JP4674073B2 - 核酸増幅反応における阻害を回避する方法 - Google Patents
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Description
(1)菌体由来の核酸を増幅する方法において、培養法によって得られた菌体を含む増菌培養液を被検試料とし、遠心濃縮およびアルカリ処理により前記培養液中の胆汁成分を除去することによって、胆汁成分による核酸の増幅反応阻害を回避する方法。
(2)培養法が、胆汁成分を含む液体培地を使用する増菌培養法である(1)記載の方法。
(3)胆汁成分が、胆汁酸塩またはウシ胆汁末である(1)または(2)記載の方法。
(4)アルカリ処理が、pH7.5以上で行われることを特徴とする(1)記載の方法。
(5)以下の工程を含むことを特徴とする核酸増幅法。
(a)菌体を含む増菌培養液を遠心濃縮し沈殿物を得る工程、
(b)前記沈殿物にアルカリ化剤を添加し、pH7.5以上にする工程、
(c)さらに遠心分離を行って沈殿物として菌体を得る工程、
(d)前記菌体由来の核酸を増幅する工程。
(6)以下の工程を含むことを特徴とする核酸増幅法。
(a)菌体を含む増菌培養液にアルカリ化剤を添加し、pH7.5以上にする工程、
(b)さらに遠心分離を行って沈殿物として菌体を得る工程、
(c)前記菌体由来の核酸を増幅する工程。
(7)アルカリ化剤が、アルカリ金属水酸化物、アルカリ金属炭酸塩、アルカリ金属リン酸塩およびグッド緩衝剤から選ばれる少なくとも1種を成分とすることを特徴とする(5)または(6)記載の方法。
(8)核酸増幅法が、LAMP法、PCR法、ICAN法、NASBA法、LCR法、SDA法、TRC法およびTMA法よりなる群から選ばれたいずれかの方法であることを特徴とする(5)または(6)記載の方法。
(1)試料の調製
もやし25gにノボビオシン加mEC培地225mLを加えて、室温で1分間ストマッカー処理した後、42℃で18時間培養し10%もやし食材液を得た。この食材液に、腸管出血性大腸菌O157:H7( Escherichia coli ATCC43889 )(以下「 E. coli 」と略)を各々1.5×102〜4cfu/mLの濃度になるように添加して菌希釈液を作製した。菌希釈液50μLを0.2mL容PCRチューブ(以下「PCRチューブ」と略)に採取し、次いで0.05mol/L水酸化ナトリウム水溶液(以下「NaOH水溶液」と略)50μL添加し、95℃で5分間加熱処理した後、0℃に冷却した。さらに、遠心機プチはち Model 2816 型( WAKEN社製 )を用いて、25℃、6,000rpm、1分間の条件で遠心処理を行い、再度0℃に冷却して得られた上清を試料とした。
(2)核酸増幅反応
試料5μLを、Loopamp(商標登録)腸管出血性大腸菌検出試薬キット( 栄研化学株式会社製 )から調製したLAMP反応試薬20μL( Reaction Mix.VT 20μLと Bst DNA polymerase 1μLの混合溶液から20μL分注した溶液 )に添加し、リアルタイム濁度測定計 LA-320C( テラメックス社製 )(以下「 LA-320C 」と略)を用い、波長650nmおける濁度(吸光度)変化を指標として、65℃、1時間LAMP反応を行った。
(1)試料の調製
実施例1(1)同様に、10%もやし食材液を調製し、3濃度の菌希釈液を作製した。この菌希釈液1mLを、小型微量遠心機 PMC-060 型( TOMY社製 )(以下「遠心機A」と略)を用いて、25℃、2,000×g、10分間の条件で遠心処理し、上清を除去後、得られた沈殿物に0.5mol/L EDTAを含む1mol/L Tris・HCl緩衝液(pH8.0)(以下「TE緩衝液」と略)10μLおよびNaOH水溶液10μLを添加し、よく攪拌した。全量をPCRチューブに移し、実施例1(1)での加熱処理以降と同様の操作を行って得られた上清を試料とした。
(2)核酸増幅反応
実施例1(2)に準じて、LAMP反応を行った。
(1)試料の調製
培地成分として汎用されており、かつ増幅反応の阻害が予測される胆汁成分として胆汁酸塩またはウシ胆汁末を選び、各胆汁成分のLAMP反応時の最終濃度が0〜20mg/mL、さらに各濃度の水溶液に鋳型核酸として E. coliを、7.5×104cfu/testの濃度となるように添加し、被検試料を調製した。
(2)核酸増幅反応
試料5μLを、Loopamp(商標登録)腸管出血性大腸菌検出試薬キット( 栄研化学株式会社製 )から調製したLAMP反応試薬20μL( Reaction Mix.VT 20μLと Bst DNA polymerase 1μLの混合溶液から20μL分注した溶液で、蛍光色素オキサゾールイエロー0.625μg/mLを含む)に添加し、蛍光検出計 ABI PRISM 7000 Sequence Detection System( Applied Biosystems社製 )を用いて、65℃、2時間LAMP反応を行った。なお、実施例1および2では、LAMP反応への阻害を、増幅反応の副生成物であるピロリン酸マグネシウムの生成に伴う濁度の検出によって評価した。しかし、阻害が、増幅反応そのものより、濁度の生成速度に影響を及ぼしている可能性も考えられたため、実施例3では、主生成物である核酸増幅産物を指標とした蛍光法を採用した。
(1)試料の調製
遠心濃縮を2回行う方法を検討した。まず、実施例1(1)同様に10%もやし食材液を調製した。この食材液に、 E. coli が3.5×104cfu/mLの濃度になるように添加して菌希釈液を作製した。菌希釈液1mLを、遠心機Aを用いて、25℃、2,000×g、10分間の条件で遠心処理し、上清を除去後、得られた沈殿物にTE緩衝液、NaOH水溶液、蒸留水または生理食塩水1mLを加え、よく攪拌洗浄した。さらに遠心機Aを用いて、同条件で遠心処理を行い、上清を除去後、沈殿物を回収した。各洗浄液によって得られた沈殿物に、TE緩衝液10μLおよびNaOH水溶液10μLを添加し、よく攪拌、懸濁し、全量をPCRチューブに移し、実施例1(1)での加熱処理以降と同様の操作を行って得られた上清を試料とした。
(2)比較対照試料の調製
実施例2に準じ、沈殿物の洗浄工程を省いて得られた試料を比較対照とした。
(3)核酸増幅反応
実施例1(2)に準じて、LAMP反応を行った。
(1)試料の調製
実施例4同様に、遠心濃縮を2回行う方法を検討した。鶏挽肉25gにEEM培地225mLを加えて、室温で1分間ストマッカー処理後、35℃18時間培養して10%鶏挽肉食材液を得た。この食材液に、サルモネラ属菌( Salmonella enteritidis ATCC13076 )(以下「Sal.」と略)を3.5×104cfu/mLの濃度になるように添加して菌希釈液を作製した。菌希釈液1mLについて、実施例4(1)の遠心後と同様の操作を行って得られた上清を試料とした。なお、洗浄液には、NaOH水溶液のみを使用した。
(2)比較対照試料の調製
実施例2に準じ、沈殿物の洗浄工程を省いて得られた試料を比較対照とした。すなわち、実施例5(1)同様の10%鶏挽肉食材液を調製し、Sal. が3.5×104cfu/mLの濃度になるように添加して菌希釈液を作製した。この菌希釈液1mLを、遠心機Aを用いて、25℃、2,000×g、10分間の条件で遠心処理し、上清を除去後、得られた沈殿物にTE緩衝液10μLおよびNaOH水溶液10μLを添加し、よく攪拌、懸濁し、全量をPCRチューブに移し、実施例1(1)での加熱処理以降と同様の操作を行って得られた上清を比較対照試料とした。
(3)核酸増幅反応
試料5μLを、Loopamp(商標登録)サルモネラ検出試薬キット( 栄研化学株式会社製 )から調製したLAMP反応試薬20μL( Reaction Mix.Sal 20μLと Bst DNA polymerase 1μLの混合溶液から20μL分注した溶液 )に添加し、LA-320Cを用いて、波長650nmおける吸光度(濁度)変化を指標として、65℃、1時間LAMP反応を行った。
(1)試料の調製
遠心濃縮を1回行う方法を検討した。実施例1(1)同様に10%もやし食材液を調製した。この食材液に、 E. coli が3.5×104cfu/mLの濃度になるように菌体を添加して菌希釈液を作製した。この菌希釈液1mLに、NaOH水溶液を各々0.25、0.5、0.6または1mLを添加し、さらに、遠心機Aを用いて、25℃、2,000×g、10分間の条件で遠心処理し、上清を除去後、沈殿物を回収した。沈殿物にTE緩衝液10μLを添加し懸濁させた。この懸濁液全量をPCRチューブに移し、さらにNaOH水溶液10μLを添加した後、実施例1(1)での加熱処理以降と同様の操作を行って得られた上清を試料とした。
(2)比較対照試料の調製
実施例6(1)で、NaOH水溶液無添加のものを比較対照試料とした。
(3)核酸増幅反応
実施例1(2)に準じて、LAMP反応を行った。
(1)試料の調製
実施例6(1)同様に菌希釈液を作製した。この菌希釈液1mLのpHが〜8.0になるようにTE緩衝液を添加し、さらに、遠心機Aを用いて、25℃、2,000×g、10分間の条件で遠心処理し、上清を除去後、沈殿物を回収した。沈殿物にTE緩衝液10μLを添加し懸濁させた。この懸濁液全量をPCRチューブに移し、さらにNaOH水溶液10μL添加した後、実施例1(1)での加熱処理以降と同様の操作を行って得られた上清を試料とした。
(2)比較対照試料の調製
実施例7(1)で、TE緩衝液無添加のものを比較対照試料とした。
(3)核酸増幅反応
実施例1(2)に準じて、LAMP反応を行った。
(1)試料の調製
貝割れ大根25gにノボビオシン加mEC培地225mLを加えて、室温で1分間ストマッカー処理後、42℃18時間培養して10%貝割れ大根食材液を得た。この食材液に、 E. coli を各々2.4×102〜5cfu/mLの濃度になるように添加して菌希釈液を作製した。実施例6に準じ、培地にアルカリ化剤を添加後遠心処理を行って培地中の胆汁成分を除去した方法(1ステップ遠心濃縮法)によって得られたものを試料とした。
(2)比較対照試料の調製
LAMP用は、実施例1に準じ、特に培地中の胆汁成分を除去しない方法によって得られた試料を比較対照とした。また、PCR用は、菌希釈液10μLを0.5mL容PCRチューブに採取し、次いでTE緩衝液90μL添加し、95℃で5分間加熱処理した後、0℃に冷却した。さらに、遠心機 Centrifuge 5414 R(ローターNo. F45-36-8、eppendorf社製 )を用いて、4℃、12,000rpm、10分間の条件で遠心処理を行い、再度0℃に冷却して得られた上清を比較対照試料とした。
(3)核酸増幅反応
実施例1(2)に準じて、LAMP反応を行った。なお、反応時間は2時間とした。また、PCR反応は、試料5μLを、PCR反応試薬45μLに添加し、熱変性94℃で1分、アニーリング55℃で1分、ポリメラーゼ伸長反応72℃で1分(最終サイクル10分)を1サイクルとして計35サイクルの条件で、行った。反応装置は、T3 Thermocycler( Biometra 社製 )を使用した。反応終了後、反応液3.5μLについて1%アガロースゲル電気泳動を行い、反応産物の確認を行った。
Claims (4)
- 菌体由来の核酸を増幅する方法において、培養法によって得られた菌体を含む増菌培養液を被検試料とし、遠心濃縮およびアルカリ処理により前記培養液中の胆汁成分を除去することによって、胆汁成分による核酸の増幅反応阻害を回避する方法。
- 培養法が、胆汁成分を含む液体培地を使用する増菌培養法である請求項1記載の方法。
- 胆汁成分が、胆汁酸塩またはウシ胆汁末である請求項1または2記載の方法。
- アルカリ処理が、pH7.5以上で行われることを特徴とする請求項1記載の方法。
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