FI120148B - Menetelmä beta-sitostanolirasvahappoesterin tai esteriseoksen valmistamiseksi - Google Patents

Description

Menetelmä β-sitostanolirasvahappoesterin tai esteriseoksen valmistami seksi - Förfarande för framställning av en β-sitostanolfettsyraester eiler esterblandning 5 Tämä hakemus on jakamalla erotettu hakemuksesta FI-20011891.

Tämä keksintö kohdistuu seerumin kolesterolipitoisuutta alentavaan aineeseen ja sen käyttöön.

Suoliston rasva-aineenvaihduntaa muuttamalla voidaan tehokkaasti alentaa seerumin korkeaa kolesterolitasoa. Tällöin vaikutuskohteena voi olla triglyseridien, 10 kolesterolin tai sappihappojen imeytymisen häiritseminen. Tiettyjen kasvistero-lien, kuten β-sitosterolin (24-etyyli-5-kolesteeni-3p-oli) ja sen kovetetun muodon, β-sitostanolin (24-etyyli-5a-kolestaani-3p-oli), on monessa tutkimuksessa todettu alentavan seerumin kolesterolitasoa vähentämällä dietaarisen kolesterolin imeytymistä suolistosta (1-25). Kasvisterolien käyttöä voidaan pitää turvallisena, koska 15 kasvisterolit ovat luonnollisia kasvirasvojen ja -öljyjen komponentteja. Itse kasvi-sterolit eivät imeydy suolistosta tai ne imeytyvät erittäin pieninä pitoisuuksina.

Seerumin kolesterolin laskuun, erityisesti LDL-kolesterolin laskuun, liittyy selvästi alentunut sepelvaltimotaudin esiintyminen. Seerumin korkea kolesteroliarvo on merkittävin yksittäinen sepelvaltimotaudin riski-indikaattori.

20 Kolesterolin imeytymisaste riippuu perinnöllisestä ominaisuudesta, apoproteiini E-fenotyypistä. Apoproteiini E on seerumin lipoproteiineihin kuuluva valkuaisaine, joka osallistuu kolesterolin kuljetukseen elimistössä (26). Imeytymiseen vaikuttavan lipoproteiinin, apoproteiini E:n, synteesiin liittyviä alleeleja tunnetaan kolme erilaista tyyppiä, e2, e3, ja e4, jotka yhdistyvät pareittain sattumanvaraisesti.

25 Alleelit voivat muodostaa kaikkiaan kuusi erilaista yhdistelmää. Mitä suurempi alaindeksien summa on, sitä paremmin kolesteroli imeytyy, ja sitä korkeampi on kolesterolin, erityisesti pahanlaatuisen LDL-kolesterolin pitoisuus seerumissa (27). Suomalaisten perintötekijöissä e4 alleen on yliedustettuna siten, että sen osuus on lähes kaksinkertainen moniin Euroopan populaatioihin verrattuna (28).

30 Suomalaiset ovatkin poikkeuksellisen herkkiä ravinnon dieettivirheille, rasvaiselle ^ ja kolesterolipitoiselle ravinnolle (29).

Seerumin kolesterolipitoisuutta voidaan dietaarisln keinoin alentaa kiinnittämällä huomiota nautitun rasvan määrään ja laatuun sekä syödyn kolesterolin määrään. Käytännössä nämä keinot eivät kuitenkaan aina johda tyydyttävään lopputulok- 2 seen. On etsittävä myös muita, koko väestölle sopivia tapoja saavuttaa nykyistä alhaisempi seerumin kolesterolitaso. Ravinnon kuitupitoisuuden lisääminen on teholtaan rajallinen keino. Ravinnon liukoisen kuidun kolesterolia alentava vaikutus perustuu sappihappojen sitomiseen ja poistamiseen. Koska kolesterolin 5 imeytymisellä on perustavaa laatua oleva merkitys seerumin kolesterolitason säätelyssä, on loogista pyrkiä kehittämään sellaisia keinoja, joiden avulla voidaan estää tai vähentää kolesterolin imeytymistä.

Pollak osoitti nautitun kasvisterolin alentavan seerumin kolesterolitasoa ihmisellä (1). Sama oli aiemmin todettu koe-eläimillä (2,3). Suurten kasvisteroliannosten on 10 todettu alentavan seerumin kolesterolitasoa useissa tutkimuksissa, parhaimmillaan 10-20 % (4,5). Näissä kokeissa on käytetty suuria määriä, ad 24 g/päivä, kiteisessä muodossa olevaa β-sitosterolia (6). Eräissä kokeissa on seerumin kolesterolitaso alentunut merkitsevästi pienemmilläkin annoksilla (7), vaikka liukoinen, rasvahappoestereinä annettu pieni sitosterolimäärä ei näyttänyt alentavan 15 seerumin kolesterolia kovinkaan tehokkaasti (8). Sitosterolivalmisteet ovat yleensä olleet pitkäaikaiskäytössä hyvin siedettyjä (9).

Luonnon kasvisterolit muistuttavat rakenteeltaan kolesterolia. Kolesteroli- ja kasvisterolimolekyylin erot löytyvät lähinnä perusrungon sivuketjun rakenteesta.

Tavallinen ruokavalio sisältää kasvisteroleja 100-300 mg/vrk. Pääosa dieetin 20 kasvisterolista on β-sitosterolia, ja noin kolmasosa kampesterolia. Myös saturoituja 5a-sitostanoleita esiintyy ravinnossa pieniä määriä. Tavallisesti erityisesti seerumin kampesterolipitoisuudet heijastavat kolesterolin imeytymisastetta (10, 11, 12). Dieetin sisältämien kasvisterolien määrissä esiintyvä vaihtelu vaikuttaa seerumin kolesterolipitoisuuteen, mutta tämä on huonosti tutkittu alue. Kasviste-25 rolit imeytyvät suolistosta niukasti. Elimistöön vähäisessä määrin imeytyvät kasvisterolit (alle 10% sterolimäärästä) (30, 31, 32) erittyvät sappeen ja sitä kautta ulosteeseen. Sterolipitoisuudet on nykyisin helppo mitata kaasukromatografisilla menetelmillä ravinto-, seerumi- tai ulostenäytteistä. Pitoisuudet seerumissa riippuvat osittain ravinnosta saaduista kasvisterolimääristä ja sterolien imeyty-30 mistehokkuudesta. Yleensä seerumin kasvisterolipitoisuudet jäävät alle 1/300 seerumin kolesterolipitoisuudesta, koska imeytynyt kasvisterolifraktio eritetään elimistöstä sapen mukana. f

Suuretkaan nautitut kasvisteroliannokset eivät näy seerumin kasvisterolipitoisuuk-sissa. Arvot pysyvät normaalitasolla, koska ihmisellä kasvisterolien imeytymiska-35 pasiteetti kyllästyy nopeasti. Seerumin kasvisterolipitoisuus nousee haitalliselle 3 tasolle muutamissa harvinaisissa sairauksissa, kuten serebrotendinoottisessa ksantomatoosissa ja sitosterolemiassa (33, 34, 35), joiden yhteydessä myös sepelvaltimotauti on tavallinen. Näitä sairauksia on korkeintaan muutama tapaus miljoonaa asukasta kohden. Suomessa ei ole havaittu yhtään tautitapausta. Erä-5 itä maksasairauksia sairastavilla potilailla tavataan ajoittain korkeita kasvistero-liarvoja (36).

Kolesteroliainevaihduntatutkimukset ovat osoittaneet sitosterolin estävän sekä endogeenisen että dietaarisen kolesterolin imeytymistä suolistosta (13,14). Tämän seurauksena neutraalisteroidien eritys ulosteeseen lisääntyy, mikä johtaa 10 kolesterolipulaan maksassa ja sitä kautta alentuneeseen seerumin kolesterolipitoisuuteen. Sappihappojen imeytymiseen sitosteroli ei sen sijaan vaikuta (13).

Eläinkokeiden perusteella näyttää sitosterolin vaikutus perustuvan sen kykyyn syrjäyttää ravinnon kolesteroli sappihappomisellistä (15, 16, 17). Samanlaisia tuloksia on saatu myös ihmisellä (37). Eri kasvisterolien on osoitettu vaikuttavan 15 eri tavalla kolesterolin imeytymiseen (19, 38). Aiempien koe-eläimillä suoritettujen tutkimusten perusteella saa vaikutelman, että sitostanoli alentaa tehokkaimmin kolesterolin imeytymistä (38) ja on itse lähes imeytymätön. Lisäksi kontrolloimaton kuudella henkilöllä suoritettu tutkimus osoitti vapaan sitostanolin (1,5 g/vrk) alentavan neljän viikon aikana seerumin kolesterolia (pääosin LDL-kolesterolia) 20 jopa 15 %. Kahden viikon tauon aikana kolesteroliarvot palautuivat ennalleen (20). Useimmat kasvisterolivalmisteet sisältävät monia eri kasvisteroleja. Kasvi-steroliseoksen vaikutus kolesterolin imeytymiseen vaihtelee, samoin niiden oma imeytyminen (21, 22, 23).

Tähänastisissa tutkimuksissa on pääasiassa keskitytty selvittämään sitä, miten 25 kasvisterolien annostelumuoto (kiteinen, suspensio, granula) vaikuttaa näiden tehoon alentaa seerumin kolesterolitasoa. Kiteiset kasvisterolit eivät liukene merkittävästi ruoansulatuskanavassa misellifaasiin, eivätkä ne siten pysty tehokkaasti estämään kolesterolin imeytymistä. Öljyt ja rasvat pystyvät liuottamaan ainoastaan rajoitetusti vapaita steroleita. Vain liuenneessa muodossa olevat sterolit 30 estävät kolesterolin imeytymisen. Heinemannin ja työtovereitten (24) mukaan sitostanoli esti infuusiokokeessa kolesterolin imeytymisen 82-prosenttisesti, sitosterolin estäessä imeytymistä vastaavasti 50 %.

4 Ί ί

Eräissä tutkimuksissa on käytetty sitosterolin rasvahappoestereitä, kuten sitoste-roliasetaattia tai -oleaattia tai stigmasterolin oleaattia rasvaan liuotettuna. Rotta-kokeissa tällainen "öljy", jonka sterolipitoisuus oli ad 8 %, vähensi kolesterolin absorptiota 20-40 % (22). Runsaskolesterolisen dieetin (500 mg/vrk) aikana sito-5 sterolioleaatti (2 g/vrk) rasvaan liuotettuna vähensi kolesterolin imeytymistä koehenkilöillä keskimäärin 33 % (25). Samassa tutkimuksessa sitosteroli ruokaan sekoitettuna ja pienemmällä annostuksella (1 g/vrk) alensi kolesterolin imeytymistä 42 %.

Saksalainen patentti (Deutsches Patentamt, Offenlegungsschrift 10 2035069/28.01.71) koskee kasvisterolirasvahappoestereiden lisäämistä ruoka- öljyyn tavoitteena ihmisen seerumin kolesterolitason alentaminen. Mainitussa patentissa on esitetty käytettäväksi vapaiden sterolien esteröimiseen menetelmää, joka ei missään tapauksessa täytä elintarvikekelpoisen tuotteen valmistus-vaatimuksia. Patentin mukaan esteröinti suoritetaan vapaan sterolin ja rasvahap-15 poanhydridin välillä perkloorihapon toimiessa katalyyttinä. Käytettyä katalyyttiä ja reagenssia ei voida hyväksyä elintarvikeprosessissa. Lisäksi kyseinen patentti koskee ainoastaan natiivien kasvisterolien rasvahappoestereitä.

Julkaisusta EP-A2-195 311 on tunnettua esteröidä mm. β-sitosterolia rasvahapoilla käyttäen entsyymiä.

20 Sterolirasvahappoestereiden valmistuksessa on käytetty monia reagensseja, joita ei voida hyväksyä elintarvikkeeksi tai elintarvikkeen lisäaineeksi tarkoitetun tuotteen valmistuksessa. Yleisiä ovat mm. rasvahappojen kloori- (39), bromi- (40), tionyylikloridi- (41) tai anhydridijohdannaisten (42) käyttö. Aiemmin tunnetuista menetelmistä vain Baltesin menetelmä (Deutsches Patentamt, Offenlegungssch-25 rift 2248921/11.04.74) öljyjen ja rasvojen sisältämien sterolien esteröimiseksi kemiallisella vaihtoesteröintitekniikalla täyttää elintarvikeprosessien edellyttämät kriteerit. Mainitussa patentissa vapaa steroli ja ylimäärä rasvahappoestereitä lisätään öljy- tai rasvaseokseen, minkä jälkeen koko rasvaseos vaihtoesteröidään yleisesti tunnetulla vaihtoesteröintitekniikalla.

30 Keksinnön pääasialliset tunnusmerkit ilmenevät oheisista patenttivaatimuksista.

Esillä oleva keksintö koskee siis kokonaan toisentyyppisen sterolin käyttöä seerumin kolesterolitason alentamiseen. Kyseessä on 5a-tyydytettyjen steroleiden rasvahappoesterit, erityisesti sitostanolirasvahappoesterit (sitostanoli= 24-etyyli-5 a-kolestaani-3p-oli), joiden on havaittu alentavan seerumin kolesterolitasoa erityi- 5 sen tehokkaasti. Kyseisiä estereitä voidaan valmistaa ja käyttää sellaisenaan, tai lisätä elintarvikkeisiin, erityisesti elintarvikkeen rasvaosaan. Sitostanoliras-vahappoesteriseos valmistetaan kovettamalla kaupallista β-sitosteroliseosta (sitosterol 24-etyyli-5-kolesteenϊ-3β-οIi). β-sitostanolia voidaan valmistaa tunnettua 5 kolesterolin kovetustekniikkaa käyttäen, kovettamalla β-sitosterolia Pd/C-katalyy-tin avulla orgaanisessa liuottimessa (43). Tällä seoksella on FDA:n hyväksyntä (Cytellin, Eli Lilly). Reaktiossa saavutetaan yli 99 %:n kovettumisaste. Kovetuk-sessa käytetty katalyytti poistetaan membraanisuodattimella ja saatu sitostanoli kiteytetään, pestään ja kuivataan. ' 10 β-sitostanoliseos, joka sisältää noin 6 % kampestanolia, esteröidään eri rasva-happoesteriseoksilla yleisesti tunnetulla kemiallisella vaihtoesteröintitekniikalla (44, 45, 46) keksinnön mukaisesti. Reaktiossa voidaan käyttää minkä tahansa kasviöljyn rasvahappojen metyyliesteriseosta. Esimerkkeinä mainittakoon ryp-siöljy-metyyliesteriseos, mutta kaikki noin 2-22 hiiliatomia sisältävät rasvahapot 15 ovat käyttökelpoisia. Keksinnön mukaisten stanolirasvahappoestereiden valmistustapa poikkeaa aikaisemmista menetelmistä siinä, ettei esteröintireaktiossa käytetä muita aineita kuin vapaata stanolia, rasvahappoesteriä tai rasvahappoes-teriseosta ja katalyyttiä. Katalyyttinä voidaan käyttää mitä tahansa tunnettua vaih-toesteröintikatalyyttiä, kuten esimerkiksi Na-etylaattia.

20 Keksinnön mukaista ainetta valmistettaessa ei, toisin kuin aiemmin mainitussa Baltesin menetelmässä, itse rasvaa vaihtoesteröidä. Tällöin rasvavalmisteen tai muun elintarvikkeen rasvaosa säilyttää luontaiset ominaisuutensa. Edelleen on huomattava, että keksinnön mukainen vaihtoesteröity seos voidaan suoraan lisätä rasvapitoisiin elintarvikkeisiin tai käyttää sellaisenaan. Koska seoksen sta-25 noliosa on imeytymätön, on stanolirasvahappoesteriseoksen energiasisältö ras-vahappokoostumuksesta riippuen vain 20-40 % tavanomaisen öljyn tai rasvan energiasisällöstä. Näin ollen seoksia voidaan käyttää edullisesti myös elintarvikkeen energiasisältöä alentavana aineena.

β-sitostanolirasvahappoestereiden vaikutusta kolesterolin absorptioon ja seeru-30 min kolesteroliarvoihin ei ole aikaisemmin tutkittu. Tähän keksintöön johtaneessa tutkimuksessa selvitettiin, miten rypsiöljyyn liuotettu sitosterolin kovetettu muoto sitostanoli (koostumus: β-sitostanolia 94 % ja kampestanolia 6 %) vaikutti sekä a) vapaana että b) rasvahappoesterinä seerumin kasvisterolipitoisuuksiin. Tutkimuksen koejärjestely on esitetty liitteen 1 kaaviossa 1. Alkujaksona oli kaikilla 35 ryhmillä rypsiöljyinterventio (50 g/vrk), vertailuryhmällä kokeen ajan rypsiöljyinter- 6 ventio, ja muilla ryhmillä rypsiöljyyn lisättynä kokeen järjestelykaavion mukainen yhdiste.

Liitteen 2 taulukosta 1 nähdään, että ravinnon β-sitostanolipitoisuuden nostaminen alensi sekä β-sitosterolin että kampesterolin pitoisuutta seerumissa, mutta ei 5 aiheuttanut seerumin β-sitostanolipitoisuudessa selvää muutosta. Tuloksista nähdään myös, että liukoisessa muodossa - siis rasva-happoestereinä - nautittu β-sitostanoli vähensi kasvisterolien imeytymistä tehokkaammin kuin samaa annostusta käyttäen nautittu vapaa β-sitostanoli. β-sitostanolien rasvahappoestereiden kohdalla havaitaan lisäksi selvä annosvaste. On ilmeistä, että β-sitostanoli estää 10 myös β-sitosterolin ja kampesterolin imeytymisen, mikä nähdään näiden pitoisuuksien pienenemisenä.

Vastaavasti mitattiin myös stanolilisäysten aiheuttamat muutokset seerumin kokonais- ja LDL-kolesterolipitoisuuksissa ja kolesterolin absorptiossa. Vertailuryhmä söi tavallista rypsiöljyä ilman stanolilisäyksiä. Liitteen 3 taulukko 2 osoittaa, 15 että kolesterolin absorptio väheni tehokkaasti β-sitostanolirasvahappoesteriseok-sella (27,4 %) vaikka syöty stanolimäärä kuitenkin oli suhteellisen pieni, 895 mg/vrk. Vertailuryhmän kolesteroliabsorptio ei muuttunut. Vapaan β-sitostanolin ja β-sitostanolirasvahappoesteriseoksen vaikutus seerumin kolesterolipitoisuuteen, verrattuna vertailuryhmään, nähdään liitteen 4 taulukosta 3. β-sitos-20 tanolirasvahappoesteriseos vähensi sekä kokonaiskolesterolia että LDL-kolesterolia tehokkaammin kuin vapaa ja β-sitostanoli. Rypsiöljyyn liuotettu β-sitostanolirasvahappoesteriseos (3,2 g β-sitostanolia/vrk) vähensi kokonaiskolesterolia 9,5 % enemmän ja LDL-kolesterolia 11,6 % enemmän kuin rypsiöljy yksinään. Vastaavasti HDL/LDL-kolesterolisuhde nousi merkitsevästi 0,32:sta 25 0,52:een.

Suoritetut tutkimukset osoittavat selvästi, että β-sitostanolirasvahappoestereiden lisäyksellä esim. ravintorasvoihin voidaan saavuttaa merkittäviä etuja sekä kansanravitsemuksessa että hyperkolesterolemian hoidossa, koska 1) seos pienentää seerumin kolesteroliarvoja, 2) seos ei lisää seerumin kasvisterolipitoi-30 suuksia, 3) seosta voidaan käyttää päivittäin normaalin ruuan valmistuksessa suurinakin annoksina (0,2-20 g/vrk) rasvan substituuttina, jolloin myös energian saanti rasvasta vähenee.

Tutkimuksessa todettuja β-stanolirasvahappoestereiden aiheuttamia lipidimuutoksia on pidettävä terveyden kannalta erittäin merkittävinä. Tulosten 7 merkittävyyttä korostaa mahdollisuus käyttää yhdistettä elintarvikevalmisteiden ohella osana tavallista ruuanvalmistusta ja ruokailua. Tutkimustulokset osoittavat, että seerumin stanolipitoisuus ei interventiodieetin aikana nouse, ja että muiden kasvisterolien pitoisuudet seerumissa alenevat. Näin ollen kyseinen β-sta-5 noliesteriseos on turvallinen myös niille harvoille henkilöille, jotka absorboivat herkästi kaikkia steroleja, tai joilla on häiriöitä sterolien erityksessä. Lisäksi päivittäinen rasvasubstituutio vähentää henkilön energiansaantia, koska vaikuttava stanoliyhdiste ei imeydy, ts. se toimii energiaa tuottamattomana osana rasvaa.

Mitään näyttöä ei ole saatu siitä, että kyseinen β-stanoliesteriseos häiritsisi lipidi-10 liukoisten vitamiinien imeytymistä tai seerumin vitamiinitasoja.

Sitostanolirasvahappoesteriseoksen käyttömahdollisuudet eri rasvojen ja öljyjen osana rasvapitoisissa tuotteissa ovat laajat, koska seoksen fysikaalisia ominaisuuksia voidaan helposti muokata muuttamalla seoksen rasvahappokoostu-musta. Tämän lisäksi voidaan β-stanolirasvahappoesteriseoksen ras-15 vahappokoostumus valita esimerkiksi runsaasti monoeeneja ja polyeeneja sisältäväksi, jolloin sen teho seerumin kolesterolin alentajana korostuu.

Koska β-sitostanolirasvahappoesteriseoksen valmistukseen käytetään tavalliseen ravintoon kuuluvia raaka-aineita ja elintarviketeollisuuden yleisiä valmistusproses- ; seja, ei yhdisteen valmistukselle ja käytölle ole esteitä.

20 Esimerkki 1

Valmistettiin pilot-mittakaavassa β-sitostanoliesteriseos. 6 kg β-sitostanolia, jota oli kuivattu yli yön 60 °C:ssa, esteröitnn 8,6 kg:n kanssa rypsiöljymetyyliesteri-seosta. Esteröinti suoritettiin seuraavasti: β-sitostanolin ja rypsiöljyn rasvahappojen metyyliesteriseosta kuumennettiin reak-25 tioastiassa 90-120 °C:ssa ja 0,67-2,0 kPa:n alipaineessa. Kuivausta jatkettiin tunnin ajan, lisättiin 12 g Na-etylaattia ja reaktiota jatkettiin noin 2 tuntia. Katalyytti tuhottiin lisäämällä seokseen vettä. Faasien erottamisen jälkeen öljyfaasi kuivattiin vakuumissa.

Reaktiossa saavutetaan 98 %:n konversio. Saatu esteriseos voidaan käyttää 30 sellaisenaan lisänä rasvoissa.

8

Rypsiöljyn rasvahappojen metyylesteriseoksen sijasta reaktiossa voidaan käyttää minkä tahansa kasviöljyn rasvahappojen metyyliesteriä tai -seosta, erityisesti sellaisten rasvahappojen, jotka sisältävät noin 2-22 hiiliatomia.

Esimerkki 2 5 Lisättiin rypsiöljyyn ennen rypsiöljyn puhallusta esimerkissä 1 valmistettua β-sito-stanollesteriseosta 3, 6 ja 13 p-%. Valmistettiin mainittuja rasvaseoksia 65% sisältävät majoneesit.

Majoneesi: % rasvaseos 65,0 10 sakeuttamisaine 2,0 suola 1,0 sokeri 3,0 etikka (10 p-%) 3,0 sinappi 2,0 15 vesi 24,0 yht. 100,0

Majoneesi valmistettiin homogenoimalla tunnetulla tavalla Koruma-homogeni-saattorilla.

Majoneesien valmistuksessa ei ilmennyt mitään ongelmia eivätkä niiden aistin-20 varaiset ominaisuudet poikenneet tavanomaisten majoneesien ominaisuuksista.

Esimerkki 3

Lisättiin rypsiöljyyn ennen öljyn puhallusta esimerkissä 1 valmistettua β-sitostano-liesteriseosta 3 ja 6 p-%.

Rypsiöljy, johon oli lisätty esteriseokset, pysyi kirkkaana huoneenlämmössä eikä 25 siinä havaittu pysyvää sameutta jääkaappilämpötiloissa säilytettyinä.

Esimerkki 4

Esimerkkien 2 ja 3 mukaisissa tuotteissa voidaan öljynä käyttää myös muita kasviöljyjä, kuten esim. auringonkukka-, soija-, oliivi-ja maissiöljyä.

9

Esimerkki 5

Lisättiin esimerkissä 1 valmistettua β-sitostanoliesteriseosta tavanomaisen jää-kaappimargariinin rasvaosaan (koostumus: osittain kovetettu soijaöljy 35 %, kookos 5 %, rypsiöljy 60 %) ennen rasvaseoksen puhallusta 10 ja 20 p-%.

5 Analysoitiin seosten DP (dropping point) ja NMR-arvot 1) seos sellaisenaan 2) seos + 10 p-% esteriseosta 3) seos + 20 p-% esteriseosta

Seos Dp. NMR-arvot (%)

10 (°C) 10 °C 20 °C 30 °C 35 eC 40 °C 45 °C

1) 31,9 24,2 11,6 2,7 0,7 0,0 0,0 2) 30,4 21,4 10,0 1,8 0,2 0,0 0,0 3) 29,6 25,4 9,2 2,0 0,6 0,0 0,0

Valmistettiin 80 % rasvaa sisältävä margariini yleisesti tunnetulla tavalla. Marga-15 riinin fysikaaliset ja aistinvaraiset ominaisuudet vastasivat tavanomaisten margariinien ominaisuuksia.

Kaavio 1

Interventiotutkimuksen koejärjestely.

KOERYHMÄT

20 (n=22) * -----*----------*-------Vertailu (n=8) ---------------* β-sitostanoli (n=7) -------------*-----------*p-sitostanoliesteri (n=7) * _ ____* _________________* 25 0 vk 6 vk 15 vk 21 vk

ALKU- KOE- JATKOJAKSO

10

Taulukko 1

Rypsiöljyyn lisätyn β-sitostanolin aiheuttamat muutokset (%) seerumin kasvistero-lien pitoisuuksissa koejaksolla sekä β-sitostanoliesterin (3150 mg/vrk) osalta jatkojaksolla 5 Rypsiöljyyn Lisäyksen aiheuttama muutos (%)1 lisätty stanoli Kampesteroli β-sitosteroli β-sitostanoli (mg/vrk) β-sitostanoli (895) -18,4X -13,0X -0,6 β-sitostanoliesteri (895)2 -28,4X -23,4X -10,3 10 β-sitostanoliesteri (3150)2 -51,7X -43,3X -10,3 1) = Muutos taulukossa korjattu rypsiöljyä saaneen vertailuryhmän %-muutok-sella 2) = määrä vapaana stanolina x) = muutos merkitsevä, vertailuryhmän muutokseen verrattuna p < 0,05 15 Taulukko 2

Rypsiöljyn ja siihen liuotetun β-sitostanoliesterin vaikutus kolesterolin absorptioon

Ryhmä Kolesterolin absorptio Muutos (%) (mg/vrk) interventiojakson -alussa -lopussa 20 Vertailu Rypsiöljy Rypsiöljy 29,4 30,4 +3,4 β-sitostanoliesteri (895)1 Rypsiöljy Rypsiöljy + β-sitostanoliesteri 29,2 21,2^ -27,4 25 x) = muutos merkitsevä, p < 0,05 t) = muutos merkitsevä vertailuryhmän muutokseen verrattuna, p < 0,05 1) = määrä vapaana stanolina 11

Taulukko 3

Rypsiöljyyn lisätyn β-sitostanolin vaikutus seerumin kolesteroliarvoihin

Rypsiöljyyn lisätty Lisäyksen aiheuttama muutos, (%)1 stanoli (mg/vrk) kokonaiskolesteroli LDL-kolesteroli 5 β-sitostanoli (895) -2,1 -6,4 β-sitostanoliesteri (3150) -9,5X* -11,6* 1) = korjattu muutos rypsiöljyä saaneen vertailuryhmän %-muutoksella x) = muutos merkitsevä, p < 0,05 t) = muutos merkitsevä vertailuryhmän muutokseen verrattuna, p < 0,05 10 12 1) Poliak, O.J., Reduction of blood cholesterol in man. Circulation, 7, 702-706, (1953).

2) Peterson, D.W., Effect of soybean sterols in the diet on plasma and liver cholesterol in chicks, Pric. Soc. Exp. Biol. Med., 78, 143-147, (1951).

5 3) Poliak, O.J., Succesful prevention of experimental hypercholesterolemia and cholesterol atheroscleroses in the rabbit, Circulation, 7, 696-701, (1953).

4) Farquhar, J.W. and Sokolow, M., Response of serum lipids and lipoproteins of man to beta-sitosterol and safflower oil - A long term study, Circulation, 17, 890, (1956).

10 5) Grundy, S.M., Ahrens, E.H. Jr., and Davignon, J., The interaction of cholesterol absorption and cholesterol synthesis in man, J. Lipid Res., 10, 304, (1969).

i 6) Öster, P., Schlierf,G., Heuck, C.C., Greten, H., Gundert-Remy, U., Haase, W.,

Klose, G., Nothelfer, A., Raetzer, H., Schellenberg, B. und Schmidt-Gayk, H., 15 Sitosterin bei familiären Hyperlipoproteinämie Typ II. Eine randomisierte gekreuzte Doppelblindstudie, Dtsch. Med. Wschr., 101, 1308-1311, (1976).

7) Grundy, S.M., Dietary and drug regulation of cholesterol metabolism in man, pp. 127-159 in " Lipid Pharmacology, Voi II", Eds: Paoletti, R and Glueck, C.J.,

Academic Press, New York, 1976.

20 8) Lees, A.M., Mok, H.Y.I., McCluskey, M.A., Grundy, S.M., Plant sterols as cholesterol lowering agents: clinical trials in patients with hypercholesterolemia and studies of sterol balance, Atherosclerosis, 28, 325-338. (1977).

9) Schwartzkopf, W. and Jantke, H.-J., Dosiswirksamkeit von Beta-sitosterin bei Hypercholesterinemien der Typen il A und II B, Munch. Med. Wschr., 120, 1575, 25 (1969).

10) Tiivis, R.S., Miettinen, T.A., Serum plant sterols and their relation to cholesterol absorption, Am. J. Clin. Nutr., 43, 92-97, (1986).

11) Miettinen, T.A., Tiivis, R.S., Kesäniemi, Y.A., Serum plant sterols and cholesterol precursors reflect cholesterol absorption and synthesis in volunteers of a 30 randomly selected male population, Am. J. Epidem., 131, (1), 20-31. (1990).

13 12) Färkkilä, M.A., Tiivis, R.S., Miettinen, T.A., Regulation of plasma plant sterols levels in patients with gut resections, Scand. J. Clin. Lab. Invest., 48, 715-722, (1988).

13) Grundy, S.M., Mok, H.Y.I., Effects of low dose phytosterols on cholesterol 5 absorption in man, pp. 112-118 in "Lipoprotein metabolism”. Ed. Greten, H.,

Berlin, Heidelberg, New York: Springer-Verlag, 1976 14) Kudchodkar, B.J., Horlick, L., Sodhi, H.S., Effects of plant sterols on cholesterol metabolism in man, Atherosclerosis, 23, 239, (1976).

15) lkeda, I., Tanaka, K., Sugano, M., Vahouny, G.V., Gallo I.L., Inhibition of 10 cholesterol absorption in rats by plant sterols, J. Lipid Res., 29, 1573-1582, (1988).

16) Ikeda, I., Tanaka, K., Sugano, M., Vahouny, G.V., Gallo, I.L., Discrimination between cholesterol and sitosterol for absorption in rats, J. Lipid Res., 29, 1583-1592,(1988).

15 17) Ikeda, I., Tanabe, Y. and Sugano, M., Effects of sitosterol and sitostanol on micellar solubility of cholesterol, J. Nutr. Sei. Vitaminoi., 35, 361-369, (1989).

18) Ikeda, I., Sugano, M., Comparison of absorption and metabolism of beta-sitosterol and beta-sitostanol in rats, Atherosclerosis, 30, 227, (1978).

19) Sugano, M., Marioka, H. and Ikeda, I., A comparison of hypocholesterolemic 20 activity of β-sitosterol and β-sitostanol in rats, J, Nutr., 107, 2011-2019, (1977).

20) Heinemann, T., Leiss, O., von Bergman, K., Effects of low-dose sitostanol on serum cholesterol in patients with hypercholesterolemia, Atherosclerosis, 61, 219-223, (1986).

21) Lees, R.S., Lees, A.M., Effects of sitosterol therapy on plasma lipids and lipo-25 protein concentrations, pp. 119-124 in "Lipoprotein metabolism". Ed: Greten, H.,

Berlin, Heidelberg, New York: Springer-Verlag, 1976.

22) Mattson, F.H., Volpenhein, R.A. and Erickson, B.A.: Effect of plant sterol esters on the absorption of dietary cholesterol, J. Nutr., 107,1139-1146, (1977).

14 23) Heinemann, T, Pietruck, B., Kullak-Ublick, G., von Bergman, K., Comparison of sitosterol and sitostanol on inhibition of intestinal cholesterol absorption, Agents Actions (Suppl), 26, 117-122, (1988).

24) Heinemann, T., Kullak-Ublick, G.-K., Pietruck, B., von Bergmann, K., 5 Mechanisms of action of plant sterols on inhibition of cholesterol absorption, Eur.

J. Clin. Pharmacol., 40 Suppl. 1, S50-S63, (1991).

25) Mattson, F.H., Grundy, S.M., Crouse, J.R., Optimizing the effect of plant sterols on cholesterol absorption in man, Am. J. Clin. Nutr., 35, 697-700, (1982).

26) Kesäniemi, Y.A., Ehnholm, C., Miettinen, T.A., Intestinal cholesterol 10 absorption efficiency in man is related to apoprotein E phenotype, J. Clin. Invest., 80,578-581,(1987).

27) Kesäniemi, Y.A., Miettinen, T.A., Metabolic epidemiology of plasma cholesterol, Ann. Clin. Res., 20, 26-31, (1988).

28) Ehnholm, C., et al., Apolipoprotein polymorphism in the Finnish population: 15 gene frequencies and relation to lipoprotein concentrations, J. Lipid. Res. 27, 227-235,(1986).

29) Miettinen, T.A., Gylling, H., Vanhanen, H., Serum cholesterol response to dietary cholesterol and apoprotein E phenotype, Lancet, 2, 1261, (1988).

30) Gould, G., Absorbability of beta-sitosterol, Trans. N.Y. Acad. Sci., 2, 129, 20 (1955).

31) Gould, R.G., Jones, R.J., LeRoy, G.W., Wissler, R.W., Taylor, C.B., Absorbability of β-sitosterol in humans, Metabolism, 18, 652-662, (1969).

32) Salen, G., Ahrens, E.J., Grundy, S.M., Metabolism of β-sitosterol in man, J. Clin. Invest., 49, 952-67, (1970).

25 33) Salen, G., Kwiterowich, P.O. Jr, Shefer, S., Tint, G.S., Horak, I., Shore, V.,

Dayal, B., Horak, E., Increased plasma cholestanol and 5a-saturated plant sterol derivatives in subjects with sitosterolemia and xanthomatosis, J. Lipid Res., 26, 203-209,(1985).

34) Salen, G., Shore, V., Tint, G.S., Forte, T., Shefer, S., Horak, I., Horak, E., 30 Dayal, B., Nguyen, L., Batta, A.K., Lindgren, F.T. and Kwiterowich, P.O., Jr., 15

Increased sito-sterol absorption, decreased removal and expanded body pools compensate for reduced cholesterol synthesis in sitosterolemia with xanthomatosis. J. Lipid Res., 30,1319-1330, (1989).

35) Miettinen, T.A. Phytosterolemia, xanthomatosis and premature 5 atherosclerosis desease: a case with high plant sterol absorption, impaired sterol elimination and low cholesterol synthesis, Eur. J. Clin. Invest., 10, 27-35, (1980).

36) Nikkilä, K., Miettinen, T.A., Serum cholesterol precursors, cholestanol and plant sterols in PBC, Scand. J. Gastroenterl., 23, 967-972, (1988).

37) Miettinen, T.A., Siurala, M., Bile salts, sterols, asterol esters, glycerides and 10 fatty acids in micellar and oil phases of intestinal contents during fat digestion in man, Z. Klin. Chem. Biochem., 9, 47-52, (1971).

38) Hassan, A.S., Rampone, A.J., Intestinal absorption and lymphatic transport of cholesterol and β-sitostanol in the rat, J. Lipid Res., 20, 646-653, (1979).

39) Kuksis, A., Beveridge, J.M.R., J. Org. Chem, 25:1209, (1960).

15 40) Saroja, M., Kaimal, T.N.B., A convenient method of esterification of fatty acids. Preparation of alkyl esters, sterol esters, wax esters and trialcylglycerols,

Synthetic communications, 16,1423-1430, (1986).

41) Prabhudesai, A.V., A simple method for the preparation of cholesteryl esters,

Lipids, 12, 242-244, (1977).

20 42) Lentz, B.R., Barenholz, Y., Thompson, T.E., A simple method for the syntesis of cholesterol esters in high yield, Chemistry and Physics of Lipids, 15, 216-221, (1975).

43) Augustine, R.L. and Reardon Jr.,E.J., The palladium catalyzed hydrogenation of cholesterol, Organic preparations and procedures 1(2), 107-109, (1969).

25 44) Sreenivasan, B., Interesterification of fats, J. Am. Oil Chemists' Soc., 55, 796- 805, (1978).

45) Lo, Y.C. and Handel, A.P., Physical and chemical properties of randomly inte-resterified blends of soybean oil and tallow for use as margarine oils, J. Am. Oil Chemists' Soc., 60, 815-818, (1983)

Claims (6)

1. Menetelmä β-sitostanolirasvahappoesterin tai β-sitostanolirasvahappoeste-riseoksen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että esteröidään vapaa β-sitostanoli rasvahappoesterillä tai rasvahappoesteriseoksella vaihtoesteröintikatalyytin läsnä 5 ollessa ja ilman liuotinta.

2. Menetelmä β-sitostanolirasvahappoesterin tai β-sitostanolirasvahappo-esteriseoksen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että esteröidään vapaa β-sitostanoli rasvahappoesterillä tai rasvahappoesteriseoksella vaihtoesteröintikatalyytin läsnä ollessa, jolloin esteröintireaktiossa ei käytetä muita aineita kuin vapaata stanolia, 10 rasvahappoesteriä tai rasvahappoesteriseosta ja katalyyttiä.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vapaa β-sitostanoli esteröidään rasvahappoesterillä tai rasvahappoesteriseoksella, jonka seoksen rasvahapot sisältävät 2-22 hiiliatomia.

4. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että 15 rasvahappoesteri tai rasvahappoesteriseos on metyylirasvahappoesteri tai metyy- lirasvahappoesteriseos.

5. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että esteröinti suoritetaan noin 90-120 °C:ssa ja noin 0,67-2,0 kPa:n alipaineessa.

20 Patentkrav