FI61807B - Foerfarande foer stabilisering av meningokockpolysackarid - Google Patents

Description

1»Λ^·;ΐ , , KUULUTUSJULKAISU ,1ftno LBJ (11) UTLÄGG N I NGSSKRI FT OloU/ • (45) ^ ^ (51) Kv.iii?/int.ci? A 61 K 39/095 SUOMI — FINLAND (21) P«enttlh»k«inu* — Pitenunsöknin* 783250 (22) H»k*ml»pilvi — An»ttknlng*d»g 25.10.78 ^ ® ) (23) Alkupilvi — Gfltlghctsdag 25-10.78 (41) Tullut julkiseksi — Bllvlt offentllg 28. OU. 7 9

Patentti- ja rekisterihallitus (44) Nihtlvlkalpanon ja kuul.julkabun pvm.- on Ao

Patent- och registerstyrelsen Anaökan utlagd och utl.skrlffn publkerad 80.00. 02 (32)(33)(31) Pyydetty etuoikeus—Begird prlorltet 27-10.77

Saksan Liittotasavalta-Förbundsrepubliken

Tyskland(DE) P 27U8132.9 (71) Behringwerke Aktiengesellschaft, D-3550 Marburg/Lahn, Saksan Liitto-tasavalta-Förbundsrepubliken Tyskland(DE) (72) Gerhard Guthöhrlein, Marburg/Lahn, Torsten Bertil Helting, Marburg/

Lahn, Saksan Liittotasavalta-Förbundsrepubliken Tyskland(DE) (7^) Oy Kolster Ab (5M Mene telinä meningokokkipolysakkaridin stabilisoimi seksi - Förfarande för stabilisering av meningokockpolysackarid

Keksinnön kohteena on menetelmä meningokokkipolysakkaridin stabilisoimiseksi. Erityisesti keksinnön kohteena on ryhmän A meningokokkikapselipolysakkaridien stabilointi.

Tunnetut rokotteet meningokokkien aiheuttamaa meningitistä (aivoselkäydinkalvon tulehdusta) vastaan sisältävät olennaisina vaikuttavina komponentteina ryhmäspesifisiä polysakkarideja, joita voidaan eristää serologisten ryhmien A ja C meningokokeista. Polysakkaridit valmistetaan meningokokkiviljelmistä ja puhdistetaan erilaisin saostus- ja uuttovaihein (vrt. E.C.Gotschlich at ai., Progr. immunbiol. Standard., Voi. 5, s. 485-491. Karger, Basel, 1972 ja WHO Technical Report Ser. No 594, S. 66/67, 1976).

Meningokokkipolysakkaridien ja niistä valmistettujen rokotteiden varastointikestävyys ei tavallisesti ole tyydyttävä, minkä johdosta vaikutusaineiden immunoiva vaikutus kärsii. Jopa kuivassa, ts. lyofiloidussa tilassa meningokokkirokotteet ovat epätavallisen pysymättömiä. Vieläpä alle 1%:n vesipitoisuudessa kuivamassasta tapahtuu hydrolysoitumista muutamien kuukausien kuluessa osoitettavassa määrässä varastoitaessa rokotteita n. 4°C:ssa, korkeammissa lämpötiloissa jo yhden viikon aikana. Tämän vuoksi meningokokki-polysakkarideja yleensä säilytetään pakastettuina.

2 61807

Meningokokkipolypolysakkaridien hydrolyysi johtaa depolymeroi-tumiseen ja siten niitä sisältävän rokotteen ei-toivottuun immunogeni-teetin alenemiseen. Depolymeroitumista voidaan seurata määrittämällä tapahtuneet muutokset molekyylipainoissa kromatografisesti.

Rijks Institut voor de Volksgezondheind'in, Bilthoven, Bull. Hlth. Org., 55, 43-98, 1977 tutkimuksista on tunnettua, että laktoosi aiheuttaa huomattavan parannuksen meningokokkipolysakkaridien varas-tointikestävyyteen.

Selitystä laktoosin aiheuttamaan stabiliteetin lisääntymiseen verrattuna aikaisemmin käytettyyn, mutta ei kuitenkaan tyydyttävään mannitoliin, ei ole voitu antaa.

Nyt on yllättäen havaittu, että hydraatteja muodostavat yhdisteet, joista vesi poistuu pakastekuivausolosuhteissa ja jotka senjäl-keen hydratoituvat palautuvasti, pystyvät laktoosin lisäksi stabiloimaan meningokokkipolysakkarideja, jolloin laktoosi voidaan korvata joko kokonaan tai osittain tällaisella yhdisteellä.

Näitä ovat sakkaroosi, raffinoosi, glukoosi, trehaloosi, glyserofosfaatti ja glutaminaatti. Edullisimpia ovat sakkaroosi ja raffinoosi, käytettynä yksinään tai seoksina jonkun edellä mainitun yhdisteen tai laktoosin kanssa.

Stabilointia varten lisätään n. 100 jjg vesiliuoksessa olevaa meningokokkipolysakkaridia kohti vähintään 0,3 mg, edullisesti 1-100 mg näitä yhdisteitä. Mainitut painomäärät ovat 1 ml:ssa vesiliuosta, joka sopii rokotteeksi.

Täten keksinnön kohteena on menetelmä meningokokkipolysakka-ridin stabiloimiseksi, jolloin sen vesiliuokseen lisätään n. 100 ^ig polysakkaridia kohti vähintään 0,3 mg ainakin yhtä fysiologisesti siedettävää, hydraattia muodostavaa yhdistettä, josta voidaan pakastekuivausolosuhteissa reversiibelisti poistaa vettä, jolloin tätä yhdiste on sakkaroosi, raffinoosi, glukoosi, trehaloosi, glyserofosfaatti tai glutaminaatti, sekoitettuna mahdollisesti laktoosin kanssa, minkä jälkeen seos kuivataan. Kuivauksen jälkeen seos edullisesti pakaste-kuivataan. Stabiloitava meningokokkipolysakkaridin vesiliuos voi muodostaa joko välituotteen rokotteen valmistusta varten tai parenteraali-sesti annettavaksi sopivan rokotevalmisteen.

Eräässä edullisessa suoritusmuodossa käytetään vähintään yhtä näistä stabiloivista yhdisteistä 5-20 mg/ml pitoisuudessa ruiskeena annettavassa rokoteliuoksessa. Liian suurella stabiloimis- 3 61807 aineen pitoisuudella, esimerkiksi sakkaroosipitoisuuden ollessa yli 100 mg/ml, saadaan hypertonisia liuoksia, niin että ruoansulatuskanavan ulkopuolisesta annettavan vastaavan polysakkaridirokotteen valmistuksessa ei näytä tarkoituksenmukaiselta ylittää tätä pitoisuutta.

Vaikka keksinnön mukaiset yhdisteet liuoksen lyofiloinnin jälkeen antavat meningokokkipolysakkaridille erinomaisen pysyvyyden, saattaa usein olla tarkoituksenmukaista, että stabiloimisaineita ei käytetä yksinään, vaan seoksina, jotka sisältävät useampaa stabiloimisainetta. Tällaisilla seoksilla on mahdollisesti synergis-tinen vaikutus, ja ne johtavat meningokokkipolysakkaridien varastointi-kestävyyden edelleen lisääntymiseen. Tällainen synergistinen vaikutus havaitaan erityisesti seoksilla, joissa on kahta mainituista stabi-loimisaineista moolisuhteessa 1:2 - 2:1.

Meningokokkipolysakkaridien valmistuksessa menetellään edullisesti WHO Technical Report Ser. no 594, s. 66/67, 1976, mukaisesti seuraavasti:

Meningokokkiviljelmään tai sen viljelyliuoksen supernatanttiin lisätään 0,1 - 0,3 % setyylitrimetyyliammoniumbromidia (=Cetavlon) ja sakka otetaan talteen 2-24 tunnin kuluttua sedimentoimalla tai linkoamalla. Tämän jälkeen sedimentti uutetaan 0,8-2-raolaarisella, edullisesti 1-molaarisella kalsiumkloridin vesiliuoksella, lisätään 20-30 %, edullisesti 25 % (tilav./tilav) etanolia ja supernantti otetaan talteen linkoamalla. Välituote saostetaan lisäämällä edelleen etanolia 70-85 %:iin asti, edullisesti 80 % (tilav./tilav.) ja otetaan talteen linkoamalla.

Välituote kootaan sitten neutraaliin tai heikosti emäksiseen vesipitoiseen väliaineeseen, esim. 0,1-0,4 M natriumasetaattiliuok-seen ja uutetaan senjälkeen fenolilla. Käytetään puskurilla kyllästettyä fenoliliuosta (koostumus: 100 g fenolia + 40 ml puskuria). Vesifaasia dialysoidaan 0,1 M kalsiumkloridiliuosta vastaan, minkä jälkeen se ultrasentrifugoidaan. Lopuksi polysakkaridi saostetaan jonkin alkoholin, edullisesti etanolin avulla, ja kuivataan. Tuotetta säilytetään -20°C:ssa.

Uudelleen liuotettuun meningokokkipolysakkaridiin lisätään kuten edellä kuvattiin vähintään yksi stabiloiva yhdiste, joka on sakkaroosi, raffinoosi, glukoosi, trehaloosi, glyserofosfaatti tai glutaminaatti sekoitettuna mahdollisesti laktoosin kanssa ja tuote lyofiloidaan.

4 61 807

Keksinnön mukaisella menetelmällä stabiloidulla rokotteella on esimerkiksi seuraava koostumus: 1. N. meningitidis ryhmän A polysakkaridia 2,5 mg sakkaroosia 250 mg

Lyofiloidussa tuotteessa ei kuukauden varastoinnin aikana 37°C:ssa havaita käytännöllisesti katsoen lainkaan polymeroitumis-asteen alentumista. Kd-arvo, joka varastoinnin alkaessa oli 0,26, nousi 0,29:ään. Sitä vastoin tapahtui samanlaisissa olosuhteissa laktoosilla stabiloidussa näytteessä Kd-arvon nousu 0,26 ml:sta -0,35:een.

Rokotteen valmistusta varten liuotetaan lyofilaatti 25 ml:aan fysiologisesti siedettävää liuotinta. Tähän käytetään liuosta, joka sisältää 7 mg NaCl/ml, 0,015 moolia/1 natriumfosfaattipuskuria (pH 7,4) ja 0,05 mg natriumtimeerifonaattia/ml.

2. N. meningitidis ryhmän A polysakkaridia 2,5 mg laktoosia 125 mg sakkaroosia 125 mg

Lyofiloidun tuotteen varastoinnin aikana 56°C:ssa lisääntyy polysakkaridin Kd-arvo 2 kuukauden aikana 0,26:sta 0,48:aan. Tuotteiden, jotka on vastaavissa olosuhteissa stabiloitu lisäämällä 250 mg laktoosia tai 250 mg sakkaroosia, Kd-arvot ovat saman aikavälin jälkeen 0,7.

(R)

Kd määritetään kromatografisesti Sepharose 4B:lla ja määritellään seuraavalla yhtälöllä: K, = V - V d _e_o V - V T o

Vg = eluaatin tilavuus kromatografoinnin aloittamisesta polysakkaridiantigeenin pääkomponentin eluutiomaksi-miin.

Vq = kokonaan ekskludoituneen aineen, esim. suurmolekyyli-sen Blue-dekstraanin eluutiotilavuus.

VT kokonaan inkludoituneen aineen, esim. radioaktiivises-ti merkityn veden eluutiotilavuus.

Määritelmä tarkoittaa, että O < K^ 1. Raja-arvot saavutetaan täydellisesti ekskludoituneella aineella (K^=0) tai täydellisesti inkludoituneella aineella (Κ^=1). Suuremmalla K^-arvolla on molekyylin koko pienentynyt. Tässä esitetyssä tapauksessa osoittaa kasvava K^-arvo, että meningokokkipolysakkaridi depolymeroituu.