ES2971094T3

ES2971094T3 - Detección de uno o más patógenos

Info

Publication number: ES2971094T3
Application number: ES16777164T
Authority: ES
Inventors: Cyrus Cody Zegrati; Michael Benjamin Centola; Gramling, Jr; Paul Simon Smith
Original assignee: Polyskope Labs
Current assignee: Polyskope Labs
Priority date: 2015-04-07
Filing date: 2016-04-06
Publication date: 2024-06-03
Anticipated expiration: 2036-04-06
Also published as: EP3280821C0; WO2016164407A3; US20180258467A1; WO2016164407A2; HK1251023A1; EP3280821A4; EP3280821A2; US11965216B2; EP3280821B1

Abstract

En el presente documento se proporcionan medios, métodos, kits, cebadores y sondas de oligonucleótidos para su uso en la detección molecular de patógenos. Estos se pueden usar en combinación para técnicas basadas en PCR de detección rápida y de alto rendimiento para detectar simultáneamente múltiples patógenos. Los métodos de detección múltiple han mejorado la sensibilidad y especificidad para la detección de múltiples patógenos simultáneamente. Las técnicas de ensayo de PCR en tiempo real que utilizan dichos cebadores incluyen micromatrices y matrices múltiplex, estas últimas opcionalmente simultáneamente con sondas oligonucleotídicas TaqMan. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Detección de uno o más patógenos

ANTECEDENTES

Los patógenos comunes en los alimentos son una de las principales causas de intoxicación alimentaria, y pueden causar una variedad de enfermedades. Estas enfermedades son una grave amenaza para la salud de las personas. La detección rápida y precisa de patógenos transmitidos por los alimentos es una herramienta eficaz para combatir tales enfermedades.

Con el desarrollo de la biología molecular, la inspección de alimentos, los trabajos de cuarentena y los métodos de identificación de patógenos han usado avances tecnológicos tales como la PCR y sondas de hibridación de oligonucleótidos, pero sigue siendo difícil con los métodos de detección actuales en biología molecular detectar simultáneamente la presencia y/o ausencia de y o detectar uno o más (pluralidad) patógenos.

No se ha establecido ningún método para detectar de manera suficiente y confiable una pluralidad de patógenos con la exactitud y precisión y dentro del plazo de la presente invención. El objeto de la presente invención es proporcionar métodos para la detección de múltiples patógenos que puedan detectar patógenos contaminantes que incluyen, pero no se limitan a,Escherichia coliSTEC, especies deSalmonella,yListeria monocytogenes,con una alta sensibilidad comparable, o incluso superior, a los métodos oficiales, que comprenden las etapas de amplificar una pluralidad de genes diana en una única reacción de amplificación, y analizar los mismos. En otras palabras, el objeto de la presente invención es proporcionar métodos para la detección de múltiples patógenos que puedan detectar patógenos contaminantes que incluyen, pero no se limitan a, STEC deEscherichia colipatógena, especies deSalmonella,yListeria monocytogenes,mediante el uso de PCR multiplex con alta sensibilidad y repetibilidad.

Bhagwat, A.A., 2003. International journal of food microbiology, 84(2), pág. 217-224 se refiere a la detección simultánea de cepas deEscherichia coli O157H7, Listeria monocytogenesySalmonellamediante PCR en tiempo real.

SUMARIO DE LA DESCRIPCIÓN

La presente invención proporciona un método que comprende:

a. enriquecer una muestra que comprende una pluralidad de patógenos en un medio rico y no selectivo para formar una muestra enriquecida; en el que el medio rico y no selectivo comprende componentes para promover el crecimiento de la pluralidad de patógenos;

b. realizar una primera lisis de la muestra y una segunda lisis de la muestra en la muestra enriquecida o una porción de la misma, en el que la segunda lisis de la muestra se realiza a una temperatura mayor que la temperatura de la primera lisis de la muestra, formando así un lisado bruto;

c. realizar una PCR múltiple con un conjunto de cebadores de amplificación sobre el lisado bruto, en el que los cebadores de amplificación comprenden pares de cebadores, en el que un primer cebador de los pares de cebadores se hibrida con una secuencia de ácido nucleico diana de los patógenos, y en el que un segundo cebador de los pares de cebadores se hibrida con una secuencia complementaria a la secuencia de ácido nucleico diana; y

d. detectar la presencia de una pluralidad de patógenos, en el que a, b, c y d se llevan a cabo dentro de un tiempo total positivo de alrededor de 28 horas.

En algunas realizaciones, la muestra comprende un alimento. En algunas realizaciones, la muestra pesa una cantidad positiva menor o igual a alrededor de 25 gramos en peso. En algunas realizaciones, la muestra se suspende en el medio rico y no selectivo de modo que la pluralidad de patógenos se aísle de la muestra. En algunas realizaciones, la pluralidad de patógenos se aísla de la muestra mediante digestión estomacal. En algunas realizaciones, la muestra se digiere durante al menos alrededor de 30 segundos. En algunas realizaciones, el medio rico y no selectivo comprende un caldo base de enriquecimiento de listeria sustancialmente sin suplementos. En algunas realizaciones, el medio de enriquecimiento puede ser medio B. En algunas realizaciones, la muestra se enriquece a una temperatura en el intervalo de alrededor de 30°C a alrededor de 45°C. En algunas realizaciones, la muestra se incuba durante una cantidad positiva de tiempo menor o igual a alrededor de 24 horas después de la ingestión estomacal. En algunas realizaciones, la lisis comprende incubar la muestra con un amortiguador de lisis. En algunas realizaciones, el amortiguador de lisis comprende: un componente amortiguador; un agente quelante de metales; un tensioactivo; un precipitante; y/o al menos dos restos lisantes. En algunas realizaciones, el componente amortiguador comprende tris(hidroximetil)aminometano (TRIS). En algunas realizaciones, el tris(hidroximetil)aminometano (TRIS) está presente en una concentración en el intervalo de alrededor de 60 mM a alrededor de 100 mM. En algunas realizaciones, el agente quelante de metales comprende ácido etilendiaminotetraacético (EDTA). En algunas realizaciones, el ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) está presente en una concentración en el intervalo de alrededor de 1 mM a alrededor de 18 mM. el tensioactivo comprende polietilenglicol p-(1,1,3,3-tetrametilbutil)-fenil éter (Triton-X-100). En algunas realizaciones, el polietilenglicol p-(1, 1,3, 3-tetrametilbutil)-fenil éter (Triton-X-100) está presente en una concentración en el intervalo de alrededor de 0,1% a alrededor de 10%. En algunas realizaciones, el precipitante comprende proteinasa K. En algunas realizaciones, la proteinasa K está presente en una concentración en el intervalo de alrededor de 17,5% a alrededor de 37,5%. En algunas realizaciones, el resto lisante comprende una perla de lisis. En algunas realizaciones, la perla de lisis comprende perlas de lisis de circonio de 100 |jm. En algunas realizaciones, las perlas de lisis de circonio de 100 jm están presentes en una concentración en el intervalo de alrededor de 0,1 gramos/ml a alrededor de 2,88 gramos/ml. En algunas realizaciones, el resto lisante comprende lisozima. En algunas realizaciones, la lisozima está presente en una concentración en el intervalo de alrededor de 10 mg/ml a alrededor de 30 mg/ml. En algunas realizaciones, en la primera lisis de la muestra, la muestra se incuba con el amortiguador de lisis en el intervalo de alrededor de 5 minutos a alrededor de 25 minutos. En algunas realizaciones, en la primera lisis de la muestra, la muestra se incuba con el amortiguador de lisis mientras se agita en el intervalo de alrededor de 1200 RPM a alrededor de 1400 RPM. En algunas realizaciones, en la primera lisis de la muestra, la muestra se incuba con el amortiguador de lisis en el intervalo de alrededor de 45°C a alrededor de 85°C. En algunas realizaciones, en la segunda lisis de la muestra, la muestra se incuba con el amortiguador de lisis en el intervalo de alrededor de 5 minutos a alrededor de 15 minutos. En algunas realizaciones, en la segunda lisis de la muestra, la muestra se incuba con el amortiguador de lisis en el intervalo de alrededor de 85°C a alrededor de 105°C. En algunas realizaciones, en la segunda lisis de la muestra, la muestra se incuba con el amortiguador de lisis mientras se agita en el intervalo de alrededor de 1200 RPM a alrededor de 1400 RPM. En algunas realizaciones, el ácido nucleico es ADN. En algunas realizaciones, el ácido nucleico se transcribe de forma inversa a partir de ARN. En algunas realizaciones, la pluralidad de patógenos comprende dos o más deEscherichia coli, Salmonella,oListeria monocytogenes.En algunas realizaciones, los pares de cebadores comprenden secuencias que son al menos 80% homólogas con las secuencias: AGCT CATTT CACATCGT CAT CT sentido, TCCACCATTCC CAAGCT AAAC C antisentido; GGCGGCCAGATTCAGCATAG sentido, GCT ACCACCTT GCACAT AAGC antisentido; TCGCCATTCGTTGACTACTTC sentido, ACATCGCTCTTGCCACAGACT antisentido; CAGTGCCCGGTGTGCAAC sentido, GACACGTT GCAGAGT GGT AT AAC antisentido; y CGGGCATACCATCCAGAGAA sentido, CACCGTGGTCCAGTTTATCGT antisentido. En algunas realizaciones, los pares de cebadores comprenden secuencias de al menos 15 bases contiguas que son al menos 80% homólogas con las secuencias: AGCTCATTTCACATCGTCATCT sentido, TCCACCATTCCCAAGCTAAACC antisentido; GGCGGCCAGATTCAGCATAG sentido, GCTACCACCTTGCACATAAGC antisentido; TCGCCATTCGTTGACTACTTC sentido, ACATCGCTCTTGCCACAGACT antisentido; CAGTGCCCGGTGTGCAAC sentido, GACACGTTGCAGAGTGGTATAAC antisentido; y CGGGCATACCATCCAGAGAA sentido, CACCGTGGTCCAGTTTATCGT antisentido. En algunas realizaciones, el método comprende además una hibridación de una sonda oligonucleotídica interna con una secuencia dentro de la secuencia diana o un complemento. En algunas realizaciones, la sonda oligonucleotídica interna no se hibrida con los cebadores de amplificación. En algunas realizaciones, la hibridación de la sonda oligonucleotídica interna con una secuencia dentro de la secuencia diana o un complemento de la misma es indicativa de la presencia del patógeno en la muestra. En algunas realizaciones, la detección puede comprender una o más de etapa de PCR, unión de lectina, difusión simple, difusión lateral, detección inmunológica, flujo lateral, ELISA, o flujo continuo. En algunas realizaciones, la detección se realiza mediante secuenciación. En algunas realizaciones, el ácido nucleico se secuencia. En algunas realizaciones, la sonda oligonucleotídica interna comprende secuencias que son al menos 80% homólogas con las secuencias: TTGCCAGGTAACGCAAGAA; CGGAAGCCAAAGCGCAC; TCTGGATTTAATGTCGCATAGCG; TTCCATGACAACGGACAGC; y ATCGGGCCGCGACTTC. En algunas realizaciones, la sonda oligonucleotídica interna comprende secuencias de al menos 15 bases contiguas que son al menos 80% homólogas con las secuencias: TTGCCAGGTAACGCAAGAA; CGGAAGCCAAAGCGCAC; TCTGGATTTAATGTCGCATAGCG; TTCCATGACAACGGACAGC; y ATCGGGCCGCGACTTC. En algunas realizaciones, las sondas oligonucleotídicas internas están marcadas en sus extremos 5' con un fluoróforo donador de transferencia de energía, y marcadas en sus extremos 3' con un fluoróforo aceptor de transferencia de energía. En algunas realizaciones, la detección se da a conocer mediante un medio de comunicación. En alguna realización, un resultado se comunica a través de un medio de comunicación, por ejemplo: un medio de comunicación electrónico, correo electrónico, facsímil, texto, vídeo, audio, telégrafo, telegrama, carta, usando un procesador de computadora, o un microprocesador. En algunas realizaciones, la muestra se pone en contacto con un amortiguador de lisis a una primera temperatura y una segunda temperatura, en la que la segunda temperatura es mayor que la temperatura de la primera temperatura. En algunas realizaciones, se detecta la presencia y/o ausencia de al menos dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez patógenos. En algunas realizaciones, el amortiguador de lisis comprende al menos uno de: un componente amortiguador; un agente quelante de metales; un tensioactivo; un precipitante; y al menos un resto lisante. En algunas realizaciones, los pares de cebadores comprenden secuencias que son al menos 80% homólogas con al menos una de las secuencias: AGCTCATTTCACATCGTCCATCT sentido, TCCACCATTCCCAAGCTAAACC antisentido; GGCGGCCAGATTCAGCATAG sentido, GCTACCACCTTGCACATAAGC antisentido; TCGCCATTCGTTGACTACTTC sentido, ACATCGCTCTTGCCACAGACT antisentido; CAGTGCCCGGTGTGACAAC sentido, GACACGTT GCAGAGT GGTATAAC antisentido, CGGGCATACCATCCAGAGAA sentido; y CACCGTGGTCCAGTTTATCGT antisentido. En algunas realizaciones, la sonda oligonucleotídica interna comprende secuencias que son al menos 80% homólogas con al menos una de las secuencias: TTGCCAGGTAACGCAAGAA; CGGAAGCCAAAGCGCAC; TCTGGATTTAATGTCGCATAGCG; TTCCATGACAACGGACAGC; y ATCGGGCCGCGACTTC. En algunas realizaciones, un tercer cebador de los pares de cebadores se hibrida con una secuencia de ácido nucleico de control interno, y un cuarto cebador de los pares de cebadores se hibrida con una secuencia complementaria a la secuencia de ácido nucleico de control interno. En algunas realizaciones, los pares de cebadores comprenden además secuencias que son al menos 80% homólogas con la secuencia en TGGCGGGACTATTCTGAATGAG sentido; y CATCTCGCTGCTGTCTTTCTTC antisentido. En algunas realizaciones, los pares de cebadores comprenden secuencias de al menos 15 bases contiguas que son al menos 80% homólogas con la secuencia en TGGCGGGACTATTCTGAATGAG sentido; y CATCTCGCTGCTGTCTTTCTTC antisentido. En algunas realizaciones, la sonda oligonucleotídica interna comprende además secuencias que son al menos 80% homólogas con la secuencia ACTACATCCTCTCCGCAGCACAC. En algunas realizaciones, la sonda oligonucleotídica interna comprende secuencias de al menos 15 bases contiguas que son al menos 80% homólogas con la secuencia ACTACATCCTCTCCGCAGCACAC. En algunas realizaciones, una o más deEscherichia coli, SalmonellaoListeria monocytogenesse detectan cuando una o más deEscherichia coli, SalmonellaoListeria monocytogenesse inoculan en o sobre un producto alimentario. En algunas realizaciones, el producto alimentario es pavo. En algunas realizaciones, el producto alimentario es lechuga. En algunas realizaciones,Escherichia colise inocula a una concentración de al menos 0,60 UFC/25 mg. En algunas realizaciones, STX-1 y STX-2 se detectan en al menos 18/20 réplicas. En algunas realizaciones, la EAE deE. colise detecta en al menos 18/20 réplicas. En algunas realizaciones, S.entericase inocula a una concentración de al menos 0,48 UFC/25 g. En algunas realizaciones, S.entericase detecta en al menos 20/20 réplicas. En algunas realizaciones,L. monocytogenesse inocula a una concentración de al menos 1,0 UFC/25 g. En algunas realizaciones,L. monocytogenesse detecta en al menos 9/20 réplicas. En algunas realizaciones,Escherichia colise inocula a una concentración de al menos 0,60 UFC/25 mg. En algunas realizaciones, STX-1 y STX-2 se detectan en al menos 12/20 réplicas. En algunas realizaciones, la EAE deE. colise detecta en al menos 12/20 réplicas. En algunas realizaciones, S.entericase inocula a una concentración de al menos 0,48 UFC/25 g. En algunas realizaciones, S.entericase detecta en al menos 6/20 réplicas. En algunas realizaciones,L. monocytogenesse inocula a una concentración de al menos 1,0 UFC/25 g. En algunas realizaciones,L. monocytogenesse detecta en al menos 11/20 réplicas. En algunas realizaciones, el enriquecimiento se realiza en menos de 1000 ml de medio rico y no selectivo. En algunas realizaciones, el enriquecimiento se realiza en menos de 500 ml de medio rico y no selectivo. En algunas realizaciones, el enriquecimiento se realiza en 225 ml de medio rico y no selectivo. En algunas realizaciones, el medio rico y no selectivo puede comprender, por 1 litro de agua: entre alrededor de 5 g/l y alrededor de 20 g/l de extracto de levadura; entre alrededor de 20 g/l y alrededor de 50 g/l de digestión pancreática de caseína; entre alrededor de 1 g/l y 10 g/l de digestión enzimática de soja; entre alrededor de 1 g/l y alrededor de 10 g/l de dextrosa; entre alrededor de 1 g/l y alrededor de 20 g/l de cloruro de sodio; entre alrededor de 1 g/l y alrededor de 10 g/l de fosfato dipotásico; entre alrededor de 1 g/l y alrededor de 10 g/l de fosfato potásico; entre alrededor de 10 g/l y alrededor de 30 g/l de fosfato disódico; y entre alrededor de 1 g/l y alrededor de 10 g/l de piruvato de sodio. En algunas realizaciones, el medio rico y no selectivo puede comprender, por 1 litro de agua, entre alrededor de 5 g/l y alrededor de 20 g/l de extracto de levadura. En algunas realizaciones, el medio rico y no selectivo puede comprender, por 1 litro de agua, entre alrededor de 20 g/l y alrededor de 50 g/l de digestión pancreática de caseína. En algunas realizaciones, el medio rico y no selectivo puede comprender, por 1 litro de agua, entre alrededor de 1 g/l y 10 g/l de digestión enzimática de soja. En algunas realizaciones, el medio rico y no selectivo puede comprender, por 1 litro de agua, entre alrededor de 1 g/l y alrededor de 10 g/l de dextrosa. En algunas realizaciones, el medio rico y no selectivo puede comprender, por 1 litro de agua, entre alrededor de 1 g/l y alrededor de 20 g/l de cloruro de sodio. En algunas realizaciones, el medio rico y no selectivo puede comprender, por 1 litro de agua, entre alrededor de 1 g/l y alrededor de 10 g/l de fosfato dipotásico. En algunas realizaciones, el medio rico y no selectivo puede comprender, por 1 litro de agua, entre alrededor de 1 g/l y alrededor de 10 g/l de fosfato potásico. En algunas realizaciones, el medio rico y no selectivo puede comprender, por 1 litro de agua, entre alrededor de 10 g/l y alrededor de 30 g/l de fosfato disódico. En algunas realizaciones, el medio rico y no selectivo puede comprender, por 1 litro de agua, entre alrededor de 1 g/l y alrededor de 10 g/l de piruvato de sodio. En algunas realizaciones, el medio rico y no selectivo puede comprender, por 1 litro de agua, alrededor de 5 g/l de dextrosa. En algunas realizaciones, el medio rico y no selectivo puede comprender, por 1 litro de agua, alrededor de 2,2 g/l de piruvato de sodio. En algunas realizaciones, el medio rico y no selectivo puede comprender, por 1 litro de agua, alrededor de 12 g/l de extracto de levadura. En algunas realizaciones, el medio rico y no selectivo puede comprender, por 1 litro de agua, alrededor de 34 g/l de digestión pancreática de caseína. En algunas realizaciones, el medio rico y no selectivo puede comprender, por 1 litro de agua, alrededor de 6 g/l de digestión enzimática de soja. En algunas realizaciones, el medio rico y no selectivo puede comprender, por 1 litro de agua, alrededor de 10 g/l de cloruro de sodio. En algunas realizaciones, el medio rico y no selectivo puede comprender, por 1 litro de agua, alrededor de 5 g/l de fosfato dipotásico. En algunas realizaciones, el medio rico y no selectivo puede comprender, por 1 litro de agua, alrededor de 2,7 g/l de fosfato potásico. En algunas realizaciones, el medio rico y no selectivo puede comprender, por 1 litro de agua, alrededor de 19,2 g/l de fosfato disódico.

Se describen aquí, aunque no forman parte de la invención, kits para detectar simultáneamente la presencia y/o ausencia de uno o más patógenos. En un aspecto, el kit comprende: un amortiguador de lisis que comprende: un componente amortiguador; un agente quelante de metales; un tensioactivo; un precipitante; y al menos dos restos lisantes; y un conjunto de cebadores de amplificación, en el que los cebadores de amplificación comprenden uno o más pares de cebadores, en el que un primer cebador de uno o más pares de cebadores se hibrida con una secuencia de ácido nucleico diana de uno o más patógenos, y en el que un segundo cebador del uno o más pares de cebadores se hibridan con una secuencia complementaria al ácido nucleico diana. En algunas realizaciones, el kit comprende además una sonda oligonucleotídica interna, en el que la sonda oligonucleotídica interna es complementaria a una secuencia dentro de la secuencia diana, o complemento de la misma, de uno o más pares de cebadores. En algunas realizaciones, el componente amortiguador comprende tris(hidroximetil)aminometano (TRIS). En algunas realizaciones, el tris(hidroximetil)aminometano (TRIS) está presente en una concentración en el intervalo de alrededor de 60 mM a alrededor de 100 mM. En algunas realizaciones, el tris(hidroximetil)aminometano (TRIS) está presente en una concentración de alrededor de 80 mM. En algunas realizaciones, el agente quelante de metales comprende ácido etilendiaminotetraacético (EDTA). En algunas realizaciones, el ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) está presente en una concentración en el intervalo de alrededor de 1 mM a alrededor de 18 mM. En algunas realizaciones, el ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) está presente en una concentración de alrededor de 8 mM. En algunas realizaciones, el tensioactivo comprende polietilenglicol p-(1, 1,3, 3-tetrametilbutil)-fenil éter (Triton-X-100). En algunas realizaciones, el polietilenglicol p-(1, 1,3, 3-tetrametilbutil)-fenil éter (Triton-X-100) está presente en una concentración en el intervalo de alrededor de 0,1% a alrededor de 10%. En algunas realizaciones, el polietilenglicol p-(1, 1, 3, 3-tetrametilbutil) -fenil éter (Triton-X-100) está presente en una concentración de alrededor de 4,8%. En algunas realizaciones, el precipitante comprende proteinasa K. En algunas realizaciones, la proteinasa K está presente en una concentración en el intervalo de alrededor de 17,5% a alrededor de 37,5%. En algunas realizaciones, la proteinasa K está presente en una concentración de alrededor de 27,5%. En algunas realizaciones, el resto lisante comprende una perla de lisis. En algunas realizaciones, la perla de lisis comprende perlas de lisis de circonio de 100 |jm. En algunas realizaciones, las perlas de lisis de circonio de 100 jm están presentes en una concentración en el intervalo de alrededor de 0,1 gramos/ml a alrededor de 2,88 gramos/ml. En algunas realizaciones, el resto lisante comprende lisozima. En algunas realizaciones, la lisozima está presente en una concentración en el intervalo de alrededor de 10 mg/ml a alrededor de 30 mg/ml. En algunas realizaciones, los pares de cebadores comprenden secuencias que son al menos 80% homólogas con las secuencias: AGCTCATTTCACATCGTCATCT sentido, TCCACCATTCCCAAGCTAAACC antisentido; GGCGGCCAGATTCAGCATAG sentido, GCTACCACCTTGCACATAAGC antisentido; TCGCCATTCGTTGACTACTTC sentido, ACATCGCTCTTGCCACAGACT antisentido; CAGTGCCCGGTGTGCAAC sentido, GACACGTT GCAGAGT GGT AT AAC antisentido; y CGGGCATACCATCCAGAGAA sentido, CACCGTGGTCCAGTTTATCGT antisentido. En algunas realizaciones, los pares de cebadores comprenden secuencias de al menos 15 bases contiguas que son al menos 80% homólogas con las secuencias: AGCTCATTTCACATCGTCATCT sentido, TCCACCATTCCCAAGCTAAACC antisentido; GGCGGCCAGATTCAGCATAG sentido, GCTACCACCTTGCACATAAGC antisentido; TCGCCATTCGTTGACTACTTC sentido, ACATCGCTCTTGCCACAGACT antisentido; CAGTGCCCGGTGTGCAAC sentido, GACACGTTGCAGAGTGGTATAAC antisentido; y CGGGCATACCATCCAGAGAA sentido, CACCGTGGTCCAGTTTATCGT antisentido. En algunas realizaciones, la sonda oligonucleotídica interna comprende secuencias que son al menos 80% homólogas con las secuencias: TTGCCAGGTAACGCAAGAA; CGGAAGCCAAAGCGCAC; TCTGGATTTAATGTCGCATAGCG; TTCCATGACAACGGACAGC; y ATCGGGCCGCGACTTC. En algunas realizaciones, la sonda oligonucleotídica interna comprende secuencias de al menos 15 bases contiguas que son al menos 80% homólogas con las secuencias: TTGCCAGGTAACGCAAGAA; CGGAAGCCAAAGCGCAC; TCTGGATTTAATGTCGCATAGCG; TTCCATGACAACGGACAGC; y ATCGGGCCGCGACTTC. En algunas realizaciones, las sondas están marcadas en sus extremos 5' con un fluoróforo donador de transferencia de energía, y marcadas en sus extremos 3' con un fluoróforo aceptor de transferencia de energía. En algunas realizaciones, el kit comprende además una mezcla de amplificación. En algunas realizaciones, el kit comprende además un control de PCR negativo. En algunas realizaciones, el kit comprende además un control de PCR positivo. En algunas realizaciones, el kit comprende además instrucciones de uso. En algunas realizaciones, el amortiguador de lisis comprende al menos uno de: un componente amortiguador; un agente quelante de metales; un tensioactivo; un precipitante; y al menos un resto lisante. En algunas realizaciones, los pares de cebadores comprenden secuencias que son al menos 80% homólogas con al menos una de las secuencias: AGCTCATTTCACATCGTCCATCT sentido, TCCACCATTCCCAAGCTAAACC antisentido; GGCGGCCAGATTCAGCATAG sentido, GCTACCACCTTGCACATAAGC antisentido; TCGCCATTCGTTGACTACTTC sentido, ACATCGCTCTTGCCACAGACT antisentido; CAGTGCCCGGTGTGACAAC sentido, GACACGTTGCAGAGTGGTATAAC antisentido, CGGGCATACCATCCAGAGAA sentido; y CACCGTGGTCCAGTTTATCGT antisentido. En algunas realizaciones, la sonda oligonucleotídica interna comprende secuencias que son al menos 80% homólogas con al menos una de las secuencias: TTGCCAGGTAACGCAAGAA; CGGAAGCCAAAGCGCAC; TCTGGATTTAATGTCGCATAGCG; TTCCATGACAACGGACAGC; y ATCGGGCCGCGACTTC. En algunas realizaciones, los pares de cebadores comprenden además secuencias que son al menos 80% homólogas con la secuencia en TGGCGGGACTATTCTGAATGAG sentido; y CATCTCGCTGCTGTCTTTCTTC antisentido. En algunas realizaciones, los pares de cebadores comprenden secuencias de al menos 15 bases contiguas que son al menos 80% homólogas con la secuencia en TGGCGGGACTATTCTGAATGAG sentido; y CATCTCGCTGCTGTCTTTCTTC antisentido. En algunas realizaciones, la sonda oligonucleotídica interna comprende además secuencias que son al menos 80% homólogas con la secuencia ACTACATCCTCTCCGCAGCACAC. En algunas realizaciones, la sonda oligonucleotídica interna comprende secuencias de al menos 15 bases contiguas que son al menos 80% homólogas con la secuencia ACTACATCCTCTCCGCAGCACAC. En algunas realizaciones, el kit puede comprender uno o más medios descritos aquí. En algunas realizaciones, el medio puede ser medio rico y no selectivo. En algunas realizaciones, el medio rico y no selectivo puede comprender, por 1 litro de agua: entre alrededor de 5 g/l y alrededor de 20 g/l de extracto de levadura; entre alrededor de 20 g/l y alrededor de 50 g/l de digestión pancreática de caseína; entre alrededor de 1 g/l y 10 g/l de digestión enzimática de soja; entre alrededor de 1 g/l y alrededor de 10 g/l de dextrosa; entre alrededor de 1 g/l y alrededor de 20 g/l de cloruro de sodio; entre alrededor de 1 g/l y alrededor de 10 g/l de fosfato dipotásico; entre alrededor de 1 g/l y alrededor de 10 g/l de fosfato potásico; entre alrededor de 10 g/l y alrededor de 30 g/l de fosfato disódico; y entre alrededor de 1 g/l y alrededor de 10 g/l de piruvato de sodio. En algunas realizaciones, el medio rico y no selectivo puede comprender, por 1 litro de agua, entre alrededor de 5 g/l y alrededor de 20 g/l de extracto de levadura. En algunas realizaciones, el medio rico y no selectivo puede comprender, por 1 litro de agua, entre alrededor de 20 g/l y alrededor de 50 g/l de digestión pancreática de caseína. En algunas realizaciones, el medio rico y no selectivo puede comprender, por 1 litro de agua, entre alrededor de 1 g/l y 10 g/l de digestión enzimática de soja. En algunas realizaciones, el medio rico y no selectivo puede comprender, por 1 litro de agua, entre alrededor de 1 g/l y alrededor de 10 g/l de dextrosa. En algunas realizaciones, el medio rico y no selectivo puede comprender, por 1 litro de agua, entre alrededor de 1 g/l y alrededor de 20 g/l de cloruro de sodio. En algunas realizaciones, el medio rico y no selectivo puede comprender, por 1 litro de agua, entre alrededor de 1 g/l y alrededor de 10 g/l de fosfato dipotásico. En algunas realizaciones, el medio rico y no selectivo puede comprender, por 1 litro de agua, entre alrededor de 1 g/l y alrededor de 10 g/l de fosfato potásico. En algunas realizaciones, el medio rico y no selectivo puede comprender, por 1 litro de agua, entre alrededor de 10 g/l y alrededor de 30 g/l de fosfato disódico. En algunas realizaciones, el medio rico y no selectivo puede comprender, por 1 litro de agua, entre alrededor de 1 g/l y alrededor de 10 g/l de piruvato de sodio. En algunas realizaciones, el medio rico y no selectivo puede comprender, por 1 litro de agua, alrededor de 5 g/l de dextrosa. En algunas realizaciones, el medio rico y no selectivo puede comprender, por 1 litro de agua, alrededor de 2,2 g/l de piruvato de sodio. En algunas realizaciones, el medio rico y no selectivo puede comprender, por 1 litro de agua, alrededor de 12 g/l de extracto de levadura. En algunas realizaciones, el medio rico y no selectivo puede comprender, por 1 litro de agua, alrededor de 34 g/l de digestión pancreática de caseína. En algunas realizaciones, el medio rico y no selectivo puede comprender, por 1 litro de agua, alrededor de 6 g/l de digestión enzimática de soja. En algunas realizaciones, el medio rico y no selectivo puede comprender, por 1 litro de agua, alrededor de 10 g/l de cloruro de sodio. En algunas realizaciones, el medio rico y no selectivo puede comprender, por 1 litro de agua, alrededor de 5 g/l de fosfato dipotásico. En algunas realizaciones, el medio rico y no selectivo puede comprender, por 1 litro de agua, alrededor de 2,7 g/l de fosfato potásico. En algunas realizaciones, el medio rico y no selectivo puede comprender, por 1 litro de agua, alrededor de 19,2 g/l de fosfato disódico.

Se describen aquí composiciones de amortiguador de lisis. En un aspecto, la composición comprende: Un componente amortiguador seleccionado del grupo que consiste en tris(hidroximetil)aminometano (TRIS), ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinoetanosulfónico (HEPES), ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico (MOPS), dihidrogenofosfato sódico (NaH2P04), hidrogenofosfato disódico (a2HP04), y combinaciones de los mismos; un agente quelante de metales seleccionado del grupo que consiste en ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido etilenglicoltetraacético (EGTA), y combinaciones de los mismos; un tensioactivo seleccionado del grupo formado por dodecilsulfato de sodio (SDS), nonilfenoxipolioxiletanol (NP-40), polietilenglicol p-(1,1,3,3-tetrametilbutil)-feniléter (Triton-X-100), monooleato de polioxietilen (20) sorbitán (Tween-20), y combinaciones de los mismos; un precipitante seleccionado del grupo que consiste en glicerol, dimetilsulfóxido (DMSO), acetonitrilo (ACN), seroalbúmina bovina (BSA), proteinasa K, sales de acetato, y combinaciones de los mismos; y al menos dos restos lisantes. En algunas realizaciones, el componente amortiguador comprende tris(hidroximetil)aminometano (TRIS). En algunas realizaciones, el tris(hidroximetil)aminometano (TRIS) está presente en una concentración en el intervalo de alrededor de 60 mM a alrededor de 100 mM. En algunas realizaciones, el agente quelante de metales comprende ácido etilendiaminotetraacético (EDTA). En algunas realizaciones, el ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) está presente en una concentración en el intervalo de alrededor de 1 mM a alrededor de 18 mM. En algunas realizaciones, el tensioactivo comprende polietilenglicol p-(1, 1, 3, 3-tetrametilbutil)-fenil éter (Triton-X-100). En algunas realizaciones, el polietilenglicol p-(1, 1,3, 3-tetrametilbutil)-fenil éter (Triton-X-100) está presente en una concentración en el intervalo de alrededor de 0,1% a alrededor de 10%. En algunas realizaciones, el precipitante comprende proteinasa K. En algunas realizaciones, la proteinasa K está presente en una concentración en el intervalo de alrededor de 17,5% a alrededor de 37,5%. En algunas realizaciones, el resto lisante comprende una perla de lisis. En algunas realizaciones, la perla de lisis comprende perlas de lisis de circonio de 100 |jm. En algunas realizaciones, las perlas de lisis de circonio de 100 jm están presentes en una concentración en el intervalo de alrededor de 0,1 gramos/ml a alrededor de 2,88 gramos/ml. En algunas realizaciones, el resto lisante comprende lisozima. En algunas realizaciones, la lisozima está presente en una concentración en el intervalo de alrededor de 10 mg/ml a alrededor de 30 mg/ml.

Se describen aquí, aunque no forman parte de la invención, métodos para el aislamiento de ácido nucleico de una muestra. En un aspecto, el método comprende: una primera lisis de la muestra, que comprende: combinar la muestra y la composición de amortiguador de lisis descrita aquí, formando así una mezcla de muestra/amortiguador de lisis; agitar la mezcla de muestra/amortiguador de lisis, lisando así la muestra y formando una mezcla de muestra lisada; una segunda lisis de la muestra, que comprende: continuar agitando la mezcla de muestra lisada a una temperatura mayor que la temperatura de la primera lisis de la muestra; y separar la mezcla de muestra lisada en una mezcla que comprende una fracción sólida que comprende muestra, y un sobrenadante que comprende ácido nucleico; y recuperar el sobrenadante de ácido nucleico de la mezcla de muestra lisada. En algunas realizaciones, agitar comprende sacudir. En algunas realizaciones, en la primera lisis de la muestra, la muestra se incuba con el amortiguador de lisis en el intervalo de alrededor de 5 minutos a alrededor de 25 minutos. En algunas realizaciones, en la primera lisis de la muestra, la muestra se incuba con el amortiguador de lisis mientras se agita en el intervalo de alrededor de 1200 RPM a alrededor de 1400 RPM. En algunas realizaciones, en la primera lisis de la muestra, la muestra se incuba con el amortiguador de lisis en el intervalo de alrededor de 45°C a alrededor de 85°C. En algunas realizaciones, en la segunda lisis de la muestra, la muestra se incuba con el amortiguador de lisis en el intervalo de alrededor de 5 minutos a alrededor de 15 minutos. En algunas realizaciones, en la segunda lisis de la muestra, la muestra se incuba con el amortiguador de lisis en el intervalo de alrededor de 85°C a alrededor de 105°C. En algunas realizaciones, en la segunda lisis de la muestra, la muestra se incuba con el amortiguador de lisis mientras se agita en el intervalo de alrededor de 1200 RPM a alrededor de 1400 RPM. En algunas realizaciones, la mezcla de muestra lisada se separa en una mezcla que comprende una fracción sólida que comprende muestra y un sobrenadante que comprende ácido nucleico mediante centrifugación.

Se describe aquí, aunque no forma parte de la invención, un par de cebadores de ADN monocatenario para la determinación de una secuencia nucleotídica del gen deListeria monocytogenesListeriolisina O (HlyA) mediante una reacción en cadena de la polimerasa, en el que el uso de los cebadores en una reacción en cadena de la polimerasa da como resultado la síntesis de ADN que tiene toda o parte de la secuencia del gen deListeria monocytogenesListeriolisina O (HlyA), en el que el par comprende secuencias que son al menos 80% homólogas con las secuencias: AGCTCATTTCACATCGTCCATCT sentido; y TCCACCATTCCCAAGCTAAACC antisentido. Se proporciona aquí una sonda oligonucleotídica que es complementaria en toda su longitud a una secuencia amplificada por el par de cebadores, en la que la sonda oligonucleotídica comprende secuencias que son al menos 80% homólogas con la secuencia: TTGCCAGGTAACGCAAGAA.

Se describe aquí, aunque no forma parte de la invención, un par de cebadores de ADN monocatenario para la determinación de una secuencia nucleotídica del gen de intimina (eaeA) deEscherichia coliproductora de toxina Shiga mediante una reacción en cadena de la polimerasa, en el que el uso de los cebadores en una reacción en cadena de la polimerasa da como resultado la síntesis de ADN que tiene toda o parte de la secuencia del gen de intimina (eaeA) deEscherichia coliproductora de toxina Shiga, en el que el par comprende secuencias que son al menos 80% homólogas con las secuencias: GGCGGCCAGATt Ca Gc At AG sentido; y GCTACCACCTTGCACATAAGC antisentido. Se proporciona aquí una sonda oligonucleotídica que es complementaria en toda su longitud a una secuencia amplificada por el par de cebadores, en la que la sonda oligonucleotídica comprende secuencias que son al menos 80% homólogas con la secuencia: CGGAAGCCAAAGCGCAC.

Se describe aquí, aunque no forma parte de la invención, un par de cebadores de ADN monocatenario para la determinación de una secuencia nucleotídica del gen de toxina Shiga 1 (stx1) deEscherichia coliproductora de toxina Shiga mediante una reacción en cadena de la polimerasa, en el que el uso de los cebadores en una reacción en cadena de la polimerasa da como resultado la síntesis de ADN que tiene toda o parte de la secuencia del gen de toxina Shiga 1 (stx1) deEscherichia coliproductora de toxina Shiga, en el que el par comprende secuencias que son al menos 80% homólogas con las secuencias: TCGCCATTCGTTGACTACTTC sentido; y ACATCGCTCTTGCCACAGACT antisentido. Se proporciona aquí una sonda oligonucleotídica que es complementaria en toda su longitud a una secuencia amplificada por el par de cebadores, en la que la sonda oligonucleotídica comprende secuencias que son al menos 80% homólogas con la secuencia: TCTGGATTTAATGTCGCATAGCG.

Se describe aquí, aunque no forma parte de la invención, un par de cebadores de ADN monocatenario para la determinación de una secuencia nucleotídica del gen de toxina Shiga 2 (stx2) deEscherichia coliproductora de toxina Shiga mediante una reacción en cadena de la polimerasa, en el que el uso de los cebadores en una reacción en cadena de la polimerasa da como resultado la síntesis de ADN que tiene toda o parte de la secuencia del gen de toxina Shiga 1 (stx2) deEscherichia coliproductora de toxina Shiga, en el que el par comprende secuencias que son al menos 80% homólogas con las secuencias: CAGTGCCCGGTGTGACAAC sentido; y GACACGTTGCAGAGTGGTATAAC antisentido. Se proporciona aquí una sonda oligonucleotídica que es complementaria en toda su longitud a una secuencia amplificada por el par de cebadores, en la que la sonda oligonucleotídica comprende secuencias que son al menos 80% homólogas con la secuencia: TTCCATGACAACGGACAGC.

Se describe aquí, aunque no forma parte de la invención, un par de cebadores de ADN monocatenario para la determinación de una secuencia nucleotídica del gen A de invasión deSalmonella(InvA) mediante una reacción en cadena de la polimerasa, en el que el uso de los cebadores en una reacción en cadena de la polimerasa da como resultado la síntesis de ADN que tiene toda o parte de la secuencia del gen A de invasión deSalmonella(InvA), en el que el par comprende secuencias que son al menos 80% homólogas con las secuencias: CGGGCATACCATCCAGAGAA sentido; y CACCGTGGTCCAGTTTATCGT antisentido. Se proporciona aquí una sonda oligonucleotídica que es complementaria en toda su longitud a una secuencia amplificada por el par de cebadores, en la que la sonda oligonucleotídica comprende secuencias que son al menos 80% homólogas con la secuencia: ATCGGGCCGCGACTTC.

Se describen aquí, aunque no forman parte de la invención, métodos para lisar una muestra. En un aspecto, el método comprende una primera lisis de la muestra, que comprende: combinar la muestra y una composición de amortiguador de lisis, formando así una mezcla de muestra/amortiguador de lisis, en el que la composición de amortiguador de lisis comprende: un componente amortiguador; un agente quelante de metales; un tensioactivo; un precipitante; y al menos dos restos lisantes; agitar la mezcla de muestra/amortiguador de lisis, lisando así la muestra y formando una mezcla de muestra lisada; una segunda lisis de la muestra, que comprende: continuar agitando la mezcla de muestra lisada a una temperatura mayor que la temperatura de la primera lisis de la muestra, lisando así la muestra. En algunas realizaciones, agitar comprende sacudir. En algunas realizaciones, en la primera lisis de la muestra, la muestra se incuba con el amortiguador de lisis en el intervalo de alrededor de 5 minutos a alrededor de 25 minutos. En algunas realizaciones, en la primera lisis de la muestra, la muestra se incuba con el amortiguador de lisis mientras se agita en el intervalo de alrededor de 1200 RPM a alrededor de 1400 RPM. En algunas realizaciones, en la primera lisis de la muestra, la muestra se incuba con el amortiguador de lisis en el intervalo de alrededor de 45°C a alrededor de 85°C. En algunas realizaciones, en la segunda lisis de la muestra, la muestra se incuba con el amortiguador de lisis en el intervalo de alrededor de 5 minutos a alrededor de 15 minutos. En algunas realizaciones, en la segunda lisis de la muestra, la muestra se incuba con el amortiguador de lisis en el intervalo de alrededor de 85°C a alrededor de 105°C. En algunas realizaciones, en la segunda lisis de la muestra, la muestra se incuba con el amortiguador de lisis mientras se agita en el intervalo de alrededor de 1200 RPM a alrededor de 1400 RPM. En algunas realizaciones, el componente amortiguador comprende tris(hidroximetil)aminometano (TRIS). En algunas realizaciones, el tris(hidroximetil)aminometano (TRIS) está presente en una concentración en el intervalo de alrededor de 60 mM a alrededor de 100 mM. En algunas realizaciones, el agente quelante de metales comprende ácido etilendiaminotetraacético (EDTA). En algunas realizaciones, el ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) está presente en una concentración en el intervalo de alrededor de 1 mM a alrededor de 18 mM. En algunas realizaciones, el tensioactivo comprende polietilenglicol p-(1, 1, 3, 3-tetrametilbutil)-fenil éter (Triton-X-100). En algunas realizaciones, el polietilenglicol p-(1, 1,3, 3-tetrametilbutil)-fenil éter (Triton-X-100) está presente en una concentración en el intervalo de alrededor de 0,1% a alrededor de 10%. En algunas realizaciones, el precipitante comprende proteinasa K. En algunas realizaciones, la proteinasa K está presente en una concentración en el intervalo de alrededor de 17,5% a alrededor de 37,5%. En algunas realizaciones, el resto lisante comprende una perla de lisis. En algunas realizaciones, la perla de lisis comprende perlas de lisis de circonio de 100 |jm. En algunas realizaciones, las perlas de lisis de circonio de 100 jm están presentes en una concentración en el intervalo de alrededor de 0,1 gramos/ml a alrededor de 2,88 gramos/ml. En algunas realizaciones, el resto lisante comprende lisozima. En algunas realizaciones, la lisozima está presente en una concentración en el intervalo de alrededor de 10 mg/ml a alrededor de 30 mg/ml.

Se describe aquí, aunque no forma parte de la invención, un par de cebadores de ADN monocatenario para la determinación de una secuencia nucleotídica de un control interno mediante una reacción en cadena de la polimerasa, en el que el uso de los cebadores en una reacción en cadena de la polimerasa da como resultado la síntesis de ADN que tiene toda o parte de la secuencia del control interno, en el que el par comprende secuencias que son al menos 80% homólogas con las secuencias: TGGCGGGACTATTCTGAATGa G sentido; y CATCTCGCTGCTGTCTTTCTTC antisentido. En algunas realizaciones, el molde de control interno comprende una secuencia de: TTTTGTGGCGGGACTATTCTGAATGAGTACTACATCCTCTCCGCAGCACACTGCATGCAC CAAGCAAAAAGATTCAAAGTTAGAGTAGGGGAACGGGACACCGAGAAGAAAGACAGCA GCGAGATGGCGCA. En algunas realizaciones, el molde de control interno comprende una secuencia al menos 80% homóloga con la secuencia TTTTGTGGCGGGACTATTCTGAATGAGTACTACATCCTCTCCGCAGCACACTGCATGCAC CAAGCAAAAAGATTCAAAGTTAGAGTAGGGGAACGGGACACCGAGAAGAAAGACAGCA GCGAGATGGCGCA. Se describe aquí una sonda oligonucleotídica que es complementaria en toda su longitud a una secuencia amplificada por el par de cebadores, en la que la sonda oligonucleotídica comprende secuencias que son al menos 80% homólogas con la secuencia: ACTACATCCTCTCCGCAGCACAC.

Los métodos de la presente invención pueden lograr estos y otros objetos mediante el uso de cebadores en combinación para las técnicas basadas en PCR de detección rápida y de alto rendimiento para detectar simultáneamente múltiples patógenos. Los métodos de detección múltiple realizados en algunos aspectos de la presente invención tienen una sensibilidad y especificidad mejoradas para la detección de múltiples patógenos simultáneamente.

En algunos aspectos, los métodos descritos aquí comprenden cebadores que detectan con alta especificidad y sensibilidad a ciertos patógenos, y por lo tanto, los cebadores descritos aquí pueden usarse en técnicas de detección fiables como se describe aquí para identificar patógenos en el suministro de alimentos humanos antes de que los patógenos alcancen el consumidor. Diversos aspectos de la presente invención utilizan tamaños de productos de PCR amplificables, lo que permite que los métodos también sean útiles en la identificación de patógenos y sus variantes estrechamente relacionadas con el fin de clasificar y rastrear el origen de la contaminación.

En algunos aspectos, los organismos que el método puede detectar incluyen, pero no se limitan a, especies, subespecies, serovares y/o cepas relevantes de, por ejemplo,Escherichia coli O157H7, Shigella Dysenteriae, Salmonella entéricassp. enterica (incluyendo losserovares Typhi,Typhimurium y Saintpaul)Francisella tularensisssp. tularensis,Francisella tularensisssp. novicida,Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Shigella sonnei, Yersinia pestis, Listeria monocytogenesyYersinia pseudotuberculosis.En algunos aspectos, los métodos descritos aquí identifican condiciones de PCR que son adecuadas para la amplificación de todos los patógenos en las mismas condiciones de reacción, haciendo así que los cebadores así identificados sean adecuados para uso combinado en esas condiciones de reacción en múltiples PCR simultáneas para detectar e identificar esos patógenos de los alimentos.

En algunos aspectos, se pueden diseñar conjuntos de cebadores de PCR multiplex y sondas TaqMan usando software comercial y secuencias de ADN genómico. En algunos aspectos, la especificidad de las secuencias resultantes se puede evaluar in silico frente a la base de datos nr usando Blast. En algunos aspectos, se pueden identificar condiciones de PCR óptimas para cada uno de los conjuntos multiplex. En algunos aspectos, la selección de un conjunto final de cebadores y sondas se puede realizar por etapas. En algunos aspectos, la compatibilidad, sensibilidad y especificidad pueden evaluarse usando ADN genómico purificado de organismos diana y con ADN de bacterias no diana. En algunos aspectos, los conjuntos de cebadores y sondas con un rendimiento óptimo con ADN de bacterias no diana se pueden ensayar posteriormente usando ADN preparado a partir de bacterias cultivadas. En algunos aspectos, se pueden ensayar conjuntos de cebadores y sondas usando ADN preparado a partir de bacterias cultivadas en presencia de diversas matrices alimentarias.

En algunos aspectos, los métodos descritos aquí pueden identificar cebadores para patógenos que pueden combinarse fácilmente en ensayos comunes para la detección rápida y precisa de patógenos, en los que los ensayos son capaces de discriminar una amplia gama de patógenos o bacterias relacionadas.

En algunos aspectos, los métodos descritos aquí pueden identificar diversos cebadores, se pueden usar solos para detectar e identificar un patógeno seleccionado, o se pueden usar en combinación y/o en tándem para detectar e identificar si cualquiera de una pluralidad de patógenos está presente en una muestra.

En algunos aspectos, cuando se usan en tándem o combinación, los cebadores y/o las sondas oligonucleotídicas descritas aquí pueden comprender el uso de pares de cebadores o sondas oligonucleotídicas diseñadas para detectar dos o más patógenos diferentes en una matriz de microplacas de PCR común o, alternativamente, en una PCR multiplex. En algunos aspectos, los diversos pares de cebadores y/o sondas oligonucleotídicas diferentes se seleccionan de manera que todos los pares usados puedan operar bajo las mismas condiciones (por ejemplo, temperaturas de fusión) de modo que el procedimiento de PCR pueda ejecutarse simultáneamente en la micromatriz o matriz de un solo tubo, o juntos en un ensayo. En algunos aspectos, las micromatrices y/o matrices multiplex contienen pares de cebadores y/o sondas oligonucleotídicas suficientes para detectar e identificar dos, tres, cuatro, cinco, seis o más patógenos simultáneamente. En algunos aspectos, particularmente con respecto a la PCR múltiples, tales realizaciones pueden usar opcionalmente diferentes sondas específicas para el gen diana que contienen diferentes colorantes de diferente capacidad de emisión para ayudar en la detección multiplex.

Se describe además aquí, aunque no forma parte de la invención, un sistema y dispositivo para detectar uno o más patógenos. El dispositivo y el sistema pueden ser un sistema informático. El dispositivo y el sistema pueden comprender una memoria que almacena instrucciones ejecutables, y un procesador para ejecutar las instrucciones ejecutables para realizar cualquier método para detectar uno o más patógenos. En algunos casos, el dispositivo y el sistema pueden detectar uno o más patógenos en una muestra usando las sondas oligonucleotídicas, cebadores y amortiguadores de lisis en los kits descritos aquí. En algunos aspectos, el dispositivo y el sistema pueden detectar la presencia o ausencia de uno o más patógenos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Las nuevas características descritas aquí se exponen con particularidad en las reivindicaciones adjuntas. Se obtendrá una mejor comprensión de las características y ventajas de las características descritas aquí haciendo referencia a la siguiente descripción detallada que expone ejemplos ilustrativos, en los que se utilizan los principios de las características descritas aquí, y cuyos dibujos adjuntos:

La FIG. 1 muestra un gráfico que muestra 1 UFC/25 g - Deli Pavo - Todas las dianas.

La FIG. 2 muestra un gráfico 1 UFC/25 g - Deli Pavo - Dianas STEC.

La FIG. 3 muestra un gráfico que muestra 1 - Deli Pavo - DianaSalmonella

La FIG. 4 muestra un gráfico que muestra 1 - Deli Pavo - DianaL. monocytogenesLa FIG. 5 muestra un gráfico que muestra 1 Deli Pavo - Tabla de resultados La FIG. 6 muestra un gráfico que muestra 5 UFC/25 g - Deli Pavo - Todas las dianas

La FIG. La figura 7 muestra un gráfico que muestra 5 UFC/25 g - Deli Pavo - Dianas STEC

La FIG. 8 muestra un gráfico que muestra 5 UFC/25 g - Deli Pavo - DianaSalmonella

La FIG. 9 representa un gráfico que muestra 5 UFC/25 g - Deli Pavo - DianaL. monocytogenes

La FIG. 10 representa un gráfico que muestra 5 UFC/25 g - Deli Pavo - Tabla de resultados

La FIG. 11 representa un gráfico que muestra 1 UFC/25 g - Salchicha - Tabla de resultados

La FIG. 12 representa un gráfico que muestra Salchicha - 5 UFC/25 g - Tabla de resultados

La FIG. 13 muestra un gráfico que muestra lechuga iceberg - 1 UFC/25 g - Tabla de resultados

La FIG. 14 representa un gráfico que muestra 5 UFC/25 g - lechuga iceberg - Tabla de resultados La FIG. 15 representa un gráfico que muestra 1 UFC/25 g - Carne picada cruda - Tabla de resultados La FIG. 16 representa un gráfico que muestra 5 UFC/25 g - Carne picada cruda Tabla de resultados

La FIG. 17 representa un gráfico que muestra 1 UFC/25 g - Deli Pavo - STX-1 y STX-2 - Control interno. La FIG. 18 representa un gráfico que muestra 1 UFC/25 g - Deli Pavo -L. monocytogenes- Control interno.

La FIG. 19 representa un gráfico que muestra Deli Pavo - S.entérica- Control interno. La FIG. 20 representa un gráfico que muestra Deli Pavo -E. coliEAE - Control interno. La FIG. 21 representa un gráfico que muestra 1 UFC/25 g - Deli Pavo - Control interno.

La FIG. 22 representa un gráfico que muestra 1 UFC/25 g - Deli Pavo - Tabla de resultados - Control interno.

La FIG. 23 representa un gráfico que muestra 5 UFC/25 g - Deli Pavo - STX-1 y STX-2 - Control interno.

La FIG. 24 representa un gráfico que muestra 5 UFC/25 g - Deli Pavo -L. monocytogenes- Control interno.

La FIG. 25 representa un gráfico que muestra Deli Pavo - S.entérica- Control interno. La FIG. 26 representa un gráfico que muestra Deli Pavo -E. coliEAE - Control interno. La FIG. 27 representa un gráfico que muestra 5 UFC/25 g - Deli Pavo - Control interno.

La FIG. 28 representa un gráfico que muestra 5 UFC/25 g - Deli Pavo - Tabla de resultados - Control interno.

La FIG. 29 representa un gráfico que muestra 1 UFC/25 g - Lechuga - STX-1 y STX-2 - Control interno.

La FIG. 30 representa un gráfico que muestra 1 UFC/25 g - Lechuga -L. monocytogenes- Control interno.

La FIG. 31 representa un gráfico que muestra 1 UFC/25 g - Lechuga - S.enterica- Control interno.

La FIG. 32 representa un gráfico que muestra 1 UFC/25 g - Lechuga -E. coliEAE - Control interno.

La FIG. 33 representa un gráfico que muestra 1 UFC/25 g - Lechuga - Control interno.

La FIG. 34 representa un gráfico que muestra 1 UFC/25 g - Lechuga - Tabla de resultados - Control interno.

La FIG. 35 representa un gráfico que muestra 5 UFC/25 g - Lechuga - STX-1 y STX-2 - Control interno.

La FIG. 36 representa un gráfico que muestra 5 UFC/25 g - Lechuga -L. monocytogenes- Control interno.

La FIG. 37 representa un gráfico que muestra 5 UFC/25 g - Lechuga - S.enterica- Control interno.

La FIG. 38 representa un gráfico que muestra 5 UFC/25 g - Lechuga -E. coliEAE - Control interno.

La FIG. 39 representa un gráfico que muestra 5 UFC/25 g - Lechuga - Control interno.

La FIG. 40 representa un gráfico que muestra 5 UFC/25 g - Lechuga - Tabla de resultados - Control interno.

La FIG. 41 representa un gráfico que muestra la inoculación de 3 UFC deListeria monocytogenesen cortes de carne de res cruda. La FIG. 41A representa un gráfico que muestra los resultados de la amplificación después del enriquecimiento en el Medio A. La FIG. 41B representa un gráfico que muestra los resultados de la amplificación después del enriquecimiento en el Medio A frente al Medio B.

La FIG. 42 representa un gráfico que muestra la inoculación de 15 UFC deEscherichia coli O157H7en espinaca cruda. La FIG. 42A representa un gráfico que muestra los resultados de la amplificación después del enriquecimiento en el Medio A. La FIG. 42B representa un gráfico que muestra los resultados de la amplificación después del enriquecimiento en el Medio A frente al Medio B.

La FIG. 43 representa un gráfico que muestra la inoculación de 15 UFC deEscherichia coli O157H7en espinaca cruda. La FIG. 43A representa un gráfico que muestra los resultados de la amplificación después del enriquecimiento en el Medio A. La FIG. 43B representa un gráfico que muestra los resultados de la amplificación después del enriquecimiento en el Medio A frente al Medio B.

La FIG. 44 representa un gráfico que muestra la inoculación de 15 UFC deListeria monocytogenesen salmón. La FIG. 44A representa un gráfico que muestra los resultados de la amplificación después del enriquecimiento en el Medio A. La FIG. 44B representa un gráfico que muestra los resultados de la amplificación después del enriquecimiento en el Medio A frente al Medio B.

La FIG. 45 representa un gráfico que muestra la inoculación de 3 UFC/25 gramos de las dianas STEC deE. colien cortes de carne cruda.

La FIG. 46 representa un gráfico que muestra la inoculación de 3 UFC/25 gramos de la dianaL. monocytogenesen cortes de carne cruda.

La FIG. 47 representa un gráfico que muestra la inoculación de 3 UFC/25 gramos de la diana S.entéricaen cortes de carne cruda.

La FIG. 48 muestra una tabla que muestra corte de carne cruda - 3 UFC/25 g - Tabla de resultados

La FIG. 49 representa un gráfico que muestra la inoculación de 15 UFC/25 gramos de la diana deL. monocytogenesen cortes de carne cruda.

La FIG. 50 representa un gráfico que muestra la inoculación de 15 UFC/25 gramos de la diana S.entéricaen cortes de carne cruda.

La FIG. 51 representa una tabla que muestra corte de carne cruda - 15 UFC/25 g - Tabla de resultados.

La FIG. 52 representa un gráfico que muestra la inoculación de 3 UFC/25 gramos de las dianas STEC deE. colien leche.

La FIG. 53 representa un gráfico que muestra la inoculación de 3 UFC/25 gramos de la dianaL. monocytogenesen leche.

La FIG. 54 representa un gráfico que muestra la inoculación de 3 UFC/25 gramos de la diana S.entericaen leche. La FIG. 55 representa una tabla que muestra Leche - 3 UFC/25 g - Tabla de Resultados.

La FIG. 56 representa un gráfico que muestra la inoculación de 15 UFC/25 gramos de las dianas STEC deE. colien leche.

La FIG. 57 representa un gráfico que muestra la inoculación de 15 UFC/25 gramos de la dianaL. monocytogenesen leche.

La FIG. 58 representa un gráfico que muestra la inoculación de 15 UFC/25 gramos de la diana S.entericaen leche. La FIG. 59 representa un gráfico que muestra Leche - 15 UFC/25 g - Tabla de Resultados.

La FIG. 60 representa un gráfico que muestra la inoculación de 15 UFC/25 gramos de las dianas O157 deE. colien espinacas crudas.

La FIG. 61 representa un gráfico que muestra la inoculación de 15 UFC/25 gramos de la dianaL. monocytogenesen Brie de Meaux.

La FIG. 62 representa un gráfico que muestra la inoculación de 15 UFC/25 gramos de la dianaL. monocytogenesen salmón ahumado.

La FIG. 63 representa un gráfico que muestra la inoculación de 15 UFC/25 gramos de la diana S.entericaen manteca de cacahuete.

La FIG. 64 representa un gráfico que muestra la inoculación de 15 UFC/25 gramos de la diana S.entericaen huevos crudos.

La FIG. 65 representa un gráfico que muestra la inoculación de 15 UFC/25 gramos de la diana S.entericaen pimienta negra.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA DESCRIPCIÓN

A continuación se describen varios aspectos con referencia a aplicaciones de ejemplos a modo de ilustración. Debe entenderse que se exponen numerosos detalles, relaciones y métodos específicos para proporcionar una comprensión completa de las características descritas aquí. Sin embargo, alguien experto en la técnica pertinente reconocerá fácilmente que las características descritas aquí se pueden practicar sin uno o más detalles específicos, o con otros métodos. Las características aquí descritas no están limitadas por el orden ilustrado de actos o eventos, ya que algunos actos pueden ocurrir en diferentes órdenes y/o simultáneamente con otros actos o eventos. Además, no todos los actos o eventos ilustrados requieren implementar una metodología acorde con las características aquí descritas. La terminología usada aquí tiene el propósito de describir casos particulares únicamente, y no pretende ser limitativa. Como se usan aquí, las formas singulares “un”, “una” y “el/la” pretenden incluir también las formas plurales, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Además, en la medida en que los términos “que incluye”, “incluye”, “que tiene”, “tiene”, “con”, o variantes de los mismos se usan en la descripción detallada y/o en las reivindicaciones, tales términos pretenden ser inclusivos de manera similar al término “que comprende”.

Definiciones

En esta descripción, la expresión “alrededor de” o “aproximadamente” puede significar dentro de un intervalo de error aceptable para el valor particular determinado por un experto en la técnica, que dependerá en parte de cómo se mide o determina el valor, es decir, las limitaciones del sistema de medida. Por ejemplo, “alrededor de” puede significar dentro de 1 o más de 1 desviación estándar, según la práctica en la técnica. Alternativamente, “alrededor de” puede significar un intervalo de hasta el 20%, hasta el 10%, hasta el 5%, o hasta el 1% de un valor dado. Alternativamente, particularmente con respecto a sistemas o procesos biológicos, la expresión puede significar dentro de un orden de magnitud, dentro de 5 veces, y dentro de 2 veces, de un valor. Cuando se describen valores particulares en la solicitud y las reivindicaciones, a menos que se indique lo contrario, se debe asumir que la expresión “alrededor de” significa dentro de un intervalo de error aceptable para el valor particular.

En esta descripción, los términos “medios”, “medio”, “caldo”, “caldo de cultivo” y similares se refieren todos a una mezcla de nutrientes adecuada para cultivar un patógeno deseado que puede ser una cepa o especie de bacteria o microbio, o virus o agente infeccioso o agente biológico que causa enfermedad o dolencia a su hospedante.

En esta descripción, el término “patógeno” y similares se refieren todos a bacterias, cepas de microbios, o especies, o virus, o agentes infecciosos o agentes biológicos que pueden causar enfermedades a su hospedante.

En esta descripción, el término “microorganismo” está incluido en el término “patógeno”.

En esta descripción, “detectar” un microorganismo o patógeno significa cualquier procedimiento de observación de la presencia de un patógeno, o un cambio en la presencia de un patógeno, en una muestra, independientemente de si el patógeno o el cambio en el patógeno se detecta realmente o no.

En esta descripción, la expresión “medio enriquecido”, “medio de enriquecimiento”, “medio rico” y similares se refieren todos a medios que han sido suplementados con materiales altamente nutritivos, tales como, pero sin limitarse a, sangre, suero o extracto de levadura, con el fin de cultivar organismos molestos.

En esta descripción, “enriquecimiento” de un medio se refiere a la adición de componentes seleccionados para promover el crecimiento u otras características de uno o más patógenos deseados. Una “disolución de enriquecimiento” se refiere a una disolución que comprende estos componentes adicionales.

En esta descripción, la expresión “agente selectivo” significa una condición química o de cultivo que sirve para favorecer el crecimiento de un patógeno deseado, o para inhibir el crecimiento de un patógeno no deseado.

En esta descripción, la expresión “medio no selectivo” y similares se refieren a medios que están sustancialmente libres, o libres de antibióticos.

En esta descripción, la expresión “suplemento de enriquecimiento selectivo” es equivalente a la expresión “agente selectivo”.

En esta descripción, la expresión “sonda de hibridación” o “sonda oligonucleotídica interna” puede ser equivalente a la expresión “sonda oligonucleotídica”.

En esta descripción, un “suplemento” para un medio de cultivo se refiere a una disolución, líquido, sólido u otro material para la adición a un medio de cultivo.

En esta descripción “sustancialmente libre” se refiere a menos de alrededor de 10% en peso, o menos de alrededor de 9% en peso, o menos de alrededor de 8% en peso, o menos de alrededor de 7% en peso, o menos de de 6% en peso, o menos de alrededor de 5% en peso, o menos de alrededor de 4% en peso, o menos de de 3% en peso, o menos de alrededor de 2% en peso, o menos de alrededor de 1,5% en peso, tal como men alrededor de 1% en peso del ingrediente al que se refiere.

En esta descripción, “amplicón” se refiere al producto amplificado de una reacción de amplificación de ácido nucleico, por ejemplo el producto de amplificación de una secuencia.

En esta descripción, los términos “muestra” y “muestra biológica” tienen el mismo y más amplio significado posible consistente con su contexto, y se refieren de manera general y sin limitación a cualquier elemento que se desee analizar para detectar la presencia de uno o más patógenos de interés, e incluyen toda dicha materia objeto, ya sea que contenga o no algún patógeno, o cualquier patógeno de interés, y si contiene o no norovirus (virus similares a Norwalk), especies deCampylobacter, Giardia lamblia, Salmonella, Shigella, Cryptosporidium parvum, Clostridium species, Toxoplasma gondii, Staphylococcus aureus, Escherichia coliproductora de toxina Shiga (STEC),Yersinia enterocolitica, Bacillus cereus, Bacillus anthracis, Cyclospora cayetanensis, Listeria monocytogenes, Vibrio parahemolyticusoV. vulnificus.

En esta descripción, la expresión “agente quelante” se refiere a un “ligando polidentado”. Las expresiones “agente quelante”, “quelador”, “quelante” y “agente secuestrante” se usan indistintamente. El agente quelante es capaz de formar múltiples enlaces con un único átomo, tal como un ion metálico, por ejemplo Mg2+ o Ca2+.

El término “detergente”, como se utiliza aquí, significa “tensioactivo”.

En esta descripción, el término “perlas” se refiere a partículas que tienen un tamaño en el intervalo de 50 |jm a 2 mm, en algunos aspectos, de 100 jm a 800 jm .

En esta descripción, los términos “polinucleótido”, cuando se usan en singular o plural, generalmente se refieren a cualquier polirribonudeótido o polidesoxirribonudeótido, que puede ser ARN o ADN no modificado, o ARN o ADN modificado. Así, por ejemplo, los polinucleótidos, como se definen aquí, incluyen, sin limitación, ADN monocatenario y bicatenario, ADN que incluye regiones monocatenarias y bicatenarias, ARN monocatenario y bicatenario, y ARN que incluye regiones monocatenarias y bicatenarias, moléculas híbridas que comprenden ADN y ARN que pueden ser monocatenarias o, más típicamente, bicatenarias, o incluyen regiones monocatenarias y bicatenarias. Además, el término “polinucleótido”, como se usa aquí, se refiere a regiones de triple hebra que comprenden ARN o ADN, o tanto ARN como ADN. Las hebras en tales regiones pueden ser de la misma molécula o de moléculas diferentes. Las regiones pueden incluir la totalidad de una o más moléculas, pero más típicamente implican sólo una región de algunas de las moléculas. Una de las moléculas de una región de triple hélice es a menudo un oligonucleótido. El término “polinucleótido” incluye específicamente los ADN y ARN que contienen una o más bases modificadas. Por lo tanto, los ADN o ARN con cadenas principales modificadas para lograr estabilidad o por otras razones son “polinucleótidos”, como se entiende ese término aquí. Además, los ADN o ARN que comprenden bases inusuales, tales como inosina, o bases modificadas, tales como bases tritiadas, se incluyen dentro del término “polinucleótidos” como se define aquí. En general, el término “polinucleótido” abarca todas las formas modificadas química, enzimática y/o metabólicamente de polinucleótidos no modificados, así como las formas químicas de ADN y ARN características de virus y células, incluyendo células simples y complejas.

En esta descripción, los términos “oligonucleótido” se refieren a un polinucleótido relativamente corto, que incluye, sin limitación, desoxirribonucleótidos monocatenarios, ribonucleótidos monocatenarios o bicatenarios, ARN, híbridos de ADN, y ADN bicatenarios. Los oligonucleótidos, tales como sondas oligonucleotídicas de ADN monocatenario, a menudo se sintetizan mediante métodos químicos, por ejemplo usando sintetizadores de oligonucleótidos automatizados que están disponibles comercialmente. Sin embargo, los oligonucleótidos se pueden preparar mediante una variedad de otros métodos, incluyendo técnicas mediadas por ADN recombinante in vitro y mediante la expresión de los ADN en células y organismos.

En esta descripción, la expresión “marcador primario” se refiere a un marcador que puede detectarse directamente, tal como un fluoróforo.

En esta descripción, el “marcador secundario” se refiere a un marcador que se detecta indirectamente.

Brevemente, y como se describe con más detalle a continuación, se describen kits, composiciones y métodos para determinar la presencia y/o ausencia de uno o más patógenos en una muestra.

Patógeno

En algunos aspectos, los organismos que el método puede detectar incluyen, pero no se limitan a, especies, subespecies, serovares y/o cepas relevantes de, por ejemplo,Escherichia coli O157H7, Shigella Dysenteriae, Salmonella entéricassp. enterica (incluyendo los serovaresTyphi,Typhimurium y Saintpaul)Francisella tularensisssp. tularensis,Francisella tularensisssp.novicida, Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Shigella sonnei, Yersinia pestis, Listeria monocytogenesyYersinia pseudotuberculosis.

En algunos aspectos, la invención se refiere a métodos rápidos y precisos para detectar patógenos transmitidos por alimentos, incluyendo, sin limitación, especies, subespecies, serovares y/o cepas relevantes de, por ejemplo, parásitos y sus huevos,norovirus (virus similares a Norwalk), especies de Campylobacter, Giardia lamblia, Salmonella, Shigella, Cryptosporidium parvum, especies de Clostridium, Toxoplasma gondii, Staphylococcus aureus, Escherichia coli productora de la toxina Shiga (STEC), Yersinia enterocolitica, Bacillus cereus, Bacillus anthracis, Cyclospora cayetanensis, Listeria monocytogenes, Vibrio parahemolyticus y V. vulnificus, Helicobactor, Mycobacterium, Streptococcus, Pseudomonas, Aeromonas hydrophila; Citrobacter freundi, Enterobacter cloacae, Entero. faecalis, E. coli no VTEC, Hafnia alvei, Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeroginosa.

Los virus patógenos se pueden detectar en combinación con un método de detección de patógenos como se describe aquí. Los ejemplos de familias de virus patógenos incluyen, pero no se limitan a, Adenoviridae, Picornaviridae, Herpesviridae, Hepadnaviridae, Flaviviridae, Retroviridae, Orthomyxoviridae, Paramyxoviridae, Papovaviridae, Rhabdoviridae, y Togaviridae. El término “microorganismo”, como se usa en esta descripción, incluye un virus, bacteria, parásito o huevo de parásito. Patrick

Tiempo

La pluralidad de patógenos se detecta en un tiempo total positivo de alrededor de 28 horas o menos. En algunos aspectos, la descripción proporciona la detección de la pluralidad de patógenos dentro de un tiempo total positivo de alrededor de 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 13 horas, 14 horas, 15 horas, 16 horas, 17 horas, 18 horas, 19 horas, 20 horas, alrededor de 21 horas, alrededor de 22 horas, alrededor de 23 horas, alrededor de 24 horas, alrededor de 25 horas, alrededor de 26 horas, alrededor de 27 horas, o alrededor de 28 horas. En algunos aspectos, la descripción proporciona la detección de 2 a 10 patógenos. En algunas realizaciones, la descripción proporciona la detección de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 patógenos. En algunos aspectos, la descripción proporciona la detección simultánea de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 patógenos simultáneamente. En algunos aspectos, la descripción proporciona la detección simultánea de 20 o más patógenos.

Muestra

En algunas realizaciones, como apreciarán los expertos en la técnica, la muestra puede comprender cualquier número de elementos, incluyendo, pero sin limitarse a, fluidos corporales (incluidos, pero sin limitarse a, sangre, secreciones nasofaríngeas, orina, suero, linfa, saliva, leche, secreciones anales y vaginales, y semen) de prácticamente cualquier organismo, con muestras de mamíferos, incluido ganado (por ejemplo, ovejas, vacas, caballos, cerdos, cabras, llamas, emúes, avestruces o burros), aves de corral (por ejemplo, pollo, pavo, ganso, pato, o ave de caza), pescado (por ejemplo, salmón o esturión), animal de laboratorio (por ejemplo, conejo, cobaya, rata o ratón), animal de compañía (por ejemplo, perro o gato), o un animal salvaje en cautiverio o libre, muestras medioambientales (incluidas, pero sin limitarse a, muestras de aire, agrícolas, de agua y de suelo); muestras de agentes de guerra biológica; muestras de investigación; muestras purificadas, tales como ADN genómico, ARN, proteínas, etc. purificados; y muestras brutas (bacterias, virus, ADN genómico, etc.).

En algunas realizaciones, la muestra puede ser un alimento, que comprende carnes, aves, pescado, mariscos, frutas, y verduras. En algunas realizaciones, la descripción proporciona una muestra que comprende productos alimentarios crudos, productos alimentarios enfriados o congelados, o productos que generalmente se calientan antes del consumo. En algunas realizaciones, la muestra no es un producto alimentario. En algunas realizaciones, la muestra puede no ser un producto alimentario. En algunas realizaciones, los productos alimentarios están crudos. En algunas realizaciones, el producto alimentario podría cocinarse parcialmente. En algunas realizaciones, el producto alimentario podría cocinarse, pero puede requerir calentamiento adicional antes de su consumo. En algunas realizaciones, los productos alimentarios pueden incluir carnes (carne de res, cerdo, cordero, conejo y/o cabra), aves, caza silvestre (faisán, perdiz, jabalí y/o bisonte), pescado, verduras (empanadas de verduras, hamburguesas de verduras), combinaciones de verduras y carne, productos de huevo (quiches, natillas, tartas de queso) y/o productos horneados (rebozados, masas, pasteles, panes, muffins, bizcochos, magdalenas, tortitas, y similares, ya sean horneados, crudos o parcialmente horneados).

En algunas realizaciones, la muestra se puede obtener tomando un trozo o porción, o mediante el uso de un hisopo, toallita, filtro, frotis, o cualquier otro método adecuado, todo lo cual se fácilmente comprenderá e implementará y seleccionará fácilmente por los expertos en la técnica. En algunas realizaciones, una muestra es o comprende material alimentario, o es o comprende material vegetal o animal, o es o comprende carne, mariscos, pescado, verduras, frutas, ensaladas, comidas preparadas, huevos, productos lácteos, materiales alimentarios combinados y no combinados, productos alimentarios enlatados, o cualquier otra forma de alimentos frescos, crudos, cocidos, sin cocer, congelados, refrigerados, picados, cortados, enlatados, tratados térmicamente, secos, conservados, refinados o conservados de cualquier tipo. En algunas realizaciones, una muestra se puede tomar de un entorno, superficie, recipiente o ubicación en el que se desea determinar si un patógeno de interés está presente, por ejemplo, y sin limitación, superficies de cocina, superficies para cocinar, recipientes para almacenar alimentos, utensilios para comer, refrigeradores, congeladores, recipientes de exhibición, materiales para envolver, plantas y animales vivos, y cualquier otro ambiente, ubicación, superficie o material que pueda ser de interés para un usuario. En algunas realizaciones, la muestra puede ser disoluciones de lavado de muestras de alimentos, agua potable, agua de océano/río, agua ambiental, barro, o tierra. Los expertos en la técnica comprenderán e implementarán métodos adecuados para seleccionar, obtener y manipular cualquier muestra para uso en realizaciones. En realizaciones seleccionadas, las muestras pueden comprender carne, pescado, marisco, verduras, huevos o productos lácteos.

En algunas realizaciones, la muestra puede ser menor o igual a alrededor de 25 gramos en peso. En algunos aspectos, la muestra pesa alrededor de 1 gramo, alrededor de 2 gramos, alrededor de 3 gramos, alrededor de 4 gramos, alrededor de 5 gramos, alrededor de 6 gramos, alrededor de 7 gramos, alrededor de 8 gramos, alrededor de 9 gramos, alrededor de 10 gramos, alrededor de 11 gramos, alrededor de 12 gramos, alrededor de 13 gramos, alrededor de 14 gramos, alrededor de 15 gramos, alrededor de 16 gramos, alrededor de 17 gramos, alrededor de 18 gramos, alrededor de 19 gramos, alrededor de 20 gramos, alrededor de 21 gramos, alrededor de 22 gramos, alrededor de 23 gramos, alrededor de 24 gramos, o alrededor de 25 gramos. En algunas realizaciones, la muestra puede tener menos de 1 gramo.

En algunas realizaciones, la muestra puede ser mayor o igual a alrededor de 25 gramos en peso. En algunas realizaciones, la muestra pesa alrededor de 26 gramos, alrededor de 27 gramos, alrededor de 28 gramos, alrededor de 29 gramos, alrededor de 30 gramos, alrededor de 31 gramos, alrededor de 32 gramos, alrededor de 33 gramos, alrededor de 34 gramos, alrededor de 35 gramos, alrededor de 36 gramos, alrededor de 37 gramos, alrededor de 38 gramos, alrededor de 39 gramos, alrededor de 40 gramos, alrededor de 41 gramos, alrededor de 42 gramos, alrededor de 43 gramos, alrededor de 44 gramos, alrededor de 45 gramos, alrededor de 46 gramos, alrededor de 47 gramos, alrededor de 48 gramos, alrededor de 49 gramos, alrededor de 50 gramos, alrededor de 51 gramos, alrededor de 52 gramos, alrededor de 53 gramos, alrededor de 54 gramos, o alrededor de 55 gramos. En algunos aspectos, la muestra pesa más de 55 gramos.

Enriquecimiento

El método de la presente invención comprende enriquecer una muestra que comprende una pluralidad de patógenos en un medio rico y no selectivo para formar una muestra enriquecida. En algunas realizaciones, la muestra se suspende en un medio rico y no selectivo. En algunas realizaciones, la muestra se suspende en un caldo base de enriquecimiento para Listeria amortiguado (sin suplementos).

En algunos aspectos, el medio puede comprender uno o más de agua, agar, proteínas o péptidos, factores de crecimiento, aminoácidos, hidrolizado de caseína, sales, lípidos, hidratos de carbono, minerales, vitaminas, y amortiguadores de pH, y pueden contener extractos tales como extracto de carne, extracto de levadura, triptona, fitona, peptona, y extracto de malta, y puede comprender medio luria bertani (LB). En algunos aspectos, el medio puede contener extractos tales como extracto de carne, extracto de levadura, triptona, fitona, peptona, o extracto de malta. En algunos aspectos, el medio puede comprender medio luria bertani (LB). En algunos aspectos, el medio puede ser medios simples, complejos o definidos, y puede ser medios enriquecidos, y puede suplementarse de muchas maneras, todas las cuales serán fácilmente entendidas por los expertos en la técnica. En algunos aspectos, el medio puede comprender amortiguador de MOPS, una sal de hierro (III) tal como citrato férrico, una sal de magnesio tal como sulfato de magnesio, una sal de litio tal como cloruro de litio, y puede contener piruvato. En algunas realizaciones, el medio puede comprender o consistir en cualquier medio central como se define aquí.

En algunos aspectos, el medio puede contener un amortiguador de pH que puede ser un amortiguador quelante no de magnesio. En algunos aspectos, el amortiguador de pH es una mezcla de sal sódica de MOPS y ácido libre de MOPS, pero en realizaciones alternativas se puede usar una variedad de otros amortiguadores, tales como amortiguadores de carbonato y fosfato, y se seleccionarán fácilmente e implementarán por los expertos en la técnica, para lograr un pH deseado para el medio.

En algunos aspectos, el medio puede proporcionarse en forma de un polvo o concentrado, también denominado generalmente “medio en polvo”, “polvo del medio”, “concentrado del medio”, “medio concentrado”, o similar, que comprende una pluralidad de componentes y es adecuado para combinarse con un volumen predeterminado de agua para proporcionar un medio líquido con las concentraciones deseadas de los componentes particulares. Tal medio en polvo o medio concentrado puede ser completo, lo que significa que sólo es necesario disolverlo en agua adecuada, normalmente agua estéril, antes del uso. Alternativamente, en algunos aspectos, un medio en polvo o concentrado puede ser parcial, lo que significa que es necesario añadir componentes adicionales para proporcionar un medio completo adecuado para uso. En realizaciones, un medio en polvo o concentrado también incluye medio que está al menos parcialmente hidratado en forma concentrada, adecuado para dilución para producir el medio para uso real en cultivo. Se entenderá que el término “medio” o “medios”, como se usa aquí, a menos que el contexto requiera lo contrario, incluye tanto los medios finales que tienen componentes en concentraciones adecuadas para el cultivo de patógenos como los medios en polvo o concentrados adecuados para la dilución.

En algunos aspectos, los componentes incluidos en una disolución de enriquecimiento incluyen uno o más de MOPS, sal de Fe(III), sal de litio, y piruvato. En algunos aspectos, un suplemento de enriquecimiento selectivo comprende uno o más agentes selectivos, tales como ácido nalidíxico, cicloheximida, e hidrocloruro de acriflavina. En algunos aspectos, el caldo enriquecido contiene uno o más sulfato de magnesio, cloruro de litio, citrato férrico, piruvato de sodio, y suplemento de enriquecimiento.

En algunos aspectos, el medio puede comprender uno o más de caldo de infusión de cerebro y corazón, caldo de soja tríptico, agar Brucella, caldo base de enriquecimiento de Listeria amortiguado, caldo de consumo de hidratos de carbono, caldo base de Fraser, caldo base de enriquecimiento secundario de Fraser, agar base de Listeria HiCrome™, agar LPM, caldo de enriquecimiento de Listeria según FDA/IDF-FIL, medio de movilidad de Listeria, agar selectivo de Listeria, agar confirmatorio de Listeria mono (Base), agar diferencial de Listeria mono (Base), Agar Nutriente, Caldo Nutriente n.° 1, Caldo Nutriente n.° 2, Caldo Nutriente N° 4, Agar Oxford, agar selectivo para Listeria PALCAM, caldo de enriquecimiento selectivo para Listeria PALCAM, agar para recuento de placa, agar para recuento de placa, agar MUG para recuento de placa, agar leche desnatada para recuento de placa, caldo ramnosa, agar extracto de levadura de soja triptona, caldo de enriquecimiento selectivo para Listeria UVM, Pre-Enriquecimiento Universal, o una combinación de los mismos.

En algunos aspectos, el medio puede comprender uno o más de agua de peptona de Andrade, agua de peptona de Andrade, agar sangre (base), caldo púrpura de bromocresol, agar lactosa azul de China, agar urea de Christensen, agar CLED, caldo base de descarboxilasa, Moeller, caldo DEV Lactosa, caldo DEV lactosa peptona, caldo DEV triptófano, agar púrpura de bromocresol glucosa, agar HiCrome™ ECC, agar HiCrome™ MM, agar HiCrome™ UTI, modificado, agar Kligler, caldo lactosa, caldo lactosa, caldo lactosa, Vegitone, agar lisina hierro, caldo de malonato, caldo de rojo de metilo Voges Proskauer, caldo de disolución salina rojo de metilo Voges Proskauer, caldo de glutamato modificado con minerales (base), medio de ensayo de movilidad, caldo Mucate, agar MUG triptona de soja, caldo de nitrato, agar nutritivo de ensayo OF, agar citrato de Simmons, agar triple azúcar Hierro, medio de triptona, agua de triptona, agua de triptona, Vegitone, caldo urea medio selectivo para diferenciación, caldo BRILA MUG, agar DEV ENDO, agar ECD MUG, agar EMB, agar Endo, agar ENDO (Base), agar Gassner, agar HiCrome™ para coliformes, agar HiCrome™E. coliB, agar selectivo HiCrome™ ECC, agar HiCrome™ ECD con medio selectivo MUG para diferenciación, agar HiCrome™ Mac Conkey Sorbitol, agar HiCrome™ M-TEC, caldo rápido para coliformes HiCrome™, agar lactosa TTC con Tergitol®-7, agar Levine EMB, caldo LST-MUG, agar Mac Conkey n.° 1, agar Mac Conkey n.° 1, Vegitone, agar MacConkey con violeta cristal, cloruro de sodio y sales biliares al 0,15%, agar MacConkey con violeta cristal, cloruro de sodio y sales biliares al 0,15%, caldo MacConkey, caldo MacConkey morado, agar MacConkey MUG, agar MacConkey (sin sal), agar MacConkey-sorbitol, agar membrana lactosa glucurónido, agar m-Endo LES, agar m-FC, placas de agar m-FC (55 mm de diámetro), agar M-FC, Vegitone, caldo M-Lauril Sulfato, caldo MUG EC, agar TBX, agar Tergitol®-7, agar bilis rojo violeta, agar bilis rojo violeta, Vegitone, agar glucosa bilis rojo violeta, agar glucosa bilis rojo violeta sin lactosa, agar glucosa bilis rojo violeta sin lactosa, Vegitone, agar dextrosa lactosa bilis rojo violeta, agar MUG VRB, agar diferencial WL, agar x LT4 (base) medios selectivos, caldo A1, caldo lactosa bilis verde brillante, caldo EC, agar ECD, caldo lauril sulfato, caldo lauril sulfato, caldo M Endo, caldo M HD Endo con verde brillante, caldo M-lauril sulfato, Vegitone, caldo mejillón, o una combinación de los mismos.

En algunos aspectos, el medio comprende uno o más de agar sulfito de bismuto, agar BPL, agar verde brillante, modificado, agar lactosa sacarosa rojo fenol verde brillante, caldo púrpura, agar DCLS, agar DCLS n° 2, agar citrato desoxicolato, agar entérico Hektoen glucosa, agar Kligler Fluka, agar Leifson, caldo lisina descarboxilasa, caldo Muller-Kauffmann tetrationato, Base (ISO), agar manitol Pril®, caldo Rappaport Vassiliadis, caldo Rappaport Vassiliadis, modificado, medio Rappaport Vassiliadis, medio Rappaport Vassiliadis (base), modificado, semisólido, agarSalmonella,caldo de enriquecimiento deSalmonella,caldo de selenita (base), caldo de selenita cistina, medio SIM, agar SS, caldo TBG, caldo tetrationato, caldo de enriquecimiento de tetrationato, agar triple azúcar hierro, caldo de urea, agar XLD, o una combinación de los mismos.

En algunos aspectos, el medio puede comprender un eliminador de oxígeno. En algunos aspectos, el eliminador de oxígeno se puede seleccionar de al menos uno de una sal de piruvato, catalasa, una sal de tioglicolato, cisteína, oxirasa™, Na2S o FeS. En algunos aspectos, el medio puede comprender de alrededor de 1,0 a alrededor de 20,0 g/l de piruvato de sodio. En algunos aspectos, el medio comprende alrededor de 0,0, 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,11, 0,12, 0,13, 0,14, 0,15, 0,16, 0,17, 0,18, 0,19, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1.2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1,2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3.9, 4,0, 4,1,4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6.6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1,7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9.3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, 10,0, 10,1, 10,2, 10,3, 10,4, 10,5, 10,6, 10,7, 10,8, 10,9, 11,0, 11,1, 11,2, 11,3, 11,4, 11,5, 11,6, 11,7, 11,8, 11,9, 12,0, 12,1, 12,2, 12,3, 12,4, 12,5, 12,6, 12,7, 12,8, 12,9, 13,0, 13,5, 14,0, 14,5, 15,0, 15,5, 16.0, 16,5, 17,0, 17,5, 18,0, 18,5, 19,0, 19,520,0, 20,5, 21,0, 21,5, 22,0, 22,5, 23,0, 24,0, 25, o más de alrededor de 25,0 g/l de eliminador de oxígeno. En algunos aspectos, el medio comprende alrededor de 0,0, 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,11, 0,12, 0,13, 0,14, 0,15, 0,16, 0,17, 0,18, 0,19, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1.0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1,2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3.7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1,4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6.4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1,7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9.1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, 10,0, 10,1, 10,2, 10,3, 10,4, 10,5, 10,6, 10,7, 10,8, 10,9, 11,0, 11,1, 11,2, 11,3, 11.4, 11,5, 11,6, 11,7, 11,8, 11,9, 12,0, 12,1, 12,2, 12,3, 12,4, 12,5, 12,6, 12,7, 12,8, 12,9, 13,0, 13,5, 14,0, 14,5, 15,0, 15.5, 16,0, 16,5, 17,0, 17,5, 18,0, 18,5, 19,0, 19,520,0, 20,5, 21,0, 21,5, 22,0, 22,5, 23,0, 24,0, 25, o más de alrededor de 25,0 g/l de piruvato de sodio. En algunos aspectos, el medio puede comprender además hidratos de carbono, tales como dextrosa, esculina, maltosa, amigdalina, celobiosa, fructosa, manosa, salicina, dextrina, (x-metil-D-glucósido, y mezclas de los mismos. En algunos aspectos, el medio comprende alrededor de 0,0, 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,11, 0,12, 0,13, 0,14, 0,15, 0,16, 0,17, 0,18, 0,19, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1.2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1,2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3.9, 4,0, 4,1,4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6.6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1,7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9.3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, 10,0, 10,1, 10,2, 10,3, 10,4, 10,5, 10,6, 10,7, 10,8, 10,9, 11,0, 11,1, 11,2, 11,3, 11,4, 11.5, 11,6, 11,7, 11,8, 11,9, 12,0, 12,1, 12,2, 12,3, 12,4, 12,5, 12,6, 12,7, 12,8, 12,9, 13,0, 13,5, 14,0, 14,5, 15,0, 15,5, 16.0, 16,5, 17,0, 19,5 17,5, 18,0, 18,5, 19,0, 19,5, 20,0, 20,5, 21,0, 21,5, 22,0, 22,5, 23,0, 24,0, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o más de alrededor de 30,0 g/l de hidrato de carbono. En algunos aspectos, el medio puede comprender de alrededor de 1,0 a alrededor de 20,0 g/l de dextrosa. En algunos aspectos, el medio comprende alrededor de 0,0, 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,11, 0,12, 0,13, 0,14, 0,15, 0,16, 0,17, 0,18, 0,19, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1,2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3.4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1,4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1,6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8.8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, 10,0, 10,1, 10,2, 10,3, 10,4, 10,5, 10,6, 10,7, 10,8, 10,9, 11,0, 11.1, 11,2, 11,3, 11,4, 11,5, 11,6, 11,7, 11,8, 11,9, 12,0, 12,1, 12,2, 12,3, 12,4, 12,5, 12,6, 12,7, 12,8, 12,9, 13,0, 13,5, 14,0, 14,5, 15,0, 15,5, 16,0, 16,5, 17,0, 17,5, 18,0, 18,5, 19,0, 19,5 o más de alrededor de 20,0 g/l de dextrosa. En algunos aspectos, el medio puede comprender extracto de levadura. En algunos aspectos, el medio puede comprender de alrededor de 1,0 a alrededor de 30,0 g/l de extracto de levadura. En algunos aspectos, el medio comprende alrededor de 0,0, 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,11, 0,12, 0,13, 0,14, 0,15, 0,16, 0,17, 0,18, 0,19, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2.7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1,4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5.4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1,6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8.1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, 10,0, 10,1, 10,2, 10,3, 10,4, 10,5, 10.6, 10,7, 10,8, 10,9, 11,0, 11,1, 11,2, 11,3, 11,4, 11,5, 11,6, 11,7, 11,8, 11,9, 12,0, 12,1, 12,2, 12,3, 12,4, 12,5, 12,6, 12.7, 12,8, 12,9, 13,0, 13,5, 14,0, 14,5, 15,0, 15,5, 16,0, 16,5, 17,0, 19,517,5, 18,0, 18,5, 19,0, 19,5, 20,0, 20,5, 21,0,

21,5, 22,0, 22,5, 23,0, 24,0, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o más de alrededor de 30,0 g/l de extracto de levadura. En algunos aspectos, el medio puede comprender sales tales como sales de cloruro de sodio, potasio o calcio. En algunos aspectos, el medio comprende alrededor de 0,0, 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,11, 0,12,

0,13, 0,14, 0,15, 0,16, 0,17, 0,18, 0,19, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9,

2.0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1,4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6,

4.7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1,6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3,

7.4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1,8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, 10,0,

10.1, 10,2, 10,3, 10,4, 10,5, 10,6, 10,7, 10,8, 10,9, 11,0, 11,1, 11,2, 11,3, 11,4, 11,5, 11,6, 11,7, 11,8, 11,9, 12,0, 12,1,

12.2, 12,3, 12,4, 12,5, 12,6, 12,7, 12,8, 12,9, 13,0, 13,5, 14,0, 14,5, 15,0, 15,5, 16,0, 16,5, 17,0, 19,517,5, 18,0, 18,5,

19.0, 19,5, 20,0, 20,5, 21,0, 21,5, 22,0, 22,5, 23,0, 24,0, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o más de alrededor de 30,0 g/l de sales.

En algunos aspectos, el medio puede comprender de alrededor de 1,0 a alrededor de 30,0 g/l de cloruro de sodio. En algunos aspectos, el medio comprende alrededor de 0,0, 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,11,

0,12, 0,13, 0,14, 0,15, 0,16, 0,17, 0,18, 0,19, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7,

1.8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1,4,2, 4,3, 4,4,

4.5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1,6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1,

7.2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8,

9.9, 10,0, 10,1, 10,2, 10,3, 10,4, 10,5, 10,6, 10,7, 10,8, 10,9, 11,0, 11,1, 11,2, 11,3, 11,4, 11,5, 11,6, 11,7, 11,8, 11,9,

12.0, 12,1, 12,2, 12,3, 12,4, 12,5, 12,6, 12,7, 12,8, 12,9, 13,0, 13,5, 14,0, 14,5, 15,0, 15,5, 16,0, 16,5, 17,0, 19,5 17,5,

18.0, 18,5, 19,0, 19,5, 20,0, 20,5, 21,0, 21,5, 22,0, 22,5, 23,0, 24,0, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o más de alrededor de 30,0 g/l de cloruro de sodio. En algunos aspectos, el medio comprende además una proteína, que puede proporcionarse a partir de una variedad de fuentes. Por ejemplo, la proteína puede proporcionarse a partir de fuentes tales como triptona, triptosa, Soytone, peptona, pantona, bitona, proteosa peptona, digestión pancreática de gelatina, digestión pancreática de caseína, digestión enzimática de soja, y mezclas de los mismos. En algunos aspectos, el medio comprende de alrededor de 1,0 a alrededor de 70,0 g/l de proteína. En algunos aspectos, los medios comprenden alrededor de 0,0, 0,01,0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,11,0,12, 0,13, 0,14, 0,15, 0,16, 0,17, 0,18, 0,19, 0,2, 0,3, 0,4,

0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1,2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3, 3.2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5, 5.9, 6,0, 6,1,6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1,7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5,

8.6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, 10,0, 10,1, 10,2, 10,3, 10,4, 10,5, 10,6, 10,7, 10,8, 10,9,

11.0, 11,1, 11,2, 11,3, 11,4, 11,5, 11,6, 11,7, 11,8, 11,9, 12,0, 12,1, 12,2, 12,3, 12,4, 12,5, 12,6, 12,7, 12,8, 12,9, 13,0,

13.5, 14,0, 14,5, 15,0, 15,5, 16,0, 16,5, 17,0, 17,5, 18,0, 18,5, 19,0, 19,5 20,0, 20,5, 21,0, 21,5, 22,0, 22,5, 23,0, 24,0,

25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36,37, 38, 39, 40, 45, 50, 60, 70 o más de alrededor de 70,0 g/l de proteína.

En algunos aspectos, el medio comprende de alrededor de 1,0 a alrededor de 60,0 g/l de digestión pancreática de caseína. En algunos aspectos, el medio comprende alrededor de 0,0, 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08,

0,09, 0,1, 0,11, 0,12, 0,13, 0,14, 0,15, 0,16, 0,17, 0,18, 0,19, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4,

1.5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1,2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1,

4.2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1,6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8,

6.9, 7,0, 7,1,7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5,

9.6, 9,7, 9,8, 9,9, 10,0, 10,1, 10,2, 10,3, 10,4, 10,5, 10,6, 10,7, 10,8, 10,9, 11,0, 11,1, 11,2, 11,3, 11,4, 11,5, 11,6, 11,7,

11,8, 11,9, 12,0, 12,1, 12,2, 12,3, 12,4, 12,5, 12,6, 12,7, 12,8, 12,9, 13,0, 13,5, 14,0, 14,5, 15,0, 15,5, 16,0, 16,5, 17,0,

17,5, 18,0, 18,5, 19,0, 19,5 20,0, 20,5, 21,0, 21,5, 22,0, 22,5, 23,0, 24,0, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36,37, 38, 39, 40, 45, 50, 60 o más de alrededor de 60,0 g/l de digestión pancreática de caseína. En algunos aspectos, el medio comprende de alrededor de 1,0 a alrededor de 40,0 g/l de digestión enzimática de soja. En algunos aspectos, el medio comprende alrededor de 0,0, 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,11, 0,12, 0,13, 0,14,

0,15, 0,16, 0,17, 0,18, 0,19, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1,

2.2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1,4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8,

4.9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1,6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1 7.6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, 10,0, 10,1,

10.2, 10,3, 10,4, 10,5, 10,6, 10,7, 10,8, 10,9, 11,0, 11,1, 11,2, 11,3, 11,4, 11,5, 11,6, 11,7, 11,8, 11,9, 12,0, 12,1, 12,2,

12.3, 12,4, 12,5, 12,6, 12,7, 12,8, 12,9, 13,0, 13,5, 14,0, 14,5, 15,0, 15,5, 16,0, 16,5, 17,0, 17,5, 18,0, 18,5, 19 20.0, 20,5, 21,0, 21,5, 22,0, 22,5, 23,0, 24,0, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36,37, 38, 39, 40, o más de alrededor de 40,0 g/l de digestión enzimática de caseína. En algunos aspectos, puede comprender además amortiguadores que sean eficaces para mantener el pH en un intervalo deseado. Por ejemplo, los amortiguadores que pueden usarse incluyen amortiguadores tales como fosfato monobásico de potasio, fosfato dibásico de potasio, fosfato dibásico de sodio, y mezclas de los mismos. En algunos aspectos, el medio comprende de alrededor de 1,0 a alrededor de 50,0 g/l de amortiguador. En algunos aspectos, los medios comprenden alrededor de 0,0, 0,01, 0,02, 0,03, 0,04,

0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,11, 0,12, 0,13, 0,14, 0,15, 0,16, 0,17, 0,18, 0,19, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9,

1.0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1,2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6,

3.7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1,4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3,

6.4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1,7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0,

9.1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, 10,0, 10,1, 10,2, 10,3, 10,4, 10,5, 10,6, 10,7, 10,8, 10,9, 11,0, 11,1, 11,2, 11,3,

11.4, 11,5, 11,6, 11,7, 11,8, 11,9, 12,0, 12,1, 12,2, 12,3, 12,4, 12,5, 12,6, 12,7, 12,8, 12,9, 13,0, 13,5, 14,0, 14,5, 15,0,

15.5, 16,0, 16,5, 17,0, 17,5, 18,0, 18,5, 19,0, 19,5 20,0, 20,5, 21,0, 21,5, 22,0, 22,5, 23,0, 24,0, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36,37, 38, 39, 40, 45, 50, o más de alrededor de 50,0 g/l de amortiguadores. En algunos aspectos, el medio puede comprender de alrededor de 1 a alrededor de 20 g/l de fosfato potásico. En algunos aspectos, el medio comprende alrededor de 0,0, 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,11, 0,12, 0,13, 0,14, 0,15, 0,16,

0,17, 0,18, 0,19, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4,

2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1,4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1,

5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1,6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1,7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8,

7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, 10,0, 10,1, 10,2, 10,3,

10.4, 10,5, 10,6, 10,7, 10,8, 10,9, 11,0, 11,1, 11,2, 11,3, 11,4, 11,5, 11,6, 11,7, 11,8, 11,9, 12,0, 12,1, 12,2, 12,3, 12,4,

12.5, 12,6, 12,7, 12,8, 12,9, 13,0, 13,5, 14,0, 14,5, 15,0, 15,5, 16,0, 16,5, 17,0, 17,5, 18,0, 18,5, 19,0, 19,520,0 o más

de alrededor de 20,0 g/l de fosfato potásico. En algunos aspectos, el medio comprende de alrededor de 1 a alrededor de 40 g/l de fosfato disódico. En algunos aspectos, el medio comprende alrededor de 0,0, 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05,

0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,11, 0,12, 0,13, 0,14, 0,15, 0,16, 0,17, 0,18, 0,19, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0,

1.1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7,

3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1,6,2, 6,3, 6,4,

6.5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1,7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1,

9.2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, 10,0, 10,1, 10,2, 10,3, 10,4, 10,5, 10,6, 10,7, 10,8, 10,9, 11,0, 11,1, 11,2, 11,3, 11,4,

11.5, 11,6, 11,7, 11,8, 11,9, 12,0, 12,1, 12,2, 12,3, 12,4, 12,5, 12,6, 12,7, 12,8, 12,9, 13,0, 13,5, 14,0, 14,5, 15,0, 15,5,

16,0, 16,5, 17,0, 17,5, 18,0, 18,5, 19,0, 19,520,0, 20,5, 21,0, 21,5, 22,0, 22,5, 23,0, 24,0, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,

32, 33, 34, 35, 36,37, 38, 39, 40, o más de alrededor de 40,0 g/l de fosfato disódico. En algunos aspectos, el medio comprende de alrededor de 1 a alrededor de 20 g/l de fosfato dipotásico. En algunos aspectos, el medio comprende alrededor de 0,0, 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,11, 0,12, 0,13, 0,14, 0,15, 0,16, 0,17, 0,18,

0,19, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6,

2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3,

5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1,6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1,7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0,

8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, 10,0, 10,1, 10,2, 10,3, 10,4, 10.6, 10,7, 10,8, 10,9, 11,0, 11,1, 11,2, 11,3, 11,4, 11,5, 11,6, 11,7, 11,8, 11,9, 12,0, 12,1, 12,2, 12,3, 12,4, 12,5, 12,6,

12.7, 12,8, 12,9, 13,0, 13,5, 14,0, 14,5, 15,0, 15,5, 16,0, 16,5, 17,0, 17,5, 18,0, 18,5, 19,0, 19,520,0 o más de alrededor de 20.0 g/l de fosfato de dipotasio.

En algunos aspectos, el medio puede comprender iones esenciales tales como magnesio y/o hierro. En algunas realizaciones, el magnesio se puede seleccionar del grupo de sulfato de magnesio, cloruro de magnesio, y mezclas de los mismos. En algunas realizaciones, el hierro se puede seleccionar del grupo de citrato férrico y amónico, sulfato ferroso, sulfato férrico, citrato férrico, sulfato ferroso y amónico, cloruro férrico, y mezclas de los mismos.

En esta descripción, la expresión “sal de piruvato” significa e incluye todas las sales de ácido pirúvico (también conocido como ácido 2-oxo-propanoico) y cualesquiera compuestos que comprendan un anión piruvato, y cualesquiera isómeros biológicamente eficaces o formas sustituidas de los mismos. En realizaciones, la sal de piruvato

es piruvato de sodio o potasio. Los expertos en la técnica identificarán y evitarán fácilmente las sales que no son biológicamente eficaces o deseables, por ejemplo debido a su toxicidad. En realizaciones, una sal es soluble, y puede

ser orgánica o inorgánica, y, a modo de ejemplo, puede ser cloruro, fosfato, nitrato, hidrogenocarbonato, piruvato, etanoato.

En algunas realizaciones, el extracto de levadura puede ser autolisado de levadura o hidrolizado de levadura. Por ejemplo, el extracto de levadura puede incluir los compuestos solubles en agua del autolisado de levadura. En este sentido, la autólisis de las células de levadura puede controlarse cuidadosamente para preservar los complejos naturales de vitamina B. El extracto de levadura puede obtenerse cultivandoSaccharomycesspp. en medios vegetales

ricos en hidratos de carbono. La levadura puede recolectarse, lavarse y resuspenderse en el agua, y después autodigerirse con sus propias enzimas (“autólisis”) en el agua. Las actividades autolíticas de las enzimas pueden perderse por calentamiento. El extracto de levadura resultante se filtra hasta que se vuelve transparente, y el filtrado

se seca por pulverización hasta obtener forma de polvo. El extracto de levadura puede aportar vitaminas, nitrógeno, aminoácidos y carbono al medio. El extracto de levadura puede estar disponible comercialmente, por ejemplo de DIFCO™ Laboratories Inc. y ACUMEDIA™ Inc.

En algunas realizaciones, el medio puede comprender fuentes de carbono adecuadas. Entre las fuentes de carbono adecuadas se encuentran, por ejemplo, glucosa, fructosa, xilosa, sacarosa, maltosa, lactosa, manitol, sorbitol, glicerol, jarabe de maíz, y sólidos de jarabe de maíz. Ejemplos de fuentes de nitrógeno adecuadas incluyen sustancias que contienen nitrógeno orgánico e inorgánico, tales como peptona, licor de maceración de maíz, extracto de carne, extracto de levadura, caseína, urea, aminoácidos, sales de amonio, nitratos, digestiones enzimáticas de soja, y mezclas de los mismos.

Los expertos en la técnica comprenderán fácilmente que el crecimiento de un microorganismo deseado se promoverá

mejor a temperaturas seleccionadas, adecuadas para el microorganismo en cuestión. En realizaciones particulares, el cultivo se puede llevar a cabo a alrededor de 39°C, y los medios a usar se pueden precalentar a esta temperatura.

En realizaciones descritas aquí, el enriquecimiento se puede llevar a cabo a cualquier temperatura entre 33°C y 43°C, y se puede llevar a cabo a alrededor de 33°C, 34°C, 35°C, 36°C, 37°C, 38°C, o 39°C, o 40°C, o 41°C o 42°C o 43°C, o entre 33°C y 34°C, 34°C y 35°C, 35°C y 36°C, 36°C y 37°C, 37°C y 38°C, 38°C y 39°C, 39°C y 40°C, 40°C y 41°C,

41°C y 42°C, o 42°C y 43°C, o a una temperatura entre 34°C y 43°C, o entre 35°C y 42°C, o entre 36°C y 42°C, 38°C

y 42°C, o entre 39°C y 41°C, o entre 39°C y 40°C, o entre 38°C y 39°C, o entre 39°C y 40°C, o entre 40°C y 41°C, o entre 41°C y 42°C, o entre 42°C y 43°C.

En algunas realizaciones, los kits descritos aquí pueden comprender un medio descrito aquí. En algunas realizaciones, los kits descritos aquí pueden comprender Medio A o un derivado del mismo. En algunas realizaciones, los kits descritos aquí pueden comprender Medio B o un derivado del mismo. En algunas realizaciones, el Medio A comprende: extracto de levadura 6 g/l, digestión pancreática de caseína 17 g/l, digestión enzimática de soja 3 g/l, dextrosa 2,5 g/l, NaCl 5 g/l, fosfato dipotásico 2,5 g/l, fosfato potásico 1,35 g/L, fosfato disódico 9,6 g/l, piruvato de sodio 1,1 g/l. En algunas realizaciones, el Medio A puede tener un pH en el intervalo de 7,2-7,4. En algunas realizaciones, el medio B comprende: extracto de levadura 12 g/l, digestión pancreática de caseína 34 g/l, digestión enzimática de soja 6 g/l, dextrosa 5 g/l, NaCl 10 g/l, fosfato dipotásico 5 g/l, fosfato potásico 2,7 g/l, fosfato disódico 19,2 g/l, piruvato de sodio 2,2 g/l. En algunas realizaciones, el Medio B puede tener un pH en el intervalo de 7,2-7,4.

Suplemento

En algunas realizaciones, el medio comprende suplementos.

En algunas realizaciones, un suplemento comprende uno o más de una sal de magnesio, una sal de litio, una sal de hierro (III), un piruvato y un agente selectivo, o comprende precursores o formas modificadas que pueden convertirse o metabolizarse fácilmente para formar cualquier de lo anterior. En algunas realizaciones, un suplemento es un suplemento para promover el crecimiento de uno o más patógenos. En algunas realizaciones, un suplemento es un suplemento para promover el crecimiento de Listeria spp. En algunas realizaciones, los agentes selectivos incluyen antibióticos, sulfanamidas o antisépticos. En algunas realizaciones, un agente selectivo es o comprende uno, dos, o los tres de ácido nalidíxico, cicloheximida e hidrocloruro de acriflavina, o incluye equivalentes adecuados o alternativos a los mismos. En algunas realizaciones, la concentración de trabajo de cicloheximida es alrededor de 33,75 mg por litro de medio de cultivo, y en realizaciones alternativas está entre 15 y 50 mg/litro de medio de cultivo, o puede ser mayor que 5, 0, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 o más mg/litro de medio de cultivo. En algunas realizaciones, la concentración de trabajo de ácido nalidíxico es alrededor de 27 mg por litro de medio de cultivo, o está entre 10 y 50 mg/litro de medio de cultivo, o es mayor que 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 o más mg/litro de medio de cultivo. En algunas realizaciones, la concentración de trabajo de hidrocloruro de acriflavina es alrededor de 10, 25 mg/litro, o está entre 6000 y 15.000 mg/litro, o es mayor que 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 11000, 12000, 13000, 14000, 15000, 16000, 17000, 18000, 19000, 20000 o más mg/litro de medio de cultivo. Sin embargo, los expertos en la técnica reconocerán que se puede emplear una amplia variedad de concentraciones de agentes selectivos, y harán ajustes adecuados para fines particulares.

En algunas realizaciones, el medio está libre de suplementos.

En algunas realizaciones, el medio está sustancialmente libre de suplementos.

pH

En algunos aspectos, el pH del medio de cultivo generalmente se establece entre 7 y 8, y, por ejemplo, en realizaciones particulares puede ser alrededor de 7,0, 7,1,7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9 u 8,0, o está en un intervalo delimitado por dos cualesquiera de los valores anteriores. Se entenderá que un pH fuera del intervalo de pH 7-8 todavía puede ser utilizable en realizaciones, pero que la eficiencia y selectividad del cultivo pueden verse afectadas negativamente. Por lo tanto, en algunas realizaciones, el pH puede ser 1-7 u 8-14.

Volumen

En algunas realizaciones, la muestra puede enriquecerse mediante suspensión en medio a un volumen en el intervalo de alrededor de 10 ml a alrededor de 1000 ml. En algunas realizaciones, la muestra puede enriquecerse mediante suspensión en medios en un volumen de alrededor de 10 ml, 20 ml, 30 ml, 40 ml, 50 ml, 60 ml, 70 ml, 80 ml, 90 ml, 100 ml, 110 ml, 120 ml, 130 ml, 140 ml, 150 ml, 160 ml, 170 ml, 180 ml, 190 ml, 200 ml, 210 ml, 220 ml, 225 ml, 230 ml, 240 ml, 250 ml, 300 ml, 350 ml, 400 ml, 450 ml, 500 ml, 550 ml, 600 ml, 650 ml, 700 ml, 800 ml, 900 ml, o alrededor de 1000 ml, en algunas realizaciones un volumen mayor que 50 ml, en algunas realizaciones el volumen es alrededor de 225 ± 10 ml, en algunas realizaciones alrededor de 225 ml.

Homogeneización

En algunas realizaciones, la muestra puede homogeneizarse o dividirse finamente de otro modo para separar el patógeno de la muestra mediante técnicas conocidas por un experto en la técnica. Por ejemplo, revolver, mezclar, agitar, amasar, o someter a vórtice. En algunas realizaciones, las muestras se pueden homogeneizar mezclando, digiriendo, o mezclando manualmente. En algunas realizaciones, la muestra se digiere. Se puede usar un dispositivo de digestión que mezcla una fuente y diluyentes en una bolsa mediante el uso de dos paletas en una acción de tipo amasado. Véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 3.819.158. Un dispositivo oscilante conocido como PULSIFIER® se describe en la patente de EE. UU. n.° 6.273.600, que emplea una bolsa colocada dentro de un anillo metálico agitador. En la patente de EE. UU. n.° 6.273.600 se ha descrito otra técnica, la agitación vorticial, para la suspensión de analitos.

En algunas realizaciones, la muestra se puede homogeneizar durante alrededor de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 225, 230, 240, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 800, 900, o 1000 segundos; en algunas realizaciones, por encima de 15 segundos; en algunas realizaciones, 30 ± 5 segundos; en algunas realizaciones, alrededor de 30 segundos.

Después de la homogeneización, en algunas realizaciones, la muestra se puede incubar. Por ejemplo, la incubación después de la homogeneización puede ocurrir a una temperatura de alrededor de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 65, 70, 75, 80°C, o a cualquier otra temperatura por encima de 80°C. En algunas realizaciones, la temperatura de incubación está en el intervalo de alrededor de 25 a alrededor de 80°C, en algunas realizaciones de alrededor de 25 a alrededor de 45°C, en algunas realizaciones la temperatura es alrededor de 37 ± 5°C. En algunas realizaciones, la incubación después de la homogeneización puede ser durante un período de tiempo en el intervalo de alrededor de 1 minuto a alrededor de 48 horas, por ejemplo 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000 minutos, en algunas realizaciones 60 minutos. En algunas realizaciones, la muestra se incuba después de la homogeneización mientras se agita. En algunas realizaciones, la muestra se incuba después de la homogeneización y se agita a una velocidad en el intervalo de 20 a 3500 rpm, por ejemplo 20, 50, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 700, 1000, 1100, 1200, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1750, 2000, 2250, 2500, 2750, 3000, 3250, 3500 rpm. En algunas realizaciones, la muestra se puede incubar después de la homogeneización mientras está sustancialmente libre de agitación. En algunas realizaciones, la muestra se puede incubar después de la homogeneización sin agitación.

Lisis

La lisis celular es un proceso de liberación de materiales en una célula mediante la alteración de la membrana celular, y en particular, un proceso de extracción de materiales intracelulares de una célula para aislar ADN o ARN antes de la amplificación, tal como una reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En algunas realizaciones, la lisis celular se puede llevar a cabo para aislar ADN o ARN antes de la amplificación, tal como una reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

En algunos aspectos, la lisis puede realizarse mediante métodos mecánicos que incluyen ultrasonidos, disrupción usando un homogeneizador, mecanismo de presión, por ejemplo una prensa francesa, etc., descompresión, pulverización, etc. Los métodos de lisis no mecánicos incluyen métodos químicos, métodos térmicos, métodos enzimáticos, etc.

En algunos aspectos, el ácido nucleico de la muestra se puede aislar usando técnicas conocidas. Por ejemplo, la muestra puede tratarse para lisar las células, usando amortiguadores de lisis conocidos, ultrasonidos, electroporación, etc., produciéndose la purificación según sea necesario, como apreciarán los expertos en la técnica. Además, las reacciones descritas aquí pueden llevarse a cabo de diversas maneras, como apreciarán los expertos en la técnica. Los componentes de la reacción de lisis se pueden añadir simultánea o secuencialmente, en cualquier orden, describiéndose algunas realizaciones a continuación. En algunos aspectos, la reacción de lisis puede incluir una variedad de otros reactivos que pueden incluirse en ensayos que se realizarán después de la lisis celular. En algunos aspectos, estos reactivos incluyen sales, amortiguadores, proteínas neutras, por ejemplo albúmina, detergentes, etc., que pueden usarse para facilitar la hibridación y detección óptimas y/o reducir las interacciones no específicas o de fondo. En algunos aspectos, se pueden usar reactivos que de otro modo mejoran la eficiencia de un ensayo, tales como inhibidores de proteasas, inhibidores de nucleasas, agentes antimicrobianos, etc., dependiendo de los métodos de preparación de la muestra y la pureza de la diana.

En algunos aspectos, la lisis puede realizarse mediante un amortiguador de lisis. En algunos aspectos, el amortiguador de lisis tiene un pH que es aproximadamente neutro. En algunos aspectos, el amortiguador de lisis tiene un pH en el intervalo de 5,5 a 8, es decir, un pH de 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, u 8, en algunos aspectos un pH de alrededor de 7. Se entenderá que un pH fuera del intervalo de pH 7-8 todavía puede ser utilizable en las realizaciones. Por lo tanto, en algunos aspectos, el pH puede ser alrededor de 1-7 o alrededor de 8-14.

La recuperación de ADN y/o ARN usando un amortiguador de lisis puede proceder combinando la muestra del amortiguador de lisis, agitando la mezcla de las células y el amortiguador de lisis para proporcionar una mezcla que incluye un sobrenadante que incluye ADN y/o ARN a recuperar y una fracción de sólidos, y recuperando el sobrenadante que contiene ADN.

En algunos aspectos, una porción de la muestra se puede combinar con el amortiguador de lisis y forma una mezcla de muestra/amortiguador de lisis. En algunos aspectos, la formación de la mezcla de muestra/amortiguador de lisis incluye la dilución del amortiguador de lisis con un medio acuoso (por ejemplo, agua desionizada). En algunos aspectos, un medio acuoso se combina con el amortiguador de lisis en una relación volumétrica (medio acuoso:amortiguador de lisis) de alrededor de 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:10, 1:20, 20:1, 10:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, o alrededor de 2:1 para dilución. Después de combinar la muestra y el amortiguador de lisis, la mezcla se trata para provocar la ruptura de las paredes celulares de la muestra y la liberación de ADN y/o ARN. En algunos aspectos, este tratamiento incluye la agitación de la mezcla de muestra/amortiguador de lisis, que generalmente incluye colocar muestras de la mezcla en un recipiente adecuado (por ejemplo, una placa de múltiples pocillos, un bloque de pocillos profundos), y agitar las muestras.

En algunos aspectos, la agitación para la ruptura de las paredes celulares y la liberación de ADN y/o ARN incluye poner en contacto la muestra con materia en partículas, para facilitar la ruptura de las paredes celulares. En algunos aspectos, este contacto generalmente incluye colocar materia en partículas adecuada en cada pocillo de la placa de múltiples pocillos/bloque de pocillos profundos, de modo que la materia en partículas y la muestra entren mutuamente en contacto abrasivo durante la agitación (por ejemplo, agitación) de la mezcla de muestra/amortiguador de lisis. La materia en partículas es generalmente esférica, y está hecha de un material adecuado (por ejemplo, acero inoxidable). En algunos aspectos, la materia en partículas puede no ser esférica.

En algunos aspectos, después de un período adecuado de agitación de la mezcla de muestra/amortiguador de lisis, la mezcla resultante generalmente comprende una mezcla de muestra lisada que incluye una fracción de sólidos y un sobrenadante que comprende ácido nucleico a recuperar. En algunos aspectos, la muestra lisada puede tratarse con el fin de separar la fracción sólida y el sobrenadante. En algunos aspectos, este tratamiento generalmente comprende centrifugar las muestras (es decir, la placa de múltiples pocillos, el bloque de pocillos profundos) en condiciones adecuadas. Normalmente, las muestras se someten a tratamiento mediante centrifugación a entre alrededor de 1000 y alrededor de 3500 revoluciones por minuto (rpm) durante alrededor de 5 a alrededor de 10 minutos.

En algunos aspectos, antes de la agitación de la mezcla de muestra/amortiguador de lisis, la mezcla puede someterse a un período de incubación. En algunos aspectos, el período de incubación transcurre durante al menos alrededor de 5 minutos, al menos alrededor de 10 minutos, o al menos alrededor de 15 minutos. En algunos aspectos, durante el período de incubación, la mezcla de muestra/lisis puede someterse a temperaturas de temperatura ambiente, o incluso superiores. En algunos aspectos, la mezcla de muestra/lisis se puede someter a temperaturas de hasta alrededor de 25°C, hasta alrededor de 35°C, o hasta alrededor de 45°C, o hasta alrededor de 55°C, o hasta alrededor de 65°C, o hasta alrededor de 75°C. La combinación precisa de condiciones de incubación de tiempo/temperatura no es estrictamente crítica; sin embargo, en diversas realizaciones, la incubación transcurre durante hasta alrededor de 15 minutos mientras la mezcla de muestra/amortiguador de lisis se somete a una temperatura de alrededor de 20°C a alrededor de 30°C (por ejemplo, alrededor de 25°C).

En algunos aspectos, la separación de la mezcla de muestra lisada (por ejemplo, mediante centrifugación) forma una mezcla de muestra lisada que incluye un sobrenadante de ácido nucleico que luego se recupera de la mezcla de muestra lisada. En algunos aspectos, el ácido nucleico se somete después a análisis mediante cualquier método conocido en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, los que se enumeran a continuación. En algunos aspectos, el contenido de ADN de la mezcla de muestra lisada y/o del sobrenadante de ácido nucleico es al menos alrededor de 50%, al menos alrededor de 60%, al menos alrededor de 70%, al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 90%, al menos alrededor de 95%, o al menos alrededor de 99% del ADN presente en la muestra antes de lisar la muestra.

En algunos aspectos, el amortiguador de lisis comprende un componente amortiguador. En algunos aspectos, el amortiguador de lisis puede comprender componentes amortiguadores que pueden usarse, por ejemplo, para ajustar el pH del amortiguador de lisis. En algunos aspectos, los componentes amortiguadores incluyen, por ejemplo, ácido 3-{[tris(hidroximetil)metil]amino}propanosulfónico (TAPS), N,N-bis(2-hidroxietil)glicina (Bicina), tris(hidroximetil)metilamina (TRIS), N-tris(hidroximetil)-metilglixina (Tricina), ácido 4-2-hidroxietil-lpiperazinaetanosulfónico (HEPES), ácido 2-{[tris(hidroximetil)metil]amino}etanosulfónico (TES), ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico (MOPS), ácido piperazin-N,N'-bis(2-etanosulfónico) (PIPES), ácido dimetilarsínico (cacodilato), citrato de sodio salino (SSC), ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES), y combinaciones de los mismos. En algunos aspectos, el amortiguador de lisis puede comprender componentes amortiguadores presentes en una concentración en el intervalo de alrededor de 0,01 a alrededor de 300 mM. En algunos aspectos, los componentes amortiguadores pueden estar presentes en alrededor de 0,01 mM, 0,05 mM, 0,1 mM, 0,5 mM, 1,0 mM, 5,0 mM, 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM, 110 mM, 120 mM, 130 mM, 140 mM, 150 mM, 160 mM, 170 mM, 180 mM, 190 mM, o 200 mM, 250 mM, o alrededor de 300 mM. En algunos aspectos, los componentes amortiguadores pueden estar presentes en una concentración por encima de alrededor de 20 mM. En algunos aspectos, la concentración está por encima de 20 mM, en algunos aspectos, la concentración es alrededor de 80 ± 10 mM, en algunos aspectos, la concentración es alrededor de 80 mM. En algunos aspectos, el amortiguador de lisis está sustancialmente libre de un componente amortiguador.

En algunos aspectos, el amortiguador de lisis puede comprender agentes quelantes. En algunos aspectos, los agentes quelantes incluyen, por ejemplo, acetilacetona, etilendiamina, dietilentriamina, iminodiacetato, trietilentetramina, triaminotrietilamina, nitrilotriacetato, etilendiaminotriacetato, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido etilenglicol tetraacético (EGTA), ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA), ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7,10-tetraacético (DOTA), y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el amortiguador de lisis contiene uno o más agentes quelantes, por ejemplo uno o más de los agentes quelantes anteriores. En algunos aspectos, el amortiguador de lisis puede contener uno o más agentes quelantes en una concentración en el intervalo de alrededor de 0,5 a alrededor de 100 mM, en algunos aspectos, de alrededor de 5 a alrededor de 10 mM, tal como en una concentración de alrededor de 1, 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, o 100 mM. En algunos aspectos, el amortiguador de lisis está sustancialmente libre de un agente quelante de metales.

En algunos aspectos, el amortiguador de lisis puede comprender un tensioactivo. En algunos aspectos, los tensioactivos incluyen, por ejemplo, sales de alquilsulfato, tales como dodecilsulfato de sodio (SDS) o laurilsulfato de amonio, tensioactivos no iónicos, tales como Triton X-100, octilglucósido, Genapol X-100, o polisorbatos, por ejemplo Tween 20 o Tween 80, y sarcosilo (N-lauroil-sarcosina), y combinaciones de los mismos. En algunos aspectos, el tensioactivo también puede incluir nonilfenoxipolioxiletanol (NP-40). En algunos aspectos, el amortiguador de lisis puede contener uno o más agentes quelantes, por ejemplo uno o más de los tensioactivos anteriores. En algunos aspectos, el amortiguador de lisis puede contener uno o más tensioactivos en una concentración en el intervalo de alrededor de 0,2% a alrededor de 20% (p/v), en algunos aspectos, alrededor de 0,5% a 10% (p/v), tales como alrededor de 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 4,8, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, o alrededor de 10% (p/v). En algunos aspectos, el amortiguador de lisis está sustancialmente libre de tensioactivos.

En algunos aspectos, el amortiguador de lisis puede comprender un precipitante. En algunos aspectos, los precipitantes incluyen, por ejemplo, glicerol, dimetilsulfóxido (DMSO), acetonitrilo (ACN), seroalbúmina bovina (BSA), proteinasa K, sales de acetato, y combinaciones de los mismos. En algunos aspectos, el amortiguador de lisis puede comprender proteinasa K. En algunos aspectos, el amortiguador de lisis puede contener uno o más precipitantes en una concentración en el intervalo de alrededor de 2% a alrededor de 50% (p/v), en algunos aspectos, alrededor de 15% a alrededor de 35% (p/v), tal como alrededor de 2, 5, 10, 15, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 48, 50, 55, o alrededor de 60% (p/v). En algunos aspectos, el amortiguador de lisis está sustancialmente libre de precipitantes.

En algunos aspectos, el amortiguador de lisis puede comprender un resto lisante. En algunos aspectos, el amortiguador de lisis comprende al menos dos restos lisante. En algunos aspectos, el resto lisante es una perla. En algunos aspectos, las perlas pueden presentar cualquier forma, por ejemplo las perlas pueden tener forma de bola, cubo, triangular, o pueden presentar cualquier forma irregular. En algunos aspectos, las perlas están hechas de un material sólido inerte. En algunos aspectos, las perlas presentan una consistencia firme, y no reaccionan químicamente con sustancias biológicas tales como proteínas o ácidos nucleicos en un grado significativo. En algunos aspectos, las perlas no se unen a ácidos nucleicos en una medida significativa. En algunos aspectos, las perlas están hechas de vidrio, cerámica, plástico, o metal tal como acero. En algunos aspectos, las superficies de las perlas pueden obtenerse con una variedad de tipos de perlas, que incluyen, pero no se limitan a, perlas hechas con sílice (por ejemplo, fabricadas como cuarzo fundido, cristal, sílice pirolizada o sílice pirógena, sílice coloidal, gel de sílice, aerogel, vidrio, fibra (por ejemplo, fibra óptica), cemento y cerámica (por ejemplo, loza, gres, y porcelana), circonio, sílice de circonio, itrio de circonio, y todos los demás óxidos de vidrio y mezclas de vidrios y óxidos relacionados. En algunos aspectos, el término “perlas” no se refiere a perlas usadas para el aislamiento de ácidos nucleicos. En algunos aspectos, el término “perlas”, como se describe aquí, están presentes en la mezcla de reacción de lisis en una concentración en el intervalo de alrededor de 0,50 a alrededor de 1,5 g/ml, en algunos aspectos, en el intervalo de alrededor de 0,100 a alrededor de 0,900 g/ml, en algunos aspectos, en el intervalo de alrededor de 0,150 a alrededor de 0,950 g/ml, en algunos aspectos, en el intervalo de alrededor de 0,250 a alrededor de 0,950 g/ml. En algunas realizaciones, las perlas pueden estar presentes en la mezcla de amortiguador de lisis en una concentración de alrededor de 0,50, 0,100, 0,150, 0,200, 0,250, 0,300, 0,350, 0,400, 0,450, 0,500, 0,600, 0,700, 0,800, 0,850, 0,88, 0,900, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, o alrededor de 1,5 g/ml, en algunos aspectos, en una concentración de alrededor de 0,8 ± 0,1 g/ml, en algunos aspectos, en una concentración de alrededor de 0,88 ± 0,05 g/ml.

En algunos aspectos, el resto lisante puede ser una enzima lisante. En algunos aspectos, el resto lisante puede ser p-glucuronidasa, mutanolisina, lisozima, acromopeptidasa, lisostafina, labiasa, combinaciones de las mismas y/u otras enzimas líticas conocidas por un experto en la técnica. En algún aspecto, el resto lisante puede ser lisozima. En algunos aspectos, la lisozima como se describe aquí está presente en el amortiguador de lisis en una concentración en el intervalo de alrededor de 5 a alrededor de 150 mg/ml, en algunos aspectos, en el intervalo de alrededor de 15 a alrededor de 25 mg/ml, en algunos aspectos, en el intervalo de alrededor de 18 a alrededor de 25 mg/ml, en algunos aspectos, en el intervalo de alrededor de 20 a alrededor de 25 mg/ml. En algunos aspectos, la lisozima puede estar presente en el amortiguador de lisis en una concentración de alrededor de 5, 10, 15, 20, 0,25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 85, 90, 100, 110, 120, 130, 140, o alrededor de 150 mg/ml, en algunos aspectos, en una concentración de alrededor de 20 ± 3 mg/ml, en algunos aspectos, en una concentración de alrededor de 20 ± 0,05 mg/ml.

En algunos aspectos, el amortiguador de lisis comprende además una sal mineral seleccionada del grupo que consiste en cloruro de sodio (NaCl), cloruro de potasio (KCl), sulfato de diamonio (NH4SO4), y combinaciones de las mismas.

En algunos aspectos, el amortiguador de lisis puede comprender además cloruro de sodio (NaCl). En algunos aspectos, el amortiguador de lisis puede comprender además cloruro de potasio (KCl). En algunos aspectos, el amortiguador de lisis puede comprender además sulfato de diamonio (NH4SO4).

En algunos aspectos, el amortiguador de lisis puede comprender además un hidróxido de metal alcalino, seleccionado del grupo que consiste en hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, y combinaciones de los mismos. En algunos aspectos, el amortiguador de lisis puede comprender además hidróxido de sodio. En algunos aspectos, el amortiguador de lisis puede comprender además hidróxido de potasio.

El método de la presente invención comprende realizar una primera lisis de la muestra y una segunda lisis de la muestra en la muestra enriquecida o una porción de la misma. En algunos aspectos, la primera lisis de la muestra puede comprender combinar la muestra y la composición de amortiguador de lisis, formando así una mezcla de muestra/amortiguador de lisis, agitar la mezcla de muestra/amortiguador de lisis, lisando así la muestra y formando una mezcla de muestra lisada. En algunos aspectos, una segunda lisis de la muestra que comprende continuar agitando la mezcla de muestra lisada se lleva a cabo a una temperatura mayor que la temperatura de la primera lisis de la muestra. En algunos aspectos, la primera lisis de la muestra se puede realizar a una primera temperatura, por ejemplo la mezcla de muestra/amortiguador de lisis se calienta desde la temperatura ambiente hasta alrededor de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 65, 70, 75, 80°C, o a cualquier otra temperatura por encima de alrededor de 80°C. En algunos aspectos, la primera temperatura está en el intervalo de alrededor de 25 a alrededor de 80°C, en algunos aspectos, de alrededor de 40 a alrededor de 70°C, en algunos aspectos, la primera temperatura es alrededor de 65 ± 5°C. En algunos aspectos, se puede llevar a cabo la segunda lisis de la muestra, en la que la mezcla de muestra/amortiguador de lisis/mezcla de muestra lisada se calienta hasta una segunda temperatura. La segunda temperatura es más alta que la primera temperatura. En algunos aspectos, la segunda temperatura está en el intervalo de alrededor de 50 a alrededor de 120°C, en algunos aspectos, de alrededor de 60 a alrededor de 100°C, en algunos aspectos, de alrededor de 80 a alrededor de 100°C. En algunos aspectos, la segunda temperatura puede ser alrededor de 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, o alrededor de 100°C, en algunos aspectos, alrededor de 95 ± 5°C. En algunos aspectos, la diferencia entre la primera temperatura y la segunda temperatura puede ser alrededor de 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, o 100°C. En algunos aspectos, la diferencia entre la primera temperatura y la segunda temperatura puede estar en el intervalo de alrededor de 1-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-25, 25 30, 30-35, 35-40, 40-45, 45-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, o 90-100°C. En algunos aspectos, después de la segunda lisis de la muestra, la temperatura se reduce hasta alrededor de la temperatura ambiente.

En algunos aspectos, la primera lisis de la muestra puede ocurrir durante un período de tiempo en el intervalo de alrededor de 1 minuto a alrededor de 1 hora, por ejemplo alrededor de 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, o alrededor de 60 minutos, en algunos aspectos, alrededor de 15 minutos. En algunos aspectos, la segunda lisis de la muestra puede ocurrir durante un período de tiempo en el intervalo de alrededor de 1 minuto a alrededor de 1 hora, por ejemplo alrededor de 1,5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, o alrededor de 60 minutos, en algunos aspectos, alrededor de 10 minutos. En algunos aspectos, la primera lisis de la muestra y la segunda lisis de la muestra se agitan a una velocidad en el intervalo de alrededor de 1000 a alrededor de 3500 rpm, por ejemplo alrededor de 1000, 1100, 1200, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1750, 2000, 2250, 2500, 2750, 3000, 3250, o alrededor de 3500 rpm, en algunos aspectos, a una velocidad de alrededor de 1350 ± 100 rpm.

Transcripción inversa

En algunas realizaciones, el ácido nucleico recuperado después de la lisis de la muestra puede ser ADN o ARN.

En algunas realizaciones, el ácido nucleico se prepara a partir de ARN mediante transcripción inversa. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos se preparan a partir de ADN mediante extensión con cebador, tal como usando una polimerasa.

En algunas realizaciones, los métodos descritos aquí se pueden usar en PCR con transcripción inversa acoplada (PCR con transcripción inversa). En algunas realizaciones, la transcripción inversa y la PCR se pueden llevar a cabo en dos etapas distintas. En algunas realizaciones, una copia de ADNc del ARNm de la muestra se puede sintetizar usando un cebador polinucleotídico dT, un cebador específico de secuencia, un cebador universal, o cualquier cebador descrito aquí.

En algunas realizaciones, la transcripción inversa y la PCR se pueden llevar a cabo en una reacción de un único recipiente cerrado. Por ejemplo, se pueden emplear tres cebadores, uno para la transcripción inversa y dos para la PCR. En algunas realizaciones, el cebador para la transcripción inversa puede unirse al ARNm en 3' con respecto a la posición del amplicón de PCR. En algunas realizaciones, el cebador de transcripción inversa puede incluir restos de ARN o análogos modificados tales como bases de 2'-O-metil ARN, que no formarán un sustrato para la ARNasa H cuando se hibriden con el ARNm.

La temperatura para llevar a cabo la reacción de transcripción inversa depende de la transcriptasa inversa que se use. En algunas realizaciones, se usa una transcriptasa inversa termoestable, y la reacción de transcripción inversa se lleva a cabo de alrededor de 37°C a alrededor de 75°C, de alrededor de 37°C a alrededor de 50°C, de alrededor de 37°C a alrededor de 55°C, de alrededor de 37°C a alrededor de 60°C, de alrededor de 55°C a alrededor de 75°C, de alrededor de 55°C a alrededor de 60°C, a alrededor de 37°C, o a alrededor de 60°C. En algunas realizaciones, se usa una transcriptasa inversa que transfiere 3 o más nucleótidos terminales que no son molde a un extremo del producto transcrito.

En algunas realizaciones, una reacción de transcripción inversa y la reacción de PCR descritas aquí se pueden llevar a cabo en diversos formatos conocidos en la técnica, tales como en tubos, placas de microtitulación, dispositivos de microfluidos, o gotitas.

En algunas realizaciones, una reacción de transcripción inversa se puede llevar a cabo en volúmenes que oscilan de alrededor de 5 |jl a 500 jl, o en volúmenes de reacción de 10 |jl a alrededor de 20 jl. En las gotitas, los volúmenes de reacción pueden oscilar de alrededor de 1 pl a 100 nl, o 10 pl a alrededor de 1 nl. En algunas realizaciones, la reacción de transcripción inversa se lleva a cabo en una gotita que tiene un volumen de alrededor de 1 nl o menos.

En algunas realizaciones, los polinucleótidos diana, tales como el ARN, se pueden transcribir de forma inversa en ADNc usando uno o más cebadores de transcripción inversa. En algunas realizaciones, uno o más cebadores de transcripción inversa pueden comprender una región complementaria a una región del ARN. En algunas realizaciones, los cebadores de transcripción inversa pueden comprender un primer cebador de transcripción inversa con una región complementaria a una región de un primer ARN, y un segundo cebador de transcripción inversa con una región complementaria a una región de un segundo ARN. En algunas realizaciones, los cebadores de transcripción inversa pueden comprender un primer cebador de transcripción inversa con una región complementaria a una región de un primer ARN, y uno o más cebadores de transcripción inversa con una región complementaria a una región de uno o más ARN, respectivamente.

En algunas realizaciones, los cebadores de transcripción inversa pueden comprender además una región que no es complementaria a una región del ARN. En algunas realizaciones, la región que no es complementaria a una región del ARN está en 5' con respecto a una región de los cebadores que es complementaria al ARN. En algunas realizaciones, la región que no es complementaria a una región del ARN está en 3' con respecto a una región de los cebadores que es complementaria al ARN. En algunas realizaciones, la región que no es complementaria a una región del ARN es una región sobresaliente en 5'. En algunas realizaciones, la región que no es complementaria a una región del ARN comprende un sitio de cebado para la amplificación y/o una reacción de secuenciación. Usando uno o más cebadores descritos aquí, las moléculas de ARN se transcriben de forma inversa usando reactivos adecuados conocidos en la técnica.

En algunas realizaciones, los cebadores directos/inversos en la pluralidad de cebadores directos/inversos pueden comprender además una región que no es complementaria a una región del ARN. En algunas realizaciones, la región que no es complementaria a una región del ARN está en 5' con respecto a una región de los cebadores directos/inversos que es complementaria al ARN. En algunas realizaciones, la región que no es complementaria a una región del ARN está en 3' con respecto a una región de los cebadores directos/inversos que es complementaria al ARN. En algunas realizaciones, la región que no es complementaria a una región del ARN es una región sobresaliente en 5'. En algunas realizaciones, la región que no es complementaria a una región del ARN comprende un sitio de cebado para la amplificación y/o una segunda reacción de secuenciación. En algunas realizaciones, la región que no es complementaria a una región del ARN comprende un sitio de cebado para la amplificación y/o una tercera reacción de secuenciación. En algunas realizaciones, la región que no es complementaria a una región del ARN comprende un sitio de cebado para una segunda y una tercera reacción de secuenciación. En algunas realizaciones, la secuencia del sitio de cebado para la segunda y tercera reacción de secuenciación es la misma. En algunas realizaciones, usando el uno o más cebadores directos/inversos y un cebador inverso como se describe aquí, las moléculas de ADNc se amplifican usando reactivos adecuados conocidos en la técnica.

Amplificación

En algunos aspectos, el ácido nucleico recuperado después de la lisis celular de la muestra enriquecida que contiene la pluralidad de patógenos comprende fragmentos del mismo, que pueden amplificarse. En algunos aspectos, la longitud promedio del ARNm, o fragmentos del mismo, puede ser menor que alrededor de 100, 200, 300, 400, 500, o alrededor de 800 pares de bases, o menor que alrededor de 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, o 200 nucleótidos, o menor que alrededor de 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, alrededor de 100 kilobases. En algunos aspectos, se amplifica una secuencia diana a partir de un molde relativamente corto, tal como una muestra que contiene un molde que tiene alrededor de 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, o alrededor de 100 bases.

En algunos aspectos, una reacción de amplificación puede comprender uno o más aditivos. En algunos aspectos, uno o más aditivos son dimetilsulfóxido (DMSO), glicerol, (mono)hidrato de betaína (N,N,N-trimetilglicina = [carboximetil]trimetilamonio), trehalosa, 7-desaza-2'-desoxiguanosina trifosfato (dC7GTP o 7-desaza-2'-dGTP), BSA (seroalbúmina bovina), formamida (metanamida), cloruro de tetrametilamonio (TMAC), otros derivados de tetraalquilamonio (por ejemplo, cloruro de tetraetiamonio (TEA-Cl) y cloruro de tetrapropilamonio (TPrA-Cl), detergente no iónico (por ejemplo, Triton X-100, Tween 20, Nonidet P-40 (NP-40)), o PREXCEL-Q. En algunos aspectos, una reacción de amplificación puede comprender 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 aditivos diferentes. En algunos aspectos, una reacción de amplificación puede comprender 10 o más aditivos diferentes.

En algunas realizaciones, las reacciones de termociclado se pueden realizar en muestras contenidas en volúmenes de reacción.

En algunos aspectos, el ácido nucleico recuperado después de la lisis celular de la muestra enriquecida que contiene la pluralidad de patógenos puede comprender ADNc, ADN, o fragmentos de los mismos, que pueden amplificarse. En algunos aspectos, la longitud promedio del ADN, ADNc, o fragmentos de los mismos, puede ser menor que alrededor de 100, 200, 300, 400, 500, o alrededor de 800 pares de bases, o menor que alrededor de 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, o alrededor de 200 nucleótidos, o menor que alrededor de 1,2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, o alrededor de 100 kilobases. En algunos casos, se amplifica una secuencia diana a partir de un molde relativamente corto, tal como una muestra que contiene un molde que tiene alrededor de 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, o alrededor de 100 bases.

En algunos aspectos, se puede usar cualquier ADN polimerasa que catalice la extensión del cebador, incluyendo, pero sin limitarse a, ADN polimerasa deE. coli,fragmento Klenow de ADN polimerasa 1 deE. coli,ADN polimerasa T7, ADN polimerasa T4, Taq polimerasa, Pfu ADN polimerasa, Vent ADN polimerasa, bacteriófago 29, REDTaq™, ADN genómico polimerasa, o sequenasa. En algunos aspectos, se usa una ADN polimerasa termoestable. En algunos aspectos, también se puede llevar a cabo una PCR de inicio en caliente en la que la reacción se calienta hasta alrededor de 95°C durante dos minutos antes de la adición de la polimerasa, o la polimerasa se puede mantener inactiva hasta la primera etapa de calentamiento en el ciclo 1. En algunos aspectos, se puede usar la PCR de inicio en caliente para minimizar la amplificación no específica. En algunos aspectos, se puede usar cualquier número de ciclos de PCR para amplificar el ADN, por ejemplo alrededor de, más de alrededor de, o menos de alrededor de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 100 ciclos. El número de ciclos de amplificación puede ser alrededor de 1-45, 10-45, 20-45, 30-45, 35-45, 10-40, 10-30, 10-25, 10-20, 10-15, 20-35, 25-35, 30-35, o alrededor de 35-40.

El método de la presente invención comprende realizar una PCR multiplex con un conjunto de cebadores de amplificación en el lisado bruto. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se usa y describe ampliamente, e implica el uso de la extensión del cebador combinada con ciclos térmicos para amplificar una secuencia diana; véanse las patentes de EE. UU. núms. 4.683.195 y 4.683.202, y PCR Essential Data, J. W. Wiley & sons, Ed. C. R. Newton, 1995.

Los ejemplos de técnicas de PCR incluyen, pero no se limitan a, PCR cuantitativa, PCR fluorescente cuantitativa (QF-PCR), PCR multiplex, PCR fluorescente multiplex (MF-PCR), PCR en tiempo real (PCR con transcripción inversa), PCR de una sola célula, PCR con polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (PCR-RFLP), PCR-RFLP/PCR con transcripción inversa-RFLP, PCR de inicio en caliente, PCR anidada, PCR multiplex anidada, PCR de polonias in situ, amplificación de círculo rodante in situ (RCA), PCR digital (dPCR), PCR digital en gotitas (ddPCR), PCR de puente, PCR con picotitulación, y PCR en emulsión. Otros métodos de amplificación incluyen la reacción en cadena de la ligasa (LCR), la amplificación de la transcripción, la PCR con sonda de inversión molecular (MIP), la replicación de secuencia autosostenida, la amplificación selectiva de secuencias de polinucleótidos diana, la reacción en cadena de la polimerasa cebada con secuencias consenso (CP-PCR), la reacción en cadena de la polimerasa cebada arbitrariamente (AP-PCR), PCR cebada con polinucleótidos degenerados (DOP-PCR), y la amplificación de secuencias basada en ácidos nucleicos (NABSA). Otros métodos de amplificación incluyen los descritos en las patentes de EE. UU. núms. 5.242.794; 5.494.810; 4.988.617; y 6.582.938, así como incluyen la amplificación de ARN mediada por Q beta replicasa.

En algunos aspectos, los ejemplos de PCR que se pueden usar en la invención incluyen, pero no se limitan a, “PCR competitiva cuantitativa” o “QC-PCR”, “inmuno-PCR”, “Alu-PCR”, “polimorfismo de conformación de cadena sencilla con PCR” o “PCR-SSCP”, “PCR con transcriptasa inversa” o “RT-PCR”, “PCR con captura de biotina”, “vectorette PCR”, “PCR angosta” y “sustracción de ADNc con PCR-Select”, “PCR específica de alelo”, entre otros. En algunos aspectos, la técnica de amplificación es la amplificación de la señal. Véase en general Sylvanen et al., Genomics 8:684-692 (1990); las patentes de EE. UU. núms. 5.846.710 y 5.888.819; Pastinen et al., Genomics Res. 7(6):606-614 (1997). Véanse en general las patentes de EE.UU. núms. 5.185.243, 5.679.524 y 5.573.907; EP 0320308 B1; EP 0 336731 B1; EP 0439 182 B1; WO 90/01069; WO 89/12696; WO 97/31256; y WO 89/09835.

En algunos aspectos, los ejemplos de PCR que se pueden usar en la invención incluyen, pero no se limitan a, amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos (NASBA), amplificación por desplazamiento de cadena (SDA), amplificación por desplazamiento múltiple (MDA), amplificación basada en Q-beta replicasa, y amplificación isotérmica mediada por bucle.

En algunos aspectos, el método de amplificación puede ser específico para un determinado ácido nucleico, tal como un gen específico o un fragmento del mismo, o puede ser universal, de modo que todo o un tipo específico de un ácido nucleico, tal como ARNm, se amplifique universalmente. En algún aspecto, el experto puede diseñar cebadores oligonucleotídicos que se hibridan específicamente con el ácido nucleico de interés, y utilizar estos cebadores en un experimento de PCR.

En algunos aspectos, el método de amplificación puede usar una mezcla maestra. En algunos aspectos, la mezcla maestra puede ser una disolución premezclada, lista para uso, que puede contener ADN polimerasa, los dNTP, MgCb y amortiguadores de reacción en concentraciones óptimas para la amplificación eficaz de moldes de ADN. En algunos aspectos, la mezcla maestra puede contener ADN polimerasa. En algunos aspectos, la ADN polimerasa puede ser una taq ADN polimerasa. En algunos aspectos, la Taq ADN polimerasa puede modificarse. En algunos aspectos, la ADN polimerasa puede no mostrar actividad enzimática a temperatura ambiente. En algunos aspectos, la ADN polimerasa puede no formar productos mal cebados y/o dímeros de cebador antes de la primera etapa de desnaturalización. En algunos aspectos, la ADN polimerasa puede activarse durante la primera etapa de desnaturalización. En algunos aspectos, la ADN polimerasa puede activarse después de alrededor de 1 segundo a alrededor de 15 minutos durante la primera etapa de desnaturalización. En algunos aspectos, la ADN polimerasa puede activarse después de alrededor de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 300, 350, 400, 500, 600, 700, 800, o alrededor de 900 segundos. En algunos aspectos, la ADN polimerasa puede tener actividad de polimerasa 5'-3'. En algunos aspectos, la ADN polimerasa puede tener actividad de endonucleasa 5'-3'. En algunos aspectos, la ADN polimerasa puede tener actividad de exonucleasa 3'-5'. En algunos aspectos, la ADN polimerasa puede no tener actividad de exonucleasa 3'-5'. En algunos aspectos, la ADN polimerasa puede tener actividad de polimerasa 5'-3' y actividad de endonucleasa 5'-3', pero ninguna actividad de exonucleasa 3'-5'. En algunos aspectos, la ADN polimerasa puede tener una tasa de error de aproximadamente 1 error por 2,2 x 105 nucleótidos incorporados. En algunos aspectos, la ADN polimerasa puede tener una tasa de error en el intervalo de alrededor de 1 error por 2,2 x 102 a alrededor de 1 error por 2,2 x 1015 nucleótidos incorporados.

En algunos aspectos, la mezcla maestra puede contener uno o más colorantes. En algunos aspectos, el uno o más colorantes pueden ser fluorescentes. En algunos aspectos, el uno o más colorantes pueden ser un colorante de referencia. En algunos aspectos, el colorante de referencia puede ser un colorante de referencia pasivo. En algunos aspectos, el colorante de referencia puede ser un colorante de referencia ROX. En algunos aspectos, la mezcla maestra puede contener MgCh. En algunos aspectos, es posible que la mezcla maestra no contenga MgCh. En algunos aspectos, la mezcla maestra puede contener los dNTP. En algunos aspectos, la mezcla maestra puede contener estabilizadores. En algunos aspectos, la mezcla maestra puede estar libre de ADNasa y/o ARNasa contaminantes. En algunos aspectos, la mezcla maestra se puede añadir en una concentración final en un intervalo de alrededor de 0,1 mM a alrededor de 50 mM. En algunas realizaciones, la mezcla maestra se puede añadir en una concentración de alrededor de 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 1005, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, o alrededor de 50 mM. En algunos aspectos, la mezcla maestra se puede añadir en una concentración final mayor que alrededor de 50 mM. En algunos aspectos, la mezcla maestra se puede añadir en una concentración final menor que alrededor de 0,1 mM.

Detección

El acto de analizar una muestra para detectar un patógeno o un cambio en el nivel de un patógeno es una “detección”, incluso si se determina que el microorganismo no está presente o está por debajo del nivel de sensibilidad. La detección puede ser una observación cuantitativa, semicuantitativa, o no cuantitativa, y puede basarse en una comparación con una o más muestras de control. La detección se puede aplicar a cualquier muestra en la que se deba evaluar la presencia o ausencia del patógeno. En algunos aspectos, y sin limitación, la etapa de detectar un patógeno puede comprender el uso de métodos de PCR, PCR en tiempo real, lectinas, difusión simple, difusión lateral, detección inmunológica, flujo lateral, o flujo continuo, para detectar la presencia del patógeno en un cultivo. A modo de ilustración y sin limitación, en realizaciones particulares, los posibles métodos de detección incluyen o usan la materia objeto descrita en cualquiera de los documentos US6483303; US 6597176; US6607922; US6927570; y US7323139.

En algunos aspectos, los patógenos pueden detectarse individualmente. En algunos aspectos, múltiples patógenos se pueden detectar simultáneamente. En algunos aspectos, la detección de patógenos puede realizarse mediante un ensayo de detección, tal como PCR multiplex, ELISA multiplex, micromatriz de ADN, micromatriz de proteínas, o ensayos basados en perlas, tal como un ensayo Luminex. En algunos aspectos, los ensayos luminex pueden usar microesferas.

El método de la presente invención comprende detectar la presencia de una pluralidad de patógenos. En algunos aspectos, la pluralidad de patógenos puede estar viva. En algunos aspectos, la pluralidad de patógenos puede estar muerta. En algunos aspectos, la pluralidad de patógenos puede estar viva y/o muerta. En algunos aspectos, se pueden detectar patógenos vivos para evitar muchos resultados de falsos positivos.

En algunos aspectos, en el contexto de la presente invención se encuentra cualquier método que permita la detección y/o identificación de un ácido nucleico o un polipéptido específico, en el que el término “detección” también comprende la determinación cuantitativa de un ácido nucleico. En algunos aspectos, la detección y/o identificación puede basarse en una amplificación específica, por ejemplo mediante la amplificación de un fragmento de ADN específico usando cebadores oligonucleotídicos específicos para dicho fragmento de ADN en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En algunos aspectos, la detección y/o identificación pueden basarse en inmunoensayos.

En algunos aspectos, la detección puede ser una observación cuantitativa, semicuantitativa, o no cuantitativa, y puede basarse en una comparación con una o más muestras de control. En algunas realizaciones y sin limitación, la etapa de detectar un microorganismo comprende usar PCR, PCR en tiempo real, lectinas, PCR multiplex, métodos de PCR descritos aquí, difusión simple, difusión lateral, detección inmunológica, flujo lateral, o métodos de flujo continuo, para detectar la presencia del microorganismo en un cultivo. A modo de ilustración y sin limitación, en realizaciones particulares, los posibles métodos de detección incluyen o usan la materia objeto descrita en cualquiera de los documentos US6483303; US 6597176; US6607922; US6927570; y US7323139.

El experto conoce bien cómo diseñar cebadores oligonucleotídicos que se hibridan específicamente con el ácido nucleico de interés. En algunos aspectos, la detección y/o identificación también se pueden lograr sin amplificación, por ejemplo mediante secuenciación del ácido nucleico que se va a analizar o mediante hibridación específica de secuencia, por ejemplo en el contexto de un experimento de micromatriz. Las técnicas de secuenciación y el análisis basado en micromatrices son procedimientos bien conocidos en el campo. En algunos aspectos, la detección después de la PCR se puede llevar a cabo, por ejemplo, mediante electroforesis, método de sonda fluorescente, método de electroforesis capilar, o método de PCR cuantitativa.

En algunos aspectos, la detección descrita aquí comprende una capacidad de detección que satisface y/o supera los requisitos normativos. En algunos aspectos, la invención descrita aquí puede detectar al menos 0,5 unidades formadoras de colonias (UFC) en un cultivo nocturno estándar. En algunos aspectos, un cultivo nocturno estándar puede consistir en 25 g de alimento 225 ml de medio. En algunos aspectos, la invención descrita aquí puede tener un umbral de sensibilidad de detección de al menos alrededor de 0,05 UFC/25 g. En algunos aspectos, la invención descrita aquí puede tener un umbral de sensibilidad de detección de al menos alrededor de 0,005 UFC/25 g. En algunos aspectos, la invención descrita aquí puede tener un umbral de sensibilidad de detección de al menos alrededor de 0,0005, 0,005, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,48, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 12, 1,5, 2, 2,5, 3, o al menos 5 UFC/25 g. En algunos aspectos, la invención descrita aquí puede tener un umbral de sensibilidad de detección de menos de alrededor de 0,05 UFC/25 g. En algunos aspectos, la invención descrita aquí puede tener un umbral de sensibilidad de detección de menos de alrededor de 0,005 UFC/25 g.

Secuenciación

En el método de la invención se puede usar cualquier técnica de alto rendimiento para secuenciar ácidos nucleicos. En algunos aspectos, las técnicas de secuenciación de ADN incluyen reacciones de secuenciación didesoxi (método Sanger) usando terminadores o cebadores marcados y separación en gel en placa o capilar, secuenciación por síntesis usando nucleótidos marcados terminados reversiblemente, pirosecuenciación, secuenciación 454, hibridación específica de alelos con una biblioteca de sondas oligonucleotídicas marcadas, secuenciación por síntesis usando hibridación específica de alelos con una biblioteca de clones marcados seguida de ligación, monitorización en tiempo real de la incorporación de nucleótidos marcados durante una etapa de polimerización, secuenciación de polonias, y secuenciación SOLiD. La secuenciación de las moléculas separadas se ha demostrado más recientemente mediante reacciones de extensión secuenciales o únicas usando polimerasas o ligasas, así como mediante hibridaciones diferenciales únicas o secuenciales con bibliotecas de sondas.

Detección

Como se describe aquí, en algunas realizaciones, los kits y el método descritos aquí utilizan la detección de secuencias diana mediante la detección de amplicones. En algunas realizaciones, se puede llevar a cabo la detección directa o indirecta del amplicón. En algunas realizaciones, la detección directa implica la incorporación de un marcador en el amplicón mediante, por ejemplo, un cebador marcado. En algunas realizaciones, la detección indirecta implica la incorporación de un marcador en, por ejemplo, una sonda de hibridación. En algunas realizaciones, para la detección directa, la o las etiquetas pueden incorporarse en al menos cuatro maneras: (1) los cebadores comprenden el o los marcadores, por ejemplo unidos a la base, una ribosa, un fosfato, o a estructuras análogas en un análogo de ácido nucleico; (2) nucleósidos modificados que se modifican en la base o en la ribosa (o a estructuras análogas en un análogo de ácido nucleico) con el o los marcadores; estos nucleósidos modificados con marcadores se convierten entonces a la forma trifosfato y se incorporan a la cadena recién sintetizada mediante una polimerasa; (3) se usan nucleótidos modificados que comprenden un grupo funcional que puede usarse para añadir un marcador detectable; o (4) se usan cebadores modificados que comprenden un grupo funcional que puede usarse para añadir un marcador detectable. En algunas realizaciones, cualquiera de estos métodos da como resultado una hebra recién sintetizada que comprende marcadores que pueden detectarse directamente.

En algunas realizaciones, para la detección indirecta, el marcador se puede incorporar en una sonda de hibridación usando métodos bien conocidos por un experto en la técnica. En algunas realizaciones, el marcador se puede incorporar uniendo el marcador a una base, ribosa, fosfato, o a estructuras análogas en un análogo de ácido nucleico, o sintetizando la sonda de hibridación usando un nucleósido modificado. En algunas realizaciones, una cadena modificada del amplicón, o la sonda de hibridación, puede incluir un marcador de detección. Por “marcador de detección” o “marcador detectable” se entiende aquí un resto que permite la detección. Puede ser un marcador primario o un marcador secundario.

En algunas realizaciones, el marcador de detección es un marcador primario. En general, los marcadores se dividen en tres clases: a) marcadores isotópicos, que pueden ser isótopos radiactivos o pesados; b) marcadores magnéticos, eléctricos, térmicos; y c) tintes coloreados o luminiscentes. En algunas realizaciones, los marcadores también pueden incluir enzimas (peroxidasa de rábano picante, etc.) y partículas magnéticas. En algunas realizaciones, los marcadores incluyen cromóforos o fósforos, pero en algunas realizaciones son colorantes fluorescentes. En algunas realizaciones, los colorantes adecuados para uso en la invención incluyen, pero no se limitan a, complejos de lantánidos fluorescentes, incluyendo los de europio y terbio, fluoresceína, rodamina, tetrametilrodamina, eosina, eritrosina, cumarina, metilcumarinas, pireno, verde malaquita, estilbeno, amarillo lucifer, Cascade Blue™, rojo Texas, coloranets Alexa, ficoeritrina, bodipy, y otros descritos en la 6th Edition of the Molecular Probes Handbook por Richard P. Haugland.

En algunas realizaciones, se usa un marcador detectable secundario, por ejemplo un marcador secundario puede unirse o reaccionar con un marcador primario para la detección, o puede permitir la separación del compuesto que comprende el marcador secundario de materiales no marcados, etc. En algunas realizaciones, los marcadores secundarios pueden incluir, pero no se limitan a, uno de un par de parejas de unión; restos químicamente modificables; inhibidores de nucleasa, etc. En algunas realizaciones, el marcador secundario puede comprender un par de parejas de unión, por ejemplo el marcador puede ser un hapteno o antígeno, que se unirá a su pareja de unión. En algunas realizaciones, la pareja de unión se puede unir a un soporte sólido para permitir la separación de cebadores extendidos y no extendidos; por ejemplo, los pares de parejas de unión adecuados incluyen, pero no se limitan a: antígenos (tales como proteínas (incluyendo péptidos)) y anticuerpos (incluyendo fragmentos de los mismos (FAb, etc.)); proteínas y moléculas pequeñas, incluyendo biotina/estreptavidina; enzimas y sustratos o inhibidores; otros pares de interacción proteína-proteína; ligandos de receptores; e hidratos de carbono y sus parejas de unión. En algunas realizaciones, también son útiles los pares de proteínas de unión de ácido nucleico-ácido nucleico. En algunas realizaciones, el par de parejas de unión comprende biotina o imino-biotina y estreptavidina. Se prefiere particularmente imino-biotina, ya que la imino-biotina se disocia de la estreptavidina en un amortiguador de pH 4,0, mientras que la biotina requiere desnaturalizantes fuertes (por ejemplo, guanidinio HCl 6 M, pH 1,5, o formamida al 90% a 95°C). En alguna realización, el par de parejas de unión comprende un marcador de detección primario y un anticuerpo, que se unirá específicamente al marcador de detección primario.

Sondas

En algunos aspectos, la detección se puede llevar a cabo en una mezcla de PCR mediante el uso de sondas marcadas fluorescentemente, correspondiendo cada una a una secuencia de ADN única, que cuando se amplifica mediante una ADN polimerasa, emite una señal de fluorescencia en su longitud de onda espectral especificada. En algunos aspectos, la discriminación de frecuencia espectral entre diferentes fluoróforos, o informadores, unidos a cada secuencia de sonda permite la detección de secuencias de amplicones, una para cada color fluorescente que puede identificarse.

En algunos aspectos, en el método de detección de la presente invención, es indispensable un procedimiento que comprende las etapas de mezclar el ADN y/o ARN extraído anteriormente y uno o más cebadores específicos de los patógenos diana a detectar, para llevar a cabo una PCR multiplex. En algunos aspectos, los cebadores usados son específicos para los patógenos diana que se van a detectar y/o un control interno. En algunos aspectos, los cebadores tienen una temperatura de fusión similar que no produce mutuamente un dímero del cebador, o en la que sus bandas de identificación no interfieren ni se solapan entre sí. En algunos aspectos, los conjuntos de cebadores incluyen, por ejemplo, un conjunto de cebadores específicos para el gen patógeno de invasión deSalmonellaA (InvA), SEQ ID NOS 9 y 10; gen deListeria monocytogenesListeriolisina O (HlyA), SEQ ID NOS 1 y 2; y genes deEscherichia coliproductora de la toxina Shiga toxina Shiga 1 (stxl), SEQ iD NOS 5 y 6; toxina Shiga 2 (stx2), SEQ ID NOS 7 y 8; que codifica intimina (eaeA), SEQ ID NOS 2 y 3; y un control interno, SEQ ID NOS 16 y 17 pueden ejemplificarse respectivamente, y estos pueden usarse en combinaciones.

En algunos aspectos, la amplificación se lleva a cabo con la adición de sondas marcadas y/o no marcadas. En algunos aspectos, las sondas oligonucleotídicas incluyen, por ejemplo, sondas oligonucleotídicas específicas para el gen patógeno de invasión deSalmonellaA (InvA), SEQ ID NOS 15; gen deListeria monocytogenesListeriolisina O (HlyA), SEQ ID NOS 11; y genes deEscherichia coliproductora de la toxina Shiga toxina Shiga 1 (stx1), SEQ ID<n>O<s>13; toxina Shiga 2 (stx2), SEQ ID NOS 14; que codifica intimina (eaeA), SEQ ID NOS 12; y un control interno, SEQ ID NO 18, pueden ejemplificarse respectivamente, y estos se pueden usar en combinaciones.

En algunos aspectos, la amplificación se lleva a cabo con la adición de sondas y secuencias de cebadores. Por ejemplo, en cuanto al conjunto de cebadores y sonda específicos para el gen patógeno de invasión deSalmonellaA (InvA), se pueden ejemplificar respectivamente el cebador SEQ ID NOS 9 y 10, la sonda SEQ ID NOS 15; para el gen deListeria monocytogenesListeriolisina O (HlyA), el cebador SEQ ID NOS 1 y 2, la sonda SEQ ID NOS 11; y para los genes deEscherichia coliproductora de la toxina Shiga toxina Shiga 1 (stx1), el cebador SEQ ID NOS 5 y 6, la sonda SEQ ID NOS 13; toxina shiga 2 (stx2), el cebador SEQ ID NOS 7 y 8, la sonda SEQ ID NOS 14; que codifica intimina (eaeA), el cebador SEQ ID NOS 2 y 3, la sonda SEQ ID NOS 12; y un control interno, SEQ ID NO 18, y estos se pueden usar en combinaciones.

En algunas realizaciones, la cantidad de cebador por reacción puede ser al menos alrededor de 0,001 nmol. En algunas realizaciones, la cantidad de cebador por reacción puede ser al menos alrededor de 0,001, 0,01, 0,1, 0,3, 1, 3, 4, 10, 30, 40, 60, 100, 250, 300, 350, 400, 500, 750, 1000, 1500, 2500, o al menos alrededor de 5000 nmol.

En algunas realizaciones, la cantidad de sonda por reacción puede ser al menos alrededor de 0,001 nmol. En algunas realizaciones, la cantidad de sonda por reacción puede ser al menos alrededor de 0,001 0,1, 0,3, 1, 3, 4, 10, 30, 40, 60, 100, 250, 300, 350, 400, 500, 750, 1000, 1500, 2500, o al menos alrededor de 5000 nmol.

En algunas realizaciones, la cantidad de control interno puede ser al menos 25 copias del gen de referencia de control interno por reacción. En algunas realizaciones, la cantidad de control interno puede ser al menos alrededor de 25, 500, 1000, 2000, 3000, 5000, 10000, 15000, 20000, 25000, 30000, 35000, 40000, 50000, 80000, 100000, 150000, o al menos alrededor de 200.000, o al menos alrededor de 300.000 copias del gen de referencia de control interno por reacción.

En algunos aspectos, las sondas oligonucleotídicas son sondas TaqMan. Las sondas TaqMan son sondas de hidrólisis diseñadas para aumentar la especificidad de los ensayos de PCR. Una sonda TaqMan estándar comprende un fluoróforo unido covalentemente al extremo 5' de una sonda oligonucleotídica, y un extintor en el extremo 3'. En algunos aspectos, durante la amplificación por PCR, los cebadores y las sondas etiquetadas fluorescentemente se hibridan con el molde de ADN, y a medida que la polimerasa extiende las secuencias del cebador, el marcador fluorescente se escinde de la hebra de la sonda, aumentando así su distancia del extintor y permitiendo que el fluoróforo emita fluorescencia con mayor intensidad.

En algunos aspectos, hay disponibles varios fluoróforos diferentes (por ejemplo, 6-carboxifluoresceína, acrónimo:FAM,o tetraclorofluoresceína, acrónimo: TET, o 6-carboxi-4',5'-dicloro-2',7'-dimetoxifluoresceína, acrónimo: JOE) y extintores (por ejemplo, tetrametilrodamina, acrónimo: TAMRA o Black Hole Quencher™ 1 (BHQ1 acrónimo: BHQ1). En la técnica se describen varios pares de fluoróforo-extintor. Véanse, por ejemplo Pesce et al, editors, Fluorescence Spectroscopy, Marcel Dekker, Nueva York, (1971); White et al, Fluorescence Analysis: A Practical Approach, Marcel Dekker, Nueva York, (1970); y similares. La bibliografía también incluye referencias que proporcionan listas exhaustivas de moléculas fluorescentes y no fluorescentes y sus propiedades ópticas relevantes, por ejemplo, Berlman, Handbook of Fluorescence Sprectra of Aromatic Molecules, 2a edición, Academic Press, Nueva York, (1971). Además, existe una amplia guía en la bibliografía para derivatizar moléculas informadoras y extintoras para la unión covalente a través de grupos reactivos normales que se pueden añadir a un oligonucleótido. Véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. n° 3.996.345; y la patente de EE.UU. n.° 4.351.760. Se pueden seleccionar pares de fluoróforoextintor ejemplares entre colorantes de xanteno, incluyendo fluoresceínas, y colorantes de rodamina. Muchas formas adecuadas de estos compuestos están ampliamente disponibles comercialmente con sustituyentes en sus restos fenílicos que pueden usarse como sitio para el enlace o como la funcionalidad de enlace para la unión a un oligonucleótido. Otro grupo de compuestos fluorescentes son las naftilaminas, que tienen un grupo amino en posición alfa o beta. Entre dichos compuestos de naftilamino están el 1-dimetilaminonaftil-5-sulfonato, 1-anilino-8-naftaleno sulfonato, y el 2-p-touidinil-6-naftaleno sulfonato. Otros colorantes incluyen 3-fenil-7-isocianatocumarina, acridinas, tales como 9-isotiocianatoacridina y naranja de acridina; N-(p-(2-benzoxazolil)fenil)maleimida; benzoxadiazoles, estilbenos, pirenos, y similares. En algunos aspectos, las moléculas de fluoróforo y extintor se seleccionan de colorantes de fluoresceína y rodamina. Estos colorantes y metodologías de unión apropiadas para la unión a oligonucleótidos se conocen en la técnica. Véanse, por ejemplo, Marshall, Histochemical J. 7: 299-303 (1975); y la patente de EE.UU. n.° 5.188.934.

En algunos aspectos, la PCR multiplex puede ser posible usando informadores de sonda no de TaqMan, tales como colorantes intercalantes, codificando niveles de intensidad para distinguir pares de cebadores de concentración limitada solos. En algunos aspectos, los colorantes intercalantes se unen a secuencias de ADN bicatenario, y por lo tanto un aumento en el producto de ADN durante la PCR conduce a un aumento en la intensidad de la fluorescencia. En algunos aspectos, los colorantes intercalantes incluyen, pero no se limitan a, SYBR o PicoGreen, que se unen al ADN bicatenario amplificado. En algunos aspectos, la detección mediante colorantes intercalantes se realiza añadiendo múltiples pares de cebadores únicos a diferentes concentraciones limitantes para producir intensidades de fluorescencia de punto final variables.

En algunos aspectos, las fluorescencias emitidas se detectan (por ejemplo, mediante filtros digitales) e identifican, y las secuencias de ADN correspondientes a las fluorescencias emitidas pueden identificarse de manera similar basándose en su correspondencia.

Detección de ácido nucleico no amplificado

En algunas realizaciones, la etapa de detección puede incluir lisar microorganismos en la muestra, hibridar una sonda de ácido nucleico con una secuencia de ácido nucleico diana del microorganismo diana para formar un complejo sonda/diana, en la que la sonda incluye un marcador que está estabilizado por el complejo, degradar selectivamente el marcador presente en la sonda no hibridada, y detectar la presencia o cantidad de marcador estabilizado como una medida de la presencia o cantidad de la secuencia de ácido nucleico diana en la muestra. En algunas realizaciones, la sonda puede marcarse con un éster de acridinio. En algunas realizaciones, la sonda puede hibridarse con el ARN ribosómico del microorganismo diana.

En algunas realizaciones, los patógenos se pueden detectar usando, por ejemplo, un ensayo de protección de la hibridación (HPA). En algunas realizaciones, los patógenos se pueden lisar para liberar ácido nucleico, y se puede hibridar una sonda oligonucleotídica con una secuencia de ácido nucleico diana del microorganismo diana para formar un complejo sonda/diana en el que se detecta la sonda.

En algunas realizaciones, los análogos de ácidos nucleicos pueden modificarse en el resto de la base, el resto de azúcar, o la cadena principal de fosfato para mejorar, por ejemplo, la estabilidad, la hibridación, o la solubilidad de un ácido nucleico. Las modificaciones en el resto de la base incluyen la sustitución de desoxiuridina por desoxitimidina, y 5-metil-2'-desoxicitidina y 5-bromo-2'-desoxicitidina por desoxicitidina. En algunas realizaciones, ejemplos de nucleobases que pueden sustituirse por una base natural incluyen 5-metilcitosina (5-me-C), 5-hidroximetilcitosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metil y otros derivados alquílicos de adenina y guanina, 2-propil y otros derivados alquílicos de adenina y guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2-tiocitosina, 5-halouracilo y citosina, 5-propinil uracilo y citosina, 6-azo uracilo, citosina y timina, 5-uracil (pseudouracilo), 4-tiouracil, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquil, 8-hidroxil y otras adeninas y guaninas 8-sustituidas, 5-halo, particularmente 5-bromo, 5-trifluorometil y otros uracilos y citosinas 5-sustituidos, 7-metilguanina y 7-metiladenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7-desazaguanina y 7-desazaadenina, y 3-desazaguanina y 3-desazaadenina. Otras nucleobases útiles incluyen las descritas, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.° 3.687.808.

En algunas realizaciones, las modificaciones del resto de azúcar pueden incluir la modificación del 2' hidroxilo del azúcar de ribosa para formar 2'-O-metil o 2'-O-alil azúcares. En algunas realizaciones, la cadena principal de fosfato de desoxirribosa se puede modificar para producir ácidos morfolino nucleicos, en los que cada resto de la base está unido a un anillo de morfolino de seis miembros, o ácidos nucleicos peptídicos, en los que la cadena principal de desoxifosfato se reemplaza por una cadena principal pseudopeptídica (por ejemplo, una cadena principal de aminoetilglicina) y se retienen las cuatro bases. Véase, por ejemplo, Summerton y Weller (1997) Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 7:187-195; y Hyrup et al. (1996) Bioorgan. Med. Chem. 4:5-23. En algunas realizaciones, la cadena principal de desoxifosfato se puede reemplazar, por ejemplo, por una cadena principal de fosforotioato o fosforoditioato, un fosforoamidito, o una cadena principal de alquilfosfotriéster. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. núms. 4.469.863, 5.235.033, 5.750.666, y 5.596.086 para métodos para preparar oligonucleótidos con cadenas principales modificadas. En algunas realizaciones, la sonda oligonucleotídica puede hibridarse con cualquier porción de un ácido nucleico del microorganismo diana, por ejemplo un oligonucleótido puede hibridarse con un ácido nucleico que codifica una proteína de la pared celular o un componente celular interno, tal como una proteína de membrana, proteína de transporte, o enzima. En algunas realizaciones, el oligonucleótido se hibrida con ARN ribosómico (ARNr) o un ARNm de un microorganismo diana. Véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 4.851.330. Por ejemplo, el oligonucleótido puede hibridarse con un ARNr 16S, 23S o 5S. En algunas realizaciones, la hibridación con ARNr puede aumentar la sensibilidad del ensayo ya que la mayoría de los microorganismos contienen miles de copias de cada ARNr.

En algunas realizaciones, la sonda oligonucleotídica está marcada con una molécula que está estabilizada por la sonda/diana. En algunas realizaciones, las sondas oligonucleotídicas pueden tener entre 10 y 75 (por ejemplo, 10-14, 15-30, 25-50, 30-45, 33-40, 20-30, 31-40, 41-50 o 51-75) nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, no es necesario que el oligonucleótido sea 100% complementario al de su ácido nucleico diana para que se produzca la hibridación. En algunas realizaciones, el oligonucleótido tiene al menos 80% (por ejemplo, al menos 85%, 90%, 95%, 99%, o 100%) de identidad de secuencia con el complemento de su secuencia diana. En algunas realizaciones, la hibridación del oligonucleótido con su diana se puede detectar basándose en la quimioluminiscencia observada después de ajustar el pH a condiciones ligeramente alcalinas. En algunas realizaciones, si se produce hibridación, se observará quimioluminiscencia. En algunas realizaciones, si no se produce la hibridación, el enlace de éster de la molécula de AE se hidrolizará, y no se observará quimioluminiscencia o se reducirá de manera mensurable.

Se conocen métodos para sintetizar oligonucleótidos.

En algunas realizaciones, la presencia, ausencia o cantidad de marcador no modificado se puede evaluar usando un luminómetro (por ejemplo, el luminómetro LEADER® de Gen-Probe Incorporated, San Diego, CA, o el luminómetro BacLite3 de 3<m>, St. Paul, MN, o el luminómetro LUMIstar Galaxy de BMG, Durham, Carolina del Norte). Los luminómetros, tales como el luminómetro BacLite3 y el luminómetro LUMIstar Galaxy, tienen capacidad de dispensación de reactivos y control de temperatura particularmente útiles para automatizar los métodos aquí descritos. Dichos luminómetros pueden programarse para dispensar, en un orden predeterminado, reactivos para lisis, hibridación y detección, y permitir la incubación. La dosificación automatizada de reactivos minimiza los problemas de contaminación que se encuentran en un ambiente húmedo, tal como un baño de agua, además de mejorar la facilidad de uso del sistema de ensayo. Se entiende que el presente método no está limitado por el dispositivo usado para detectar el marcador en la sonda oligonucleotídica.

Diseño de cebador y sonda

En algunos aspectos, se pueden llevar a cabo búsquedas bibliográficas y de Blast para identificar conjuntos de genes con el potencial de identificar de forma única organismos diana patógenos en el contexto de una reacción de PCR multiplex de 5 colores basada en TaqMan. En algunos aspectos, los genes escogidos a partir de estas búsquedas pueden ser: Gen A de invasión deSalmonella(InvA), gen deListeria monocytogenesListeriolisina O (HlyA), y genes deEscherichia coliproductora de la toxina Shiga toxina Shiga 1 (stx1), toxina Shiga 2 (stx2), y que codifica intimina (eaeA).

En algunas realizaciones, los conjuntos de cebadores de PCR multiplex y sondas TaqMan se pueden diseñar usando software comercial y secuencias de ADN genómico. En algunos aspectos, la especificidad de las secuencias resultantes se puede evaluar in silico frente a la base de datos nr usando Blast. En algunos aspectos, se pueden identificar condiciones de PCR óptimas para cada uno de los conjuntos multiplex. En algunos aspectos, la selección de un conjunto final puede realizarse por etapas. En algunos aspectos, la compatibilidad, sensibilidad y especificidad pueden evaluarse inicialmente usando ADN genómico purificado de organismos diana y con ADN de bacterias no diana. En algunos aspectos, los conjuntos se pueden ensayar usando ADN preparado a partir de bacterias cultivadas en presencia de diversas matrices alimentarias.

Reactivos de ácido nucleico: Cebadores y sondas

En algunas realizaciones, los kits y el método descritos aquí usan reactivos de ácido nucleico, por ejemplo oligonucleótidos, por ejemplo cebadores de amplificación y sondas de hibridación, para la detección de las secuencias distintivas. En algunos aspectos, se describen aquí cebadores y sondas ejemplares, por ejemplo en la Tabla 1; y en algunas realizaciones, los kits y métodos incluyen los cebadores y sondas descritos en la Tabla 1. En algunas realizaciones, los kits y métodos pueden usar versiones variantes de los cebadores y sondas descritos aquí, por ejemplo oligonucleótidos que son más cortos o más largos o que tienen al menos alrededor de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 88%, 89, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o al menos alrededor de 99% de identidad de secuencia, siempre que el oligonucleótido cumpla esa misma función, por ejemplo funciona en el ensayo para la detección de las secuencias distintivas.

En algunas realizaciones, la longitud de un reactivo de ácido nucleico, por ejemplo un cebador o una sonda de hibridación o una sonda oligonucleotídica, variará dependiendo de la aplicación. En algunas realizaciones, la longitud total puede tener una longitud de alrededor de 5 a 80 nucleobases. En algunas realizaciones, los cebadores, la sonda oligonucleotídica y las sondas de hibridación usadas según esta invención pueden comprender de alrededor de 8 a alrededor de 80 nucleobases (es decir, de alrededor de 8 a alrededor de 80 nucleósidos unidos). Un experto en la técnica apreciará que la invención incorpora oligonucleótidos de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, u 80 nucleobases de longitud. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos tienen una longitud mayor que 80 nucleobases.

En algunas realizaciones, los kits incluyen reactivos de ácido nucleico que son conjuntos de oligonucleótidos para cada secuencia diana que se va a detectar. Cada conjunto tiene cebadores de PCR, sonda oligonucleotídica o sondas de hibridación para cada secuencia diana. Las realizaciones ejemplares incluyen los cebadores de PCR y las sondas oligonucleotídicas descritos en la Tabla 1. En algunas realizaciones, el kit incluye cada uno de los cebadores de PCR y sondas oligonucleotídicas enumerados para el patógeno respectivo. En algunas realizaciones, el kit incluye un subconjunto del cebador y las sondas descritos. En algunas realizaciones, el kit incluye al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, o al menos 50 de los pares de cebadores. En algunas realizaciones, el kit incluye al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, o al menos 50 sondas oligonucleotídicas.

En algunas realizaciones, los kits incluyen reactivos para la detección de menos de todos los patógenos, por ejemplo para la detección de al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o al menos 20 de los patógenos. En algunas realizaciones, las sondas TaqMan se pueden detectar mediante métodos conocidos en la técnica.

Controles internos

Al analizar una muestra biológica para detectar contaminación por un patógeno o confirmar que una muestra está libre de un patógeno, puede existir un problema al interpretar un resultado negativo. Sin controles adecuados, puede que no sea posible determinar si la ausencia del patógeno contaminante que se detecta es el resultado de un fallo del ensayo o de la ausencia de cualquier patógeno contaminante en la muestra. Si el resultado negativo puede atribuirse al motivo anterior, el fallo del ensayo podría haber ocurrido en cualquier etapa. Por ejemplo, en un ensayo de ácido nucleico, el fallo puede haber ocurrido durante las etapas de extracción, manipulación, amplificación o detección del ácido nucleico. Generalmente, por ejemplo y sin carácter limitativo, se pueden usar cuatro controles en métodos basados en PCR para la detección de ácidos nucleicos. El primer control puede ser un control positivo interno para la etapa de extracción del ácido nucleico. El segundo control puede ser para la detección de los productos de la PCR. El tercer control puede ser para la etapa de amplificación. Finalmente, el cuarto control puede ser un control sin molde, para detectar contaminación durante el ensayo.

En algunos aspectos, la amplificación puede llevarse a cabo con un control interno. En algunos aspectos, el control interno puede ser un control negativo. En algunos aspectos, el control interno puede ser un control positivo.

En algunos aspectos, el control interno puede ser un polinucleótido u oligonucleótido. En algunos aspectos, el control interno puede ser una secuencia exógena. En algunos aspectos, el control interno se puede usar como control interno universal, ya que comprende sitios de cebador y sonda únicos y no muestra homología con ninguna secuencia de ácido nucleico conocida que pueda interferir con este ensayo, es decir, no se hibrida con secuencias de ácido nucleico conocidas durante técnicas de PCR convencionales.

En algunos aspectos, el control interno puede ser moléculas de ADN y/o ARN de origen natural o sintético que pueden ser monocatenarias o bicatenarias, y representan la cadena sentido o antisentido. En algunos aspectos, el control interno puede ser una secuencia escogida según se requiera en una reacción de amplificación. En algunos aspectos, el control interno puede ser una secuencia seleccionada de, por ejemplo, secuencias que son adecuadas para detectar y/o distinguir material patógeno tal como virus, bacterias, hongos, parásitos tales como Plasmodium falciparum, garrapatas,E. coli,etc. En algunos aspectos, el control interno puede contener análogos de nucleótidos conocidos o restos o enlaces de la cadena principal modificados, y cualquier sustrato que pueda incorporarse a un polímero mediante ADN o ARN polimerasa. Ejemplos de tales análogos incluyen fosforotioatos, fosforamidatos, metilfosfonatos, metilfosfonatos quirales, 2-O-metilribonucleótidos, ácidos peptidonucleicos (PNA), y similares. En algunos aspectos, el control interno se puede aislar. En algunos aspectos, el control interno puede aislarse o purificarse sustancialmente a partir del ADN o ARN genómico de la especie de la que se obtuvo la molécula de ácido nucleico.

En algunos aspectos, el control interno puede prepararse fácilmente mediante métodos convencionales conocidos en la técnica, por ejemplo sintetizando directamente la secuencia de ácido nucleico usando métodos y equipos conocidos en la técnica, tales como sintetizadores automatizados de oligonucleótidos, tecnología de PCR, técnicas de ADN recombinante, y similares. Documentos WO 2003075837 A2, WO 2012114312 A2 y WO 2012114312 A2.

En algunos aspectos, una sonda de control interno se puede usar para detectar la presencia o ausencia del control interno. En algunos aspectos, la sonda de control interno puede ser una sonda oligonucleotídica interna. En algunos aspectos, la sonda oligonucleotídica interna puede marcarse en el extremo 5' con un fluoróforo donador de transferencia de energía, y marcarse en los extremos 3' con un fluoróforo aceptor de transferencia de energía. En algunos aspectos, la sonda oligonucleotídica interna se hibrida específicamente entre los cebadores directo e inverso de una secuencia diana. En algunos aspectos, la sonda oligonucleotídica interna puede escindirse por el extremo 5' durante la amplificación por PCR, y la molécula informadora puede separarse entonces de la molécula extintora para generar una señal específica de la secuencia. En algún aspecto, con cada ciclo de amplificación, se pueden separar moléculas informadoras adicionales de las moléculas extintoras. En algunos aspectos, la intensidad de una señal, tal como la fluorescencia, se puede monitorizar antes, durante o después de la amplificación por PCR, o una combinación de las mismas.

En algunos aspectos, el control interno puede usarse para distinguir un resultado verdadero negativo de un resultado falso negativo. Como se usa aquí, un resultado “verdadero negativo” indica correctamente que una muestra carece de una secuencia de ácido nucleico diana. Un resultado “falso negativo” indica incorrectamente la ausencia de una secuencia de ácido nucleico diana que puede deberse a inhibidores de PCR presentes en la muestra, o a un error técnico.

En algunas realizaciones, los métodos de detección descritos aquí pueden detectar la presencia o ausencia de uno o más patógenos en una muestra con una precisión en el intervalo de entre al menos el 1% y al menos el 99,9%. En algunas realizaciones, los métodos de detección descritos aquí pueden detectar la presencia y/o ausencia de uno o más patógenos en una muestra con una precisión de al menos el 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o al menos el 99%. En algunas realizaciones, los métodos de detección descritos aquí pueden detectar la presencia y/o ausencia de uno o más patógenos en 1/5, 2/5, 3/5, 4/5 o 5/5 réplicas. En algunas realizaciones, los métodos de detección descritos aquí pueden detectar la presencia y/o ausencia de uno o más patógenos en 1/20, 2/20, 3/20, 4/20, 5/20, 6/20, 7/20, 8/20, 9/20, 10/20, 11/20, 12/20, 13/20, 14/20, 15/20, 16/20, 17/20, 18/20, 19/20, o 20/20 réplicas. En algunas realizaciones, los métodos de detección descritos aquí pueden detectar la presencia y/o ausencia de uno o más patógenos en un intervalo de entre al menos el 10% y el 99,9% de las réplicas. En algunas realizaciones, los métodos de detección descritos aquí pueden detectar la presencia y/o ausencia de uno o más patógenos en al menos el 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o al menos el 99% de las réplicas.

Efecto

En algunas realizaciones, los kits, dispositivos y métodos descritos aquí salvan el problema de detectar múltiples organismos que se consideran incompatibles con el enriquecimiento simultáneo. En algunas realizaciones, los medios de enriquecimiento y/o los métodos de enriquecimiento descritos aquí salvan el problema de detectar múltiples organismos que se consideran incompatibles con el enriquecimiento simultáneo. En algunas realizaciones, los amortiguadores de lisis y/o los métodos de lisis descritos aquí salvan el problema de detectar múltiples organismos que se consideran incompatibles con el enriquecimiento simultáneo. En algunas realizaciones, los métodos de enriquecimiento y/o los medios de enriquecimiento y los amortiguadores de lisis y/o los procedimientos de lisis descritos aquí salvan el problema de detectar múltiples organismos que se consideran incompatibles con el enriquecimiento simultáneo.

En algunas realizaciones, los medios de enriquecimiento, los procedimientos de enriquecimiento, el amortiguador de lisis y los procedimientos de lisis pueden conferir un efecto sinérgico sobre la sensibilidad de los métodos de detección descritos aquí. En algunas realizaciones, los medios de enriquecimiento, los procedimientos de enriquecimiento, los amortiguadores de lisis y los procedimientos de lisis descritos aquí pueden aumentar la eficacia de la detección de patógenos. En algunas realizaciones, los medios de enriquecimiento, los procedimientos de enriquecimiento, el amortiguador de lisis y los procedimientos de lisis pueden conferir un efecto aditivo sobre la sensibilidad de los métodos de detección descritos aquí. En algunas realizaciones, la sensibilidad de los métodos de detección descritos aquí puede aumentar cuando el medio/procedimiento de enriquecimiento, el amortiguador/procedimiento de lisis y los ensayos descritos aquí se usan en conjunto.

En algunas realizaciones, los medios de enriquecimiento, los procedimientos de enriquecimiento, el amortiguador de lisis y los procedimientos de lisis pueden conferir un efecto sinérgico en el tiempo de detección de patógenos de los métodos de detección descritos aquí. En algunas realizaciones, los medios de enriquecimiento, los procedimientos de enriquecimiento, los amortiguadores de lisis y los procedimientos de lisis descritos aquí pueden disminuir el tiempo de detección de patógenos de forma sinérgica. En algunas realizaciones, los medios de enriquecimiento, los procedimientos de enriquecimiento, el amortiguador de lisis y los procedimientos de lisis pueden conferir un efecto aditivo sobre el tiempo de detección de los métodos de detección descritos aquí. En alguna realización, el tiempo de detección de patógenos de los métodos de detección descritos aquí puede disminuir de manera aditiva cuando el medio/procedimiento de enriquecimiento y el amortiguador/procedimiento de lisis descritos aquí se usan conjuntamente.

Tabla 1.

Ejemplos:

Validación de carnes frías listas para consumo (Deli Pavo) (1 UFC/25 g)

Los 3 organismos diana se inocularon e incubaron simultáneamente: 0,725 UFC/25 g deE. coli O157:H7(ATCC:43895), 0,832 UFC/25 g de S.entérica(ATCC: 13076) y 1,008 UFC/25 g deL. monocytogenes(ATCC: 13932). Las muestras se suspendieron en un caldo base de enriquecimiento para Listeria amortiguado (sin suplementos), se digirieron durante 30 segundos, en una bolsa estomacal, la bolsa se cerró, y las muestras se incubaron durante 24 horas a 37°C. El amortiguador de lisis comprendía: EDTA 8 mM, TRIS 80 mM, Triton X-100 al 4,8%, Proteinasa K al 27,5% (disolución preparada del catálogo de Qiagen n.° 19133), lisozima 20 mg/ml (n.° de catálogo de Amresco 0663-10G, y perlas de lisis de circonio de 100 |jm 0,88 gramos/ml (catálogo de Ops Diagnostics n.° BLBZ 100-250-14). Para lisar las muestras, se pipetearon 100 j l de disolución amortiguador de lisis en cada pocillo de un bloque de pocillos profundos, se añadieron 50 j l de H2O estéril a cada pocillo, se retiraron 50 j l de sobrenadante de la bolsa de enriquecimiento y se añadió a cada pocillo. Las muestras se lisaron a 65°C durante 15 minutos, agitando a 1350 RPM.

Las muestras se lisaron durante 10 minutos adicionales a 95°C, agitando a 1350 RPM, después de lo cual, el bloque de pocillos profundos se enfrió hasta temperatura ambiente. El ADN bacteriano se obtuvo mediante PCR multiplex. El protocolo de PCR de amplificación multiplex comprendió una reacción de 25 j l usando 1 j l de lisado al final del procedimiento de lisis. El ciclo de PCR es el siguiente: Etapa inicial: 98°C durante 3 minutos, 2.) 95°C durante 10 segundos, 3.) 58,5°C durante 45 segundos. Vuelva a la etapa 2 y repita 49 veces. La PCR multiplex se realizó en 20 réplicas usando el instrumento BioRad CFX-96 Touch. Los cebadores y sondas usados en la PCR multiplex se describen en la Tabla 1.

EAE se identificó en 16/20 (80%) réplicas como positivas para EAE, STX-1 se identificó en 16/20 (80%) réplicas como positivas para STX-1, STX-2 se identificó en 17/20 (85%) replica como positivas para STX-2,Salmonellaspp. (1 diana) se identificó en 19/20 (95%) réplicas como positivas para S.entérica, Listeria monocytogenes(1 diana) se identificó en 14/20 (70%) réplicas como positivas paraL. monocytogenes.Figura 1-5. Patrick

Validación de carnes frías listas para consumo (5 UFC/25 g)

3 organismos diana inoculados simultáneamente, UFC determinadas mediante recuento de placa,E. coliinoculada en una cantidad de 5,5 UFC/25 g, S.entericainoculada en una cantidad de 4,5 UFC/25 g,L. monocytogenesinoculada en una cantidad de 5,15 UFC/25 g. Las muestras se suspendieron en un caldo base de enriquecimiento para Listeria amortiguado (sin suplementos), se digirieron durante 30 segundos, en una bolsa estomacal, la bolsa se cerró, y las muestras se incubaron durante 24 horas a 37°C. El amortiguador de lisis comprendía: EDTA 8 mM, TRIS 80 mM, Triton X-100 al 4,8%, Proteinasa K al 27,5% (disolución recién preparada del catálogo de Qiagen n.° 19133), lisozima 20 mg/ml (n.° de catálogo de Amresco 0663-10G, y perlas de lisis de circonio de 100 jm 0,88 gramos/ml (catálogo de Ops Diagnostics n.° BLBZ 100-250-14).

Para lisar las muestras, se pipetearon 100 j l de disolución de amortiguador de lisis en cada pocillo de un bloque de pocillos profundos, se añadieron 50 j l de H2O estéril a cada pocillo, se retiraron 50 j l de sobrenadante de la bolsa de enriquecimiento y se añadieron a cada pocillo. Las muestras se lisaron a 65°C durante 15 minutos, agitando a 1350 RPM. Las muestras se lisaron durante 10 minutos adicionales a 95°C, agitando a 1350 RPM, después de lo cual, el bloque de pocillos profundos se enfrió hasta temperatura ambiente. El ADN bacteriano se obtuvo mediante PCR multiplex.

El protocolo de PCR de amplificación multiplex comprendió una reacción de 25 j l usando 1 j l de lisado al final del procedimiento de lisis. El ciclo de PCR es el siguiente: Etapa inicial: 98°C durante 3 minutos, 2.) 95°C durante 10 segundos, 3.) 58,5°C durante 45 segundos. Vuelva a la etapa 2 y repita 49 veces. La PCR multiplex se realizó en 5 réplicas usando el instrumento BioRad CFX-96 Touch. Los cebadores y sondas usados en la PCR multiplex se describen en la Tabla 1.

Dianas deE. coli(STEC) (3 dianas): EAE: se identificó en 5/5 (100%) réplicas como positivas para EAE, STX-1: se identificó en 5/5 (100%) réplicas como positivas para STX-1, STX-2: se identificó en 5/5 (100%) réplicas como positivas para STX-2,Salmonellaspp. (1 diana): se identificó en 5/5 (100%) réplicas como positivas para S.enterica. L. monocytogenes(1 diana): se identificó en 5/5 (100%) réplicas como positivas paraL. monocytogenes.Figura 6-10

Validación de carne lista para consumo (salchicha tipo perrito caliente) (1 UFC/25 g)

Los 3 organismos diana se inocularon e incubaron simultáneamente, 0,900 UFC/25 g deE. coli O157:H7(ATCC:43895), 1,022 UFC/25 g de S.enterica(ATCC: 13076), 0,877 UFC/25 g deL. monocytogenes(ATCC: 13932). Las muestras se suspendieron en un caldo base de enriquecimiento para Listeria amortiguado (sin suplementos), se digirieron durante 30 segundos, en una bolsa estomacal, la bolsa se cerró, y las muestras se incubaron durante 24 horas a 37°C. El amortiguador de lisis comprendía EDTA 8 mM, TRIS 80 mM, Triton X-100 al 4,8%, Proteinasa K al 27,5% (disolución recién preparada del catálogo de Qiagen n.° 19133), lisozima 20 mg/ml (catálogo de Amresco n.° 0663-10G, y perlas de lisis de circonio de 100 jm 0,88 gramos/ml (catálogo de Ops Diagnostics n.° BLBZ 100-250 14).

Para lisar las muestras, se pipetearon 100 j l de disolución de amortiguador de lisis en cada pocillo de un bloque de pocillos profundos, se añadieron 50 j l de H2O estéril a cada pocillo, se retiraron 50 j l de sobrenadante de la bolsa de enriquecimiento y se añadieron a cada pocillo. Las muestras se lisaron a 65°C durante 15 minutos, agitando a 1350 RPM. Las muestras se lisaron durante 10 minutos adicionales a 95°C, agitando a 1350 RPM, después de lo cual, el bloque de pocillos profundos se enfrió hasta temperatura ambiente. El ADN bacteriano se obtuvo mediante PCR multiplex. El protocolo de PCR de amplificación multiplex comprendió una reacción de 25 j l usando 1 j l de lisado al final del procedimiento de lisis. El ciclo de PCR es el siguiente: Etapa inicial: 98°C durante 3 minutos. 2.) 95°C durante 10 segundos. 3.) 58,5°C durante 45 segundos. Vuelva a la etapa 2 y repita 49 veces. La PCR multiplex se realizó en 20 réplicas usando el instrumento BioRad CFX-96 Touch. Los cebadores y sondas usados en la PCR multiplex se describen en la Tabla 1

Dianas deE. coli(STEC) (3 dianas) EAE: se identificó en 20/20 (100%) réplicas como positivas para EAE, STX-1: se identificó en 20/20 (100%) réplicas como positivas para STX-1, STX-2: se identificó en 20/20 (100%) réplicas como positivas para STX-2;Salmonellaspp. (1 diana): se identificó en 20/20 (100%) réplicas como positivas para S.entérica.;L. monocytogenes(1 diana): se identificó en 10/20 (50%) réplicas como positivas paraL. monocytogenes.Figura 11.

Validación de carne lista para consumir (salchicha tipo perrito caliente) (5 UFC/25 g)

3 organismos diana inoculados simultáneamente, UFC determinadas mediante recuento de placa,E. coliinoculada en una cantidad de 4,5 UFC/25 g, S.entéricainoculada en una cantidad de 5,11 UFC/25 g,L. monocytogenesinoculada en una cantidad de 4,385 UFC/25 g. Las muestras se suspendieron en un caldo base de enriquecimiento para Listeria amortiguado (sin suplementos), se digirieron durante 30 segundos, en una bolsa estomacal, la bolsa se cerró, y las muestras se incubaron durante 24 horas a 37°C. El amortiguador de lisis comprendía: EDTA 8 mM, TRIS 80 mM, Triton X-100 al 4,8%, Proteinasa K al 27,5% (disolución recién preparada del catálogo de Qiagen n.° 19133), lisozima 20 mg/ml (n.° de catálogo de Amresco 0663-10G, y perlas de lisis de circonio de 100 |jm 0,88 gramos/ml (catálogo de Ops Diagnostics n.° BLBZ 100-250-14).

Para lisar las muestras, se pipetearon 100 j l de disolución de amortiguador de lisis en cada pocillo de un bloque de pocillos profundos, se añadieron 50 j l de H2O estéril a cada pocillo, se retiraron 50 j l de sobrenadante de la bolsa de enriquecimiento y se añadieron a cada pocillo. Las muestras se lisaron a 65°C durante 15 minutos, agitando a 1350 RPM. Las muestras se lisaron durante 10 minutos adicionales a 95°C, agitando a 1350 RPM, después de lo cual, el bloque de pocillos profundos se enfrió hasta temperatura ambiente. El ADN bacteriano se obtuvo mediante PCR multiplex. El protocolo de PCR de amplificación multiplex comprendió una reacción de 25 j l usando 1 j l de lisado al final del procedimiento de lisis. El ciclo de PCR es el siguiente: Etapa inicial: 98°C durante 3 minutos. 2.) 95°C durante 10 segundos. 3.) 58,5°C durante 45 segundos. Vuelva a la etapa 2 y repita 49 veces. La PCR multiplex se realizó en 5 réplicas usando el instrumento BioRad CFX-96 Touch. Los cebadores y sondas usados en la PCR multiplex se describen en la Tabla 1.

Resultados: EAE: se identificó en 5/5 (100%) réplicas como positivas para EAE, STX-1: se identificó en 5/5 (100%) réplicas como positivas para STX-1, STX-2: se identificó en 5/5 (100%) réplicas como positivas para STX-2;Salmonellaspp. (1 diana): se identificó en 5/5 (100%) réplicas como positivas para S.enterica.; L. monocytogenes(1 diana): se identificó en 5/5 (100%) réplicas como positivas paraL. monocytogenes.Figura 12.

Validación de lechuga iceberg (1 UFC/25 g)

Los 3 organismos diana se inocularon e incubaron simultáneamente: 0,852 UFC/25 g deE. coli O157:H7(ATCC:43895), 1,04 UFC/25 g de S.enterica(ATCC: 13076), 1,064 UFC/25 g deL. monocytogenes(ATCC: 13932).

Las muestras se suspendieron en un caldo base de enriquecimiento para Listeria amortiguado (sin suplementos), se digirieron durante 30 segundos, en una bolsa estomacal, la bolsa se cerró, y las muestras se incubaron durante 24 horas a 37°C. El amortiguador de lisis comprendía: EDTA 8 mM, TRIS 80 mM, Triton X-100 al 4,8%, Proteinasa K al 27,5% (disolución recién preparada del catálogo de Qiagen n.° 19133), lisozima 20 mg/ml (n.° de catálogo de Amresco 0663-10G, y perlas de lisis de circonio de 100 jm 0,88 gramos/ml (catálogo de Ops Diagnostics n.° BLBZ 100-250 14).

Para lisar las muestras, se pipetearon 100 j l de disolución de amortiguador de lisis en cada pocillo de un bloque de pocillos profundos, se añadieron 50 j l de H2O estéril a cada pocillo, se retiraron 50 j l de sobrenadante de la bolsa de enriquecimiento y se añadieron a cada pocillo. Las muestras se lisaron a 65°C durante 15 minutos, agitando a 1350 RPM. Las muestras se lisaron durante 10 minutos adicionales a 95°C, agitando a 1350 RPM, después de lo cual, el bloque de pocillos profundos se enfrió hasta temperatura ambiente. El ADN bacteriano se obtuvo mediante PCR multiplex. El protocolo de PCR de amplificación multiplex comprendió una reacción de 25 j l usando 1 j l de lisado al final del procedimiento de lisis. El ciclo de PCR es el siguiente: Etapa inicial: 98°C durante 3 minutos. 2.) 95°C durante 10 segundos. 3.) 58,5°C durante 45 segundos. Vuelva a la etapa 2 y repita 49 veces. La PCR multiplex se realizó en 20 réplicas usando el instrumento BioRad CFX-96 Touch. Los cebadores y sondas usados en la PCR multiplex se describen en la Tabla 1.

Dianas deE. coli(STEC) (3 dianas) EAE: se identificó en 9/20 (45%) réplicas como positivas para EAE, STX-1: se identificó en 9/20 (45) réplicas como positivas para STX-1, STX-2: se identificó en 9/20 (45%) réplicas como positivas para STX-2;Salmonellaspp. (1 diana): se identificó en 17/20 (85%) réplicas como positivas para S.enterica.; L. monocytogenes(1 diana): se identificó en 10/20 (50%) réplicas como positivas paraL. monocytogenes.Figura 13

Validación de lechuga iceberg (5 UFC/25 g)

3 organismos diana inoculados simultáneamente, UFC determinadas mediante recuento de placa,E. coliinoculada en una cantidad de 4,26 UFC/25 g, S.entericainoculada en una cantidad de 5,2 UFC/25 g,L. monocytogenesinoculada en una cantidad de 5,32 UFC/25 g. Las muestras se suspendieron en un caldo base de enriquecimiento para Listeria amortiguado (sin suplementos), se digirieron durante 30 segundos, en una bolsa estomacal, la bolsa se cerró, y las muestras se incubaron durante 24 horas a 37°C. El amortiguador de lisis comprendía: EDTA de 8 mm, TRIS 80 mM, Triton X-100 al 4,8%, Proteinasa K al 27,5% (disolución recién preparada del catálogo de Qiagen n.° 19133), lisozima 20 mg/ml (n.° de catálogo de Amresco 0663-10G, y perlas de lisis de circonio de 100 |jm 0,88 gramos/ml (catálogo de Ops Diagnostics n.° BLBZ 100-250-14).

Para lisar las muestras, se pipetearon 100 j l de disolución de amortiguador de lisis en cada pocillo de un bloque de pocillos profundos, se añadieron 50 j l de H2O estéril a cada pocillo, se retiraron 50 j l de sobrenadante de la bolsa de enriquecimiento y se añadieron a cada pocillo. Las muestras se lisaron a 65°C durante 15 minutos, agitando a 1350 RPM. Las muestras se lisaron durante 10 minutos adicionales a 95°C, agitando a 1350 RPM, después de lo cual, el bloque de pocillos profundos se enfrió hasta temperatura ambiente. El ADN bacteriano se obtuvo mediante PCR multiplex. El protocolo de PCR de amplificación multiplex comprendió una reacción de 25 j l usando 1 j l de lisado al final del procedimiento de lisis. El ciclo de PCR es el siguiente: Etapa inicial: 98°C durante 3 minutos. 2.) 95°C durante 10 segundos. 3.) 58,5°C durante 45 segundos. Vuelva a la etapa 2 y repita 49 veces. La PCR multiplex se realizó usando el instrumento BioRad CFX-96 Touch. Los cebadores y sondas usados en la PCR multiplex se describen en la Tabla 1.

Dianas deE. coli(STEC) (3 dianas), EAE: se identificó en 5/5 (100%) réplicas como positivas para EAE, STX-1: se identificó en 5/5 (100%) réplicas como positivas para STX-1, STX-2: se identificó en 5/5 (100%) réplicas como positivas para STX-2;Salmonellaspp. (1 diana): se identificó en 5/5 (100%) réplicas como positivas para S.entérica.;L. monocytogenes(1 diana): se identificó en 5/5 (100%) réplicas como positivas paraL. monocytogenes.Figura 14.

Validación de carne picada cruda (1 UFC/25 g)

Los 3 organismos diana inoculados e incubados simultáneamente: 0,852 UFC/25 g deE. coli O157:H7(ATCC:43895), 1,04 UFC/25 g de S.enterica(ATCC: 13076), y 1,064 UFC/25 g deL. monocytogenes(ATCC: 13932). Las muestras se suspendieron en un caldo base de enriquecimiento para Listeria amortiguado (sin suplementos), se digirieron durante 30 segundos, en una bolsa estomacal, la bolsa se cerró, y las muestras se incubaron durante 24 horas a 37°C. El amortiguador de lisis comprendía: EDTA 8 mM, TRIS 80 mM, Triton X-100 al 4,8%, Proteinasa K al 27,5% (disolución recién preparada del catálogo de Qiagen n.° 19133), lisozima 20 mg/ml (n.° de catálogo de Amresco 0663-10G, perlas de lisis de circonio de 100 jm 0,88 gramos/ml (catálogo de Ops Diagnostics n.° BLBZ 100-250-14).

Dianas deE. coli(STEC) (3 dianas): EAE: se identificó en 13/20 (65%) réplicas como positivas para EAE, STX-1: se identificó en 13/20 (65) réplicas como positivas para STX-1, STX-2: se identificó en 13/20 (65%) réplicas como positivas para STX-2;Salmonellaspp. (1 diana): se identificó en 14/20 (70%) réplicas como positivas para S.enterica.; L. monocytogenes(1 diana): se identificó en 8/20 (40%) réplicas como positivas paraL. monocytogenes.Figura 15.

Validación de carne picada (5 UFC/25 g)

3 organismos diana inoculados simultáneamente, UFC determinadas mediante recuento de placa:E. coliinoculada a una cantidad medida de 4,26 UFC/25 g, S.entericainoculada a una cantidad medida de 5,2 UFC/25 g, yL. monocytogenesinoculada a una cantidad medida de 5,32 UFC/25 g. Las muestras se suspendieron en un caldo base de enriquecimiento para Listeria amortiguado (sin suplementos), se digirieron durante 30 segundos, en una bolsa estomacal, la bolsa se cerró, y las muestras se incubaron durante 24 horas a 37°C. El amortiguador de lisis comprendía: EDTA 8 mM, TRIS 80 mM, Triton X-100 al 4,8%, Proteinasa K al 27,5% (disolución recién preparada del catálogo de Qiagen n.° 19133), lisozima 20 mg/ml (n.° de catálogo de Amresco 0663-10G, y perlas de lisis de circonio de 100 jm 0,88 gramos/ml (catálogo de Ops Diagnostics n.° BLBZ 100-250-14).

Para lisar las muestras, se pipetearon 100 j l de disolución de amortiguador de lisis en cada pocillo de un bloque de pocillos profundos, se añadieron 50 j l de H2O estéril a cada pocillo, se retiraron 50 j l de sobrenadante de la bolsa de enriquecimiento y se añadieron a cada pocillo. Las muestras se lisaron a 65°C durante 15 minutos, agitando a 1350 RPM. Las muestras se lisaron durante 10 minutos adicionales a 95°C, agitando a 1350 RPM, después de lo cual, el bloque de pocillos profundos se enfrió hasta temperatura ambiente. El ADN bacteriano se obtuvo mediante PCR multiplex. El protocolo de PCR de amplificación multiplex comprendió una reacción de 25 j l usando 1 j l de lisado al final del procedimiento de lisis. El ciclo de PCR es el siguiente: Etapa inicial: 98°C durante 3 minutos. 2.) 95°C durante 10 segundos, 3.) 58,5°C durante 45 segundos, Vuelva a la etapa 2 y repita 49 veces. La PCR multiplex se realizó usando el instrumento BioRad CFX-96 Touch. Los cebadores y sondas usados en la PCR multiplex se describen en la Tabla 1.

Dianas deE. coli(STEC) (3 dianas): EAE: se identificó en 5/5 (100%) réplicas como positivas para EAE, STX-1: se identificó en 5/5 (100%) réplicas como positivas para STX-1, STX-2: se identificó en 5/5 (100%) réplicas como positivas para STX-2;Salmonellaspp. (1 diana): se identificó en 5/5 (100%) réplicas como positivas para S.entérica.;L. monocytogenes(1 diana): se identificó en 5/5 (100%) réplicas como positivas paraL. monocytogenes.Figura 16.

Validación de Deli Pavo listo para consumo (1 UFC/25 g) -Control interno

Los 3 organismos diana se inocularon en pavo, y se incubaron simultáneamente a 4°C durante 48 horas, 0,60 UFC/25 g deE. coli O157:H7(ATCC:43895), 0,48 UFC/25 g de S.enterica(ATCC: 13076) y 1,00 UFC/25 g deL. monocytogenes(ATCC: 13932). Las muestras se suspendieron entonces en un caldo base de enriquecimiento para Listeria amortiguado (sin suplementos), se digirieron durante 30 segundos, en una bolsa estomacal, la bolsa se cerró, y las muestras se incubaron durante 24 horas a 37°C. El recuento aeróbico de placa (APC) realizado en un control no inoculado indicó 2,4 * 103 bacterias nativas por gramo.

El amortiguador de lisis comprendía: EDTA 8 mM, TRIS 80 mM, Triton X-100 al 4,8%, Proteinasa K al 27,5% (disolución preparada del catálogo de Qiagen n.° 19133), lisozima 20 mg/ml (n.° de catálogo de Amresco 0663-10G, y perlas de lisis de circonio de 100 |jm 0,88 gramos/ml (catálogo de Ops Diagnostics n.° BLBZ 100-250-14). Para lisar las muestras, se pipetearon 100 j l de disolución amortiguador de lisis en cada pocillo de un bloque de pocillos profundos, se añadieron 50 j l de H2O estéril a cada pocillo, se retiraron 50 j l de sobrenadante de la bolsa de enriquecimiento y se añadió a cada pocillo. Las muestras se lisaron a 65°C durante 15 minutos, agitando a 1350 RPM.

Las muestras se lisaron durante 10 minutos adicionales a 95°C, agitando a 1350 RPM, después de lo cual, el bloque de pocillos profundos se enfrió hasta temperatura ambiente. El ADN bacteriano se obtuvo mediante PCR multiplex. El protocolo de PCR de amplificación multiplex comprendió reacciones de 25 j l usando 1 j l de lisado al final del procedimiento de lisis. 30.000 copias del gen de referencia de control interno por reacción. El ciclo de PCR es el siguiente: Etapa inicial: 98°C durante 3 minutos, 2.) 95°C durante 10 segundos, 3.) 58,5°C durante 45 segundos. Vuelva a la etapa 2 y repita 49 veces. La PCR multiplex se realizó en 20 réplicas usando el instrumento BioRad CFX-96 Touch. Los cebadores y sondas usados en la<p>C<r>multiplex se describen en la Tabla 1. Cantidad de cebador por reacción: 100 nmol por secuencia por diana. Cantidad de sonda por reacción: 100 nmol de sondas STX-2,Salmonella(INV), control interno, y EAE por reacción; 250 nmol de sondas STX-1 y Listeria (HLY) por reacción.

EAE se identificó en 18/20 (90%) réplicas como positivas para EAE; STX-1 y STX-2 se identificó en 18/20 (80%) réplicas como positivas para STX-1 y STX-2;Listeria monocytogenesse identificó en 9/20 (45%) réplicas como positivas paraL. monocytogenes; S. entericase identificó en 20/20 (100%) réplicas como positivas para S.enterica.Control interno se identificó en 20/20 (100%) réplicas como positivas para control interno. Figura 17-22.

Validación de carnes frías lista para consumo (5 UFC/25 g) -Control interno

Se inocularon 3 organismos diana en pavo simultáneamente, y se incubaron a 4°C durante 48 horas. UFC determinadas mediante recuento de placa,E. coliinoculada en una cantidad de 3 UFC/25 g, S.entericainoculada en una cantidad de 2,42 UFC/25 g,L. monocytogenesinoculada en una cantidad de 5,00 UFC/25 g. Las muestras se suspendieron entonces en un caldo base de enriquecimiento para Listeria amortiguado (sin suplementos), se digirieron durante 30 segundos, en una bolsa estomacal, la bolsa se cerró, y las muestras se incubaron durante 24 horas a 37°C. El recuento aeróbico de placa (APC) realizado en un control no inoculado indicó 2,4 * 103 bacterias nativas por gramo. El amortiguador de lisis comprendía: EDTA 8 mM, TRIS 80 mM, Triton X-100 al 4,8%, Proteinasa K al 27,5% (disolución recién preparada del catálogo de Qiagen n.° 19133), lisozima 20 mg/ml (n.° de catálogo de Amresco 0663-10G, y perlas de lisis de circonio de 100 jm 0,88 gramos/ml (catálogo de Ops Diagnostics n.° BLBZ 100-250-14).

El protocolo de PCR de amplificación multiplex comprendió una reacción de 25 j l usando 1 j l de lisado al final del procedimiento de lisis. 30.000 copias del gen de referencia de control interno por reacción. El ciclo de PCR es el siguiente: Etapa inicial: 98°C durante 3 minutos, 2.) 95°C durante 10 segundos, 3.) 58,5°C durante 45 segundos. Vuelva a la etapa 2 y repita 49 veces. La PCR multiplex se realizó en 5 réplicas usando el instrumento BioRad CFX-96 Touch. Los cebadores y sondas usados en la PCR multiplex se describen en la Tabla 1. Cantidad de cebador por reacción: 100 nmol por secuencia por diana. Cantidad de sonda por reacción: 100 nmol de sondas STX-2,Salmonella(INV), control interno, y EAE por reacción; 250 nmol de sondas STX-1 y Listeria (HLY) por reacción.

Dianas deE. coli(STEC) (3 dianas): EAE: se identificó en 5/5 (100%) réplicas como positivas para EAE, STX-1 y STX-2: se identificó en 5/5 (100%) réplicas como positivas para STX-1 y STX-2,Salmonellaspp. (1 diana): se identificó en 5/5 (100%) réplicas como positivas para S.entérica. L. monocytogenes(1 diana): se identificó en 5/5 (100 %) réplicas como positivas paraL. monocytogenes.El control interno se identificó en 5/5 (100%) réplicas como positivas para el control interno. Fig. 23-28

Validación de lechuga (1 UFC/25g) -Control Interno

Los 3 organismos diana se inocularon en lechuga, y se incubaron simultáneamente a 4°C durante 48 horas, 0,60 UFC/25 g deE. coli O157:H7(ATCC:43895), 0,48 UFC/25 g de S.enterica(ATCC:13076), 1,00 UFC/25 g deL. monocytogenes(ATCC: 13932).

Las muestras se suspendieron entonces en un caldo base de enriquecimiento para Listeria amortiguado (sin suplementos), se digirieron durante 30 segundos, en una bolsa estomacal, la bolsa se cerró, y las muestras se incubaron durante 24 horas a 37°C. El recuento aeróbico de placa (APC) realizado en un control no inoculado indicó 4,4 x 102 bacterias nativas por gramo. El amortiguador de lisis comprendía: EDTA 8 mM, TRIS 80 mM, Triton X-100 al 4,8%, Proteinasa K al 27,5% (disolución recién preparada del catálogo de Qiagen n.° 19133), lisozima 20 mg/ml (n.° de catálogo de Amresco 0663-10G, y perlas de lisis de circonio de 100 |jm 0,88 gramos/ml (catálogo de Ops Diagnostics n.° BLBZ 100-250-14).

Para lisar las muestras, se pipetearon 100 j l de disolución de amortiguador de lisis en cada pocillo de un bloque de pocillos profundos, se añadieron 50 j l de H2O estéril a cada pocillo, se retiraron 50 j l de sobrenadante de la bolsa de enriquecimiento y se añadieron a cada pocillo. Las muestras se lisaron a 65°C durante 15 minutos, agitando a 1350 RPM. Las muestras se lisaron durante 10 minutos adicionales a 95°C, agitando a 1350 RPM, después de lo cual, el bloque de pocillos profundos se enfrió hasta temperatura ambiente. El ADN bacteriano se obtuvo mediante PCR multiplex. El protocolo de PCR de amplificación multiplex comprendió una reacción de 25 j l usando 1 j l de lisado al final del procedimiento de lisis. 30.000 copias del gen de referencia de control interno por reacción. El ciclo de PCR es el siguiente: Etapa inicial: 98°C durante 3 minutos. 2.) 95°C durante 10 segundos. 3.) 58,5°C durante 45 segundos. Vuelva a la etapa 2 y repita 49 veces. La PCR multiplex se realizó en 20 réplicas usando el instrumento BioRad CFX-96 Touch. Los cebadores y sondas usados en la p Cr multiplex se describen en la Tabla 1. Cantidad de cebador por reacción: 100 nmol por secuencia por diana. Cantidad de sonda por reacción: 100 nmol de sondas STX-2,Salmonella(INV), control interno, y EAE por reacción; 250 nmol de sondas STX-1 y Listeria (HLY) por reacción.

Dianas deE. coli(STEC) (3 dianas) EAE: se identificó en 12/20 (60 %) réplicas como positivas para EAE, STX-1 y STX-2: se identificó en 12/20 (60) réplicas como positivas para STX-1 y STX -2;Salmonellaspp. (1 diana): se identificó en 6/20 (30%) réplicas como positivas para S.enterica.; L. monocytogenes(1 diana): se identificó en 11/20 (60%) réplicas como positivas paraL. monocytogenes.Control interno se identificó en 20/20 (100%) réplicas como positivas para control interno. Fig. 29-34.

Validación de lechuga (5 UFC/25g) -Control Interno

Se inocularon 3 organismos diana en lechuga simultáneamente, y se incubaron a 4°C durante 48 horas. UFC determinadas mediante recuento de placa,E. coliinoculada en una cantidad de 3,00 UFC/25 g, S.entericainoculada en una cantidad de 2,4 UFC/25 g,L. monocytogenesinoculada en una cantidad de 5,00 UFC/25 g. Las muestras se suspendieron entonces en un caldo base de enriquecimiento para Listeria amortiguado (sin suplementos), se digirieron durante 30 segundos, en una bolsa estomacal, la bolsa se cerró, y las muestras se incubaron durante 24 horas a 37°C. El recuento aeróbico de placa (APC) realizado en un control no inoculado indicó 4,4 x 102 bacterias nativas por gramo. El amortiguador de lisis comprendía: EDTA de 8 mm, TRIS 80 mM, Triton X-100 al 4,8%, Proteinasa K al 27,5% (disolución recién preparada del catálogo de Qiagen n.° 19133), lisozima 20 mg/ml (n.° de catálogo de Amresco 0663-10G, y perlas de lisis de circonio de 100 jm 0,88 gramos/ml (catálogo de Ops Diagnostics n.° BLBZ 100-250-14).

Para lisar las muestras, se pipetearon 100 j l de disolución de amortiguador de lisis en cada pocillo de un bloque de pocillos profundos, se añadieron 50 j l de H2O estéril a cada pocillo, se retiraron 50 j l de sobrenadante de la bolsa de enriquecimiento y se añadieron a cada pocillo. Las muestras se lisaron a 65°C durante 15 minutos, agitando a 1350 RPM. Las muestras se lisaron durante 10 minutos adicionales a 95°C, agitando a 1350 RPM, después de lo cual, el bloque de pocillos profundos se enfrió hasta temperatura ambiente. El ADN bacteriano se obtuvo mediante PCR multiplex. El protocolo de PCR de amplificación multiplex comprendió una reacción de 25 j l usando 1 j l de lisado al final del procedimiento de lisis. 30.000 copias del gen de referencia de control interno por reacción. El ciclo de PCR es el siguiente: Etapa inicial: 98°C durante 3 minutos. 2.) 95°C durante 10 segundos. 3.) 58,5°C durante 45 segundos. Vuelva a la etapa 2 y repita 49 veces. La PCR multiplex se realizó usando el instrumento BioRad CFX-96 Touch. Los cebadores y sondas usados en la PCR multiplex se describen en la Tabla 1. Cantidad de cebador por reacción: 100 nmol por secuencia por diana. Cantidad de sonda por reacción: 100 nmol de sondas STX-2,Salmonella(INV), control interno, y EAE por reacción; 250 nmol de sondas STX-1 y Listeria (HLY) por reacción.

Dianas deE. coli(STEC) (3 dianas), EAE: se identificó en 4/5 (80%) réplicas como positivas para EAE, STX-1 y STX-2: se identificó en 5/5 (100%) réplicas como positivas para STX-1 y STX-2;Salmonellaspp. (1 diana): se identificó en 3/5 (60%) réplicas como positivas para S.enterica.; L. monocytogenes(1 diana): se identificó en 5/5 (100%) réplicas como positivas paraL. monocytogenes.Control interno se identificó en 5/5 (100%) réplicas como positivas para control interno. Fig. 35-40.

Inoculación de 3 UFC deListeria monocytogenes, Escherichia coli O157:H7ySalmonellaEnterica en cortes de carne cruda

Se inocularonListeria monocytogenes, Escherichia coli O157:H7ySalmonellaEnterica en cortes de carne cruda, y se incubaron simultáneamente a 4°C durante 48 horas: 3 UFC/25 g deEscherichia coli O157:H7,3 UFC/25 g de S.entericay 3 UFC/25 g deL. monocytogenes.Después, se suspendieron 25 gramos de muestra en 225 ml de Medio A o Medio B, se digirieron durante 30 segundos, en una bolsa estomacal, la bolsa se cerró, y las muestras se incubaron durante 24 horas a 37°C.

El medio A comprendía: extracto de levadura 6 g/l (Sigma Aldrich n.° de cat. 92144), digestión pancreática de caseína 17 g/l (Sigma Aldrich n.° de cat. T9410), digestión enzimática de soja 3 g/l (Sigma Aldrich n.° de cat. 70178 ), dextrosa 2,5 g/l (Sigma Aldrich n.° de cat. D9434), NaCl 5 g/l (Sigma Aldrich n.° de cat. S7653), fosfato dipotásico 2,5 g/l (Sigma Aldrich n.° de cat. P3786), fosfato potásico 1,35 g/l (Sigma Aldrich n.° de cat. p Hr 1330), fosfato disódico 9,6 g/l (Amresco n.° de cat. 0404), piruvato de sodio 1,1 g/l (Sigma Aldrich n.° de cat. P2256). Medio A pH 7,2-7,4. El medio A se llevó hasta un litro con agua destilada o agua desionizada.

El medio B comprendía: extracto de levadura 12 g/l, digestión pancreática de caseína 34 g/l, digestión enzimática de soja 6 g/l, dextrosa 5 g/l, NaCl 10 g/l, fosfato dipotásico 5 g/l, fosfato potásico 2,7 g/l, fosfato disódico 19,2 g/l, piruvato de sodio 2,2 g/l. Medio B pH 7,2-7,4. El medio B se llevó hasta un litro con agua destilada o agua desionizada.

El amortiguador de lisis comprendía: EDTA 8 mM, TRIS 80 mM, Triton X-100 al 4,8%, Proteinasa K al 27,5%, lisozima 20 mg/ml, y perlas de lisis de circonio de 100 |jm 0,88 gramos/ml. Para lisar las muestras, se pipetearon 100 |jl de disolución de amortiguador de lisis en cada pocillo de un bloque de pocillos profundos, se añadieron 50 j l de H2O estéril a cada pocillo, se retiraron 50 j l de sobrenadante de la bolsa de enriquecimiento y se añadieron a cada pocillo. Las muestras se lisaron a 65°C durante 15 minutos, agitando a 1350 RPM.

Las muestras se lisaron durante 10 minutos adicionales a 95°C, agitando a 1350 RPM, después de lo cual, el bloque de pocillos profundos se enfrió hasta temperatura ambiente. El ADN bacteriano se obtuvo mediante PCR multiplex. El protocolo de PCR de amplificación multiplex comprendió reacciones de 25 j l usando 1 j l de lisado al final del procedimiento de lisis. El ciclo de PCR es el siguiente: Etapa inicial: 98°C durante 3 minutos, 2.) 95°C durante 10 segundos, 3.) 58,5°C durante 45 segundos, 4.) Lea la placa. Vuelva a la etapa 2 y repita 29 veces. La PCR multiplex se realizó en réplicas usando el instrumento BioRad CFX-96 Touch. Los cebadores y sondas usados en la PCR multiplex se describen en la Tabla 1. Cantidad de cebador por reacción: 100 jmol por secuencia por diana.

Preparación de mezcla de PCR 25 j l

La señal deListeria monocytogenes semuestra en la Fig. 41. Ciclo de cuantificación promedio (“Cq”) del Medio A: 29,7; Cq promedio del Medio B: 29,8, como se muestra en la Fig. 41. El ciclo de cuantificación representa el ciclo en el que la señal de UFR excede el límite para la interferencia de fondo y puede considerarse una señal verdadera.

Inoculación de 15 UFC deEscherichia coli O157H7en espinacas crudas

Se inoculóEscherichia coli O157:H7en espinacas crudas, y se incubó a 4°C durante 48 horas: 15 UFC/25 g deEscherichia coli O157H7por 25 gramos de muestra se suspendieron entonces en 225 ml Medio A o Medio B, se digirieron durante 30 segundos, en una bolsa estomacal, la bolsa se cerró, y las muestras se incubaron durante 24 horas a 37°C.

El Medio A comprendía: extracto de levadura 6 g/l, digestión pancreática de caseína 17 g/l, digestión enzimática de soja 3 g/l, dextrosa 2,5 g/l, NaCl 5 g/l, fosfato dipotásico 2,5 g/l, fosfato potásico 1,35 g/l, fosfato disódico 9,6 g/l, piruvato de sodio 1, 1 g/l. El pH del medio A estaba dentro del intervalo de 7,2-7,4. El medio A se llevó hasta un litro con agua destilada o agua desionizada.

El medio B comprendía: extracto de levadura 12 g/l, digestión pancreática de caseína 34 g/l, digestión enzimática de soja 6 g/l, dextrosa 5 g/l, NaCl 10 g/l, fosfato dipotásico 5 g/l, fosfato potásico 2,7 g/l, fosfato disódico 19,2 g/l, piruvato de sodio 2,2 g/l. El pH del medio B estaba dentro del intervalo de 7,2-7,4. El medio B se llevó hasta un litro con agua destilada o agua desionizada.

Cq promedio del Medio A: 26,0 y Cq promedio del Medio B: 25,2, como se muestra en la Fig. 42.

Inoculación de 15 UFC 15 UFC deListeria monocytogenesen queso

Se inoculóListeria monocytogenesen queso, y se incubó a 4°C durante 48 horas 15 UFC/25 g deL. monocytogenes.Después, se suspendieron 25 gramos de muestra en 225 ml de Medio A o Medio B, se digirieron durante 30 segundos, en una bolsa estomacal, la bolsa se cerró, y las muestras se incubaron durante 24 horas a 37°C.

El amortiguador de lisis comprendía: EDTA 8 mM, TRIS 80 mM, Tritón X-100 al 4,8%, Proteinasa K al 27,5%, lisozima 20 mg/ml, y perlas de lisis de circonio de 100 |jm 0,88 gramos/ml. Para lisar las muestras, se pipetearon 100 |jl de disolución de amortiguador de lisis en cada pocillo de un bloque de pocillos profundos, se añadieron 50 j l de H2O estéril a cada pocillo, se retiraron 50 j l de sobrenadante de la bolsa de enriquecimiento y se añadieron a cada pocillo. Las muestras se lisaron a 65°C durante 15 minutos, agitando a 1350 RPM.

Las muestras se lisaron durante 10 minutos adicionales a 95°C, agitando a 1350 RPM, después de lo cual, el bloque de pocillos profundos se enfrió hasta temperatura ambiente. El ADN bacteriano se obtuvo mediante PCR multiplex. El protocolo de PCR de amplificación multiplex comprendió reacciones de 25 j l usando 1 j l de lisado al final del procedimiento de lisis. El ciclo de PCR es el siguiente: Etapa inicial: 98°C durante 3 minutos, 2.) 95°C durante 10 segundos, 3.) 58,5°C durante 45 segundos, 4.) Lea la placa. Vuelva a la etapa 2 y repita 29 veces. La PCR multiplex se realizó en réplicas usando el instrumento BioRad CFX-96 Touch. Los cebadores y sondas usados en la PCR multiplex se describen en la Tabla 1. Cantidad de cebador por reacción: 100 jmol por secuencia por diana. Cq promedio del Medio A: 32,1 y Cq promedio del Medio B: 29,7, como se muestra en la Fig. 43.

Inoculación de 15 UFC 15 UFC deListeria monocytogenesen salmón

Se inoculóListeria monocytogenesen salmón, y se incubó a 4°C durante 48 horas 15 UFC/25 g deL. monocytogenes.Después, se suspendieron 25 gramos de muestra en 225 ml de Medio A o Medio B, se digirieron durante 30 segundos, en una bolsa estomacal, la bolsa se cerró, y las muestras se incubaron durante 24 horas a 37°C.

El amortiguador de lisis comprendía: EDTA 8 mM, TRIS 80 mM, Triton X-100 al 4,8%, Proteinasa K al 27,5%, lisozima 20 mg/ml, y perlas de lisis de circonio de 100 jm 0,88 gramos/ml. Para lisar las muestras, se pipetearon 100 j l de disolución de amortiguador de lisis en cada pocillo de un bloque de pocillos profundos, se añadieron 50 j l de H2O estéril a cada pocillo, se retiraron 50 j l de sobrenadante de la bolsa de enriquecimiento y se añadieron a cada pocillo. Las muestras se lisaron a 65°C durante 15 minutos, agitando a 1350 RPM.

Las muestras se lisaron durante 10 minutos adicionales a 95°C, agitando a 1350 RPM, después de lo cual, el bloque de pocillos profundos se enfrió hasta temperatura ambiente. El ADN bacteriano se obtuvo mediante PCR multiplex. El protocolo de PCR de amplificación multiplex comprendió reacciones de 25 j l usando 1 j l de lisado al final del procedimiento de lisis. El ciclo de PCR es el siguiente: Etapa inicial: 98°C durante 3 minutos, 2.) 95°C durante 10 segundos, 3.) 58,5°C durante 45 segundos, 4.) Lea la placa. Vuelva a la etapa 2 y repita 29 veces. La PCR multiplex se realizó en réplicas usando el instrumento BioRad CFX-96 Touch. Los cebadores y sondas usados en la PCR multiplex se describen en la Tabla 1. Cantidad de cebador por reacción: 100 jmol por secuencia por diana. Cq promedio del Medio A: 31,0 y Cq promedio del Medio B: 26,6, como se muestra en la Fig. 44.

Validación de cortes de carne cruda (3 UFC/25 g)

Los 3 organismos diana se inocularon en cortes de carne cruda, y se incubaron simultáneamente, 2,88 UFC/25 g deE. coli O157:H7(ATCC:43895), 2,80 UFC/25 g de S.enterica(ATCC: 13076), 3,90 UFC/25 g deL. monocytogenes(ATCC: 13932).

Las muestras se enriquecieron como se describió anteriormente, y después se incubaron durante 24 horas a 37°C. El recuento aeróbico de placa (APC), realizado en un control no inoculado, indicó 1,3 * 106 bacterias nativas por gramo. Se realizó la lisis de la muestra, y se detectaron patógenos como se describió anteriormente.

Dianas deE. coli(STEC) (3 dianas) EAE: se identificó en 7/8 (87,5%) réplicas como positivas para EAE, STX-1, STX-2: se identificó en 7/8 (87,5%) réplicas como positivas para STX-1 y STX-2;Salmonellaspp. (1 diana): se identificó en 5/8 (62,50%) réplicas como positivas para S.enterica; L. monocytogenes(1 diana): se identificó en 8/8 (100%) réplicas como positivas paraL. monocytogenes.Control interno identificado detectado en todas las réplicas. Fig. 45-48.

Validación de cortes de carne cruda (15 UFC/25 g)

Los 3 organismos diana se inocularon en cortes de carne cruda, y se incubaron simultáneamente, 7,71 UFC/25 g deE. coli O157:H7(ATCC:43895), 13,0 UFC/25 g de S.enterica(ATCC: 13076), 17,25 UFC/25 g deL. monocytogenes(ATCC: 13932).

Las muestras se enriquecieron como se describió anteriormente, y después se incubaron durante 24 horas a 37°C. El recuento aeróbico de placa (APC), realizado en un control no inoculado, indicó 2,3 * 106 bacterias nativas por gramo. Se realizó la lisis de la muestra, y se detectaron patógenos como se describió anteriormente.

Dianas deE. coli(STEC) (3 dianas) EAE: se identificó en 8/8 (100%) réplicas como positivas para EAE, STX-1, STX-2: se identificó en 8/8 (100%) réplicas como positivas para STX-1 y STX-2;Salmonellaspp. (1 diana): se identificó en 8/8 (100%) réplicas como positivas para S.entérica; L. monocytogenes(1 diana): se identificó en 8/8 (100%) réplicas como positivas paraL. monocytogenes.Control interno identificado detectado en todas las réplicas. Fig. 49-51. Validación de leche (3 UFC/25 g)

Los 3 organismos diana se inocularon en leche, y se incubaron simultáneamente, 2,22 UFC/25 g deE. coli O157:H7(ATCC:43895), 2,80 UFC/25 g de S.enterica(ATCC:13076), 3,80 UFC/25 g deL. monocytogenes(ATCC: 13932). Las muestras se enriquecieron como se describió anteriormente, y después se incubaron durante 24 horas a 37°C. El recuento aeróbico de placa (APC), realizado en un control no inoculado, indicó 1,3 * 1012 bacterias nativas por gramo. Se realizó la lisis de la muestra, y se detectaron patógenos como se describió anteriormente.

Dianas deE. coli(STEC) (3 dianas) EAE: se identificó en 8/8 (100%) réplicas como positivas para EAE, STX-1, STX-2: se identificó en 8/8 (100%) réplicas como positivas para STX-1 y STX-2;Salmonellaspp. (1 diana): se identificó en 7/8 (87,5%) réplicas como positivas para S.enterica; L. monocytogenes(1 diana): se identificó en 8/8 (100%) réplicas como positivas paraL. monocytogenes.Control interno identificado detectado en todas las réplicas. Fig. 52-55. Validación de leche (15 UFC/25 g)

Los 3 organismos diana se inocularon en leche, y se incubaron simultáneamente, 14,4 UFC/25 g deE. coli O157:H7(ATCC:43895), 12,0 UFC/25 g de S.enterica(ATCC:13076), 14,25 UFC/25 g deL. monocytogenes(ATCC: 13932). Las muestras se enriquecieron como se describió anteriormente, y después se incubaron durante 24 horas a 37°C. El recuento aeróbico de placa (APC), realizado en un control no inoculado, indicó 1,2 * 1012 bacterias nativas por gramo. Se realizó la lisis de la muestra, y se detectaron patógenos como se describió anteriormente.

Dianas deE. coli(STEC) (3 dianas) EAE: se identificó en 8/8 (100%) réplicas como positivas para EAE, STX-1, STX-2: se identificó en 8/8 (100%) réplicas como positivas para STX-1 y STX-2;Salmonellaspp. (1 diana): se identificó en 8/8 (100%) réplicas como positivas para S.enterica; L. monocytogenes(1 diana): se identificó en 8/8 (100%) réplicas como positivas paraL. monocytogenes.Control interno identificado detectado en todas las réplicas. Fig. 56-59. Validación de espinacas crudas (15 UFC/25 g)

Se inocularon 14,4 UFC/25 g deE. coli O157H7(ATCC:43895) en espinacas crudas como se describió anteriormente. Las muestras se enriquecieron como se describió anteriormente, y después se incubaron durante 24 horas a 37°C. El recuento aeróbico de placa (APC), realizado en un control no inoculado, indicó 3,0 * 107 bacterias nativas por gramo. Se realizó la lisis de la muestra, y se detectaron patógenos como se describió anteriormente.E. coli:se identificó en 8/8 (100%) réplicas como positivas paraE. coliFig. 60.

Validación de Brie de Meaux (15 UFC/25 g)

Se inocularon 12,75 UFC/25 g deL. monocytogenes(ATCC: 13932) como se describió anteriormente.

Las muestras se enriquecieron como se describió anteriormente, y después se incubaron durante 24 horas a 37°C. El recuento aeróbico de placa (APC), realizado en un control no inoculado, indicó 6,0 * 104 bacterias nativas por gramo. Se realizó la lisis de la muestra, y se detectaron patógenos como se describió anteriormente.L. monocytogenesse identificó en 8/8 (100%) réplicas como positivas paraE. coliFig. 61.

Validación de salmón ahumado (15 UFC/25 g)

Se inocularon 10,8 UFC/25 g deL. monocytogenes(ATCC: 13932) como se describió anteriormente.

Las muestras se enriquecieron como se describió anteriormente, y después se incubaron durante 24 horas a 37°C. El recuento aeróbico de placa (APC), realizado en un control no inoculado, indicó 2,0 * 101 bacterias nativas por gramo. Se realizó la lisis de la muestra, y se detectaron patógenos como se describió anteriormente.L. monocytogenesse identificó en 8/8 (100%) réplicas como positivas paraE. coliFig. 62.

Validación de mantequilla de cacahuete (15 UFC/25 g)

Se inocularon 6,0 UFC/25 g de S.enterica(ATCC: 13076) como se describió anteriormente.

Las muestras se enriquecieron como se describió anteriormente, y después se incubaron durante 24 horas a 37°C. El recuento aeróbico de placa (APC), realizado en un control no inoculado, indicó 2,0 * 103 bacterias nativas por gramo.

Se llevó a cabo la lisis de la muestra, y los patógenos se detectaron como se describió anteriormente. S.entéricase identificó en 8/8 (100%) réplicas como positivas paraE. coliFig. 63.

Validación de huevos crudos (15 UFC/25 g)

Se inocularon 17,0 UFC/25 g de S.entérica(ATCC: 13076) como se describió anteriormente.

Las muestras se enriquecieron como se describió anteriormente, y después se incubaron durante 24 horas a 37°C. El recuento aeróbico de placa (APC), realizado en un control no inoculado, indicó 0,0 bacterias nativas por gramo. Se llevó a cabo la lisis de la muestra, y los patógenos se detectaron como se describió anteriormente. S.entéricase identificó en 8/8 (100%) réplicas como positivas paraE. coliFig. 64.

Validación de huevos crudos (15 UFC/25 g)

Se inocularon 20,0 UFC/25 g de S.entérica(ATCC: 13076) como se describió anteriormente.

Las muestras se enriquecieron como se describió anteriormente, y después se incubaron durante 24 horas a 37°C. El recuento aeróbico de placa (APC), realizado en un control no inoculado, indicó 4,0 * 103 bacterias nativas por gramo. Se realizó la lisis de la muestra, y los patógenos se detectaron como se describió anteriormente. S.entericase identificó en 8/8 (100%) réplicas como positivas paraE. coliFig. 65.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método, que comprende:

2. El método de la reivindicación 1, en el que la muestra comprende un alimento.

3. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que el medio rico y no selectivo comprende, por 1 litro de agua:

a. entre alrededor de 5 g/l y alrededor de 20 g/l de extracto de levadura;

b. entre alrededor de 20 g/l y alrededor de 50 g/l de digestión pancreática de caseína;

c. entre alrededor de 1 g/l y 10 g/l de digestión enzimática de soja;

d. entre alrededor de 1 g/l y alrededor de 10 g/l de dextrosa;

e. entre alrededor de 1 g/l y alrededor de 20 g/l de cloruro de sodio;

f. entre alrededor de 1 g/l y alrededor de 10 g/l de fosfato dipotásico;

g. entre alrededor de 1 g/l y alrededor de 10 g/l de fosfato potásico;

h. entre alrededor de 10 g/l y alrededor de 30 g/l de fosfato disódico; y

i. entre alrededor de 1 g/l y alrededor de 10 g/l de piruvato de sodio.

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la primera lisis de la muestra y la segunda lisis de la muestra comprenden incubar la muestra enriquecida o la porción de la misma en un amortiguador de lisis que comprende:

a. un componente amortiguador;

b. un agente quelante de metales;

c. un tensioactivo;

d. un precipitante; y

e. al menos dos restos lisantes.

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la pluralidad de patógenos comprende dos o más deEscherichia coli, Salmonella,oListeria monocytogenes.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que los pares de cebadores comprenden secuencias que tienen al menos 80% de identidad con al menos una de las secuencias:

a. AGCTCATTTCACATCGTCCATCT sentido, TCCACCATTCCCAAGCTAAACC antisentido;

b. GGCGGCCAGATTCAGCATAG sentido, GCTACCACCTTGCACATAAGC antisentido;

c. TCGCCATTCGTTGACTACTTC sentido, ACATCGCTCTTGCCACAGACT antisentido;

d. CAGTGCCCGGTGTGACAAC sentido, GACACGTTGCAGAGTGGTATAAC antisentido; y e. CGGGCATACCATCCAGAGAA sentido, CACCGTGGTCCAGTTTATCGT antisentido.