위하여 바이러스가 불활성화된 (virus inactivated) 피브리노겐 조성물을 정맥으로 적용하는 것이 바람직하다.
피브린 글루 (fibrin glue), 피브리노겐 접착제, 조직 글루 및 유사하게 지칭되는 제제에 피브리노겐에 존재하며, 이러한 제제는 분말, 페이스트, 폼 (form)으로, 또는 상처에의 반창고인 직물과의 조합으로써 국소용으로 의도되지만, 그들의 농도 (consistency) 및 조성이 주사되면 즉시 혈전증 현상 (thrombotic event)을 개시하기 때문에 정맥내 적용에 사용할 수 없다. 이러한 제제는 추가적으로 트롬빈, 칼슘염, 및 상대적으로 다량의 응고인자 XIII를 포함한다. 이와 같은 제제의 예는 US-A1-2008/003272, WO-A-95/22316 또는 US-A1-2008/181878이다.
피브리노겐이 매트릭스에 결합하는 조건 하에서, 피브리노겐 함유 용액을 이온 교환 매트릭스에 적용하는 단계, ω-아미노산을 하나 이상 포함하는 버퍼 용액으로 이온 교환 매트릭스를 세척하는 단계, 10 mM 트리스 (Tris), 10 mM 시트르산, 45 mM 수크로오스; 및 200mM 내지 1.0M 농도의 NaCl로 이루어진 버퍼로 매트릭스로부터 피브리노겐을 용출하는 단계, 및 선택적으로 용출액으로부터 피브리노겐을 회수하는 단계를 포함하는, 피브리노겐 함유 용액으로부터 피브리노겐을 정제하는 방법에 관한 EP-B1-1　240　200으로부터 피브리노겐 생산 방법이 공지된다.
EP-B1-0　771　324는 피브리노겐을 포함하는 가용화된 혈장 분획물에 화학적 바이러스 불활성화 처리, 즉 S/D 또는 용매/세제 (solvent/detergent) 처리를 수행하는 단계, 상청액을 수득하기 위하여 바이러스-불활성화된 결과 분획물을 산성 pH의 아미노산을 포함하는 용액 중 침전시키는 단계, 정제된 피브리노겐 농축물을 수득하기 위하여 상청액을 여과하는 단계, 및 정제된 피브리노겐 농축물을 회수하는 단계에 의해 수득되는 바이러스 불포함 (virus free) 피브리노겐 농축물의 생산 방법에 관한 것이다. 제2 바이러스 불활성화를 위하여 회수된 피브리노겐 농축물에 자외선 조사가 수행된다. 생산물은 제3 바이러스 불활성화 전에 안정화되고, 동결 건조된다.
EP-B1-1　519　944는 피브리노겐 및 플라스미노겐이 매트릭스에 결합하는 조건하에서 고정화된 금속 이온 친화성 크로마토그래피 매트릭스의 이용 및 선택적으로 매트릭스로부터 피브리노겐 및 93 %의 플라스미노겐을 개별적으로 용출하는 단계를 교시한다.
EP-B1-0　555　135는 4차 아민기를 포함하는 가교된 아가로스에 기반한 음이온 교환 겔을 이용하여 피브리노겐 용액을 정제하는 것에 의해 정맥 내 적용가능한 피브리노겐을 생산하는 방법을 개시한다. 생산된 피브리노겐은 인자 VIIIc가 포함하지 않은 것으로 개시된다.
EP-B1-1　457　497은 피브리노겐 용액의 안정화 및 동결 및 그들의 후속 해동을 특징으로 하는 피브리노겐 용액 중 바이러스를 제거하는 방법에 관한 것이다. 단백질의 희석 전에 용해되지 않은 물질의 분리가 일어나고, 뒤이어 35 nm보다 더 작은 공극 크기의 필터를 이용한, 결과적으로 수득된 용액의 나노여과가 이어진다.
US-A1-2006/0009376도 피브리노겐의 제조 방법을 개시한다. 인자 XIII를 제거하기 위하여 피브리노겐의 용해 및 침전의 반복이 이어진다.
Goheen, S. C. 등은 Journal of Chromatography A. 816 (1998) 89-96에서, 4차 아민 또는 술포프로필 작용기를 포함하는 비다공성 (nonporous) 컬럼 물질을 이용한 혈장 단백질 알부민, 피브리노겐 및 면역글로불린 (G)의 HPLC 이온-교환 크로마토그래피에 관하여 보고한다.
본 발명의 일 목적은 부작용 또는 병원체 관련 질환의 발병을 방지하기 위하여 특정 병원체의 제거 및/또는 불활성화 단계를 포함하는 제조방법에 의해 제조된 피브리노겐 농축물을 제공하는 것이다. 상기 병원체는 박테리아, 바이러스 및, 프리온 단백질 스크래피 (PrPsc)와 같은 프리온의 그룹으로부터 선택된다. 이와 같은 피브리노겐 생산물의 정맥 내 경로를 통한 전신 적용은 선천성 섬유소원결핍혈증 및 후천성 피브리노겐 결핍의 치료를 가능하게 한다. 이 표준화된 피브리노겐 농축물의 적용은 시간이 소요되는 신선동결혈장의 해동 및 저하된 용량 로드 (volume load) 없이 응급 상황에서의 신속한 치료와 필수적으로 일정한 조성에 기인하는 신뢰할 수 있는 응고 특성을 가능하게 한다.
본 출원의 또 다른 목적은 소규모의 생산, 즉 수 1/10 리터 내지 수 리터의 소규모 생산 역시 가능하지만, 산업적 수준으로, 즉 수백 내지 수천 리터의 혈액 또는 혈장과 같은 출발 물질로 농축물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
이러한 목적 및 추가적 목적은 청구항 1 내지 14의 방법, 및 청구항 15 내지 19에서 청구된 바와 같은 본 발명의 방법에 의하여 수득 가능한 생산물에 의하여 달성된다.
일반적으로, 본 발명의 피브리노겐을 포함하는 소스 (source)로부터 피브리노겐을 정제 또는 제조하는 방법은 하기의 단계를 포함한다:
- 하나 이상의 침전제를 피브리노겐을 포함하는 소스에 첨가하여 피브리노겐이 강화된 (fibrinogen enriched) 침전물을 형성하는 단계;
- 선택적으로, 예를 들면 상기 침전물을 원심분리하여 피브리노겐이 강화된 침전물을 단리하는 단계;
- 피브리노겐이 강화된 침전물을 액상 매질에 수용하여 피브리노겐 포함 용액을 형성하며, 선택적으로, 뒤이어 여과 및/또는 초미세/정용여과를 수행하는 단계:
- 피브리노겐이 고정상에 결합하는 조건 하에서, 피브리노겐 포함 용액과 고정상을 접촉시켜, 피브리노겐 포함 용액에 강 음이온 교환기 (strong anion exchange group)를 갖는 고정상에서의 크로마토그래피를 수행하는 단계;
- 뒤이어 전술한 단계의 이온 강도보다 더 높은 이온 강도를 갖는 수용액을 이용하여 고정상으로부터 피브리노겐을 용출하여, 수집된 피브리노겐이 강화된 분획물을 생성하는 단계;
- 선택적으로, 피브리노겐이 강화된 분획물을 희석 및/또는 농축하는 후속 단계; 및
- 선택적으로, 피브리노겐이 강화된 분획물을 적합한 바이알 (vial)에 충진하는 단계.
본 발명의 제조 방법의 일 구체예에서 피브리노겐을 포함하는 소스는 혈장, 분획 Ⅰ과 같은 혈장 분획, 또는 동결침전물, 피브리노겐을 생산하는 세포 배양물 및/또는 상기 세포 배양물의 상청액으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 동결침전물이 출발물질로 사용되지 않는 경우, 출발물질인 피브리노겐 포함 중간체 (intermediate)는 Cohn, Kistler-Nitschmann에 의해 기술된 것과 같은 잘 알려진 방법 및 이의 변형에 의해 생산된다.
약제학적으로 사용 가능한 생산물을 수득하기 위하여, 피브리노겐을 포함하는 소스에 대하여 바이러스 불활성화 과정, 예를 들어 용매 세제 과정을 수행하는 것이 유리하다.
본 발명의 다른 구체예에 따르면, 바이러스 불활성화는 피브리노겐이 강화된 침전물 형성 전에 수행된다. 그러나, 바이러스 불활성화를 다른 단계에서 수행하는 것도 가능하다.
본 발명의 또 다른 구체예에 따르면, 바이러스 불활성화 물질의 제거는 오일 추출 및/또는 강 음이온 교환기를 이용한 크로마토그래피에 의하여 수행된다.
본 발명의 제조 방법에 사용하기 위한 대표적인 침전제는 글리신과 같은 아미노산, 고염 농축물 (염석 (salting-out)) 또는 폴리에틸렌 글리콜로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 구체예에 따르면, 수용 (taking up)은 7.5 내지 8.5 pH를 갖는 버퍼 에 페이스트를 재현탁 (resuspending)하는 것이다.
본 발명의 또 다른 구체예에 따르면, 고정상은 3차 또는 4차 아미노기를 갖는다.
본 발명의 제조 방법 중 크로마토그래피 단계는 특히 컬럼에서 수행될 수 있다.
충진된 피브리노겐이 강화된 분획물의 일반적인 저장 형태는 액체 상태, 바람직하게 -15 ℃ 미만, 더욱 바람직하게는 -30 ℃ 미만에서의 동결 상태, 또는 동결 건조 형태이다.
또한 본 발명의 대상은 본 발명의 제조 방법에 따라 수득가능한 피브리노겐이 강화된 분획물이다. 본 발명의 피브리노겐이 강화된 분획물은 예를 들면 피브리노겐 mg 당 0.01 내지 9.0 ng 피브리노펩티드 A를 포함한다. 또한, 본 발명의 피브리노겐이 강화된 분획물은 클라우스 (Clauss) 방법으로 결정된, 피브리노겐 mg 당 0.80 내지 1.10 mg 피브리노겐-항원; 피브리노겐 mg 당 0.1 IU 미만의 VWF:Ag 활성; 피브리노겐 mg 당 0.07 IU 이상의 응고 인자 XIII 활성; 피브리노겐 mg 당 0.01 내지 1.00 ㎍ 피브로넥틴 및 피브리노겐 mg 당 0.03 IU 미만의 트롬빈을 포함한다.
피브리노겐 농축물은 무균 여과 후 최종 용기에 충진되며 액체, 냉동액 또는 동결건조된 형태로 저장될 수 있다.
이 방법에 따라 생산된 피브리노겐은 생산물의 원형성 (nativity)을 증명하는 매우 적은 양의 불순물을 특징으로 하며, 환자의 장기 (long term) 치료를 가능하게 한다. 바람직하게는 FXIII이 농축물에 포함되며, 이는 형성된 피브린의 안정화에 기여하기 때문이지만, 이 트랜스글루타미나아제의 과적 (overload)은 회피된다.
용어 "포함하는" 또는 "포함하다"는 설명의 개시를 변경시키지 않으면서 "이루어진" 또는 "이루어져 있다"로 대체될 수 있다.
이론상, 모든 피브리노겐을 포함하는 소스가 본 발명에 따라 사용될 수 있지만, 동결침전물이 바람직한 소스이며 하기의 본 발명의 제조 방법에 대한 추가적 기술에서 동결침전물이 피브리노겐의 대표적인 소스의 역할을 한다.
일반적으로 동결침전물은 적절한 버퍼 조건, 특히, 약 중성 pH (예를 들면 시트르산 나트륨 및 NaCl를 포함하는 용액 버퍼 중 pH 6.9-7.0)하에서 재구성되거나 (reconstituted) 또는 가용화되고, 흡착, 특히 Al(OH)3에 흡착되며, 결과적으로 수득된 겔은 예를 들면 원심 분리에 의하여 제거된다. 뒤이어 상청액은 예를 들면 용매/세제 (solvent/detergent, S/D) 처리에 의하여 바이러스 불활성화될 수 있다. 이 방법은 통상의 기술자에게 잘 알려져 있으며 본래 EP-A-131　740에 기술되었다. 트리톤 (Triton) (O-[4-(1,1,3,3-테트라메틸부틸) 페녹시]-폴리에톡시에탄올) (O-[4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl) phenoxy]-polyethoxyethanole) 및 TnBP (트리-n-부틸-인산염) (Tri-n-butyl-phosphate) 과 같은 S/D 화합물은 특히 피마자유 (castor oil)를 이용한 추출로 제거된다. 추가적 정제를 위하여 수상 (water-phase)에는 크로마토그래피가 수행될 수 있다. 일반적으로, 이는 수상을 강이온 교환겔, Fractogel®EMD-TMAE와 같은, 매트릭스 물질에 접합된 (grafted) 트리-메틸-아미노-에틸 (tri-methyl-amino-ethyl, TMAE)과 접촉시키는 것에 의해 수행될 수 있다. 6.9 내지 7.1의 pH-값 및 570 내지 610 mosmol/l의 오스몰 농도를 갖는 버퍼를 이용하여 크로마토그래피가 수행되는 경우, 좋은 결과를 달성할 수 있다. 이러한 조건하에서 피브리노겐은 고정상에 결합되지 않고 이에 따라 통과액 또는 상청액에서 발견되며, 배치-크로마토그래피 과정이 수행되는 경우 후자에서 발견된다.
일반적으로 약 40 g/l (클라우스의 비탁법 (Clauss' turbidometric method))를 포함하는, 결합되지 않은 피브리노겐 용액은 pH=7.0 내지 8.0로, 특히 pH=7.3 내지 7.5로 조정된다. 적절한 침전제, 예를 들면 글리신을 0.8 내지 1.2 M, 특히 0.9 내지 1.1M 농도로 첨가한 후, 결과적으로 수득된 용액은 피브리노겐을 침전시키기 위하여 60 내지 120 분 동안 교반 (stir)시킬 수 있다. 뒤이어 피브리노겐 포함 침전물을 원심분리로 분리할 수 있고, 이 중간 피브리노겐 페이스트는 -70 ℃ 이하, 바람직하게는 - 100 ℃ 내지 - 70 ℃에서, 최대 한 달 동안 보관될 수 있다. 예를 들면 글리신을 이용한 단일 침전은 이미 후속 처리를 위해 충분히 순수한 피브리노겐 페이스트를 제공한다.
이에 따라 제조된 중간체는 10 내지 30 mM 트리스 버퍼 (pH=7.5 내지 8.5), 특히 pH=7.5 내지 8.5의 15 내지 25 mM 트리스 버퍼에 재현탁시킬 수 있다. 수득된 현탁액을 뒤이어 여과시킬 수 있고, 예를 들면 현탁액 용량 (suspension volume)의 5배 부피의 동일하거나 상이한 버퍼로 초미세/정용여과를 수행할 수 있다.
결과적으로 수득된 피브리노겐 포함 용액은 뒤이어 강 음이온 교환겔 바람직하게는, 매트릭스에 접합된 리간드로서 3차 또는 4차 아미노기의 그룹으로부터 선택된 강 음이온-교환 겔 상에 로딩된다. 작용기는 잘 알려진 디에틸-아미노-에틸 (diethyl-amino-ethyl, DEAE), 트리-메틸-아미노 (tri-methy-amino), 트리-메틸-아미노-에틸 (tri-methyl-amino-ethyl, TMAE) 및 기타 그룹으로부터 선택된 것인 반면 캐리어 물질은 셀룰로스, 아가로스, 실리카, 중합체 또는 세라믹 물질로 구성될 수 있다. GigaCap Q-650®과 같이, 연결기 (linking group)를 통하여 히드록실화 메타크릴 중합체 (hydroxylated methacrylic polymer)에 접합된 트리메틸-아미노기를 이용하여, 특히 피브로넥틴 및 비트로넥틴의 감소에서, 좋은 결과가 달성될 수 있다. 화학적으로 유사한 Marco-Prep High Q®, 트리메틸-아미노 리간드를 포함하지만 중합체 백본 (polymeric backbone)에 히드록실 작용기 (hydroxyl functionality)가 없는, 디에틸렌-글리콜-디메타크릴레이트/글리시딜-메타크릴레이트로 구성된 메타크릴계 공중합체가 상기 두 단백질의 감소에 덜 효과적이기 때문에, 이는 매우 놀랍다. 막힘이 감소됨에 따라 필터의 수명이 증가하기 때문에, 끈적이는 피브로넥틴의 효과적인 감소는 초미세/정용여과 또는 나노여과와 같은, 선택적인 여과에 매우 유리하다. 방법이 나노여과를 포함하도록 의도되는 경우, 희석된 용액 (약 2 g/l의 피브리노겐 농도), 특히 나노필터의 케스케이드를 이용하여 이 방법을 수행하는 것이 바람직하다. 크로마토그래피 겔 또는 수지는 피브리노겐 용액을 적용하기 전에 중간 피브리노겐 페이스트의 재현탁에 사용한 것과 동일한 버퍼를 이용하여 특히 선평형화 (preequilibrate)된다. 느슨하게 결합된 물질은 평형화 버퍼 및 뒤이은 세척 버퍼 (1.5 g /l 시트르산 나트륨, 6.0 g /l 염화나트륨, pH=6.8 내지 7.2, 바람직하게는 6.9 내지 7.1로 조정되고, 20 내지 25 ℃의 실온에서 11.0 내지 13.0 mS/cm의 전도도를 가짐)에 의하여 세척되었다.
뒤이어, 1.5 g/l 시트르산 나트륨, 및 10.0 g/l 글리신을 포함하는 용출 버퍼 예를 들면 특히 HCl 및/또는 NaOH를 이용하여 세척 버터와 동일한 pH 범위로 조정되고, 약 7.0 g/l NaCl을 이용하여 20 내지 25 ℃의 실온에서 13.1 내지 15 mS/cm의 전도도로 조정된 용출버퍼에 의해 피브리노겐은 크로마토그래피 컬럼으로부터 용출시킬 수 있다. 컬럼에 적용된 피브리노겐의 약 74 %는 용출액 중 회수되는 반면, 피브로넥틴은 피브리노겐 포함 용출액으로부터 거의 완전히 제거된다.
이 여과된 피브리노겐 용액은 초미세/정용여과를 이용하여 약 20 내지 26 g/l로 더욱 농축될 수 있고, 0.2 ㎛ 이하의 공칭 (nominal) 공극 크기의 막을 이용하여 무균여과될 수 있다. 1 내지 19.9 g/l 또는 26.01 내지 30 g/l, 또는 더 높은 것과 같은 기타 농도도 달성 가능하다는 것은 통상의 기술자에게 주지하다. 또한 본 발명의 피브리노겐 농축물은 탄수화물, 예를 들면 수크로스, 트레할로스, 아미노산, 예를 들면 글리신, 히스티딘, 알라닌, 아르기닌 및 세제, 예를 들면 폴리옥시에틸렌-(20)-소르비탄-모노올리에이트 (TWEEN 80®)와 같이 통상의 기술자에게 공지된 보조제 (adjuvant) 및 안정화제 (stabiliser)와 함께 제제화될 수 있다. 이 무균여과된 벌크 (bulk)는 2차로 무균 여과되기 전에, 선택적으로 -70 ℃ 또는 더 낮은 온도, 특히 -70 ℃ 내지 -80 ℃에서 최대 5일간 보관되며, 최종 용기에 충진되고 선택적으로 동결 건조되거나, 제2 무균 여과 없이 최종 용기에 즉시 충진되고 선택적으로 동결 건조될 수 있다.
추가적인 버퍼, 안정화제, 보조제 또는 응고 인자 XIII (F XIII)과 같은 기타 화합물을 첨가하는 것은 필수적이지 않다. 응고 인자 XIII은 농축물 내에 피브리노겐 mg 당 0.05 IU 이상 (클라우스 방법), 특히 피브리노겐 mg 당 0.07 내지 0.3 IU, 피브리노겐 mg 당 0.06 내지 0.5 IU, 또는 피브리노겐 mg 당 0.05 내지 1 IU의 활성으로 존재한다.
본 방법에 따른 생산된 피브리노겐 농축물은 0.80 내지 1.10, 특히 0.85 내지 1.05, 또는 0.90 내지 1.00의 피브리노겐-항원/피브리노겐-클라우스 관계; 피브리노겐 mg 당 0.01 내지 9.0 ng, 특히 피브리노겐 mg 당 0.05 내지 8.0 ng 또는 피브리노겐 mg 당 0.08 내지 6.0 ng의 피브리노펩티드-A 함량 (content) (클라우스 방법); 피브리노겐 mg 당 0.1 IU 미만, 특히 피브리노겐 mg 당 0.001 내지 0.09 IU, 피브리노겐 mg 당 0.002 내지 0.07 IU, 또는 피브리노겐 mg 당 0.002 내지 0.04 IU의 VWF:Ag 활성 (클라우스 방법); 피브리노겐 mg 당 0.07 IU 이상, 특히 피브리노겐 mg 당 0.07 내지 0.3 IU, 피브리노겐 mg 당 0.08 내지 0.5 IU, 또는 피브리노겐 mg 당 0.07 내지 1 IU의 인자 XIII의 활성 (클라우스 방법); 피브리노겐 mg 당 0.01 내지 1.00 ㎍ 피브로넥틴 함량, 특히 피브리노겐 mg 당 0.03 내지 0.70 ㎍ 또는 피브리노겐 mg 당 0.05 내지 0.40 ㎍의 피브로넥틴 함량 (클라우스 방법); 및 피브리노겐 mg 당 1 내지 11 mIU의 플라스미노겐 (plasminogen) 활성을 통하여 그의 원형성 (nativity)을 나타낸다. 트롬빈 활성은 표 1에 나타난 바와 같이 동일한 피브리노겐 농도 및 모든 시행 (run)에서 0.15 IU/ml의 검출가능 한계보다 더 낮은 것으로 결정되었고, 이는 피브리노겐 mg 당 0.007 IU 보다 더 낮거나 0.0069 내지 0.0001 IU/mg에 상당하다.
본 발명은 하기의 비-한정적인 실시예에 의하여 더 설명된다.
실시예
확립된 방법을 이용하여 혈장으로부터 생성한, 동결침전물을 약 중성 pH에서 재구성하거나 또는 가용화하고, Al(OH)3 를 이용하여 흡착시켰으며, 결과적으로 수득된 겔은 원심분리로 제거하였다. 상청액을 용매/세제 (solvent/detergent, S/D) 처리로 바이러스 불활성화시켰다. S/D 화합물, 트리톤 (Triton) 및 TnBP를 식물성 오일을 이용하여 추출하고, 수상 (water-phase)을 Fractogel® EMD-TMAE와 접촉시켰다. 피브리노겐이 겔에 결합하지 않고 따라서 통과액 또는 상청액에서 발견되는 크로마토그래피 조건 (6.9 내지 7.1의 pH-값 및 570 내지 610 mosmol/l의 오스몰 농도)을 이용하였다.
피브리노겐의 침전을 위하여 결합되지 않은 피브리노겐의 용액을 글리신 (1 mol/l 최종 농도 및 pH=7.4) 첨가 후 약 90 분 동안 교반하였다. 뒤이어 피브리노겐 포함 침전물은 원심분리를 이용하여 분리시키고, 중간 피브리노겐 페이스트를 수득하였다.
이렇게 제조된 중간체를 20 mM 트리스 버퍼 (pH= 약 8.0)에 재현탁시켰다. 뒤이어 수득된 현탁액을 여과시키고 초미세/정용여과를 수행하였다.
뒤이어 결과적으로 수득된 피브리노겐 포함 용액을 GigaCap Q-650M®에 로딩시키고, 피브리노겐 용액의 적용 전 재현탁에 이용한 것과 동일한 트리스 버퍼로 크로마토그래피 겔 또는 수지를 선평형화 (preequilibrate)시켰다. 느슨하게 결합된 물질을 평형화 퍼버를 이용하여 세척하고, 뒤이어 세척 버퍼 (1.5 g/l 시트르산 나트륨, 6.0 g/l 염화나트륨, 약 pH=7.0 및 약 12.0 mS/cm의 전도도로 조정함)로 세척하였다. 뒤이어 피브리노겐을 용출 버퍼 (1.5 g/l 시트르산 나트륨, 및 10.0 g/l 글리신, 세척 버퍼와 동일한 pH로 조정하고, 약 7.0 g/l NaCl를 이용하여 13.1 내지 15 mS/cm의 전도도로 조정함)를 이용하여 크로마토그래피 컬럼으로부터 용출시켰다.
결과적으로 수득된 피브리노겐 용액을 농축시키고, 제제화하며 및 무균 여과시켰다. 이 무균 여과된 벌크를 2차 무균 여과 전에 -80 ℃에서 5일 동안 보관하고 최종 용기에 충진시켰다. 최종 컨테이너의 일부분은 동결 건조시키는 반면, 나머지 부분은 액체 제제로 보존하였다.
동결 건조된 생산물의 재구성 후 4개의 상이한 생산 시행 (production run)의 생산물을 분석하였다. 동결건조물의 재구성은 동결건조 전 농도까지 주사용수 (water for injection, WFI)의 첨가에 의해 수행하였다. 모든 생산 시행은 실시예에 나타난 것과 본질적으로 동일한 방식으로 수행하였다. 결과는 표 1에 나타낸다.
Figure pct00001
표 2는 클라우스 방법에 의해 결정된, 피브리노겐 mg 당 함량 또는 활성의 산출에 의한 측정된 값의 정규화를 나타낸다.
Figure pct00002
상용 생산물과의 비교.
표 3은 상용 피브리노겐 농축물의 측정된 값을 표시한다. 모든 생산물은 동결건조된 생산물이며 제조사의 가이드라인에 따라서 재구성하였다. 이미 표 1에 나타낸 본 발명에 따른 시행 1 내지 4의 값의 범위도 나타낸다.
Figure pct00003
표 4는 클라우스 방법에 의하여 결정된, 피브리노겐 mg 당 함량 또는 활성의 산출에 의한 상용 생산물의 측정된 값의 정규화를 나타낸다. 이미 표 2에 나타낸 본 발명에 따른 시행 1 내지 4의 값의 범위도 나타낸다.
Figure pct00004
WO 01/48016의 바람직한 구체예와의 비교.
1 g의 분획 I 페이스트를 8.33g의 추출 버퍼 (0.8 M NaCl, 5 mM ε-ACA (epsilon-aminocaproic acid), 20 mM Na-시트레이트, 60 IU/ml 헤파린 및 pH=7.3, 즉 단락 1.1.19의 개선된 버퍼)를 이용하여 37 ℃에서 2시간 동안 추출하였다. 50 g의 2 % 알류미늄 수산화물 (알히드로겔 (alhydrogel)) 용액을 추출물의 상청액에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 15분간 교반하고, 5000 g에서 10분간 원심분리하고 펠릿 (pellet)을 제거했다. 알히드로겔 상청액 및 글리신/NaCl 버퍼 (2.1 M 글리신, 20 mM Na-시트레이트, 3.6 M NaCl 및 2.4 mM CaCl2)를 각각 30.2 ℃ 및 29.7 ℃가 되게 하고 상청액을 버퍼에 4.5 분 내에 첨가하였다. 1 부분 (part) 상청액과 2.05 부분 버퍼의 혼합물을 30.2 내지 31.1 ℃에서 20분간 교반하고 뒤이어 5000 g에서 10 분간 원심분리하였다. Gly/NaCl-침전물을 분획 1 페이스트 추출물의 상청액 용량의 1/3에 해당하는 버퍼 D로 약 21 ℃에서 2시간 동안의 연속적인 교반으로 재가용화시켰다. 재가용화된 침전물을 뒤이어 1 % 폴리소르베이트 80 (Polysorbate 80) 및 0.3 % TnBP의 농도로 1시간 동안 약 23 ℃에서 폴리소르베이트 80 및 TnBP를 이용하여 S/D 처리하였다. 음이온 교환 크로마토그래피는 약 100 ml의 컬럼 용량에 해당하는 약 20 cm의 베드 높이로 XK26 컬럼 중 MacroPrep®HQ 수지를 이용하여 10 ml/분의 유속 (flow rate)으로 수행하였다. 개선된 MQ 버퍼 (pH=8.0의 50 mM 트리스, 100 mM NaCl, 20mM ε-ACA, 단락 2.2.3)의 2 컬럼 용량을 이용하여 평형화를 수행하고, MQ 버퍼의 주어진 경계 +-10 %의 전도도에 도달하였다. MQ 버퍼의 6 컬럼 용량으로의 세척 후, 피브리노겐를 개선된 버퍼 ME (pH=7.0에서 500 mM NaCl, 1.1 mM CaCl2, 10 mM Na-시트레이트, 10mM 트리스 및 45 mM 수크로스 즉, 버퍼 D + 2×200 mM NaCl)를 이용하여 단일 피크로 용출시켰다.
분석 결과를 표 5에 나타낸다.
Figure pct00005

Claims (20)

  1. 음이온 교환 수지에서의 크로마토그래피를 이용한 피브리노겐을 포함하는 소스 (source)로부터 피브리노겐을 정제하는 방법으로서, 상기 음이온 교환 수지는 접합된 3차 또는 4차 아미노기를 갖는 히드록실화 중합체를 포함하는 지지 물질로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 지지 물질은 셀룰로스, 아가로스, 실리카, 중합체 또는 세라믹 물질로 구성된 것인 방법.
  3. 청구항 1 내지 2 중 어느 한 항에 있어서, 상기 음이온-교환 수지는 GigaCap Q-650M®과 같이, 연결기 (linking group)를 통하여 히드록실화 메타크릴 중합체 (hydroxylated methacrylic polymer)에 접합된 트리메틸-아미노기인 것인 방법.
  4. 청구항 1 내지 3 중 하나 이상의 항에 있어서, 상기 피브리노겐을 포함하는 소스는 바람직하게는 약 중성 pH에서 가용화된, 동결침전물 (cryoprecipitate)인 것인 방법.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 용액은 Al(OH)3로 처리되고 결과적으로 수득된 겔은 제거되는 것인 방법.
  6. 청구항 4 또는 5에 있어서, 용매/세제 (solvent/detergent, S/D) 처리를 이용하여 바이러스 불활성화가 수행되는 것인 방법.
  7. 청구항 6에 있어서, 식물성 오일을 이용한 S/D 시약의 추출 및 6.9 내지 7.1의 pH-값 및 570 내지 610 mosmol/l의 오스몰농도에서 TMAE 수지와 수상 (water-phase)의 접촉이 수행되는 것인 방법.
  8. 청구항 6 또는 7에 있어서, 피브리노겐은 글리신, 특히 약 1 M 글리신으로 침전시키고, 형성된 피브리노겐 페이스트 (paste)를 분리하는 것인 방법.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 피브리노겐 페이스트는, 바람직하게는 약 8.0의 pH에서 약 20 mM 트리스 (TRIS) 버퍼에 재현탁 시키는 것인 방법.
  10. 청구항 9에 있어서, 여과 후, 수득된 분획을 연결기를 통하여 히드록실화 메타크릴 중합체 백본 (backbone)에 접합된 트리메틸-아미노기를 포함하는 강 음이온 교환 수지에 로딩하고 느슨히 결합된 물질은, 바람직하게는 약 12.0 mS/cm 전도도의 세척 버퍼로 세척하여 제거하는 것인 방법.
  11. 청구항 10에 있어서, 피브리노겐은 특히 약 7.0의 pH 및 13.1 내지 15 mS/cm 전도도로 조정된, 시트르산 나트륨, 염화나트륨, 및 글리신, 바람직하게는 약 1.5 g/l 시트르산 나트륨, 약 7.0 g/l 염화나트륨 및 약 10.0 g/l 글리신을 포함하는 용출 버퍼에 의해 용출시키는 것인 방법.
  12. 청구항 11에 있어서, 수득된 분획을 농축시키고, 제제화하며, 무균여과 및/또는 충진시키는 것인 방법.
  13. 청구항 12에 있어서, 상기 수득된 분획을 동결건조시키는 것인 방법.
  14. 청구항 1에 있어서, 하기의 단계를 포함하는 것인 방법:
    a) 약 중성 pH에서 가용화된, 동결침전물을 가용화하는 단계,
    b) 수득된 용액을 Al(OH)3를 이용하여 흡착시키고 결과적으로 수득된 겔을 제거하는 단계,
    c) 단계 b)의 결과적으로 수득된 용액을 용매/세제 (S/D) 처리로 바이러스를 불활성화하고, 식물성 오일로 S/D 시약을 추출하며, 6.9 내지 7.1의 pH-값 및 570 내지 610 mosmol/l의 오스몰 농도에서 TMAE 수지와 수상을 접촉시키는 단계,
    d) 단계 c)의 통과액 (flow-through) 또는 상청액에서 발견된 피브리노겐을, 약 1 M 글리신으로 침전시키고, 피브리노겐 페이스트를 분리하는 단계,
    e) 상기 피브리노겐 페이스트를 약 8.0의 pH에서 20 mM 트리스 버퍼에 재현탁시키고 여과하는 단계 및,
    f) 단계 e)의 여과된 용액을 연결기 (linking group)를 통하여 히드록실화된 메타크릴 중합체 백본에 접합된 트리메틸-아미노기를 포함하는 강 음이온 교환 수지에 로딩하고 느슨하게 결합된 물질을 약 12.0 mS/cm 의 전도도의 세척 버퍼로 세척하여 제거하는 단계,
    g) 피브리노겐을 특히 약 7.0의 pH 및 13.1 내지 15 mS/cm 전도도로 조정된, 약 1.5 g/l 시트르산 나트륨, 약 7.0 g/l 염화나트륨 및 약 10.0 g/l 글리신을 포함하는 용출 버퍼를 이용하여 용출하는 단계,
    h) 농축, 제제화, 무균여과 및 충진하는 단계.
  15. 청구항 1 내지 14 중 어느 한 항에 따라 수득 가능한 피브리노겐 생산물.
  16. 청구항 15에 있어서, 하기의 단계를 포함하는 단계로 수득 가능한 피브리노겐 mg당 0.01-1.00 ㎍의 피브로넥틴 함량을 갖는 것인 피브리노겐 생산물:
    a) 약 중성 pH에서 가용화된, 동결침전물을 가용화하는 단계,
    b) 용액을 Al(OH)3를 이용하여 흡착시키고 결과적으로 수득된 겔을 제거하는 단계,
    c) 단계 b)의 결과적으로 수득된 용액을 트리톤 (Triton) 및 TnBP를 이용한 용매/세제 (S/D) 처리로 바이러스를 불활성화하고, 식물성 오일로 S/D 시약을 추출하며, 6.9 내지 7.1의 pH-값 및 570 내지 610 mosmol/l의 오스몰 농도에서 TMAE 수지와 수상을 접촉시키는 단계,
    d) 단계 c)의 통과액 또는 상청액에서 발견되는 피브리노겐을, 1 M 글리신으로 침전시키고, 피브리노겐 페이스트를 분리하는 단계,
    e) 상기 피브리노겐 페이스트를 약 8.0의 pH에서 20 mM 트리스 버퍼에 재현탁시키고 여과하는 단계 및,
    f) 단계 e)의 여과된 용액을 연결기 (linking group)를 통하여 히드록실화 메타크릴 중합체 백본에 접합된 트리메틸-아미노기를 포함하는 강 음이온 교환 수지에 로딩하고 느슨하게 결합된 물질을 약 12.0 mS/cm 의 전도도의 세척 버퍼로 세척하여 제거하는 단계,
    g) 피브리노겐을 특히 약 7.0의 pH 및 13.1 내지 15 mS/cm 전도도로 조정된, 약 1.5 g/l 시트르산 나트륨, 약 7.0 g/l 염화나트륨 및 약 10.0 g/l 글리신을 포함하는 용출 버퍼를 이용하여 용출하는 단계,
    h) 농축, 제제화, 무균여과 및 충진하는 단계.
  17. 청구항 15 또는 16에 있어서, 피브리노펩티드-A의 함량은 0.01 내지 9.0 ng/mg 피브리노겐이고, VWF:Ag 활성은 0.1 IU/mg 피브리노겐 미만이며, 인자 XIII 활성은 0.07 내지 1 IU/mg 피브리노겐이거나 또는 트롬빈 활성은 0.007 IU/mg 피브리노겐 미만인 것인 피브리노겐 생산물.
  18. 청구항 15 내지 17 중 하나 이상의 항에 있어서, 하기의 특성을 갖는 것인 피브리노겐 생산물:
    Figure pct00006
  19. 청구항 15 내지 18 중 하나 이상의 항에 있어서, 동결건조된 상태인 것을 특징으로 하는 피브리노겐.
  20. 청구항 1 내지 14 중 하나 이상의 항의 방법에서의 청구항 15 내지 19 중 하나 이상 항의 피브리노겐 생산물의 정제 또는 제조를 위한, 3차 또는 4차 아미노기가 접합된 히드록실화된 중합체 백본을 포함하는 지지 물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 음이온 교환 수지의 용도.
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