CN103484546B - 十四种食源性致病菌多重pcr检测引物组和试剂盒 - Google Patents

十四种食源性致病菌多重pcr检测引物组和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种十四种食源性致病菌多重PCR检测引物组和试剂盒。其检测引物组由检测沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌、空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、单核细胞增生性李斯特氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、阪崎肠杆菌、大肠埃希氏菌、霍乱弧菌、大肠埃希氏菌O157、嗜水气单胞菌和阳性内对照的引物对组成。本发明建立一种基于普通PCR平台的多重PCR检测方法，利用分析设计得到的所述引物对，对待测样品中提取的细菌的基因组DNA，在同一反应体系中进行多重PCR反应，通过对反应产物的电泳分析来判定样品中是否含有上述食源性致病菌。

Description

十四种食源性致病菌多重PCR检测引物组和试剂盒
技术领域
本发明属微生物检测领域，涉及十四种食源性致病菌多重快速PCR检测引物组和试剂盒。
背景技术
食源性致病微生物是引起食物中毒的重要生物学因素。随着国家对食品安全工作的重视，快速筛查食物中毒原因成为当务之急。本发明试剂盒的设计可用于筛查常见的引起腹泻的食源性微生物，它们包括沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌、空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、单核细胞增生性李斯特氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、阪崎肠杆菌、大肠埃希氏菌、霍乱弧菌、大肠埃希氏菌O157和嗜水气单胞菌，共十四种食源性致病微生物，检测样品来自于临床标本或者污染食物样本的增菌液。
本发明基于多重PCR原理，可在1-2个PCR反应中完成对上述十四种食源性致病菌的快速筛查，节约了操作时间和操作人力，极大地提高了食物中毒事件中实验室的检测能力。
目前，没有相似的试剂盒能做到同时筛查十四种常见食源性致病微生物，只能采用实时荧光PCR、普通PCR方法、免疫学方法（如酶联免疫吸附法（ELISA）、免疫胶体金法）对十四种致病微生物单个目标依次检测。这些单重检测方法共同的问题是缺少全套的可供使用的检测试剂以实现对十四种食源性致病微生物的筛查；使用单重检测方法逐个操作，配置反应体系数目多，要消耗大量的试剂、人力、物力和时间。免疫胶体金方法检测灵敏度和特异性较低。ELISA方法操作过程复杂，检测手段不够灵活，很难应对应急处置等场景的快速筛查。
与本发明相类似的检测方法有基于液相芯片检测平台的多重PCR技术、基于双探针杂交的multifinder多重PCR技术和基于arm-PCR原理的多重PCR技术等。这些技术与本发明的相同之处都采用了多重PCR技术，即在同一个反应体系内同时扩增多个目标片段，以达到节省时间、人力、试剂和样本的目标。
基于液相芯片检测平台的多重PCR技术、基于双探针杂交的multifinder多重PCR技术均可以实现对多个检测目标的快速筛查，但目前基于这些技术均没有检测十四种食源性致病微生物的试剂盒研发成功。且基于液相芯片检测平台的多重PCR技术在一个PCR反应管中分两步进行PCR反应，第一轮PCR低浓度特异性引物设计导致PCR反应的灵敏度显著降低，从而影响整个检测试剂的灵敏度；多色微球标记检测PCR产物技术存在稳定性差的问题。且仪器的购置费用高，试剂耗材昂贵。
基于双探针杂交的multifinder多重PCR技术使用相邻的两个特异性探针杂交，提高检测特异性的同时影响了筛查的灵敏度，容易产生假阴性结果；该技术采用一代测序平台检测PCR产物，如ABI3130，ABI3500等，试剂耗材昂贵；检测过程经过核酸提取、双探针杂交、探针连接、PCR扩增、产物分析等步骤，操作比较繁琐，对操作人员的技术要求非常高，需要掌握一代测序平台的使用。
基于arm-PCR原理的多重PCR技术，虽然解决了操作自动化和产物污染的问题，但是该技术投入较大，耗材昂贵。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种多重PCR检测十四种食源性致病菌的引物组和试剂盒，可快速筛查上述十四种食源性致病菌，建立一种基于普通PCR平台的多重PCR检测方法。
为了实现本发明目的，本发明首先提供了设计和筛选特异性引物的技术方案及一种多重PCR检测食源性致病菌的引物组：
1、构建阳性内对照(IAC)扩增引物和模板
以pET28a质粒为模板设计一对引物，扩增其中的1176bp大小的片段，作为检测的IAC。IAC上游引物序列为5’-TGCAGGTCGACTCTAGAGGA-3’，IAC下游引物的序列为5’-TTCGAGCTCGGTACCCGGGGA-3’。pET28a的碱基序列如SEQ IDNo.31所示。
2、筛选不同细菌特异性的基因或者DNA片段用于引物设计
本发明通过文献分析和检测需求分析，获得了每一种致病菌候选扩增的基因或者DNA片段（见表1）。
表1十四种常见食源性致病菌多重PCR检测候选目标基因
目标微生物 候选扩增基因
沙门氏菌 invA
志贺氏菌 ipaH
副溶血性弧菌 toxR+toxS
空肠弯曲菌 hipO
结肠弯曲菌 cdtA
金黄色葡萄球菌 nuc
蜡样芽孢杆菌 groB
单核细胞增生性李斯特氏菌 hly
小肠结肠炎耶尔森氏菌 16S rRNA
阪崎肠杆菌 zpx
大肠埃希氏菌 uidA
霍乱弧菌 hlyA
大肠埃希氏菌O157 rfbEO157
嗜水气单胞菌 aha1
注：uidA基因在大肠埃希氏菌和志贺氏菌均有扩增。
3、引物候选方案设计
本发明使用primer premier6软件针对所有扩增目标候选基因或者片段设计1-2套备用方案。
4、对扩增目标基因的引物候选方案进行Blast分析
在Genbank中对所有引物候选方案进行Blast分析，获得特异性较高的引物方案作为实验验证用方案，每一种致病菌可能会选择多个扩增目标，每个扩增目标会有1-2个实验验证方案。
5、对每一个可用实验验证方案进行单重PCR验证，确定引物的可用性，包括特异性评估和敏感性评估。
6、将所有扩增目标的引物混合进行多重PCR，验证引物共同扩增时的可用性，对不能工作的引物需要按照步骤2-4重复设计新的引物进行替换。最终获得本发明提供的一套特异的引物序列（详见表2）。
表2十四种常见食源性致病菌多重PCR检测引物组
注：虽然所选检测目标的基因或者DNA片段为保守区域，但仍有个别碱基***或缺失的可能型，PCR产物的大小也会随之增加或减少几个bp，不影响结果的判断。
基于上述技术方案，本发明提供了一种多重PCR检测食源性致病菌的引物组，其是由检测沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌、空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、单核细胞增生性李斯特氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、阪崎肠杆菌、大肠埃希氏菌、霍乱弧菌、大肠埃希氏菌O157和嗜水气单胞菌的引物对组成；
所述检测金黄色葡萄球菌引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示；
所述检测大肠埃希氏菌O157引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示；
所述检测沙门氏菌引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示；
所述检测志贺氏菌引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示；
所述检测阪崎肠杆菌引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10所示；
所述检测霍乱弧菌引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12所示；
所述检测小肠结肠炎耶尔森氏菌引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14所示；
所述检测结肠弯曲菌引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16所示；
所述检测嗜水气单胞菌引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18所示；
所述检测副溶血性弧菌引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20所示；
所述检测蜡样芽孢杆菌引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22所示；
所述检测大肠埃希氏菌引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.24所示；
所述检测单核细胞增生性李斯特氏菌引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.26所示；
所述检测空肠弯曲菌引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.28所示。
本发明还提供了一种对14种食源性致病菌进行多重PCR检测的方法，将所述引物组与待测样品的DNA进行多重PCR反应，反应结束后对PCR反应产物进行电泳分析以确定样品中是否含有上述14种食源性致病菌。
进一步地，在进行多重PCR反应时，反应体系中还加入阳性内对照引物对和相应的模板。
所述阳性内对照引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQID NO.29和SEQ ID NO.30所示。
该方法能全面快速筛检沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌、空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、单核细胞增生性李斯特氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、阪崎肠杆菌、大肠埃希氏菌、霍乱弧菌、大肠埃希氏菌O157、嗜水气单胞菌共十四种，其技术方案具体如下：
1、引物合成
按照表2中的引物序列，在基因合成公司合成所有引物的寡聚核苷酸序列。
2、DNA模板提取
选择沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌、空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、单核细胞增生性李斯特氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、阪崎肠杆菌、大肠埃希氏菌、霍乱弧菌、大肠埃希氏菌O157、嗜水气单胞菌作为建立检测方法的目标微生物，分别按照国标或者行业标准方法对十四种微生物进行增菌培养，将十四种模板的菌液浓度调整至108CFU/mL，采用细菌基因组提取试剂盒提取DNA模板。
3、使用普通PCR平台构建多重PCR检测体系
在确定多重反应体系中引物序列后，还需要从引物浓度、退火温度、反应体系配置、反应条件等方面分别进行优化。反应体系的配置如下：
Taq DNA聚合酶1-2U，5×PCR buffer（Tris·HCl 100mM(PH8.3)，KCl 250mM，tween-200.2%）5ul，10mm的dNTP0.5-1.5ul，25mM的MgCl21-5ul，引物混合物2.5ul(包括特异性引物和IAC引物，每个待测目标的引物浓度0.4um-4um)，pET28a0.0001-0.01ng（作为IAC模板），DNA模板2-5ul，超纯水补至25ul。
所述引物混合物为表2中15种引物对的混合物。
多重体系的反应条件如下：
a：95℃4min；
b：95℃15-60S，
c：55-65℃15-60s，
d：72℃30-120s，b-d循环30-40个反应；
e：72℃5-10min。
4、多重PCR产物分析和结果判定
将5ul多重PCR产物进行电泳分析PCR产物片段大小，根据片段大小对照表2判定扩增目标基因的情况。
5、检测体系的验证
针对已经建立的十四种常见食源性致病微生物的多重PCR检测方法进行特异性验证和敏感性验证。
特异性验证：选用河弧菌、炭疽芽孢杆菌、韦氏芽孢杆菌、绵羊李斯特氏菌、百日咳杆菌、军团菌、链球菌等作为特异性评估用菌株，进行核酸提取，采用前期建立和优化的反应条件，应用本发明检测试剂进行检测。
结果表明IAC（阳性内对照）均为阳性。除IAC外，阴性对照和特异性验证菌株无非特异性条带扩增，重复检测结果全部一致，表明该检测方法具有较好的特异性，能够将非目标菌有效区分开。
敏感性验证：对初始浓度为108CFU/mL的14种目标菌DNA分别稀释到107CFU/mL，106CFU/mL，105CFU/mL，104CFU/mL。采用前期建立和优化的反应条件进行检测，每种目标菌的检测限均可达到105CFU/mL，重复检测结果全部一致，表明该检测方法具有高度的敏感性和良好的重复性。
本发明还提供了一种快速检测试剂盒，所述试剂盒包括前述引物组、阳性内对照引物对、阳性内对照模板、DNA聚合酶、5×PCR缓冲液、Mg2+、dNTP、阳性对照和去离子水。
本发明的有益效果在于：
本发明建立的多重食源性致病微生物检测方法，能够克服其他技术手段的不足之处，达到以下的检测效果：
（一）多重检测
本发明所建立的检测方法能够在1-2个PCR反应中同时筛查包括沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌、空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、单核细胞增生性李斯特氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、阪崎肠杆菌、大肠埃希氏菌、霍乱弧菌、大肠埃希氏菌O157、嗜水气单胞菌的十四种常见食源性致病微生物，全面涵盖了食品安全筛查常见和重要的致病微生物，快速获得检测结果，节省时间、人力和物力成本。
（二）特异性高
本发明所建立的检测方法特异性主要体现在一整套引物的特异性，所有引物都经过Blast比对分析，具有高度的保守性和特异性；同时经过特异性验证，能够很好的区分与检测目标种属相近、生存环境相同的细菌，包括河弧菌、炭疽芽孢杆菌、韦氏芽孢杆菌、绵羊李斯特氏菌、百日咳杆菌、军团菌、链球菌等，证明检测方法具有高度的特异性，能够将非目标细菌准确分辨出来。
（三）灵敏度高
本发明所建立的检测方法能够实现14个目标菌的同时筛检，在每一个反应体系中每个目标菌的检测灵敏度可达到105CFU/mL。
（四）成本较低
本发明所建立的多重PCR检测方法在操作性上降低了人力成本和时间成本，原来单重检测需要14次人工和14倍时间，现在使用此方法只需要1次人工和1次反应的时间；该多重检测方法同时节省了重复检测同一个样本的试剂消耗，最大可节省50%以上的试剂成本。
（五）预防假阴性结果
体系中添加的IAC引物和对应的模板，可以有效的提示假阴性检测结果。
本发明为多种常见食源性致病微生物的快速检测提供了完备的解决方案，能实现食物中毒事件发生后的快速应急检测，为尽快处置疫情节省宝贵的时间。
综上所述，本发明提供一种多重PCR检测十四种常见食源性致病菌的引物组，并建立一种基于普通PCR平台的多重PCR检测方法。本发明采用高灵敏度和特异性的引物序列，保证检测结果的质量；该检测方法操作简单，省时省力；检测通量高，试剂耗材成本低；可以对样本的增菌液进行检测，相比较于传统检测方法，将能够提前24-48小时锁定可疑致病菌；对检测平台和检测人员的要求低，能够在检验检疫第一线广泛推广。
附图说明
图1为本发明实施例2中特异性分析的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果；
其中：M:100bp DNA marker；1.invA-1；2.invA-2；3.invA-3；4.阳性对照。
图2为本发明实施例2中敏感性评估的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果；
其中：M:100bp DNA marker；1.invA-1；2.invA-2；3.invA-3。
图3为本发明所述十四种食源性致病微生物多重PCR检测qiaxcel电泳结果；
其中：1.金黄色葡萄球；2.大肠埃希氏菌O157；3.沙门氏菌；4.志贺氏菌；5.阪崎肠杆菌；6.霍乱弧菌；7.小肠结肠炎耶尔森氏菌；8.结肠弯曲菌；9.嗜水气单胞；10.副溶血性弧菌；11.蜡样芽孢杆菌；12.大肠埃希氏菌；13.单核细胞增生性李斯特氏菌；14.空肠弯曲菌；15.阳性对照(14种模板混合)；16.空白对照。
图4为本发明所述十四种食源性致病微生物多重PCR检测琼脂糖凝胶电泳结果；
其中：M:100bp marker；A1.金黄色葡萄球菌；A2.沙门氏菌；A3.阪崎肠杆菌；A4.小肠结肠炎耶尔森氏菌；A5.嗜水气单胞；A6.蜡样芽孢杆菌；A7.单核细胞增生性李斯特氏菌；B1.大肠埃希氏菌O157；B2.志贺氏菌；B3.霍乱弧菌；B4.结肠弯曲菌；B5.副溶血性弧菌；B6.大肠埃希氏菌；B7.空肠弯曲菌；blank.空白对照。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1沙门氏菌的引物设计与合成
在Genbank中下载沙门氏菌invA基因的全长序列65条，把65条invA基因全长序列导入Mega4软件中，使用alignment功能比对分析invA基因的保守序列，获得保守序列区段，碱基序列如序列表SEQ IDNo.32所示。
把上述invA基因的保守序列输入primer premier6软件中，自动分析获得多种引物设计方案。在此基础上手动调节引物位置和序列长度，将Tm值设定为55±5℃，GC含量35%～60%，尽可能不产生发夹结构和引物二聚体，无错误引发产生。将上述手动调节获得的引物设计方案在NCBI网站上进行Blast分析，如果其中任何引物对与非目标菌存在交叉反应，需要重新调整引物的位置和序列长度，直至获得高特异性的invA基因引物序列。最终获得如表3的三种invA基因引物备选方案。
表3invA基因引物备选方案
引物编号 上游序列（5’-3’） 下游序列（5’-3’） 扩增长度（bp）
invA-1 TTATTGGCGATAGCCTGGC AATACCGGCCTTCAAATC 173
invA-2 ATGGGGTCGTTCTACATTG GCTATCGCCAATAACGAATT 174
invA-3 CCGGKGAAATTATCGCCA GTTTACCGGGCATACCAT 171
其他基因的引物设计方法与invA基因相同。获得的引物备选方案均在invitrogen公司合成。
实施例2沙门氏菌引物筛选试验
特异性评估的细菌组：包括志贺氏菌、副溶血性弧菌、空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、单核细胞增生性李斯特氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、阪崎肠杆菌、大肠埃希氏菌、霍乱弧菌、大肠埃希氏菌O157、嗜水气单胞菌等十四种试剂盒内的检测目标菌，还包括与检测目标种属相近、生存环境相同的细菌，如河弧菌、炭疽芽孢杆菌、韦氏芽孢杆菌、绵羊李斯特氏菌、百日咳杆菌、军团菌、链球菌等7种。
对上述细菌采用细菌基因组提取试剂盒获得DNA模板备用。将提取的模板各取5ul混匀，作为特异性验证的模板。
沙门氏菌的特异性分析试验：使用实施例1中设计完成的引物对，按照如下项目配置PCR反应体系：Taq DNA聚合酶0.4ul（5U/ul），5×PCR buffer（Tris·HCl 100mM(PH8.3)，KCl 250mM，tween-200.2%）5ul，dNTP0.75ul（10mM），MgCl24ul（25mM），每对引物1ul（20uM）；特异性验证DNA模板5ul，去离子水补至25ul。按照如下反应条件进行PCR扩增：
a：95℃4min；
b：95℃30s，
c：62℃30s，
d：72℃45s，b-d循环30个反应。
PCR扩增产物5ul使用2%琼脂糖凝胶电泳分析结果如图1所示。由图1可知，在阳性对照（加入沙门的引物和模板）成立的前提下，设计的三条沙门氏菌引物invA-1、invA-2和invA-3与志贺氏菌、副溶血性弧菌、空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、单核细胞增生性李斯特氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、阪崎肠杆菌、大肠埃希氏菌、霍乱弧菌、大肠埃希氏菌O157、嗜水气单胞菌、河弧菌、炭疽芽孢杆菌、韦氏芽孢杆菌、绵羊李斯特氏菌、百日咳杆菌、军团菌、链球菌等生境相似、高频并存的菌均无交叉反应。因此可认为，三条引物invA-1、invA-2和invA-3均具有较好的特异性。
敏感性评估：选择1株沙门氏菌的模板，其初始浓度大约为107CFU/mL，梯度稀释到105CFU/mL，作为invA基因扩增引物敏感性评估的模板。体系配置如下：Taq DNA聚合酶0.4ul（5U/ul），5×PCRbuffer（Tris·HCl 100mM(PH8.3)，KCl250mM，tween-200.2%）5ul，dNTP0.75ul（10mM），MgCl24ul（25mM），每对引物1ul（20uM）；沙门氏菌模板2ul，去离子水补至25ul。PCR反应条件同特异性实验。
PCR扩增产物5ul使用2%琼脂糖凝胶电泳分析结果如图2所示。由图2可以看出，三个引物对均可以达到105CFU/mL，其中引物对invA-3的条带亮度最高，其次是invA-1，invA-2。
综合敏感性和特异性的评估结果，选择invA-3作为invA基因扩增的引物。
其他基因的评估方法与沙门氏菌invA基因相同。
实施例314种常见食源性致病微生物多重PCR检测试剂盒的组建
该试剂盒由2×反应体系缓冲液、DNA聚合酶、10×引物混合液、阳性对照、去离子水构成，其具体组分如下：2×PCR Buffer（Tris·HCl 40mM(PH8.3)，KCl 100mM，tween-200.08%，0.0006ng/ulpET28a，1mm dNTP、8mm MgCl2）；25×DNA聚合酶：2U/ul；10×引物混合液（包括特异性引物和IAC引物，根据检测目的和电泳平台确定引物混合液的种类和管子数目）、阳性对照（14种食源性致病菌混合模板，每种106CFU/ml）。
试剂盒检测的反应体系为25ul，其配置如下：2×PCR Buffer12.5ul；25×DNA聚合酶1ul；10×引物混合液（根据检测目的和电泳平台确定引物混合液的种类和管子数目）2.5ul；模板2ul，去离子水7ul。
实施例4试剂盒的操作和结果判断（依据qiaxcel全自动核酸蛋白电泳平台）
1、基因组的提取
1-2mL细菌增菌液或者悬浊液，按照细菌基因组提取试剂盒说明书提取模板DNA。
2、反应体系的配制
试剂盒组建：该试剂盒由2×反应体系缓冲液、DNA聚合酶、10×引物混合液、阳性对照、去离子水构成，其具体组分如下：反应体系缓冲液：2×PCR Buffer（Tris·HCl 40mM(PH8.3)，KCl100mM，tween-200.08%，0.0006ng/ul pET28a，1mm dNTP，8mm MgCl2）；25×DNA聚合酶：2U/ul；10×引物混合液（14种食源性致病菌引物和IAC引物混合液，每种终浓度2um）；阳性对照（十四种食源性致病菌的混合模板，每种106CFU/ml）。
取200ul的PCR管配置25ul的反应体系，其配置如下：2×PCRBuffer12.5ul；25×DNA聚合酶1ul；10×引物混合液（14种食源性致病菌引物和IAC引物混合液，每种终浓度2um）2.5ul，模板2ul，去离子水7ul。
3、PCR反应
将PCR管放入Bio-Rad C1000型PCR仪中，开启热盖后，按照如下程序进行PCR反应：95℃4min；95℃30s，62℃30s，72℃90s，30个循环；72℃5min。
4、qiaxcel全自动核酸蛋白电泳平台分析PCR产物
5、结果判断
PCR扩增结果如图3所示，由图3可知，包括空白对照在内的所有泳道均至少有一个条带扩增，空白对照（16泳道）有IAC的扩增，其他检测有目标条带和（或）IAC的扩增，表明所有PCR反应均成立，排除假阴性的结果。否则视实验无效，需要重复。
在IAC扩增的基础上，第1泳道还出现117bp扩增条带，表明该菌株是金黄色葡萄球菌，第2泳道还出现142bp和601bp的扩增条带，表明该菌株是大肠埃希氏菌O157血清型；第3泳道还出现171bp扩增条带，表明该菌株是沙门氏菌；第4泳道还出现210bp和601bp的扩增条带，表明该菌株是志贺氏菌；第5泳道还出现253bp扩增条带，表明该菌株是阪崎肠杆菌；第6泳道还出现262bp扩增条带，表明该菌株是霍乱弧菌；第7泳道还出现315bp扩增条带，表明该菌株是小肠结肠炎耶尔森氏菌；第8泳道还出现385bp扩增条带，表明该菌株是结肠弯曲菌；第9泳道还出现407bp扩增条带，表明该菌株是嗜水气单胞；第10泳道还出现478bp扩增条带，表明该菌株是副溶血性弧菌；第11泳道还出现515bp扩增条带，表明该菌株是蜡样芽孢杆菌；第12泳道还出现601bp扩增条带，表明该菌株是大肠埃希氏菌；第13泳道还出现700bp扩增条带，表明该菌株是单核细胞增生性李斯特氏菌。第14泳道还出现980bp扩增条带，表明该菌株是空肠弯曲菌；第15泳道出现15条特异性条带的扩增，对应着14个检测目标和一条IAC的扩增；低16泳道为空白对照，只有IAC扩增。
实施例5在普通琼脂糖凝胶电泳对试剂盒多重检测试验
检测样本：选择沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌、空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、单核细胞增生性李斯特氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、阪崎肠杆菌、大肠埃希氏菌、霍乱弧菌、大肠埃希氏菌O157、嗜水气单胞菌共十四种病原体基因组DNA作为试验的模板，每种模板的浓度大约为105CFU/ml。试剂盒组建：该试剂盒由2×反应体系缓冲液、DNA聚合酶、10×引物混合液A、10×引物混合液B、阳性对照、去离子水构成，其具体组分如下：反应体系缓冲液：2×PCR Buffer（Tris·HCl 40mM(PH8.3)，KCl100mM，tween-200.08%，0.0006ng/ul pET28a，1mm dNTP，8mmMgCl2）；25×DNA聚合酶：2U/ul；10×引物混合液A（含有金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、坂崎肠杆菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、嗜水气单胞、腊样芽孢杆菌、单核细胞增生性李斯特氏菌和IAC引物，每种终浓度均为0.2um）和10×引物混合液B（含大肠埃希氏菌O157、志贺氏菌、霍乱弧菌、结肠弯曲菌、副溶血性弧菌、大肠埃希氏菌、空肠弯曲菌和IAC引物，每种终浓度均为0.2um）；阳性对照（十四种食源性致病菌的混合模板，每种106CFU/ml）。
试剂盒操作：按照实施例4操作试剂盒。
多重检测实验结果如图4所示。
由图4可知：包括空白对照在内的所有泳道均至少有一个条带扩增，空白对照有IAC的扩增，其他检测有目标条带或IAC的扩增。表明所有PCR反应***均成立，排除假阴性的结果。在IAC扩增的基础上A1泳道还出现117bp扩增条带，表明该菌株是金黄色葡萄球菌；A2还出现171bp扩增条带，表明该菌株是沙门氏菌；A3泳道还出现253bp扩增条带，表明该菌株是阪崎肠杆菌；A4泳道还出现315bp扩增条带，表明该菌株是小肠结肠炎耶尔森氏菌；A5泳道还出现407bp扩增条带，表明该菌株是嗜水气单胞；A6泳道还出现515bp扩增条带，表明该菌株是蜡样芽孢杆菌；A7泳道还出现700bp扩增条带，表明该菌株是单核细胞增生性李斯特氏菌。
B1泳道还出现142bp和601bp的扩增条带，表明该菌株是大肠埃希氏菌O157血清型；B2泳道还出现210bp和601bp的扩增条带，表明该菌株是志贺氏菌；B3泳道还出现262bp扩增条带，表明该菌株是霍乱弧菌；B4泳道还出现385bp扩增条带，表明该菌株是结肠弯曲菌；B5泳道还出现478bp扩增条带，表明该菌株是副溶血性弧菌；B6泳道还出现601bp扩增条带，表明该菌株是大肠埃希氏菌；B7泳道还出现980bp扩增条带，表明该菌株是空肠弯曲菌。
实施例6试剂盒的保存期试验
以105的CFU/ml的沙门氏菌作为评估用检测样本，在第0天时，分装成9份冻存于-70℃冰箱中。将组建完毕的试剂盒放置于-20℃保存，分别取0、10、20、30、60、90、120、150和180天的试剂盒进行保存期试验。保存期检测结果如表4所示：
表4保存期试验结果
保存期 IAC特异性条带 沙门氏菌特异性条带
第0天 + +
第10天 + +
第20天 + +
第30天 + +
第60天 + +
第90天 + +
第120天 + +
第150天 + +
第180天 + +
由表4可知，试剂盒保存在-20℃冰箱，在不同保存期检测沙门氏菌的结果均为阳性，表明该试剂盒的保存期至少为6个月。
实施例7试剂盒的特异性试验
选择河弧菌、炭疽芽孢杆菌、韦氏芽孢杆菌、绵羊李斯特氏菌、百日咳杆菌、军团菌、链球菌等与检测目标菌种属相近，存在环境相似的细菌作为待检细菌，经检测均只有一条IAC条带扩增，无杂带产生。且对目标菌检测时，除特异性条带外，无杂带产生。表明本发明试剂盒能够有效区分非目标细菌，具有较好的特异性。
实施例8试剂盒的敏感性试验
评估用检测样本：将十四种目标菌的浓度调整至108CFU/mL数量级，采用细菌基因组提取试剂盒提取14种检测目标菌的DNA。每个模板梯度稀释成107CFU/mL，106CFU/mL，105CFU/mL，104CFU/mL的检测样品。
使用本发明试剂盒分别检测14个目标菌不同稀释度的模板。根据实例4结果判断方法，试剂盒检测14种目标菌的敏感性试验结果如表5所示：
表5试剂盒检测14种目标菌敏感性试验结果
从表5看出，试剂盒检测14种食品致病微生物的敏感性均为105CFU/mL。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (2)

1.一种多重PCR检测食源性致病菌的引物组，其特征在于，其是由检测沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌、空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、单核细胞增生性李斯特氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、阪崎肠杆菌、大肠埃希氏菌、霍乱弧菌、大肠埃希氏菌O157和嗜水气单胞菌的引物对组成；
所述检测金黄色葡萄球菌引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示；
所述检测大肠埃希氏菌O157引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示；
所述检测沙门氏菌引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示；
所述检测志贺氏菌引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示；
所述检测阪崎肠杆菌引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10所示；
所述检测霍乱弧菌引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12所示；
所述检测小肠结肠炎耶尔森氏菌引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14所示；
所述检测结肠弯曲菌引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16所示；
所述检测嗜水气单胞菌引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18所示；
所述检测副溶血性弧菌引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20所示；
所述检测蜡样芽孢杆菌引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22所示；
所述检测大肠埃希氏菌引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.24所示；
所述检测单核细胞增生性李斯特氏菌引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.26所示；
所述检测空肠弯曲菌引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.28所示。
2.一种快速检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物组、阳性内对照引物对、阳性内对照模板、DNA聚合酶、反应体系缓冲液、Mg2+、dNTP、阳性对照和去离子水；
所述阳性内对照引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQID NO.29和SEQ ID NO.30所示。
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