ES2950399T3

ES2950399T3 - Ratones humanizados Sirpa-IL15 insertados y métodos de uso de los mismos

Info

Publication number: ES2950399T3
Application number: ES16720234T
Authority: ES
Inventors: Dietmar Herndler-Brandstetter; Richard A Flavell; Davor Frleta; Cagan Gurer; Markus Manz; Andrew J Murphy; Noah W Palm; Liang Shan; Sean Stevens; Till Strowig; George D Yancopoulos; Zoete Marcel De
Original assignee: Institute for Research in Biomedicine IRB; Yale University; Regeneron Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Institute for Research in Biomedicine IRB; Yale University; Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2015-04-13
Filing date: 2016-04-12
Publication date: 2023-10-09
Anticipated expiration: 2036-04-12
Also published as: US10561126B2; US20230292721A1; EP4248740A2; JP7526227B2; KR102658190B1; CN113424798B; JP2020202853A; EP4248740A3; RU2020124128A; JP2022111334A; IL254727B1; MX2022001202A; JP7088992B2; IL254727A0; AU2022221378A1; FI3282835T3; AU2016247892A1; RU2730599C2; RU2017139008A; SG10202103445QA

Abstract

Se proporcionan animales no humanos genéticamente modificados que expresan SIRPα humana e IL-15 humana del genoma animal no humano. También se proporcionan métodos para producir animales no humanos que expresan SIRPα humana e IL-15 humana a partir del genoma de animales no humanos, y métodos para usar animales no humanos que expresan SIRPα humana e IL-15 humana a partir del genoma de animales no humanos. Estos animales y métodos encuentran muchos usos en la técnica, incluyendo, por ejemplo, en el modelado del desarrollo y función de células T humanas y/o células asesinas naturales (NK), en el modelado de infección por patógenos humanos de células T humanas y/o células NK, y en varias pantallas in vivo. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Ratones humanizados Sirpa-IL15 insertados y métodos de uso de los mismos

Referencia cruzada

Esta solicitud reivindica el beneficio de las solicitudes provisionales de EE. UU. n.° 62/146.938, presentada el 13 de abril de 2015; 62/148.667, presentada el 16 de abril de 2015; y 62/287.842, presentada el 27 de enero de 2016.

Campo de la invención

La invención se refiere al campo de animales no humanos modificados genéticamente.

Introducción

Los animales no humanos modificados genéticamente, tales como ratones humanizados, son muy prometedores para la investigación de transferencia, ya que permiten modelar y estudiar enfermedades humanas in vivo. En la última década, se ha logrado un progreso considerable en el desarrollo de ratones humanizados mediante la inserción genética de genes humanos que son esenciales para el correcto desarrollo y funcionamiento de las células inmunitarias humanas en el ratón. Sin embargo, algunas limitaciones aún restringen la utilidad de los ratones humanizados en la investigación de transferencia. En particular, el desarrollo y la supervivencia de los linfocitos T humanos es subóptimo.

Aunque se ha demostrado que el modelo de médula ósea-hígado-timo (BLT) mejora la reconstitución de linfocitos T intestinales en ratones NS/NSG-BLT (Denton P.W., Nochi T., Lim A. et al. Mucosal Immunol 2012; 5:555-566, Nochi T., Denton P.W., Wahl A. et al. Cell Rep 2013; 3:1874-1884), se ha comprobado que esos ratones desarrollan la enfermedad de injerto contra hospedador, lo que provoca una infiltración masiva de células inmunitarias en múltiples tejidos (Greenblatt M.B., Vrbanac V., Tivey T. et al. PLoS One 2012; 7:e44664). Por lo tanto, los modelos de ratón humanizado actuales aún carecen del desarrollo y la función adecuados de los linfocitos T humanos. En particular, la ausencia de linfocitos T de memoria residentes en tejidos humanos impide el uso de ratones humanizados como una herramienta preclínica para desarrollar y probar estrategias de inmunización más eficaces que tienen como objetivo inducir una inmunidad duradera de las mucosas contra patógenos como el VIH.

Con el fin de comprender mejor el desarrollo y la supervivencia de los linfocitos T residentes en tejidos humanos y proporcionar un modelo para probar nuevas estrategias de inmunización para inducir una inmunidad duradera de las mucosas dependiente de linfocitos T, sería útil tener un animal no humano modificado genéticamente que desarrolle linfocitos T residentes en tejidos humanos. Dicho modelo de ratón también se podría utilizar para estudiar la interacción de las células inmunitarias residentes en tejidos humanos con la microbiota intestinal, por ejemplo, cómo la microbiota puede dar forma al desarrollo y la supervivencia de las células inmunitarias humanas en el intestino delgado y el colon.

Además, existe una necesidad en la materia de modelos animales no humanos de desarrollo y función de linfocitos citolíticos naturales (NK) humanos.

Sumario

Se proporcionan ratones modificados genéticamente que expresan SIRPa humana e IL-15 humana a partir del genoma del ratón. También se divulgan métodos para hacer que animales no humanos expresen SIRPa humana e IL-15 humana a partir del genoma del animal no humano, y métodos para utilizar animales no humanos que expresen SIRPa humana e IL-15 humana a partir del genoma animal no humano. Estos animales y métodos encuentran muchos usos en la materia, incluidos, por ejemplo, en el modelado del desarrollo y la función de linfocitos citolíticos naturales (NK) y/o linfocitos T humanos; en el modelado de la infección por patógenos humanos de células NK y/o linfocitos T humanos; en la selección in vivo de agentes que inhiben la infección por un patógeno que activa, induce y/o se dirige a linfocitos T y/o células NK; en la selección in vivo de agentes que modulan el desarrollo y/o la función de células NK y/o linfocitos T humanos, por ejemplo, en un estado sano o enfermo; en la selección in vivo de agentes que son tóxicos para las células NK y/o linfocitos T humanos; en la selección in vivo de agentes que evitan, mitigan o revierten los efectos tóxicos de los agentes tóxicos en las células NK y/o linfocitos T humanos; en la selección in vivo de vacunas candidatas inductoras de linfocitos T; y en la selección in vivo e in vitro de agentes que inhiben el crecimiento tumoral y/o la infección mediante la activación de procesos de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC, del inglés antibody dependent cellular cytotoxicity) mediados por células NK.

En un primer aspecto, la presente divulgación proporciona un ratón modificado genéticamente como se establece en la reivindicación 1.

El promotor del gen SIRPa es un promotor del gen SIRPa de ratón endógeno en el locus del gen SIRPa de ratón. El ratón modificado genéticamente incluye una mutación anuladora en el gen SIRPa no humano en el locus del gen SIRPa de ratón. En dicha realización, la mutación anuladora es una eliminación de al menos los exones 2 a 4 de SIRPa de ratón. En otra de dichas realizaciones, el ratón modificado genéticamente es heterocigoto para el alelo que incluye la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína SIRPa humana. En otra de dichas realizaciones, el ratón modificado genéticamente es homocigoto para el alelo que incluye la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína SIRPa humana.

En otra realización del primer aspecto, o en una realización adicional de cualquiera de las realizaciones anteriores del mismo, la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína SIRPa humana incluye la secuencia codificante y no codificante genómica de SIRPa humana.

En otra realización del primer aspecto, o en una realización adicional de cualquiera de las realizaciones anteriores del mismo, la proteína SIRPa humana es un fragmento funcional de una proteína SIRPa humana de longitud completa. En dicha realización, el fragmento funcional incluye un dominio extracelular de SIRPa humana, por ejemplo, un dominio extracelular que incluye al menos los aminoácidos 28 a 362 de la SEQ ID NO: 12.

El promotor del gen IL-15 es un promotor del gen IL-15 de ratón endógeno en el locus del gen IL-15 de ratón de acuerdo con la reivindicación 1. El ratón modificado genéticamente incluye una mutación anuladora en el gen IL-15 de ratón en el locus del gen IL-15 de ratón. En dicha realización, la mutación anuladora es una eliminación de al menos los exones 5 a 8 de IL-15 de ratón. En otra de dichas realizaciones, el modificado genéticamente es heterocigoto para el alelo que incluye la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína IL-15 humana. En otra de dichas realizaciones, el ratón modificado genéticamente es homocigoto para el alelo que incluye la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína IL-15 humana.

En otra realización del primer aspecto, o en una realización adicional de cualquiera de las realizaciones anteriores del mismo, la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína IL-15 humana incluye la secuencia codificante y no codificante genómica de IL-15 humana.

En otra realización del primer aspecto, o en una realización adicional de cualquiera de las realizaciones anteriores del mismo, la proteína IL-15 humana es un fragmento funcional de una proteína IL-15 humana de longitud completa.

El ratón modificado genéticamente es inmunodeficiente. Por ejemplo, en una realización, el ratón modificado genéticamente incluye una inactivación del gen Rag2. En otra realización, el ratón modificado genéticamente incluye una inactivación del gen IL2rY, o una inactivación del gen Rag2 y una inactivación del gen IL2rY.

En otra realización del primer aspecto, o en una realización adicional de cualquiera de las realizaciones anteriores del mismo, el ratón modificado genéticamente incluye un injerto de células hematopoyéticas humanas. En dicha realización, el ratón genéticamente modificado incluye una infección con un patógeno humano. En una realización, donde el ratón genéticamente modificado incluye una infección con un patógeno humano, el patógeno humano activa, induce y/o se dirige a los linfocitos T y/o a linfocitos citolíticos naturales (NK). En otra realización, donde el ratón modificado genéticamente incluye una infección con un patógeno humano, el patógeno humano es un patógeno que afecta (por ejemplo, infecta) el intestino humano. En dicha realización, el patógeno humano es un rotavirus humano. En otra realización, donde el ratón genéticamente modificado incluye una infección con un patógeno humano, el patógeno afecta (por ejemplo, infecta) el pulmón humano. En dicha realización, el patógeno humano es el virus de la gripe. En otra realización, donde el ratón genéticamente modificado incluye una infección con un patógeno humano, el patógeno afecta (por ejemplo, infecta) el hígado humano. En otra realización más, un ratón modificado genéticamente incluye un injerto de células hematopoyéticas humanas y un tumor, por ejemplo, un tumor humano, por ejemplo, tumor humano trasplantado.

En la presente invención, el promotor del gen SIRPa es un promotor del gen SIRPa de ratón endógeno en el locus del gen SIRPa y el ratón modificado genéticamente incluye una mutación anuladora en el gen SIRPa en el locus del gen SIRPa de ratón. En dicha realización, la mutación anuladora es una eliminación de al menos los exones 2 a 4 de SIRPa de ratón. En otra de dichas realizaciones, el ratón modificado genéticamente es heterocigoto para el alelo que incluye la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína SIRPa humana. En otra de dichas realizaciones, el ratón modificado genéticamente es homocigoto para el alelo que incluye la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína SIRPa humana.

En una realización adicional de cualquiera de las realizaciones anteriores de la misma, la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína SIRPa humana incluye la secuencia codificante y no codificante genómica de SIRPa humana.

En una realización adicional de cualquiera de las realizaciones anteriores de la misma, la proteína SIRPa humana es un fragmento funcional de una proteína SIRPa humana de longitud completa. En dicha realización, el fragmento funcional incluye un dominio extracelular de SIRPa humana, por ejemplo, un dominio extracelular que incluye los aminoácidos 28 a 362 de la SEQ ID NO: 12.

En la presente invención, el promotor del gen IL-15 es un promotor del gen IL-15 no humano endógeno en el locus del gen ⁱL-15 de ratón e incluye una mutación anuladora en el gen IL-15 de ratón en el locus del gen IL-15 de ratón. En una realización, la mutación anuladora es una eliminación de al menos los exones 5 a 8 de IL-15 de ratón. En dicha realización, el ratón modificado genéticamente es heterocigoto para el alelo que incluye la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína IL-15 humana. En otra de dichas realizaciones, el ratón modificado genéticamente es homocigoto para el alelo que incluye la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína IL-15 humana.

En una realización adicional de cualquiera de las realizaciones anteriores de la misma, la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína IL-15 humana incluye la secuencia codificante y no codificante genómica de IL-15 humana.

En una realización adicional de cualquiera de las realizaciones anteriores de la misma, la proteína IL-15 humana es un fragmento funcional de una proteína IL-15 humana de longitud completa.

En la presente invención, el ratón modificado genéticamente es inmunodeficiente. Por ejemplo, en una realización, el ratón modificado genéticamente incluye una inactivación del gen Rag2. En otra realización, el ratón modificado genéticamente incluye una inactivación del gen IL2rY, o una inactivación del gen Rag2 y una inactivación del gen IL2rY.

En la presente invención, el promotor del gen SIRPa es un promotor del gen SIRPa de ratón endógeno en el locus del gen SIRPa de ratón y el ratón modificado genéticamente incluye una mutación anuladora en el gen SIRPa de ratón en el locus del gen SIRPa de ratón. En una realización, la mutación anuladora es una eliminación de al menos los exones 2 a 4 de SIRPa de ratón. En otra de dichas realizaciones, el ratón modificado genéticamente es heterocigoto para el alelo que incluye la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína SIRPa humana. En otra de dichas realizaciones, el ratón modificado genéticamente es homocigoto para el alelo que incluye la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína SIRPa humana.

En una realización adicional de cualquiera de las realizaciones anteriores de la misma, la proteína SIRPa humana es un fragmento funcional de una proteína SIRPa humana de longitud completa. En dicha realización, el fragmento funcional incluye un dominio extracelular de SIRPa humana, por ejemplo, un dominio extracelular que incluye al menos los aminoácidos 28 a 362 de la SEQ ID NO: 12.

En la presente invención, el promotor del gen IL-15 es un promotor del gen IL-15 de ratón endógeno en el locus del gen IL-15 de ratón.

El ratón modificado genéticamente incluye una mutación anuladora en el gen IL-15 de ratón en el locus del gen IL-15 de ratón. En una realización, la mutación anuladora es una eliminación de al menos los exones 5 a 8 de IL-15 de ratón. En otra de dichas realizaciones, el ratón modificado genéticamente es heterocigoto para el alelo que incluye la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína IL-15 humana. En otra de dichas realizaciones, el ratón modificado genéticamente es homocigoto para el alelo que incluye la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína IL-15 humana.

En la presente invención, el ratón modificado genéticamente es inmunodeficiente. Por ejemplo, en una realización, el ratón modificado genéticamente incluye una inactivación del gen Rag2. En otra realización, el ratón modificado genéticamente incluye una inactivación del gen IL2rY, o una inactivación del gen Rag2 y una inactivación del gen IL2rY.

En la presente invención, el promotor del gen SIRPa es un promotor del gen SIRPa no humano endógeno en el locus del gen SIRPa de ratón e incluye una mutación anuladora en el gen SIRPa en el locus del gen SIRPa. En una realización, la mutación anuladora es una eliminación de al menos los exones 2 a 4 de SIRPa de ratón. En otra de dichas realizaciones, el ratón modificado genéticamente es heterocigoto para el alelo que incluye la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína SIRPa humana. En otra de dichas realizaciones, el ratón modificado genéticamente es homocigoto para el alelo que incluye la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína SIRPa humana.

En otra realización, la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína SIRPa humana incluye la secuencia codificante y no codificante genómica de SIRPa humana.

En otra realización, la proteína SIRPa humana es un fragmento funcional de una proteína SIRPa humana de longitud completa. En dicha realización, el fragmento funcional incluye un dominio extracelular de SIRPa humana, por ejemplo, un dominio extracelular que incluye al menos los aminoácidos 28 a 362 de la SEQ ID NO: 12.

En la presente invención, el promotor del gen IL-15 es un promotor del gen IL-15 de ratón endógeno en el locus del gen IL-15 de animal no humano y el ratón modificado genéticamente incluye una mutación anuladora en el gen IL-15 de ratón en el locus del gen IL-15 de ratón. En una realización, la mutación anuladora es una eliminación de al menos los exones 5 a 8 de IL-15 de ratón. En otra de dichas realizaciones, el ratón modificado genéticamente es heterocigoto para el alelo que incluye la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína IL-15 humana. En otra de dichas realizaciones, el ratón modificado genéticamente es homocigoto para el alelo que incluye la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína IL-15 humana.

En otra realización, la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína IL-15 humana incluye la secuencia codificante y no codificante genómica de IL-15 humana.

En otra realización, la proteína IL-15 humana es un fragmento funcional de una proteína IL-15 humana de longitud completa.

En otra realización, el ratón modificado genéticamente incluye una inactivación del gen Rag2.

En otra realización, el ratón modificado genéticamente incluye una inactivación del gen IL2ry.

En la presente invención, el promotor del gen SIRPa es un promotor del gen SIRPa no humano endógeno en el locus del gen SIRPa de ratón y el ratón modificado genéticamente incluye una mutación anuladora en el gen SIRPa no humano en el locus del gen SIRPa de ratón. En una realización, la mutación anuladora es una eliminación de al menos los exones 2 a 4 de SIRPa de ratón. En otra de dichas realizaciones, el ratón modificado genéticamente es heterocigoto para el alelo que incluye la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína SIRPa humana. En otra de dichas realizaciones, el ratón modificado genéticamente es homocigoto para el alelo que incluye la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína SIRPa humana.

En una realización, la proteína SIRPa humana es un fragmento funcional de una proteína SIRPa humana de longitud completa. En dicha realización, el fragmento funcional incluye un dominio extracelular de SIRPa humana, por ejemplo, un dominio extracelular que incluye los aminoácidos 28 a 362 de la SEQ ID NO: 12.

En la presente invención, el promotor del gen IL-15 es un promotor del gen IL-15 de ratón endógeno en el locus del gen IL-15 de ratón y el ratón modificado genéticamente incluye una mutación anuladora en el gen IL-15 de ratón en el locus del gen IL-15 de ratón. En una realización, la mutación anuladora es una eliminación de al menos los exones 5 a 8 de IL-15 de ratón. En otra de dichas realizaciones, el ratón modificado genéticamente es heterocigoto para el alelo que incluye la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína IL-15 humana. En otra de dichas realizaciones, el ratón modificado genéticamente es homocigoto para el alelo que incluye la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína IL-15 humana.

En otra, el ratón modificado genéticamente incluye una inactivación del gen IL2ry.

En el presente documento se divulga un método para hacer que un animal no humano exprese una proteína IL-15 humana y una proteína SIRPa humana, que incluye: introducir en un genoma de un primer animal no humano una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína IL-15 humana, en donde la secuencia que codifica la proteína IL-15 humana está unida operativamente a una secuencia promotora del gen IL-15; introducir en un genoma de un segundo animal no humano una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína SIPRa humana, en donde la secuencia que codifica la proteína SIRPa humana está unida operativamente a una secuencia promotora de SIRPa; y hacer que un tercer animal no humano incluya la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína IL-15 humana y la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína SIRPa humana, en donde el tercer animal no humano expresa la proteína IL-15 humana y la proteína SIPRa humana.

Las etapas para introducir el ácido nucleico en el genoma pueden incluir la generación de un animal no humano a partir de una célula madre pluripotente que incluye el ácido nucleico que codifica la IL-15 humana o la SIRPa humana.

El primer animal puede ser un animal diferente al segundo animal, y la etapa de hacer el tercer animal puede incluir cruzar el primer y el segundo animal.

El primer animal y el segundo animal pueden ser el mismo, la etapa de introducir en el genoma del primer animal puede incluir poner en contacto una primera célula madre pluripotente con la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína IL-15 humana para obtener una segunda célula madre pluripotente, la etapa de introducir en el genoma del segundo animal puede incluir poner en contacto la segunda célula madre pluripotente con la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína SIRPa humana para obtener una tercera célula madre pluripotente, y el tercer animal no humano puede hacerse a partir de la tercera célula madre pluripotente.

En el presente documento se divulga un método para hacer que un animal no humano exprese una proteína IL-15 humana y una proteína SIRPa humana, que incluye: introducir en un genoma de un primer animal no humano una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína SIPRa humana, en donde la secuencia que codifica la proteína SIPRa humana está unida operativamente a una secuencia promotora del gen SIPRa; introducir en un genoma de un segundo animal no humano una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína IL-15 humana, en donde la secuencia que codifica la proteína IL-15 humana puede unirse operativamente a una secuencia promotora de IL-15; y hacer que un tercer animal no humano incluya la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína IL-15 humana y la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína SIRPa humana, en donde el tercer animal no humano expresa la proteína IL-15 humana y la proteína SIPRa humana.

En los métodos descritos anteriormente, el primer animal y el segundo animal pueden ser el mismo, la etapa de introducir en el genoma del primer animal puede incluir poner en contacto una primera célula madre pluripotente con la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína SIRPa humana para obtener una segunda célula madre pluripotente, la etapa de introducir en el genoma del segundo animal puede incluir poner en contacto la segunda célula madre pluripotente con la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína IL-15 humana para obtener una tercera célula madre pluripotente, y el tercer animal no humano puede hacerse a partir de la tercera célula madre pluripotente.

En los métodos descritos anteriormente, la célula madre pluripotente puede ser una célula ME o una célula MPi.

En los métodos descritos anteriormente, la célula madre pluripotente puede ser deficiente para Rag2.

En los métodos descritos anteriormente, la célula madre pluripotente puede ser deficiente para IL2^iy

En los métodos descritos anteriormente, el tercer animal no humano puede ser deficiente en uno o ambos de Rag2 e IL2ry.

En los métodos descritos anteriormente, la secuencia promotora de IL-15 puede ser una secuencia promotora de IL-15 humano.

En los métodos descritos anteriormente, la secuencia promotora de IL-15 puede ser una secuencia para el promotor de IL-15 de animal no humano endógeno.

En los métodos descritos anteriormente, la integración puede dar como resultado un reemplazo del gen IL-15 no humano en el locus del gen IL-15 no humano.

En los métodos descritos anteriormente, la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína IL-15 humana puede incluir secuencias codificantes y no codificantes genómicas de IL-15 humana.

En el presente documento se divulga un método para injertar un animal no humano genéticamente modificado que expresa una proteína IL-15 humana, que incluye: trasplantar una población de células que incluyen células hematopoyéticas humanas en el animal no humano genéticamente modificado fabricado mediante un método de acuerdo con los métodos descritos anteriormente. El trasplante puede incluir inyección en la vena de la cola, inyección en el hígado fetal o inyección retroorbitaria.

En este método de injerto divulgado en el presente documento, el animal no humano modificado genéticamente puede irradiarse de forma subletal antes del trasplante.

En este método de injerto, las células hematopoyéticas humanas pueden ser células CD34+.

En este método de injerto, las células hematopoyéticas humanas pueden ser de hígado fetal, de la médula ósea adulta o de sangre del cordón umbilical.

En el presente documento se divulga un método para determinar la eficacia de un anticuerpo terapéutico o una proteína de unión a antígeno candidatos para destruir una célula diana, incluyendo el método: administrar el anticuerpo terapéutico o la proteína de unión a antígeno candidatos a un animal no humano modificado genéticamente, en donde el animal no humano modificado genéticamente es deficiente para un sistema inmunitario endógeno e incluye: (i) una secuencia de ácido nucleico incorporada al genoma del animal no humano modificado genéticamente, cuya secuencia codifica una proteína SIRPa humana y está unida operativamente a un promotor del gen SIRPa, (ii) una secuencia de ácido nucleico incorporada al genoma del animal no humano modificado genéticamente, cuya secuencia codifica una proteína IL-15 humana y está unida operativamente a un promotor del gen IL-15 y (iii) un injerto de células hematopoyéticas humanas, en donde el animal no humano genéticamente modificado expresa la proteína SIRPa humana y la proteína IL-15 humana; y determinar si el anticuerpo terapéutico candidato o la proteína de unión a antígeno modula una citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo mediada por células NK contra la célula diana en el animal no humano genéticamente modificado.

En el presente documento se divulga un método para determinar la eficacia de un anticuerpo terapéutico o una proteína de unión a antígeno candidatos para destruir una célula diana que incluye: aislar una célula NK de un animal no humano modificado genéticamente, en donde el animal no humano modificado genéticamente es deficiente para un sistema inmunitario endógeno e incluye: (i) una secuencia de ácido nucleico incorporada al genoma del animal no humano modificado genéticamente, cuya secuencia codifica una proteína SIRPa humana y está unida operativamente a un promotor del gen SIRPa, (ii) una secuencia de ácido nucleico incorporada al genoma del animal no humano modificado genéticamente, cuya secuencia codifica una proteína IL-15 humana y está unida operativamente a un promotor del gen IL-15 y (iii) un injerto de células hematopoyéticas humanas, en donde el animal no humano genéticamente modificado expresa la proteína SIRPa humana y la proteína IL-15 humana; poner en contacto la célula NK aislada con el anticuerpo terapéutico o la proteína de unión a antígeno candidatos y la célula diana; y determinar la actividad citolítica dependiente del anticuerpo o de la proteína de unión al antígeno de la célula NK aislada contra la célula diana.

En el presente documento se divulga un método para seleccionar un anticuerpo terapéutico candidato o una proteína de unión a antígeno para mejorar la eficacia en la destrucción de una célula diana que incluye: administrar el anticuerpo terapéutico o la proteína de unión a antígeno candidatos a un animal no humano modificado genéticamente, en donde el animal no humano modificado genéticamente es deficiente para un sistema inmunitario endógeno e incluye: (i) una secuencia de ácido nucleico incorporada al genoma del animal no humano modificado genéticamente, cuya secuencia codifica una proteína SIRPa humana y está unida operativamente a un promotor del gen SIRPa, (ii) una secuencia de ácido nucleico incorporada al genoma del animal no humano modificado genéticamente, cuya secuencia codifica una proteína IL-15 humana y está unida operativamente a un promotor del gen IL-15 y (iii) un injerto de células hematopoyéticas humanas, en donde el animal no humano genéticamente modificado expresa la proteína SIRPa humana y la proteína IL-15 humana; y determinar si el anticuerpo terapéutico candidato o la proteína de unión a antígeno muestra una eficacia mejorada para destruir la célula diana en el animal no humano modificado genéticamente.

En los métodos descritos anteriormente, la célula diana puede ser una o más de una célula tumoral, una célula infectada por virus, una célula infectada por bacterias, una célula bacteriana, una célula fúngica y una célula parásita.

Breve descripción de los dibujos

El archivo de patente o solicitud contiene al menos un dibujo realizado a color. La oficina proporcionará copias de esta patente o publicación de solicitud de patente con dibujos a color previa solicitud y pago de la tarifa necesaria.

En la figura 1 se proporciona una representación esquemática del reemplazo del gen SIRPa de ratón por la secuencia SIRPa humana. En la figura 1 (arriba) se muestra el locus Sirpa de ratón que indica la ubicación relativa de los exones 1 a 8. En la figura 1 (abajo) se proporciona una representación esquemática que muestra el alelo diana final con los exones humanos 2 a 4. La proteína quimérica codificada posee una región extracelular correspondiente a los aminoácidos 28 a 362 de la proteína SIRPa humana de tipo silvestre fusionada con la parte intracelular de la proteína SIRPa de ratón. Las formas con rayas diagonales representan una secuencia humana insertada.

En la figura 2 se proporciona una representación esquemática que ilustra el reemplazo genómico dirigido del gen IL-15 de ratón como se logró para el ratón 2. Las formas vacías representan una secuencia humana insertada. En la figura 3A se proporcionan gráficos que muestran la expresión del gen hIL-15 en varios tejidos de ratones SRG no injertados (SRPa humana, Rag Ko , IL-2ry KO) y SRG-15 (SIRPa humana, Rag KO, IL-2rY KO, IL-15 humana (ratón 1)). En el eje de ordenadas se muestra el nivel de ARNm de hIL-15 en relación con el gen constitutivo Hprt.

En la figura 3^bse proporcionan gráficos que muestran la expresión del gen hIL-15 humano en varios tejidos de ratones RG no injertados (Rag KO, IL-2ry Ko ) y SRG-15 no injertados (SIRPa humana, Rag KO, IL-2rY KO, IL-15 humana) (ratón n.° 1 y ratón n.° 2 como se indica).

En la figura 4 se proporcionan niveles en suero de la proteína IL-15 humana en ratones SRG, SRG IL-15h/m (ratón 2) y SRG IL-15h/h (ratón 2) después de la exposición con poli (I:C).

En la figura 5A se proporciona un gráfico que muestra el injerto eficaz de células hematopoyéticas humanas en la sangre de ratones N^sG, SRG y SRG-15 (ratón 2) 12 a 14 semanas después del injerto. Todos los datos mostrados son la media ± e.e.m. Los análisis estadísticos se realizaron mediante la prueba de la U de Mann-Whitney bilateral para datos independientes (* P <0,05, ** P <0,01, **** P <0,0001).

En la figura 5B se proporcionan gráficos que muestran el número de células CD45+ humanas en la MO, bazo, GL, hígado y pulmón de SRG y SRG-15 (ratón 2) 14 semanas después del injerto.

En la figura 6A se proporcionan diagramas que muestran frecuencias de células NK y linfocitos T humanos en ratones SRG y SRG-15 (ratón 1) en la médula ósea (MO), hígado y pulmón.

En la figura 6B se proporcionan gráficos que muestran las frecuencias de células NK humanas en ratones SRG y SRG-15 (ratón 1) en varios tejidos.

En la figura 6C se proporcionan diagramas y gráficos que ilustran la maduración de células NK humanas en el hígado de ratones SRG y SRG-15 (ratón 1).

En la figura 6D se proporcionan gráficos que muestran que las células NK CDS6°scur° CD16+ humanas expresan niveles elevados de receptores inhibidores citolíticos humanos en el bazo de ratones SRG-15.

En la figura 7A se proporciona un gráfico que muestra la frecuencia de células NK humanas en la sangre de ratones NSG, SRG y SRG-15 (ratón 2) 10 a 12 semanas después del injerto. Todos los datos mostrados son la media ± e.e.m. Los análisis estadísticos se realizaron mediante la prueba de la U de Mann-Whitney bilateral para datos independientes (* P <0,05, ** P <0,01, **** P <0,0001).

En la figura 7B se proporciona un gráfico que muestra el porcentaje de células Nkp46+ humanas en el bazo 14 semanas después del injerto para SRG, SRG-15h/m y SRG-15h/h. Todos los datos mostrados son la media ± e.e.m. Los análisis estadísticos se realizaron mediante la prueba de la U de Mann-Whitney bilateral para datos independientes (* P <0,05, ** P <0,01, **** P <0,0001).

En la figura 7C se proporcionan gráficos que muestran la frecuencia de las células NK humanas en la sangre, bazo (B), hígado y pulmón de ratones SRG y SRG-15 (ratón 2) 14 semanas después del injerto. Todos los datos mostrados son la media ± e.e.m. Los análisis estadísticos se realizaron mediante la prueba de la U de Mann-Whitney bilateral para datos independientes (* P <0,05, ** P <0,01, **** P <0,0001).

En la figura 7D se proporcionan gráficos que muestran la frecuencia de células NK humanas en el bazo (B), hígado y pulmón de ratones SRG y SRG-15 (ratón 2) 14 semanas después del injerto. Todos los datos mostrados son la media ± e.e.m. Los análisis estadísticos se realizaron mediante la prueba de la U de Mann-Whitney bilateral para datos independientes (* P <0,05, ** P <0,01, **** P <0,0001).

En la figura 8 se proporcionan diagramas (izquierda) que muestran la distribución de linfocitos T y células NK humanas en ratones SRG y SRG-15 (ratón 2) en sangre (clasificadas en células CD45+ humanas (células hematopoyéticas) y células NKp46+ (células NK); y un gráfico (derecha) que muestra el porcentaje de células hCD45+ que son células NKp46+ en la sangre de ratones SRG-15 injertados.

En la figura 9A se proporcionan diagramas que muestran la distribución de células NK y linfocitos T en el bazo y gráficos que muestran el porcentaje y el número de células NKp46+ en el bazo de ratones SRG-15 (ratón 2) injertados con huHSC CD34+ en relación con ratones SRG injertados con huHSC CD34+.

En la figura 9B se proporciona un gráfico que muestra la composición de células inmunitarias humanas en la sangre de ratones NSG (n = 5), SRG (n = 19) y SRG-15 (ratón 2) (n = 39) 10 a 12 semanas después del injerto. En la figura 9C se proporcionan la cantidad de células CD45+ humanas en el timo de ratones SRG y SRG-15 (ratón 2) 14 semanas después del injerto.

En la figura 9D se proporcionan diagramas de citometría de flujo representativos de células hCD45+ en el timo de un ratón SRG y SRG-15 (ratón 2).

En la figura 9E se proporciona un gráfico que muestra la composición de células hCD45+ en el timo de ratones SRG (n = 8) y SRG-15 (ratón 2) (n = 4) 14 semanas después del injerto.

En la figura 10A se proporcionan diagramas que muestran la frecuencia de los subconjuntos de células NK CD56brillante CD16'y cD56°scu^° CD16+ en la sangre y el bazo de ratones SRG y SRG-15 (ratón 2) siete semanas después del injerto.

En la figura 10B se proporcionan gráficos que muestran la frecuencia de subconjuntos de células NK CDS6brillanteCD16‘ y CD56°scu^° CD16+ en la sangre y el bazo de ratones SRG y SRG-15 (ratón 2) siete semanas después del injerto.

En la figura 10C se proporciona diagramas y gráficos que muestran la expresión de los receptores inhibidores citolíticos (KIR, del inglés killer inhibitory receptors) en subconjuntos de células NK en seres humanos y ratones SRG-15 (ratón 2).

En la figura 11 se proporcionan dos diagramas (arriba a la izquierda y arriba a la derecha) que muestran la distribución de células ^{N k} CD16+ frente a CD16' en la sangre de ratones SRG-15 (ratón 2) en relación con una muestra de PBMC. En la figura 11 también se proporciona un gráfico (abajo) que muestra el porcentaje de células NKp46+ que son CD16+ frente a CD16' en sangre obtenida de ratones SRG-15 (ratón 2) o una muestra procedente de PBMC.

En la figura 12 se proporcionan gráficos que muestran el desarrollo de células NK humanas en la médula ósea de ratones SRG y SRG-15 (ratón 2) siete semanas después del injerto. Todos los datos mostrados son la media ± e.e.m. Los análisis estadísticos se realizaron mediante la prueba de la U de Mann-Whitney bilateral para datos independientes (* P <0,05, ** P <0,01, **** P <0,0001).

En la figura 13A se proporcionan gráficos que muestran frecuencias de linfocitos T humanos en ratones SRG y SRG-15 (ratón 1) en varios tejidos. (K/μl = miles de células por μl).

En la figura 13B se proporcionan diagramas y gráficos que muestran el fenotipo de linfocitos T CD8+ humanos en sangre e hígado para ratones SRG y SRG-15 (ratón 1).

En la figura 14A se proporciona diagramas y un gráfico que muestran la expresión del marcador CD69 residente en tejido en linfocitos T CD8+ de pulmón de ratones SRG y SRG-15 (ratón 1).

En la figura 14B se proporcionan un diagrama y un gráfico que muestran la expresión del marcador CD69 residente en tejido en los linfocitos T CD8+ de hígado de ratones SRG y SRG-15 (ratón 1).

En la figura 15A se proporcionan gráficos que muestran la frecuencia de linfocitos T hCD3+ en el bazo, pulmón e hígado de ratones SRG y SRG-15 (ratón 2) 16 semanas después del injerto.

En la figura 15B se proporcionan gráficos que muestran la relación CD4/CD8 en el bazo, pulmón e hígado de ratones SRG y SRG-15 (ratón 2) 16 semanas después del injerto.

En la figura 16A se proporcionan diagramas que ilustran la frecuencia de linfocitos de la lámina propia (LLP) humanos en el colon de ratones SRG y SRG-15 (ratón 1).

En la figura 16B se proporcionan gráficos que ilustran la frecuencia de linfocitos de la lámina propia (LLP) humanos en el colon de ratones SRG y SRG-15 (ratón 1).

En la figura 17A, junto con las figuras 17B y 17C, se ilustra el injerto eficaz de linfocitos intraepiteliales (LIE) humanos en el intestino delgado de ratones SRG-15 de 16 semanas de edad (ratón 1). En la figura 17A se proporcionan diagramas y gráficos que muestran células CD45+ y linfocitos T CD8+ humanos en de la fracción de LIE de ratones SRG y SRG-15 (ratón 1).

En la figura 17B se proporcionan imágenes de tinción inmunohistoquímica de hCD45 en el intestino delgado de ratones SRG y SRG-15 (ratón 1) de 16 semanas.

En la figura 17C se proporcionan diagramas que muestran las características fenotípicas de los linfocitos T CD8+ humanos en el bazo y el intestino delgado de ratones SRG-15 (ratón 1).

En la figura 18A se proporcionan diagramas de FACS representativos que muestran células CD45+ humanas y de ratón en de la fracción de LIE de ratones SRG y SRG-15 (ratón 2) 16 semanas después del injerto.

En la figura 18B se proporcionan gráficos que muestran el número de LIE humanos en el intestino delgado de ratones SRG en relación con ratones SRG-15 (ratón 2) y el número de LLP humanos en el intestino grueso de ratones SRG grueso en relación con ratones SRG-15 (ratón 2). Todos los datos mostrados son la media ± e.e.m. Los análisis estadísticos se realizaron mediante la prueba de la U de Mann-Whitney bilateral para datos independientes (*** P <0,001).

En la figura 18C se proporciona un diagrama que muestra la composición de células hCD3+ en el intestino delgado de ratones SRG-15 (ratón 2). Un diagrama FACS representativo de ocho ratones SRG-15 (ratón 2).

En la figura 18D se proporcionan gráficos que muestran las características fenotípicas de los linfocitos T hCD3+ hCD8+ en el bazo y el intestino delgado de ratones SRG-15 (ratón 2).

En la figura 18E se proporcionan imágenes de tinción inmunohistoquímica de hCD8 en el intestino delgado de ratones SRG y SRG-15 (ratón 2). Las flechas indican LIE hCD8+. Las imágenes son representativas de tres ratones por grupo.

En la figura 19A se proporcionan diagramas y gráficos que muestran la distribución y el número de células hCD45+ en las poblaciones de linfocitos intraepiteliales de ratones SRG y SRG-15 y los porcentajes relativos de células NK y linfocitos T en las poblaciones de células hCD45+ en las poblaciones de linfocitos intraepiteliales de ratones SRG y SRG-15 (ratón 2).

En la figura 19B se proporcionan diagramas y gráficos que muestran la distribución y el porcentaje de células NK CD16+ y CD16- en linfocitos intraepiteliales de ratones SRG-15 (ratón 2) en comparación con la sangre y el bazo. En la figura 19C se proporcionan diagramas y gráficos que muestran la distribución y el número de LIE humanos y linfocitos de la lámina propia (LLP) humanos en ratones SRG y SRG-15 (ratón 2).

En las figuras 20A y 20B se proporcionan diagramas y gráficos que demuestran la presencia de placas de Peyer discernibles que contienen predominantemente células hCD45+ en ratones SRG-15 (ratón 2).

En la figura 21A se proporciona un cronograma para la covivienda y la recogida de muestras de heces para la secuenciación de la microbiota intestinal.

En la figura 21B se proporciona un diagrama que muestra la abundancia relativa de bacterias de ratón en el intestino de ratones SRG y SRG-15 (ratón 1) no injertados e injertados.

En la figura 22 se ilustra la relevancia funcional de los linfocitos T residentes en tejidos humanos en ratones SRG-15. De manera más específica, en la figura 22 se proporciona un gráfico que demuestra la relevancia funcional de los LIE humanos para eliminar la infección aguda por rotavirus.

En la figura 23A se proporcionan diagramas V ^ísN^eque muestran análisis basados en CyTOF de 42 parámetros de subconjuntos de células NK CD56brillante CD16' y CDS6°scur° CD16+ en seres humanos (n = 20) y ratones SRG-15 (ratón 2) (n = 9). Cada punto representa una sola célula.

En la figura 23B se proporcionan diagramas ViSNE que muestran la intensidad de expresión de ocho marcadores seleccionados en células NK CDS6brillante CD16' en seres humanos (n = 20) y ratones SRG-15 (ratón 2) (n = 9). En los diagramas ViSNE de la figura 23C se muestra la intensidad de expresión de ocho marcadores seleccionados en células NK CD56°scu^° CD16+ en seres humanos (n = 20) y ratones SRG-15 (n = 9).

En la figura 24A se proporciona un gráfico que muestra el porcentaje de células NK en sangre en ratones SRG frente a SRG-15 (ratón 2) que son CD69+ antes y después de la inyección de poli-IC.

En la figura 24B se proporcionan gráficos que muestran la producción de IFN^ya partir de células NK procedentes de SRG y SRG-15 (ratón 2) después la estimulación in vitro con poli I:C o IL-12p70 humana. Las células NK de ratones se comparan con las células NK procedentes de PBMC humanas sanas. Todas las muestras están normalizadas para el número de NK.

En la figura 24C se proporcionan gráficos que muestran la capacidad citolítica de las células NK esplénicas de ratones SRG y SRG-15 (ratón 2) frente a células K562 deficientes en HLA de clase I (izquierda) o frente a células Raji en ausencia (arriba a la derecha) o en presencia (abajo a la derecha) del anticuerpo anti-CD20. SRG-15 n.° 1 y SRG-15 n.° 2 representan dos preparaciones diferentes de células NK de compañeros de camada SRG-15 (ratón 2).

En la figura 25A se proporciona un gráfico que muestra que las células NK humanas en ratones SRG-15 (ratón 2) inhiben el crecimiento tumoral después del tratamiento con rituximab (RTX). Todos los datos mostrados son la media ± e.e.m. Los análisis estadísticos se realizaron mediante la prueba de la U de Mann-Whitney bilateral para datos independientes (*** P <0,001).

En la figura 25B se proporcionan diagramas y un gráfico que muestran la frecuencia de células NK y linfocitos T humanos en xenoinjertos de tumores humanos de ratones SRG-15 no tratados (n = 5) y tratados con RTX (n = 1). Todos los datos mostrados son la media ± e.e.m. Los análisis estadísticos se realizaron mediante la prueba de la U de Mann-Whitney bilateral para datos independientes (*** P <0,001).

En la figura 25C se proporcionan diagramas y gráficos que muestran subconjuntos de células NK humanas en la sangre y el tumor de ratones SRG-15 no tratados (n = 2) y tratados con RTX (n = 1). Todos los datos mostrados son la media ± e.e.m. Los análisis estadísticos se realizaron mediante la prueba de la U de Mann-Whitney bilateral para datos independientes (*** P <0,001).

Descripción detallada

A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el entendido habitualmente por un experto en la materia a la que pertenece la presente invención. Aunque puede usarse cualquier método y material similar o equivalente a los que se describen en el presente documento en la práctica o ensayo de la presente invención, a continuación, se describen métodos y materiales particulares. Se entiende que la presente divulgación reemplaza cualquier divulgación de una publicación incorporada en la medida en que exista una contradicción.

Tal como será evidente para los expertos en la materia tras la lectura de la presente divulgación, cada una de las realizaciones individuales descritas e ilustradas en el presente documento tiene características y componentes discretos que fácilmente pueden separarse o combinarse con las características de cualquiera de las otras realizaciones. Cualquier método citado puede llevarse a cabo en el orden de los eventos citados o en cualquier otro orden que sea posible lógicamente.

Cabe destacar que tal como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "uno/a" y "el/la" incluyen referencias en plural, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a "una célula" incluye una pluralidad de dichas células y la referencia a "la proteína" incluye la referencia a una o más proteínas y equivalentes de las mismas conocidas por los expertos en la materia, y así sucesivamente.

Las publicaciones analizadas en el presente documento se proporcionan únicamente para su divulgación antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. No ha de interpretarse que nada en el presente documento constituya una admisión de que la presente invención no tenga derecho a anteponer dicha publicación.

Se proporcionan ratones genéticamente modificados que expresan SIRPa humana e IL-15 humana del genoma del ratón. También se divulgan métodos para hacer ratones que expresan SIRPa humana e IL-15 humana a partir del genoma de ratón, y métodos para utilizar los ratones que expresan SIRPa humana e IL-15 humana a partir del genoma de ratón. Estos animales y métodos encuentran muchos usos en la materia, incluidos, por ejemplo, en el modelado del desarrollo y la función de linfocitos citolíticos naturales (NK) y/o linfocitos T humanos; en el modelado de infección por patógenos humanos, por ejemplo, infección por patógenos humanos de tejidos específicos, por ejemplo, infección por patógenos humanos intestinales, pulmonares o hepáticos; en el modelado de la infección por patógenos humanos de células NK y/o linfocitos T humanos; en la selección in vivo de agentes que inhiben la infección por un patógeno que activa, induce y/o se dirige a linfocitos T y/o células NK; en la selección in vivo de agentes que modulan el desarrollo y/o la función de células NK y/o linfocitos T humanos, por ejemplo, en un estado sano o enfermo; en la selección in vivo de agentes que son tóxicos para las células NK y/o linfocitos T humanos; en la selección in vivo de agentes que evitan, mitigan o revierten los efectos tóxicos de los agentes tóxicos en las células NK y/o linfocitos T humanos; en la selección in vivo de vacunas candidatas inductoras de linfocitos T; y en la selección in vivo e in vitro de agentes que inhiben el crecimiento tumoral y/o la infección mediante la activación de procesos de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) mediados por células NK.

ANIMALES NO HUMANOS SIRPa HUMANIZADOS

En la presente invención se proporciona un ratón SIRPa humanizado. Por un animal no humano SIRPa humanizado, o "ratón SIRPa", se entiende un ratón que incluye una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína SIRPa humana. Como se utiliza en el presente documento, "proteína SIRPa humana" significa una proteína que es una proteína SIRPa humana de tipo silvestre (o nativa) o una variante de una proteína SIRPa humana de tipo silvestre (o nativa), que conserva una o más funciones de señalización y/o de receptor de una proteína SIRPa humana de tipo silvestre. Como se utiliza en el presente documento, el término "variante" define un mutante genético aislado de origen natural de un polipéptido o una secuencia de ácido nucleico humanos o una variación preparada de forma recombinante de un polipéptido o una secuencia de ácido nucleico humanos, cada uno de los cuales contiene una o más mutaciones en comparación con la correspondiente secuencia de ácido nucleico o polipéptido humanos de tipo silvestre. Por ejemplo, dichas mutaciones pueden ser una o más sustituciones, adiciones y/o eliminaciones de aminoácidos. El término "variante" también incluye homólogos y ortólogos humanos. En algunas realizaciones, un polipéptido variante de la presente invención tiene el 70 % o más de identidad, por ejemplo, el 75 %, el 80 %, o el 85 % o más de identidad con un polipéptido humano de tipo silvestre, por ejemplo, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % de identidad con un polipéptido humano de tipo silvestre.

El porcentaje de identidad entre dos secuencias se puede determinar con cualquier técnica conveniente en la materia, por ejemplo, el alineamiento de las secuencias con, por ejemplo, un programa informático disponible públicamente. Las mutaciones se pueden introducir mediante técnicas convencionales de biología molecular, tales como mutagénesis dirigida al sitio, mutagénesis mediada por PCR, evolución dirigida y similares. Un experto en la materia reconocerá que se pueden introducir una o más sustituciones de ácidos nucleicos sin alterar la secuencia de aminoácidos, y que se pueden introducir una o más mutaciones de aminoácidos sin alterar las propiedades funcionales de la proteína humana.

Se pueden realizar sustituciones conservadoras de aminoácidos en proteínas humanas para producir variantes de proteínas humanas. Por sustituciones conservadoras de aminoácidos se entienden sustituciones reconocidas en la materia de un aminoácido por otro aminoácido que tiene características similares. Por ejemplo, cada aminoácido puede describirse como poseedor de una o más de las siguientes características: electropositivo, electronegativo, alifático, aromático, polar, hidrófobo e hidrófilo. Una sustitución conservadora es una sustitución de un aminoácido que tiene una característica estructural o funcional específica por otro aminoácido que tiene la misma característica. Los aminoácidos ácidos incluyen aspartato y glutamato; los aminoácidos básicos incluyen histidina, lisina y arginina; los aminoácidos alifáticos incluyen isoleucina, leucina y valina; los aminoácidos aromáticos incluyen fenilalanina, glicina, tirosina y triptófano; los aminoácidos polares incluyen aspartato, glutamato, histidina, lisina, asparagina, glutamina, arginina, serina, treonina y tirosina; y los aminoácidos hidrófobos incluyen alanina, cisteína, fenilalanina, glicina, isoleucina, leucina, metionina, prolina, valina y triptófano; y las sustituciones conservadoras incluyen la sustitución entre aminoácidos dentro de cada grupo. Los aminoácidos también se pueden describir en términos de tamaño relativo, alanina, cisteína, aspartato, glicina, asparagina, prolina, treonina, serina, valina, todos normalmente considerados pequeños.

Las variantes humanas pueden incluir análogos de aminoácidos sintéticos, derivados de aminoácidos y/o aminoácidos no convencionales, incluidos de manera ilustrativa, aunque no de forma limitativa, ácido a-aminobutírico, citrulina, canavanina, cianoalanina, ácido diaminobutírico, ácido diaminopimélico, dihidroxifenilalanina, ácido djenkólico, homoarginina, hidroxiprolina, norleucina, norvalina, 3-fosfoserina, homoserina, 5-hidroxitriptófano, 1 -metilhistidina, metilhistidina y ornitina.

Las variantes humanas normalmente estarán codificadas por ácidos nucleicos que tienen un elevado grado de identidad con un ácido nucleico que codifica la proteína humana de tipo silvestre. El complemento de un ácido nucleico que codifica una variante humana se hibrida específicamente con un ácido nucleico que codifica una humana de tipo silvestre en condiciones de elevada rigurosidad. Los ácidos nucleicos que codifican una variante humana se pueden aislar o generar de forma recombinante o sintética con una metodología bien conocida. La expresión "proteína SIRPa humana" también abarca fragmentos de una proteína SIRPa humana de tipo silvestre (o una variante de la misma), que conservan una o más funciones de señalización y/o de receptor de una proteína SIRPa humana de tipo silvestre, por ejemplo, un dominio extracelular de una proteína SIRPa humana.

La expresión "proteína SIRPa humana" también abarca proteínas de fusión, es decir, proteínas quiméricas, que incluyen uno o más fragmentos de una proteína SIRPa humana de tipo silvestre (o una variante de la misma) y que conservan una o más funciones de señalización y/o de receptor de una proteína SIRPa humana de tipo silvestre. Una proteína de fusión que incluye uno o más fragmentos de una proteína SIRPa humana de tipo silvestre (o una variante de la misma), por ejemplo, en combinación con uno o más péptidos o polipéptidos no humanos, también puede denominarse en el presente documento proteína SIRPa humanizada. Por lo tanto, por ejemplo, una proteína que incluye una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular de una proteína SIRPa humana de tipo silvestre fusionada con un dominio de señalización de una proteína SIRPa de ratón de tipo silvestre está abarcada por el término "proteína SIRPa humana".

En algunos casos, una proteína SIRPa humana de acuerdo con la presente divulgación incluye una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 98 %, al menos aproximadamente un 99 %, o el 100 %, de identidad de secuencia de aminoácidos con los aminoácidos 28 a 362 de la SEQ ID NO: 12.

Una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína SIRPa humana es, por lo tanto, un polinucleótido que incluye una secuencia codificante para una proteína SIRPa humana, por ejemplo, una proteína SIRPa humana de tipo silvestre, una variante de una proteína SIRPa humana de tipo silvestre, un fragmento de una proteína SIRPa humana de tipo silvestre (o una variante de la misma) que conserva una o más funciones de señalización y/o de receptor de una proteína SIRPa humana de tipo silvestre, o proteínas de fusión, es decir, proteínas quiméricas, que incluyen uno o más fragmentos de una proteína SIRPa humana de tipo silvestre (o una variante de la misma) y que conservan una o más funciones de señalización y/o de receptor de una proteína SIRPa humana de tipo silvestre.

SIRPa (también conocida como "proteína reguladora de señales a" y "CD172A" en seres humanos) es un miembro de la familia de proteínas reguladoras de señales (SIRP, del inglés signal-regulatory-protein) y también pertenece a la superfamilia de las inmunoglobulinas. Se ha demostrado que SIRPa mejora el injerto celular en ratones inmunodeficientes (Strowig et al. Proc Natl Acad Sci USA 2011; 108:13218-13223). La secuencia polipeptídica para SIRPa humana de tipo silvestre y la secuencia de ácido nucleico que codifica SIRPa humana de tipo silvestre se pueden encontrar en Genbank con los números de registro NM_001040022.1 (variante 1), NM_001040023.1 (variante 2) y NM_080792.2 (variante 3). El gen SIRPa se conserva en al menos el chimpancé, macaco de la India, perro, vaca, ratón, rata y pollo. El locus genómico que codifica la proteína SIRPa humana de tipo silvestre se puede encontrar en el genoma humano en el cromosoma 20; NC_000020.11 (1894117-1939896). La secuencia de proteínas está codificada por los exones 1 a 8 en este locus. De esta manera, en algunas realizaciones, una secuencia de ácido nucleico que incluye la secuencia codificante para SIRPa humana incluye uno o más de los exones 1 a 8 del gen SIRPa humano. En algunos casos, la secuencia de ácido nucleico también incluye aspectos del locus genómico de la SIRPa humana, por ejemplo, intrones, secuencia no traducida (UTR, del inglés untranslated) en 3' y/o 5'. En algunos casos, la secuencia de ácido nucleico incluye regiones enteras del locus genómico SIRPa humano. En algunos casos, la secuencia de ácido nucleico incluye los exones 2 a 4 del locus genómico SIRPa humano.

En los ratones SIRPa humanizados de la presente solicitud, la secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína SIRPa humana puede estar unida operativamente a una o más secuencias reguladoras de un gen SIRPa, por ejemplo, una secuencia reguladora de un gen SIRPa del animal no humano. Las secuencias reguladoras de SIRPa de animales no humanos, por ejemplo, de ratón, son aquellas secuencias del locus genómico SIRPa de animales no humanos que regulan la expresión de SIRPa de animales no humanos, por ejemplo, las secuencias reguladoras en 5', por ejemplo, el promotor SIRPa, una región no traducida (UTR) en 5' de SIRPa, etc.; las secuencias reguladoras en 3', por ejemplo, la 3'-UTR; y potenciadores, etc.

Un "promotor" o "secuencia promotora" se refiere a una región reguladora de ADN capaz de unirse a la ARN polimerasa en una célula e iniciar la transcripción de una secuencia codificante cadena abajo (dirección 3'). La secuencia promotora está limitada en su extremo 3' por el sitio de inicio de la transcripción y se extiende cadena arriba (dirección 5') para incluir el número mínimo de bases o elementos necesarios para iniciar la transcripción a niveles detectables por encima del fondo. Dentro de la secuencia promotora se encontrará un sitio de iniciación de la transcripción, así como dominios de unión a proteínas responsables de la unión de la ARN polimerasa. Los promotores eucariotas a menudo, pero no siempre, contienen cajas "TATA" y cajas "CAT". De particular interés para la presente divulgación son los elementos reguladores del ADN, por ejemplo, promotores, que promueven la transcripción de la proteína humana en el mismo patrón de expresión espacial y temporal, es decir, en las mismas células y tejidos y en los mismos tiempos, como se observaría para la correspondiente proteína endógena.

La SIRPa murina se encuentra en el cromosoma 2; NC 000068.7 (129592606-129632228), y la secuencia de codificación de SIRPa murina se puede encontrar en Genbank con los n.° de registro NM_007547.4 (isoforma 1), NM_001177647.2 (isoforma 2), NM_001291019.1 (isoforma 3), NM_001291020.1 (isoforma 3), NM_001291021.1 (isoforma 4), NM_001291022.1 (isoforma 5). Las secuencias reguladoras de la SIRPa murina están bien definidas en la materia y pueden identificarse fácilmente mediante métodos informáticos, por ejemplo, haciendo referencia a los números de registro de Genbank anteriores en el UCSC Genome Browser en la red mundial, o mediante métodos experimentales como se describe en la materia. En algunos casos, por ejemplo, cuando la secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína SIRPa humana se localiza en el locus genómico SIRPa de ratón, las secuencias reguladoras unidas operativamente a la secuencia codificante SIRPa humana son endógenas, o nativas, del genoma de ratón, es decir, se presentaron en el genoma de ratón antes de la integración de las secuencias de ácido nucleico humanas.

En algunos casos, el animal no humano SIRPa humanizado, por ejemplo, ratón, se genera mediante la integración aleatoria, o inserción, de una secuencia de ácido nucleico humano que codifica una proteína SIRPa humana (incluidos los fragmentos descritos anteriormente), es decir, una "secuencia de ácido nucleico de SIRPa humana", o "secuencia SIRPa humana", en el genoma. Normalmente, la localización de la secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína SIRPa humana en el genoma es desconocida. En otros casos, el animal no humano SIRPa humanizado se genera mediante la integración dirigida, o inserción, de la secuencia de ácido nucleico de SIRPa humana en el genoma, mediante, por ejemplo, recombinación homóloga. En la recombinación homóloga, un polinucleótido se inserta en el genoma hospedador en un locus diana mientras, simultáneamente, se elimina material genómico hospedador, por ejemplo, 50 pares de bases (pb) o más, 100 pb o más, 200 pb o más, 500 pb o más, 1 kb o más, 2 kb o más, 5 kb o más, 10 kb o más, 15 kb o más, 20 kb o más, o 50 kb o más de material genómico, a partir del locus diana. Así, por ejemplo, en un ratón SIRPa humanizado que incluye una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína SIRPa humana creada mediante el direccionamiento de la secuencia de ácido nucleico de SIRPa humana al locus SIRPa de ratón, la secuencia de ácido nucleico de SIRPa humana puede reemplazar algunas o todas las secuencias de ratón, por ejemplo, exones y/o intrones, en el locus SIRPa. En algunos de dichos casos, una secuencia de ácido nucleico de SIRPa humana se integra en el locus de SIRPa de ratón de tal manera que la expresión de la secuencia de SIRPa humana está regulada por las secuencia reguladoras nativas, o endógenas, en el locus SIRPa de ratón. En otras palabras, la(s) secuencia(s) reguladora(s) a la(s) que la secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína SIRPa humana está unida operativamente son las secuencias reguladoras de SIRPa nativas en el locus SIRPa de ratón.

En algunos casos, la integración de la secuencia de SIRPa humana no afecta la transcripción del gen en el que se ha integrado la secuencia de SIRPa humana. Por ejemplo, si la secuencia de SIRPa humana se integra en una secuencia codificante como una inteína, o la secuencia de SIRPa humana incluye un péptido 2A, la secuencia de SIRPa humana se transcribirá y traducirá simultáneamente con el gen en el que se ha integrado la secuencia de SIRPa humana. En otros casos, la integración de la secuencia de SIRPa humana interrumpe la transcripción del gen en el que se ha integrado la secuencia de SIRPa humana. Por ejemplo, tras la integración de la secuencia de SIRPa humana mediante recombinación homóloga, se puede eliminar parte o la totalidad de la secuencia codificante en el locus de integración, de modo que la secuencia de SIRPa humana se transcribe en su lugar. En algunos de dichos casos, la integración de una secuencia de SIRPa humana crea una mutación anuladora y, por lo tanto, un alelo nulo. Un alelo nulo es una copia mutante de un gen que carece por completo de la función normal de ese gen. Esto puede ser el resultado de la ausencia completa del producto génico (proteína, ARN) a nivel molecular, o la expresión de un producto génico no funcional. En el nivel fenotípico, un alelo nulo es indistinguible de una eliminación del locus completo.

En algunos casos, el ratón SIRPa humanizado, por ejemplo, ratón, incluye una copia de la secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína SIRPa humana. Por ejemplo, el ratón puede ser heterocigoto para la secuencia de ácido nucleico. En otras palabras, un alelo en un locus puede incluir la secuencia de ácido nucleico, mientras que el otro puede ser el alelo endógeno. Por ejemplo, como se ha comentado anteriormente, en algunos casos, una secuencia de ácido nucleico de SIRPa humana se integra en el locus de SIRPa de ratón de tal manera que crea un alelo nulo para el ratón SIRPa. El ratón SIRPa humanizado puede ser heterocigoto para la secuencia de ácido nucleico que codifica la SIRPa humana, es decir, el ratón SIRPa humanizado incluye un alelo nulo para la SIRPa de animal no humano (el alelo que incluye la secuencia de ácido nucleico) y un alelo SIRPa endógeno (de tipo silvestre o de otro tipo). En otras palabras, el ratón puede ser un ratón SIRPa h/m, donde "h" representa el alelo que incluye la secuencia humana y "m" representa el alelo endógeno. En otros casos, el SIRPa humanizado incluye dos copias de la secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína SIRPa humana. Por ejemplo, el ratón puede ser homocigoto para la secuencia de ácido nucleico, es decir, ambos alelos para un locus en el genoma diploide incluirán la secuencia de ácido nucleico, es decir, el ratón SIRPa humanizado incluye dos alelos nulos para el SIRPa de ratón (el alelo que incluye la secuencia de ácido nucleico). En otras palabras, el ratón puede ser un ratón SIRPa h/h.

El ratón SIRPa humanizado incluye otras modificaciones genéticas. En la presente invención, el ratón SIRPa humanizado es un animal inmunodeprimido. Por ejemplo, el ratón SIRPa humanizado puede incluir al menos un alelo nulo para el gen Rag2 ("gen 2 activador de la recombinación", en donde la secuencia codificante para el gen de ratón se puede encontrar con el número de registro de Genbank NM_009020.3). En algunas realizaciones, el ratón SIRPa humanizado incluye dos alelos nulos para Rag2. En otras palabras, el ratón SIRPa humanizado puede ser homocigoto nulo para Rag2. Como otro ejemplo, el SIRPa humanizado puede incluir al menos un alelo nulo para el gen IL2rY ("receptor de interleucina 2 y", también conocido como cadena y común, o yC, en donde la secuencia codificante para el gen de ratón se puede encontrar con el número de registro de Genbank NM_013563.3). En algunas realizaciones, el ratón SIRPa humanizado incluye dos alelos nulos para IL2rY. En otras palabras, el ratón SIRPa humanizado es homocigoto nulo para IL2rY, es decir, es IL2ry-/-(o IL2rYY/- donde el gen IL2ry se encuentra en el cromosoma X como en el ratón). En algunas realizaciones, el ratón SIRPa incluye un alelo nulo para Rag2 e IL2ry, es decir, es Rag2-/-IL2ry-/- (o Rag2-/- IL2ryY/- donde el gen IL2rY se encuentra en el cromosoma X como en el ratón). También se contemplan otras modificaciones genéticas. Por ejemplo, el ratón SIRPa humanizado puede incluir modificaciones en otros genes asociados con el desarrollo y/o función de las células hematopoyéticas y el sistema inmunitario, por ejemplo, el reemplazo de uno u más de otros genes de ratón por una secuencia de ácido nucleico que codifica el ortólogo humano. De manera adicional o como alternativa, el ratón SIRPa humanizado puede incluir modificaciones en genes asociados con el desarrollo y/o función de otras células y tejidos, por ejemplo, genes asociados con trastornos o enfermedades humanas, o genes que, cuando se modifican en ratones, proporcionan modelos de trastornos o enfermedades humanas.

ANIMALES NO HUMANOS IL-15 HUMANIZADOS

En la presente divulgación, se proporciona un ratón IL-15 humanizado. Por un ratón IL-15 humanizado, o "ratón IL-15", se entiende un ratón que incluye una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de IL-15 humana. Como se utiliza en el presente documento, "proteína IL-15 humana" significa una proteína que es una proteína IL-15 humana de tipo silvestre (o nativa) o una variante de una proteína IL-15 humana de tipo silvestre (o nativa), que conserva una o más funciones de señalización de una proteína IL-15 humana de tipo silvestre (o nativa), por ejemplo, que permite la estimulación de (o la señalización a través de) el receptor de IL-15 humana, y/o que es capaz de unirse a la subunidad alfa del receptor de IL-15 humana del receptor de IL-15 humana, y/o que es capaz de unirse a IL-2Rp/IL-15R p y la cadena y común (yc). La expresión "proteína IL-15 humana" también abarca fragmentos de una proteína IL-15 humana de tipo silvestre (o variantes de la misma), que conservan una o más funciones de señalización de una proteína IL-15 humana de tipo silvestre, por ejemplo, un fragmento de una proteína IL-15 humana, que permite la estimulación de (o la señalización a través de) el receptor de IL-15 humana, y/o que es capaz de unirse a la subunidad alfa del receptor de IL-15 humana del receptor de IL-15 humana, y/o que es capaz de unirse a IL-2Rp/IL-15R p y la cadena y común (yc).

La expresión "proteína IL-15 humana" también abarca proteínas de fusión, es decir, proteínas quiméricas, que incluyen uno o más fragmentos de una proteína IL-15 humana de tipo silvestre (o una variante de la misma) y que conservan una o más funciones de señalización de una proteína IL-15 humana de tipo silvestre, por ejemplo, como se ha descrito anteriormente. Una proteína de fusión que incluye uno o más fragmentos de una proteína IL-15 humana de tipo silvestre (o una variante de la misma) también puede denominarse en el presente documento proteína IL-15 humanizada.

Una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína IL-15 humana es, por lo tanto, un polinucleótido que incluye una secuencia codificante para una proteína IL-15 humana, es decir, una proteína IL-15 humana de tipo silvestre, una variante de una proteína iL-15 humana de tipo silvestre, un fragmento de una proteína IL-15 humana de tipo silvestre (o una variante de la misma) que conserva una o más funciones de señalización de una proteína IL-15 humana de tipo silvestre, o proteínas de fusión, es decir, proteínas quiméricas, que incluyen uno o más fragmentos de una proteína ⁱL-15 humana de tipo silvestre (o una variante de la misma) y que conservan una o más funciones de señalización de una proteína IL-15 humana de tipo silvestre, por ejemplo, como se ha descrito anteriormente.

IL-15 (también conocida como "Interleucina 15") es una citocina que estimula la proliferación de linfocitos T. La secuencia polipeptídica para la IL-15 humana de tipo silvestre y la secuencia de ácido nucleico que codifica la IL-15 humana de tipo silvestre se pueden encontrar Genbank con los números de registro NM_000585.4; NP_000576.1 (isoforma 1), NM_172175.2; Np_751915.1 (isoforma 2). El locus genómico que codifica la proteína IL-15 humana de tipo silvestre se puede encontrar en el genoma humano en el cromosoma 4; Nc_000004.12 (141636596-141733987). El locus IL-15 humano incluye 8 exones, siendo los exones 3 a 8 exones de codificación. De esta manera, en algunas realizaciones, una secuencia de ácido nucleico que incluye la secuencia codificante de la IL-15 humana incluye uno o más de los exones 3 a 8 del gen IL-15 humano (es decir, los exones de codificación 1 a 6, véase la figura 2). Por ejemplo, se han identificado varias isoformas de ARNm de IL-15 que se producen a través de las siguientes combinaciones de uso de exones Exones 1-2-3-4-5-6-7-8; Exones 1-3-4-5-6-7-8 o Exones 1-3-4-(exón alternativo 5)-5-6-7-8). En algunos casos, la secuencia de ácido nucleico también incluye aspectos del locus genómico de la IL-15 humana, por ejemplo, intrones, secuencia no traducida (UTR) en 3' y/o 5'. En algunos casos, la secuencia de ácido nucleico incluye regiones enteras del locus genómico IL-15 humano. En algunos casos, la secuencia de ácido nucleico incluye los exones 5 a 8 del locus genómico IL-15 humano (es decir, codifica los exones 3 a 6).

En algunos casos, una proteína IL-15 humana de acuerdo con la presente divulgación incluye una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 98 %, al menos aproximadamente un 99 %, o el 100 %, de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEQ ID NO: 31.

En los ratones IL-15 humanizados de la presente solicitud, la secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de IL-15 humana está unida operativamente a una o más secuencias reguladoras de un gen IL-15, por ejemplo, una secuencia reguladora de un gen IL-15 del ratón. Las secuencias reguladoras de IL-15 de ratón son aquellas secuencias del locus genómico de IL-15 de ratón que regulan la expresión de IL-15 de ratón, por ejemplo, las secuencias reguladoras en 5', por ejemplo, el promotor de IL-15, una región no traducida (UTR) en 5' de IL-15, etc.; las secuencias reguladoras en 3', por ejemplo, la 3'-UTR; y potenciadores, etc. IL-15 de ratón se encuentra en el cromosoma 8, NC_000074.6 (82331624-82403227, complemento), y la secuencia codificante de IL-15 de ratón puede encontrarse en Genbank con los números de registro NM_008357.2 (variante 1); NM_001254747.1 (variante 2). Las secuencias reguladoras de IL-15 murina están bien definidas en la materia y pueden identificarse fácilmente mediante métodos informáticos, por ejemplo, haciendo referencia a los números de registro de Genbank anteriores en el navegador UCSC Genome, en la web mundial en genome.ucsc.edu, o mediante métodos experimentales como se describe en la materia. En algunos casos, por ejemplo, cuando la secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína IL-15 humana se localiza en el locus genómico IL-15 de ratón, las secuencias reguladoras unidas operativamente a la secuencia codificante IL-15 humana son endógenas, o nativas, del genoma de ratón, es decir, se presentaron en el genoma de ratón antes de la integración de las secuencias de ácido nucleico humanas.

En algunos casos, el animal no humano IL-15 humanizado, por ejemplo, ratón, se genera mediante la integración aleatoria, o inserción, de una secuencia de ácido nucleico humano que codifica una proteína IL-15 humana (incluidos los fragmentos descritos anteriormente), es decir, una "secuencia de ácido nucleico de IL-15 humana", o "secuencia IL-15 humana", en el genoma. Normalmente, la localización de la secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína IL-15 humana en el genoma es desconocida. En otros casos, el animal no humano IL-15 humanizado se genera mediante la integración dirigida, o inserción, de la secuencia de ácido nucleico de IL-15 humana en el genoma, mediante, por ejemplo, recombinación homóloga. En la recombinación homóloga, un polinucleótido se inserta en el genoma hospedador en un locus diana mientras, simultáneamente, se elimina material genómico hospedador, por ejemplo, 50 pares de bases (pb) o más, 100 pb o más, 200 pb o más, 500 pb o más, 1 kb o más, 2 kb o más, 5 kb o más, 10 kb o más, 15 kb o más, 20 kb o más, o 50 kb o más de material genómico, a partir del locus diana. Así, por ejemplo, en un ratón IL-15 humanizado que incluye una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína IL-15 humana creada mediante el direccionamiento de la secuencia de ácido nucleico de IL-15 humana al locus de IL-15 de ratón, la secuencia de ácido nucleico de IL-15 humana puede reemplazar algunas o todas las secuencias de ratón, por ejemplo, exones y/o intrones, en el locus IL-15. En algunos de dichos casos, una secuencia de ácido nucleico de IL-15 humana se integra en el locus de IL-15 de ratón de tal manera que la expresión de la secuencia de IL-15 humana está regulada por las secuencias reguladoras nativas, o endógenas, en el locus IL-15 de ratón. En otras palabras, la(s) secuencia(s) reguladora(s) a la(s) que la secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína IL-15 humana está unida operativamente son las secuencias reguladoras de IL-15 nativas en el locus IL-15 de ratón.

En algunos casos, la integración de la secuencia de IL-15 humana no afecta la transcripción del gen en el que se ha integrado la secuencia de IL-15 humana. Por ejemplo, si la secuencia de IL-15 humana se integra en una secuencia codificante como una inteína, o la secuencia de IL-15 humana incluye un péptido 2A, la secuencia de IL-15 humana se transcribirá y traducirá simultáneamente con el gen en el que se ha integrado la secuencia de IL-15 humana. En otros casos, la integración de la secuencia de IL-15 humana interrumpe la transcripción del gen en el que se ha integrado la secuencia de IL-15 humana. Por ejemplo, tras la integración de la secuencia de IL-15 humana mediante recombinación homóloga, se puede eliminar parte o la totalidad de la secuencia codificante en el locus de integración, de modo que la secuencia de IL-15 humana se transcribe en su lugar. En algunos de dichos casos, la integración de una secuencia de IL-15 humana crea una mutación anuladora y, por lo tanto, un alelo nulo. Un alelo nulo es una copia mutante de un gen que carece por completo de la función normal de ese gen. Esto puede ser el resultado de la ausencia completa del producto génico (proteína, ARN) a nivel molecular, o la expresión de un producto génico no funcional. En el nivel fenotípico, un alelo nulo es indistinguible de una eliminación del locus completo.

En algunos casos, el ratón IL-15 humanizado, incluye una copia de la secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína IL-15 humana. Por ejemplo, el ratón puede ser heterocigoto para la secuencia de ácido nucleico. En otras palabras, un alelo en un locus incluirá la secuencia de ácido nucleico, mientras que el otro será el alelo endógeno. Por ejemplo, como se ha comentado anteriormente, en algunos casos, una secuencia de ácido nucleico de IL-15 humana se integra en el locus de IL-15 del animal no humano, por ejemplo, de ratón, de tal manera que crea un alelo nulo para la IL-15 del animal no humano. En algunas dichas realizaciones, el animal no humano IL-15 humanizado puede ser heterocigoto para la secuencia de ácido nucleico que codifica la IL-15 humana, es decir, el ratón IL-15 humanizado incluye un alelo nulo para la IL-15 del animal no humano (el alelo que incluye la secuencia de ácido nucleico) y un alelo IL-15 endógeno (de tipo silvestre o de otro tipo). En otras palabras, el ratón es un animal no humano IL-15 h/m, donde "h" representa el alelo que incluye la secuencia humana y "m" representa el alelo endógeno. En otros casos, la IL-15 humanizada incluye dos copias de la secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína IL-15 humana. Por ejemplo, el ratón puede ser homocigoto para la secuencia de ácido nucleico, es decir, ambos alelos para un locus en el genoma diploide incluirán la secuencia de ácido nucleico, es decir, el ratón IL-15 humanizado incluye dos alelos nulos para la IL-15 de ratón (el alelo que incluye la secuencia de ácido nucleico). En otras palabras, el ratón es un ratón IL-15h/h.

RATONES SIRPa-IL-15 HUMANIZADOS

Al cruzar ratones IL-15 humanizados como se describe anteriormente con ratones SIRPa humanizados como se describe anteriormente, se pueden producir ratones genéticamente modificados que expresan tanto SIRPa humana como IL-15 humana. En la presente invención, dichos ratones genéticamente modificados son deficientes para un sistema inmunitario endógeno, por ejemplo, animales inmunodeprimidos, por ejemplo, como resultado de un alelo nulo para uno o ambos Rag2 e IL2rY. Por ejemplo, un ratón de acuerdo con la presente divulgación es Rag2'/_ y/o IL2rY-/-(o Rag2'/_ y/o IL2ryY/' donde el gen IL2ry se encuentra en el cromosoma X como en el ratón). En algunas realizaciones, se proporciona un ratón modificado genéticamente en donde el ratón modificado genéticamente es SIRPah/m IL-15h/m Rag2-/- IL2rYY/-, SIRPah/h IL-15h/m Rag2'/‘ IL2rYY/- o SIRPah/m IL-15h/h Rag2'/‘ IL2rYY/-.

En la presente invención, se proporciona un ratón modificado genéticamente que incluye una secuencia de ácido nucleico incorporada en el genoma del modificado genéticamente cuya secuencia codifica una proteína SIRPa humana y está unida operativamente a un promotor del gen SIRPa; y una secuencia de ácido nucleico incorporada en el genoma del modificado genéticamente, cuya secuencia codifica una proteína IL-15 humana y está unida operativamente a un promotor del gen IL-15, en donde el modificado genéticamente expresa la proteína SIRPa humana y la proteína IL-15 humana.

En la presente invención, el promotor del gen SIRPa es un promotor del gen SIRPa no humano endógeno en el locus del gen SIRPa del animal no humano.

En la presente invención, el promotor del gen IL-15 es un promotor del gen IL-15 en el locus del gen IL-15 del animal no humano.

En algunas realizaciones, un modificado genéticamente como se describe en el presente documento expresa ARNm de IL-15 humana en el hígado, pulmón, médula ósea (MO), intestino delgado (ID) y colon.

En algunas realizaciones, un ratón modificado genéticamente, que expresa tanto SIRPa humana como IL-15 humana, como se describe en el presente documento, presenta un mayor porcentaje y número de linfocitos T humanos y células NK que un ratón modificado genéticamente que expresa solo SIRPa humana, después del injerto con células hematopoyéticas humanas, por ejemplo, células CD45+. En algunas realizaciones, un ratón genéticamente modificado que expresa tanto SIRPa humana como IL-15 humana, como se describe en el presente documento, presenta un mayor porcentaje y número de células NK en sangre y bazo. En algunas realizaciones, un ratón modificado genéticamente que expresa tanto SIRPa humana como IL-15 humana, como se describe en el presente documento, incluye ambos subconjuntos de células NK humanas, CD56brillanteCD16‘ y CD56oscuroCD16+, en la sangre, bazo e hígado, después del injerto con células hematopoyéticas humanas, por ejemplo, células CD45+. En algunas realizaciones, un ratón modificado genéticamente, que expresa tanto SIRPa humana como IL-15 humana, como se describe en el presente documento, presenta una distribución similar de células NK CD16+ frente a CD16- en sangre como la distribución de células NK CD16+ frente a CD16- en PBMC obtenidas de sujetos humanos.

En algunas realizaciones, un ratón modificado genéticamente, que expresa tanto SIRPa humana como IL-15 humana, como se describe en el presente documento, incluye células n K en el hígado del ratón modificado genéticamente que presentan un nivel de expresión más elevado de CD16 y CD56, lo que indica una mayor maduración de las células NK, en relación con un ratón modificado genéticamente que solo expresa SIRPa humana, después del injerto con células hematopoyéticas humanas, por ejemplo, células CD45+.

En algunas realizaciones, un ratón modificado genéticamente, que expresa tanto SIRPa humana como IL-15 humana, como se describe en el presente documento, e injertado con células hematopoyéticas humanas, por ejemplo, células CD45+, incluye células Nk en el bazo que presentan un nivel de expresión distinto de receptores inhibidores citolíticos, con la población de células NK CD56oscuroCD16+ que incluye el mayor porcentaje de células que expresan CD158, similar a lo que se encuentra para los subconjuntos de células NK en la sangre de seres humanos.

En algunas realizaciones, un ratón modificado genéticamente, que expresa tanto SIRPa humana como IL-15 humana, como se describe en el presente documento, e injertado con células hematopoyéticas humanas, por ejemplo, células CD45+, presenta una mayor frecuencia de linfocitos T CD45+ y CD8+ humanos en la población de linfocitos intraepiteliales en relación con un ratón modificado genéticamente, que solo expresa SIRPa humana. En algunas realizaciones, un ratón modificado genéticamente, que expresa tanto SIRPa humana como IL-15 humana como se describe en el presente documento, e injertado con células hematopoyéticas humanas, presenta una distribución de células NK CD16+ frente a CD16- comparable en los LIE, y más células NK CD16+ que CD16- en la sangre y el bazo, lo que refleja la fisiología humana normal.

En algunas realizaciones, un ratón modificado genéticamente, que expresa tanto SIRPa humana como IL-15 humana, como se describe en el presente documento, e injertado con células hematopoyéticas humanas, por ejemplo, células CD45+, presenta un mayor número de linfocitos T humanos en el pulmón en relación con un ratón modificado genéticamente que solo expresa SIRPa humana. En algunas dichas realizaciones, dicho ratón genéticamente modificado presenta un nivel más elevado de expresión de CD69 en linfocitos T CD8+ humanos en el pulmón en relación con un ratón genéticamente modificado que expresa solo SIRPa humana.

En algunas realizaciones, un ratón modificado genéticamente, que expresa tanto SIRPa humana como IL-15 humana, como se describe en el presente documento, e injertado con células hematopoyéticas humanas, por ejemplo, células CD45+, presenta un nivel más elevado de expresión de CD69 en linfocitos T ^cD8+ humanos en el hígado en relación con un ratón modificado genéticamente que expresa solo SIRPa humana.

En algunas realizaciones, un ratón modificado genéticamente, que expresa tanto SIRPa humana como IL-15 humana, como se describe en el presente documento, e injertado con células hematopoyéticas humanas, presenta placas de Peyer discernibles que son predominantemente CD45+ humana.

En una realización, el sujeto genéticamente modificado es un ratón, por ejemplo, un ratón de una cepa C57BL (por ejemplo, C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr, C57BL/Ola, etc.); un ratón de la cepa 129 (por ejemplo, 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1 (por ejemplo, 129S1/SV, 129S1/SvIm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2); un ratón de la cepa BALB; por ejemplo, BALB/c; y similares. Véase, por ejemplo, Festing et al. (1999) Mammalian Genome 10:836, véase también, Auerbach et al. (2000) "Establishment and Chimera Analysis of 129/SvEv- and C57BL/6-Derived Mouse Embryonic Stem Cell Lines)". En otra realización, un ratón es una mezcla de las cepas antes mencionadas.

En la presente invención, el ratón genéticamente modificado sujeto es inmunodeficiente. "Inmunodeficiencia", incluye deficiencias en uno o más aspectos del sistema inmunitario nativo o endógeno de un animal, por ejemplo, el animal es deficiente para uno o más tipos de células inmunitarias del hospedador en funcionamiento, por ejemplo, deficiente para el número y/o función de linfocitos B no humanos, número y/o función de linfocitos T no humanos, número y/o función de células NK no humanas, etc.

Un método para lograr la inmunodeficiencia en los sujetos animales es la irradiación subletal. Por ejemplo, las crías de ratón genéticamente modificadas recién nacidas pueden irradiarse de forma subletal, por ejemplo, 2 * 200 cGy con un intervalo de cuatro horas. Como alternativa, la inmunodeficiencia se puede lograr mediante una cualquiera de una serie de mutaciones genéticas conocidas en la materia, cualquiera de las cuales puede cruzarse sola o en combinación con los animales no humanos genéticamente modificados objeto de la presente divulgación o que puede utilizarse como fuente de células madre en las que se pueden introducir las modificaciones genéticas de la presente divulgación. Los ejemplos no limitantes incluyen SCID ligada a X, asociada con mutaciones del gen IL2ry y caracterizada por el fenotipo de linfocitos T(-) B(+) NK(-); SCID autosómica recesiva asociada con mutaciones del gen Jak3 y caracterizada por el fenotipo de linfocitos T(-) B(+) NK(-); mutaciones del gen ADA caracterizadas por el fenotipo de linfocitos T(-) B(-) NK(-); mutaciones de la cadena a de IL-7R caracterizadas por el fenotipo de linfocitos T(-) B(+) NK(+); mutaciones CD36 o £ caracterizadas por el fenotipo de linfocitos T(-) B(+) NK(+); mutaciones RAG1 y RAG2 caracterizadas por el fenotipo de linfocitos T(-) B(-) NK(+); mutaciones del gen Artemis caracterizadas por el fenotipo de linfocitos T(-) B() NK(+), mutaciones del gen CD45 caracterizadas por el fenotipo de linfocitos T(-) B(+) NK(+); y mutaciones Prkdcscid caracterizadas por el fenotipo de linfocitos T(-), B(-). De esta manera, en algunas realizaciones, el animal no humano inmunodeficiente modificado genéticamente tiene una o más deficiencias seleccionadas de una deficiencia de la cadena y del receptor IL2 (IL2ryy/_), una deficiencia de Jak3, una deficiencia de ADA, una deficiencia de IL7R, una deficiencia de CD3, una deficiencia de RAG1 y/o RAG2, una deficiencia de Artemis, una deficiencia de CD45 y una deficiencia de Prkdc. Estos y otros modelos animales de inmunodeficiencia serán conocidos por el experto en la materia, cualquiera de los cuales puede utilizarse para generar animales inmunodeficientes de la presente divulgación.

En algunas realizaciones, ratones genéticamente modificados de acuerdo con la invención encuentran uso como receptores de células hematopoyéticas humanas que son capaces de desarrollar células inmunitarias humanas a partir de células hematopoyéticas humanas injertadas. De esta manera, en algunos aspectos de la invención, el sujeto animal genéticamente modificado es un ratón genéticamente modificado inmunodeficiente al que se le han injertado células hematopoyéticas humanas.

INJERTO DE RATONES SIRPa-IL-15 HUMANIZADOS

Como se ha comentado anteriormente, en algunos aspectos de la invención, el ratón SIRPa-IL-15 humanizado, por ejemplo, a un ratón hSIRPa hIL-15 Rag2'/'IL2ryY/', o un ratón hSIRPa hIL-15 irradiado subletalmente, se le injerta, o trasplanta, células. Las células pueden ser células mitóticas o células posmitóticas, e incluyen células de interés tales como células madre pluripotentes, por ejemplo, células ME, células MPi y células germinales embrionarias; y células somáticas, por ejemplo, fibroblastos, células hematopoyéticas, neuronas, células musculares, células óseas, células endoteliales vasculares, células intestinales y similares, y sus progenitores y precursores restringidos por linaje. Las poblaciones de células de interés particular incluyen aquellas que comprenden células madre hematopoyéticas o progenitoras, que contribuirán o reconstituirán el sistema hematopoyético del animal no humano SlRPa-IL-15 humanizado, por ejemplo, leucocitos de sangre periférica, células hepáticas fetales, hueso fetal, timo fetal, ganglios linfáticos fetales, piel vascularizada, segmentos arteriales y células madre hematopoyéticas purificadas, por ejemplo, CMH movilizadas o CMH de sangre del cordón umbilical.

Cualquier fuente de células hematopoyéticas humanas, células madre hematopoyéticas (CMH) humanas y/o células madre hematopoyéticas progenitoras (CMHP) como se conocen en la materia o se describen en el presente documento pueden trasplantarse en los animales no humanos inmunodeficientes genéticamente modificados de la presente divulgación. Una fuente adecuada de células hematopoyéticas humanas conocida en la materia son las células sanguíneas del cordón umbilical humano, en particular las células positivas para CD34 (CD34+). Otra fuente de células hematopoyéticas humanas es el hígado fetal humano. Otra fuente es la médula ósea humana. También se incluyen las células madre pluripotentes inducidas (CMPi) y las células madre hematopoyéticas inducidas (CMHi) producidas por la desdiferenciación de células somáticas, por ejemplo, mediante métodos bien conocidos en la materia.

Las células pueden ser de cualquier especie de mamífero, por ejemplo, murina, roedor, caninas, felina, equina, bóvido, ovina, primate, humana, etc. Las células pueden ser de estirpes celulares establecidas o pueden ser células primarias, donde "células primarias", "estirpes celulares primarias" y "cultivos primarios" se utilizan indistintamente en el presente documento para referirse a células y cultivos celulares que proceden de un sujeto y que se les ha permitido crecer in vitro durante un número limitado de pasajes, es decir, divisiones, del cultivo. Por ejemplo, los cultivos primarios son cultivos que pueden haber sido pasados 0 veces, 1 vez, 2 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces o 15 veces, pero no pasan por la etapa de crisis suficientes veces. Normalmente, las estirpes celulares primarias de la presente invención se mantienen durante menos de 10 pases in vitro.

Si las células son células primarias, pueden recogerse de un individuo por cualquier método conveniente. Por ejemplo, las células, por ejemplo, las células sanguíneas, por ejemplo, los leucocitos, pueden recogerse mediante aféresis, leucocitaféresis, separación por gradiente de densidad, etc. Como otro ejemplo, las células, por ejemplo, de la piel, músculo, médula ósea, bazo, hígado, páncreas, pulmón, intestino, tejido estomacal, etc. pueden recogerse mediante biopsia. Puede utilizarse una solución apropiada para la dispersión o suspensión de las células recogidas. Dicha solución generalmente será una solución de sal equilibrada, por ejemplo, salmuera normal, PBS, solución de sal equilibrada de Hank, etc., convenientemente complementada con suero fetal de ternero u otros factores de origen natural, junto con un tampón aceptable a baja concentración, generalmente de 5 a 25 mM. Los tampones convenientes incluyen HEPES, tampones fosfato, tampones lactato, etc.

En algunos casos, se trasplantará en el ratón humanizado una población heterogénea de células. En otros casos, una población de células que se enriquece para un tipo particular de célula, por ejemplo, una célula progenitora, por ejemplo, una célula progenitora hematopoyética, se injertará en el ratón humanizado. El enriquecimiento de una población de células de interés puede ser mediante cualquier técnica de separación conveniente. Por ejemplo, las células de interés pueden enriquecerse mediante métodos de cultivo. En dichos métodos de cultivo, normalmente, se añaden factores de crecimiento y nutrientes particulares a un cultivo que promueven la supervivencia y/o la proliferación de una población de células sobre otras. Otras condiciones de cultivo que afectan la supervivencia y/o la proliferación incluyen crecimiento en sustratos adherentes o no adherentes, cultivo durante periodos de tiempo particulares, etc. Dichas condiciones de cultivo son bien conocidas en la materia. Como otro ejemplo, las células de interés pueden enriquecerse mediante la separación de las células de interés de la población inicial mediante técnicas de separación por afinidad. Las técnicas para la separación por afinidad pueden incluir separación magnética que utiliza perlas magnéticas recubiertas con un reactivo de afinidad, cromatografía de afinidad, "cribado" con un reactivo de afinidad unido a una matriz sólida, por ejemplo, una placa, agentes citotóxicos unidos a un reactivo de afinidad o utilizado junto con un reactivo de afinidad, por ejemplo, complemento o citotoxinas, u otra técnica conveniente. Las técnicas que proporcionan una separación precisa incluyen clasificador celular activado por fluorescencia, que puede tener diversos grados de sofisticación, como canales de color múltiples, canales de detección de dispersión de luz de ángulo bajo y obtuso, canales de independencia, etc. Las células pueden seleccionarse contra células muertas mediante el empleo de colorantes asociados con células muertas (por ejemplo, yoduro de propidio). Puede emplearse cualquier técnica que no sea indebidamente perjudicial para la viabilidad de las células de interés.

Por ejemplo, utilizando técnicas de separación por afinidad, las células que no son las células de interés para el trasplante pueden agotarse de la población al poner en contacto la población con reactivos de afinidad que reconocen específicamente y unen selectivamente marcadores que no se expresan en las células de interés. Por ejemplo, para enriquecer a una población de células progenitoras hematopoyéticas, se podrían agotar las células que expresan marcadores de células hematopoyéticas maduras. De manera adicional o como alternativa, la selección positiva y la separación se pueden realizar mediante el contacto de la población con reactivos de afinidad que reconocen específicamente y unen selectivamente marcadores asociados con células progenitoras hematopoyéticas, por ejemplo, CD34, CD133, etc. Por "unión selectiva" se entiende que la molécula se une preferentemente a la diana de interés o se une con mayor afinidad a la diana que a otras moléculas. Por ejemplo, un anticuerpo se unirá a una molécula que incluye un epítopo para el que es específico y no a epítopos no relacionados. En algunas realizaciones, el reactivo de afinidad puede ser un anticuerpo, es decir, un anticuerpo que es específico para CD34, CD133, etc. En algunas realizaciones, el reactivo de afinidad puede ser un receptor o ligando específico para CD34, CD133, etc., por ejemplo, un ligando peptídico y receptor; moléculas efectoras y receptoras, un receptor de linfocitos T específico para CD34, CD133, etc., y similares. En algunas realizaciones, pueden utilizarse reactivos de afinidad múltiple específicos para el marcador de interés.

Los anticuerpos y los receptores de linfocitos T que se utilizan como reactivos de afinidad pueden ser monoclonales o policlonales, y pueden ser producidos por animales transgénicos, animales inmunizados, linfocitos B humanos o de animal inmortalizados, células transfectadas con vectores de ADN que codifica el anticuerpo o el receptor de linfocitos T, etc. Los detalles de la preparación de anticuerpos y su idoneidad para su uso como miembros de unión específica son bien conocidos por los expertos en la materia. De particular interés es la utilización de anticuerpos marcados como reactivos de afinidad. De manera conveniente, estos anticuerpos están conjugados con un marcador para su uso en la separación. Los marcadores incluyen perlas magnéticas, que permiten la separación directa; biotina, que se puede eliminar con avidina o estreptavidina unida a un soporte; fluorocromos, que pueden utilizarse con un clasificador celular activado por fluorescencia; o similares, para permitir la facilidad de separación del tipo de célula particular. Los fluorocromos que encuentran utilidad incluyen ficobiliproteínas, por ejemplo, ficoeritrina y aloficocianinas, fluoresceína y rojo Texas. Con frecuencia, cada anticuerpo se marca con un fluorocromo diferente, para permitir la clasificación independiente para cada marcador.

La población inicial de células se pone en contacto con el (los) reactivo(s) de afinidad y se incuba durante un período de tiempo suficiente para unir los antígenos de superficie celular disponibles. La incubación generalmente será de al menos aproximadamente 5 minutos y generalmente de menos de aproximadamente 60 minutos. Es deseable tener una concentración suficiente de anticuerpos en la mezcla de reacción, de modo que la eficacia de la separación no está limitada por la falta de anticuerpos. La concentración adecuada se determina mediante valoración, pero normalmente será una dilución de anticuerpo en el volumen de la suspensión celular que es aproximadamente 1:50 (es decir, 1 parte de anticuerpo frente a 50 partes de volumen de reacción), aproximadamente 1:100, aproximadamente 1:150, aproximadamente 1:200, aproximadamente 1:250, aproximadamente 1:500, aproximadamente 1:1000, aproximadamente 1:2000 o aproximadamente 1:5000. El medio en el que se suspenderán las células será cualquier medio que mantenga la viabilidad de las células. Un medio preferido es solución salina tamponada con fosfato que contiene del 0,1 al 0,5 % de BSA o del 1 al 4 % de suero de cabra. Diversos medios están disponibles en el mercado y pueden usarse de acuerdo con la naturaleza de las células, incluido el medio Eagle modificado de Dulbecco (dMEM), la solución salina equilibrada de Hank (HBSS), la solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (dPBS), RPMI, medio de Iscove, p Bs con EDTA 5 mM, etc., con frecuencia complementados con suero fetal de ternero, BSA, HSA, suero de cabra, etc.

Las células en la población puesta en contacto que se marcan con el reactivo de afinidad se seleccionan mediante cualquier técnica de separación por afinidad conveniente, por ejemplo, como se describe anteriormente o como se conoce en la materia. Después de la separación, las células separadas pueden recogerse en cualquier medio adecuado que mantenga la viabilidad de las células, que generalmente tiene una banda de suero en el fondo del tubo de recogida. Diversos medios están disponibles en el mercado y pueden usarse de acuerdo con la naturaleza de las células, incluidos dMEM, HBSS, dPBS, RPMI, medio de Iscove, etc., con frecuencia complementados con suero fetal de ternero.

Las composiciones altamente enriquecidas para un tipo celular de interés, por ejemplo, células hematopoyéticas, se logran de esta manera. Las células serán aproximadamente un 70 %, aproximadamente un 75 %, aproximadamente un 80 %, aproximadamente un 85 %, aproximadamente un 90 % o más de la composición celular, aproximadamente un 95 % o más de la composición celular enriquecida y, preferentemente, serán aproximadamente un 95 % o más de la composición celular enriquecida. En otras palabras, la composición será una composición sustancialmente pura de las células de interés.

Las células que se van a trasplantar en los ratones SIRPa-IL-15 humanizados, sea una población heterogénea de células o una población enriquecida de células, pueden trasplantarse inmediatamente. Como alternativa, las células pueden congelarse a temperaturas de nitrógeno líquido y almacenarse durante largos períodos de tiempo, descongelándose y siendo capaces de reutilizarse. En dichos casos, las células generalmente se congelarán en DMSO al 10 %, suero al 50 %, medio tamponado al 40 % o alguna otra solución similar como se utiliza normalmente en la materia para conservar las células a dichas temperaturas de congelación, y se descongelarán de la manera normalmente conocida en la materia para descongelar células cultivadas congeladas. De manera adicional o como alternativa, las células pueden cultivarse in vitro en diversas condiciones de cultivo. El medio de cultivo puede ser líquido o semisólido, por ejemplo, que contiene agar, metilcelulosa, etc. La población celular puede suspenderse convenientemente en un medio nutriente apropiado, tal como DMEM modificado de Iscove o RPMI-1640, normalmente complementado con suero fetal de ternero (aproximadamente de un 5 a un 10 %), L-glutamina, un tiol, particularmente 2-mercaptoetanol, y antibióticos, por ejemplo, penicilina y estreptomicina. El cultivo puede contener factores de crecimiento a los que las células son sensibles. Los factores de crecimiento, como se define en el presente documento, son moléculas capaces de fomentar la supervivencia, el crecimiento y/o la diferenciación de las células, ya sea en cultivo o en el tejido inalterado, a través de efectos específicos sobre un receptor transmembrana. Los factores de crecimiento incluyen factores polipeptídicos y no polipeptídicos.

Las células pueden modificarse genéticamente antes de trasplantarlas a los ratones SIRPa-IL-15, por ejemplo, para proporcionar un marcador seleccionable o detectable, para inducir un defecto genético en las células (por ejemplo, para el modelado de enfermedades), para reparar un defecto genético o expresar ectópicamente un gen en las células (por ejemplo, para determinar si dichas modificaciones afectarán el curso de la enfermedad), etc. Las células pueden modificarse genéticamente mediante transfección o transducción con un vector adecuado, recombinación de homólogos u otra técnica adecuada, para que expresen un gen de interés, o con un ARNm antisentido, ARNip o ribozimas para bloquear la expresión de un gen no deseado. Se conocen diversas técnicas en la materia para la introducción de ácidos nucleicos en células diana. Para demostrar que se ha modificado genéticamente las células, se pueden emplear diversas técnicas. El genoma de las células puede restringirse y utilizarse con o sin amplificación. Se puede emplear la reacción en cadena de la polimerasa, la electroforesis en gel; el análisis de restricción; las transferencias Southern, Northern y Western; la secuenciación; o similares. Los métodos generales en bioquímica molecular y celular para estos y otros propósitos divulgados en esta solicitud se pueden encontrar en libros de texto convencionales como Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3.a ed. (Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001); Short Protocols in Molecular Biology, 4.a ed. (Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons 1999); "Protein Methods" (Bollag et al., John Wiley & Sons 1996); "Nonviral Vectors for Gene Therapy" (Wagner et al. eds., Academic Press 1999); "Viral Vectors" (Kaplift & Loewy eds., Academic Press 1995); "Immunology Methods Manual" (I. Lefkovits ed., Academic Press 1997); y "Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology" (Doyle & Griffiths, John Wiley & Sons 1998). Los reactivos, vectores de clonación y kits para la manipulación genética a los que se hace referencia en esta divulgación están disponibles en proveedores comerciales como BioRad, Stratagene, Invitrogen, Sigma-Aldrich y ClonTech.

Las células se pueden trasplantar en los animales no humanos humanizados SIRPa-IL-15, por ejemplo, ratones, mediante cualquier método conveniente, incluidos, por ejemplo, inyección intrahepática, inyección en la vena caudal, inyección retroorbital y similares. Normalmente, se trasplantan aproximadamente de 0,5 * 105 a 2*10® células pluripotentes o progenitoras, por ejemplo, aproximadamente de 1 * 105a 1*10® células, o aproximadamente de 2 * 105 a 5 * 105 células. En algunos casos, el animal no humano, por ejemplo, ratón, se irradia subletalmente antes de trasplantar las células humanas. En otras palabras, el animal no humano, por ejemplo, ratón, está expuesto a una dosis subletal de radiación, por ejemplo, como se conoce en la materia. El ratón SIRPa-IL-15 humanizado injertado se mantiene en condiciones de laboratorio de cría de animales durante al menos 1 semana, por ejemplo, 1 semana o más, o dos semanas o más, a veces 4 semanas o más, y en algunos casos 6 semanas o más, tal como 10 semanas o más, o 15 semanas o más, para permitir una reconstitución suficiente del sistema inmunitario con las células injertadas.

Los ratones SIRPa-IL-15 humanizados y los ratones SIRPa-IL-15 humanizados injertados con células hematopoyéticas humanas, por ejemplo, los ratones hSIRPa hIL-15 injertados Rag2'/_IL2rYY/', y, opcionalmente, otras modificaciones genéticas son útiles en muchas aplicaciones. Por ejemplo, estos ratones proporcionan un sistema útil para modelar enfermedades inmunitarias humanas y patógenos humanos. Por ejemplo, los ratones sujetos son útiles para modelar, por ejemplo, el desarrollo y la función de células citolíticas naturales (NK) y/o linfocitos T humanos; la infección por patógenos humanos de tejidos y/o células específicos, por ejemplo, infección por patógenos humanos del intestino o los pulmones, y/o infección por patógenos humanos o respuesta a células NK y/o linfocitos T humanos. Dichos ratones también encuentran uso en la detección in vivo de agentes que inhiben la infección por un patógeno, por ejemplo, un patógeno que afecta (por ejemplo, que infecta) un tejido específico o un tipo de célula, por ejemplo, un patógeno humano del intestino o los pulmones, por ejemplo, un patógeno humano que activa, induce y/o se dirige a linfocitos T y/o células NK; en la selección in vivo de agentes que modulan el desarrollo y/o la función de células NK y/o linfocitos T humanos, por ejemplo, en un estado sano o enfermo; en la selección in vivo de agentes que son tóxicos para las células NK y/o linfocitos T humanos; en la selección in vivo de agentes que evitan, mitigan o revierten los efectos tóxicos de los agentes tóxicos en las células NK y/o linfocitos T humanos; en la selección in vivo de vacunas candidatas inductoras de linfocitos T; y en la selección in vivo e in vitro de agentes que inhiben el crecimiento tumoral y/o la infección mediante la activación de procesos de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) mediados por células NK.

La presente divulgación proporciona resultados inesperados que demuestran que los ratones SIRPa-IL-15 humanizados, injertados con células hematopoyéticas humanas, por ejemplo, ratones hSIRPa hIL-15 injertados Rag2-/-IL2rYY/", desarrollan linfocitos residentes en tejidos, por ejemplo, linfocitos intraepiteliales, en el intestino y el pulmón. Por consiguiente, la presente divulgación proporciona modelos animales no disponibles anteriormente que permiten el control y el ensayo de dichos linfocitos residentes en tejidos. Dichos modelos animales son particularmente útiles para modelar la respuesta inmunitaria de los linfocitos residentes en tejidos, por ejemplo, linfocitos T y células NK, a patógenos humanos que afectan (por ejemplo, que infectan) el intestino y/o el pulmón y para la selección de terapias y vacunas que se dirigen a dichos patógenos y/o inducen o mejoran una respuesta de linfocitos residentes en tejidos. Además, la presencia de estos linfocitos residentes en tejidos también permite el modelado de enfermedades autoinmunitarias impulsadas por células inmunitarias humanas que afectan al tubo gastrointestinal, tal como la enfermedad celíaca y la EII.

Por consiguiente, en algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un modelo in vivo, que incluye un ratón modificado genéticamente que incluye una secuencia de ácido nucleico incorporada en el genoma del animal no humano modificado genéticamente, cuya secuencia codifica una proteína SIRPa humana y está ligada operativamente a un promotor del gen SIRPa. El ratón modificado genéticamente también incluye una secuencia de ácido nucleico incorporada en el genoma del ratón modificado genéticamente, cuya secuencia codifica una proteína IL-15 humana y está unida operativamente a un promotor del gen IL-15. Por último, el ratón modificado genéticamente incluye un injerto de células hematopoyéticas humanas, en donde el animal no humano modificado genéticamente (i) expresa la proteína SIRPa humana y la proteína IL-15 humana, y (ii) incluye linfocitos residentes en tejidos humanos, por ejemplo, linfocitos intraepiteliales (LIE), en el intestino del animal no humano modificado genéticamente. En algunas dichas realizaciones, el ratón genéticamente modificado está infectado con un patógeno humano, por ejemplo, un patógeno humano que afecta (por ejemplo, que infecta) el intestino.

Los patógenos humanos que pueden afectar (por ejemplo, infectar) el intestino incluyen, pero sin limitación, Campylobacter jejuni, Clostridium difficile, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Escherichia coli, rotavirus humano, Listeria monocytogenes, virus de Norwalk, Salmonella enterica, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Shigella dysenteriae, Yersinia pestis, Yersinia enterocolitica y Helicobacter pylori.

En otras realizaciones, la presente divulgación proporciona un modelo in vivo, que incluye un ratón modificado genéticamente que incluye una secuencia de ácido nucleico incorporada en el genoma del ratón modificado genéticamente cuya secuencia codifica una proteína SIRPa humana y está unida operativamente a un promotor del gen SIRPa. El ratón modificado genéticamente también incluye una secuencia de ácido nucleico incorporada en el genoma del animal no humano modificado genéticamente, cuya secuencia codifica una proteína IL-15 humana y está unida operativamente a un promotor del gen IL-15. Por último, el ratón modificado genéticamente incluye un injerto de células hematopoyéticas humanas, en donde el ratón modificado genéticamente (i) expresa la proteína SIRPa humana y la proteína IL-15 humana, y (ii) incluye linfocitos residentes en tejidos humanos, por ejemplo, linfocitos intraepiteliales (LIE), en el pulmón del animal no humano modificado genéticamente. En algunas dichas realizaciones, el animal no humano modificado genéticamente está infectado por un patógeno humano, por ejemplo, un patógeno humano que afecta (por ejemplo, infecta) el pulmón.

Los patógenos humanos que pueden afectar (por ejemplo, infectar) el pulmón incluyen, pero sin limitación, Streptococcus pyogenes, Haemophilus influenza, Corynebacterium diphtheria, el coronavirus del SARS, Bordetella pertussis, Moraxella catarrhalis, virus de la gripe (A, B y C), coronavirus, adenovirus, virus respiratorio sincicial, virus de parainfluenza, virus de las paperas, Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Legionella pneumophila, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, neumonía por micoplasma, tuberculosis por Mycobacterium, Chlamydia Pneumoniae, Blastomyces dermatitidis, Cryptococcus neoformans y Aspergillus fumigatus.

Se necesitan nuevas terapias, nuevas vacunas y nuevas formas de probar la eficacia de terapias y vacunas. Un animal no humano, por ejemplo, ratón, que admita un injerto eficaz de linfocitos T y células NK humanas, por ejemplo, sería útil para identificar nuevas terapias y nuevas vacunas, en particular para un patógeno humano que infecta linfocitos T y/o células NK humanas. Se podrían probar nuevas terapias y nuevas vacunas en dicho animal no humano, por ejemplo, ratón, mediante, por ejemplo, la determinación de la cantidad de un patógeno humano, por ejemplo, un virus, en el animal no humano (en la sangre o en un tejido determinado) en respuesta al tratamiento con un supuesto agente antivírico, o mediante la inoculación al ratón de una supuesta vacuna seguida de la exposición a una administración infecciosa de un patógeno humano, por ejemplo, el VIH, y la observación de cualquier cambio en la infecciosidad debido a la inoculación por la supuesta vacuna en comparación con un control no inoculado con la vacuna pero infectado con el VIH.

Dichos modelos de infección por patógenos en animales no humanos, por ejemplo, un ratón, son útiles en investigación, por ejemplo, para comprender mejor la progresión de una infección humana. Dichos modelos de infección en ratones también son útiles en el descubrimiento de fármacos, por ejemplo, para identificar agentes candidatos que protegen o tratan una infección.

Los animales genéticamente modificados injertados de la presente divulgación encuentran uso en la selección de agentes candidatos para identificar aquellos que tratarán infecciones por patógenos humanos, por ejemplo, patógenos humanos que se dirigen a los linfocitos T y/o células NK humanas. Los términos "tratar", "tratamiento", "que trata" y similares se utilizan en el presente documento para incluir en líneas generales la obtención de un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado. El efecto puede ser profiláctico en lo referente a prevenir completa o parcialmente una enfermedad o un síntoma de la misma y/o puede ser terapéutico en lo referente a una cura parcial o completa para una enfermedad y/o un efecto adverso atribuible a la enfermedad. "Tratamiento", como se utiliza en el presente documento, incluye cualquier tratamiento de una enfermedad de un mamífero e incluye: (a) prevenir que se produzca la enfermedad en un sujeto que pueda tener predisposición a la enfermedad, pero al que aún no se le haya diagnosticado; (b) inhibir la enfermedad, es decir, detener su desarrollo; o (c) aliviar la enfermedad, es decir, provocar la regresión de la enfermedad.

Los términos "individuo", "sujeto", "hospedador", y "paciente" se utilizan indistintamente en el presente documento e incluyen cualquier sujeto mamífero para el que se desea el diagnóstico, tratamiento o terapia, en particular, seres humanos.

Los animales no humanos SIRPa-IL-15 humanizados, por ejemplo, ratones, injertados con células hematopoyéticas humanas proporcionan un sistema útil para seleccionar agentes candidatos para otras actividades deseadas in vivo, así como, por ejemplo, para agentes que pueden modular (es decir, promover o suprimir) el desarrollo y/o la actividad de los linfocitos T y células NK humanas, por ejemplo, en un estado sano o enfermo, por ejemplo, para identificar nuevas terapias y/o desarrollar una mejor comprensión de las bases moleculares del desarrollo y la función del sistema inmunitario; para agentes que son tóxicos para los linfocitos T y/o las células NK y sus progenitores; y para agentes que evitan, mitigan o revierten los efectos tóxicos de agentes tóxicos en linfocitos T, células NK y sus progenitores; para anticuerpos o proteínas de unión a antígeno que median los procesos de ADCC dependientes de células NK, etc. Como otro ejemplo más, los ratones modificados genéticamente descritos en el presente documento proporcionan un sistema útil para predecir la capacidad de respuesta de un individuo a una terapia de enfermedad, por ejemplo, proporcionando una plataforma in vivo para seleccionar la capacidad de respuesta del sistema inmunitario de un individuo a un agente, por ejemplo, un agente terapéutico, para predecir la capacidad de respuesta de un individuo a ese agente.

En ensayos de selección para agentes biológicamente activos, los animales no humanos SIRPa-IL-15 humanizados, por ejemplo, ratones, por ejemplo, ratones hSIRPa hIL-15 injertados Rag2'/_IL2rYY/', que se han injertado con células hematopoyéticas humanas y, en algunos casos, infectados con patógenos humanos, o células para ser injertadas en un animal no humano SIRPa-IL-15 humanizado, por ejemplo, ratón, se ponen en contacto con un agente candidato de interés y se evalúa el efecto del agente candidato mediante el control de uno o más parámetros de producción. Estos parámetros de producción pueden reflejar la viabilidad de las células, por ejemplo, el número total de células hematopoyéticas o el número de células de un tipo de células hematopoyéticas particular, o del estado apoptótico de las células, por ejemplo, la cantidad de fragmentación del ADN, la cantidad de zeiosis celular, la cantidad de fosfatidilserina en la superficie de la célula y similares mediante métodos que son bien conocidos en la materia. Como alternativa o además, estos parámetros de producción pueden reflejar la capacidad de diferenciación de las células, por ejemplo, las proporciones de células diferenciadas y tipos de células diferenciadas, por ejemplo, linfocitos T y/o células NK. Como alternativa o además, estos parámetros de producción pueden reflejar la función de las células, por ejemplo, las citocinas y quimiocinas producidas por las células, la capacidad de las células para dirigirse y extravasarse a un sitio de exposición, la capacidad de las células para modular, es decir, promover o suprimir, la actividad de otras células in vitro o in vivo, etc. Otros parámetros de producción pueden reflejar la extensión de la infección de patógenos en el animal, por ejemplo, el valor del patógeno en el animal no humano, por ejemplo, ratón, etc.

Los parámetros son componentes cuantificables de las células, particularmente componentes que se pueden medir con precisión, deseablemente en un sistema de alto rendimiento. Un parámetro puede ser cualquier componente celular o producto celular, incluido el determinante de la superficie celular, receptor, proteína o la modificación conformacional o postraduccional de la misma, lípido, hidrato de carbono, molécula orgánica o inorgánica, ácido nucleico, por ejemplo, ARNm, ADN, etc. o una porción procedente de dicho componente celular o combinaciones de los mismos. Si bien la mayoría de los parámetros proporcionarán una lectura cuantitativa, en algunos casos, será aceptable un resultado semicuantitativo o cualitativo. Las lecturas pueden incluir un solo valor determinado o pueden incluir la media, el valor de la mediana o la varianza, etc. Característicamente, se obtendrá un intervalo de los valores de lectura del parámetro para cada parámetro a partir de una multiplicidad de los mismos ensayos. Se espera una variabilidad y se obtendrá un intervalo de valores para cada uno de los conjuntos de parámetros de ensayo usando métodos estadísticos convencionales con un método estadístico común usado para proporcionar valores únicos.

Los agentes candidatos de interés para el cribado incluyen compuestos conocidos y desconocidos que abarcan numerosas clases químicas, principalmente moléculas orgánicas, que pueden incluir moléculas organometálicas, moléculas inorgánicas, secuencias genéticas, vacunas, antibióticos u otros agentes sospechosos de tener propiedades antibióticas, péptidos, polipéptidos, anticuerpos, proteínas de unión a antígeno, agentes que han sido aprobados como productos farmacéuticos para su uso en seres humanos, etc. Un aspecto importante de la invención es evaluar fármacos candidatos, incluyendo controles de toxicidad; y similares.

Los agentes candidatos incluyen moléculas orgánicas que incluyen grupos funcionales necesarios para las interacciones estructurales, en particular enlaces de hidrógeno y normalmente incluyen al menos un grupo amina, carbonilo, hidroxilo o carboxilo, con frecuencia, al menos dos de los grupos químicos funcionales. Los agentes candidatos incluyen a menudo estructuras cíclicas de carbono o heterocíclicas y/o estructuras aromáticas o poliaromáticas sustituidas con uno o más de los grupos funcionales anteriores. Los agentes candidatos también se encuentran entre las biomoléculas, que incluyen péptidos, polinucleótidos, sacáridos, ácidos grasos, esteroides, purinas, pirimidinas, derivados, análogos estructurales o combinaciones de los mismos. Se incluyen fármacos farmacológicamente activos, moléculas genéticamente activas, etc. Los compuestos de interés incluyen agentes quimioterapéuticos, hormonas o antagonistas de hormonas, etc. Los ejemplos de agentes farmacéuticos adecuados para esta invención son aquellos descritos en, "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Goodman y Gilman, McGraw-Hill, Nueva York, N.Y., (1996), novena edición. También se incluyen toxinas y agentes de guerra biológicos y químicos, por ejemplo, véase Somani, S. M. (Ed.), "Chemical Warfare Agents", Academic Press, Nueva York, 1992).

Los agentes candidatos de interés para el cribado también incluyen ácidos nucleicos, por ejemplo, ácidos nucleicos que codifican ARNip, ARNhc, moléculas antisentido o ARNmi o ácidos nucleicos que codifican polipéptidos. Se encuentran disponibles muchos vectores útiles para transferir ácidos nucleicos a células diana. Los vectores pueden mantenerse episomalmente, por ejemplo, como plásmidos, ADN de minicírculos, vectores procedentes de virus tales como citomegalovirus, adenovirus, etc., o pueden estar integrados en el genoma de la célula diana, a través de recombinación homóloga o integración aleatoria, por ejemplo, vectores procedentes de retrovirus tales como MMLV, VIH-1, VLA, etc. Los vectores se pueden proporcionar directamente a las células sujeto. En otras palabras, las células pluripotentes se ponen en contacto con vectores que incluyen el ácido nucleico de interés de manera que los vectores son captados por las células.

Los métodos para poner en contacto las células, por ejemplo, células en cultivo o células en un animal no humano, por ejemplo, ratón, con vectores de ácidos nucleicos, tales como electroporación, transfección con cloruro de calcio y lipofección, son bien conocidos en la materia. Como alternativa, el ácido nucleico de interés puede proporcionarse a las células a través de un virus. En otras palabras, las células se ponen en contacto con partículas víricas que incluyen el ácido nucleico de interés. Los retrovirus, por ejemplo, los lentivirus, son particularmente adecuados para el método de la invención. Los vectores retrovíricos comúnmente usados son "defectuosos", es decir, incapaces de producir proteínas víricas necesita para una infección productiva. En su lugar, la replicación del vector necesita crecimiento en una estirpe celular de empaquetamiento. Para generar partículas víricas que incluyen ácidos nucleicos de interés, los ácidos nucleicos retrovíricos que incluyen el ácido nucleico se empaquetan en cápsidas víricas mediante una estirpe celular de empaquetamiento. Las diferentes estirpes celulares de empaquetamiento proporcionan una proteína de envoltura diferente para ser incorporada en la cápside, esta proteína de envoltura determina la especificidad de la partícula vírica para las células. Las proteínas de envoltura son de al menos tres tipos, ecotrópicas, anfotrópicas y xenotrópicas. Los retrovirus empaquetados con proteína de envoltura ecotrópica, por ejemplo, MMLV, son capaces de infectar la mayoría de los tipos de células murinas y de rata, y se generan mediante la utilización de estirpes celulares de empaquetamiento ecotrópico, tales como BOSC23 (Pear et al. (1993) P.N.A.S. 90:8392-8396). Los retrovirus que portan proteína de envoltura anfotrópica, por ejemplo, 4070A (Danos et al, anteriormente citado), son capaces de infectar a la mayoría de los tipos celulares de mamíferos, incluido del ser humano, perros y ratones, y se generan mediante la utilización de estirpes celulares de empaquetamiento anfotrópico, tales como PA12 (Miller et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:431-437); PA317 (Miller et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:2895-2902); GRIP (Danos et al. (1988) PNAS 85:6460-6464). Los retrovirus empaquetados con proteína de envoltura xenotrópica, por ejemplo, AKR env, son capaces de infectar a la mayoría de los tipos celulares de mamíferos, excepto a las células murinas. La estirpe celular de empaquetamiento adecuada puede utilizarse para asegurar que las células de interés, en algún caso, las células injertadas, en algún ejemplo, la célula del hospedador, es decir, los SIRPa-IL-15 humanizados, son el objetivo de las partículas víricas empaquetadas.

Los vectores utilizados para proporcionar el ácido nucleico de interés para las células sujeto incluirán normalmente promotores adecuados para dirigir la expresión, es decir, la activación transcripcional, del ácido nucleico de interés. Esto puede incluir promotores de actuación ubicua, por ejemplo, el promotor CMV-b-actina, o promotores inducibles, tales como promotores que son activos en poblaciones celulares particulares o que responden a la presencia de fármacos tales como tetraciclina. Por activación transcripcional, se pretende que la transcripción se incremente por encima de los niveles basales en la célula diana en al menos aproximadamente 10 veces, en al menos aproximadamente 100 veces, más generalmente en al menos aproximadamente 1000 veces. Además, los vectores utilizados para proporcionar factores de reprogramación a las células sujeto pueden incluir genes que después deben eliminarse, por ejemplo, mediante un sistema de recombinasas, tal como Cre/Lox, o las células que los expresan se destruyen, por ejemplo, incluyendo genes que permiten una toxicidad selectiva, tales como TK de herpesvirus, bcl-xs, etc.

Los agentes candidatos de interés para el cribado también incluyen polipéptidos. Dichos polipéptidos pueden fusionarse opcionalmente a un dominio polipeptídico que aumenta la solubilidad del producto. El dominio puede unirse al polipéptido a través de un sitio de escisión por proteasas definido, por ejemplo, una secuencia TEV, que se escinde mediante la proteasa TEV. El enlazador también puede incluir una o más secuencias flexibles, por ejemplo, de 1 a 10 restos de glicina. En algunas realizaciones, la escisión de la proteína de fusión se realiza en un tampón que mantiene la solubilidad del producto, por ejemplo, en presencia de urea de 0,5 a 2 M, en presencia de polipéptidos y/o polinucleótidos que aumentan la solubilidad y similares. Los dominios de interés incluyen dominios endosomolíticos, por ejemplo, dominio HA de la gripe; y otros polipéptidos que ayudan en la producción, por ejemplo, dominio IF2, dominio GST, dominio GRPE y similares. De manera adicional o como alternativa, dichos polipéptidos pueden formularse para una estabilidad mejorada. Por ejemplo, los péptidos pueden estar PEGilados, donde el grupo polietilenoxi proporciona una vida útil potenciada en el torrente sanguíneo. El polipéptido puede fusionarse a otro polipéptido para proporcionar funcionalidad adicional, por ejemplo, para aumentar la estabilidad in vivo. En general, dichas parejas de fusión son una proteína plasmática estable, que puede, por ejemplo, extender la semivida plasmática in vivo del polipéptido cuando está presente como una fusión, en particular, en donde dicha proteína plasmática estable es un dominio constante de inmunoglobulina. En la mayoría de los casos en que la proteína plasmática estable se encuentra normalmente en una forma multimérica, por ejemplo, inmunoglobulinas o lipoproteínas, en el que las mismas o diferentes cadenas polipeptídicas están unidas normalmente por enlaces disulfuro y/o no covalentemente para formar un polipéptido multicadena ensamblado, en el presente documento, las fusiones que contienen el polipéptido también se producirán y emplearán como un multímero que tiene sustancialmente la misma estructura que el precursor de la proteína plasmática estable. Estos multímeros serán homogéneos en relación con el agente polipeptídico que incluyen o pueden contener más de un agente polipeptídico.

El agente polipeptídico candidato puede producirse a partir de células eucariotas, o puede producirse mediante células procariotas. Puede procesarse adicionalmente mediante despliegue, por ejemplo, desnaturalización por calor, reducción de DTT, etc. y pueden volverse a plegar, mediante métodos conocidos en la materia. Las modificaciones de interés que no alteran la secuencia primaria incluyen derivatización química de polipéptidos, por ejemplo, acilación, acetilación, carboxilación, amidación, etc. También se incluyen modificaciones de glucosilación, por ejemplo, las realizadas mediante la modificación de los patrones de glucosilación de un polipéptido durante su síntesis y procesamiento o en etapas de procesamiento adicionales; por ejemplo, mediante la exposición del polipéptido a enzimas que afectan la glucosilación, tales como enzimas glucosilantes o desglucosilantes de mamífero. También se incluyen secuencias que tienen restos de aminoácidos fosforilados, por ejemplo, fosfotirosina, fosfoserina o fosfotreonina. Los polipéptidos pueden haberse modificado utilizando técnicas biológicas moleculares ordinarias y química sintética para mejorar su resistencia a la degradación proteolítica o para optimizar las propiedades de solubilidad o para hacerlas más adecuadas como agente terapéutico. Los análogos de tales polipéptidos incluyen aquellos que contienen restos distintos de los L-aminoácidos de origen natural, por ejemplo, D-aminoácidos o aminoácidos sintéticos que no son de origen natural. Los D-aminoácidos pueden ser sustituidos por algunos o todos los restos de aminoácidos.

El agente polipeptídico candidato puede prepararse por síntesis in vitro, mediante métodos convencionales conocidos en la materia. Están disponibles diferentes aparatos sintéticos comerciales, por ejemplo, sintetizadores automatizados de Applied Biosystems, Inc., Beckman, etc. Mediante el uso de sintetizadores, los aminoácidos de origen natural pueden sustituirse por aminoácidos no naturales. La secuencia particular y la forma de preparación se determinarán por conveniencia, economía, pureza requerida y similares. Como alternativa, el agente polipeptídico candidato puede aislarse y purificarse de acuerdo con métodos convencionales de síntesis recombinante. Puede prepararse un lisado del hospedador de expresión y purificarse el lisado usando HPLC, cromatografía de exclusión, electroforesis en gel, cromatografía de afinidad u otras técnicas de purificación. En su mayoría, las composiciones que se utilizan incluirán al menos un 20 % en peso del producto deseado, más habitualmente al menos aproximadamente un 75 % en peso, preferentemente al menos aproximadamente un 95 % en peso y, para fines terapéuticos, habitualmente al menos aproximadamente un 99,5 % en peso, en relación con los contaminantes relacionados con el método de preparación del producto y su purificación. Habitualmente, los porcentajes se basarán en la proteína total.

En algunos casos, los agentes polipeptídicos candidatos a cribar son anticuerpos o proteínas de unión a antígeno. El término "anticuerpo" o "fracción de anticuerpo" pretende incluir cualquier estructura molecular que contenga cadenas polipeptídicas con una forma específica que se ajuste a un epítopo y lo reconozca, donde una o más interacciones de unión no covalentes estabilizan el complejo entre la estructura molecular y el epítopo. El ajuste específico o selectivo de una estructura dada y su epítopo específico a veces se denomina ajuste de "bloqueo y llave". La molécula de anticuerpo arquetípica es la inmunoglobulina, y todos los tipos de inmunoglobulinas, IgG, IgM, IgA, IgE, IgD, etc., de todas las fuentes, por ejemplo, ser humano, roedor, conejo, vaca, oveja, cerdo, perro, otros mamíferos, pollo, otras aves, etc., se consideran "anticuerpos". Los anticuerpos utilizados en la presente invención pueden ser anticuerpos policlonales o anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos se proporcionan normalmente en los medios en los que se cultivan las células. Además de los anticuerpos, las proteínas de unión a antígeno abarcan polipéptidos que también están diseñados para unirse a un antígeno de interés y provocar una respuesta, por ejemplo, una reacción inmunitaria. Los fragmentos de unión a antígeno conocidos en la materia (que incluyen, por ejemplo, Fab, Fab', F(ab')₂, Fabc y scFv) también están incluidos en la expresión "proteína de unión a antígeno". Los términos "anticuerpo" y "proteína de unión a antígeno" también incluyen una o más cadenas o fragmentos de inmunoglobulina que pueden conjugarse químicamente, o expresarse como, proteínas de fusión con otras proteínas, anticuerpos monocatenarios y anticuerpos biespecíficos.

Los agentes candidatos pueden obtenerse a partir de una amplia variedad de fuentes que incluyen bibliotecas de compuestos sintéticos o naturales. Por ejemplo, se encuentran disponibles numerosos medios para la síntesis aleatoria y dirigida de una gran variedad de compuestos orgánicos, incluidas las biomoléculas, que incluyen la expresión de oligonucleótidos y oligopéptidos aleatorizados. Como alternativa, se encuentran disponibles o se producen fácilmente bibliotecas de compuestos naturales en forma de extractos bacterianos, fúngicos, vegetales y animales. Además, las bibliotecas y compuestos naturales o producidos de manera sintética se modifican fácilmente por medios químicos, físicos y bioquímicos convencionales, y pueden utilizarse para producir bibliotecas combinatorias. Los agentes farmacológicos conocidos pueden someterse a modificaciones químicas dirigidas o aleatorias, tales como acilación, alquilación, esterificación, amidificación, etc. para producir análogos estructurales.

Los agentes candidatos se criban para la actividad biológica mediante la administración del agente a al menos una y, normalmente, una pluralidad de muestras, a veces junto con muestras que carecen del agente. Se mide el cambio en los parámetros en respuesta al agente y se evalúa el resultado en comparación con los cultivos de referencia, por ejemplo, en presencia y ausencia del agente, obtenido con otros agentes, etc. En los casos en los que se realiza un cribado para identificar los agentes candidatos que evitarán, mitigarán o revertirán los efectos de un agente tóxico, el cribado generalmente se realiza en presencia del agente tóxico, donde el agente tóxico se añade en el momento más apropiado para los resultados a determinar. Por ejemplo, en los casos en los que se prueba la capacidad protectora/preventiva del agente candidato, el agente candidato se puede añadir antes del agente tóxico, simultáneamente con el agente candidato, o después del tratamiento con el agente candidato. Como otro ejemplo, en los casos en que se prueba la capacidad del agente candidato para revertir los efectos de un agente tóxico, el agente candidato se puede añadir después del tratamiento con el agente candidato. Tal como se ha mencionado anteriormente, en algunos casos, la muestra es el animal no humano SIRPa-IL-15 humanizado, por ejemplo, ratón, al que se han injertado células, es decir, se proporciona un agente candidato al animal no humano SIRPa-IL-15 humanizado, por ejemplo, ratón, al que se han injertado células. En algunos casos, la muestra son las células a injertar, es decir, el agente candidato se proporciona a las células antes del trasplante.

Si el agente candidato se va a administrar directamente al animal no humano, por ejemplo, ratón, el agente se puede administrar mediante cualquiera de una serie de métodos bien conocidos en la materia para la administración de péptidos, moléculas pequeñas y ácidos nucleicos. Por ejemplo, el agente puede administrarse por vía oral, mucosa, tópica, intradérmica o por inyección, por ejemplo, inyección intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, intravenosa o intracraneal, y similares. El agente puede administrarse en un tampón, o puede incorporarse en cualquiera de una variedad de formulaciones, por ejemplo, mediante combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable adecuado. "Vehículos farmacéuticamente aceptables" pueden ser vehículos aprobados por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal o enumerados en la Farmacopea de Estados Unidos u otra farmacopea reconocida generalmente para su uso en mamíferos, tales como en seres humanos. El término "vehículo " se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o transportador con el que un compuesto de la invención se formula para la administración a un mamífero. Dichos vehículos farmacéuticos pueden ser lípidos, por ejemplo, liposomas, por ejemplo, dendrímeros liposómicos; líquidos, tales como agua y aceites, incluidos aquellos de origen en el petróleo, de origen animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares, solución salina; goma arábiga, gelatina, pasta de almidón, talco, queratina, sílice coloidal, urea y similares. Además, se pueden utilizar agentes auxiliares, estabilizantes, espesantes, lubricantes y colorantes. Las composiciones farmacéuticas pueden formularse en preparados en forma sólida, semisólida, líquida o gaseosa, tales como comprimidos, cápsulas, polvos, gránulos, pomadas, soluciones, supositorios, inyecciones, inhalantes, geles, microesferas y aerosoles. El agente puede ser sistémico después de la administración o puede localizarse mediante la utilización de administración regional, administración intramural o la utilización de un implante que actúa para retener la dosis activa en el sitio de la implantación. El agente activo puede formularse para actividad inmediata o puede formularse para liberación sostenida. Para algunas afecciones, en particular las afecciones del sistema nervioso central, puede ser necesario formular agentes para cruzar la barrera hematoencefálica (BHE). Una estrategia para la administración de fármacos a través de la barrera hematoencefálica (BHE) implica la interrupción de la BHE, ya sea por medios osmóticos como el manitol o los leucotrienos, o bioquímicamente mediante la utilización de sustancias vasoactivas como la bradicinina. Un agente disruptivo de la BHE puede coadministrarse con el agente cuando las composiciones se administran mediante inyección intravascular. Otras estrategias para pasar por la BHE pueden implicar la utilización de sistemas de transporte endógenos, que incluyen transcitosis mediada por Caveolin-1, transportadores mediados por portadores, tales como portadores de glucosa y aminoácidos, transcitosis mediada por receptor para insulina o transferrina, y transportadores de eflujo activo, tales como p-glucoproteína. Las fracciones de transporte activo también se pueden conjugar con los compuestos terapéuticos para su uso en la invención para facilitar el transporte a través de la pared endotelial del vaso sanguíneo. Como alternativa, la liberación de fármacos por detrás de la BHE puede realizarse mediante liberación local, por ejemplo, mediante liberación intratecal, por ejemplo, a través de un depósito de Ommaya (véanse, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos números 5.222.982 y 5385582); mediante inyección en bolo, por ejemplo, mediante una jeringa, por ejemplo, intravítreal o intracranealmente; mediante infusión continua, por ejemplo, mediante canulación, por ejemplo, con convección (véase, por ejemplo, la solicitud de los Estados Unidos n.° 20070254842); o mediante implantación de un dispositivo sobre el cual el agente se ha fijado de manera reversible (véanse, por ejemplo, las solicitudes de los Estados Unidos n.° 20080081064 y 20090196903,).

Si el agente(s) candidato se proporciona a las células antes del trasplante, los agentes se añaden convenientemente en la solución o en forma fácilmente soluble, al medio de las células en cultivo. Los agentes se pueden añadir en un sistema de flujo continuo, como una corriente, intermitente o continuo, o como alternativa, mediante la adición de un bolo del compuesto, de manera individual o incremental, a una solución de otra manera estática. En un sistema de flujo continuo, se utilizan dos líquidos, donde uno es una solución fisiológicamente neutra y el otro es la misma solución con el compuesto de ensayo añadido. Se hace pasar el primer líquido sobre las células, seguido del segundo. En un único método de solución, se añade un bolo del compuesto de ensayo al volumen del medio que rodea las células. Las concentraciones globales de los componentes del medio de cultivo no deberían cambiar significativamente con la adición del bolo, o entre las dos soluciones en un método de flujo continuo.

Se puede realizar una pluralidad de ensayos en paralelo con diferentes concentraciones del agente para obtener una respuesta diferencial a las diversas concentraciones. Como se conoce en la materia, la determinación de la concentración eficaz de un agente normalmente utiliza un intervalo de concentraciones resultantes de diluciones 1:10 u otras escalas logarítmicas. Las concentraciones pueden refinarse aún más con una segunda serie de diluciones, en caso necesario. Normalmente, una de estas concentraciones sirve como un control negativo, es decir, a una concentración cero o inferior al nivel de detección del agente o a una concentración del agente igual o inferior a la que no produce un cambio detectable en el fenotipo.

Un análisis de la respuesta de las células en un animal no humano SIRPa-IL-15 humanizado, por ejemplo, ratón, al agente candidato puede realizarse en cualquier momento después del tratamiento con el agente. Por ejemplo, las células pueden analizarse 1, 2 o 3 días, a veces 4, 5 o 6 días, a veces 8, 9 o 10 días, a veces 14 días, a veces 21 días, a veces 28 días, a veces 1 mes o más después del contacto con el agente candidato, por ejemplo, 2 meses, 4 meses, 6 meses o más. En algunas realizaciones, el análisis incluye análisis en múltiples puntos temporales. La selección del punto(s) temporal para el análisis se basará en el tipo de análisis que se realizará, tal como entenderá fácilmente el experto en la materia.

El análisis puede incluir medir cualquiera de los parámetros descritos en el presente documento o conocidos en la materia para medir la viabilidad celular, la proliferación celular, la identidad celular, la morfología celular y la función celular, en particular en lo que respecta a las células del sistema inmunitario, por ejemplo, linfocitos T y/o células NK. Por ejemplo, la citometría de flujo puede utilizarse para determinar el número total de células hematopoyéticas o el número de células de un tipo de célula hematopoyética particular. Puede realizarse histoquímica o inmunohistoquímica para determinar el estado apoptótico de las células, por ejemplo, marcado del extremo libre por desoxinucleotidil transferasa terminal dUTP (TUNEL, del inglés, transferase dUTP nick end labeling) para medir la fragmentación del ADN o inmunohistoquímica para detectar anexina V que se une a la fosfatidilserina en la superficie celular. La citometría de flujo también puede emplearse para evaluar las proporciones de células diferenciadas y tipos de células diferenciadas, por ejemplo, para determinar la capacidad de las células hematopoyéticas para diferenciarse en presencia del agente. Se pueden realizar ELISA, transferencias de Western y Northern para determinar los niveles de citocinas, quimiocinas, inmunoglobulinas, etc., expresados en el animal no humano SIRPa-IL-15 humanizado injertado, por ejemplo, ratón, por ejemplo, para evaluar la función de las células injertadas. También se pueden realizar ensayos in vivo para probar la función de las células inmunitarias, así como ensayos oportunos para enfermedades o trastornos de interés particulares, tales como la diabetes, una enfermedad autoinmunitaria, enfermedad de injerto contra hospedador, DMS, etc. Véase, por ejemplo, Current Protocols in Immunology (Richard Coico, ed. John Wiley & Sons, Inc. 2012) e Immunology Methods Manual (I. Lefkovits ed., Academic Press 1997).

Así, por ejemplo, se divulga un método para determinar el efecto de un agente en un patógeno humano, incluida la exposición de un animal no humano SIRPa-IL-15 humanizado injertado, por ejemplo, ratón, por ejemplo, un ratón hSIRPa hIL-15 Rag2-/-IL2rYY/- injertado, a una cantidad eficaz de un patógeno humano, siendo la cantidad eficaz de un patógeno la cantidad de patógeno necesaria para producir una infección en el ratón; que permite al patógeno infectar al ratón; que mide un parámetro de la infección a lo largo del tiempo en presencia del agente; y que compara esa medida con la medida de un animal no humano SIRPa-IL-15 humanizado injertado, por ejemplo, ratón, no expuesto al agente. Se determina que el agente es un agente antipatogénico si reduce la cantidad del agente en la sangre o en un tejido del animal no humano, por ejemplo, ratón, en al menos la mitad después de una sola administración o dos o más administraciones del agente durante un período de tiempo seleccionado.

Como otro ejemplo, se divulga un método para determinar si un aislado o cepa de patógeno de interés es resistente a fármacos, por ejemplo, resistente a múltiples fármacos. En estos métodos, un animal no humano SIRPa-IL-15 humanizado injertado, por ejemplo, ratón, por ejemplo, un ratón hSIRPa hIL-15 Rag2-/-IL2rYY/- injertado, se expone a una cantidad eficaz de un aislado o cepa de patógeno humano de interés, siendo la cantidad eficaz del patógeno la cantidad de patógeno necesaria para producir una infección en el animal no humano, por ejemplo, ratón; se permite que el patógeno infecte al animal no humano; se mide en presencia del fármaco un parámetro de la infección, por ejemplo, el valor del aislado o cepa de interés en la sangre o tejido del animal no humano, la capacidad del aislado o cepa de interés para mantener una infección en el animal no humano, o la capacidad del aislado o cepa de interés para reproducirse en el animal no humano en un punto temporal después de la administración del fármaco; y esa medición se compara con la medición de un animal no humano SIRPa-IL-15 humanizado injertado, por ejemplo, un ratón infectado con patógeno no expuesto al agente. Los ejemplos de fármacos de interés incluyen amoxicilina, ampicilina, cefotaxima, ceftriaxona, ceftazidima, cloranfenicol, ciprofloxacino, cotrimoxazol, ertapenem, imipenem, fluoroquinolonas (por ejemplo, ciprofloxacino, gatifloxacina y ofloxacina), estreptomicina, sulfadiazina, sulfametoxazol, tetraciclina y una combinación de los mismos. La administración del fármaco o combinación de fármacos puede ser al menos una semana, 10 días, dos semanas, tres semanas o cuatro semanas después de una exposición productora de la infección al aislado o cepa de interés.

Además, los ratones SIRPa-IL-15 humanizados y los ratones SIRPa-IL-15 humanizados injertados con células hematopoyéticas humanas, por ejemplo, ratones hSlRPa hIL-15 Rag2'/_IL2rYY/' injertados, y que opcionalmente tienen otras modificaciones genéticas, son útiles para estudiar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) mediada por células NK (por ejemplo, células NK humanas). Dichos animales también son modelos útiles para probar la capacidad de los candidatos a fármacos terapéuticos, por ejemplo, proteínas de unión a antígeno o anticuerpos, diseñados para dirigirse varias células (por ejemplo, tumores o células infectadas) o agentes infecciosos, para activar las vías de las células NK implicadas en la destrucción de dichas células o agentes infecciosos.

Es ampliamente conocido que uno de los mecanismos subyacentes a la terapia con anticuerpos monoclonales es la activación de las células NK a través de la unión del receptor CD16 de Fc de las células NK (receptor Fc gamma IIIA). Se han realizado intentos para aumentar la afinidad de varios candidatos monoclonales conocidos (por ejemplo, rituximab) por Fcgamma RIIIA para mejorar la ADCC (por ejemplo, Bowles et al. Blood 2006; 108:2648-2654; Garff-Tavernier et al. Leukemia 2011; 25:202-209). Tal como se demuestra en el presente documento, los animales no humanos injertados SIRPa-IL-15 humanizados producen células NK humanas que son capaces de mediar en la ADCC; y, por tanto, estos animales presentan un modelo in vivo útil para estudiar los mecanismos de ADCC y seleccionar varios candidatos terapéuticos.

Por lo tanto, las células y los ratones SIRPa-IL-15 humanizados injertados, por ejemplo, las células NK humanas, aislado de los mismos, pueden utilizarse en métodos de selección diseñados para identificar agentes que mejoran la actividad de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) de un tipo de célula injertada en el ratón o células humanizados, por ejemplo, células NK humanas. Por ejemplo, un método adecuado puede incluir la administración de un agente a un ratón SIRPa-IL-15 humanizado injertado y la determinación del efecto del agente sobre la actividad de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) de un tipo de célula injertada in vivo en el ratón humanizado. Dicho efecto puede dar como resultado una mejor destrucción de tumores, por ejemplo, de un tumor trasplantado, por ejemplo, de un tumor humano. Dicho efecto puede dar como resultado una mejor destrucción de células infectadas, por ejemplo, células infectadas por virus o células infectadas por bacterias. Dicho efecto puede dar como resultado una mejor destrucción de una bacteria, un hongo o un parásito. El agente puede ser un anticuerpo o una proteína de unión a antígeno. El anticuerpo o la proteína de unión a antígeno pueden diseñarse para dirigirse a un antígeno expresado en una célula tumoral humana. El anticuerpo o la proteína de unión a antígeno pueden diseñarse para dirigirse a un antígeno expresado en una célula infectada por virus o una célula infectada por bacterias. El anticuerpo o la proteína de unión a antígeno pueden diseñarse para dirigirse a un antígeno bacteriano, fúngico o parasitario. En el presente documento se divulga un método in vitro en donde las células humanas, por ejemplo, las células NK humanas, se aíslan de un ratón SIRPa-IL-15 humanizado injertado y se ponen en contacto in vitro con un agente, tal como un anticuerpo o una proteína de unión a antígeno, y una célula diana (por ejemplo, una célula tumoral) para determinar la eficacia del agente para mediar en la destrucción de la célula diana. El efecto del agente en la actividad citolítica de las células humanas, por ejemplo, las células NK humanas, entonces se puede determinar.

Se proporcionan otros ejemplos de usos para los ratones en cuestión en otra parte del presente documento. Aplicaciones adicionales de los ratones genéticamente modificados e injertados descritos en esta divulgación serán evidentes para los expertos en la materia tras leer esta divulgación.

MÉTODOS PARA HACER LOS ANIMALES NO HUMANOS GENÉTICAMENTE MODIFICADOS EN CUESTIÓN

En el presente documento, que no forma parte de la invención, se divulgan métodos para fabricar los ratones objeto de la presente invención. En la práctica de los métodos divulgados, se genera un animal no humano que incluye una secuencia de ácido nucleico incorporada en el genoma del animal no humano modificado genéticamente, cuya secuencia codifica una proteína SIRPa humana y está unida operativamente a un promotor del gen SIRPa, por ejemplo, un promotor del gen SIRPa endógeno no humano; y una secuencia de ácido nucleico incorporada en el genoma del animal no humano modificado genéticamente, cuya secuencia codifica una proteína IL-15 humana y está unida operativamente a un promotor del gen IL-15, por ejemplo, un promotor del gen IL-15 no humano endógeno.

La generación de un animal no humano que incluye una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína SIRPa humana y está unida operativamente a un promotor SIRPa y/o una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína IL-15 humana y está unida operativamente a un promotor del gen IL-15, puede lograrse mediante cualquier método conveniente para hacer animales modificados genéticamente, por ejemplo, como se conoce en la materia o como se describe en el presente documento.

Por ejemplo, un ácido nucleico que codifica una proteína SIRPa humana o una proteína IL-15 humana puede incorporarse en un vector recombinante de forma adecuada para la inserción en el genoma de la célula hospedadora y la expresión de la proteína humana en una célula hospedadora no humana. El vector recombinante puede incluir la una o más secuencias reguladoras unidas operativamente al ácido nucleico que codifica la proteína humana de una manera que permite la transcripción del ácido nucleico en ARNm y la traducción del ARNm en la proteína humana, como se ha descrito anteriormente. Debe entenderse que el diseño del vector puede depender de factores tales como la elección de la célula hospedadora a transformar y/o la cantidad de proteína humana a expresar.

A continuación, se puede utilizar cualquiera de los diversos métodos para introducir la secuencia de ácido nucleico humano en una célula animal para producir un animal genéticamente modificado que exprese el gen humano. Dichas técnicas son bien conocidas en la materia e incluyen, pero sin limitación, microinyección pronuclear, transformación de células madre embrionarias, recombinación homóloga y técnicas de inserción génica. Los métodos para generar animales modificados genéticamente que se pueden utilizar incluyen, pero sin limitación, los descritos en Sundberg e Ichiki (2006, Genetically Engineered Mice Handbook, CRC Press), Hofker y van Deursen (2002, Genetically modified Mouse Methods and Protocols, Humana Press), Joyner (2000, Gene Targeting: A Practical Approach, Oxford University Press), Turksen (2002, Embryonic stem cells: Methods and Protocols in Methods Mol Biol., Humana Press), Meyer et al. (2010, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 107:15022-15026) y Gibson (2004, A Primer of Genome Science 2.° ed. Sunderland, Massachusetts: Sinauer), la patente de EE. UU. n.° 6.586.251, Rathinam et al. (2011, Blood 118:3119-28), Willinger et al., (2011, Proc Natl Acad Sci USA, 108:2390-2395), Rongvaux et al., (2011, Proc Natl Acad Sci USA, 108:2378-83) y Valenzuela et al. (2003, Nat Biot 21:652-659).

Por ejemplo, los animales modificados genéticamente en cuestión se pueden crear mediante la introducción del ácido nucleico que codifica la proteína humana en un ovocito, por ejemplo, mediante microinyección, y permitiendo que el ovocito se desarrolle en un animal de acogida hembra.

El ácido nucleico puede inyectarse en ovocitos fertilizados. Los ovocitos fertilizados se pueden recoger de hembras superovuladas el día después del apareamiento e inyectarse con la construcción de expresión. Los ovocitos inyectados se cultivan durante la noche o se transfieren directamente a oviductos de hembras pseudoembarazadas 0,5 días p.c. Los métodos para la superovulación, la recogida de ovocitos, la inyección de la construcción de expresión y la transferencia de embriones son conocidos en la materia y se describen en Manipulating the Mouse Embryo (2002, A Laboratory Manual, 3.a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press). La descendencia se puede evaluar para determinar la presencia del ácido nucleico introducido mediante análisis de ADN (por ejemplo, p Cr , transferencia de Southern, secuenciación de ADN, etc.) o mediante análisis de proteínas (por ejemplo, ELISA, transferencia de Western, etc.).

Como otro ejemplo, la construcción que incluye la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína humana puede transfectarse en células madre (por ejemplo, células ME o células MPi) mediante métodos bien conocidos, tales como electroporación, precipitación con fosfato de calcio, lipofección, etc. Las células se pueden evaluar para determinar la presencia del ácido nucleico introducido mediante análisis de ADN (por ejemplo, PCR, transferencia de Southern, secuenciación de ADN, etc.) o mediante análisis de proteínas (por ejemplo, ELISA, transferencia de Western, etc.). Las células que se ha determinado que han incorporado la construcción de expresión se pueden introducir después en embriones de preimplantación. Para una descripción detallada de los métodos conocidos en la materia útiles para las composiciones y métodos de la invención, véase Nagy et al., (2002, Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, 3.a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press), Nagy et al. (1990, Development 110:815-821), la patente de EE. UU. n.° 7.576.259, la patente de EE. UU. n.° 7.659.442, la patente de EE. UU. n.° 7.294.754 y Kraus et al. (2010, Genesis 48:394-399).

Un método para generar un animal modificado genéticamente descrito en el presente documento puede utilizar una construcción dirigida hecha con la tecnología VELOCIGENE®, mediante la introducción de la construcción en células ME y la introducción de los clones de células ME dirigidos en un embrión de ratón con la tecnología VELOCIMOUSE®, como se describe en los ejemplos.

Los animales modificados genéticamente iniciales pueden cruzarse con animales adicionales que lleven la modificación genética. Por ejemplo, los animales no humanos SIRPa humanizados pueden cruzarse con animales no humanos IL-15 humanizados de la misma especie para producir los animales no humanos hSIRPa-hIL-15 descritos en el presente documento. Los animales genéticamente modificados que portan un ácido nucleico que codifica la(s) proteína(s) humana(s) de la presente divulgación pueden cruzarse además con animales inactivados, por ejemplo, un animal no humano que es deficiente para una o más proteínas, por ejemplo, que no expresa uno o más de sus genes, por ejemplo, un animal deficiente en Rag2 y/o un animal deficiente en IL2iy

Como se ha comentado anteriormente, el animal no humano genéticamente modificado en cuestión es un animal inmunodeficiente. Los animales no humanos genéticamente modificados que son inmunodeficientes e incluyen una o más proteínas humanas, por ejemplo, hSIRPa y/o hIL-15, pueden generarse mediante cualquier método conveniente para la generación de animales modificados genéticamente, por ejemplo, como se conoce en la materia o como se describe en el presente documento. Por ejemplo, la generación del animal inmunodeficiente modificado genéticamente se puede lograr mediante la introducción del ácido nucleico que codifica la proteína humana en un ovocito o células madre que incluye un alelo del gen SCID mutante que, cuando es homocigoto, dará como resultado inmunodeficiencia como se describe con mayor detalle anteriormente y en los ejemplos de trabajo del presente documento. A continuación, los ratones se generan con el ovocito modificado o las células ME utilizando, por ejemplo, los métodos descritos en el presente documento y conocidos en la materia, y se aparean para producir los ratones inmunodeficientes que incluyen la modificación genética deseada. Como otro ejemplo, los animales no humanos modificados genéticamente se pueden generar en un entorno inmunocompetente y cruzarse con un animal que incluya un alelo del gen mutante que, cuando es hemicigoto u homocigoto, dará como resultado la inmunodeficiencia, y la progenie se apareará para crear un animal inmunodeficiente que exprese la al menos una proteína humana de interés.

El ratón modificado genéticamente puede tratarse para eliminar las células hematopoyéticas endógenas que pueden existir en el animal no humano modificado genéticamente. El tratamiento puede incluir la irradiación del ratón modificado genéticamente. Las crías de ratón genéticamente modificadas recién nacidas pueden recibir radiación subletal. Las crías recién nacidas pueden irradiarse 2 * 200 cGy con un intervalo de cuatro horas.

Diversas realizaciones de la invención proporcionan animales genéticamente modificados que incluyen un ácido nucleico humano en sustancialmente todas sus células, así como animales genéticamente modificados que incluyen un ácido nucleico humano en algunas, pero no en todas sus células. En algunos casos, por ejemplo en la recombinación dirigida, una copia del ácido nucleico humano se integrará en el genoma de los animales modificados genéticamente. En otros casos, por ejemplo en la integración aleatoria, múltiples copias, adyacentes o distantes entre sí, del ácido nucleico humano pueden integrarse en el genoma de los animales modificados genéticamente.

Por lo tanto, el ratón modificado genéticamente en cuestión es un animal inmunodeficiente que incluye un genoma que incluye un ácido nucleico que codifica un polipéptido humano unido operativamente al correspondiente promotor animal no humano, en donde el animal expresa el polipéptido humano codificado. En otras palabras, el animal no humano inmunodeficiente genéticamente modificado en cuestión incluye un genoma que incluye un ácido nucleico que codifica al menos un polipéptido humano, en donde el ácido nucleico está unido operativamente al correspondiente promotor no humano y a una señal de poliadenilación, y en donde el animal expresa el polipéptido humano codificado.

REACTIVOS, DISPOSITIVOS Y KITS

También se divulgan reactivos, dispositivos y kits de los mismos para practicar uno o más de los métodos descritos anteriormente. Los reactivos, dispositivos y kits de los mismos pueden variar mucho.

Los reactivos o kits pueden incluir uno o más agentes para su uso en los métodos descritos en el presente documento. Por ejemplo, el kit puede incluir un animal no humano SIRPa-IL-15 humanizado, por ejemplo, ratón, por ejemplo, un ratón hSIRPa hIL-15 Rag2-/--IL2rYY/-. El kit puede incluir reactivos para la cría de animales no humanos SIRPa-IL-15 humanizados, por ejemplo, ratones, por ejemplo, cebadores y, en algunos casos, reactivos para el genotipado de animales no humanos SIRPa-IL-15 humanizados, por ejemplo, ratones. El kit puede incluir células hematopoyéticas humanas o una población enriquecida de células progenitoras hematopoyéticas humanas para el trasplante en el animal no humano SIRPa-IL-15 humanizado, por ejemplo, un ratón, o reactivos para preparar una población de células hematopoyéticas o una población enriquecida de células hematopoyéticas de un ser humano para el trasplante en un animal no humano SIRPa-IL-15 humanizado, por ejemplo, un ratón. Otros reactivos pueden incluir reactivos para determinar la viabilidad y/o la función de las células hematopoyéticas o de las células inmunitarias diferenciadas (por ejemplo, linfocitos T y/o células NK), por ejemplo, en presencia/ausencia del agente candidato, por ejemplo, uno o más anticuerpos que son específicos para marcadores expresados por diferentes tipos de células hematopoyéticas o células inmunitarias diferenciadas (por ejemplo, linfocitos T y/o células NK), o reactivos para detectar citocinas particulares, quimiocina, etc. Otros reactivos pueden incluir medios de cultivo, complementos de cultivo, composiciones de matriz o similares.

Además de los componentes anteriores, los kit objeto de la invención pueden incluir además instrucciones para la práctica de los métodos objeto de la invención. Estas instrucciones pueden estar presentes en los kits objetos de la invención en una diversidad de formas, una o más de las cuales pueden estar presentes en el kit. Una forma en la que pueden estar presentes estas instrucciones es como información impresa en un medio o sustrato adecuado, por ejemplo, uno o más trozos de papel en los que se imprime la información, en el envase del kit, en un prospecto, etc. Otro medio más sería un medio legible por ordenador, por ejemplo, disquete, CD, etc., en el que se ha grabado la información. Otro medio más que puede estar presente es la dirección de un sitio web que puede utilizarse a través de Internet para acceder a la información en un sitio remoto. Cualquier medio conveniente puede estar presente en los kits.

Los aspectos, incluidas las realizaciones, de la presente materia descritos anteriormente puede ser beneficiosos solos o en combinación con uno o más aspectos o realizaciones.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se exponen a fin de proporcionar a los expertos en la materia una divulgación y descripción completa de cómo producir y usar la presente invención y no pretenden limitar el alcance de lo que los inventores consideran su invención y tampoco pretenden representar que los experimentos presentados a continuación sean todos o los únicos experimentos llevados a cabo. Se han realizado esfuerzos para garantizar la precisión en relación con los números usados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.) pero deben tenerse en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique de otro modo, las partes son partes en peso, el peso molecular es peso molecular promedio ponderal, la temperatura es en grados centígrados y la presión es atmosférica o cercana a la atmosférica.

Ejemplo 1: Generación de ratones insertados SIRPa humanizados (SRG)

Se generó un ratón insertado SIRPa humano, que expresa el dominio extracelular de SIRPa humana unido operativamente al promotor de SIRPa de ratón (véase la figura 1). Se sabe que la SIRPa humana existe en al menos 10 formas alélicas. En este ejemplo particular, se emplea la variante 1 de SIRPa humana para humanizar un gen SIRPa endógeno de un ratón.

Materiales y métodos

La generación de ratones insertados que codifican SIRPa humana en el entorno genético de 129xBalb/c Rag2-/- IL2rYY/-(N₂) se realizó con tecnología VELOCIGENE® como se describe en mayor detalle a continuación. Los ratones se mantuvieron en condiciones sin patógenos específicos y con tratamiento continuo de enrofloxacino en el agua de bebida (Baytril; 0,27 mg/ml).

Se construyó un vector dirigido para la humanización de una región extracelular de un gen SIRP (por ejemplo, SIRPa) mediante tecnología VELOCIGENE® (véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos n.° 6.586.251 y Valenzuela et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech. 21(6):652-659).

En resumen, el clon bMQ-261H14 del cromosoma artificial bacteriano (BAC, del inglés bacterial artificial chromosome) de ratón se modificó para eliminar la secuencia que contenía los exones 2 a 4 de un gen SIRPa endógeno e insertar los exones 2 a 4 de un gen SIRPa humano usando el clon BAC humano CTD-3035H21. El ADN genómico correspondiente a los exones 2 a 4 de un gen SIRPa endógeno (-8555 pb) se reemplazó en el clon bMQ-261H14 del BAC por un fragmento de ADN de -8581 pb que contenía los exones 2 a 4 de un gen SIRPa humano del clon CTD-3035H21 del BAC. El análisis de secuencia del alelo SIRPa humano contenido en el clon CTD-3035H21 del BAC reveló que el alelo corresponde a la variante 1 humana. Se añadió un casete de neomicina flanqueado por los sitios loxP al final del fragmento de ADN humano de -8581 pb que contenía los exones 2 a 4 del gen SIRPa humano (Figura 1 (abajo)).

Se obtuvieron brazos de homología cadena arriba y cadena abajo a partir de ADN del BAC de ratón en las posiciones 5' y 3' de los exones 2 y 4, respectivamente, y se añadieron al casete de neomicina-fragmento humano de -8581 pb para crear el vector de direccionamiento final para la humanización de un gen SIRPa endógeno, que contenía de 5' a 3' un brazo de homología en 5' que contenía 19 kb de ADN de ratón en 5' del exón 2 del gen SIRPa endógeno, un fragmento de ADN de -8581 pb que contiene los exones 2 a 4 de un gen SIRPa humano, un casete de neomicina flanqueado por sitios loxP y un brazo de homología en 3' que contenía 21 kb de ADN de ratón en 3' del exón 4 de un gen SIRPa endógeno. La inserción dirigida del vector de direccionamiento colocó el casete de neomicina en el quinto intrón de un gen SIRPa de ratón entre los exones 4 y 5. El vector de direccionamiento se linealizó mediante digestión con SwaI y después se utilizó en la recombinación homóloga en células bacterianas para lograr un reemplazo dirigido de los exones 2 a 4 en un gen SIRPa de ratón con los exones 2 a 4 de un gen SIRPa humano (Figura 1 (abajo)).

El ADN diana del BAC (descrito anteriormente) se utilizó para electroporar células ME de ratón Rag2'/_ IL2rYY/- para crear células ME modificadas que incluyen un reemplazo de los exones 2 a 4 en un gen SIRPa de ratón endógeno con un fragmento genómico que incluye los exones 2 a 4 de un gen SIRPa humano. Las células ME positivas que contienen un fragmento genómico que incluye los exones 2 a 4 de un gen SIRPa humano se identificaron mediante PCR cuantitativa usando sondas TAQMa N™ (Lie y Petropoulos, 1998. Curr. Opin. Biotechnology 9:43-48). La secuencia de nucleótidos a través del punto de inserción cadena arriba incluyó lo siguiente, que indica la secuencia endógena de ratón cadena arriba del punto de inserción (contenida en los paréntesis siguientes) unida de forma contigua a la secuencia genómica SIRPa humana presente en el punto de inserción:

(AGCTCTCCTACCACTAGACTGCTGAGACCCGCTGCTCTGCTCAGGACTCG ATTTCCAGTACACAATCTCCCTCTTTGAAAAGTACCACACATCCTGGGGT) GCTCTTGCATTTGTGTGACACTTTGCTAGCCAGGCTCAGTCCTGGGTTCCA GGTGGGGACTCAAACACACTGGCACGAGTCTACATTGGATATTCTTGGT (SEQ ID NO: 1). La secuencia de nucleótidos a través del punto de inserción cadena abajo en el extremo 5' del casete de neomicina incluía lo siguiente, que indica la secuencia genómica SIRPa humana contigua a la secuencia del casete cadena abajo del punto de inserción (contenida entre paréntesis a continuación con la secuencia loxP en cursiva):

GCTCCCCATTCCTCACTGGCCCAGCCCCTCTTCCCTACTCTTTCTAGCCCCT GCCTCATCTCCCTGGCTGCCATTGGGAGCCTGCCCCACTGGAAGCCAG(TC GAGATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATATGGCCTCCGCGC CGGGTTTTGGCGCCTCCCGCGGGCGCCCCCCTCCTCACGGCGA) (SEQ ID NO: 2). La secuencia de nucleótidos a través del punto de inserción cadena abajo en el extremo 3' del casete de neomicina incluía lo siguiente, que indica la secuencia del casete contigua a la secuencia genómica de ratón en 3' del exón 4 de un gen SIRPa endógeno (contenido entre paréntesis a continuación):

CATTCTCAGTATTGTTTTGCCAAGTTCTAATTCCATCAGACCTCGACCTGC AGCCCCTAGATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATGCTAGC(T

GTCTCATAGAGGCTGGCGATCTGGCTCAGGGACAGCCAGTACTGCAAAGA GTATCCTTGTTCATACCTTCTCCTAGTGGCCATCTCCCTGGGACAGTCA) (SEQ ID NO: 3). Después se utilizaron clones de células ME positivas para implantar ratones hembra mediante el método VELOCIMOUSE® (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 7.294.754 y Poueymirou et al., 2007, F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses, Nature Biotech. 25(1):91-99) para generar una camada de crías que contenían una inserción de los exones 2 a 4 de un gen SIRPa humano en un gen SIRPa endógeno de ratón.

Las células ME dirigidas descritas anteriormente se utilizaron como células ME donantes y se introdujeron en un embrión de ratón en la fase de 8 células mediante el método VELOCIMOUSE® (anteriormente citado). Los ratones portadores de la humanización de los exones 2 a 4 de un gen SIRPa endógeno se identificaron mediante genotipado utilizando un ensayo de modificación de alelos (Valenzuela et al., citado anteriormente) que detectó la presencia de las secuencias del gen SIRPa humano.

Los ratones que portan la construcción del gen SIRPa humanizado (es decir, que contienen los exones 2 a 4 de SIRPa humano en un gen SIRPa de ratón) se pueden cruzar con una cepa de ratón con eliminación de Cre (véase, por ejemplo, la publicación de la solicitud de patente internacional n.° WO 2009/114400) a fin de eliminar cualquier casete de neomicina con lox introducido mediante el vector de direccionamiento que no se elimina, por ejemplo, en la fase de célula ME o en el embrión. Opcionalmente, se conserva el casete de neomicina en los ratones. Para obtener ratones Sirpa homocigotos se crían heterocigotos.

Resultados

Los ratones que incluyen un ácido nucleico que codifica una versión humanizada del gen SIRPa de ratón como se describe anteriormente (ratones SRG) muestran expresión fisiológica de una proteína SIRPa humanizada (datos no mostrados). Estos ratones también muestran un injerto de células inmunitarias humanas en el bazo, los ganglios linfáticos (GL) periféricos y el timo comparable al de los ratones NOD scid gamma (NSG) (datos no mostrados).

Ejemplo 2: Generación de ratones SRG IL-15h/h (SRG-15) humanizados insertados

Se ha demostrado que la citocina IL-15 es importante para el desarrollo de células NK de ratón y para la diferenciación y mantenimiento de linfocitos T CD8+ de memoria. Para estudiar los efectos de la IL-15 humana en el desarrollo, diferenciación y mantenimiento de células inmunitarias humanas en el contexto de un modelo animal, se generaron ratones insertados para SIRPa humana con IL-15 humana como se describe con mayor detalle a continuación. En la figura 2 se muestra una representación esquemática de la construcción insertada de IL-15.

Materiales y métodos

Las células ME de ratón se modificaron para reemplazar la secuencia del gen IL-15 de ratón por la secuencia del gen IL-15 humano en el locus endógeno de IL-15 de ratón, bajo el control de los elementos reguladores de la IL-15 de ratón, mediante tecnología de ingeniería genética de VELOCIGENE®, para producir un locus humanizado como se muestra en la figura 2. Se generaron ratones insertados que comprendían IL-15 humana en entornos genéticos 129xBalb/c Rag2'/_ IL2rYY/-. En la figura 2 no se muestra cadena arriba (en relación con la dirección de la transcripción del gen IL-15) los exones no traducidos en 5' del gen de ratón (exones 1 y 2); el exón 1 de codificación (exón 3) de la figura 2 muestra una pequeña región no traducida (sin relleno) cadena arriba del exón de codificación. Excepto como se indica a continuación para el ratón 1, como se muestra en la humanización en la parte inferior de la figura 2, se retuvieron los exones 1 y 2 de codificación de ratón (exones 3 y 4), mientras que los exones 3 a 6 de codificación del ratón (exones 5 a 8) se reemplazaron por los exones 3 a 6 de codificación humanos (exones 5 a 8). En el extremo cadena abajo, el exón 6 de codificación humano (exón 8) va seguido de un codón de parada y una 3'-UTR humana, y además por una secuencia humana que se encuentra cadena abajo de la 3'UTR humana. A efectos de selección, se incluyó un casete de selección (floxado para que Cre lo eliminara). El locus humanizado de la figura 2 expresa una proteína IL-15 madura que es completamente humana.

Específicamente, se realizó una recombinación homóloga bacteriana (RHB) para construir un vector de direccionamiento grande (LTVEC, del inglés large targeting vector) que contenía secuencias del gen IL-15 humano para dirigirse al locus de IL-15 de ratón utilizando técnicas de RHB convencionales (véase, por ejemplo, Valenzuela et al. (2003), citado anteriormente) y reparación de brechas por RHB. Los fragmentos lineales se generaron mediante la unión de las cajas de homología generadas por PCR con casetes clonados, seguido del aislamiento en gel de los productos de unión y la electroporación en bacterias competentes para RHB que albergan el cromosoma artificial bacteriano (BAC) diana. El PRCl₂3-203P7 del BAC de ratón se utiliza como fuente de secuencia de ratón; el RP11-103B12 del BAC humano se utiliza como fuente de la secuencia del gen IL-15 humano. Después de una etapa de selección, los clones correctamente recombinados se identifican mediante PCR a través de uniones novedosas y mediante análisis de restricción. Se preparó un LTVEC que contenía brazos de homología y secuencias del gen IL-15 humano.

El gen IL-15 de ratón (GenelD de ratón: 103014; RefSeq transcript: NM_008357.2; ensembl eID: 16168) se modifica mediante el uso de coordenadas genómicas para la eliminación GRCM38: cr 8: 82331173-82343471 (hebra negativa); coordenadas genómicas para el reemplazo GRCh37: cr 4: 142642924-142655819 (hebra positiva). 12299 nucleótidos de la secuencia de ratón se reemplazaron por 12896 nucleótidos de la secuencia humana. El reemplazo de la secuencia de IL-15 de ratón como se describe anteriormente se presenta gráficamente en la figura 2.

El LTVEC que incluía el gen IL-15 humanizado tenía aproximadamente 13 kb de brazo de direccionamiento de ratón cadena arriba flanqueado cadena arriba con un sitio MluI, y un brazo de direccionamiento de ratón cadena abajo de 27 kb flanqueado cadena abajo con un sitio AscI. El LTVEC se linealizó con MluI y AscI mediante electroporación. Tras la construcción del LTVEC, la secuencia de nucleótidos del LTVEC a través de la unión en 5' de ratón/humano y la unión en 3' de humano/ratón se muestra en la tabla 1 a continuación. La SEQ ID NO: 4 representa la unión cadena arriba (en relación con la dirección de la transcripción del gen IL-15) entre la secuencia de ratón y la secuencia humana; la secuencia que se muestra comienza con la secuencia del ratón en mayúsculas, seguido de un sitio de restricción AsisI en minúsculas, seguido de la secuencia de ácido nucleico de IL-15 humana en mayúsculas. La SEQ ID NO: 5 indica la secuencia codificante y no codificante de IL-15 humana cadena abajo en mayúsculas (3'UTR humana en negrita y cursiva), seguido de un sitio XhoI en minúsculas, seguido de un sitio lox (mayúsculas, cursiva y negrita), seguido de la secuencia del casete de selección neo cadena abajo (mayúsculas), que se extiende 2,6 kb cadena abajo (no se muestra). La SEQ ID NO: 6 es una secuencia de ácido nucleico que representa la unión entre la parte cadena abajo del casete de selección neo (mayúsculas), con el sitio lox (mayúsculas y negrita cursiva), seguido de un sitio NheI (en minúsculas), a la que sigue la secuencia de ratón cadena abajo de la humanización (en mayúsculas); el casete de selección se extiende 2,6 kb cadena arriba.

Tabla 1: Secuencias de unión del locus IL-15 humanizado

(continuación)

(continuación)

Las células ME de ratón se sometieron a electroporación con las construcciones LTVEC, crecieron en medio de selección y se utilizaron como células ME donantes para producir ratones IL-15 humanizados que incluían un reemplazo en el locus de IL-15 de ratón endógeno por la secuencia humana como se representa en la figura 2. Después de la electroporación de la célula ME, se realiza un ensayo de pérdida de alelo nativo (véase, por ejemplo, Valenzuela et al. (2003), citado anteriormente) para detectar la pérdida de la secuencia de IL-15 endógena debido al direccionamiento.

Las células ME correctamente dirigidas se electroporaron adicionalmente con un vector transitorio que expresa Cre para eliminar el casete de selección de fármaco Neo.

Con el método VELOCIMOUSE® se introdujeron células ME de ratón donante, incluido un locus humanizado de IL-15, en embriones de ratón en etapa inicial (Poueymirou et al. (2007) F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses, Nat Biotechnol 25:91-99). Se obtuvieron ratones heterocigotos y se criaron heterocigotos para obtener homocigotos en relación con la IL-15 humanizada. Se generaron dos versiones de ratones IL-15 humanizados (denominados aquí ratón 1 y ratón 2). Tras un análisis más detallado, se encontró que la versión de ratón 1 contenía una duplicación de exón en su genoma. En el ratón 2, el locus de IL-15 de ratón endógeno se reemplazó por la secuencia humana como se representa en la figura 2.

Los niveles de ARNm de IL-15 humana se determinaron como sigue. Se realizó qPCR con retrotranscripción (RT) utilizando un sistema de PCR en tiempo real rápido 7500 (Applied Biosystems) y un kit de qPCR universal SYBR® FAST (KAPA Biosystems). Los cebadores de oligonucleótidos específicos de secuencia se diseñaron utilizando el programa informático Primer3 y se sintetizaron por Sigma-Aldrich. Se usaron los siguientes cebadores: Hprt de ratón directo: 5 '-AGGGATTTGAATCACGTTTG-3'(SEQ ID NO: 7), Hprt de ratón inverso: 5'-TTTACTGGCAACATCAACAG-3' (SEQ ID NO: 8); IL15 humano directo: 5'-GCCCAGGGAAATCAAAAGAT-3' (SEQ ID NO: 9), IL15 humano inverso: 5'-TGGCTCCAACAAATCAACAG-3' (SEQ ID NO: 10). Los valores de expresión relativa se calcularon utilizando el método de ciclo de umbral comparativo y se normalizaron a Hprt de ratón.

Los ratones SRG-15 se generan mediante (1) reproducción de ratones que comprenden el reemplazo de SIRPa humana con ratones que comprenden el reemplazo de IL-15 humana, ambos con entorno Rag2'/_ IL2rYY/-, o (2) la introducción de un gran vector dirigido que comprende IL-15 humana en una célula ME que alberga el reemplazo de SIRPa humana en el entorno Rag2'/_ IL2rYY/-(descrito en el ejemplo 1) y la generación de ratones a partir de células ME que albergan reemplazos de genes IL-15 y SIRPa humanos, así como Rag2'/_ IL2rYY/- utilizando el método VELOCIMOUSE®. Los ratones heterocigotos se crían en homocigosidad.

Resultados

Como se ilustra en las figuras 3A y 3B, se encontraron niveles elevados de expresión de ARNm de IL-15 humana en el hígado, pulmón, médula ósea (MO), intestino delgado (ID) y colon de ratón 1 SRG-15 no injertado. De manera similar, se encontraron niveles elevados de ARNm de IL-15 humana en el hígado, pulmón e intestino delgado de ratón 2 SRG-15 no injertado (Figura 3B). Tal como se muestra en la figura 4, tras la estimulación con poli (I:C), también se pudieron detectar niveles elevados de proteína IL-15 humana en el suero del ratón 2 SRG-15, en donde los exones humanos 5 a 8 reemplazan los exones de ratón endógenos.

Ejemplo 3: Injerto de ratones SRG-15

Materiales y métodos

Los ratones SRG y SRG-15 se injertan como se describe a continuación. Los ratones recién nacidos se irradian subletalmente sin anestesia 3 a 5 días después del nacimiento con 160 cGy y se devuelven a sus madres para que descansen. 4 a 12 horas después de la irradiación, estos neonatos se les trasplantan huHSC CD34+ en 25 μl de PBS por vía intrahepática (i.h.) utilizando una aguja de 30G.

Resultados

Para evaluar el impacto de la IL-15 humana en el desarrollo de células inmunitarias, se comparó el injerto de células CD45+ humanas en ratones NSG, SRG y SRG-15. Se observó un injerto eficaz de células hematopoyéticas humanas en la sangre de ratones NSG, SRG y s RG-15 (ratón 2) 12 a 14 semanas después del injerto como se muestra en la figura 5A. En la figura 5B se proporciona una comparación que muestra el injerto como lo demuestran los números de células CD45+ humanas en la MO bazo, GL, hígado y pulmón de SRG y SRG-15 (ratón 2) 14 semanas después del injerto.

En el ratón 1, aunque el injerto de células CD45+ humanas no fue diferente, se encontró un mayor porcentaje y número de células NK humanas en varios tejidos en ratones SRG-15 en comparación con ratones SRG, como se ilustra en las figuras 6A y 6B. La IL-15 no solo es importante para el desarrollo y la supervivencia de las células NK, sino también para su maduración. Como se muestra en la figura 6C, las células N^khumanas en el hígado de los ratones SRG-15 (ratón 1) tenían un nivel de expresión más elevado de CD16 y CD56, lo que indica una mayor maduración de las células NK en ratones SRG-15 en comparación con ratones SRG. Ambos subconjuntos de células NK humanas, CD56brillanteCD16‘ y CD56°scur°CD16+, se encontraron presentes en la sangre, bazo e hígado de ratones SRG-15, como se muestra en la figura 6D (bazo) (y datos no mostrados). Además, como se muestra en la figura 6D, el análisis de los dos subconjuntos de células NK humanas en el bazo de ratones SRG-15 (ratón 1) mostró que tenían un nivel de expresión distinto de receptores inhibidores citolíticos, con la población de células NK CD56°scu^°CD16+ que incluye el mayor porcentaje de células que expresan CD158. Esto se asemeja a lo que se encuentra para los subconjuntos de células NK en la sangre de seres humanos (datos no mostrados).

Para el ratón 2 SRG-15, se observó un injerto eficaz de células NK humanas en tejidos linfoides y no linfoides como se muestra en las figuras 7A a 7D. En las figuras 7A y 7B se muestra el porcentaje de células n K en sangre y bazo, respectivamente. En las figuras 7C y 7D se muestra la frecuencia de las células NK humanas en la sangre, bazo (B), hígado y pulmón de ratones SRG y SRG-15 (ratón 2) 14 semanas después del injerto. En las figuras 8 y 9A respectivamente se proporcionan datos adicionales que muestran la distribución y el porcentaje de células NK en la sangre y el bazo de ratones SRG y SRG-15 (ratón 2) de diferentes experimentos. En la figura 9B se muestra un aumento en el fragmento hNKp46 de células hCD45+ en la sangre de ratones SRG-15 (ratón 2). En las figuras 9C a 9E se muestran números relativos, distribución y composición de células hCD45+ en el timo de ratones SRG y SRG-15 (ratón 2).

Se caracterizaron los subconjuntos de células NK en seres humanos y ratones SRG-15 (ratón 2). Como se muestra en las figuras 10A y 10B, se observó el aumento de los niveles de hCD-56brillante hCD16‘ y hCD56°scur° hCD16+ en la sangre y el bazo de los ratones SRG-15 en relación con los ratones SRG. Al igual que en seres humanos, se observó expresión de receptores inhibidores citolíticos (KIR) en subconjuntos de células NK en ratones SRG-15 (ratón 2) (Figura 10C). En la figura 10C se muestran células NK CD56brillante CD16' (recuadro izquierdo de cada gráfico) y células NK CD56°scu^° CD16+ (recuadro derecho de cada gráfico). El siguiente histograma muestra la expresión de CD158 en esos subconjuntos. CD158 (KIR2D) en los subconjuntos de células NK en ratones SRG-15 es similar a lo que se observa en células NK procedentes de PBMC humanas.

La distribución de las células NK humanas en la sangre de ratones SRG-15 se comparó con la de la sangre obtenida de dos donantes humanos sanos. Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de capas leucocitarias de dos donantes individuales (obtenidas de BioreclamationlVT, Westbury, NY) sobre Ficoll-Paque; aunque se observó un mayor porcentaje de células NK en sangre en ratones SRG-15 injertados que en PBMC de donantes humanos, se observó una distribución fisiológicamente comparable de células NK citotóxicas (CD16+) frente a células NK productoras de IFN-y (CD16-) (Figura 11).

Por último, un análisis de la médula ósea de SRG y SRG-15 (ratón 2) mostró un mayor desarrollo de células NK humanas en ratones SRG-15 en relación con ratones SRG (Figura 12).

También se evaluó el impacto de la IL-15 humana en el desarrollo de linfocitos T humanos en ratones SRG-15. Una comparación de ratones SRG-15 (ratón 1) con ratones SRG mostró que el efecto de la IL-15 humana en el porcentaje, el número y/o proporción de linfocitos T varió dependiendo del tejido (Figura 13A). El tamaño y la cantidad de ganglios linfáticos en la semana 16 después del injerto no difirieron entre los ratones SRG y SRG-15, lo que confirma los resultados de que el número de linfocitos T humanos en los ganglios linfáticos de ratones SRG y SRG-15 (ratón 1) era similar (Figura 13A). En la figura 13B se muestra un fenotipo de linfocitos T CD8+ humanos en sangre e hígado de ratones SRG y SRG-15 (ratón 1), con un aumento en las células hCD62L' en ratones SRG-15 (ratón 1) en relación con ratones SRG tanto para sangre como para hígado. En las figuras 14A y 14B se proporcionan datos adicionales que caracterizan los linfocitos T de los ratones SRG-15 (ratón 1) en relación con los ratones SRG, que muestran la expresión del marcador CD69 residente en tejido en los linfocitos T CD8+ de pulmón (14A) e hígado (14B) de ratones SRG y SRG-15. Los datos anteriores proporcionan evidencia de un aumento en los linfocitos T residentes en tejido efectores en ratones SRG-15.

Para el ratón 2, la frecuencia de linfocitos T hCD3+ en el bazo, pulmón e hígado en relación con ratones SRG se evaluó 16 semanas después del injerto, como se muestra en las figuras 15A y 15B.

Ejemplo 4: Desarrollo de linfocitos residentes en tejidos humanos en ratones SRG-15

Debido a que se ha demostrado que la IL-15 la producen células epiteliales en el intestino y el pulmón y que puede desempeñar un papel importante para el desarrollo y la supervivencia de los linfocitos T y las células NK residentes en tejidos humanos, se analizaron linfocitos T y células NK residentes en tejido humanos en ratones SRG y SRG-15.

Materiales y métodos

Los ratones recién nacidos se irradian subletalmente sin anestesia 3 a 5 días después del nacimiento con 160 cGy y se devuelven a sus madres para que descansen. 4 a 12 horas después de la irradiación, estos neonatos se les trasplantan huHSC CD34+ en 25 μl de PBS por vía intrahepática (i.h.) utilizando una aguja de 30G.

Resultados

Como se muestra en la figura 17A, el aislamiento de la población de linfocitos intraepiteliales del intestino delgado durante condiciones de estado estacionario en el ratón 1 reveló una mayor frecuencia de células CD45+ humanas en ratones SRG-15 en comparación con ratones SRG. Como se ilustra en la figura 17B, un análisis inmunohistoquímico demostró que las células NL CD45+ humanas se localizaron en la capa de células epiteliales del intestino delgado de ratones SRG-15 (ratón 1) (como indican las flechas en la figura 17B), mientras que se encontraron muy pocos linfocitos intraepiteliales en ratones SRG. Los LIE CD8+ humanos en ratones SRG-15 mostraron una expresión elevada de CD69, el marcador típico de los linfocitos T residentes en tejidos. En contraste con los LIE humanos (Sathaliyawala T, Kubota M, Yudanin N et al. Immunity 2013; 38:187-197), solo una subpoblación de LIE CD8+ humanos en los ratones SRG-15 expresaron el marcador CD103 residente en tejido (Figura 17C). Como se muestra en las figuras 16A y 16B, el fenotipo del aumento de LIE CD8+ humanos en ratones SRG-15 (ratón 1) fue específico ya que hubo poca diferencia en el número de células de la lámina propia en el colon durante el estado estacionario entre ratones SRG y SRG-15. Además del aumento del número de linfocitos T humanos en el pulmón del ratón 1 SRG-15, como se muestra en la figura 13A, también se encontró mayor expresión de CD69 en linfocitos T CD8+ humanos en el pulmón de ratones SRG-15 en comparación con ratones SRG como se muestra en la figura 14A. Además, en la figura 14B se muestra un nivel más elevado de linfocitos T CD8+ que expresan hCD69 en el hígado del ratón 1 SRG-15 en comparación con el ratón SRG.

Similar al ratón 1 SRG-15 injertado, en el ratón 2 SRG-15 injertado, el análisis FACS reveló una mayor proporción de células CD45+ humanas en la fracción de LIE de ratones SRG-15 en comparación con ratones SRG (Figura 18A). Además, mientras que el número de LLP no cambió significativamente entre los ratones SRG y SRG-15 (ratón 2), se observó un aumento significativo en los LIE en los ratones SRG-15 (ratón 2) en relación con los ratones SRG (Figura 18B). La composición de las células hCD3+ en el intestino delgado de ratones SRG-15 (ratón 2) se proporciona en la figura 18C y muestra una mayor proporción de hCD8+ en relación con las células hCD4+. En la figura 18D se proporcionan las características fenotípicas de los linfocitos T hCD3+ hCD8+ en el bazo y el intestino delgado de ratones SRG-15 (ratón 2). Como se ilustra en la figura 18E, un análisis inmunohistoquímico demostró que los LIE CD8+ humanos se localizaron en la capa de células epiteliales del intestino delgado de ratones SRG-15 (ratón 2) (como indican las flechas en la figura 18E), mientras que se encontraron muy pocos linfocitos intraepiteliales en ratones SRG.

Como se indicó anteriormente en relación con las figuras 18A y 18B, en el ratón 2 SRG-15 injertado, se observó una mayor reconstitución de linfocitos intraepiteliales (LIE) humanos residentes en tejido linfoide asociado al intestino (GALT, del inglés gut-associated lymphoid tissue) en comparación con los ratones SRG (figuras 19A y 19C). De manera interesante, la mayoría de los linfocitos humanos observados eran células NK humanas. Como se esperaba para la fisiología humana normal del GALT, la mayoría de las células NK en el ratón 2 SRG-15 tanto en la sangre como en el bazo eran células NK citotóxicas (CD16+), mientras que en los LIE había una distribución comparable de células NK CD16+ frente a CD16-(Figura 19B). No hubo cambios en el número de linfocitos de la lámina propia entre los ratones SRG y SRG-15 injertados (Figura 19C). A diferencia del ratón 1 SRG-15 injertado, en el ratón 2 SRG-15 injertado, una mayor proporción de LIE CD3+ CD8+ humanos expresó el marcador CD103 humano. Las placas de Peyer estaban completamente ausentes en los ratones SRG pero estaban presentes en el ratón 2 SRG-15 y estaban pobladas con linfocitos humanos como se muestra en las figuras 20A y 20B.

Ejemplo 5: Determinación del papel funcional de los linfocitos T residentes en tejidos humanos en ratones SRG-15 durante infecciones víricas

Para probar si los linfocitos T residentes en tejidos en ratones SRG-15 tienen una relevancia funcional durante la homeostasis, se determinó si el aumento del número de LIE CD8 humanos en ratones SRG-15 inducía cambios característicos en la composición de la microbiota intestinal del ratón.

Materiales y métodos

Cuatro semanas después del injerto, los ratones SRG-15 se alojaron juntos durante cuatro semanas con ratones Balb/c SRG y donantes para igualar la microbiota intestinal entre las diferentes cepas. A continuación, los ratones se separaron y las muestras fecales se recogieron y analizaron mediante secuenciación de ARNr 16S. En la figura 21A se proporciona un cronograma para la covivienda y la recogida de muestras de heces para la secuenciación de la microbiota intestinal.

Resultados

Como se ilustra en 21B, para ratón 1, los resultados muestran que no hubo cambios significativos entre los ratones SRG-15 y SRG injertados después de la covivienda, lo que indica que los LIE CD8+ humanos en desarrollo no inducen cambios importantes durante las condiciones de estado estacionario. Se realizaron experimentos adicionales para determinar si los LIE CD8+, que son suficientes para eliminar la infección aguda por rotavirus, pueden eliminar la infección por rotavirus en ratones SRG-15 injertados. Tal como se muestra en la figura 22, los resultados indicaron que la infección aguda por rotavirus se puede eliminar en ratones SRG-15 injertados pero no en ratones SRG no injertados.

Ejemplo 6: Análisis de subconjuntos de células NK en ratones SRG-15 (ratón 2) y seres humanos

Los subconjuntos de células NK en ratones SRG-15 (ratón 2) se caracterizaron por varios marcadores fenotípicos y se compararon con seres humanos.

Materiales y métodos

Los subconjuntos de células NK se detectaron mediante citometría por tiempo de vuelo (CyTOF), como se describe en general en Yao et al. J. of Immunological Methods 415 (2014) 1-5, y analizado mediante ViSNE (el-AD et al. Nat. Biotechnol. junio de 2013; 31(6):545-52doi: 10,1038/nbt.2594. Epub 19 de mayo de 2013).

Resultados

En la figura 23A se proporcionan diagramas ViSNE que muestran análisis basados en CyTOF de 33 parámetros de subconjuntos de células NK CD56brillante CD16'y CD56°scur° CD16+ en seres humanos (n = 20) y ratones SRG-15 (ratón 2) (n = 9). Cada punto representa una sola célula.

En la figura 23B se proporcionan diagramas ViSNE que muestran la intensidad de expresión de ocho marcadores seleccionados en células NK CD56brillante CD16' en seres humanos (n = 20) y ratones SRG-15 (ratón 2) (n = 9).

En los diagramas ViSNE de la figura 23C se muestra la intensidad de expresión de ocho marcadores seleccionados en células NK CD56°scu^° CD16+ en seres humanos (n=20) y ratones SRG-15 (n = 9). Este análisis unicelular multidimensional de 33 moléculas clave de células NK humanas indica que las células NK humanas que se desarrollan en ratones SRG-15 son muy comparables a las células NK humanas en individuos sanos.

Ejemplo 7: Capacidad citotóxica de las células NK de ratones SRG-15

Materiales y métodos

Para estudios in vitro de citotoxicidad de NK, se trataron células NK esplénicas aisladas de ratones SRG y SRG-15 injertados con HSC humana (ratón 2) durante la noche con IL-2 humana. Al día siguiente, las células NK se cultivaron con células diana K562 marcadas con CFSE susceptibles a NK en proporciones variables de efector a diana (E:D). Después del cultivo junto con Shr, la destrucción de las células K562 se midió mediante análisis FACS de la captación de colorante de viabilidad Topro3 por células K562 (controlado en células CFSE+ para distinguir K562 y después análisis de porcentaje positivo para Topro3).

Además, para estudios in vitro de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), se trataron células NK esplénicas aisladas de ratones SRG y SRG-15 injertados con HSC humana durante la noche con IL-2 humana. Al día siguiente, las células NK se cultivaron con células Raji diana marcadas con CFSE en proporciones variables de efector a diana (E:D). Las células Raji se trataron previamente con anti-CD20 (Rituximab) o IgG de control. Después del cultivo junto con Shr, la destrucción de las células Raji se midió mediante análisis FACS de la captación de colorante de viabilidad Topro3 por células Raji (controlado en células CFSE+ y después análisis de porcentaje positivo para Topro3).

Para estudios in vivo de activación de células NK, a ratones SRG y SRG-15 injertados con HSC humana (ratón 2) se les inyectaron por vía intraperitoneal 50 |jg de poli IC. Los ratones se sangraron previamente (antes de la inyección de poli iC) y 18 horas después de la inyección de poli IC. Se analizó CD45+ NKp46+ humana (células NK) para determinar la expresión del marcador de activación CD69 mediante FACS antes y después de la administración de poli IC.

Resultados

En un estudio clásico de citotoxicidad de NK, las células K562 deficientes en HLA de clase I diana NK clásica se sometieron a destrucción mediante células NK activadas de ratones SRG o SRG-15 (ratón 2). Como se muestra en la figura 24C (izquierda), las células NK esplénicas de ratones SRG y SRG-15 mostraron una capacidad citolítica comparable en relación con las células K562 cuando se normalizó el número.

Las células NK suelen ser responsables de la ADCC mediada por anticuerpos anti-CD20 contra las leucemias y linfomas de linfocitos B (véase, por ejemplo, J. Golay et al. Haematologica 2003; 88:1002-12). Con el fin de demostrar la capacidad de las células n K de ratones SRG-15 injertados para facilitar la ADCC mediada por anti-CD20, se probaron células NK esplénicas de ratones SRG y SRG-15 y se demostró que presentaban actividad de toxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) comparable frente a células Raji tratadas con anti-CD20 cuando se normalizó el número de células (Figura 24C (derecha)).

Tal como se representa, por ejemplo, en las figuras 8 y 9, hay un aumento significativo de las células NK tanto en el bazo como en la sangre de los animales SRG-15. La capacidad de activación de las células NK en ratones SRG-15 se probó mediante la medición de la activación del marcador CD69 después de una inyección de poli-IC. Como se muestra en la figura 24A, el porcentaje de células NK positivas para el marcador de activación CD69 aumentó en los ratones SRG-15 en relación con los ratones SRG. Como se demostró que las células NK SRG-15 median la ADCC comparable a las células NK SRG in vitro en condiciones normalizadas, la capacidad de las células NK SRG-15 para presentar un mayor fenotipo activado in vivo, así como un mayor número de células NK en ratones SRG-15, sugiere que los ratones SRG-15 pueden ser un modelo in vivo adecuado para estudiar la ADCC de células NK humanas.

Ejemplo 8: Producción de IFNy a partir de células NK procedentes de SRG y SRG-15

Materiales y métodos

Las células NK se aislaron de esplenocitos agrupados de ratones SRG o SRG-15 (3 bazos por grupo) y las células NK se aislaron utilizando el kit de enriquecimiento EasySep Human NK (StemCell Technologies; n.° de cat 19055). Las células NK también se aislaron de PBMC humanas sanas. Las células NK se trataron durante la noche con 10 ng/ml de IL-2 humana. Al día siguiente, las células se estimularon durante la noche con 10 ng/ml de IL-12p70 humana o 2 mg/ml de poli I:C o se dejaron sin tratar. Al día siguiente, se recogió el sobrenadante y se evaluaron los niveles de IFN^yutilizando el kit ELISA Quantikine de IFN^yhumano (R&D systems; n.° de cat. DIF50). La pureza de las células NK se analizó mediante FACS y los niveles de IFNy se normalizaron como picogramos (μg) producidos por células NK individuales. El análisis estadístico se realizó mediante la prueba ANOVA.

Resultados

Como se muestra en la figura 24B, las células NK procedentes de SRG y SRG-15 tienen una secreción de IFNy comparable, pero menor que la de las células NK procedentes de PBMC humanas tras el tratamiento con IL-12p70. Ejemplo 9: Las células NK humanas inhiben el crecim iento tumoral en ratones SRG-15

Se probó la capacidad de las células NK humanas para infiltrarse en xenoinjertos de tumores humanos e inhibir el crecimiento tumoral en ratones SRG-15 (ratón 2).

Materiales y métodos

Se inyectó i.p. Rituximab cada dos días (comenzado en el día 14 después de la inyección s.c. de 5 millones de células Raji). El crecimiento del tumor se evaluó mediante la medición del calibre y el volumen se calculó utilizando la siguiente fórmula: volumen tumoral = 0,5 * (largo * anchoA2). Se agruparon los datos de 2 experimentos independientes. El análisis estadístico se realizó mediante la prueba de la U de Mann-Whitney bilateral para datos independientes que compara ratones SRG-15 injertados y no tratados con ratones SRG-15 injertados y tratados con RTX (* P <0,05). El tumor s.c. se trituró y se digirió usando colagenasa D (1 hora, 37 °C). Las células recuperadas, incluidas las células tumorales e inmunitarias, se analizaron mediante un citómetro de flujo LSRII.

Resultados

Como se muestra en la figura 25A, las células NK humanas en ratones SRG-15 inhiben el crecimiento tumoral después del tratamiento con rituximab (RTX). En la figura 25B se muestra la frecuencia de células NK y linfocitos T humanos en xenoinjertos de tumores humanos de ratones SRG-15 no tratados (n = 5) y tratados con ^rT^x(n = 1). En la figura 25C se muestran subconjuntos de células NK humanas en la sangre y el tumor de ratones SRG-15 no tratados (n = 2) y tratados con RTX (n = 1).

Ejemplo 10: Materiales y métodos adicionales utilizados en relación con los ejemplos anteriores

Aislam iento e inyección de células CD34+ humanas. El aislamiento y la inyección de células CD34+ humanas se realizó de acuerdo con los métodos descritos, por ejemplo, en Rongvaux A., Willinger T., Martinek J. et al. Nat Biotechnol 2014; 32:364-372.

Análisis de citometría de flu jo de poblaciones de células humanas. El análisis de citometría de flujo de poblaciones de células humanas se realizó como se describe en Strowig T., Rongvaux A., Rathinam C. et al. Proc Natl Acad Set USA 2011; 108:13218-13223, y en Rongvaux A., Willinger T., Martinek J. et al. Nat Biotechnol 2014; 32:364-372. Histología. El tejido se fijó durante la noche en paraformaldehído al 4 %, se transfectó a etanol al 70 % y se incluyó en parafina.

RT-PCR cuantitativa. La RT-PCR cuantitativa se realizó como se describe en Rongvaux A., Willinger T., Martinek J. et al. Nat Biotechnol 2014; 32:364-372.

Secuenciación de ARNr 16S. La secuenciación de ARNr 16S se realizó como se describe en Palm N. W., de Zoete M. R., Cullen T.W. et al. Cell 2014; 158:1000-1010.

Infecciones víricas. Se obtuvieron rotavirus y virus de la influenza y se aplicaron en los métodos en cuestión.

Análisis estadístico. La significación estadística se realizó con el programa informático Prism 6 (GraphPad),

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un ratón modificado genéticamente, que comprende:

una mutación anuladora en el gen SIRPa de ratón en el locus del gen SIRPa de ratón y una secuencia de ácido nucleico incorporada en el genoma del ratón modificado genéticamente, secuencia que codifica una proteína SIRPa humana y está unida operativamente a un promotor del gen SIRPa de ratón endógeno en el locus del gen SIRPa de ratón; y

una mutación anuladora en el gen IL-15 de ratón en el locus del gen IL-15 de ratón y una secuencia de ácido nucleico incorporada en el genoma del ratón modificado genéticamente, secuencia que codifica una proteína IL-15 humana y está unida operativamente a un promotor del gen IL-15 de ratón endógeno en el locus del gen IL-15 de ratón,

en donde el ratón modificado genéticamente expresa la proteína SIRPa humana y la proteína IL-15 humana, en donde el ratón modificado genéticamente es inmunodeficiente y comprende una inactivación del gen Rag2 y una inactivación del gen IL2rg, una inactivación del gen Rag2 o una inactivación del gen IL2rg, y

en donde cuando el ratón modificado genéticamente comprende un injerto de células hematopoyéticas humanas, el ratón modificado genéticamente comprende linfocitos intraepiteliales (LIE) humanos en el pulmón, o intestino delgado y placas de Peyer, del ratón modificado genéticamente.

2. El ratón modificado genéticamente de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la mutación anuladora es una eliminación de al menos los exones 2 a 4 de SIRPa de ratón, en donde el ratón modificado genéticamente es heterocigoto para el alelo que comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína SIRPa humana, o en donde el ratón modificado genéticamente es homocigoto para el alelo que comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína SIRPa humana.

3. El ratón modificado genéticamente de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en donde la proteína SIRPa humana es un fragmento funcional de una proteína SIRPa humana de longitud completa, y/o la proteína IL-15 humana es un fragmento funcional de una proteína IL-15 humana de longitud completa.

4. El ratón modificado genéticamente de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el fragmento funcional comprende un dominio extracelular de SIRPa humana.

5. El ratón modificado genéticamente de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la mutación anuladora es una eliminación de al menos los exones 5 a 8 de IL-15 de ratón, en donde el ratón modificado genéticamente es heterocigoto para el alelo que comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína IL-15 humana, o en donde el ratón modificado genéticamente es homocigoto para el alelo que comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína IL-15 humana.

6. El ratón modificado genéticamente de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el ratón modificado genéticamente comprende un injerto de células hematopoyéticas humanas.

7. El ratón modificado genéticamente de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el ratón modificado genéticamente comprende una infección con un patógeno humano.

8. El ratón modificado genéticamente de acuerdo con la reivindicación 7, en donde el patógeno humano activa, induce y/o se dirige a linfocitos T y/o linfocitos citolíticos naturales (NK), o en donde el patógeno humano es un patógeno que infecta el intestino humano o el pulmón humano.

9. El ratón modificado genéticamente de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el ratón modificado genéticamente comprende LIE en el pulmón del ratón modificado genéticamente.

10. El ratón modificado genéticamente de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el ratón modificado genéticamente comprende LIE en el intestino delgado y placas de Peyer del ratón modificado genéticamente.