FI79543B - Foerfarande foer framstaellning av immunologiskt aktiva glykosider. - Google Patents

Description

χ 79543

Menetelmä immunologisesti aktiivisten glykosidien valmistamiseksi

Keksintö koskee menetelmää erinomaisen immuno-5 logisen aktiivisuuden omaavien glykosidien valmistamiseksi. Nämä glykosidit ovat N-asetyylineuramiinihappojohdannaisia .

Alalla on ennestään tunnettua, että N-substituoi-tuja neuramiinihappoja, esim. N-asetyylineuramiinihappoa 10 ja vastaavia, esiintyy monissa eläimissä ja useiden bakteerien solupinnalla kompleksina siaalihapon kanssa gly-koproteiinien, glykolipidien, oligosakkariden tai polysakkaridien muodossa.

Viime aikoina N-substituoiduista neuramiinitials poista on tullut tärkeitä aineita lääketieteessä ja farmasiassa hermotoimintojen, syövän, tulehdusten, immuniteetin, virusinfektioiden, solujen erilaistumisen, hormonireseptorien jne. yhteydessä. Ne on havaittu ainutlaatuisen aktiiveiksi molekyyleiksi solu-20 jen pinnalla, mutta, toistaiseksi ei ole kuitenkaan pystytty selvittämään N-substituoitujen neuramiinihappojen osaa siaalihapon kanssa muodostuvissa komplekseissa.

Myös monet orgaanikot ovat tutkineet N-substituoitu ja neuramiinihappoja, joista onkin valmistettu 25 useita yksinkertaisia johdannaisia, mutta toistaiseksi ei ole aikaansaatu erinomaisen immunologisen aktiivisuuden omaavaa johdannaista.

Toisaalta ihmisen keskimääräistä ikää on pystytty pidentämään verta muodostavien elinten pahanlaa-30 tuisten kasvainten, monien syöpälajien ja kollageeni-sairauksien hoidossa tapahtuneiden terapeuttisten parannusten ansiosta. Toisaalta lääkkeiden, esim. adre-nokortikohormoni- tai immunosuppressanttilääkkeiden käytön huomattava kasvu on johtanut ei-toivottujen sivu-35 vaikutusten kasvuun ja samalla immunologisen kyvyn huononemiseen ja pienenemiseen.

2 79543

Sen vuoksi tämän keksinnön perustana olevassa tutkimustyössä kiinnitettiin erityisesti huomiota siaalihap-poon, joka on biologisesti luontainen aineosa. Tutkimukset laajennettiin käsittämään immuniteetin säätöaineita, 5 joilla on harvoja sivuvaikutuksia, koska siaalihappo on kemiallisesti modifioitavissa ja sillä voidaan säädellä immunologisia vaikutuksia. Näiden tutkimusten perusteella pystyttiin löytämään uusia yhdisteitä, joilla on immunologinen säätövaikutus siten, että suppressorina toimivat T-10 solut aktivoituvat ja immunoglobuliinin muodostuminen B-soluista estyy.

Tämän keksinnön pääkohteena on menetelmä, jolla aikaansaadaan uusia yhdisteitä, joilla on erinomainen immunologinen aktiivisuus ja erityisesti immunosäätelyvaikutus.

15 Tämän keksinnön mukaisesti valmistettavat uudet yh

disteet ovat glykosideja, joilla on kaava I

OR, 0R3 / 1 20 I / ^^0--/

0R3 / /X I

CH3CONH^^/^7\v^ / R2 :: 0R3 jossa R1 on ryhmä, jolla on kaava III'

- 25 O

A^r HN Y III·

„aJ

30 CH2-0-CH2-CH2-0- ja R2 on alkoksikarbonyyliryhmä tai vapaa tai suolan muodossa oleva karboksyyliryhmä, tai R1 on alkoksikarbonyyliryhmä tai vapaa tai suolan muodossa oleva karboksyyliryhmä, ja R2 on ryhmä, jolla on 35 kaava III' 3 79543 o A^f

HN

o^y m· 5 ch2-o-ch2-ch2-o- ja R^ on vetyatomi tai asetyyliryhmä.

Esimerkkejä alkoksikarbonyyliryhmistä ja R2 ovat metoksikarbonyyliryhmä, etoksikarbonyyliryhmä ja vas-10 taavat. Suolan muodossa oleva karboksyyliryhmä voi olla esimerkiksi karboksyyliryhmän alkalimetallisuola tai maa-alkalimetallisuola, kuten natriumsuola, kaliumsuola, kal-siumsuola ja vastaavat.

Kaavan I mukaisiin yhdisteisiin kuuluvat /3-konfi-15 guraation omaava johdannainen (/&-johdannainen), jossa R^ on ryhmä xV' 20 CH20CH2CH20- ja Cli-konfiguraation omaava johdannainen (Oi-johdannainen), jossa R2 on ryhmä CH20CH2CH20- 30 :: : Kaavan I mukaisia yhdisteitä valmistetaan keksin nön mukaisesti menetelmällä, jota kuvaa seuraavassa esitetty reaktiokaavio, jossa alkoksikarbonyyliryhmänä R^ tai vastaavasti R2 on esimerkinomaisesti metoksikarbonyyli ja 35 suolan muodossa olevana karboksyyliryhmänä natriumsuola.

Asetyyliryhmästä käytetään merkintää Ac. Tällöin metyyli- 2-kloori-4,7,8,9-tetra-0-asetyyli-/i -D-N-asetyyli-neurami- 4 79543 naatista (seuraavassa yhdiste II) ja 5-fluori-1-^12-hydr-oksetoksi)etyyli^urasiilista (seuraavassa yhdiste III) saadaan edellä määritellyn kaavan I mukaisiin yhdistei— siin kuuluvat yhdisteet (IV) - (Xl). Yhdisteet (IV/ - (Xl) on ni- 5 metty seuraavasti: yhdiste (IV): 1-0-/metyyli(5-N-asetyyli-3,5-dideoksi-4,7,8,9-tetra- 0- asetyyli-/3-D-glysero-D-galakto-2-nonulopyranosyl) -onaatti7-2-0-/"(2,4-diokso-5-f luori-1 , 2,3,4-tetrahyd- 10 ropyrimidin-1-yyli)metyyli7etaanidioli, yhdiste (V): 1- 0-/metyyli(5-N-asetyyli-3,5-dideoksi-4,7,8,9-tetra- 0- asetyyli-Ä-D-glysero-D-galakto-2-nonulopyranosyl)-onaatti7-2-0-/”(2,4-diokso-5-f luori-1 , 2,3,4-tetrahyd- 15 ropyrimidin-1-yyli)metyyli7etaanidioli, yhdiste (VI): 1 -0-/metyyli (5-N-asetyyli-3,5-dideoksi-/3-D-glysero-D-galakto-2-nonulopyranosyl) onaatti7-2-0-/"(2,4-diokso- 5-fluori-1,2,3,4-tetrahydropyrimidin-1-yyli)metyyli^-20 etaanidioli, yhdiste (VII): ; 1-0-/metyyli(5-N-asetyyli-3,5-dideoksi-<X-D-glysero-D- galakto-2-nonulopyranosyl) onaatti7-2-0-yT(2,4-diokso- 5-fluori-1,2,3,4-tetrahydropyrimidin-1-yyli)metyyli7~ 25 etaanidioli, yhdiste (VIII): 1- 0-/natrium(5-N-asetyyli-3,5-dideoksi-/J~D-glysero-D-galakto-2-nonulopyranosyl) onaatti7~2-0-/"(2,4-diokso-5-fluori-1,2,3,4-tetrahydropyrimidin-1-yyli)metyyli7etaa- 30 nidioli, yhdiste (IX): 1 -0-/jiatrium (5-N-asetyyli-3,5-dideoksi-Cfc-D-glysero-D-galakto-2-nonulopyranosyl) onaatti7-2-0-^*(2,4-diokso- 5-fluori-1 ,2,3,4-tetrahydropyrimidin-1-yyli)metyyli/-35 etaanidioli, 5 79543 yhdiste (X): 1- 0-/7 5-N-asetyyli-3,5-dideoksi-/0-D-glysero-D-galakto- 2- nonulopyranosyl) onihappq7-2-0-/*( 2,4-diokso-5-fluori- 1.2.3.4- tetrahydropyrimidin-1-yyli)-etyyli7etaanidioli, 5 yhdiste (XI): 1- 0-/7 5-N-asetyyli-3,5-dideoksi-a-D-glysero-D-galakto- 2- nonulopyranosyl) onihappq7-2-0-/'( 2,4-diokso-5-fluori- 1.2.3.4- tetrahydropyrimidin-1-yyli)metyyli/etaanidioli 6 79543 OAc OAc

AcO / 0 7\. __,

AcNH / COOMe OAc (II) 0

HN

1 „ CH„-OH

O^N^n I 2 I / nI (iii) ch2 ch2 ' ’ ____

Koenigs-Knorr-reaktio :i ώ' OAc OAc Γ |Ί/°.

AcO 0 ~7\ - AcNH L ^ COOKe OAc (IV) johdannainen 0 OAc AcP HN^iY^

\ I COOMe \ M

—► aj

AcNH-0 OAc ^ (V) Co- johdannainen 7 79543 o=H-7 >\ / / x °=\ ?-7 s~\ °\ § sK ° g « Γ /° I ° A /§ -s

/ '5 I / S

\ G O K G

X. g <a / ns \ Ό / Ό 7 X!

O / Λ / O

//0 / O / ·π / / Τ' * // <ί> I § /C j' o —

\ X \ , H

,1 - E

/'"o« \ I

B / § /”'§* O te~/ o SC! / * 55 \ ^ K OW\ <j § h \ / 0=0-7 2 : *~ί fl 8 O-/

’ / G

--- O / <U

// c //(0

/ fv. K G

K \ ^-o G

I \ «3 \ \\ Ό

\ B

/III O 0 / K -n

B / I

° * 'Q

::: \ υ \ < y §

--- B

Λ >

. . . ‘ M

„ 79543

O

(*< Cu —7 °~H—7 =1 \ 1 -1 \ s I % | -5

Ifl O 5 1 tö

2 y 5 O G

O / ,2 X / c O / ? O / lö Γ) 1 U^K ! fr: B fr *ν,,§§ * / * °n I r> ^ r % ) \Z ) · )=^ O ·=< Z--r ( X ° r-

(1! O

S / β 0/0) O / β ; " Γ) 1

/ L

(f ! §-/ a ;; o * > 9 79543

Edellä kuvatut yhdisteet (ΙΓ* ja (tl]? ovat tunnettuja yhdisteitä. Yhdiste (li syntetisoidaan esim. menetelmällä, joka on kuvattu julkaisussa Kuhn, Chem. Ber. 99, (1966), s. 611. Kaavan (lii) mukainen yhdiste saadaan esim.

5 menetelmällä, joka on kuvattu julkaisussa Morris J. Ro bins, Can. J. Chem. 60 (1982), s. 547.

Uusien yhdisteiden (IV) (β-johdannaisen) ja (V) (oC-johdannaisen) seos saadaan yhdisteiden (II) ja (III) Koenigs-Knorr-reaktiolla. Koenigs-Knorr-reaktio voi-10 daan suorittaa HgBr2:n, Hg(CN)2:n tai niiden seoksen läsnäollessa tai CF^SO^Agin (hopeatrifluorimetaanisul-fonaatin) läsnäollessa. Reaktio suoritetaan mieluiten CF^SO^Agtn läsnäollessa, koska CF^SO^Agsllä yhdisteiden (IV) ja (V) kokonaissaannot ovat yleensä suuremmat 15 kuin HgBr2:lla ja vastaavilla.

Kun mainittu reaktio suoritetaan CF^SO^Agjn läsnäollessa, on lisäksi suotavaa suorittaa reaktio liuotti-messa, kuten tetrahydrofuraanissa, asetonitriilissä, me-tyleenikloridissa tai vastaavassa huoneen lämpötilan ja 20 -50°C:n välisessä lämpötilassa n. 5-60 minuutissa. Eri tyisen suositeltavaa on, että reaktioaika on n. 20 minuuttia ja liuottimena on tetrahydrofuraani. Siten edellä mää-: riteltyihin kaavan I mukaisiin yhdisteisiin kuuluvat uu det yhdisteet (IV) (^-johdannainen) ja (V) (oc-johdannainen) ; : : 25 voidaan erottaa toisistaan ja puhdistaa kromatografoimal- la edellä saatu yhdiste silikageelipylväässä.

Uusi yhdiste (VI) (yb-johdannainen) voidaan lisäksi saada vaihtoesteröimällä yhdiste (IV) natriummetok-sidilla metanolissa. Käsiteltävänä olevan keksinnön uu-30 si yhdiste (VII) (PJ-johdannainen) voidaan samalla ta voin saada yhdisteestä (V).

Yhdisteet (VIII) (yi-johdannainen) ja (IX) (<*-joh-dannainen) voidaan saada hydrolysoimalla yhdisteet (VI) ja (VII) natriumhydroksidiliuoksessa. Vapaan hapon muo-35 dossa olevat yhdisteet (X) ^-johdannainen) ja (XI) 10 79543 (ot-johdannainen) voidaan saada tekemällä yhdisteiden (VIII) ja (IX) mukaiset vesiliuokset happamiksi tai hydrolysoimalla yhdisteet (VI) ja (VII) natriumhydroksidi-liuoksessa ja tekemällä liuos happameksi.

5 Jäljempänä esitetyt esimerkit havainnollistavat konkreettisesti kaavan I mukaisten yhdisteiden valmistusmenetelmää, joka toteutetaan edellä esitetyn reaktiokaa-vion osoittamalla tavalla.

Keksinnön mukaisesti valmistetuilla kaavan I mu-10 kaisilla yhdisteillä on erinomainen kyky säätää immuuni-systeemin voimakkuutta. Kyky säätää immuunisysteemin voimakkuutta voidaan osoittaa seuraavan menetelmän avulla:

Kyky estää Con A:n aktivoiva vaikutus hiiren per-nalymfosyytteihin 15 Koska Con A aktivoi epäspesifisesti T-solut, kek sinnön mukaisesti valmistettua glykosidia lisättiin reaktioon ja sitten tutkittiin sen vaikutusta. Toimittiin siten, että Con A:ta ja kaavan I mukaista yhdistettä, esim. jäljempänä olevissa esimerkeissä valmistettua yhdistettä 20 lisättiin pernalymfosyytteihin (SPC), jotka oli otettu BALB/C-hiirestä, ja seosta viljeltiin 20 tuntia tai suunnilleen 20 tuntia 37°C:ssa mikrolevyllä, jolloin seokseen oli lisätty 5 % CC^sta. Saatuun seokseen lisättiin tritiumilla merkittyä tymidiiniä, seosta viljeltiin 37°C:ssa

25 vielä 10 tuntia tai suunnilleen 10 tuntia ja sitten SPC

• . . 3 otettiin talteen. Määritettiin SPCthen sitoutuneen H-ty- midiinin määrä tuikelaskurilla.

Havaittiin, että kaavan I mukaisella yhdisteellä oli 3 edistävä ja lujittava vaikutus H-tymidiinin sitoutumiseen 30 ja havaittiin myös, että kyky estää Con A:n aktivoiva vaikutus T-soluihin parani.

Kyky estää immunoglobuliinin muodostuminen hiiren pernalymfosyyteissä

Tutkittiin myös keksinnön mukaisesti valmistettu-35 jen N-subsituoitujen neuramiinihappojohdannaisten, jotka edellä kuvatussa kokeessa vaikuttivat T-solujen aktivointiin, kyky estää immunoglobuliinin muodostuminen mittaamalla plakinmuodostajasolujen (PFC) lukumäärä.

11 79543

Aluksi lampaan punasoluja ja jokin kaavan I mukaisista yhdisteistä, esim. jäljempänä esitetyissä esimerkeissä kuvattu yhdiste lisättiin SPCrhen ja seosta viljeltiin 5 vuorokautta 37°C:ssa. Näin saatuun herkistettyyn 5 SPCshen lisättiin nytkin SRBC:tä ja komplementtia. Saatua seosta viljeltiin 3-12 tuntia 37°C:ssa Cunningham-kam-miossa ja sitten laskettiin PFC-solujen määrä.

Todettu PFC-solujen määrän väheneminen ja solujen elinkelpoisuuden pysyminen samana kuin vertailukokeessa 10 on todisteena parantuneesta kyvystä estää immunoglobulii-nin muodostuminen.

Molemmissa edellä kuvatuissa erilaisissa testeissä voitiin havaita keksinnön mukaisesti valmistettujen yhdisteiden erinomainen aktiivisuus. Voitiin siten päätellä, 15 että immunogloguliinin muodostuminen estyi suppressorina toimivien T-solujen aktivoitumisen vaikutuksesta.

Toistaiseksi on voitu todeta suppressorina toimivien T-solujen toiminnan heikkenemistä autoimmuunisairauksissa, esim. kollageenisairaudessa. Siten voidaan olettaa, 20 että keksinnön mukaisesti valmistetut N-substituoidut neuramiinihappojohdannaiset, jotka aktivoivat suppressori-na toimivia T-soluja, ovat kliinisesti käyttökelpoisia immuunisysteemin voimakkuutta säätelevinä lääkeaineina.

Seuraavat esimerkit havainnollistavat keksintöä.

25 Esimerkki 1 :: Yhdisteiden (IV) ja (V) valmistusmenetelmä : : 120 ml:aan vedetöntä tetrahydrofuraaniliuos- ta, jossa oli 2,54 g (12,44 mmol) yhdistettä (III), lisättiin 50 ml vedetöntä asetonitriililiuosta, jossa 30 oli 1,12 g (4,44 mmol) merkurisyanidia ja 2,24 g (6,21 mmol) merkuribromidia, lisättiin 7,74 g molekyy-liseulaa 4A ja sekoitettiin tunti huoneenlämpötilassa.

Sitten yllä saatuun seokseen lisättiin 35 ml vedetöntä asetonitriililiuosta, jossa oli 4,64 g - 35 (9,10 mmol) yhdistettä (II) ja sekoitettiin 46 tun tia huoneen lämpötilassa.

I2 79543

Reaktion päätyttyä suspensio neutraloitiin Amberlite®A-21:llä ja suodatettiin. Muodostunut suo-dos tislattiin vakuumissa ja jäännös liuotettiin etyyliasetaattiin, absorboitiin 10 g:aan silikageeliä 5 (Wakogel C-300), liuotin poistettiin tislaamalla vakuumissa ja erotettiin lopuksi useiksi fragmenteiksi pylväskromatografoitiin /kiintofaasi: silikageeli (Wakogel C-300) 100 g, eluointiliuotin: kloroformi-metanoli 30:1^7· Lähtöaineet poistettiin ensimmäises-10 tä fragmentista ja kohdetuotteena saatiin yhdisteiden (IV) ja (V) seos. Seos erotettiin fragmenteikseen pylväskromatografoitiin /kiintofaasi: silikageeli (Wakogel C-300), eluointiliuotin: tolueeni-metanoli 10:17» kummankin fragmentin liuotin poistettiin tis-15 laamalla ja jäännös liuotettiin veteen ja kvlmäkuivat-tiin. Näin saatiin 1,82 g (saanto 29,6 %) yhdistettä (IV) (^-johdannainen) ja 1,87 g (saanto 30,4 %) yhdistettä (V) (Λ-johdannainen) puhtaina, värittöminä, amorfeina kiteinä. Yhdisteiden (IV) ja (V) kokonais-20 saanto oli 60,0 %.

i3 79543

Yhdisteen (IV) fysikaaliset arvot;

Hajoamispiste; 100-109°C

Alkuaineanalyysi C27H36FN3°1 6 ' ^^20, mp. 688,42 Laskettu: C 47,11; H, 5,45; N, 6,10 Saatu: C 47,15; H, 5,41; N, 5,80 IRlnJ£r cm-l: 3400 (-NH-), 1720 (-C0-0-) 1670 (y C=0 amidi i) , 1550 (yC=0 amidi II), 1230(C-O-C) 1 ppm H-NMR 400 MHz (CDC13) 1,894, 2,027, 2,035, 2,063, 2,149 (15H,kaikki S, CH3CO - X5) 2,342 (1H, dd, J=13,lHz, J=4r9Hz, 3-hek) 3,802 (3H, S, -COOCH3) 3,539; 3,656 (2H, m; m,-OCH2CH2-0-) 3,716; 3,907 (2H, m; m,-OCH2CH2-0-) \ 4,780 (1H, d, J=10,7Hz, 6

"''H

5,603 (1H, d, J=10,7Hz, Λ C ) ^ V* '

H

5,107 - 5,174 (1H, m, 4-H) 7,457(1H, d, J=5,2Hz, pyrlmidiini- 6 -H) [ofc]p4 - 5,75° (C=l, AcOEt) 14 79543

Yhdisteen (V) fysikaaliset arvot:

Hajoamispiste; 94-105°C

Alkuaineanalyysi C^^H^gFN^O^ g . 11 /1 C^O, mp. 697,43 Laskettu: C 46,50; H, 5,52; N, 6,03

Saatu: C, 46,51; H, 5,24; N, 5,90 IR^ cm-l: 3350 (-NH-) , 1720 (-C0-0-) , 1670 {uC=Q, amidi I) f 1550 (i/C=0, amidi II) , 1220 (C-O-C) 1 ppm H-m«0 MHz (CDCl3) 1,888, 2,040, 2,148, 2,153 (15H, kaikki S, CH3CO - X5) 2,578 (1H, dd, J=12,7Hz, J=4,8Hz, 3-hek) 3,808 (3H,S, -COOCH3) 3, 475; 3,906 (2H, m; m,-OCH2CH2-O-), 3,737 (2H, m, -OCH7CH9-O-)

5,173 (1H, d, J=10,7Hz /H

) : n h 5,210 (1H, d, J=10;7Hz

N H

4,800 - 4,903 (1H, m, 4-H) 15 79543 7,530 (1H, d, J=5r2Hz, pyrimidiini -6-H) W d4 - 8,08° (C=l, AcOEt) 5

Esimerkki 2

Yhdisteiden (IV) ja (V) valmistusmenetelmä (2) 70 ml:aan vedetöntä tetrahydrofuraaniliuosta, jossa oli 1,54 g (7,55 mmol) yhdistettä (III) ja 2,96 g 10 (5,81 mmol) yhdistettä (II), lisättiin 4,61 g molekyy- liseula 4 A-jauhetta ja sekoitettiin 30 minuuttia huoneenlämpötilassa. Sitten saatu liuos jäähdytettiin lämpötilaan -15 - -20°C, lisättiin 8 ml vedetöntä tetrahydrofuraaniliuosta, jossa oli 2,09 g (8,13 mmol) hopea-15 trifluorimetaanisulfonaattia, ja sekoitettiin 20 mi nuuttia .

Kun saatu reaktiosuspensio oli suodatettu ja muodostuneen suodoksen liuotin oli poistettu tislaamalla vakuumissa, jäännös liuotettiin 200 ml:aan etyy-20 liasetaattia ja pestiin kyllästetyllä natriumkloridi- vesiliuoksella ja kyllästetyllä natriumvetykarbonaatti-vesiliuoksella ja kuivattiin natriumsulfaatilla. Pois-... tamalla kuivausaine suodattamalla ja liuotin tislaa- maila vakuumissa saatiin 4,23 g jäännöstä. 4,23 g jään-25 nöstä liuotettiin etyyliasetaattiin ja erotettiin frak- tioiksi silikageelikromatografoimalla ^kiintofaasi: silikageeli (Wakogel C-300) 423 g, eluointiliuotin: tolueeni-metanoli 1 0 :1_7 . Saatiin ensimmäinen fragmentti (lähtöaineiden ja yhdisteen (IV) seos) ja toinen 30 fragmentti (joka sisälsi yhdistettä (V)).

Kun liuotin oli poistettu tislaamalla, ensimmäi-• · nen fraktio fraktioitiin pylväskromatografoimalla ^kiintofaasi: silikageeli (Wakogel C-300), eluointi-liuotin: kloroformi-metanoli 40:1.7. Liuotin poistet-35 tiin tislaamalla yhdistettä (IV) sisältävästä fragmen- ie 79543 tista ja jäännös liuotettiin veteen ja kylmäkuivattiin. Näin saatiin puhtaana tuotteena 0,77 g (saanto 19,6 %) yhdistettä (IV) (β-johdannainen). Liuotin poistettiin tislaamalla toisesta fraktiosta ja jäännös liuotettiin 5 veteen ja kylmäkuivattiin, jolloin saatiin puhtaana tuotteena 2,70 g (saanto 68,7 %) yhdistettä (V) (#-joh dannainen) . Yhdisteiden (IV) ja (V) kokonaissaanto oli 88,3 %.

Esimerkki 3 10 Yhdisteen (VI) valmistus 420 mg (0,62 mmol) esimerkeissä 1 ja 2 saatua yhdistettä (IV) liuotettiin 100 ml:aan 0,01-n natrium-metoksidin metanoliliuosta ja sekoitettiin 1,5 tuntia huoneen lämpötilassa. Saatuun reaktioliuokseen lisättiin 15 Dowex 50W-X8:n H-muotoa, neutraloitiin ja suodatettiin.

Sitten muodostunut suodos konsentroitiin ja kuivattiin. Jäännös pylväskromatografoitiin /jciintofaasi: silika-geeli (Wakogel C-200), eluointiliuotin: kloroformi-metanoli 5:37. Liuotin poistettiin tislaamalla erote-20 tusta fragmentista ja saatu jäännös liuotettiin veteen ja kylmäkuivattiin. Näin saatiin 270 mg (saanto 86 %) yhdistettä (VI) (β-johdannainen) puhtaina, värittöminä, amorfeina kiteinä.

Tuotteen fysikaaliset arvot:

25 Hajoamispiste: 138-142°C

Alkuaineanalyysi g^gFN^O^ 2 * 7/2H20' mp. 572,51 Laskettu: C 39,86; H 6,16; N 7,34 Saatu: C 39,62; H 5,90; N 7,13 17 79543 IRvnSf cm”1: 3400 -0H-), 1710 (-C0-0-) , 1670 (vc=0 amidi I), 1560 (*>c=0 amidi χχ) 5 1h-nmr 400 MHZ (CDC13 + °20) 1,758 (1H, dd, J=12,4Hz, J=ll,9Hz, 3-haks) 2,035 (3H, S, CH3CONH-) 10 2,347(1H, dd, J=12,4Hz, J=4,8Hz, 3-hek) 3,320 - 4,080 (13H, m, sialyyli-H, -CH2CH2-O-) 15 3,823 (3H, S, COOCH3) 7,940 (1H, d, J=5,4Hz, pyrinidiini- 6 -H) 20 W19d5 - 17»9° (C=1' DMF> • - - ‘ Esimerkki 4 - ‘ Yhdisteen (VII) valmistus ".· : Esimerkin 3 menetelmän mukaisesti, mutta käyttäen : esimerkeissä 1 ja 2 saatua yhdistettä (V) yhdisteen (IV) : : : 25 asemasta, saatiin 221 mg (saanto 80 %) yhdistettä (VII) (0(-johdannainen) .

Tuotteen fysikaaliset arvot?

Hajoamispiste; 147-150°C

Alkuaineanalyysi 9H2gFN3°-| 2 * 1 ^/1 0H2O, mp. 543,69 30 Laskettu: C 41,97; H 5,90; N 7,73 Saatu: C 7,73; H 5,72; N 7,59 ie 79543 IR^ cm-l; 3400 <-NH-' -OH-)' 1710 (-C0-0-), 1670 (^ OO, amidi I) , 5 1560 (vC=0 amidi II) iH-NMRPPJ HHz (CDC 3 + D20) 1,758 (1H, dd, J=12,4 Hz, J=ll,lHz, 3-haks) !0 2,010 (3H, S, CH3CONH-) 2,637 (1H, dd, J=12.4Hz, J=4 r 5Hz, 3-hek ) 3,484 - 3,972 (13H, m, 15 sialyyli-H, -CH2CH2-O-) 3,836 (3H, S, -COOCH3) 7,906 (1H, d, J=5,3Hz, 20 pyrimidiini-6-H) Μ19£)5 “33r4° (C=1' DMF) : Esimerkki 5 : Yhdisteen (VIII) valmistus 25 650 rag:aan (1,28 mmol) esimerkissä 3 saatua - yhdistettä (VI) lisättiin 2 ml vettä ja suspendoitiin ja sitten lisättiin 2 ml 1-n natriumhydroksidi/vesi-liuosta ja sekoitettiin 20 minuuttia huoneen lämpötilassa. Sitten saatuun seokseen lisättiin niin paljon 1-n 30 natriumhydroksidi/vesiliuosta, että reaktioseoksen pH- arvoksi tuli 10-11 ja muodostunutta seosta sekoitettiin 5 minuuttia. Reaktioseokseen lisättiin Amberlite® ICR-50:tä, seoksen pH säädettiin arvoon 5-6 ja suodatettiin. Sitten saatu suodos kylmäkuivattiin ja saatiin 636 mg 35 (saanto 96,1 %) yhdistettä (VIII) värittöminä, amorfei-na kiteinä.

19 79543

Tuotteen fysikaaliset arvot:

Hajoamispiste; 196-201°C

Alkuaineanalyysi gH^EN^ 2.1 4/5Η2<0, mp. 567,86 Laskettu: C 38,07; H 5,43; N 7,40 5 Saatu: C 37,80; H 5,25; N 7,20 IR".Sä cirri’ 3400 (-MH, -OH), 1700, 1670 (vC=0 amidi I), 1610 (-COO© ), 1560 (ν0=0 amidi II).

M19'5 - 15.50 (C=l, H20)

Ih-NMrPPJ MHz (DMSO - d6, t-BuOH) 1,465 (1H, t, J=llf9Hz, 3-haks) 15 1,871 (3H, S, CH3CONH-) 2,083 (1H, dd, J=ll,9Hz, 4,5Hz, 3-hek) 3,331 - 3,669 (10H, m, sialyyli-H, -0-CH2CH2-0“) 20 3,808 (1H, m, 4H) 5,052 (1H, d, J = 10,3Hz,

H

\ \ ... C ' / \

':-··· 25 N H

5,090 (1H, d, J=10,3Hz,

0 -H

\ ]

30 N

Y: 5,276 (1H, -OH) 8,113 (1H, d, J=6,6Hz f pyrimidiini- 6Ή) 35 8,245 (1H, d, J=7,3Hz, CH3CONH-) 2o 79543

Esimerkki 6

Yhdisteen (IX) valmistus

Esimerkin 5 menetelmän mukaisesti, mutta käyttäen 372 mg (0,73 mmol) esimerkissä 4 saatua yhdistet-5 tä (VII) yhdisteen (VI) asemasta ja käyttäen 1,5 ml 1-n natriumhydroksidi/vesiliuosta saatiin 373 mg (saanto 98,6 %) yhdistettä (IX).

Tuotteen fysikaaliset arvot:

Hajoamispiste: 178-183°C

10 Alkuaineanalyysi gH.^FN^NAO.j 2~4H20, mp. 589,48

Laskettu: C 36,68; H 5,64; N 7,13 Saatu: C 36,39; H 5,51; N 6,95 IR Ä em-1! 3400(-NH,-OH> 1700, 1670 (vC=0 amidi I) Θ 1610 (-COOw ), 1560 (»/C=0, amidi II) [«^V - 4,50 (Oi, H20) 20 1H-NMRPP™ Hz (DMSO-d6, t-BuOH) 1,242 (1H, t, J=llt7Hz, 3-haks), 1,888 (3H, S, CH3CONH) • : 2,650 (1H, dd, J=llf7Hz, 25 4 f 6Hz, 3-hek ) 3,18 - 3f58 (10H, m, sialyyli-H, -O-CH2CH2-O-) 3,725 (1H, m, 4-H) 30 4,793 (1H, m, -OH) 5,035 (2H, S, -OCH2N n) 21 79543 5,235 (lH, S, -OH) 6,338 (1H, S, -OH) 8,118 (2H, d, J=6,4Hz, pyrimidiini- 5 6 Ή) 8,439 (1H, d, J=6,lHz, CH3CONH-)

Esimerkki 7

Yhdisteen (X) valmistus (1) 10 Liuokseen, jossa oli 100 mg (1,28 mmol) esi merkissä 5 saatua yhdistettä (VIII) ja 30 ml tislattua vettä, lisättiin n. 3 ml Dowex 50W-X8:aa (H-muoto) ja sekoitettiin tunti huoneen lämpötilassa. Muodostuneen liuoksen pH oli 4.

15 Suodos, joka saatiin suodattamalla reaktioseos, kylmäkuivattiin ja saatiin 84 mg (saanto 89,2 %) yhdistettä (X) värittöminä, amorfeina kiteinä.

Tuotteen fysikaaliset arvot:

Hajoamispiste: 138-148°C

20 Alkuaineanalyysi C1 gH^FN^ 2.11 /10H2O, mp. 515,25

Laskettu: C 41,96; H 5,52; N 8,16

Saatu: C 41,70; H 5,20; N 8,08 IRp1®/ -1: 3400 (-OH, -NH-) ,

males cm A

1700(-COOH), 1680(-NHCO-) : · 25 lH-NMR^S MHz (DMSO-d6) 1,620 (1H, t, J=12,5Hz, 3-haks), 1,961 (3H, S, CH3CONH-) 3Q 2,257 (1H, dd, J=12f5Hz, 4,5Hz, 3-hek) 3,90 - 3,89 (1H, mr 4-H), 5,136 (2H, S, -OCH2NCT:) 35 7,972 (1H, d, J=6,0Hz, pyrimidiini- 6 ' H) M 1V - 16,80 (C-l, h20) 22 79543

Esimerkki 8

Yhdisteen (XI) valmistus (1)

Esimerkin 7 menetelmän mukaisesti, mutta käyt-^ täen 102 mg (0,20 mmol) esimerkissä 6 saatua yhdistet tä (IX) yhdisteen (VIII) asemasta saatiin 90,4 mg (saanto 92,4 %) yhdistettä (XI).

Yhdisteen (XI) fysikaaliset arvot:

Hajoamispiste; 123-128°C

10

Alkuaineanalyysi G-| gH26FN3°1 2 *H20/ mp* 513'45

Laskettu: C 42,11; H 3,70; N 8,18

Saatu: C 41,85; H 3,41; N 8,10 IR P . 3400 (—OH, —NH—) , maks cm'·1· 1700(-COOH), 1680(-NHCO-), 1-H-NMrPP” MHz (DMSO-d6) , 1,572 (1H, t, J=12,2Hz, 3-haks) , 1,953 (3H, S, CH3CONH-), 20 2,655 (1H, dd, J=12,2Hz, .· 4,5Hz, 3-hek), / 3,82 - 3,90 (1H, m, 4-H), . 5,124 (2H, S, -OCH2NrZ) 25 7,975 (1H, d, J-6,0Hz, pyrimidiini· ·6 1 H) [ftj19^5 _ 5tQO (C=l, H20) : 30 Esimerkki 9 : Yhdisteen (X) valmistus (2) 100 mg (0,196 mmol) esimerkissä 3 saatua yhdistettä (VI) liuotettiin 2 ml vettä ja lisättiin 0,2 ml 1-n natriumhydroksidi/vesiliuosta. Kun oli sekoitettu 33 3 tuntia huoneenlämpötilassa, reaktioseokseen lisättiin 23 79543

Dowex 50W-X8:aa (H-muoto), sekoitettiin n. 30 minuuttia, suodatettiin ja pestiin vedellä. Suodos ja pesu-liuos kylmäkuivattiin ja saatiin 90 mg (saanto 93 %) yhdistettä (X).

5 Esimerkki 10

Yhdisteen (XI) valmistus (2)

Esimerkin 9 menetelmän mukaisesti, mutta käyttäen esimerkissä 4 saatua yhdistettä (VII) yhdisteen (VI) asemasta saatiin 88 mg (saanto 91 %) yhdistet-10 tä (XI).

Claims (8)

24 7 9 5 4 3

1. Menetelmä immunologisesti aktiivisen glykosidin valmistamiseksi, jolla on yleinen kaava I 5 f3 or3 / °R3 / °"/S'R 1 ch3conh-/ 2

10 OR3 jossa on ryhmä, jolla on kaava III' 0 JL / f HN |f III' 15 CH2-0-CH2-CH2-0- ja R2 on alkoksikarbonyyliryhmä tai vapaa tai suolan muodossa oleva karboksyyliryhmä, 20 tai R^ on alkoksikarbonyyliryhmä tai vapaa tai suolan muodossa oleva karboksyyliryhmä, ja R2 on ryhmä, jolla on kaava III' : O HN

25. I : ο^γ III' ch2-o-ch2-ch2-o- ja R3 on vetyatomi tai asetyyliryhmä, 30 tunnettu siitä, että a) yhdiste, jolla on kaava II or3 ; or3 /C1 35 0R3 / °~~7\ : CH3CONH -__l—COO-Alk χχ OR· 25 79543 jossa Aik on alkyyli ja Rjj on asetyyli, saatetaan reagoimaan yhdisteen kanssa, jolla on kaava III rV CH2OCH2CH2OH hopeatrifluorimetaanisulfonaatin läsnäollessa, tai elohopea (II)bromidin, elohopea(II)syanidin tai näiden seok-10 sen läsnäollessa, jolloin saadaan kaavan I mukainen yh diste, jossa R^ on kaavan III' mukainen ryhmä ja R2 on alkoksikarbonyyli, tai R^ on alkoksikarbonyyli ja R2 on kaavan III' mukainen ryhmä, ja R^ on asetyyli, tai b) kaavan I mukaisen yhdisteen valmistamiseksi, 15 jossa R^ on kaavan III' mukainen ryhmä ja R2 on alkoksi karbonyyli, tai on alkoksikarbonyyli ja R2 on kaavan III' mukainen ryhmä, ja R^ on vetyatomi, vastaavasta kaavan I mukaisesta yhdisteestä, jossa R^ on asetyyli, poistetaan selektiivisesti asetyyliryhmätR^, tai 20 c) kaavan I mukaisen yhdisteen valmistamiseksi, jossa R^ on kaavan III' mukainen ryhmä ja R2 on vapaa tai suolan muodossa oleva karboksyyliryhmä, tai R^ on vapaa tai suolan muodossa oleva karboksyyliryhmä ja R2 on kaavan III' mukainen ryhmä, ja R^ on vetyatomi, vastaavasta 25 kaavan I mukaisesta yhdisteestä, jossa R^ tai vastaavasti R2 on alkoksikarbonyyliryhmä, hydrolysoidaan tämä alkoksi-karbonyyliryhmä, ja mikäli saadussa yhdisteessä R^ tai vastaavasti R2 on suolan muodossa oleva karboksyyliryhmä, tämä muutetaan haluttaessa vapaaksi karboksyyliryhmäksi 30 hapon avulla.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että alkoksikarbonyyliryhmä R^ tai R2 on metoksikarbonyyli.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 35 tunnettu siitä, että suolan muodossa oleva karb oksyyliryhmä R^ tai R2 on -COONa. 26 79543

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että menetelmässä a) reaktio suoritetaan liuottimessa.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, 5 tunnettu siitä, että liuotin on ryhmästä tetra- hydrofuraani, asetonitriili ja metyleenikloridi.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että menetelmässä a) reaktio suoritetaan lämpötilassa huoneen lämpötilasta -50°C:seen 10 n. 5 - 60 minuutissa.

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että menetelmässä b) asetyyli-ryhmätR^ poistetaan natriummetoksidin avulla metanolissa.

8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 15 tunnettu siitä, että menetelmässä c) hydrolyysi suoritetaan natriumhydroksidiliuoksessa. 2V 79543