FI110378B - Fermentointiliemipohjainen aminohappoeläinrehulisäosa, menetelmä sen valmistamiseksi ja sen käyttö - Google Patents

Description

110378

Fermentointiliemipohjäinen aminohappoeläinrehulisäosa, menetelmä sen valmistamiseksi ja sen käyttö

Keksintö koskee uutta eläinrehulisäosaa, jossa on 5 suuri määrä ainakin yhtä aminohappoa, menetelmää tämän valmistamiseksi fermentoimalla ja tämän käyttöä.

Eläinrehua täydennetään eläinten tarvetta vastaavilla yksityisillä aminohapoilla. Lisäosana käytetään kemiallisesti valmistetun metioniinin ohella erityisesti 10 fermentoimalla valmistettuja aminohappoja: lysiini, treo- niini ja tryptofaani. Siten esim. sioilla optimaaliseksi rehun hyväksikäytöksi = minimaaliseksi lantakertymäksi on määritelty näiden kolmen aminohapon suhde lysiini: treonii-ni: tryptofaani = 100 : 65 : 18 %, jos lysiini määritellään 15 arvona 100 % (katso T.C. Wang, M. Fuller, British Journal of Nutrition, 63, 77 - 89 (1989).

Eläinrehujen täydentämiseksi esim. L-lysiinillä toistaiseksi käytetään ylivoimaisesti eniten L-lysiinimonohydrokloridia, jonka L-lysiinipitoisuus on 80 %. 20 Koska L-lysiiniä valmistetaan fermentoimalla, mono-, hydrokloridin valmistamiseksi raa'asta fermentointiliemestä ···· on ensin kertaalleen erotettava kaikki ylimääräiset raa'an ’ * käymisliemen aineosat kustannuksia vaativin mene- telmävaihein, muutettava sitten monohydrokloridiksi ja vii-:,*·· 25 memainittu kiteytettävä.

Siksi menneinä aikoina ei ole puuttunut kokeiluja välttää kallista rehuaminohappojen, etenkään puhtaan L- : lysiinimonohydrokloridin valmistamista ja raa'an fermen- .···. tointiliemen muuttamiseksi kustannuksiltaan edullisemmin » 30 kiinteäksi eläinrehuksi. Mitkään kaikista näistä kokeista * eivät kuitenkaan ole johtaneet mihinkään taloudellisesti siedettävään tulokseen. Yksinkertainen veden poistaminen : raa'asta fermentointiliemestä johti vahvasti hygroskooppi- .···. sen ja tahmean konsentraatin muodostumiseen, jota tässä 35 muodossa ei voitu käyttää eläinrehuna. Jotta saavutettaisiin valutettava ja varastointia kestävä stabiili tuote, 2 110378 varastointia kestävä stabiili tuote, konsentraattiin oli sekoitettava suuri määrä mitä erilaisimpia lisäaineita. Tämän seurauksena kuitenkin monissa tapauksissa sitä paitsi jo suhteellisen vähäinen aminohappopitoisuus pieneni vielä 5 edelleen.

EP-B 122 163:sta tunnetaan menetelmä, jonka mukaan säilyttämällä aivan erityiset käymisolosuhteet voidaan saada raakaa fermentointilientä, joka voidaan kuivata kiinteäksi ja stabiiliksi tuotteeksi. Tätä tuotetta saadaan jäl-10 leen poistamalla vettä koko fermentointiliemestä, sen L-lysiinipitoisuus on kuitenkin vain 35 - 48 paino-% ja on siten selvästi alhaisempi kuin L-lysiinimonohydrokloridin L-lysiinipitoisuus. Tuotteeseen jäljelle jäävä biomassa vaikuttaa tällöin kuten täyteaine valuvuuden paranemiseen. 15 Keksinnön kohteena on eläinrehulisäosa, joka sisäl tää suurena konsentraationa ainakin yhtä aminohappoa vähän häiritsevien sivutuotteiden ohella. Lisäosan on oltava valmistuksessa kustannukseltaan edullinen eikä lopputuotteena kohtuuttoman hygroskooppinen tai tarttuisa. Sen lisäksi . 20 aminohappopitoisuuden on oltava yksinkertaisin keinoin « * ** standardisoitavissa. Kohteena on sen lisäksi menetelmä • · · * « · • ••I eläinrehulisäaineen valmistus ja tämän käyttö.

• 1 Eläinrehulisäosan puolesta tehtävä ratkaistaan pa- tenttivaatimuksen 1 mukaisen tuotteen mukaisesti.

! 1.j 25 Keksinnön mukainen aminohappoeläinrehulisäosa si- sältää fermentoimalla saadun aminohapon (saatujen aminohappojen) ohella vielä suurimman osan fermentointiliemen si- .·. ; sältämistä aineista.

Keksinnön mukaisen fermentointiliemipohjäisen ami-30 nohappoeläinrehulisäosan kuivamassan koostumus on seuraa- : vanlainen: · » 3 110378 vapaa aminohappo (vapaat aminohapot) 40 - 90 paino-% proteiineja enintään 10 paino-% karboksyylihappoja, joissa on vähemmän kuin 8 C-atomia enintään 8 paino-% 5 kokonaissokeri enintään 10 paino-% rasvoja ja öljyjä enintään 5 paino-% mineraalisia aineksia 3-30 paino-% Tämä tuote sisältää erittäinkin vielä suurimman osan fermentointiliemen sisältämistä aineosista, mahdollisesti 10 ottamatta lukuun ainakin osaa biomassasta tai yleensä mekaanisesti erotettavista tuotteista.

Tavalliseen tapaan tuote sisältää jäännösvettä pitoisuudeltaan vähintään 0,5 paino-%, paakkuuntumisen välttämiseksi, joskaan vesipitoisuuden ei pitäisi kuitenkaan 15 ylittää arvoa 5 paino-%.

Proteiinipitoisuus saadaan selville vähentämällä kokonaistyppipitoisuudesta epäorgaaninen typpipitoisuus ja vapaiden aminohappojen typpipitoisuus ja kertomalla saatu arvo luvulla 6,25 ( (kokonais-N-% - epäorg. N-% - aminohap- 20 po-N-%) · 6,25). Kokonaistyppipitoisuus määritetään | ” analyysin avulla Kjeldahlin mukaisesti (standardimene- telmä) , epäorgaaninen typpipitoisuus (ammoniumpitoisuus) ·”· määritetään esimerkiksi kolorimetrisesti, titrimetrisesti tai potentiometrisesti, vapaan aminohapon typpipitoisuus : 25 saadaan selville vapaiden aminohappojen kvantitatiivisen määrityksen avulla (aminohappoanalysaattori ASA) tähän liittyvän N-pitoisuuden laskennan kanssa. Epäorgaanisiksi .·. : aineiksi määritellään kaikkien epäorgaanisten kationien ja anionien kokonaismäärä.

30 Emäksiset aminohapot ovat suoloina ja sen vuoksi : niiden mineraalisten ainesten minimipitoisuus on suurempi ί : (raakatuotteessa väh. 10 %) ja vapaan aminohapon maksimi- ,·’ ; pitoisuus alhaisempi (raakatuotteessa enintään 72 %, eri- tyisesti enintään 67 %) . Maksimiarvo määritetään tällöin 35 anionin (esim. 0^2~; Cl") osalta, yleensä suurempi arvo emäksisten aminohappojen yhteydessä voidaan asettaa 4 110378 90 %:iksi suolan vapaan aminohappoemäksen teoreettisesta pitoisuudesta (esimerkki: (lysiini)2 · H2SO4 sisältää 75 paino-% lysiiniä, vastaava keksinnön mukainen tuote sisältää enintään 75 · 0,9 = 67,5 paino-% lysiiniä).

5 Pitoisuus määritetään lisäksi vielä käytetyistä mikro-organismeista ja lisätyistä fermentointiväliaineista.

Suuria aminohappopitoisuuksia, enintään 90 % kuiva-painosta, voidaan saada esimerkiksi valmistettaessa treo-niinia Escherichia coli BKIIM B-3996:lla (FR-A 2 640 640) 10 johtuen tällöin erityisesti suhteellisen yksinkertaisista väliaineista.

Valmistettaessa lysiiniä tai tryptofaania Co-rynebacterium glutamicumin tai Escherichia coli K12-johdannaisilla aminohappopitoisuus raakatuotteessa on hiu-15 kan alhaisempi, erityisesti tryptofaanin yhteydessä fermen-toitaessa tyypillisiä ovat silloin enintään 70 paino-%:n maksimipitoisuudet.

Fermentointiliemi-aminohappopohjan osalta pätee, että ainakin osa (ensisijaisesti pääosa) lisäosasta on fer-. 20 mentointiliemen kuivamassaa, lukuun ottamatta mekaanisin I ” erotusmenetelmin poistettavissa olevia aineita, jotka voi- ···· vat olla poistettuja patenttivaatimusten mukaisesti.

Mekaanisesti poistettavia aineita ovat erityisesti biomassa ja proteiinit. Mekaanisia erotusmenetelmiä ovat 25 erityisesti suodattaminen (esim. ultra- ja mikrosuodatus) , :‘eristäminen (esim. sentrifugointi ja dekantointi) , jolloin pääasiallisesti erotetaan vain liukenemattomia ja/tai suu-.·. ; rimolekyylisempiä aineita.

* ti !./ Keksinnön piiriin kuuluvat myös sellaiset "* 30 eläinrehulisäaineet, jotka yhden tai useamman aminohapon t · · V : ohella sisältävät vielä pääosan aminohapoksi (amino- : : hapoiksi) luettavista fermentointiliemen sisältämistä ,*[ ; aineista, lukuunottamatta ainakin osaa biomassasta; samoin kuin sellaiset eläinrehulisäaineet, jotka ovat tyydyttäviä 35 edellä mainitussa koostumuksessa, jolloin tässä voi olla biomassa kokonaisuudessaan, osittain tai sitä ei ole siinä s 110378 lainkaan. Erityisesti kun lisäosassa on vielä ainakin osa biomassaa, silloin mikro-organismien pitäisi olla ensisijaisesti luonnollisia mikro-organismeja, se on sellaisia, joita ei ole käsitelty geenimanipuloimalla tai 5 jotka eivät kuulu saksalaisen geenitekniikkalain puitteisiin.

Keksinnön mukaisia lisäosia saadaan suoraan, esim. (suihku)kuivaamalla fermentointiliemeä, mahdollisesti erottamalla etukäteen ainakin osa biomassasta. Yllättävää 10 ja erityisen edullista on tällöin, että lisäosat tähän saakka tunnettuihin tuotteisiin (fermentointiliemistä saatuihin) verrattuna saadaan proteiinipitoisuudeltaan alhaisempina ja voidaan siitä huolimatta jatkokäsitellä (kuivata) käsiteltäväksi jauheeksi tai granulaatiksi.

15 Hyvin puhtaiden (orgaanisista jäännösaineksista köyhien) fermentointien yhteydessä liemi voidaan jopa ilman biomassaa ja oleellisesti ilman apuaineita, kuten lisättyjä (mineraalisia) kantajia, kuivata käsiteltäväksi granulaatiksi. Samoin fermentointiliemiä, joita ennakolta on 20 käsitelty siten, että niissä on vain vähän biomassaa, • *’ voidaan kuivata suoraan (oleellisesti ilman apuaineita ...: kuten lisättyjä (mineraalisia) kantajia) lisäosaksi.

Kumpaakin tietä saadaan keksinnön mukaisia proteiinimääräl-(_)·’ tään pienempiä tai proteiiniköyhiä lisäosia. Tunnetut 25 tuotteet sisältävät aina suuria määriä biomassaa ja usein vielä huomattavia määriä muita kantajia.

Lisäaineen proteiinipitoisuudella on hyvin tärkeä ,·, ; merkitys, edullisemmin se ei saa ylittää arvoa 10 paino-%, !..* ensisijaisesti se on alle 10 paino-%, erityisesti enintään * * * 30 7 paino-%. Aivan ensisijaisia ovat proteiinipitoisuudet, » i > ί(ί : jotka ovat alle 5 paino-%. Prosessitaloudellisista syistä : proteiinipitoisuus on useimmiten vähintään 0,5 %, yleensä » » · . 1 paino-% ja sitä suurempi. Alhainen proteiinipitoisuus on » » » merkittävä, koska lisäosan kanssa sekarehun typpi- tai ·”' 35 proteiinipitoisuus saa kohota mahdollisimman vähän. Jo N-pitoisuuden pienentyminen 0,05 % on merkittävä. Rehun 6 110378 proteiinimäärän kohotessa lisääntyy lisäosan tarve sekä lannan N-pitoisuus ja alentaa tuotteessa olevaa prosenttuaalista lisäosa-aminohapon(-happojen) osuutta, mistä johtuen aiheutuvat muun muassa korkeammat 5 rahtikustannukset lisäosapitoisuuden suhteen laskien.

Erityisesti lanta voi johtaa vaikeisiin ympäristöongelmiin. Suuri proteiinipitoisuus on sen lisäksi huomioitava proteiinianalyysin yhteydessä. Sen vuoksi sekarehuun saa lisätä mahdollisimman vähän tarpeetonta ja 10 koostumuksensa puolesta tuntematonta proteiinia.

Tavallisesti fermentointiliemi sisältää yli 10 - 20 paino-% biomassaa kuiva-aineessa. Jos proteiinipitoisuus eläinrehulisäosassa tulee liian suureksi, pienenee fermentointibiomassan osuus lisäosassa, rajoittuen 15 ensisijaisesti enintään 10 paino-%: ksi kuiva-aineesta. Usein fermentointibiomassan osuus on enintään 5 paino-%. Ensisijaisia ovat myös biomassattomat lisäainekoostumukset, se on sellaiset, joissa on enintään 0,1 paino-% biomassaa.

Ensisijaisesti lisäosassa on suurimmaksi osaksi . 20 vain yhtä aminohappoa.

• " Sellainen lisäosa on silloin yleisesti ···· aminohappopitoisuuttaan vastaavasti annosteltavissa ·"* jokaiseen rehuun tai esiseoksiin. Määrättyjen rehuseosten yhteydessä voi kuitenkin myös olla tarkoituksenmukaista, : 25 että useampia aminohappoja voi olla lisäosassa toisiinsa nähden tietyssä suhteessa siten, että vain yhtä lisäosaa saadaan aminohappolisäosaksi. Näiden aminohappojen suhde ; voidaan saada esimerkiksi sekoittamalla useampia aminohappo-f ermentaatioliemiä tai lisäosia (koko 30 biomassaerän tai sen osan kanssa tai ilman sitä) , sekä myös • » · V *’ annostelemalla edullisella tavalla pienempiä määriä : : puhdasta aminohappoa (esim. tryptofaania ja/tai treoniinia . esim. lysiini-lisäaineeseen) .

Tämän keksinnön yhteydessä sopivia aminohappoja • · **· 35 ovat erityisesti lysiini, treeniini, tryptofaani sekä leusiini, isoleusiini, väliini, proliini ja alaniini.

7 110378

Yksityisen aminohapon tai useampien tarkoituksella saatujen tai määrättyjen aminohappojen ohella lisäosassa tulisi olla mahdollisimman vähän muita määrittelemättömiä tai lisäosana liittämiseen soveltumattomia aminohappoja.

5 Lisäosa-aminohappojen määrän lisäosassa tulisi olla vähintään 95 paino-% vapaiden aminohappojen kokonaismäärästä, ensisijaisesti pitoisuus on vähintään 97 paino-%. Prosessitaloudellisista syistä muiden, täydentämisen yhteydessä tarkoituksettomien aminohappojen tai 10 ilmoittamattomien (määrittelemättömien) α-aminohappojen alaraja on useimmiten 0,5 paino-%, tavallisesti niiden pitoisuus on vähintään 1 paino-%. Näillä muilla aminohapoilla on samanlaisia varjopuolia kuin peptidipitoisuudella, ne ovat kuitenkin kokonais-15 aminohappoanalyysin yhteydessä helpommin määriteltävissä.

Muiden α-aminohappojen ja proteiinien summa ei saisi ensisijaisesti olla suurempi kuin 11 paino-%, tavallisia ovat arvot, jotka ovat alle 11 paino-%, erityisesti 8 paino-% ja sen alapuolella. Alaraja on 20 tällöin tavallisesti 2 paino-%.

• *’ Ilmoitetut arvot proteiinien ja aminohappojen ...: osalta tai niiden summa on niin vähäinen, että näitä osuuksia ei tarvitse huomioida täydennettävän rehun proteiini/aminohappo-analyysin yhteydessä, korkeammat arvot ; 25 voivat olosuhteista riippuen olla haitaksi täydennyksessä halutun optimaalisen aminohappokoostumuksen yhteydessä.

Kokonaissokeripitoisuuteen sisältyy mikro- ; organismien hyväksikäyttämä ja hyväksikäyttämätön sokeri, edullisesti se on enintään 5 paino-%, erityisen edullisia h' 30 ovat arvot 2,5 paino-% ja sitä pienemmät, parhaat : pitoisuudet ovat enintään 1,5 paino-%. Mitä suurempi : : sokeripitoisuus on, sitä hygroskooppisempi tuote voi olla ’ : ja taipuvainen liimautumaan yhteen. Sen lisäksi korkeiden (,. sokeripitoisuuksien yhteydessä kuiviin haihdutettaessa ja *··’ 35 kuivattaessa voi syntyä Maillard-tuotteita, jotka pienentävät saantoja ja tuoteominaisuuksia. Sokeri- 8 110378 pitoisuutta voidaan alentaa siten, että ainakin fermentoinnin päättyessä sokerinlisäystä rajoitetaan.

Rasvojen ja öljyjen osuus rajoitetaan edullisesti tavallisesti arvoon 3 paino-%, kuten proteiinien yhteydessä 5 osuus ei tällöinkään saisi olla näin suuri, jotta sekarehun täydentämisen yhteydessä se voidaan jättää huomioimatta.

Täydentämiseen soveltuvat erityiset lisäosat, joissa haluttujen vapaan(vapaiden)aminohappojen pitoisuus on vähintään 49,5 paino-%, ensisijaisesti arvo on 50 % tai si-10 tä suurempi. Yläraja on ensisijaisesti prosessi-taloudellisista syistä emäksisten aminohappojen yhteydessä enintään 60 paino-%. Enintään 57 paino-%:n arvot ovat osoittautuneet erityisen sopiviksi; neutraalien aminohappojen yhteydessä nämä arvot ovat 85 paino-% tai 15 80 paino-%.

Lisäosia voidaan saada (suihku)kuivaamalla fermen-tointiliemi (jonka biomassaa on mahdollisesti vähennetty), seoksina sellaisten lisäosien (myös liemien) kanssa tai muiden lisäosien kanssa, joissa on esiseoksia, kuten hi-. 20 venalkuaine/vitamiini-esiseoksia tai mineraa-liaines- * esiseoksia.

t i i

Sellaiset lisäosat ovat puhtaiksi eristämiseen sa-·"· moin kuin tähänastisiin fermentointiliemistä saatuihin tuotteisiin verrattuina hinnaltaan edullisempia pitoisuuk-25 sien ollessa suuret, ne ovat helposti standardisoitavissa • · ja sisältävät vähän sivutuotteita ja muodostamiskustannuk- i set ovat pienet.

,·, : Selostettu lisäosakoostumus soveltuu erityisesti ‘ · · lysiini-täydennykseen, koska lysiini on helposti saatavissa *;* 30 f ermentoimalla ja on eräs tärkeimmistä lisäosa- I i < : aminohapoista.

* I I

: : Keksinnön mukainen eläinrehu on useimmiten ,** . vaaleankeltaista - ruskean beigeväristä jauhetta, jonka

• » I

tilavuus-paino on välillä 0,4 ja 0,7 kg/1. Kun kyseessä on * * • · *** 35 L-lysiini, tämä on suolamaisena yhdisteenä, esimerkiksi sulfaattina tai karbonaattina. Se on täysin stabiili ja yli 9 110378 12 kuukauden varastoinnin jälkeen 25 °C:ssa ei ole todettavissa lainkaan L-lysiinin pitoisuuden alentumista. Sen hygroskooppisuuskäyttäytyminen on hyvä.

Sen valumiskyky osoittautuu hyväksi, sillä ei ole 5 taipumusta paakkuuntua ja on sekoitettavissa helposti homogeenisesti täysrehuun tai esiseoksiin. Se omaa myös sellaisten seosten aineosana erinomaisen stabilisuuden.

L-lysiinin lähteenä sillä on saman L-lysiinipitoisuuden suhteen ainakin sama vaikutus kuin talo vallisesti käytetyllä puhtaalla L-lysiinimono- hydrokloridilla.

Muuna keksinnön kohteena ovat menetelmät näiden eläinrehulisäosien valmistamiseksi. Menetelmille on tunnusomaista, että ainakin yhtä aminohappoa tuottavaa 15 mikro-organismia viljellään fermentointiväliaineessa, joka sisältää ainakin yhtä hiililähdettä, ainakin yhtä typpilähdettä, mineraalisuoloja ja hivenaineita, jolloin fermentointi suoritetaan siten, että sen päättyessä saadaan raakaa fermentointilientä, joka sisältää käyttökelpoista . 20 sokeria enintään 4 g/1 ja erityisesti kiinteän aineen / pitoisuuden ollessa 7,5 - 26 paino-%, aminohappopitoisuuden ···' 1 - 20 paino-%, edullisesti 4 - 10,5 paino-% ja ‘ · sokeripitoisuuden enintään 2,6 paino-%. Vaihtoehtoisesti fermentointi voidaan toteuttaa (mahdollisesti käyttämällä t · ί('.| 25 sopivaa mikro-organismia) siten, että biomassan pitoisuus on siten rajattuna, että fermentointiliemen kuivamassa sisältää enintään 10 paino-% proteiinia ja erityisesti 40 -: 90 paino-% aminohappoa (happoja) , enintään 8 paino-% 1..* karboksyylihappoja, joissa on vähemmän kuin 8 C-atomia, 30 yhteensä enintään 10 paino-% sokeria, enintään 5 paino-% t t · V * rasvoja ja öljyjä ja enintään 5-30 paino-% mineraalisia aineita, tai ensisijaisesti fermentoinnin päätyttyä ainakin ,·’ : osittain biomassan määrä alennetaan erityisesti enintään 10 paino-% :ksi kuivamassasta tai biomassaa muodostavia * · 35 mikro-organismeja ja mahdollisesti muita aineita poistetaan mekaanisin erotusmenetelmin ja jättämällä silleen pääosat 10 110378 fermentointilieraen jäännöskomponenteista ensisijaisesti fermentoinnin päätyttyä. Nämä menetelmät voidaan yhdistää keskenään. Jäljelle jäävä liemi on edullista haihduttaa kuiviin. Kuiviinhaihduttaminen tapahtuu edellisestä 5 väkevöimällä liemi, kunnes kiinteäainepitoisuus on 40 -60 paino-% ja kuivamalla tämä viskoosinen liemi, esim. suihkukuivaamalla. Jos mitään biomassaa ei tarvitse poistaa, fermentointi on suoritettavissa siten, että biomassaa muodostuu mahdollisimman vähän, jolloin 10 lisättyjen ravintoaineiden on oltava kulutetut loppuun mahdollisimman täydellisesti. Sellaista fermentointia on selostettu esim. DE-A 4 130 867:ssä esimerkissä 3.

Fermentointi suoritetaan edullisesti siten, että sen jälkeen kun fermentointiajasta on kulunut vähintään 15 enemmän kuin 30 %, ensisijaisesti enemmän kuin 70 %, fer-mentointiliemessä olevan käyttökelpoisen sokerin konsent-raatio on korkeintaan 0,3 paino-%.

Fermentoinnin päättyessä käyttökelpoisen sokerin pitoisuus säädetään maksimiarvoon 1 g/1, se on, sokeria ei . 20 lisätä lainkaan ja fermentointi katkaistaan vasta tämän ar- • ” von saavuttamisen tai alittumisen jälkeen. Normaalisti, sen ..J jälkeen kun ainakin osa biomassasta on poistettu, fermen- tointijäännöstä kuivataan, kunnes vesipitoisuus on enintään 5 paino-%.

25 Edullista on, että biomassa voidaan poistaa täydellisesti, jolloin saadussa lopputuotteessa on erityisen suurin pitoisuuksin lysiiniemästä tai muita ,·. ; aminohappoja. Sen lisäksi tuote, jota saadaan biomassan I | | täydellisen poistamisen jälkeen, on erityisen sopiva 30 lopputuotteen standardisoimiseksi vakinaiseen amino-V · happopitoisuuteen. Tämä on erityisesti välttämätöntä : silloin, jos yksityisten fermentointierien yhteydessä . saadaan erilaisia aminohappopitoisuuksia.

Aminohappoa tuottavina mikro-organismeina lysiiniä * · 35 varten käytetään ensisijaisesti sopivia Corynebacterium-tai Brevibacterium-lajien mutantteja, esim. Deutschen 11 110378

Sammlung fur Mikroorganismen talletuslaitokseen DSM 5715 talletusnumerolla tallennettua ja vapaasti saatavaa kantaa. Hiililähteenä käytetään ensisijaisesti tärkkelys-hydrolysaattia (glukoosia) tai sakkaroosia. Vähäinen osa 5 voi myös olla peräisin sokerijuurikas- tai sokeriruokomelassista. Tämä osa ei saisi olla suurempi kuin 5 paino-% koko hiililähteestä (= 10 paino-% melassia koko hiililähteestä).

Treoniinia ja tryptofaania varten käytetään 10 ensisijaisesti sopivia Escherichia coli -lajien mutantteja, esim. treoniinia varten kantaa BKIIM-B-3996 (FR-A 2 640 640) .

Typpilähteinä ovat ammoniakin tai ammoniumsulfaatin ohella ensisijaisesti proteiinihydrolysaatteja sisältävät 15 aineet, kuten maissin gluteeni, soijajauho tai edellä mainitusta sakasta saatu biomassa. Muita sopivia typpilähteitä ovat esimerkiksi maissilähdevesi tai kalapeptoni.

Fermentointilämpötila on tarkoituksen mukaisesti , 20 välillä 30 ja 40 °C, fermentointiväliaineen pH-arvo välillä • 6,0 ja 8,0. Fermentoinnin kesto on yleensä enintään 100 t * · tuntia.

·"· Fermentoinnin päätyttyä mikro-organismit voidaan « tuhota lämpökäsittelyn avulla tai myös muilla menetelmillä, 25 esim. lisäämällä epäorgaanista happoa, esim. rikkihappoa. Osa biomassasta eristetään sen jälkeen tunnetuin > menetelmin, kuten erottamalla, dekantoimalla, erottamisen ,·, ; ja dekantoimisen yhdistelmällä, ultrasuodattamalla tai • » · ‘ mikrosuodattamalla. Biomassasta ainakin osittain vapau- 30 tettu liemi sakeutetaan sitten tunnetuin menetelmin, V * esimerkiksi ohutkerros- tai valukalvohaihduttimessa » · t : : esikonsentraatiksi, jonka kiinteäainepitoisuus on 40 - 60 . paino-%. Esikonsentraatin lopullisena kuivaajana voi toimia

* t I

esimerkiksi suihkukuivaaja, spin-f lash-kuivaa j a tai • t 35 pyörrekerroskuivaaja.

12 110378

Erotettu biomassa voidaan hydrolysoida yksinkertaisella tavalla rikkihapolla, suolahapolla tai sopivilla entsyymeillä. Siten saatu hydrolysaatti voidaan edullisesti seuraavan fermentoinnin yhteydessä lisätä 5 fermentointiväliaineeseen typpilähteenä. Kierrättämällä biomassaa säästetään raaka-aineita.

Mikäli keksinnön mukaisen eläinrehun standardisointi aminohapon, etenkin L-lysiinin pitoisuuden suhteen on toivottavaa, tämä voi tapahtua valitsemalla jäljelle 10 jäävän biomassan määrä ja/tai sekoittamalla sopivasti erilaisista fermentointiliemistä saatuja esikonsent-raatteja. Nämä esikonsentraatit ovat erityisen sopivia, jos ne eivät enää sisällä lainkaan biomassaa, koska nämä tuotteet ovat homogeenisia.

15 Vastaavasti myös biomassattomia liemiä tai liemiä, joissa biomassan määrää on pienennetty, voidaan sekoittaa standardisointia varten. Eräs muu mahdollisuus on lisätä vähäisiä määriä rehuun soveltuvia vaarattomia lisäaineita, esimerkiksi vehnänleseitä tai maissinkehräjauhoa.

. 20 Mahdollinen on myös yksityisten vaiheiden keskeinen ; “ yhdistelfiäuraavat esimerkit valaisevat keksintöä lähemmin: ·>·· Esimerkki 1

Sekoitinlaitteella ja ilmastointisysteemillä ],*·’ varustettuun f ermentointisäiliöön pantiin ensin 150 kg 25 steriiliä liuosta, jonka koostumus oli seuraava: vesi 130 1 glukoosi 12,4 kg ,·, ,* maissigluteenihydrolysaatti, rikkihappoinen 9,0 kg !,.* ammoniumsulfaatti 1,5 kg 30 mineraalisuoloja * « · V · hivenaineita 0,4 kg

» I I

: : säädetty ammoniakkiliuoksella pH-arvoon 7,5.

t·’ . Tähän liuokseen lisättiin 33 - 35 °C:ssa 12 litraa samassa f ermentointiväliaineessa, mutta erillisessä » » 11 · 35 f ermentointisäiliössä kasvatettua Corynebacteriumin ymppivilj elmää.

13 1 10378 40 tunnin kuluessa siihen annostettiin 77 litraa steriiliä liuosta, jonka koostumus ennen neutralointia pH-arvoon 7,5 oli seuraava: vesi 38 1 5 glukoosi 40,0 kg maissigluteenihydrolysaatti, rikkihappoinen 8,3 kg ammoniumsulfaatti 0,9 kg vaahdonestoaine (NalcoR) 0,08 kg mineraalisuoloj a hivenaineita 0,2 kg

Koko fermentointiajan pH-arvo pidettiin ammo-niakkiliuoksen avulla välillä 7,0 ja 7,5. Sekoittimen kierrosluku säädettiin arvoon 600 kierrosta/min ja ilmastusarvot välille 0,5 - 0,7 vvm.

15 Fermentointiajan päätyttyä saatiin 275 kg raakaa fermentointilientä, jonka kiinteän aineen pitoisuus oli 34,1 kg, L-lysiiniemäksen pitoisuus 15,5 kg ja sokeripitoisuus 0,71 kg. Mikro-organismit tuhottiin lämpökäsittelemällä ja erotettiin separaattorin ja . 20 dekantterin yhdistelmällä.

* • '* Biomassasta vapautettu liemi sakeutettiin valukalvohaihduttimessa vakuumissa, kunnes kiinteän aineen ·'*· pitoisuus oli noin 52 paino-%.

| 'j‘ Tämän jälkeen tästä esikonsentraatista poistettiin 25 vettä suihkukuivaajassa vaaleanruskeaksi beigeväriseksi t » jauheeksi, jonka tärypaino oli 0,51 kg/1 ja koostumus seuraava: . L-lysiiniemäs 52,1 paino-% » · » I..’ muut a-aminohapot 2,5 paino-% ’j* 30 proteiinit 8,8 paino-% ’· karboksyylihapot, joissa on vähemmän ; : kuin 8 C-atomia 6,8 paino-% . sokeri 2,4 paino-% »*♦ I · * !,.* rasvat ja öljyt 2,5 paino-% » » 35 mineraaliaineet 21,1 paino-% vesi 1,6 paino-%.

i4 110378

Esimerkki 2

Fermentointi suoritettiin kuten esimerkissä 1 sillä poikkeuksella, että puhtaan rikkihappoisen maissi-gluteenihydrolysaatin asemesta käytettiin seosta, jossa oli 5 3,5 kg rikkihappoista maissigluteenihydrolysaattia ja 13,8 kg esimerkissä 1 erotetun biomassan rikkihappoista hydro-lysaattia.

Fermentaatioajan päätyttyä saatiin 272 kg raakaa fermentaatiolientä, jonka kiinteäainepitoisuus oli 36,2 kg, 10 L-lysiiniemäksen pitoisuus 17,1 kg ja sokeripitoisuus 0,55 kg.

Biomassa erotettiin esikäsittelemättä ultra-suodatusta käyttäen (< 300 000 Daltonia). Biomassasta vapautettu liemi sakeutettiin kuten esimerkissä 1, kunnes 15 kiinteäainepitoisuus oli noin 53 paino-%.

Tämän jälkeen osasta tätä esikonsentraattia poistettiin vettä pyörrekerroskuivaajassa vaaleanruskeaksi-beigeväriseksi jauheeksi, jonka tärypaino oli 0,53 kg/1 ja koostumus seuraava: 20 L-lysiiniemäs 62,1 paino-% . ** muut a-aminohapot 1,2 paino-% * » · proteiinit 2,6 paino-% karboksyylihapot, joissa on vähemmän * ··· kuin 8 C-atomia 3,1 paino-% * * ? * j\! 25 sokeri 2,0 paino-%

• I

rasvat ja öljyt 1,7 paino-% i » » mineraaliaineet 24,4 paino-% . , vesi 1,6 paino-% t » t » ' ·

Muuhun osaan esikonsentraattia lisättiin ennen veden • · ';** 30 poistamista pyörrekerroskuivaajassa niin paljon maissikeh-! räjauhoa, että saadun kiinteän tuotteen standardisoitu L- lysiiniemäspitoisuus oli 60 paino-%.

i i i , Esimerkki 3 • > i ' Sekoittimella ja ilmastussysteemillä varustettuun ! i h*·* 35 fermentointisäiliöön pantiin ensin 150 kg steriiliä liuosta, jonka koostumus oli seuraava: is 110378 vesi 133,0 kg melassi 0,77 kg sakkaroosi 3,68 kg maissigluteenihydrolysaatti, rikkihappoinen 1,03 kg 5 biomassahydrolysaatti, rikkihappoinen 9,4 kg

Ammoniumsulfaatti 1,3 kg mineraalisuoloja hivenaineita 0,4 k9 pH säädettiin ammonakkiliuoksella arvoon 7,5.

10 Tähän liuokseen lisättiin 33 - 35 °C:ssa 17,6 litraa samassa fermentointiväliaineessa, mutta erillisessä fermen-tointisäiliössä kasvatettua Corynebacteriumin ymppiviljel-mäkantaa numero DSM 5715. Kantaa saadaan vapaasti talletus-laitoksesta Deutschen Sammlug fiir Mikroorganismen.

15 39 tunnin kuluessa annosteltiin steriiliä liuosta, jonka koostumus ennen neutralointia pH-arvoon 7,5 oli seu-raava: vesi 36 kg melassi 2,7 kg 20 sakkaroosi 43,1 kg , *·. maissigluteenihydrolysaatti, rikkihappoinen 1,1 kg ';· biomassahydrolysaatti, rikkihappoinen 10,7 kg :··· ammoniumsulfaatti 0,9 kg mineraalisuolo j a .·, : 25 hivenaineita 0,2 kg • · ·

Koko fermentointiajan pH-arvo pidettiin ammo-niakkiliuoksen avulla välillä 7,0 ja 7,5. Sekoittimen ’* ” kierrosluku säädettiin arvoon 600 kierr./min ja ...* 30 ilmastusmäärä välille 0,5 - 0,7.

Ferment oint ia j an päätyttyä saatiin 218 kg raakaa fermentointilientä, jonka kiinteän aineen pitoisuus oli I i _· _ 29,2 kg, L-lysiiniemäksen pitoisuus 10,6 kg ja sokeripitoi- *· Ί suus 1,4 kg. Mikro-organismit tuhottiin lämpökäsittelyllä ♦ i t *...· 35 ja erotettiin separaattorin ja ekantoinnin yhdistelmällä.

16 1 10378

Biomassasta vapautettu liemi sakeutettiin valukalvohaihduttimessa vakuumissa noin 52 paino-% kiinteää ainetta sisältäväksi. Sen jälkeen tästä esikonsentraatista poistettiin vettä suihkukuivaajassa vaaleanruskeaksi-5 beigeväriseksi jauheeksi, jonka tärypaino oli 0,50 kg/1 ja koostumus seuraava: L-lysiiniemäs 41,8 paino-% muut a-aminohapot 4,1 paino-% proteiineja 8,5 paino-% 10 karboksyyliihappoja, joissa on vähemmän kuin 8 C-atomia 6,7 paino-% sokeri 5,7 paino-% rasvoja ja öljyjä 2,8 paino-% mineraaliaineita 25,6 paino-% 15 vesi 3,0 paino-%

Esimerkki 4

Sekoittimella ja ilmastuslaitteella varustettuun fermentointisäiliöön pantiin ensin 6,6 kg steriiliä liuosta, jonka koostumus oli seuraava: 20 vesi 6,05 kg , ’·· glukoosi 150 g • · · *;· ammoniumsulfaatti 50 g ;··· mineraalisuolo j a hivenaineita 50 g

t I M

,·. : 25 pH-arvo säädettiin ammoniakkiliuoksella (25 %) 6,5:ksi.

• « · Tähän liuokseen lisättiin 33 °C:ssa 0,7 kg samaa fermentointiväliainetta, mutta erillisessä fermen-tointisäiliössä kasvatettua Escherichia coli K12-'* ’· johdannaisen ymppikulttuuria.

...· 30 24 tunnin kuluessa annosteltiin 1,7 kg steriiliä liuosta, jonka koostumus oli seuraava: ,··. vesi 0,6 kg glukoosi 1,1 kg * · · *· Koko fermentointiajan pH pidettiin ammoniak- * i · '...· 35 kiliuoksen avulla arvossa 6,5.

17 110378

Fermentointiaikojen päätyttyä yhdistettiin useampia siten saatuja fermentointiliemiä ja biomassa erotettiin ultrasuodattamalla (< 300 000 Daltonia).

Biomassasta vapautetusta liemestä poistettiin vettä 5 lyofilisaattorissa vaaleanruskeaksi jauheeksi, jonka koostumus oli seuraava: L-tryptofaani 46,0 paino-% muut a-aminiohapot 4,0 paino-% proteiinit 1,7 paino-% 10 karboksyylihapot, joissa on vähemmän kuin 8 C-atomia 3,0 paino-% sokeri 1,0 paino-% mineraaliaineet 25,0 paino-% vesi 2,3 paino-% 15 ei spesifioidut 17,0 paino-%

Esimerkki 5

Treoniinieläinrehulisäainetta voidaan saada seuraavasti :

Samalla tavalla kuin FR-A 2 640 640:ssä on selos-20 tettu viljelemällä kantaa Escherichia coli BKIIM B-3996 . 1·· fermentointiväliaineessa valmistetaan fermentoin-tilientä, ·!' jossa on 85 g/1 L-treoniinia.

;·· Geeniteknillisesti muutetusta mikro-organismista saatu biomassa erotetaan sen jälkeen ultrasuodattamalla ja » 1 t · .·,: 25 biomassasta vapautetusta liemestä poistetaan vesi sopivassa • · · kuivaajassa.

• I I

* » · * · • · * i · • » ·

« I

· »tl

Claims (15)

1. Fermentointiliemipohjainen aminohappoeläinrehu-lisäosa, tunnettu siitä, että aminohappolisäosa sisäl- 5 tää vielä pääosan fermentointiliemen sisältämistä aineista ja kuivamassan koostumus on: aminohappoa/aminohappoja 40 - 90 paino-% proteiineja enintään 10 paino-% karboksyylihappoja, joissa on vähemmän 10 kuin 8 C-atomia 8 paino-% kokonaissokeria enintään 10 paino-% rasvoja ja öljyjä enintään 5 paino-% mineraaliaineita 3-30 paino-% ja että aminohappolisäosa voidaan eristää suoraan fermen-15 taatioliemestä sumutuskuivaamalla.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen lisäosa, tunnettu siitä, että osa biomassasta poistetaan.

3. Jonkin patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen lisäosa, tunnettu siitä, että vesipitoisuus on 0,5 - 5 20 paino-%.

4. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukai- “··· nen lisäosa, tunnettu siitä, että kuivamassa sisältää enintään 10 paino-% f ermentointibiomassaa .

5. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukai-25 nen lisäosa, tunnettu siitä, että fermentoimalla valmis- • · « tetun/valmistettu j en aminohapon/aminohappo j en pitoi-suus t I I ' on vähintään 49,5 paino-%.

6. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukai- t * nen lisäosa, tunnettu siitä, että fermentoimalla valmis- 1 ,,,·’ 30 tetun aminohapon pitoisuus on enintään 60 paino-% emäksi- sen aminohapon tapauksessa tai 85 paino-% neutraalien ami- (...t nohappojen tapauksessa.

* · *!’ 7. Menetelmä patenttivaatimuksen 1 mukaisen fer- mentointiliemipoh j aisen aminohappoeläinrehulisäosan vai- • i · !(>>· 35 mistamiseksi, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää seuraavat vaiheet: 19 110378 - viljellään ainakin yhtä «-aminohappoa tuottavaa mikro-organismia fermentointiväliaineessa, joka sisältää ainakin yhtä hiililähdettä, ainakin yhtä typpilähdettä, mineraalisuoloja ja hivenaineita, 5. fermentointia ohjataan siten, että sen päättyessä saadaan raakafermentointilientä, jossa käyttökelpoisen sokerin pitoisuus on enintään 4 g/1, ainakin osittain vähennetään biomassaa muodostavien mikro-organismien määrä kuivamassassa 10 erityisesti enintään 10 paino-%:iksi, siten että aminohappoeläinrehulisäosa voidaan eristää suoraan fermentointiliemestä sumutuskuivaamalla.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä fermentointiliemipohjaisen aminohappoeläinrehulisäosan 15 valmistamiseksi, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää seuraavat vaiheet: - viljellään ainakin yhtä «-aminohappoa tuottavaa mikro-organismia fermentointiväliaineessa, joka sisältää ainakin yhtä hiililähdettä, ainakin yhtä typpilähdettä, 20 mineraalisuoloja ja hivenaineita, , ’· - fermentointia ohjataan siten, että sen ·;* päättyessä saadaan raakafermentointilientä, jossa ;··· käyttökelpoisen sokerin pitoisuus on enintään 4 g/1, - ainakin osittain vähennetään biomassaa ,·, : 25 muodostavien mikro-organismien ja mahdollisesti muiden aineiden määrää mekaanisin erotusmenetelmin ja jätetään pääosat jäljellä olevista fermentointiliemen komponenteista lisäosaan, siten että aminohappo- i # · '· " eläinrehulisäosa voidaan eristää suoraan fermen- ...· 30 tointiliemestä sumutuskuivaamalla. .'f.

9. Patenttivaatimuksen 7 tai 8 mukainen menetelmä • t *··. fermentaatioliemipohjaisen aminohappoeläinrehulisäosan valmistamiseksi, tunnettu siitä, että fermentointia oh-” jataan siten, että sen päättyessä saadaan raaka- 35 fermentointilientä, jossa käyttökelpoisen sokerin pitoi suus on enintään 4 g/1 ja biomassaa pitoisuutena, joka on 20 110 3 7 8 rajoitettuna siten, että fermentointiliemen kuivamassassa on enintään 10 paino-% proteiinia ja erityisesti 40 - 90 paino-% aminohappoa/aminohappoja, enintään 8 paino-% kar-boksyylihappoja, joissa on vähemmän kuin 8 C-atomia, enin-5 tään 10 paino-% sokeria kaikkiaan, enintään 5 paino-% rasvoja ja öljyjä ja 3 - 30 paino-% mineraaliaineita.

10. Jonkin patenttivaatimuksista 7-9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sen päättyessä raakafermentointiliemessä kiinteän aineen pitoisuus on 10 7,5 - 26 paino-%.

11. Jonkin patenttivaatimuksista 7-10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että fermentointiliemi kuivataan sen jälkeen vesipitoisuuteen 5 paino-% tai vähemmän.

12. Patenttivaatimuksen 7 tai 11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että fermentointia ohjataan siten, että sen päättyessä raakafermentointiliemessä on aminohappoa/aminohappoja 1-20 paino-%.

13. Jonkin patenttivaatimuksista 7-12 mukainen 20 menetelmä, tunnettu siitä, että vähintään 30 %:n aikana fermentointiajasta käyttökelpoisen sokerin konsentraatio “··· pidetään enintään arvossa 0,3 paino-%.

;··| 14. Eläinrehu tai esiseos, tunnettu siitä, että se sisältää jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen .·, : 25 mukaista aminohappoeläinrehulisäosaa. • « *

15. Jonkin patenttivaatimuksista 1-6 mukaisen ' aminohappoeläinrehulisäosan tai minkä tahansa patenttivaa timuksen 7-13 mukaisesti valmistetun aminohappoeläinre-.hulisäosan käyttö eläinrehun tai esiseosten täydentämiseen ,,,· 30 tai valmistamiseen. 21 110378