CZ277939B6 - Process for preparing stable concentrate of a complex factor viii-von willebrand factor exhibiting high specific activity - Google Patents

Description

Vynález se týká způsobu přípravy koncentrátu komplexu faktor VIII-von Willebrandův faktor, mající vysokou specifickou aktivitu, z celkové krevní plasmy.

Běžně praktikované léčení hemofilie A injekcí faktoru VIII vyžaduje použití preparátů vysoké čistoty. Uvedená vysoká čistota je nezbytná jednak vzhledem k tomu, aby bylo pokud možno redukováno riziko kontaminace viry, neboť tyto injekce se často opakují, a jednak k tomu, že reziduální kontaminující látky by mohly vyvolat nežádoucí imunologickou odezvu nebezpečnou pro pacienta.

Ve střediscích pro zpracování lidské plasmy bylo pro čištění faktoru VIII již použito několik metod. Základem těchto metod je vysrá?ení kontaminujících proteinů za použití různých chemických činidel, gelová permeační chromatografie, imunoafinitní chromatografie, iontoměničová chromatografie a různé kombinace těchto metod.

Jestliže je však v plasmě přítomno pouze malé množství faktoru VIII, potom je hlavním problémem výtěžek čistícího procesu. Kromě toho je faktor VIII nestabilním proteinem, který může být aktivován ostatními krevními faktory; nicméně faktor VIII v aktivované formě ztrácí svou terapeutickou hodnotu. Čisticí proces a finální dávkování musí být tedy přizpůsobeny také k vyřešení tohoto problému..

Přihlašovatel již vyvinul čisticí proces, který využívá k čištění faktoru VIII iontoměničovou chromatografii a který je popsán ve francouzské přihlášce vynálezu 88 07530. Tento čisticí proces umožňuje získání faktoru VIII s vysokou čistotou.

Nicméně při tomto čisticím procesu se jako výchozího materiálu, stejně jako při procesech používaných jinými producenty, používá kryoprecipitované frakce plasmy. Tento kryoprecipitační stupeň má však za následek ztrátu 30 až 40 % faktoru VIII, který zůstává v supernatantu.

Bylo by tedy velmi výhodné vyvinout způsob přípravy koncentrátu komplexu faktor VIII-von Willebrandův faktor z celkové nekryoprecipitované plasmy, čímž by se snížily ztráty faktoru VIII, ke kterým jinak při čisticím procesu dochází. Tento způsob by dále měl být dosti jednoduchý, aby bylo umožněno jeho použití i ve střediscích pro zpracování lidské plasmy, která nejsou adekvátně vybavena pro zpracování plasmy kryoprecipitací.

Vzhledem k výše uvedeným požadavkům byl přihlašovatelem vyvinut jednoduchý způsob čištění faktoru VIII z celkové plasmy, který umožňuje získat velmi stabilní koncentrát faktoru VIII s vysokou čistotou a ve velmi dobrém výtěžku.

Předmětem vynálezu je způsob přípravy stabilního koncentrátu komplexu faktor VIII-von Willebrandův faktor majícího vysokou specifickou aktivitu, z celkové plasmy, jehož podstata spočívá v tom, že se celková plasma předčistí působením chloridu barnatého a hydroxidu hlinitého, načež se čistí na aniontoměničovém gelu umožňujícím retenci velmi velkých molekul.

Způsob podle vynálezu je dále výhodně charakterizován tím, že se jako celková plasma použije čerstvá nebo zmražená plasma.

Způsob podle vynálezu je dále výhodně charakterizován tím, že se k plasmě přidá stabilizující směs obsahující 0,2 až 2 U/ml heparinu, 1 až 6 mM EDTA a 1 až 10 mM chloridu vápenatého.

Způsob podle vynálezu je dále výhodně charakterizován tím, že stabilizační směs dále obsahuje glukózu v koncentraci 5 až 60 g/1.

Způsob podle vynálezu je dále výhodně charakterizován tím, že předčištění zahrnuje:

a) srážení chloridem barnatým, odstředění vysrážené směsi a izolaci supernatantu,

b) adsorpci na gelu hydroxidu hlinitého, odstředění za chladu a izolaci supernatantu a

c) odsolení.

Způsob podle vynálezu je dále výhodně charakterizován tím, že srážení chloridem barnatým se provádí přidáním za míchání 1 M roztoku chloridu barnatého při hodnotě pH 6,5, načež se vysrážená směs odstředí při teplotě 5 až 10 ’C a supernatant se oddělí.

Způsob podle vynálezu je dále výhodně charakterizován tím, že se adsorpce na gelu hydroxidu hlinitého provádí za použití 3% gelu hydroxidu hlinitého při hodnotě 6,5, načež se získaná směs rychle ochladí na teplotu 5 °C, odstředí se při teplotě 5 °C a supernatant se oddělí.

Způsob podle vynálezu je dále výhodně charakterizován tím, že se odsolení provádí ultrafiltrací v přítomnosti nosného pufru pro následující chromatografický stupeň, ke kterému byl přidán heparin.

Způsob podle vynálezu je dále výhodně charakterizován tím, že se odsolení provádí chromatograficky na sloupci Sephadexu G 25 za použití nosného pufru pro následující chromatografický stupeň, ke kterému byl přidán heparin.

Způsob podle některého z předcházejících znaků je dále výhodně charakterizován tím, že supernant plasmy, který byl předčištěn, se injikuje na chromatografický sloupec, obsahující aniontoměničovou pryskyřici, která má schoopnost retence velmi velkých molekul a která umožňuje přechod fibrinogenu, albuminu, imunoglobulinů, antithrombinu III a fibronektinu do filtrátu.

Způsob podle vynálezu je dále výhodně charakterizován tím, že se jako chromatografická pryskyřice použije pryskyřice vinylového typu (vinylový polymer), na které jsou fixovány skupiny typu DEAE, T-MAE nebo D-MAE.

Způsob podle vynálezu je dále výhodně charakterizován tím, že se jako polymerní gel použije Fractogel.

Způsob podle vynálezu je dále výhodné charakterizován tím, že se jako nosný pufr pro chromatografický sloupec použije pufr

CZ 277'939 B6 na bázi citranu sodného a chloridu vápenatého obsahující glycin a lysin, ke kterému bylo přidáno 0,11 M chloridu sodného a který byl nastaven na hodnotu pH 7.

Způsob podle vynálezu je dále výhodně charakterizován tím, že pufr obsahuje 8 až 11 g/1 glycinu a 2 až 4 g/1 lysinu.

Způsob podle vynálezu je dále výhodně charakterizován tím, že iontová síla pufru se za účelem desorpce komplexu faktor VIII-von Willebrandův faktor z chromatografického sloupce zvýší na 0,27 M chloridu sodného.

Způsob podle vynálezu je dále výhodně charakterizován tím, že se iontová síla pufru zvýší na 0,13 M chloridu sodného, čímž se dosáhne eliminace fibronektinu, načež se iontová síla pufru zvýší za účelem desorpce komplexu faktor VIII-von Willebrandův faktor z chromatografického sloupce na 0,27 M chloridu sodného.

Způsob podle vynálezu je dále výhodně charakterizován tím, že komplex faktor VIII-von Willebrandův faktor, který byl desorbován z chromatografického sloupce, se podrobí dodatečnému čisticímu a koncentračnímu stupni, který se provádí chromatograf íčky.

Způsob podle vynálezu je dále výhodně charakterizován tím, že se dodatečný chromatografický čisticí a koncentrační stupeň provádí na iontoměničové pryskyřici zvolené ze skupiny zahrnující DEAE- nebo T/D-MAE-Fractogel, imobilizovaný amino-hexyl, imobilizovaný heparin, dextransulfát, sulfopropyl nebo afinitní nebo imunoakfinitní pryskyřici.

Způsob podle vynálezu je dále výhodně charakterizován tím, že se dodatečný chromatografický čisticí a koncentrační stupeň provádí za použití pufru nastaveného na 0,11 M chloridu sodného a že zahrnuje 2 následná zvýšení iontové síly na 0,13 M a potom na 0,27 M chloridu sodného.

Způsob podle vynálezu je dále výhodně charakterizován tím, že dodatečný chromatografický čisticí a koncentrační stupeň se provádí za použití pufru nastaveného na 0,17 M chloridu sodného a že zahrnuje jediné zvýšení iontové síly na 0,27 M chloridu sodného.

Způsob podle vynálezu je dále výhodně charakterizován tím, že se před libovolným z chromatografických stupňů provede konvenční inaktivace virů za použití techniky rozpouštědlo-detergent.

Předmětem vynálezu je rovněž koncentrát komplexu faktor VIII-von Willebrandův faktor, jehož podstata spočívá v tom, že byl získán výše uvedeným způsobem podle vynálezu.

Předmětem vynálezu je rovněž výše uvedený koncentrát, který je formulován pro terapeutické použití.

Vzhledem k výše uvedenému se vynález týká způsobu přípravy koncentrátu faktoru VIII z celkové plasmy. Tento způsob zahrnuje předčištění, prováděné za účelem odstranění složek prothrombinového komplexu (faktory II, VII, IX, X), a čištění aniontoměničovou chromatografií, při které se volbou iontoměničového gelu a elučního pufru dosáhne získání komplexů faktor VIII-νοη Willebrandův faktor vysoké čistoty.

Tento způsob může být rovněž použit po zařazení dalšího čisticího stupně k získání vyčištěných roztoků i ostatních plasmových proteinů, jakými jsou zejména fibrinogen, fibronektin, albumin, imunoglobuliny a antithrombin III.

Způsob podle vynálezu byl vyvinut pro lidskou plasmu, ale může být rovněž použit pro plasmu zvířecího původu.

Způsob podle vynálezu tedy umožňuje použít při čisticím procesu jako výchozí materiál celkovou plasmu, tzn. plasmu, která je buď čerstvá nebo která byla za účelem konzervace zmražena, a nikoliv kryoprecipitovanou plasmu. S výhodou byla tato plasma izolována v přítomnosti antikoagulačního nebo stabilizačního roztoku. Obvykle se k tomuto účelu používá citráto-dextros-fosfátová směs; je však možné s výhodou přidat k uvedené směsi ještě libovolný jiný vhodný stabilizátor faktoru VIII anebo tímto stabilizátorem uvedenou směs nahradit.

Jako stabilizační roztok pro výchozí plasmový materiál může být s výhodou použita směs 0,2 až 2 U/ml heparinu, 1 až 5 mM EDTA a 1 až 10 mM chloridu vápenatého; tato směs může případně obsahovat glukózu v koncentraci od 5 do 60 g/1.

Způsob podle vynálezu obsahuje první předčisticí stupeň, při kterém je srážení chloridem vápenatým kombinováno s adsorpcí na gelu hydroxidu hlinitého.

Uvedené zpracování chloridem barnatým se výhodně provádí s plasmou, jejíž hodnota pH byla nastavena na 6,5, tak, že se k ní přidá 1 M roztok chloridu barnatého až k dosažení konečné koncentrace chloridu barnatého 0,08 M. Tento přídavek chloridu barnatého se provádí za míchání. Vysrážená plasma se potom odstředí při teplotě 5 až 10 ’C za účelem oddělení vysrážených proteinů, načež se oddělí supernatant. Uvedené vysrážené proteiny mohou být s výhodou použity pro přípravu prothrombinového komplexu nebo jeho složek.

Výše uvedeným způsobem získaný supernatant se potom uvede do styku s 3% gelem hydroxidu hlinitého při hodnotě pH 6,5. Gel hydroxidu hlinitého adsorbuje reziduální kontaminující proteiny. Rezultující směs se potom ochladí v kryostatu a odstředí při teplotě 5 C. Supernatant se oddělí a uchová se při teplotě 5 až 8 °C.

Uvedený supernatant se potom odsolí, což může být provedeno buď ultrafiltrací v přítomnosti nosného pufru pro následující chromatografický stupeň, ke kterému bylo přidáno 0,5 až 2 U/ml heparinu, anebo chromatografíčky na Sephadexu G25 za použití téhož nosného pufru.

Způsob podle vynálezu potom zahrnuje separaci aniontoměničovou chromatografií. Přihlašovatel již ve francouzské patentové přihlášce 88 07530 popsal výhody, které zjistil pro tento účel u určitého typu pryskyřice mající nízkou iontoměnnou účinnost a veliké póry a umožňující tak retenci velmi velkých molekul. Taková prolongovaná retence umožňuje vytvoření slabých hydrofobnlch vazeb s pryskyřicí a specifická volba iontové síly pufru zase umožní selektivní desorpci fixovaných molekul.

Pryskyřice tohoto typu jsou’ komerčně dostupné pod označením Fractogel. K danému účelu mohou být použity DEAE-Fractogel 650 a T- nebo D-MAE-Fractogel (vyráběný formou komerčně dostupných produktů firmou Měrek. Tyto pryskyřice jsou obvykle dodávány ve formě, která je dodavatelem označena jako pryskyřice tykadlového typu (tentacular type resins). Struktura těchto pryskyřic je modifikována tak, aby bylo dosaženo zvětšení povrchu pro fixování pozitivních nábojů, což může příznivě ovlivnit zvýšenou kapacitu gelu.

Nosným pufrem pro chromatografický sloupec pufr na bázi citranu sodného a chloridu sodného nastavený na hodnotu pH 7. Tento nosný pufr s výhodou obsahuje chlorid vápenatý v koncentraci 0,5 až 6 mM, lysin v koncentraci asi 2 až 4 g/1 a glycin v koncentraci 8 až 11 g/1. V rámci vynálezu bude koncentrace chloridu sodného zvyšována předem stanoveným způsobem.

Při .způsobu podle vynálezu se tedy výše uvedeným způsobem předčištěný preparát injikuje na chromatografický sloupec. Za definovaných podmínek (0,11 M chlorid sodný) fixuje uvedený chromatografický sloupec velmi velké molekuly, jakými jsou molekuly komplexu faktor VIII-νοη Willebrandův faktor, a umožní aby fibrinogen, albumin, imunoglobuliny, antithrombin III a fibronektin opouštěly chromatografický sloupec ve filtrátu.

Při výhodné provedení způsobu podle vynálezu, které je zaměřeno na dosažení optimální účinnosti izolace faktoru VIII, se iontová síla pufru použitého pro eluci chromatografického sloupce zvyšuje pouze jednou a to na koncentraci 0,27 M chloridu sodného. Podle dalšího výhodného provedení způsobu podle vynálezu se tento eluční stupeň provádí až po předběžném zvýšení iontové síly na 0,13 chloridu sodného. Tímto opatřením se dosáhne předběžného odvedení fibronektinu z chromatografického sloupce.

Komplex faktor VIII-νοη Willebrandův faktor, který byl desorbován a eluován za těchto podmínek, má specifickou aktivitu alespoň rovnou 5 až 10 U/mg. Celkový výtěžek čisticího procesu je alespoň rovný 350 U/litr výchozí plasmy a může být roven alespoň 5Q0 U/litr v případě, kdy se k výchozí plasmě přid? výše popsaná stabilizační směs.

V závislosti na předpokládaném použití roztoku komplexu faktor VIII-νοη Willebrandův faktor může být tento roztok dále podroben dodatečnému čisticímu a zejména koncentračnímu stupni dalším chromatografickým zpracováním. Toto chromatografické zpracování může být stejně jako předcházející chromatografické zpracování provedeno za použití pryskyřic typů DEAE- nebo

T/D-MAE-Fractogel nebo jiných pryskyřic; v tomto případě mohou být použity i jiné separační nosiče, jakými jsou například dextransulfát, imobilizovaný amino-hexyl, imobilizovaný heparin, nebo sulfopropylové pryskyřice a afinitní nebo imunoafinitní pryskyřice.

Uvedený dodatečný chromatografický stupeň se provádí za použití stejného bázického pufru, jaký již byl popsán v předcházejícím případě. Při výhodném provedení způsobu podle vynálezu, které je zaměřeno na získání pokud možno co nejkoncentrovanějšího faktoru VIII, se tento dodatečný chromatografický stupeň provádí za již uvedených podmínek, tzn. že se při něm provádí pouze jediný desorpční stupeň zvýšení iontové síly pufru na 0,27 M chloridu sodného. Podle jiného výhodného provedení způsobu podle vynálezu se iontová síla pufru nejprve zvýší na 0,13 M chloridu sodného, čímž se dosáhne desorpce reziduálních kontaminujících proteinů, načež se iontová síla pufru zvýší na 0,27 M chloridu sodného, čímž se izoluje koncentrát komplexu faktor VIII-νοη Willebrandův faktor vysoké čistoty, která má specifickou aktivitu alespoň rovnou 10 až 20 U/mg.

Ostatní proteiny obsažené v uvedeném prvním filtrátu, jakými jsou zejména imunoglobuliny, albumin, antithrombin a fibronektin, mohou být rovněž vyčištěny a koncentrovány za použití konvenčních chromatografických metod.

Způsob podle vynálezu rovněž zahrnuje inaktivaci virů, která se provádí známými technikami. V případě, že se k tomuto účelu použije chemické činidlo, jako například v případě techniky rozpouštědlo-detergent, potom je výhodné takovou inaktivaci virů provádět před některým z chromatografických stupňů. V tomto případě se totiž dosáhne toho, že použité inaktivační chemické činidlo se odstraní společně s chromatografickým filtrátem.

Předmětem vynálezu jsou rovněž koncentráty jak komplexu faktor VIII-νοη Willebrandův faktor, tak i ostatních plasmových proteinů, které byly získány způsobem podle vynálezu.

Tyto koncentráty se potom formulují v souladu se standardy definovanými v lékopisech a mohou být takto použity pro terapeutické účely.

V následující části popisu bude vynález blíže objasněn formou konkrétních příkladů jeho provedení. Tyto příklady mají pouze ilustrativní charakter a vlastní rozsah vynálezu nikterak neomezují.

Příklad 1

V tomto příkladu se použije 250 ml čerstvé plasmy nebo zmražené plasmy, která byla následně rozmražena při teplotě 22 až 25 °C. Tato plasma byla odebrána v přítomnosti antikoagulačního/stabilizačního činidla (například tvořeného citráto-dextroso-fosfátovou směsí) a její hodnota pH byla nastavena na 6,5 kyselinou octovou.

Stupeň a)

Předčištění

K plasmě se přidá 20 ml' 1 M roztoku chloridu barnatého při hodnotě pH 6,5 až k dosažení konečné koncentrace chloridu barnatého 0,08 M. Roztok chloridu barnatého se přidává pomocí peristaltické pumpy rychlostí 4 až 8 ml za minutu a směs se potom míchá při pokojové teplotě po dobu 15 minut.

Dále se směs odstředí při 2 700 otáčkách za minutu a teplotě a “C po dobu 20 minut, načež se supernatant oddělí od sedimentu.

Takto získaný supernatant se potom uvede do styku s gelem hydroxidu hlinitého (Alhydrogel Eurobio se 3 % hydroxidu hlinitého), přičemž se na litr plasmy použije 2,3 g gelu hydroxidu hlinitého. pH se nastaví na hodnotu 6,5 a teplota směsi se sníží v kryostatu na 5 °C. Rezultující směs se potom odstředí při 2 700 otáčkách za minutu a teplotě 5 °C po dobu 20 minut, načež se supernatant od sedimentu oddělí a uchovává se při teplotě 5 °C.

Toto zpracování umožní eliminaci složek prothrombinového komplexu (faktory II, VII, IX a X), které mohou být izolovány a přečištěny známými technikami.

Obzvláště dobrých výsledků může být dosaženo kombinací obou uvedených zpracování (srážení chloridem barnatým a adsorpce na gelu hydroxidu hlinitého). Samotná adsorpce na gelu hydroxidu hlinitého totiž neumožňuje úplnou eliminaci prothrombinu a ostatních složek PPSB. Naopak zase samotné srážení chloridem barnatým ponechává v supernatantu určité množství faktoru X, prothrombinu a především faktoru VII.

Takto izolovaný supernatant se potom odsolí buď ultrafiltrací v přítomnosti nosného pufru pro následující chromatografický stupeň (viz níže), ke kterému bylo přidáno 1 U/ml heparinu, anebo chromatograficky na Sephadexu G25 za použití téhož pufru.

Potom se provede konvenční inaktivace virů technikou rozpouštědlo-detergent po dobu 6 hodin při teplotě 24 °C. Zpracování technikou rozpouštědlo-detergent je popsáno v evropské patentové přihlášce 0 131 740.

Stupeň b)

Chromatografické čištění

Předčištěný dialyzovaný supernatant se podrobí chromatografickému čisticímu stupni. Pro tento chromatografický čisticí stupeň se použije kolona k26/30 (Pharmacia-Upsala Sweden), mající průměr 2,6 cm a užitečnou výšku 30 cm, přičemž tato kolona je do výšky 10 cm naplněna pryskyřicí DEAE-Fractogel-TSK 650 (komerčně dostupná u firmy Měrek).

Nosný pufr pro chromatografickou kolonu a pufr pro rozpuštění vzorku mají následující si ožení: 10 mM citranu sodného, 1 mM chloridu vápenatého, 9 g/1 glycinu, 3 g/1 lysinu.

K tomuto pufru se přidá chlorid sodný k dosažení jeho finální koncentrace 0,11 M a pH 7.

Vzorek se potom injikuje na chromatografický sloupec rychlostí 100 ml/h. Chromatografický sloupec se potom eluuje nosným pufrem, čímž se dosáhne odstranění brinogenu, alubiminu, imunoglobulinů, antithrombinu III a fibronectinu, jakož i činidel použitých pro inaktivaci virů.

Komplex faktor VIII-νοη Willebrandův faktor se potom desorbuje zvýšením iontové síly pufru na 0,27 M chloridu sodného.

Roztok faktoru VIII získaný za použití tohoto postupu má specifickou aktivitu 5 až 10 IU/mg, přičemž účinnost čisticího procesu činí ve srovnání s čistotou plasmy injikované na uvedený chromatografický sloupec asi 60 až 80 I. V uvedeném komplexu byl zjištěn poměr obou faktorů, tj. faktoru VIII a von Willebrandova faktoru, rovný 1U/1U, kde druhý z uvedených faktorů je vyjádřen v ristocetinových kofaktorových jednotkách.

Čistota uvedeného roztoku faktoru VIII může být ještě mírně zlepšena dodatečným chromatografickým separačním stupněm, který umožní zkoncentrování produktu. Tak je například pro tento účel možné použít druhý sloupec DEAE-Fractogelu, který je provozován za použití stejného nosného pufru. Předběžně se provede eluce při iontové síle pufru 0,13 M chloridu sodného, čímž se dosáhne odstranění z chromatografického sloupce reziduálních kontaminujících proteinů. Iontová síla pufru se potom zvýší na 0,27 M chloridu sodného za účelem desorpce a eluce vysoce čistého a koncentrovaného roztoku komplexu faktor VIII-νοη Willebrandův faktor.

Uvedený druhý chromatografický koncentrační stupeň může být nahrazen ultrafíltrací.

Při obvyklém provedení způsobu podle vynálezu se první čisticí chromatografický stupeň provádí na pryskyřici DEAE-Fractogel. Nicméně dobrých výsledků může být rovněž dosaženo použitím nově na trh uvedených pryskyřic (firma Měrek) TMAE-Fractogel (TMAE = tri-methyl-amino-ethyl) nebo DMAE-Fractogel (DMAE = Di-MAE), které mají vlastnosti, které jsou ekvivalentní vlastnostem pryskyřice DEAE-Fractogel. Rovněž mohou být použity nové pryskyřice tykadlového typu, které byly vyvinuty firmou Měrek a uvedeny W. Mullerem ve sborníku Conference on Liquid Chromatography, červen 1989, Stockholm.

Příklad 2

Další provedení způsobu podle vynálezu rovněž umožňuje přípravu koncentrátů fibrinogenu a fibronektinu a to při současném získání koncentrátu faktoru VII a von Willebrandova faktoru ve formě komplexu, majícího mírně zvýšenou specifickou aktivitu na úkor nižšího výtěžku.

Postupuje se stejně jako v příkladu 1 až do eluce komplexu faktor VITI-von Willebrandův faktor z prvního chromatografického sloupce tvořeného pryskyřicí DEAE-Fractogel.

Fibrinogen, antithrombin III, albumin a imunoglobuliny nejsou chromatografickým sloupcem zadrženy a mohou být izolovány ve filtrátu. ...---.Komplex faktor VIII-νοη Willebrandův faktor může být dočištěn· a koncentrován druhým chromatografickým separačním stupněm na sloupci pryskyřice DEAE-Fractogel, přičemž se použije nosný pufr s iontovou silou 0,17 M chloridu sodného. Za těchto podmínek nedochází k zadržení reziduálních kontaminujících proteinů. Následným zvýšením iontové síly pufru na 0,27 M chloridu sodného se dosáhne desorpce a eluce komplexu faktor VIII-νοη Willebrandův faktor. Tímto způsobem se dosáhne specifické aktivity 10 až 20 IU/mg.

Fibrinogen a fibronektin mohou být potom vyčištěny a koncentrovány za použití známých chromatografických procesů, přičemž se získají roztoky mající kvalitu vhodnou pro terapeutické použití (viz francouzská patentová přihláška 88 07530). Ostatní proteiny plasmy mohou být přečištěny a koncentrovány za použití konvenčních frakcionačních postupů.

Příklad 3

Účinnost čisticího procesu může být ještě dále zlepšena stabilizací výchozí plasmy od okamžiku jejího rozmražení na teplotu 25 °C přidáním následující směsi: heparin 1 U/ml

EDTA 2 mM nebo 0,74 g/1 chlorid vápenatý 6 mM nebo 0,67 g/1.

K této směsi může být dále přidána glukóza v koncentraci 5 až 60 g/1. Hodnota pH se potom sníží na 6,5 přidáním kyseliny octové. Čisticí stupně se potom provádí stejně jako v příkladu 1 nebo 2. Za těchto podmínek je celkový výtěžek čisticího procesu alespoň roven 500 U FVIII;C/litr výchozí plasmy. To odpovídá celkové výtěžnosti 55.až 65 % aktivity faktoru VIII při specifické aktivitě 10 až 30 jednotek FVIII:C/mg proteinu.

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (23)

1. Způsob přípravy stabilního koncentrátu komplexu faktor VIII-von Willebrandův faktor majícího vysokou specifickou aktivitu, vyznačený tím, že se celková plasma přečistí působením chloridu barnatého a hydroxidu hlinitého, načež se čistí na aniontoměničovém gelu umožňujícím retenci molekul s molekulovou hmotností vyšší než 1 milion daltonů.

2. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že se jako celková plasma použije čerstvá nebo zmražená plasma.

3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačený tím, že stabilizační směs obsahující 0,2 až 2 U/ml heparinu, 1 až 5 mM EDTA a 1 až 10 mM chloridu vápenatého se přidá k plasmě.

4. Způsob podle nároku 3, vyznačený tím, že stabilizační směs obsahuje glukózu v koncentraci 5 až 60 g/1.

5. Způsob podle některého z nároků 1 až 4, vyznačený tím, že předčištění zah zuje srážení chloridem barnatým, odstředění vysrážené směsi a izolaci supernatantu, dále adsorpci na gelu hydroxidu hlinitého, odstředění za chladu a izolaci supernatantu a nakonec odsolení.

6. Způsob podle nároku 5, vyznačený tím, že srážením chloridem barnatým se provádí přidáním za míchání 1M roztoku chloridu barnatého při hodnotě pH 6,5, načež se vysrážená směs odstředí při teplotě 5 až 10 °C a supernatant se oddělí.

7. Způsob podle nároku 5 nebo 6, vyznačený tím, že se adsorpce na gelu hydroxidu hlinitého se provádí za použití 3% gelu hydroxidu hlinitého při hodnotě pH 6,5, načež se získaná směs rychle ochladí na teplotu 5 °C, odstředí se při teplotě 5 °C a supernatant se oddělí.

8. Způsob podle některého z předcházejících bodů 5 až 7, vyznačený tím, že odsolení se provádí ultrafiltrací v přítomnosti nosného pufru pro následující chromatografický stupeň, ke kterému byl přidán heparin.

9. Způsob podle některého z předcházejících nároků 5 až 7, vyznačený tím, že odsolení se provádí chromatograficky na sloupci Sephadexu G 25 za použití nosného pufru pro následující chromatografický stupeň, ke kterému byl přidán heparin.

10. Způsob podle některého z předcházejících nároků 1 až 9, vyznačený tím, že supernatant plasmy, který byl předčištěn, se injikuje na chromatografický sloupec, obsahující antiontoměničovou pryskyřici, která má schopnost retence molekul s molekulovou hmotnosti vyšší než 1 milion daltonů a která umožňuje přechod fibrinogenu, albuminu, imunoglobulinů, antithrombinu III a fibronektinu do filtrátu.

11. Způsob podle některého z předcházejících nároků 1 až 10, vyznačený tím, že se jako chromatografická pryskyřice použije pryskyřice typu vinylového polymeru, na které jsou fixovány skupiny typu DEAE, T-MAE nebo D-MAE.

12. Způsob podle nároku 11, vyznačený tím, že se jako polymerní gel použije Fractogel.

13. Způsob podle některého z předcházejících nároků 10 až 12, vyznačený tím, že se jako nosný pufr pro chromatografický sloupec použije pufr na bázi citranu sodného a chloridu vápenatého obsahující glycin a lysin, ke kterému bylo přidáno 0,11 M chloridu sodného a který byl nastaven na hodnotu pH 7.

14. Způsob podle nároku 13, vyznačený tím, že pufr obsahuje 8 až 11 g/1 glycinu a 2 až 4 g/1 lysinu.

15. Způsob podle některého z předcházejících bodů 10 až 14, vyznačený tím, že iontová síla pufru se za účelem desorpce komplexu faktor VIII-νοη Willebrandův faktor z chromatografického sloupce zvýší na 0,27 M chloridu sodného.

16. Způsob podle některého z předcházejících nároků 10 až 14, vyznačený tím, že se iontová síla pufru zvýší na 0,13 M chloridu sodného, čímž se dosáhne eliminace fibronektinu, načež se iontová síla pufru zvýší za účelem desorpce komplexu faktor VIII-νοη Willebrandův faktor z chromatografického sloupce na 0,27 M chloridu sodného.

17. Způsob podle některého z předcházejících nároků 1 až 16, vyznačený tím, že komplex faktor VIII-νοη Willebrandův faktor, který byl desorbován z chromátografického sloupce, se podrobí dodatečnému čisticímu a koncentračnímu stupni, který se provádí chromatograficky.

18. Způsob podle některého z předcházejících nároků 1 až 17, vyznačený tím, že se dodatečný chromatografický čisticí a koncentrační stupeň provádí na intoměničové pryskyřici zvolené ze skupiny zahrnující DEAE- nebo T/D-MAE-Fractogel, imobilizovaný amino-hexyl, imobilizovaný heparin, dextransulfát, sulfopropyl nebo afinitní anebo imunoafinitní pryskyřici.

19. Způsob podle nároků 17 a 18, vyznačený tím, že se dodatečný chromatografický čisticí a koncentrační stupeň provádí za použití pufru nastaveného na 0,11 M chloridu sodného a že zahrnuje 2 následná zvýšení iontové síly na 0,13 M a potom na 0,27 M chloridu sodného.

20. Způsob podle některého z nároků 17 nebo 18, vyznačený tím, že dodatečný chromatografický čisticí a koncentrační stupeň se provádí za použití pufru nastaveného na 0,17 M chloridu sodného a že zahrnuje jediné zvýšení iontové síly na 0,27 M chloridu sodného.

21. Způsob podle některého z předcházejících nároků 1 až 20, vyznačený tím, že se před libovolným z chromatografických stupňů provede konvenční inaktivace virů za použití techniky rozpouštědlo-detergent.

22. Koncentrát komplexu faktor VIII-νοη Willebrandův faktor, vyznačený tím, že je získán způsobem podle některého z předcházejících nároků 1 až 21.

23. Koncentrát podle nároku 22, vyznačený tím, že je formulován pro terapeutické použití.