CN108588126B - Cd47基因人源化改造动物模型的制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及人源化基因改造非人动物，特别是基因改造啮齿动物，但尤其是基因改造小鼠，具体涉及人源化CD47基因动物模型的构建方法及其在生物医药领域的应用。

Description

CD47基因人源化改造动物模型的制备方法及应用
技术领域
本申请涉及基因改造人源化动物模型的建立方法及应用，具体而言，涉及基于一种CD47基因人源化改造动物模型的构建方法及其在生物医药的应用。
背景技术
CD47(CD47molecule)又称整合素相关蛋白(integrin associated protein，IAP)，是一种细胞表面受体，其包括细胞外IgV-组结构域、5次跨越膜的跨膜结构域、和替代剪接的胞质尾区，其是免疫球蛋白超家族中的一种细胞表面分子，广泛表达于正常和肿瘤细胞的表面，可与多种配体如信号调节蛋白α(Signal regulatory proteinα,SIRPα)、血小板反应蛋白(thrombospondin-1,TSP1)以及整合素(integrins)相互作用，介导细胞凋亡、增殖、免疫等一系列的反应。已有研究报道人CD47基因定位于3q13.12，NCBI基因ID为961，而小鼠Cd47基因定位于16B5，NCBI基因ID为16423。
近年来的研究表明，CD47基因在肿瘤和免疫治疗领域具有巨大应用价值，US8236313披露了在缺血和血流领域中有用的抗体，包括阻断CD47的抗体，以便逆转和/或防止组织缺血和有关且关联的组织与细胞损害。US8101719披露了结合CD47在治疗血液学病症中的应用。此外，现有研究表明CD47在几乎所有人类肿瘤细胞及癌干细胞(CSCs)的表面高度表达。在含有相似类型肿瘤的人群中，表达CD47高的患者寿命更短。CD47抗体已被证明在体外和小鼠异体移植模型中，针对许多不同的人类肿瘤都具有临床前检测活性。由于CD47靶点的治疗策略结合了先天与后天免疫***，联合其它药物和治疗的方法被认为具有更大的治疗潜力，包括与其它治疗性抗体、巨噬细胞增强剂、化疗等的联合用药。总之，抑制CD47-SIRPα信号通路可以对肿瘤产生有效的治疗。尽管由于CD47在正常细胞中广泛性的低表达而存有安全性方面的顾虑，但许多人都将CD47抗体看作是继PD1/PD-L1抗体之后，下一代肿瘤免疫抑制剂的明星靶点(Willingham SB,2012)。此外，CD47在动脉粥样硬化、肥胖和代谢并发症等方面也有相关研究，使用CD47阻断剂能改善多种小鼠模型中的相关疾病表型(Kojima,2015)。
实验动物疾病模型对于研究人类疾病发生的病因、发病机制、开发防治技术和开发药物是不可缺少的研究工具。但由于动物与人类的生理结构和代谢***本身的差异，传统的动物模型并不能很好的反映人体的真实状况，在动物体内建立更接近人类的生理特征的疾病模型是生物医药行业的迫切需求。
随着基因工程技术的不断发展和成熟，用人类基因替代或置换动物的同源性基因已经实现，通过这种方式开发人源化动物模型(humanized animal model)是动物模型未来的重要发展方向。其中基因人源化动物模型，即利用基因编辑技术，用人源正常或突变基因序列替换动物基因组的同源基因序列，可建立更接近人类生理或疾病特征的正常或突变基因动物模型。基因人源化动物不但本身具有重要应用价值，如通过基因人源化可改进和提升异种细胞或组织移植生长的效率，更重要的是，由于人类基因片段的***，动物体内可表达部分或全部人源蛋白，可作为识别人蛋白序列的药物的靶点，为在动物水平进行抗人抗体及其它药物的筛选提供了可能。然而，由于动物与人类在生理学及病理学方面存在差异，加上基因(即遗传因子)的复杂性，如何能构建出“有效”的人源化动物模型用于新药研发仍是最大的挑战(Scheer N,2013)。
目前已有与Cd47相关的动物模型主要是Cd47基因敲除小鼠。最早是Lindberg等人(1996年)为了研究Cd47在体内宿主防御(host defense)中的作用，通过传统胚胎干细胞技术破坏小鼠体内Cd47基因的2号外显子，制备了C57BL/6背景的Cd47-/-小鼠(回交15代)。该小鼠可正常存活，且无明显异常表型。Cd47-/-小鼠接种大肠杆菌更容易出现严重感染而死亡，表明Cd47-/-小鼠确实在宿主防御中存在缺陷(F.P.Lindberg,1996)。他们还使用类似方法制备了Cd47-/-NOD小鼠(Oldenborg，2002)，该小鼠在出生180-280天之内会自发重度自身免疫性溶血性贫血(AIHA)，而NOD小鼠一般是300-500天的年龄才会出现轻度AIHA。Cd47-/-C57BL/6小鼠及与其它品系或基因修饰模型交配得到的多种Cd47-/-小鼠模型，主要应用于Cd47基因的生物学功能(基因型、功能、调控)及相关疾病机制研究(SvenHagnerud，2006；Lundberg P,2007；Ozge,2007；
Figure BDA0001618658140000021
O，2009；Su X.2008；Westlund J，2012)。
在CD47靶点相关药物研发过程中，由于啮齿类如小鼠的CD47蛋白与人CD47蛋白在氨基酸序列上同源性为66％左右，所以，一般情况下识别人CD47蛋白的抗体，无法识别小鼠CD47，即无法用普通小鼠来筛选和评价靶向人源CD47药物的药效。目前研究靶向药物药效广泛使用的是人源肿瘤异体移植小鼠模型，但该类模型在特定靶点研究中的靶向性和特异性不强，且所使用的异体移植的小鼠是免疫缺陷小鼠，而抗人CD47的治疗效果具有巨噬细胞依赖性，因此这类模型研究药效的结果准确性不高(Xiaojuan Liu,2015)。通过人源化改造小鼠体内的Cd47基因，人源化之后的小鼠可以用于靶向人CD47药物的筛选和药效评价。国外Regeneron公司使用传统胚胎干细胞方法将小鼠Cd47基因2-7号外显子用人CD47基因2-7号外显子替换，制备了CD47人源化动物。由于免疫细胞的信号传递包括蛋白受体胞外部分与配体结合、通过穿膜区与其它蛋白聚合形成复合物、以及通过胞内区的特定区域(domain)(如ITIM、ITAM等)跟下游蛋白进行结合并输送信号(A.Neil Barclay，2014)。Regeneron公司的CD47人源化小鼠改造的序列范围较大，包括将胞内参与信号传导的部分鼠源序列也替换为人源序列，将会影响细胞内CD47蛋白下游蛋白的信号传递，从而影响实验结果。此外，该模型制备方法也存在缺陷：回交代次多，往往需要2年以上的时间，耗费时间、资金和人力，且如果回交的次数不同也会造成小鼠遗传背景的差异和试验结果重复性差。
鉴于CD47基因在肿瘤和免疫治疗领域具有巨大应用价值，越来越多的国内外制药企业参与到靶向CD47蛋白的抗体药物研发。为了使临床前期的药效试验更有效并提高研发成功率，本发明在世界范围内提供一种建立CD47基因人源化改造动物模型的新方法，并得到CD47基因人源化动物。具体来说，本发明的目的是制备一种非人动物模型，该动物体内可正常表达CD47蛋白，且表达的CD47蛋白能被识别并结合抗人CD47的抗体，该方法在药物筛选、有效性验证等方面有着广阔的应用前景。此外，本方法得到的非人动物还可与SIRPα人源化非人动物交配得到CD47和SIRPα双基因人源化动物模型，用于筛选和评估针对该信号通路的人用药及药效研究。
发明内容
本发明第一方面，涉及一种人源化动物模型构建的方法，包括导入人CD47基因、使得该人CD47基因在动物细胞中表达并且促进该细胞产生人或人源化CD47蛋白，同时降低或消除了动物体内内源的Cd47基因的表达。
优选的，所述人源化动物模型的基因组中包括人源化CD47基因，所述人源化CD47基因编码人源化CD47蛋白的胞外区、跨膜结构域和胞内区，其中所述跨膜结构域和胞内区为动物来源，所述胞外区的全部或部分由人源部分编码，同时该动物来源部分和人源部分通过序列拼接连接于动物模型内源的Cd47启动子后。
优选的，所述人源化CD47蛋白的胞外区包括IgV结构域，所述人源化CD47基因包括动物来源部分和人源部分，所述人源部分编码IgV结构域。
在本发明的一个实施例中，所述动物来源部分包括动物来源Cd47基因的1号外显子全部序列、2号外显子部分序列、3号外显子及其后所有外显子的全部序列；和/或所述人源部分为编码人CD47多肽的氨基酸的第2号外显子的全部或部分序列。
优选的，使用基因编辑技术进行CD47人源化动物模型的构建，所述基因编辑技术包括基于胚胎干细胞的DNA同源重组技术、CRISPR/Cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术；优选的，使用基于CRISPR/Cas9的基因编辑技术进行CD47人源化动物的构建。
优选的，所述动物来源的Cd47基因为非人类哺乳动物来源的Cd47基因；优选的，所述非人类哺乳动物为啮齿类动物；进一步优选的，所述啮齿类动物为小鼠。
在本发明的另一个实施例中，动物来源的Cd47基因为非人类哺乳动物来源的Cd47基因；优选的，所述非人类哺乳动物为啮齿类动物；进一步优选的，所述啮齿类动物为小鼠。所述小鼠Cd47的mRNA序列的全部或部分片段如SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50或SEQ ID NO：51中的全部或部分片段所示；或者所述小鼠Cd47的蛋白序列的全部或部分片段如SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57或SEQ ID NO：58中的全部或部分片段所示。
在本发明的另一个实施例中，所述人CD47基因的全部或部分片段的人CD47mRNA序列如SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61或SEQ ID NO：62中的全部或部分片段所示；或所述人CD47全部或部分片段的蛋白序列如SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65或SEQ ID NO：66中的全部或部分片段所示。
在本发明的另一个实施例中，动物模型基因组中包括嵌合CD47基因，所述嵌合CD47基因包括小鼠来源的Cd47基因部分和人源的CD47基因部分，所述嵌合CD47基因的嵌合mRNA序列与SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72或SEQ ID NO：73所示的全部或部分序列具有至少80％、或至少90％、或至少95％、或至少95％、或至少99％、至少99.9％的同源性；优选的，所述嵌合CD47基因包括动物来源的Cd47基因部分和人源的CD47基因部分，所述嵌合CD47基因的嵌合mRNA序列如SEQ IDNO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72或SEQID NO：73的全部或部分所示。或者所述动物模型基因组中包括嵌合CD47基因，所述嵌合CD47基因包括动物来源的Cd47基因部分和人源的CD47基因部分，编码所述嵌合CD47基因的蛋白序列与SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：79或SEQ ID NO：80所示的序列的部分或全部具有至少80％、或至少90％、或至少95％、或至少95％、或至少99％、至少99.9％的同源性；优选的，所述动物模型基因组中包括嵌合CD47基因，所述嵌合CD47基因包括动物来源的Cd47基因部分和人源的CD47基因部分，所述嵌合CD47基因的蛋白序列如SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：76、SEQ IDNO：77、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：79或SEQ ID NO：80的部分或全部所示。
优选的，所述人源化动物模型构建的方法，具体涉及将动物来源的Cd47的第2号外显子全部或部分序列替换为人CD47的第2号外显子全部或部分序列，其中，使用sgRNA靶向技术实现上述替换，优选的，所述sgRNA在待改变的非人动物Cd47基因上的靶序列上是唯一的，且符合5’-NNN(20)-NGG3’或5’-CCN-N(20)-3’的序列排列规则，更优选的，所述sgRNA靶向的5’端靶位点序列如SEQ ID NO：1-8任一项所示，3’端靶位点序列如SEQ ID NO：9-17任一项所示。最为优选的，使用的sgRNA靶位点序列为SEQ ID NO：6和/或SEQ ID NO：9。
优选的，所述人源化动物模型构建的方法，其中所述sgRNA的载体的制备方法，包括如下步骤：
(1)提供一种sgRNA序列，制备获得正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列，所述sgRNA序列靶向非人动物Cd47基因，同时所述sgRNA在待改变的非人动物Cd47基因上的靶序列上是唯一的，且符合5’-NNN(20)-NGG3’或5’-CCN-N(20)-3’的序列排列规则；
(2)合成含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA，并将所述片段DNA通过EcoRI和BamHI酶切连接至骨架载体上，经测序验证，获得pT7-sgRNA载体；
(3)将步骤(1)获得的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸变性、退火，形成可以连入步骤(2)所述的pT7-sgRNA载体的双链；
(4)将步骤(3)中退火的双链sgRNA寡聚核苷酸分别与pT7-sgRNA载体进行链接，筛选获得sgRNA载体。
进一步优选的，所述sgRNA载体的制备方法，包括以下步骤：(1)将序列如SEQ IDNO：1-8所示的任一项sgRNA靶序列和/或SEQ ID NO：9-17所示的任一项sgRNA靶序列，制备获得正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列；优选的，所述sgRNA靶序列为SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：9，获得的正向寡核苷酸序列如SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：20所示；反向寡核苷酸序列如SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：21所示，其中SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19为A组，SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21为B组；(2)合成含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA，其中含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA如SEQ ID NO：22所示，将上述片段通过EcoRI和BamHI酶切连接至骨架载体pHSG299上，经测序验证，获得pT7-sgRNAG2载体。(3)分别合成步骤1中所述的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，优选为A组和B组中的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，将合成的sgRNA寡聚核苷酸变性、退火，形成可以连入步骤2所述的pT7-sgRNAG2载体的双链；(4)将步骤3中退火的双链sgRNA寡聚核苷酸分别与pT7-sgRNAG2载体进行链接，筛选获得sgRNA载体。
优选的，所述人源化动物模型的制备方法，具体包括以下步骤：
第一步：按照上述sgRNA载体的制备方法获得sgRNA载体；
第二步：将sgRNA载体的体外转录产物、靶向Cd47基因的载体和Cas9mRNA进行混合，将混合液注射至动物受精***质或细胞核中，将注射后的受精卵转移至培养液中进行培养，然后移植至受体雌性动物的输卵管中发育，得到F0代人源化动物模型；
第三步：将F0代动物利用PCR技术进行检验，验证细胞中的CD47基因改造嵌合动物；
优选的，所述第三步中使用的PCR检测的5'端引物对如SEQ ID NO：35和SEQ IDNO：36所示；3'端引物对如SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38所示。
优选的，所述人源化动物模型的制备方法，所述人源化CD47蛋白为嵌合CD47蛋白，所述嵌合CD47蛋白选自下列组中的一种：
a)嵌合CD47蛋白序列中人CD47的蛋白序列如SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQID NO：65或SEQ ID NO：66部分或全部序列所示；
b)嵌合CD47蛋白序列中人CD47的蛋白序列与SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQID NO：65或SEQ ID NO：66所示氨基酸的序列同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
c)嵌合CD47蛋白序列中编码人CD47的蛋白序列的核酸序列在严格条件下，与编码SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65或SEQ ID NO：66所示的蛋白序列的核苷酸序列杂交；
d)嵌合CD47蛋白序列中人CD47的蛋白序列与SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQID NO：65或SEQ ID NO：66所示的氨基酸的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；
e)嵌合CD47蛋白序列中人CD47的蛋白序列具有SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQID NO：65或SEQ ID NO：66所示的，包括取代、缺失和/或***一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列；
或
f)嵌合CD47蛋白序列中动物CD47的蛋白序列如SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57或SEQ ID NO：58部分或全部序列所示；
g)嵌合CD47蛋白序列中动物CD47的蛋白序列与SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57或SEQ ID NO：58所示氨基酸的序列同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
h)嵌合CD47蛋白序列中编码动物CD47的蛋白序列的核酸序列在严格条件下，与编码SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57或SEQ ID NO：58所示的蛋白序列的核苷酸序列杂交；
i)嵌合CD47蛋白序列中动物CD47的蛋白序列与SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57或SEQ ID NO：58所示的氨基酸的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；
j)嵌合CD47蛋白序列中动物CD47的蛋白序列具有SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57或SEQ ID NO：58所示的，包括取代、缺失和/或***一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列；
和/或
k)嵌合CD47的蛋白序列为SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：76、SEQ IDNO：77、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：79或SEQ ID NO：80的部分或全部；
l)嵌合CD47的蛋白序列与SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：76、SEQ IDNO：77、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：79或SEQ ID NO：80所示氨基酸的序列同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
m)编码嵌合CD47的蛋白的核酸序列在严格条件下，与编码SEQ ID NO：74、SEQ IDNO：75、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：79或SEQ ID NO：80所示的蛋白的核苷酸序列杂交；
n)嵌合CD47的蛋白序列与SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：76、SEQ IDNO：77、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：79或SEQ ID NO：80所示的氨基酸的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；
o)嵌合CD47的蛋白序列具有SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：76、SEQ IDNO：77、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：79或SEQ ID NO：80所示的，包括取代、缺失和/或***一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
优选的，所述人源化动物模型构建的方法，所述嵌合CD47基因编码上述的嵌合CD47蛋白或所述的嵌合CD47基因选自下列组中的一种：
a)嵌合CD47基因序列中来自人CD47基因的mRNA序列如SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61或SEQ ID NO：62所示的序列的部分或全部所示；
b)嵌合CD47基因序列中来自人CD47基因的mRNA序列与SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61或SEQ ID NO：62所示的序列同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
c)嵌合CD47基因序列中来自人CD47基因的mRNA序列与SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61或SEQ ID NO：62所示的核苷酸序列杂交；
d)嵌合CD47基因序列中来自人CD47基因的mRNA序列与SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61或SEQ ID NO：62所示的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；
e)嵌合CD47基因序列中来自人CD47基因的mRNA序列具有与SEQ ID NO：59、SEQ IDNO：60、SEQ ID NO：61或SEQ ID NO：62所示的，包括取代、缺失和/或***一个或多个核苷酸的核苷酸序列；
或
f)嵌合CD47基因序列中动物来源的Cd47基因的mRNA序列如SEQ ID NO：45、SEQ IDNO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50或SEQ ID NO：51所示的序列的部分或全部所示；
g)嵌合CD47基因序列中动物来源的Cd47基因的mRNA序列与SEQ ID NO：45、SEQ IDNO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50或SEQ ID NO：51所示的序列同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
h)嵌合CD47基因序列中动物来源的Cd47基因的mRNA序列与SEQ ID NO：45、SEQ IDNO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50或SEQ ID NO：51所示的核苷酸序列杂交；
i)嵌合CD47基因序列中动物来源的Cd47基因的mRNA序列与SEQ ID NO：45、SEQ IDNO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50或SEQ ID NO：51所示的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；
j)嵌合CD47基因序列中动物来源的Cd47基因的mRNA序列具有与SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50或SEQ ID NO：51所示的，包括取代、缺失和/或***一个或多个核苷酸的核苷酸序列；
或
k)嵌合CD47基因中人CD47基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：27所示的序列的部分或全部；
l)嵌合CD47基因中人CD47基因的核苷酸序列与SEQ ID NO：27所示的核苷酸序列同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
m)嵌合CD47基因中人CD47基因的核苷酸序列在严格条件下，与编码SEQ ID NO：27所示的核苷酸序列杂交；
n)嵌合CD47基因中人CD47基因的核苷酸序列与SEQ ID NO：27所示的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；
o)嵌合CD47基因中人CD47基因的核苷酸序列具有SEQ ID NO：27所示的，包括取代、缺失和/或***一个或多个核苷酸的核苷酸序列；
和/或
p)嵌合CD47基因的mRNA序列为SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72或SEQ ID NO：73所示的序列的部分或全部；
q)嵌合CD47基因的mRNA序列与SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72或SEQ ID NO：73所示的序列同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
r)嵌合CD47基因的mRNA序列与SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72或SEQ ID NO：73所示的核苷酸序列杂交；s)嵌合CD47基因的mRNA序列与SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQID NO：71、SEQ ID NO：72或SEQ ID NO：73所示的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；
t)嵌合CD47基因的mRNA序列具有与SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72或SEQ ID NO：73所示的，包括取代、缺失和/或***一个或多个核苷酸的核苷酸序列；
和/或
u)嵌合CD47基因的核苷酸的部分序列为SEQ ID NO：23所示的序列的部分或全部；
v)嵌合CD47基因的核苷酸部分序列与SEQ ID NO：23所示的核苷酸序列的部分或全部的同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
w)嵌合CD47基因的核苷酸部分序列在严格条件下，与编码SEQ ID NO：23所示的核苷酸序列杂交；
x)嵌合CD47基因的核苷酸部分序列与SEQ ID NO：23所示的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；
y)嵌合CD47基因的核苷酸部分序列具有SEQ ID NO：23所示的，包括取代、缺失和/或***一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述编码嵌合CD47基因中，SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72或SEQ ID NO：73所示序列为嵌合小鼠CD47DNA的非模板链、编码链或有义链。
本发明的第二方面，涉及编码上述嵌合CD47蛋白的DNA。
在本发明的一个实施例中，所述人源化小鼠CD47的基因组DNA序列转录获得的mRNA逆转录后得到的DNA序列，与权利要求本发明涉及的序列中任意一项所述的DNA或基因序列一致或互补。
本发明的第三方面，涉及一种表达人源化小鼠嵌合CD47蛋白的构建体。
本发明的第四方面，涉及一种包含上述构建体的细胞。
本发明的第五方面，涉及一种包含上述细胞的组织。
在本发明的一个实施例中，涉及非人类哺乳动物，其是啮齿类动物。
在本发明的一个实施例中，涉及的啮齿类动物是小鼠。
在本发明的一个实施例中，涉及的小鼠为C57BL/6或BALB/c小鼠。
在本发明的一个实施例中，涉及的非人类哺乳动物，所述小鼠为C57BL/6或BALB/c小鼠的后代。
本发明第六方面，涉及上述任一方法构建的人源化动物模型或其后代。
本发明第七方面，涉及一种Cd47基因敲除动物模型构建的方法，具体包括将动物体内的Cd47的第2号外显子全部或部分敲除，使得内源Cd47蛋白失活；其中，使用sgRNA靶向技术实现上述敲除，优选的，所述sgRNA在待改变的非人动物Cd47基因上的靶序列上是唯一的，且符合5’-NNN(20)-NGG3’或5’-CCN-N(20)-3’的序列排列规则，更优选的，所述sgRNA靶向的5’端靶位点如SEQ ID NO：1-8任一项所示，3’端靶位点的序列如SEQ ID NO：9-17任一项所示；最为优选的，使用的sgRNA靶位点序列为SEQ ID NO：6和/或SEQ ID NO：9。
优选的，所述Cd47基因敲除动物模型的制备方法，包括以下步骤：第一步：按照上述sgRNA载体的制备方法步骤1-4，获得sgRNA载体；第二步：将sgRNA载体的体外转录产物和Cas9mRNA进行混合，获得混合液，将混合液注射至小鼠受精***质或细胞核中，将注射后的受精卵转移至培养液中进行培养，然后移植至受体母鼠的输卵管中发育，得到F0代小鼠；第三步：将F0代小鼠利用PCR技术进行检验，验证细胞中的CdD47基因被敲除，获得Cd47基因敲除阳性小鼠；第四步：将第三步筛选的阳性小鼠通过杂交和自交的方式，扩大种群数量，建立稳定的Cd47-/-小鼠。；优选的，所述述第三步中使用的PCR检测引物对序列如SEQ IDNO：43和SEQ ID NO：44所示。
本发明的第八方面，涉及一种靶向载体，其包含：a)与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂/受体，其选自Cd47基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；b)***或替换的供体DNA序列，其编码供体转换区；和c)与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，即3’臂/受体，其选自Cd47基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸。
在本发明的一个实施例中涉及的靶向载体，其中，a)与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂/受体，其选自与NCBI登录号为NC_000082.6至少具有90％同源性的核苷酸；c)与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，即3’臂/受体，其选自NCBI登录号为NC_000082.6至少具有90％同源性的核苷酸。
在本发明的一个实施例中涉及的靶向载体，其中，a)与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂/受体，其选自如NCBI登录号为NC_000082.6的第49866727-49867784位核苷酸；c)与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段即3’臂/受体，其选自如所示的NCBI登录号为NC_000082.6的第49868091-49869239位核苷酸。
在本发明的一个实施例中涉及的靶向载体，所述的待改变的转换区位于CD47基因的第2外显子。
在本发明的一个实施例中涉及的靶向载体，所述5’臂序列如SEQ ID NO：24所示。
在本发明的一个实施例中涉及的靶向载体，所述3’臂序列如SEQ ID NO：32所示。
在本发明的一个实施例中涉及的靶向载体，所述靶向载体还包括可选择的基因标记。进一步优选的，所述标记基因为负筛选标记的编码基因。最优选的，所述负筛选标记的编码基因为白喉毒素A亚基的编码基因(DTA)。
进一步优选的，所述靶向载体还包括阳性克隆筛选的抗性基因。最优选的，所述阳性克隆筛选的抗性基因为新霉素磷酸转移酶编码序列Neo。
进一步优选的，所述靶向载体还包括特异性重组***。最优选的，所述特异性重组***为Frt重组位点(也可选择常规的LoxP重组***)。所述的特异性重组***为2个，分别装在抗性基因的两侧。
在本发明的一个实施例中涉及的靶向载体，其中替换的供体DNA序列片段来自人。
在本发明的一个实施例中涉及的靶向载体，其中替换的供体DNA序列为人CD47基因的核苷酸序列部分或全部。
在本发明的一个实施例中涉及的靶向载体，其中，核苷酸序列包括人CD47基因DNA序列的第2号外显子的全部或部分。
在本发明的一个实施例中涉及的靶向载体，其中，人CD47的核苷酸序列选自NCBI登录号为NC_000003.12的第108080013-108080324位核苷酸。
在本发明的一个实施例中涉及的靶向载体，其中，所述人源CD47的核苷酸序列如SEQ ID NO:27所示。
本发明的第九方面，涉及一种可稳定传代的人源化基因工程非人类哺乳动物，所述非人类哺乳动物体内表达嵌合CD47蛋白，其中所述非人类哺乳动物由上述任一所述的方法制备获得。
本发明的第十方面，涉及一种能够特异的靶向Cd47基因的sgRNA序列，其中所述sgRNA序列靶向非人动物Cd47基因，同时所述sgRNA在待改变的非人动物Cd47基因上的靶序列上是唯一的，且符合5’-NNN(20)-NGG3’或5’-CCN-N(20)-3’的序列排列规则。
优选的，所述非人动物为啮齿类动物；进一步优选的，所述啮齿类动物为小鼠。
在本发明的一个具体实施例中，所述sgRNA序列在小鼠Cd47基因的靶位点位于小鼠的Cd47基因的第2号外显子上。
优选的，所述sgRNA靶向的5’端靶位点的序列如SEQ ID NO：1-8任一项所示，sgRNA靶向的3’端靶位点的序列如SEQ ID NO：9-17任一项所示；优选的，sgRNA靶向的5’端靶位点的序列如SEQ ID NO：6所示，sgRNA靶向的3’端靶位点的序列如SEQ ID NO：9所示。
本发明的第十一方面，涉及一种编码上述所述sgRNA的DNA分子；优选的，DNA双链序列分别如SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19，或SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21所示。
本发明的第十二方面，涉及一种构建动物模型的载体，所述载体能够产生上述的sgRNA，用于敲除或替换CD47基因的第2号外显子的部分或全部。
本发明的第十三方面，涉及一种制备sgRNA载体的方法，包括如下步骤：
(1)提供一种sgRNA序列，制备获得正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列，所述sgRNA序列靶向非人动物Cd47基因，同时所述sgRNA在待改变的非人动物Cd47基因上的靶序列上是唯一的，且符合5’-NNN(20)-NGG3’或5’-CCN-N(20)-3’的序列排列规则；
(2)合成含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA，并将所述片段DNA通过EcoRI和BamHI酶切连接至骨架载体上，经测序验证，获得pT7-sgRNA载体；
(3)将步骤(1)获得的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸变性、退火，形成可以连入步骤(2)所述的pT7-sgRNA载体的双链；
(4)将步骤(3)中退火的双链sgRNA寡聚核苷酸分别与pT7-sgRNA载体进行链接，筛选获得sgRNA载体。
优选的，所述制备sgRNA载体的方法，包括以下步骤：
(1)将序列如SEQ ID NO：1-8所示的任一项sgRNA靶序列和/或SEQ ID NO：9-17所示的任一项sgRNA靶序列，制备获得正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列；
优选的，所述sgRNA靶序列为SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：9，获得的正向寡核苷酸序列如SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：20所示；反向寡核苷酸序列如SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：21所示，其中SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19为A组，SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21为B组；
(2)合成含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA，其中含有T7启动子及sgRNAscaffold的片段DNA如SEQ ID NO：22所示，将上述片段依次通过EcoRI和BamHI酶切连接至骨架载体pHSG299上，经测序验证，获得pT7-sgRNAG2载体；
(3)分别合成步骤1中所述的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，优选为A组和B组中的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，将合成的sgRNA寡聚核苷酸变性、退火，形成可以连入步骤2所述的pT7-sgRNAG2载体的双链；
(4)将步骤3中退火的双链sgRNA寡聚核苷酸分别与pT7-sgRNAG2载体进行链接，筛选获得sgRNA载体。
本发明第十四方面，涉及一种细胞，述细胞包含上述的靶向载体、上述的sgRNA序列、上述的载体和/或上述的载体的体外转录产物。
本发明的第十五方面，涉及上述的靶向载体、上述的sgRNA序列、上述的载体或上述的细胞在基因修饰Cd47基因座中的应用。
优选的，所述基因修饰Cd47基因座包括替换或敲除非人动物基因组中的Cd47基因。
本发明的第十六方面，涉及一种Cd47基因缺失细胞株，使用上述能够特异的靶向Cd47基因的sgRNA、或者DNA分子、载体或上述细胞敲除第2号外显子的部分或全部制备获得。
本发明的第十七方面，涉及一种CD47基因人源化细胞株，使用上述能够特异的靶向CD47基因的sgRNA、上述DNA分子、上述载体或上述细胞通过对第2号外显子的部分或全部进行替换制备获得。
本发明的第十八方面，涉及一种制备多基因人源化动物模型的方法，
(a)利用本发明所述方法获得动物模型；(b)将步骤(a)获得的动物模型与其他人源化动物交配或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因人源化动物模型；
优选的，所述其他人源化动物为人源化SIRPα或PD-1基因的动物；更优选的，所述人源化SIRPα基因的动物编码与动物来源的SIRPα多肽的胞内部分和跨膜区相连接的人源SIRPα多肽的胞外部分；进一步优选的，所述人源化SIRPα基因的动物中的SIRPα基因为包括人类SIRPα基因的外显子2、外显子3、外显子4中的一种或多种；
更进一步优选的，所述获得的多基因人源化动物模型，其编码与动物来源的SIRPα多肽的胞内部分和跨膜区相连接的人源SIRPα多肽的胞外部分。
在本发明的一个实施例中，所述多基因人源化动物可以是双基因人源化动物、三基因人源化动物、四基因人源化动物、五基因人源化动物、六基因人源化动物、七基因人源化动物、八基因人源化动物或九基因人源化动物。
本发明的第十九方面，涉及一种制备多基因人源化动物模型的方法制备获得的多基因人源化动物模型或其后代。
优选的，所述动物模型为非人类哺乳动物。更优选的，所述动物模型为啮齿动物；更进一步优选的，所述动物模型为小鼠。
本发明的第二十方面，涉及一种荷瘤动物模型，所述动物模型是通过本发明所述的方法制备获得的；优选的，荷瘤动物模型是啮齿类动物；更优选的，荷瘤动物模型是小鼠。
本发明的第二十一方面，涉及来源于本发明所述的一种人源化动物模型或其后代，本发明涉及的多基因人源化动物模型或其后代、本发明涉及的荷瘤动物模型的细胞或细胞系或原代细胞培养物。
本发明的第二十二方面，涉及来源于本发明所述的一种人源化动物模型或其后代，本发明涉及的多基因人源化动物模型或其后代、本发明涉及的荷瘤动物模型的组织或器官或其培养物。
优选的，所述组织或器官或其培养物为脾脏、肿瘤或其培养物。
本发明的第二十三方面，涉及来源于本发明所述的一种人源化动物模型或其后代，本发明涉及的多基因人源化动物模型或其后代、本发明涉及的荷瘤动物模型的荷瘤后的瘤组织。本发明的第二十四方面，涉及来源于所述的人源化动物模型或其后代、多基因人源化动物模型或其后代、荷瘤动物模型在需要涉及人类细胞的免疫过程的产品开发，制造人类抗体，或者作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的模型***中的应用。
本发明的第二十五方面，涉及来源于所述的人源化动物模型或其后代、多基因人源化动物模型或其后代、荷瘤动物模型在生产和利用动物实验疾病模型，用于病原学研究和/或用于开发新的诊断策略和/或治疗策略中的应用。
本发明的第二十六方面，涉及来源于所述的人源化动物模型或其后代、多基因人源化动物模型或其后代、荷瘤动物模型在筛选、验证、评价或研究CD47基因功能、CD47/SIRPA信号通路、CD47抗体、SIRPA抗体、针对CD47和/或SIRPA靶位点的药物、药效研究，免疫相关疾病药物以及抗肿瘤药物，筛选和评估人用药及药效研究方面的用途。
本发明所述“治疗(treating)”(或“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”)表示减缓、中断、阻止、控制、停止、减轻、或逆转一种体征、症状、失调、病症、或疾病的进展或严重性，但不一定涉及所有疾病相关体征、症状、病症、或失调的完全消除。术语“治疗(treating)”等是指在疾病已开始发展后改善疾病或病理状态的体征、症状等等的治疗干预。
本发明所述“有效量”是指在以单个或多个剂量给予至患者或器官之后提供所希望的治疗或预防的本发明的组合物的量或剂量。
本发明所述“同源性”，是指在使用蛋白序列或核苷酸序列的方面，本领域技术人员可以根据实际工作需要对序列进行调整，使用序列与现有技术获得的序列相比，具有(包括但不限于)1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，21％，22％，23％，24％，25％，26％，27％，28％，29％，30％，31％，32％，33％，34％，35％，36％，37％，38％，39％，40％，41％，42％，43％，44％，45％，46％，47％，48％，49％，50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.1％，99.2％，99.3％，99.4％，99.5％，99.6％，99.7％，99.8％，99.9％的同源性。
本领域的技术人员能够确定并比较序列元件或同一性程度，以区分另外的小鼠和人序列。
本发明的嵌合CD47基因，包括具有第2号外显子人CD47基因的全部或部分序列，或其与人CD47基因中的第2号外显子具有至少50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.1％，99.2％，99.3％，99.4％，99.5％，99.6％，99.7％，99.8％，99.9％同一性的序列。
本发明的嵌合CD47基因包括这样的CD47基因，其人源化核苷酸序列具有与现有技术中人CD47(例如：SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61或SEQ ID NO：62)的核苷酸具有至少50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.1％，99.2％，99.3％，99.4％，99.5％，99.6％，99.7％，99.8％，99.9％同一性的序列。
本发明的嵌合CD47蛋白包括这样的CD47氨基酸序列，其人源化氨基酸序列具有与现有技术中人CD47氨基酸序列(例如：SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65或SEQID NO：66)相比具有至少50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.1％，99.2％，99.3％，99.4％，99.5％，99.6％，99.7％，99.8％，99.9％同一性的序列。
本发明的动物来源的Cd47核苷酸包括这样的CD47核苷酸序列，其编码胞内区域序列(参与信号传导的区域)的核苷酸序列与现有技术中动物来源CD47(例如：SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50或SEQ ID NO：51)对应的编码胞内区域序列(信号肽区域)核苷酸序列相比，具有至少50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.1％，99.2％，99.3％，99.4％，99.5％，99.6％，99.7％，99.8％，99.9％同一性的序列。
本发明的动物来源的CD47蛋白包括这样的CD47氨基酸序列，其胞内区域序列(参与信号传导的区域)与现有技术中动物来源CD47(例如：SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57或SEQ ID NO：58)对应的胞内区域序列(信号肽区域)氨基酸序列相比，具有至少50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.1％，99.2％，99.3％，99.4％，99.5％，99.6％，99.7％，99.8％，99.9％同一性的序列。
本发明的嵌合CD47核苷酸包括这样的CD47核苷酸序列，其嵌合核苷酸序列与SEQID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72或SEQ ID NO：83对应的氨基酸序列相比，具有至少50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.1％，99.2％，99.3％，99.4％，99.5％，99.6％，99.7％，99.8％，99.9％同一性的序列。
本发明的嵌合CD47蛋白包括这样的CD47氨基酸序列，其嵌合序列与SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：79或SEQ IDNO：80对应的氨基酸序列相比，具有至少50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.1％，99.2％，99.3％，99.4％，99.5％，99.6％，99.7％，99.8％，99.9％同一性的序列。
在一个方面，所述非人动物是哺乳动物。在一个方面，所述非人动物是小型哺乳动物，例如跳鼠科或鼠总科超家族。在一个实施方式中，所述基因修饰的动物是啮齿动物。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自鼠家族。在一个实施方式中，所述基因修饰的动物来自选自丽仓鼠科(例如小鼠样仓鼠)、仓鼠科(例如仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠)、鼠总科(真小鼠和大鼠、沙鼠、刺毛鼠、冠毛大鼠)、马岛鼠科(登山小鼠、岩小鼠、有尾大鼠、马达加斯加大鼠和小鼠)、刺睡鼠科(例如多刺睡鼠)和鼹形鼠科(例如摩尔大鼠、竹大鼠和鼢鼠)家族。在一个特定实施方式中，所述基因修饰的啮齿动物选自真小鼠或大鼠(鼠总科)、沙鼠、刺毛鼠和冠毛大鼠。在一个实施方式中，所述基因修饰的小鼠来自鼠科家族成员。在一个实施方式中，所述动物是啮齿动物。在一个特定实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠和大鼠。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠。
在一个特定实施方式中，所述非人动物是啮齿动物，其为选自BALB/c、C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr和C57BL/Ola的C57BL品系的小鼠。在另一个实施方式中，所述小鼠是选自由以下品系构成的组的129品系：129P1、129P2、129P3、129X1、129S1(例如129S1/SV、129S1/SvIm)、129S2、129S4、129S5、129S9/SvEvH、129S6(129/SvEvTac)、129S7、129S8、129T1、129T2(参见例如Festing等(1999)Revisednomenclatureforstrain129mice(对129小鼠品系修订的命名法)，MammalianGenome10:836，亦参见Auerbach等(2000)EstablishmentandChimeraAnalysisof129/SvEv-andC57BL/6-DerivedMouseEmbryonicStemCellLines(129/SvEv-和C57BL/6-来源的小鼠胚胎干细胞系的建立和嵌合体分析)。在一个实施方式中，所述非人动物是大鼠。在一个实施方式中，所述大鼠选自Wistar大鼠、LEA品系、SpragueDawley品系、Fischer品系、F344、F6和黑刺鼠。在一个实施方式中，所述大鼠品系是两种或多种选自下组的品系的混合：Wistar、LEA、SpragueDawley、Fischer、F344、F6和黑刺鼠。
本发明所述“癌”选自下组，该组由以下各项组成：白血病、淋巴瘤、卵巢癌、乳腺癌、子宫内膜癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、膀胱癌、肺癌、支气管癌、骨癌、***癌、胰腺癌、肝和胆管癌、食管癌、肾癌、甲状腺癌、头颈部癌、睾丸癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、黑色素瘤、骨髓增生异常综合征、以及肉瘤。其中，所述的白血病选自下组，该组由以下各项组成：急性淋巴细胞性(成淋巴细胞性)白血病、急性骨髓性白血病、髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、以及慢性骨髓性白血病；所述淋巴瘤选自下组，该组由以下各项组成：霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，包括B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；并且所述肉瘤选自下组，该组由以下各项组成：骨肉瘤、尤文肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、腺泡状软组织肉瘤、血管肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、以及软骨肉瘤。
除非特别说明，本发明的实践将采取细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的传统技术。这些技术在以下文献中进行了详细的解释。例如：Molecular Cloning A Laboratory Manual，2ndEd.，ed.By Sambrook，Fritschand Maniatis(Cold Spring Harbor Laboratory Press：1989)；DNA Cloning，Volumes I and II(D.N.Glovered.，1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gaited.，1984)；Mullisetal.U.S.Pat.No.4，683，195；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney，AlanR.Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，A PracticalGuide To Molecular Cloning(1984)；the series，Methods In ENZYMOLOGY(J.Abelsonand M.Simon，eds.-in-chief，Academic Press，Inc.，New York)，specifically，Vols.154and 155(Wuetal.eds.)and Vol.185，″Gene Expression Technology″(D.Goeddel，ed.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller andM.P.Caloseds.，1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；Immunochemical Methods InCell And Molecular Biology(Mayer and Walker，eds.，Academic Press，London，1987)；Handbook Of Experimental Immunology，Volumes V(D.M.Weir and C.C.Blackwell，eds.，1986)；and Manipulating the Mouse Embryo，(Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。
以上只是概括了本发明的一些方面，不是也不应该认为是在任何方面限制本发明。
本说明书提到的所有专利和出版物都是通过参考文献作为整体而引入本发明的。本领域的技术人员应认识到，对本发明可作某些改变并不偏离本发明的构思或范围。下面的实施例进一步详细说明本发明，不能认为是限制本发明或本发明所说明的具体方法的范围。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：
图1：sgRNA活性检测结果，(A)5’端靶位点sgRNA活性检测结果(sgRNA1-sgRNA8)；(B)3’端靶位点sgRNA活性检测结果(sgRNA9-sgRNA17)，其中，Con.为阴性对照，PC为阳性对照；
图2：pT7-sgRNA质粒图谱示意图；
图3：pClon-4G-CD47质粒酶切结果图，其中，1-6为pClon-4G-CD47载体编号，M为Marker，ck为未经酶切的质粒对照；
图4：C57BL/6背景小鼠鼠尾PCR鉴定结果，图4(A)为5’端引物的检测结果，图4(B)为3’端引物的检测结果，其中，WT为野生型对照，+为阳性对照，H2O为水对照，F0-1至F0-6为小鼠编号；
图5：BALB/c背景小鼠鼠尾PCR鉴定结果，图5(A)为5’端引物的检测结果，图5(B)为3’端引物的检测结果，其中，WT为野生型对照，+为阳性对照，H2O为水对照，B-F0-1为小鼠编号；
图6：F1代C57BL/6背景小鼠鼠尾PCR鉴定结果，图6(A)为5’端引物的检测结果，图6(B)为3’端引物的检测结果，其中，WT为野生型对照，+为阳性对照，H2O为水对照，M为Marker，F1-1至F1-12为小鼠编号；
图7：F1代BALB/c背景小鼠鼠尾PCR鉴定结果，图7(A)为5’端引物的检测结果，图7(B)为3’端引物的检测结果，其中，WT为野生型对照，+为阳性对照，H2O为水对照，M为Marker，B-F1-1至B-F1-10为小鼠编号；
图8：C57BL/6背景小鼠流式分析结果，其中，取1只C57BL/6小鼠和CD47人源化小鼠(C57BL/6背景)，分别用鼠CD3抗体刺激脾脏内T细胞(图b、c、e、f)激活；另取1只C57BL/6小鼠作为对照(图a、d)，用鼠CD47抗体(mCD47Aleax Fluor 647，图a、b、c)和人CD47抗体(hCD47PE，图d、e、f)对3只小鼠的T细胞胞外蛋白进行标记，用流式细胞仪检测分析；
图9：BALB/c背景小鼠流式分析结果，其中，取BALB/c小鼠和CD47人源化小鼠(BALB/c背景)，分别用抗鼠CD3抗体刺激脾脏内T细胞(图b、c、e、f)激活；另取1只BALB/c小鼠作为对照(图a、d)，用鼠CD47抗体(mCD47Aleax Fluor 647，图a、b、c)和人CD47抗体(hCD47PE，图d、e、f)对3只小鼠的T细胞胞外蛋白进行标记，用流式细胞仪检测分析；
图10：RT-PCR检测结果，其中，(A)中+/+为野生型C57BL/6小鼠，H/+为CD47人源化F1代杂合子小鼠(C57BL/6背景)，(B)中+/+为野生型BALB/c小鼠，H/+为CD47人源化F1代杂合子小鼠(BALB/c背景)；
图11：C57BL/6背景人源化CD47纯合子流式分析结果，其中，图A、D为未经刺激的C57BL/6小鼠，图B、E为经抗鼠CD3抗体刺激脾脏内T细胞的C57BL/6小鼠，图C、F为经抗鼠CD3抗体刺激脾脏内T细胞的人源化CD47纯合子小鼠，再分别用鼠CD47抗体(mCD47 AleaxFluor 647，图A、B、C)和人CD47抗体(hCD47PE，图D、E、F)对3只小鼠的T细胞胞外蛋白进行标记，用流式细胞仪检测分析；
图12：C57BL/6背景人源化CD47纯合子RT-PCR检测结果，其中，+/+为野生型C57BL/6小鼠，H/H为CD47人源化纯合子小鼠(C57BL/6背景)；
图13：BALB/c背景人源化CD47纯合子流式分析结果，其中，图A、D为未经刺激的C57BL/6小鼠，图B、E为经抗鼠CD3抗体刺激脾脏内T细胞的C57BL/6小鼠，图C、F为经抗鼠CD3抗体刺激脾脏内T细胞的人源化CD47纯合子小鼠，再分别用鼠CD47抗体(mCD47 AleaxFluor 647，图A、B、C)和人CD47抗体(hCD47PE，图D、E、F)对3只小鼠的T细胞胞外蛋白进行标记，用流式细胞仪检测分析；
图14：BALB/c背景人源化CD47纯合子RT-PCR检测结果，+/+为野生型BALB/c小鼠，H/H为CD47人源化纯合子小鼠(BALB/c背景)；
图15：Cd47基因敲除小鼠PCR鉴定结果，其中，WT为野生型对照，+为阳性对照，H2O为水对照，编号1代表BALB/c背景小鼠，编号2、3代表C57BL/6背景小鼠；
图16：选择B-hCD47小鼠纯合子，给药组随机选择6种抗人CD47抗体(Ab1-Ab6，10mg/kg)进行毒性实验，图为各组实验动物存活时间及体重；
图17：鼠尾PCR鉴定结果，其中，M为Marker，WT为野生型对照，H2O为水对照，图A、B中，PC为CD47纯合子对照，图C、D中，PC为SIRPA纯合子对照；
图18：对C57BL/6小鼠和双重人源化CD47/SIRPA纯合子小鼠进行流式分析，其中，图A、D为未经刺激的C57BL/6小鼠，图B、E为经鼠CD3抗体刺激的C57BL/6小鼠，图C、F为经鼠CD3抗体刺激的双重人源化CD47/SIRPA纯合子小鼠；用鼠CD47抗体mCD47AF647(图A、B、C)或人CD47抗体hCD47PE(图D、E、F)和鼠T细胞表面抗体mTcR PerCP对3只小鼠的T细胞胞外蛋白进行标记，用流式细胞仪检测分析；
图19：对C57BL/6小鼠和双重人源化CD47/SIRPA纯合子小鼠进行流式分析，其中，图A、D为未经刺激的C57BL/6小鼠，图B、E为经鼠CD3抗体刺激脾脏内T细胞的C57BL/6小鼠，图C、F为经鼠CD3抗体刺激脾脏内T细胞的双重人源化CD47/SIRPA纯合子小鼠；再用鼠Sirpa抗体mSirpa PE(图A、B、C)或人SIRPa抗体hSirpa APC(图D、E、F)对3只小鼠的T细胞胞外蛋白进行细胞标记，用流式细胞仪检测分析；
图20：双重人源化CD47/SIRPA小鼠RT-PCR检测结果，其中，+/+为野生型C57BL/6小鼠，H/H为双重人源化CD47/SIRPA纯合子小鼠；GAPDH为内参对照；
图21：将过表达人CD47的小鼠结肠癌细胞MC38植入双重人源化CD47/SIRPA小鼠体内，并利用人CD47抗体进行抗肿瘤药效试验结果，图为实验周期内小鼠体重情况；
图22：将过表达人CD47的小鼠结肠癌细胞MC38植入双重人源化CD47/SIRPA小鼠体内，并利用人CD47抗体进行抗肿瘤药效试验结果，图为实验周期内肿瘤测量结果；
图23：将过表达人CD47的小鼠结肠癌细胞MC38植入双重人源化CD47/SIRPA小鼠体内，并利用人SIRPA抗体进行抗肿瘤药效试验结果，图为实验周期内小鼠体重情况；
图24：将过表达人CD47的小鼠结肠癌细胞MC38植入双重人源化CD47/SIRPA小鼠体内，并利用人SIRPA抗体进行抗肿瘤药效试验结果，图为实验周期内肿瘤测量结果；
图25：打靶策略示意图；
图26：人源化小鼠CD47基因示意图；
图27：基于胚胎干细胞的打靶策略示意图。
具体实施方式
本发明提供了基因工程改造的非人动物，该动物具有编码人CD47蛋白的人源化遗传物质，可以用于人或类似人的CD47蛋白开展实验。本文所述的实施例包括啮齿动物，特别是小鼠。
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
在下述每一实施例中，设备和材料是从以下所指出的几家公司获得：
C57BL/6小鼠购自中国食品药品检定研究院国家啮齿类实验动物种子中心；
BALB/c小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司；
AIO试剂盒来源百奥赛图公司，货号BCG-DX-004；
UCA试剂盒来源百奥赛图公司，货号BCG-DX-001；
BbsI、EcoRI、BamHI、EcoRV、XbaI、HindIII酶购自NEB，货号分别为；R0539L、R3101M、R3136M、R0195S、R0145M、R3104M；
TOP10感受态细胞购自Tiangen公司，货号为CB104-02；
Anti-mCD3购自BD公司，货号：553057；
逆转录试剂盒来源TakaRa，货号6110A；
PerCP/Cy5.5anti-mouse TCRβchain(mTcRβPerCP)购自Biolegend，货号为：109228；
Alexa
Figure BDA0001618658140000211
647anti-mouse CD47(mCD47Aleax Fluor 647，mCD47AF647)购自Biolegend，货号为：127510；
PE anti-human CD47(hCD47PE)购自Biolegend，货号为：323108；
PE anti-mouse CD172a(SIRPα)Antibody(mSirpa PE)购自Biolegend，货号为：144012；
APC anti-human CD172a/b(SIRPα/β)Antibody(hSirpa APC)购自Biolegend，货号为：323810；
pHSG299质粒购自Takara，货号3299；
KOD酶购自Toyobo，货号KOD-101；
流式细胞仪生产厂家BD，型号为Calibur。
实施例1 Cd 47基因sgRNA的设计
设计并合成识别5’端靶位点(sgRNA1-sgRNA8)、3’端靶位点(sgRNA9-sgRNA17)的sgRNA序列。
5’端靶位点和3’端靶位点均位于Cd47基因(Gene ID:16423)第2号外显子上，各sgRNA在Cd47上的靶位点序列如下：
sgRNA-1靶位点序列(SEQ ID NO：1)：5’-CCCTTGCATCGTCCGTAATGTGG-3’
sgRNA-2靶位点序列(SEQ ID NO：2)：5’-TCCACATTACGGACGATGCAAGG-3’
sgRNA-3靶位点序列(SEQ ID NO：3)：5’-TGCTTTGCGCCTCCACATTACGG-3’
sgRNA-4靶位点序列(SEQ ID NO：4)：5’-CACTTCATGCAATGAAACTGTGG-3’
sgRNA-5靶位点序列(SEQ ID NO：5)：5’-CCGAAGAAATGTTTGTGAAGTGG-3’
sgRNA-6靶位点序列(SEQ ID NO：6)：5’-ATTGCATGAAGTGAACTCTATGG-3’
sgRNA-7靶位点序列(SEQ ID NO：7)：5’-TCGTATATTTTCATCTATGATGG-3’
sgRNA-8靶位点序列(SEQ ID NO：8)：5’-CCACTTCACAAACATTTCTTCGG-3’
sgRNA-9靶位点序列(SEQ ID NO：9)：5’-AATGGATAAGCGCGATGCCATGG-3’
sgRNA-10靶位点序列(SEQ ID NO：10)：5’-GATAAGCGCGATGCCATGGTGGG-3’
sgRNA-11靶位点序列(SEQ ID NO：11)：5’-GCAAGTGTAGTTTCCCACCATGG-3’
sgRNA-12靶位点序列(SEQ ID NO：12)：5’-TCAGTCTCAGACTTAATCAATGG-3’
sgRNA-13靶位点序列(SEQ ID NO：13)：5’-TGAGACTGAGATTTTTGCACTGG-3’
sgRNA-14靶位点序列(SEQ ID NO：14)：5’-GCGCTTATCCATTTTCAAAGAGG-3’
sgRNA-15靶位点序列(SEQ ID NO：15)：5’-TGGCATTGCCTCTTTGAAAATGG-3’
sgRNA-16靶位点序列(SEQ ID NO：16)：5’-GTGACAGAGTTATCCAGAGAAGG-3’
sgRNA-17靶位点序列(SEQ ID NO：17)：5’-TATAACTGTTTTGCCTTCTCTGG-3’
实施例2 sgRNA的筛选
利用UCA试剂盒检测多个sgRNA的活性，从结果可见sgRNA具有不同活性，检测结果参见图1。其中，sgRNA-7、sgRNA-8、sgRNA-17活性相对较低，这可能由于靶位点序列的特殊性导致，但根据我们的实验，sgRNA-7、sgRNA-8、sgRNA-17的数值仍显著高于对照组数值，仍可判断sgRNA-7、sgRNA-8、sgRNA-17是具有活性的，并且活性满足基因打靶实验要求，UCA检测结果见表1。
从中优先选择2个，分别是sgRNA6(SEQ ID NO：6)和sgRNA9(SEQ ID NO：9)，进行后续实验。
表1 UCA检测结果
Figure BDA0001618658140000221
合成sgRNA的正、反向寡核苷酸序列，如下:
sgRNA6序列：正向：5’-taggcatgaagtgaactcta-3’(SEQ ID NO：18)；
反向：5’-aaactagagttcacttcatg-3’(SEQ ID NO：19)；
sgRNA9序列：正向：5’-taggataagcgcgatgcca-3’(SEQ ID NO：20)；
反向：5’-aaactggcatcgcgcttat-3’(SEQ ID NO：21)。
实施例3 pT7-sgRNA G2质粒构建
pT7-sgRNA G2质粒来源：pT7-sgRNA G2载体图谱，参见图2。该质粒骨架来源Takara，货号3299。
由质粒合成公司合成含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA(SEQ ID NO：22)并通过酶切(EcoRI及BamHI)连接至骨架载体上，经专业测序公司测序验证，结果表明获得了目的质粒。
含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA(SEQ ID NO：22)：
5’-gaattctaatacgactcactatagggggtcttcgagaagacctgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatc aacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcttttaaaggatcc-3’
实施例4 pT7-Cd47-6和pT7-Cd47-9重组表达载体的构建
退火后将退火产物分别连接至pT7-sgRNA质粒(质粒先用BbsI线性化)，获得表达载体pT7-Cd47-6和pT7-Cd47-9，连接反应体系见表2：
表2连接反应体系
sgRNA退火产物 1μL(0.5μM)
pT7-sgRNA载体 1μL(10ng)
T4DNA Ligase 1μL(5U)
10×T4DNA Ligase buffer 1μL
50％PEG4000 1μL
H<sub>2</sub>O 补至10μL
反应条件为：室温连接10-30min，转化至30μL TOP10感受态细胞中，然后取200μL涂布于Kan抗性的平板，37℃培养至少12小时后挑选2个克隆接种含有Kan抗性的LB培养基(5mL)中，37℃，250rpm摇培至少12小时。
随机挑选克隆送测序公司进行测序验证，选择连接正确的表达载体pT7-Cd47-6和pT7-Cd47-9进行后续实验。
实施例5序列设计
将小鼠Cd47基因上(NCBI登录号为NC_000082.6)位于第2号外显子上的第12533-12838位核苷酸用人DNA片段(SEQ ID NO：27)进行替代，最终期望得到的改造后的人源化小鼠CD47基因的DNA序列(嵌合CD47基因DNA)如下SEQ ID NO：23所示：
Figure BDA0001618658140000241
SEQ ID NO：23仅列出涉及改造部分的DNA序列，其中斜体下划线区域为人CD47基因片段，大写字母为点突变位置。
按照上述操作，将小鼠Cd47基因上的第2号外显子上用人DNA片段进行替代，获得人源化小鼠，鉴于人CD47和小鼠Cd47具有多种亚型或转录本，改造后的人源化小鼠CD47的mRNA序列及其编码的蛋白序列可能有多个序列，部分举例如下：
人源化小鼠CD47的mRNA序列如SEQ ID NO：67至SEQ ID NO：73所示；人鼠嵌合CD47蛋白序列如SEQ ID NO：74至SEQ ID NO：80所示。
本文所述的方法可应用于人CD47和/或小鼠Cd47其它亚型或转录本。
实施例6载体构建
根据上述实验方案，设计3段同源重组片段的上游引物和与其匹配的下游引物以及相关序列。具体为：
5’端同源臂：NCBI登录号为NC_000082.6的第49866727-49867784位核苷酸(SEQID NO：24)
上游引物(SEQ ID NO：25)：
F：5’-tttaagaaggagatatacatgaattctgtctggtttacatagaaggaggaact-3’
下游引物(SEQ ID NO：26)：
R：5’-gaattctacagattttgttttattaaacagtagttgagctgaacctggaa-3’
人源DNA片段(312bp)(SEQ ID NO：27)：该序列与NCBI登录号为NC_000003.12的第108080324-108080013位核苷酸序列相比仅有一处突变：序列第129位(即NCBI登录号为NC_000003.12第108080196位)碱基T→C，但该突变不影响蛋白表达。
为了引入上述突变，将人DNA分两段进行PCR后通过overlap PCR方法将两个片段连接得到SEQ ID NO：27所述人源DNA片段，PCR使用的两组引物序列如下：
第一组：
上游引物(SEQ ID NO：28)
F：5’-gttcagctcaactactgtttaataaaacaaaatctgtagaattcacg-3’
下游引物(SEQ ID NO：29)
R：5’-gtttagagctccatcaaaggtgtagatatctcttcctttaaatttccac-3’
第二组：
上游引物(SEQ ID NO：30)：
F：5’-gtggaaatttaaaggaagagatatctacacctttgatggagctctaaac-3’
下游引物(SEQ ID NO：31)：
R：5’-gtgcggtttttcagctctatgatcgtttcaccttctctggttaattc-3’
3’同源臂：NCBI登录号为NC_000082.6的第49868091-49869239位核苷酸(SEQ IDNO：32)
上游引物(SEQ ID NO：33)：
F：5’-ccagagaaggtgaaacgatcatagagctgaaaaaccgcacgggtaag-3’
下游引物(SEQ ID NO：34)：
R：5’-ttgttagcagccggatctcaggatcctaacaacactgctgtccgcaactc-3’
以C57BL/6小鼠基因组DNA为模板PCR扩增获得5’端同源臂片段和3’端同源臂片段；以人基因组DNA为模板PCR扩增获得人DNA片段。通过AIO试剂盒将5’端同源臂片段、3’端同源臂片段和人源DNA片段连接至试剂盒配备的pClon-4G质粒上，最终获得载体pClon-4G-CD47。
实施例7载体验证
随机挑选6个pClon-4G-CD47克隆，使用3组酶进行酶切验证，其中，EcoRI应出现3579bp+1371bp+1082bp，EcoRV+XbaI应出现4100bp+1385bp+547bp，Hindlll+BamHI应出现3456bp+2576bp。
酶切结果参见图3，质粒1、2、3、4、5的酶切结果均符合预期，表明这几个编号的质粒酶切验证正确结果。其中编号2和3的质粒经测序公司测序验证正确。
实施例8显微注射及胚胎移植
取C57BL/6小鼠的受精卵，利用显微注射仪将预混好的pT7-Cd47-6、pT7-Cd47-9质粒的体外转录产物(使用Ambion体外转录试剂盒，按照说明书方法进行转录)和Cas9mRNA，pClon-4G-Cd47质粒注射至小鼠受精***质或细胞核中。按照《小鼠胚胎操作实验手册(第三版)》中的方法进行胚胎的显微注射，注射后的受精卵转移至培养液中短暂培养，然后移植至受体母鼠的输卵管，生产基因改造人源化小鼠，得到C57BL/6背景的首建鼠(即founder鼠，为F0代)。
实施例9显微注射及胚胎移植
取BALB/c小鼠的受精卵，利用显微注射仪将预混好的pT7-Cd47-6、pT7-Cd47-9质粒的体外转录产物(使用Ambion体外转录试剂盒，按照说明书方法进行转录)和Cas9mRNA，pClon-4G-Cd47质粒注射至小鼠受精***质或细胞核中。按照《小鼠胚胎操作实验手册(第三版)》中的方法进行胚胎的显微注射，注射后的受精卵转移至培养液中短暂培养，然后移植至受体母鼠的输卵管，生产基因改造人源化小鼠，得到BALB/c背景的首建鼠(即founder鼠，为F0代)。
实施例10基因改造人源化小鼠的鉴定
1、F0代基因型鉴定
分别使用两对引物对得到的C57BL/6背景和BALB/c背景的F0代小鼠的鼠尾基因组DNA进行PCR分析，引物位置L-GT-F位于5’同源臂左侧，R-GT-R位于3’同源臂右侧，R-GT-F和L-GT-R均位于2号外显子上，具体序列如下：
5’端引物：
上游引物：L-GT-F(SEQ ID NO：35)：5’-acccttagccagagagcacagagac-3’；
下游引物：L-GT-R(SEQ ID NO：36)：5’-tggggacagtggacttgtttagagc-3’
3’端引物：
上游引物：R-GT-F(SEQ ID NO：37)：5’-acactgtcgtcattccatgctttgt-3’；
下游引物：R-GT-R(SEQ ID NO：38)：5’-acctggttctcaaagtgtcaccacc-3’
PCR反应体系(20μL)如表3所示。
表3 PCR反应体系(20μL)
10×缓冲液 2μL
dNTP(2mM) 2μL
MgSO<sub>4</sub>(25mM) 0.8μL
上游引物(10μM) 0.6μL
下游引物(10μM) 0.6μL
鼠尾基因组DNA 200ng
KOD-Plus-(1U/μL) 0.6μL
ddH<sub>2</sub>O 加至20μL
PCR扩增反应条件如表4所示。
表4 PCR扩增反应条件
Figure BDA0001618658140000261
Figure BDA0001618658140000271
如果重组载体***位置正确，则应只有1条PCR条带，5’端引物产物长度应为1408bp，3’端引物产物长度应为1612bp。
C57BL/6背景的F0小鼠的PCR鉴定结果见图4，其中编号为F0-1、F0-4、F0-6的小鼠为两对引物检测结果都正确的阳性小鼠。
BALB/c背景的小鼠的PCR鉴定结果见图5，其中编号为B-F0-1的小鼠为两对引物检测结果都正确的阳性小鼠。
2、F1代基因型鉴定
将F0鉴定为阳性的小鼠分别与相同背景的野生型小鼠交配得到F1代小鼠。对F1代鼠尾基因组DNA进行PCR分析。PCR条件及引物同F0代基因型鉴定。C57BL/6背景的F1代小鼠PCR实验结果见图6，显示有8只F1代小鼠为两对引物检测结果都正确的阳性小鼠，具体编号为：F1-1、F1-2、F1-3、F1-4、F1-7、F1-8、F1-10、F1-12。BALB/c背景的F1代小鼠PCR实验结果见图7，显示有6只F1代小鼠为两对引物检测结果都正确的阳性小鼠，具体编号为：B-F1-1、B-F1-2、B-F1-4、B-F1-5、B-F1-7、B-F1-10。
这表明使用本方法能构建出可稳定传代的CD47人源化基因工程小鼠。
3、人源化小鼠的表达情况分析
选取1只阳性F1代杂合子小鼠，另选2只相同背景的野生型小鼠作为对照，给小鼠腹腔注射7.5μg鼠CD3抗体，24h后取脾脏，研磨后过70μm细胞筛网，将过滤好的细胞悬液离心弃上清，加入红细胞裂解液，裂解5min后加入PBS溶液中和裂解反应，离心弃上清后用PBS清洗细胞1次，分别进行FACS检测和RT-PCR检测。
FACS检测：用鼠CD47抗体mCD47Alexa Fluor 647和mTcRβPerCP及人CD47抗体hCD47PE和mTcRβPerCP对胞外蛋白同时进行染色，PBS清洗细胞1次，进行流式检测蛋白表达。C57BL/6背景的小鼠流式分析结果如图8显示，与未经刺激(图a，d)和经过鼠CD3抗体刺激(图b，e)脾脏中T细胞激活后的C57BL/6小鼠相比，人CD47抗体检测到人源化小鼠(图c，f)脾脏内表达人源化CD47蛋白的细胞；而在C57BL/6对照鼠的脾脏内未检测到表达人或人源化CD47蛋白的细胞。BALB/c背景的小鼠流式分析结果如图9显示，与未经刺激(图a，d)和经过鼠CD3抗体(图b，e)刺激脾脏中T细胞激活后的BALB/c小鼠相比，人CD47抗体检测到人源化小鼠(c，f)脾脏内表达人源化CD47蛋白的细胞；而在BALB/c对照鼠的脾脏内未检测到表达人或人源化CD47蛋白的细胞。
RT-PCR检测：提取小鼠脾脏细胞RNA，利用逆转录试剂盒逆转录成cDNA，
利用引物：
mCD47RT-PCR F2：5’-GTCATCCCTTGCATCGTCCG-3’(SEQ ID NO：39)，和
mCD47RT-PCR R2：5’-ACTTCGCAAGTGTAGTTTCCCA-3’(SEQ ID NO：40)
扩增大小为230bp的鼠Cd47片段；
利用引物
hCD47RT-PCR F1：5’-ACACTGTCGTCATTCCATGCT-3’(SEQ ID NO：41)，和
hCD47RT-PCR R1：5’-CCTGTGTGTGAGACAGCATCA-3’(SEQ ID NO：42)
扩增大小为226bp的人CD47片段。
PCR反应体系20μL，反应条件：95℃，5min；(95℃，30sec；60℃，30sec；72℃，30sec，35个循环)；72℃，10min；4℃保温。使用GAPDH作为内参。
C57BL/6背景的小鼠实验结果显示，见图10A，野生型C57BL/6小鼠和F1代杂合子小鼠活化细胞中均可检测到鼠Cd47的mRNA表达，F1代杂合子小鼠活化细胞中可检测到人CD47的mRNA表达。BALB/c背景的小鼠实验结果显示，见图10B，野生型BALB/c小鼠和F1代杂合子小鼠活化细胞中均可检测到鼠Cd47的mRNA表达，F1代杂合子小鼠活化细胞中可检测到人CD47的mRNA表达。
将同背景的F1代杂合子小鼠相互交配可得到纯合子小鼠，按照上述流程对纯合子进行表达情况分析，结果表明经过改造后的小鼠使用人CD47抗体可检测到脾细胞中有表达人源化CD47蛋白的细胞，并可检测到人CD47的mRNA表达。C57BL/6背景纯合子小鼠实验结果见图11、12；BALB/c背景纯合子小鼠实验结果见图13、14。
实施例11基因敲除小鼠的鉴定
由于Cas9的切割造成双链断裂，同源重组的修复方式可产生***/缺失突变，故而，使用本实验所述方法，也可以得到CD47蛋白功能丧失的基因敲除小鼠。为此设计一对引物，分别位于5’端靶位点左侧和3’端靶位点右侧，序列如下：
5’-ggtaaatttatccccaagatgcatggta-3’(SEQ ID NO：43)
5’-gccttaattcctcctagtgacttctgc-3’(SEQ ID NO：44)
野生型小鼠应只有1条PCR条带，产物长度应为698bp，杂合子应还有1条PCR条带，产物长度应为约386bp。
PCR反应体系(20μL)如表5所示：
表5 PCR反应体系(20μL)
2×TSINGKE Master mix 10μL
上游引物(0.2μM) 0.5μL
下游引物(0.2μM) 0.5μL
鼠尾基因组DNA 200ng
H<sub>2</sub>O 补至20μL
PCR扩增反应条件如表6所示：
表6 PCR扩增反应条件
Figure BDA0001618658140000291
鼠尾PCR鉴定结果见图15，其中编号为1的小鼠为BALB/c背景的阳性小鼠，编号为2、3的小鼠为C57BL/6背景的阳性小鼠，得到CD47蛋白功能丧失的基因敲除小鼠。
实施例12 CD47基因人源化动物模型体内药物毒性验证
CD47是一类自我保护信号，表达在几乎所有细胞表面，尤其是红细胞表面。由于抗人CD47抗体与鼠CD47不结合，因此无法在普通小鼠体内进行靶向人CD47的药物毒性试验。CD47基因人源化改造后的小鼠体内表达人源化CD47蛋白，给药后由于抗人CD47抗体能与人源化CD47蛋白结合，阻断自我保护信息的传递。鉴于CD47大量表达在红细胞表面，抗体结合CD47后会阻断CD47/SIRPA信号通路，可引起体内红细胞凋亡，严重的可导致小鼠死亡。Balb/c背景的小鼠因mSIRPa可与人hCD47结合，除可进行毒性测试外，还可以测试抗体的阻断作用和ADCP功能。本实施例将以毒性检测为例阐述如何将人源化CD47小鼠应用于抗体研发中。
取B-hCD47纯合小鼠(7-9周，C57BL/6背景)，随机分为对照组或给药组(n＝2/组)。给药组随机选择7种抗人CD47抗体(Ab1-Ab6，均为采用常规方法免疫小鼠得到)，腹腔注射，剂量为10mg/kg，对照组注射等体积的生理盐水。分组后在24小时内给药1次，给药后至少观察7天，每天观察小鼠状态并称量体重，小鼠体重下降超过20％应执行安乐死结束试验。实验周期内不同给药组小鼠体重不同(见图16)，表明不同的抗人CD47抗体在B-hCD47小鼠体内显现出毒性大小不同，其中Ab-2、Ab-4毒性比较强，小鼠不能耐受出现死亡情况。
实施例13双重人源化或多重人源化小鼠的制备及鉴定
利用本方法或制得的B-hCD47小鼠还可以制备双人源化或多人源化小鼠模型。如，前述实施例8或9中，显微注射及胚胎移植过程使用的受精***选择来源于其它基因修饰小鼠的受精***，或将B-hCD47小鼠的受精***进行基因编辑，可以进一步得到CD47人源化与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的小鼠模型。也可将本方法得到的B-hCD47小鼠纯合或杂合子与其它基因修饰纯合或杂合小鼠交配或体外受精(IVF)，对其后代进行筛选，根据孟德尔遗传规律，可有一定几率得到CD47人源化与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的杂合小鼠，再将杂合子相互交配可以得到双基因或多基因修饰的纯合子。
以双重人源化CD47/SIRPA小鼠的生成为例。由于小鼠CD47与SIRPA基因分别位于16号和2号染色体上，选择相同背景的B-hCD47小鼠与SIRPA人源化小鼠进行IVF，通过阳性子代小鼠的筛选和交配，最终得到双重人源化CD47/SIRPA小鼠。
分别使用4对引物对双重人源化CD47/SIRPA小鼠的鼠尾基因组DNA进行PCR分析，具体序列及产物长度见表7，反应体系和条件见表8、9。多只双重人源化CD47/SIRPA小鼠的鉴定结果见图17，其中图A、B表明编号为437-453的小鼠为CD47纯合子小鼠、图C、D表明编号为437-453的小鼠为SIRPA纯合子小鼠，综合两组结果可知，编号为437-453的17只小鼠为双基因纯合子。
表7引物序列
Figure BDA0001618658140000301
Figure BDA0001618658140000311
表8 PCR反应体系(20μL)
2×Master Mix 10μL
上游引物(10μM) 0.5μL
下游引物(10μM) 0.5μL
鼠尾基因组DNA 200ng
KOD-Plus-(1U/μL) 0.6μL
ddH<sub>2</sub>O 补至20μL
表9 PCR扩增反应条件
Figure BDA0001618658140000312
进一步的对双重人源化CD47/SIRPA小鼠的表达情况进行检测。选取1只双重人源化CD47/SIRPA小鼠纯合子(C57BL/6，5-6周龄)，另选2只野生型C57BL/6小鼠作为对照，小鼠腹腔注射7.5μg鼠CD3抗体，24h后取脾脏，研磨后过70μm细胞筛网，将过滤好的细胞悬液离心弃上清，加入红细胞裂解液，裂解5min后加入PBS溶液中和裂解反应，离心弃上清后用PBS清洗细胞1次，进行FACS检测。用鼠CD47抗体mCD47AF647和鼠T细胞表面抗体mTcRβPerCP或人CD47抗体hCD47PE和鼠T细胞表面抗体mTcRβPerCP对T细胞胞外蛋白同时进行染色检测CD47的表达；用鼠SIRPA抗体mSirpa PE或人SIRPA抗体hSirpa APC对T细胞胞外蛋白同时进行染色检测SIRPA的表达。流式分析结果(见图18、19)显示，与未经刺激和经过鼠CD3抗体刺激脾脏中T细胞激活后的C57BL/6小鼠相比，人CD47抗体和人SIRPA抗体可以检测到人源化CD47/SIRPA纯合子小鼠脾脏内表达人CD47和SIRPA蛋白的细胞；而在C57BL/6对照鼠的脾脏内未检测到表达人或人源化CD47和SIRPA蛋白的细胞。
RT-PCR检测：提取野生型C57BL/6小鼠和双人源化CD47/SIRPA纯合子小鼠脾脏细胞总RNA，利用逆转录试剂盒逆转录成cDNA：
利用引物mCD47RT-PCR F2(SEQ ID NO：39)，和mCD47RT-PCR R2(SEQ ID NO：40)扩增大小为230bp的鼠Cd47片段；利用引物hCD47RT-PCR F1(SEQ ID NO：41)，和hCD47RT-PCRR1(SEQ ID NO：42)扩增大小为226bp的人CD47片段。
利用引物mSirpa RT-PCR F2：5’-TTGCTGCTGGGGATTCGAC-3’(SEQ ID NO：86)，和mSirpa RT-PCR R2：5’-CTGCTGGGGTGACATTACTGAT-3’(SEQ ID NO：87)扩增大小为210bp的鼠Sirpa片段；
利用引物hSIRPa RT-PCR F1：5’-CCTGACAAGTCCGTGTTGG-3’(SEQ ID NO：88)，和hSIRPa RT-PCR R1：5’-CTCCTCTGAACCACTGGATGG-3’(SEQ ID NO：89)扩增大小为100bp的人SIRPA片段；
PCR反应体系20μL，反应条件：95℃，5min；(95℃，30sec；60℃，30sec；72℃，30sec，35个循环)；72℃，10min；4℃保温。使用GAPDH作为内参。
实验结果显示(见图20)，野生型C57BL/6小鼠活化细胞中可检测到鼠Cd47和Sirpa的mRNA表达，CD47/SIRPA基因人源化纯合子小鼠活化细胞中可检测到人CD47和SIRPA的mRNA表达。
上述得到的双重人源化CD47/SIRPA小鼠可以用于制备三人源化CD47/SIRPA/PD-1小鼠。由于小鼠CD47或SIRPA基因与PD-1基因均不在同一条染色体上，可通过将双重人源化CD47/SIRPA小鼠与包含人源PD-1基因的小鼠(如B-hPD-1小鼠)以自然交配或体外受精的方式进行繁殖，通过阳性子代小鼠的筛选和交配扩繁，最终可得到三人源化CD47/SIRPA/PD-1小鼠。
实施例14双重人源化CD47/SIRPA小鼠动物模型体内药效验证
取双重人源化CD47/SIRPA小鼠(7-9周)，皮下接种过表达人CD47的小鼠结肠癌细胞MC38，待肿瘤体积约100mm3后随机分为对照组或治疗组(n＝5/组)。治疗组随机选择抗人CD47抗体AB1、AB2、AB3中的1种或抗人SIRPA抗体Ab-S1、Ab-S2、Ab-S3中的1种(以上抗体均为采用常规方法免疫小鼠得到)，给药剂量为3mg/kg，每周1、4给药，共给药6次。对照组注射生理盐水。每周测量肿瘤体积2次并称量小鼠的体重，接种后单只小鼠肿瘤体积达到3000mm3时执行安乐死结束实验。
整体来看，各组实验过程中，动物健康状态良好。在各实验终点时，各组动物体重增长良好，所有治疗组与对照组相比，动物体重无明显差异，表明动物对所述3种抗人CD47抗体及3种抗人SIRPA抗体均耐受良好。所有实验治疗组和对照组小鼠体重(图21、23)在整个实验周期内均无明显区别，但从肿瘤测量结果上看(图22、24)，所有对照组小鼠肿瘤在实验周期内均持续生长，人CD47抗体实验组中，所有治疗组小鼠与对照组相比，肿瘤体积呈现不同程度的缩小，表明3种抗人CD47抗体具有不同程度的抑瘤作用；抗人SIRPA抗体实验组中，不同治疗组小鼠肿瘤体积被抑制程度较低，表明这3种抗人SIRPA抗体在本次实验中的肿瘤抑制率不高，但所有6种抗体均未对动物产生明显毒性作用，安全性较好。
表10中列出了各个实验的主要数据和分析结果，具体包括分组时(第0天)和分组后14天时的肿瘤体积及实验结束时的肿瘤体积、小鼠存活情况、无肿瘤小鼠(tumor free)的情况、肿瘤(体积)抑制率(Tumor Growth Inhibition value，TGITV)。
在实验终点时，所有小鼠均存活，人CD47抗体实验组中，对照组(G1)平均肿瘤体积为2166±335mm3，AB1治疗组(G2)为2007±438mm3，AB2抗体治疗组(G3)为1227±229mm3，AB3抗体治疗组(G4)为828±139mm3，使用AB1治疗组(G2)与对照组(G1)小鼠肿瘤体积大小差别不大，但G3、G4组与对照组(G1)的瘤体积相比均具有显著的差异(P＜0.05)，TGITV分别为46.7％、65.6％，表明在相同的给药剂量和频次下，3种人CD47单抗具有不同的抑瘤作用，且未对动物产生明显毒性作用，安全性较好。
人SIRPA抗体实验组中，抗体Ab-S1(G2)、Ab-S2(G3)治疗组与对照组(G1)相比，肿瘤体积差别不明显，抗体Ab-S3治疗组(G4)的小鼠平均肿瘤体积为820±88mm3，与对照组(G1)相比，肿瘤体积呈一定程度的缩小，表明这3种抗人SIRPA单抗在抑制肿瘤生长方面具有不同的作用，抗体Ab-S3体内***效果明显优于抗体Ab-S1、Ab-S2。
本实验证明了双重人源化CD47/SIRPA小鼠可用于筛选靶向人CD47、SIRPA的药物(如，抗体)及体内药效检测。
表10肿瘤体积、存活率及肿瘤抑制率
Figure BDA0001618658140000331
Figure BDA0001618658140000341
实施例15基于胚胎干细胞的制备方法
采用其它基因编辑***和制备方法也可以得到本发明的非人哺乳动物，包括但不限于基于胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES)的基因同源重组技术、锌指核酸酶(ZFN)技术、转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)技术、归巢核酸内切酶(兆碱基大范围核酶)或其他分子生物学技术。本实施例以传统的ES细胞基因同源重组技术为例，阐述如何采用其它方法制备获得CD47基因人源化小鼠。
以NM_010581.3→NP_034711.1转录本为例，图25、26显示了本发明的基因编辑策略和人源化小鼠CD47基因示意图，据此发明人设计了图27所示的打靶策略，图25中还显示了重组载体的设计。鉴于本发明的目的之一是将小鼠Cd47基因的2号外显子全部或部分用人CD47基因片段替换，为此，发明人设计了包含5’同源臂(4081bp)、3’同源臂(3410bp)和人源化基因片段(312bp)的重组载体，在重组载体上构建了用于阳性克隆筛选的抗性基因，如新霉素磷酸转移酶编码序列Neo，并在抗性基因的两侧装上两个同向排列的位点特异性重组***，如Frt或LoxP重组位点。进一步的，还在重组载体3’同源臂下游构建了具有负筛选标记的编码基因，如白喉毒素A亚基的编码基因(DTA)。载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接等。将构建正确的重组载体转染小鼠胚胎干细胞，如C57BL/6小鼠的胚胎干细胞，利用阳性克隆筛选标记基因对得到的重组载体转染细胞进行筛选，并利用Southern Blot技术进行DNA重组鉴定。将筛选出的正确阳性克隆按照《小鼠胚胎操作实验手册(第三版)》中的方法将阳性克隆细胞(黑色鼠)通过显微注射进入已分离好的囊胚中(白色鼠)，注射后的嵌合囊胚转移至培养液中短暂培养，然后移植至受体母鼠(白色鼠)的输卵管，可生产F0代嵌合体鼠(黑白相间)。通过提取鼠尾基因组和PCR检测，挑选基因正确重组的F0代嵌合鼠用于后续繁殖和鉴定。将F0代嵌合鼠与野生型鼠交配获得F1代鼠，通过提取鼠尾基因组和PCR检测，挑选可以稳定遗传的基因重组阳性F1代杂合子小鼠。再将F1代杂合小鼠互相交配即可获得基因重组阳性F2代纯合子鼠。此外，可将F1代杂合鼠与Flp或Cre工具鼠交配去除阳性克隆筛选标记基因(neo等)后，再通过互相交配即可得到基因人源化纯合子小鼠。对获得的F1代杂合或F2代纯合鼠进行基因型和表型检测的方法与前述实施例10一致。结果表明，利用ES细胞基因同源重组技术也可以制备得到CD47基因人源化小鼠。
综上，本发明获得的CD47人源化小鼠具有制备方法简便、制备周期短、遗传背景清晰等明显优势，人源改造序列片段较小，在充分保留人CD47拮抗剂的主要结合部位的同时，极大程度的降低了对小鼠体内正常表达CD47蛋白的影响，且不会影响小鼠体内CD47蛋白下游细胞内的信号传递和功能。本方法在获得人源化小鼠的同时，还可以利用同源重组的方式产生随机***/缺失突变的小鼠。以上实验表明本方法可以用于啮齿类Cd47基因组编辑和遗传改造，所制备的CD47人源化小鼠可用于人CD47相关的信号机理研究及体内进行靶向人CD47基因的药物筛选和测试。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
序列表
<110> 北京百奥赛图基因生物技术有限公司
<120> CD47基因人源化改造动物模型的制备方法及应用
<130> 1
<160> 89
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cccttgcatc gtccgtaatg tgg 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tccacattac ggacgatgca agg 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgctttgcgc ctccacatta cgg 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cacttcatgc aatgaaactg tgg 23
<210> 5
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ccgaagaaat gtttgtgaag tgg 23
<210> 6
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
attgcatgaa gtgaactcta tgg 23
<210> 7
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tcgtatattt tcatctatga tgg 23
<210> 8
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ccacttcaca aacatttctt cgg 23
<210> 9
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aatggataag cgcgatgcca tgg 23
<210> 10
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gataagcgcg atgccatggt ggg 23
<210> 11
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gcaagtgtag tttcccacca tgg 23
<210> 12
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tcagtctcag acttaatcaa tgg 23
<210> 13
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tgagactgag atttttgcac tgg 23
<210> 14
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gcgcttatcc attttcaaag agg 23
<210> 15
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tggcattgcc tctttgaaaa tgg 23
<210> 16
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gtgacagagt tatccagaga agg 23
<210> 17
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tataactgtt ttgccttctc tgg 23
<210> 18
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
taggcatgaa gtgaactcta 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
aaactagagt tcacttcatg 20
<210> 20
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
taggataagc gcgatgcca 19
<210> 21
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
aaactggcat cgcgcttat 19
<210> 22
<211> 132
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
gaattctaat acgactcact atagggggtc ttcgagaaga cctgttttag agctagaaat 60
agcaagttaa aataaggcta gtccgttatc aacttgaaaa agtggcaccg agtcggtgct 120
tttaaaggat cc 132
<210> 23
<211> 486
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
tatatgcaga ttgtaatgaa atatttttgt gtatgtattc caggttcagc tcaactactg 60
tttaataaaa caaaatctgt agaattcacg ttttgtaatg acactgtcgt cattccatgc 120
tttgttacta atatggaggc acaaaacact actgaagtat acgtaaagtg gaaatttaaa 180
ggaagagata tctacacctt tgatggagct ctaaacaagt ccactgtccc cactgacttt 240
agtagtgcaa aaattgaagt ctcacaatta ctaaaaggag atgcctcttt gaagatggat 300
aagagtgatg ctgtctcaca cacaggaaac tacacttgtg aagtaacaga attaaccaga 360
gaaggtgaaa cgatcataga gctgaaaaac cgcacgggta agtgacacag tttgcctgtt 420
ttgaaacgtg tgttgagata tggttgccac tgtgggagtg ctgtaaggtg gaaccttgca 480
gaagtc 486
<210> 24
<211> 1058
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
tgtctggttt acatagaagg aggaactatt aatgattaat ggagttaatg ttttatattc 60
gttggtactt tgggttttga aggcaaagtc aacaagctac tcagataaga gctttggata 120
catggccatg ttagaaaata gagtggtagt tcctccacat ctttgccatt tgagtcaaat 180
ggtaagcagg gcactcaagg gtggtctatg ccagtgagaa gagccaatga gtattctcta 240
ctcatcagca gcatctgctc ttgctttcaa atttttcctt ggcttttagg gtagtttatg 300
gtttattgga ggaagaaata cctgtaatct acatttcaca attgttctgt agagtcagtg 360
aaatgtcggg gtaggaaaaa tgccattcaa ttgtgtggaa tcctttgtgt ggacttgcat 420
acaaagcgcc tatcgctctc tcttttgaag tgggaaatag ccacagagaa cattttttcc 480
ctcattagta ttccaagact tcccatcctc ttggaaagat aagatttgat tcattccagt 540
tgctttgtat attaaagtat aatagaactg gccacttctt ttgggttatg cagcctgagt 600
gaagagataa atttcatatc actttagcac attccatcta gaagacgtgt atggaagttg 660
agcctgaata gaatatttgg ttttctattc aggatgttcc catagtaagg agagtatttt 720
tctacatata tcagtaagca gacatgatta cttcagagct ttcaaagcta gatactgtac 780
cttgcatatt ccaacacaat tggtaaattt atccccaaga tgcatggtat gcatactttg 840
tattattaaa accaaaaaag aaaagttaca gtctactggc tggtgtgcaa ataatttgtt 900
gctatttttc accttgttcc tgtactacaa gcataaatga acagttgcag tagttttctt 960
tacgttaagg gtttgtaata cacctaagat aatcatatat gcagattgta atgaaatatt 1020
tttgtgtatg tattccaggt tcagctcaac tactgttt 1058
<210> 25
<211> 53
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
tttaagaagg agatatacat gaattctgtc tggtttacat agaaggagga act 53
<210> 26
<211> 50
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
gaattctaca gattttgttt tattaaacag tagttgagct gaacctggaa 50
<210> 27
<211> 312
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
aataaaacaa aatctgtaga attcacgttt tgtaatgaca ctgtcgtcat tccatgcttt 60
gttactaata tggaggcaca aaacactact gaagtatacg taaagtggaa atttaaagga 120
agagatatct acacctttga tggagctcta aacaagtcca ctgtccccac tgactttagt 180
agtgcaaaaa ttgaagtctc acaattacta aaaggagatg cctctttgaa gatggataag 240
agtgatgctg tctcacacac aggaaactac acttgtgaag taacagaatt aaccagagaa 300
ggtgaaacga tc 312
<210> 28
<211> 47
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
gttcagctca actactgttt aataaaacaa aatctgtaga attcacg 47
<210> 29
<211> 49
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
gtttagagct ccatcaaagg tgtagatatc tcttccttta aatttccac 49
<210> 30
<211> 49
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
gtggaaattt aaaggaagag atatctacac ctttgatgga gctctaaac 49
<210> 31
<211> 47
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
gtgcggtttt tcagctctat gatcgtttca ccttctctgg ttaattc 47
<210> 32
<211> 1149
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
atagagctga aaaaccgcac gggtaagtga cacagtttgc ctgttttgaa acgtgtgttg 60
agatatggtt gccactgtgg gagtgctgta aggtggaacc ttgcagaagt cactaggagg 120
aattaaggct cttcttgggc aagtgggcta gccatctgga tagaaagtga gtctggcact 180
cgtgtttctt tctcttttac acacacacaa acacatacac acacacacac acacacacac 240
acacacacac acacacacac acacactcac tcactcactc ttcatctagc acatctacag 300
cattgtgagg tagcacaatc ctcctcagaa gctgagcagg tgtcagcacc atgcagtgga 360
acttctaggc ccaagaacca gaaaccaagt taagctgctt atcagatacc tcctcctggt 420
cctgtgttac agcaggagaa aacagactga aagcaagcaa aagtaagacc gtaaaattcc 480
taaaggcctc ctgcatccta gtgatgctga ccctcttaga aagagcacag tagtagccag 540
acttgtctct catctatagc tctttccctc aggagcaagg cccagcctca gctatataac 600
atatttgagg ctagcctggg caacaggaaa cctcatgtta aaaacaaccc ttctgatgac 660
gtaatgggtg tttctgttcg ttgtcatcaa atgtaattta tctgagtatg gtggcccatg 720
actgatctta gcaccccgga ggctgagaca ggaggattgc tgcaaattgg aggcaaccct 780
ggactctgta agtgagttac agaagaacct cagggcaaga cctcacctta ccaagccaag 840
aaacttttgc aaacaaaatg tactttttat tattctatga atttgtaaag ttcctcctgg 900
ttatttcgtc tttttgtggt cttatagcct tcaacactga ccaaggatca gcctgttctt 960
acgaggagga gaaaggaggt tgcaaattag gtaatcatgc tgattcctgg aggcttctgt 1020
ggccagcttg ctacactggc cagcaactgg gaagcaggga ttcaacttaa ccgaattgaa 1080
ttcagtcttg atgctagcgt ccagactttt catgagtggg ttggtgagtt gcggacagca 1140
gtgttgtta 1149
<210> 33
<211> 47
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
ccagagaagg tgaaacgatc atagagctga aaaaccgcac gggtaag 47
<210> 34
<211> 50
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
ttgttagcag ccggatctca ggatcctaac aacactgctg tccgcaactc 50
<210> 35
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
acccttagcc agagagcaca gagac 25
<210> 36
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
tggggacagt ggacttgttt agagc 25
<210> 37
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
acactgtcgt cattccatgc tttgt 25
<210> 38
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
acctggttct caaagtgtca ccacc 25
<210> 39
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
gtcatccctt gcatcgtccg 20
<210> 40
<211> 22
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
acttcgcaag tgtagtttcc ca 22
<210> 41
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
acactgtcgt cattccatgc t 21
<210> 42
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
cctgtgtgtg agacagcatc a 21
<210> 43
<211> 28
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
ggtaaattta tccccaagat gcatggta 28
<210> 44
<211> 27
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
gccttaattc ctcctagtga cttctgc 27
<210> 45
<211> 1928
<212> DNA/RNA
<213> 小鼠(Mouse)
<400> 45
cccgggcagc ctgggcggcc gctcctgcct gtcactgctg cggcgctgct ggtcggtcgt 60
ttcccttgaa ggcagcagcg gaggcggcgg ctgctccaga cacctgcggc ggcgaccccc 120
cggcggcgcg gagatgtggc ccttggcggc ggcgctgttg ctgggctcct gctgctgcgg 180
ttcagctcaa ctactgttta gtaacgtcaa ctccatagag ttcacttcat gcaatgaaac 240
tgtggtcatc ccttgcatcg tccgtaatgt ggaggcgcaa agcaccgaag aaatgtttgt 300
gaagtggaag ttgaacaaat cgtatatttt catctatgat ggaaataaaa atagcactac 360
tacagatcaa aactttacca gtgcaaaaat ctcagtctca gacttaatca atggcattgc 420
ctctttgaaa atggataagc gcgatgccat ggtgggaaac tacacttgcg aagtgacaga 480
gttatccaga gaaggcaaaa cagttataga gctgaaaaac cgcacggcct tcaacactga 540
ccaaggatca gcctgttctt acgaggagga gaaaggaggt tgcaaattag tttcgtggtt 600
ttctccaaat gaaaagatcc tcattgttat tttcccaatt ttggctatac tcctgttctg 660
gggaaagttt ggtattttaa cactcaaata taaatccagc catacgaata agagaatcat 720
tctgctgctc gttgccgggc tggtgctcac agtcatcgtg gttgttggag ccatccttct 780
catcccagga gaaaagcccg tgaagaatgc ttctggactt ggcctcattg taatctctac 840
ggggatatta atactacttc agtacaatgt gtttatgaca gcttttggaa tgacctcttt 900
caccattgcc atattgatca ctcaagtgct gggctacgtc cttgctttgg tcgggctgtg 960
tctctgcatc atggcatgtg agccagtgca cggccccctt ttgatttcag gtttggggat 1020
catagctcta gcagaactac ttggattagt ttatatgaag tttgtcgctt ccaaccagag 1080
gactatccaa cctcctagga ataggtgaag ggaagtgacg gactgtaact tggaagtcag 1140
aaatggaaga atacagttgt ctaagcacca ggtcttcacg actcacagct ggaaggaaca 1200
gacaacagta actgacttcc atccaggaaa acatgtcaca taaatgatta ctaagtttat 1260
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aatcccattt ttctattgtt tctactcaac taggggcaaa cgtttcaggg gcaacttcca 1380
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ctcaaatata aatccagcca tacgaataag agaatcattc tgctgctcgt tgccgggctg 1080
gtgctcacag tcatcgtggt tgttggagcc atccttctca tcccaggaga aaagcccgtg 1140
aagaatgctt ctggacttgg cctcattgta atctctacgg ggatattaat actacttcag 1200
tacaatgtgt ttatgacagc ttttggaatg acctctttca ccattgccat attgatcact 1260
caagtgctgg gctacgtcct tgctttggtc gggctgtgtc tctgcatcat ggcatgtgag 1320
ccagtgcacg gccccctttt gatttcaggt ttggggatca tagctctagc agaactactt 1380
ggattagttt atatgaagtt tgtcgcttcc aaccagagga ctatccaacc tcctaggaaa 1440
gctgtagagg aaccccttaa cgcatttaaa gagtcaaaag gaatgatgaa tgacgaatag 1500
gtgaagggaa gtgacggact gtaacttgga agtcagaaat ggaagaatac agttgtctaa 1560
gcaccaggtc ttcacgactc acagctggaa ggaacagaca acagtaactg acttccatcc 1620
aggaaaacat gtcacataaa tgattactaa gtttatattc aaagcagctg tactttacat 1680
aataaaaaaa atatgatgtg ctgtgtaacc aattggaatc ccatttttct attgtttcta 1740
ctcaactagg ggcaaacgtt tcaggggcaa cttccaagaa tgatgcttgt tagatcctag 1800
agtctctgaa cactgagttt aaattgattc cgagtgagac tcgccaagca ctaacctgag 1860
ggttagttac ccagagatac ctatgaaaaa cagtggtatc cagcaagcct tagtaaactc 1920
aggttgccag cagctttgcc acttccgctg ctagctgaat aacaagactg ccacttctgg 1980
gtcatagtga tagagactga agtagaaaaa cgaatgtggt tgggcaaatc ccgtgtggcc 2040
cctctgtgtg ctatgatatt gatggcactg gtgtcttcat tcttgggggt tgccatcatt 2100
cacacacacc cctttgacat acagtgcacc ccagttttga atacattttt tttgcaccct 2160
gtcccgttct gctactttga tttgcgttat gatatatata tatatatata ataccttttc 2220
tcctctttaa acatggtcct gtgacacaat agtcagttgc agaaaggagc cagacttatt 2280
cgcaaagcac tgtgctcaaa ctcttcagaa aaaaaggaaa aaaaaaaaaa gctatagttg 2340
taacatatgt attccagacc tctggtttaa aggcaaaaga aaaaaaatct acagtgtttc 2400
ttctcatgtt ttctgatcgg aggcatgaca aagcaagact gaaatctgaa ctgtgtctcc 2460
tgcatggcaa cacgtgtctc cgtcaggccc tcgcaaggcc cggggagggg gttctacgcc 2520
tcttgtctct ttgttgcatg ctgaacactc atcgccttcc tactgtatcc tgcctcctgc 2580
agcctccctc ttcctcctcc tcttcctctt cctcctcttc ctcctcctcc tcctcttcct 2640
ccaagtttga aaggtcaaac aaaactacca cattccctac ccagttagaa gaaaaccacc 2700
gtcctgacag ttgtgatcgc atggagtact tttagattat tagcacctgt ttttacctcg 2760
tttgtgggcg tgtttgtatg tgcacatgta tgaagtcggc acatgcacct tctgtatggg 2820
cagaggcgtg gcatctacag aagagcagat gccaactttg tgcttttagt gaatacatta 2880
aaaaaaaaaa accaacggtc cttattgagt ggaattctat ttgatgcaaa tatttgagct 2940
ctttaagact ttaaaactag ataatgtgcc aagcttttag gactgctcac cagtgccctc 3000
tgaagaaaca ccagtacttt ttcctgtttg tgtaataaag gcatatttgt a 3051
<210> 51
<211> 2993
<212> DNA/RNA
<213> 小鼠(Mouse)
<400> 51
tggtgaaagc agaagcagcg cctacaccgg gagagcaggg aggaggagtt ggactgaggt 60
tgggcggctc cgaggtccag ggcgagcttg gccagaggga gtagagagca gcggggctgc 120
gcagggacgc gtgccgtgag ttccggtgag cgtgtgtgtc ccatgctccc gtctttcagg 180
ccggcccagg acacgaagcc ggaagagagc tggctggagg gacgggggcc gtgagcagag 240
agtgcaaccc gcgcagcccc ggggacaggc tgattcttgg cgctctccgc cggagcctgc 300
ccagggctgg gtgtgaggct ggcgtcacgt caacgagcag aggcggccag gcggggcgga 360
gtgcgcgtgc gcggggcggc gagcacgcgc gcgcgcgcac ccccgggcag cctgggcggc 420
cgctcctgcc tgtcactgct gcggcgctgc tggtcggtcg tttcccttga aggcagcagc 480
ggaggcggcg gctgctccag acacctgcgg cggcgacccc ccggcggcgc ggagatgtgg 540
cccttggcgg cggcgctgtt gctgggctcc tgctgctgcg gttcagctca actactgttt 600
agtaacgtca actccataga gttcacttca tgcaatgaaa ctgtggtcat cccttgcatc 660
gtccgtaatg tggaggcgca aagcaccgaa gaaatgtttg tgaagtggaa gttgaacaaa 720
tcgtatattt tcatctatga tggaaataaa aatagcacta ctacagatca aaactttacc 780
agtgcaaaaa tctcagtctc agacttaatc aatggcattg cctctttgaa aatggataag 840
cgcgatgcca tggtgggaaa ctacacttgc gaagtgacag agttatccag agaaggcaaa 900
acagttatag agctgaaaaa ccgcacggtt tcgtggtttt ctccaaatga aaagatcctc 960
attgttattt tcccaatttt ggctatactc ctgttctggg gaaagtttgg tattttaaca 1020
ctcaaatata aatccagcca tacgaataag agaatcattc tgctgctcgt tgccgggctg 1080
gtgctcacag tcatcgtggt tgttggagcc atccttctca tcccaggaga aaagcccgtg 1140
aagaatgctt ctggacttgg cctcattgta atctctacgg ggatattaat actacttcag 1200
tacaatgtgt ttatgacagc ttttggaatg acctctttca ccattgccat attgatcact 1260
caagtgctgg gctacgtcct tgctttggtc gggctgtgtc tctgcatcat ggcatgtgag 1320
ccagtgcacg gccccctttt gatttcaggt ttggggatca tagctctagc agaactactt 1380
ggattagttt atatgaagtt tgtcgcttcc aaccagagga ctatccaacc tcctaggaat 1440
aggtgaaggg aagtgacgga ctgtaacttg gaagtcagaa atggaagaat acagttgtct 1500
aagcaccagg tcttcacgac tcacagctgg aaggaacaga caacagtaac tgacttccat 1560
ccaggaaaac atgtcacata aatgattact aagtttatat tcaaagcagc tgtactttac 1620
ataataaaaa aaatatgatg tgctgtgtaa ccaattggaa tcccattttt ctattgtttc 1680
tactcaacta ggggcaaacg tttcaggggc aacttccaag aatgatgctt gttagatcct 1740
agagtctctg aacactgagt ttaaattgat tccgagtgag actcgccaag cactaacctg 1800
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tcaggttgcc agcagctttg ccacttccgc tgctagctga ataacaagac tgccacttct 1920
gggtcatagt gatagagact gaagtagaaa aacgaatgtg gttgggcaaa tcccgtgtgg 1980
cccctctgtg tgctatgata ttgatggcac tggtgtcttc attcttgggg gttgccatca 2040
ttcacacaca cccctttgac atacagtgca ccccagtttt gaatacattt tttttgcacc 2100
ctgtcccgtt ctgctacttt gatttgcgtt atgatatata tatatatata taataccttt 2160
tctcctcttt aaacatggtc ctgtgacaca atagtcagtt gcagaaagga gccagactta 2220
ttcgcaaagc actgtgctca aactcttcag aaaaaaagga aaaaaaaaaa aagctatagt 2280
tgtaacatat gtattccaga cctctggttt aaaggcaaaa gaaaaaaaat ctacagtgtt 2340
tcttctcatg ttttctgatc ggaggcatga caaagcaaga ctgaaatctg aactgtgtct 2400
cctgcatggc aacacgtgtc tccgtcaggc cctcgcaagg cccggggagg gggttctacg 2460
cctcttgtct ctttgttgca tgctgaacac tcatcgcctt cctactgtat cctgcctcct 2520
gcagcctccc tcttcctcct cctcttcctc ttcctcctct tcctcctcct cctcctcttc 2580
ctccaagttt gaaaggtcaa acaaaactac cacattccct acccagttag aagaaaacca 2640
ccgtcctgac agttgtgatc gcatggagta cttttagatt attagcacct gtttttacct 2700
cgtttgtggg cgtgtttgta tgtgcacatg tatgaagtcg gcacatgcac cttctgtatg 2760
ggcagaggcg tggcatctac agaagagcag atgccaactt tgtgctttta gtgaatacat 2820
taaaaaaaaa aaaccaacgg tccttattga gtggaattct atttgatgca aatatttgag 2880
ctctttaaga ctttaaaact agataatgtg ccaagctttt aggactgctc accagtgccc 2940
tctgaagaaa caccagtact ttttcctgtt tgtgtaataa aggcatattt gta 2993
<210> 52
<211> 324
<212> PRT
<213> 小鼠(Mouse)
<400> 52
Met Trp Pro Leu Ala Ala Ala Leu Leu Leu Gly Ser Cys Cys Cys Gly
1 5 10 15
Ser Ala Gln Leu Leu Phe Ser Asn Val Asn Ser Ile Glu Phe Thr Ser
20 25 30
Cys Asn Glu Thr Val Val Ile Pro Cys Ile Val Arg Asn Val Glu Ala
35 40 45
Gln Ser Thr Glu Glu Met Phe Val Lys Trp Lys Leu Asn Lys Ser Tyr
50 55 60
Ile Phe Ile Tyr Asp Gly Asn Lys Asn Ser Thr Thr Thr Asp Gln Asn
65 70 75 80
Phe Thr Ser Ala Lys Ile Ser Val Ser Asp Leu Ile Asn Gly Ile Ala
85 90 95
Ser Leu Lys Met Asp Lys Arg Asp Ala Met Val Gly Asn Tyr Thr Cys
100 105 110
Glu Val Thr Glu Leu Ser Arg Glu Gly Lys Thr Val Ile Glu Leu Lys
115 120 125
Asn Arg Thr Ala Phe Asn Thr Asp Gln Gly Ser Ala Cys Ser Tyr Glu
130 135 140
Glu Glu Lys Gly Gly Cys Lys Leu Val Ser Trp Phe Ser Pro Asn Glu
145 150 155 160
Lys Ile Leu Ile Val Ile Phe Pro Ile Leu Ala Ile Leu Leu Phe Trp
165 170 175
Gly Lys Phe Gly Ile Leu Thr Leu Lys Tyr Lys Ser Ser His Thr Asn
180 185 190
Lys Arg Ile Ile Leu Leu Leu Val Ala Gly Leu Val Leu Thr Val Ile
195 200 205
Val Val Val Gly Ala Ile Leu Leu Ile Pro Gly Glu Lys Pro Val Lys
210 215 220
Asn Ala Ser Gly Leu Gly Leu Ile Val Ile Ser Thr Gly Ile Leu Ile
225 230 235 240
Leu Leu Gln Tyr Asn Val Phe Met Thr Ala Phe Gly Met Thr Ser Phe
245 250 255
Thr Ile Ala Ile Leu Ile Thr Gln Val Leu Gly Tyr Val Leu Ala Leu
260 265 270
Val Gly Leu Cys Leu Cys Ile Met Ala Cys Glu Pro Val His Gly Pro
275 280 285
Leu Leu Ile Ser Gly Leu Gly Ile Ile Ala Leu Ala Glu Leu Leu Gly
290 295 300
Leu Val Tyr Met Lys Phe Val Ala Ser Asn Gln Arg Thr Ile Gln Pro
305 310 315 320
Pro Arg Asn Arg
<210> 53
<211> 320
<212> PRT
<213> 小鼠(Mouse)
<400> 53
Met Trp Pro Leu Ala Ala Ala Leu Leu Leu Gly Ser Cys Cys Cys Gly
1 5 10 15
Ser Ala Gln Leu Leu Phe Ser Asn Val Asn Ser Ile Glu Phe Thr Ser
20 25 30
Cys Asn Glu Thr Val Val Ile Pro Cys Ile Val Arg Asn Val Glu Ala
35 40 45
Gln Ser Thr Glu Glu Met Phe Val Lys Trp Lys Leu Asn Lys Ser Tyr
50 55 60
Ile Phe Ile Tyr Asp Gly Asn Lys Asn Ser Thr Thr Thr Asp Gln Asn
65 70 75 80
Phe Thr Ser Ala Lys Ile Ser Val Ser Asp Leu Ile Asn Gly Ile Ala
85 90 95
Ser Leu Lys Met Asp Lys Arg Asp Ala Met Val Gly Asn Tyr Thr Cys
100 105 110
Glu Val Thr Glu Leu Ser Arg Glu Gly Lys Thr Val Ile Glu Leu Lys
115 120 125
Asn Arg Thr Ala Phe Asn Thr Asp Gln Gly Ser Ala Cys Ser Tyr Glu
130 135 140
Glu Glu Lys Gly Gly Cys Lys Leu Val Ser Trp Phe Ser Pro Asn Glu
145 150 155 160
Lys Ile Leu Ile Val Ile Phe Pro Ile Leu Ala Ile Leu Leu Phe Trp
165 170 175
Gly Lys Phe Gly Ile Leu Thr Leu Lys Tyr Lys Ser Ser His Thr Asn
180 185 190
Lys Arg Ile Ile Leu Leu Leu Val Ala Gly Leu Val Leu Thr Val Ile
195 200 205
Val Val Val Gly Ala Ile Leu Leu Ile Pro Gly Glu Lys Pro Val Lys
210 215 220
Asn Ala Ser Gly Leu Gly Leu Ile Val Ile Ser Thr Gly Ile Leu Ile
225 230 235 240
Leu Leu Gln Tyr Asn Val Phe Met Thr Ala Phe Gly Met Thr Ser Phe
245 250 255
Thr Ile Ala Ile Leu Ile Thr Gln Val Leu Gly Tyr Val Leu Ala Leu
260 265 270
Val Gly Leu Cys Leu Cys Ile Met Ala Cys Glu Pro Val His Gly Pro
275 280 285
Leu Leu Ile Ser Gly Leu Gly Ile Ile Ala Leu Ala Glu Leu Leu Gly
290 295 300
Leu Val Tyr Met Lys Phe Val Glu Trp Arg Glu Thr Pro Ser Val Ser
305 310 315 320
<210> 54
<211> 342
<212> PRT
<213> 小鼠(Mouse)
<400> 54
Met Trp Pro Leu Ala Ala Ala Leu Leu Leu Gly Ser Cys Cys Cys Gly
1 5 10 15
Ser Ala Gln Leu Leu Phe Ser Asn Val Asn Ser Ile Glu Phe Thr Ser
20 25 30
Cys Asn Glu Thr Val Val Ile Pro Cys Ile Val Arg Asn Val Glu Ala
35 40 45
Gln Ser Thr Glu Glu Met Phe Val Lys Trp Lys Leu Asn Lys Ser Tyr
50 55 60
Ile Phe Ile Tyr Asp Gly Asn Lys Asn Ser Thr Thr Thr Asp Gln Asn
65 70 75 80
Phe Thr Ser Ala Lys Ile Ser Val Ser Asp Leu Ile Asn Gly Ile Ala
85 90 95
Ser Leu Lys Met Asp Lys Arg Asp Ala Met Val Gly Asn Tyr Thr Cys
100 105 110
Glu Val Thr Glu Leu Ser Arg Glu Gly Lys Thr Val Ile Glu Leu Lys
115 120 125
Asn Arg Thr Ala Phe Asn Thr Asp Gln Gly Ser Ala Cys Ser Tyr Glu
130 135 140
Glu Glu Lys Gly Gly Cys Lys Leu Val Ser Trp Phe Ser Pro Asn Glu
145 150 155 160
Lys Ile Leu Ile Val Ile Phe Pro Ile Leu Ala Ile Leu Leu Phe Trp
165 170 175
Gly Lys Phe Gly Ile Leu Thr Leu Lys Tyr Lys Ser Ser His Thr Asn
180 185 190
Lys Arg Ile Ile Leu Leu Leu Val Ala Gly Leu Val Leu Thr Val Ile
195 200 205
Val Val Val Gly Ala Ile Leu Leu Ile Pro Gly Glu Lys Pro Val Lys
210 215 220
Asn Ala Ser Gly Leu Gly Leu Ile Val Ile Ser Thr Gly Ile Leu Ile
225 230 235 240
Leu Leu Gln Tyr Asn Val Phe Met Thr Ala Phe Gly Met Thr Ser Phe
245 250 255
Thr Ile Ala Ile Leu Ile Thr Gln Val Leu Gly Tyr Val Leu Ala Leu
260 265 270
Val Gly Leu Cys Leu Cys Ile Met Ala Cys Glu Pro Val His Gly Pro
275 280 285
Leu Leu Ile Ser Gly Leu Gly Ile Ile Ala Leu Ala Glu Leu Leu Gly
290 295 300
Leu Val Tyr Met Lys Phe Val Ala Ser Asn Gln Arg Thr Ile Gln Pro
305 310 315 320
Pro Arg Lys Ala Val Glu Glu Pro Leu Asn Ala Phe Lys Glu Ser Lys
325 330 335
Gly Met Met Asn Asp Glu
340
<210> 55
<211> 331
<212> PRT
<213> 小鼠(Mouse)
<400> 55
Met Trp Pro Leu Ala Ala Ala Leu Leu Leu Gly Ser Cys Cys Cys Gly
1 5 10 15
Ser Ala Gln Leu Leu Phe Ser Asn Val Asn Ser Ile Glu Phe Thr Ser
20 25 30
Cys Asn Glu Thr Val Val Ile Pro Cys Ile Val Arg Asn Val Glu Ala
35 40 45
Gln Ser Thr Glu Glu Met Phe Val Lys Trp Lys Leu Asn Lys Ser Tyr
50 55 60
Ile Phe Ile Tyr Asp Gly Asn Lys Asn Ser Thr Thr Thr Asp Gln Asn
65 70 75 80
Phe Thr Ser Ala Lys Ile Ser Val Ser Asp Leu Ile Asn Gly Ile Ala
85 90 95
Ser Leu Lys Met Asp Lys Arg Asp Ala Met Val Gly Asn Tyr Thr Cys
100 105 110
Glu Val Thr Glu Leu Ser Arg Glu Gly Lys Thr Val Ile Glu Leu Lys
115 120 125
Asn Arg Thr Ala Phe Asn Thr Asp Gln Gly Ser Ala Cys Ser Tyr Glu
130 135 140
Glu Glu Lys Gly Gly Cys Lys Leu Val Ser Trp Phe Ser Pro Asn Glu
145 150 155 160
Lys Ile Leu Ile Val Ile Phe Pro Ile Leu Ala Ile Leu Leu Phe Trp
165 170 175
Gly Lys Phe Gly Ile Leu Thr Leu Lys Tyr Lys Ser Ser His Thr Asn
180 185 190
Lys Arg Ile Ile Leu Leu Leu Val Ala Gly Leu Val Leu Thr Val Ile
195 200 205
Val Val Val Gly Ala Ile Leu Leu Ile Pro Gly Glu Lys Pro Val Lys
210 215 220
Asn Ala Ser Gly Leu Gly Leu Ile Val Ile Ser Thr Gly Ile Leu Ile
225 230 235 240
Leu Leu Gln Tyr Asn Val Phe Met Thr Ala Phe Gly Met Thr Ser Phe
245 250 255
Thr Ile Ala Ile Leu Ile Thr Gln Val Leu Gly Tyr Val Leu Ala Leu
260 265 270
Val Gly Leu Cys Leu Cys Ile Met Ala Cys Glu Pro Val His Gly Pro
275 280 285
Leu Leu Ile Ser Gly Leu Gly Ile Ile Ala Leu Ala Glu Leu Leu Gly
290 295 300
Leu Val Tyr Met Lys Phe Val Ala Ser Asn Gln Arg Thr Ile Gln Pro
305 310 315 320
Pro Arg Lys Ala Val Glu Glu Pro Leu Asn Glu
325 330
<210> 56
<211> 312
<212> PRT
<213> 小鼠(Mouse)
<400> 56
Met Trp Pro Leu Ala Ala Ala Leu Leu Leu Gly Ser Cys Cys Cys Gly
1 5 10 15
Ser Ala Gln Leu Leu Phe Ser Asn Val Asn Ser Ile Glu Phe Thr Ser
20 25 30
Cys Asn Glu Thr Val Val Ile Pro Cys Ile Val Arg Asn Val Glu Ala
35 40 45
Gln Ser Thr Glu Glu Met Phe Val Lys Trp Lys Leu Asn Lys Ser Tyr
50 55 60
Ile Phe Ile Tyr Asp Gly Asn Lys Asn Ser Thr Thr Thr Asp Gln Asn
65 70 75 80
Phe Thr Ser Ala Lys Ile Ser Val Ser Asp Leu Ile Asn Gly Ile Ala
85 90 95
Ser Leu Lys Met Asp Lys Arg Asp Ala Met Val Gly Asn Tyr Thr Cys
100 105 110
Glu Val Thr Glu Leu Ser Arg Glu Gly Lys Thr Val Ile Glu Leu Lys
115 120 125
Asn Arg Thr Ala Phe Asn Thr Asp Gln Gly Ser Ala Cys Ser Tyr Glu
130 135 140
Glu Glu Lys Gly Gly Cys Lys Leu Val Ser Trp Phe Ser Pro Asn Glu
145 150 155 160
Lys Ile Leu Ile Val Ile Phe Pro Ile Leu Ala Ile Leu Leu Phe Trp
165 170 175
Gly Lys Phe Gly Ile Leu Thr Leu Lys Tyr Lys Ser Ser His Thr Asn
180 185 190
Lys Arg Ile Ile Leu Leu Leu Val Ala Gly Leu Val Leu Thr Val Ile
195 200 205
Val Val Val Gly Ala Ile Leu Leu Ile Pro Gly Glu Lys Pro Val Lys
210 215 220
Asn Ala Ser Gly Leu Gly Leu Ile Val Ile Ser Thr Gly Ile Leu Ile
225 230 235 240
Leu Leu Gln Tyr Asn Val Phe Met Thr Ala Phe Gly Met Thr Ser Phe
245 250 255
Thr Ile Ala Ile Leu Ile Thr Gln Val Leu Gly Tyr Val Leu Ala Leu
260 265 270
Val Gly Leu Cys Leu Cys Ile Met Ala Cys Glu Pro Val His Gly Pro
275 280 285
Leu Leu Ile Ser Gly Leu Gly Ile Ile Ala Leu Ala Glu Leu Leu Gly
290 295 300
Leu Val Tyr Met Lys Phe Val Glu
305 310
<210> 57
<211> 321
<212> PRT
<213> 小鼠(Mouse)
<400> 57
Met Trp Pro Leu Ala Ala Ala Leu Leu Leu Gly Ser Cys Cys Cys Gly
1 5 10 15
Ser Ala Gln Leu Leu Phe Ser Asn Val Asn Ser Ile Glu Phe Thr Ser
20 25 30
Cys Asn Glu Thr Val Val Ile Pro Cys Ile Val Arg Asn Val Glu Ala
35 40 45
Gln Ser Thr Glu Glu Met Phe Val Lys Trp Lys Leu Asn Lys Ser Tyr
50 55 60
Ile Phe Ile Tyr Asp Gly Asn Lys Asn Ser Thr Thr Thr Asp Gln Asn
65 70 75 80
Phe Thr Ser Ala Lys Ile Ser Val Ser Asp Leu Ile Asn Gly Ile Ala
85 90 95
Ser Leu Lys Met Asp Lys Arg Asp Ala Met Val Gly Asn Tyr Thr Cys
100 105 110
Glu Val Thr Glu Leu Ser Arg Glu Gly Lys Thr Val Ile Glu Leu Lys
115 120 125
Asn Arg Thr Val Ser Trp Phe Ser Pro Asn Glu Lys Ile Leu Ile Val
130 135 140
Ile Phe Pro Ile Leu Ala Ile Leu Leu Phe Trp Gly Lys Phe Gly Ile
145 150 155 160
Leu Thr Leu Lys Tyr Lys Ser Ser His Thr Asn Lys Arg Ile Ile Leu
165 170 175
Leu Leu Val Ala Gly Leu Val Leu Thr Val Ile Val Val Val Gly Ala
180 185 190
Ile Leu Leu Ile Pro Gly Glu Lys Pro Val Lys Asn Ala Ser Gly Leu
195 200 205
Gly Leu Ile Val Ile Ser Thr Gly Ile Leu Ile Leu Leu Gln Tyr Asn
210 215 220
Val Phe Met Thr Ala Phe Gly Met Thr Ser Phe Thr Ile Ala Ile Leu
225 230 235 240
Ile Thr Gln Val Leu Gly Tyr Val Leu Ala Leu Val Gly Leu Cys Leu
245 250 255
Cys Ile Met Ala Cys Glu Pro Val His Gly Pro Leu Leu Ile Ser Gly
260 265 270
Leu Gly Ile Ile Ala Leu Ala Glu Leu Leu Gly Leu Val Tyr Met Lys
275 280 285
Phe Val Ala Ser Asn Gln Arg Thr Ile Gln Pro Pro Arg Lys Ala Val
290 295 300
Glu Glu Pro Leu Asn Ala Phe Lys Glu Ser Lys Gly Met Met Asn Asp
305 310 315 320
Glu
<210> 58
<211> 303
<212> PRT
<213> 小鼠(Mouse)
<400> 58
Met Trp Pro Leu Ala Ala Ala Leu Leu Leu Gly Ser Cys Cys Cys Gly
1 5 10 15
Ser Ala Gln Leu Leu Phe Ser Asn Val Asn Ser Ile Glu Phe Thr Ser
20 25 30
Cys Asn Glu Thr Val Val Ile Pro Cys Ile Val Arg Asn Val Glu Ala
35 40 45
Gln Ser Thr Glu Glu Met Phe Val Lys Trp Lys Leu Asn Lys Ser Tyr
50 55 60
Ile Phe Ile Tyr Asp Gly Asn Lys Asn Ser Thr Thr Thr Asp Gln Asn
65 70 75 80
Phe Thr Ser Ala Lys Ile Ser Val Ser Asp Leu Ile Asn Gly Ile Ala
85 90 95
Ser Leu Lys Met Asp Lys Arg Asp Ala Met Val Gly Asn Tyr Thr Cys
100 105 110
Glu Val Thr Glu Leu Ser Arg Glu Gly Lys Thr Val Ile Glu Leu Lys
115 120 125
Asn Arg Thr Val Ser Trp Phe Ser Pro Asn Glu Lys Ile Leu Ile Val
130 135 140
Ile Phe Pro Ile Leu Ala Ile Leu Leu Phe Trp Gly Lys Phe Gly Ile
145 150 155 160
Leu Thr Leu Lys Tyr Lys Ser Ser His Thr Asn Lys Arg Ile Ile Leu
165 170 175
Leu Leu Val Ala Gly Leu Val Leu Thr Val Ile Val Val Val Gly Ala
180 185 190
Ile Leu Leu Ile Pro Gly Glu Lys Pro Val Lys Asn Ala Ser Gly Leu
195 200 205
Gly Leu Ile Val Ile Ser Thr Gly Ile Leu Ile Leu Leu Gln Tyr Asn
210 215 220
Val Phe Met Thr Ala Phe Gly Met Thr Ser Phe Thr Ile Ala Ile Leu
225 230 235 240
Ile Thr Gln Val Leu Gly Tyr Val Leu Ala Leu Val Gly Leu Cys Leu
245 250 255
Cys Ile Met Ala Cys Glu Pro Val His Gly Pro Leu Leu Ile Ser Gly
260 265 270
Leu Gly Ile Ile Ala Leu Ala Glu Leu Leu Gly Leu Val Tyr Met Lys
275 280 285
Phe Val Ala Ser Asn Gln Arg Thr Ile Gln Pro Pro Arg Asn Arg
290 295 300
<210> 59
<211> 5346
<212> DNA/RNA
<213> 人(human)
<400> 59
ggggagcagg cgggggagcg ggcgggaagc agtgggagcg cgcgtgcgcg cggccgtgca 60
gcctgggcag tgggtcctgc ctgtgacgcg cggcggcggt cggtcctgcc tgtaacggcg 120
gcggcggctg ctgctccaga cacctgcggc ggcggcggcg accccgcggc gggcgcggag 180
atgtggcccc tggtagcggc gctgttgctg ggctcggcgt gctgcggatc agctcagcta 240
ctatttaata aaacaaaatc tgtagaattc acgttttgta atgacactgt cgtcattcca 300
tgctttgtta ctaatatgga ggcacaaaac actactgaag tatacgtaaa gtggaaattt 360
aaaggaagag atatttacac ctttgatgga gctctaaaca agtccactgt ccccactgac 420
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ggggatctgt ggtgtatgta tggaaacaca tactccttaa tttacctgtt gttggaaact 4260
ggagaaatga ttgtcgggca accgtttatt ttttattgta ttttatttgg ttgagggatt 4320
tttttataaa cagttttact tgtgtcatat tttaaaatta ctaactgcca tcacctgctg 4380
gggtcctttg ttaggtcatt ttcagtgact aatagggata atccaggtaa ctttgaagag 4440
atgagcagtg agtgaccagg cagtttttct gcctttagct ttgacagttc ttaattaaga 4500
tcattgaaga ccagctttct cataaatttc tctttttgaa aaaaagaaag catttgtact 4560
aagctcctct gtaagacaac atcttaaatc ttaaaagtgt tgttatcatg actggtgaga 4620
gaagaaaaca ttttgttttt attaaatgga gcattattta caaaaagcca ttgttgagaa 4680
ttagatccca catcgtataa atatctatta accattctaa ataaagagaa ctccagtgtt 4740
gctatgtgca agatcctctc ttggagcttt tttgcatagc aattaaaggt gtgctatttg 4800
tcagtagcca tttttttgca gtgatttgaa gaccaaagtt gttttacagc tgtgttaccg 4860
ttaaaggttt ttttttttat atgtattaaa tcaatttatc actgtttaaa gctttgaata 4920
tctgcaatct ttgccaaggt acttttttat ttaaaaaaaa acataacttt gtaaatatta 4980
ccctgtaata ttatatatac ttaataaaac attttaagct a 5021
<210> 62
<211> 5078
<212> DNA/RNA
<213> 人(human)
<400> 62
agtgggagcg cgcgtgcgcg cggccgtgca gcctgggcag tgggtcctgc ctgtgacgcg 60
cggcggcggt cggtcctgcc tgtaacggcg gcggcggctg ctgctccgga cacctgcggc 120
ggcggcggcg accccgcggc gggcgcggag atgtggcccc tggtagcggc gctgttgctg 180
ggctcggcgt gctgcggatc agctcagcta ctatttaata aaacaaaatc tgtagaattc 240
acgttttgta atgacactgt cgtcattcca tgctttgtta ctaatatgga ggcacaaaac 300
actactgaag tatacgtaaa gtggaaattt aaaggaagag atatttacac ctttgatgga 360
gctctaaaca agtccactgt ccccactgac tttagtagtg caaaaattga agtctcacaa 420
ttactaaaag gagatgcctc tttgaagatg gataagagtg atgctgtctc acacacagga 480
aactacactt gtgaagtaac agaattaacc agagaaggtg aaacgatcat cgagctaaaa 540
tatcgtgttg tttcatggtt ttctccaaat gaaaatattc ttattgttat tttcccaatt 600
tttgctatac tcctgttctg gggacagttt ggtattaaaa cacttaaata tagatccggt 660
ggtatggatg agaaaacaat tgctttactt gttgctggac tagtgatcac tgtcattgtc 720
attgttggag ccattctttt cgtcccaggt gaatattcat taaagaatgc tactggcctt 780
ggtttaattg tgacttctac agggatatta atattacttc actactatgt gtttagtaca 840
gcgattggat taacctcctt cgtcattgcc atattggtta ttcaggtgat agcctatatc 900
ctcgctgtgg ttggactgag tctctgtatt gcggcgtgta taccaatgca tggccctctt 960
ctgatttcag gtttgagtat cttagctcta gcacaattac ttggactagt ttatatgaaa 1020
tttgtggctt ccaatcagaa gactatacaa cctcctagga aagctgtaga ggaacccctt 1080
aatgaataac tgaagtgaag tgatggactc cgatttggag agtagtaaga cgtgaaagga 1140
atacacttgt gtttaagcac catggccttg atgattcact gttggggaga agaaacaaga 1200
aaagtaactg gttgtcacct atgagaccct tacgtgattg ttagttaagt ttttattcaa 1260
agcagctgta atttagttaa taaaataatt atgatctatg ttgtttgccc aattgagatc 1320
cagttttttg ttgttatttt taatcaatta ggggcaatag tagaatggac aatttccaag 1380
aatgatgcct ttcaggtcct agggcctctg gcctctaggt aaccagttta aattggttca 1440
gggtgataac tacttagcac tgccctggtg attacccaga gatatctatg aaaaccagtg 1500
gcttccatca aacctttgcc aactcaggtt cacagcagct ttgggcagtt atggcagtat 1560
ggcattagct gagaggtgtc tgccacttct gggtcaatgg aataataaat taagtacagg 1620
caggaatttg gttgggagca tcttgtatga tctccgtatg atgtgatatt gatggagata 1680
gtggtcctca ttcttggggg ttgccattcc cacattcccc cttcaacaaa cagtgtaaca 1740
ggtccttccc agatttaggg tacttttatt gatggatatg ttttcctttt attcacataa 1800
ccccttgaaa ccctgtcttg tcctcctgtt acttgcttct gctgtacaag atgtagcacc 1860
ttttctcctc tttgaacatg gtctagtgac acggtagcac cagttgcagg aaggagccag 1920
acttgttctc agagcactgt gttcacactt ttcagcaaaa atagctatgg ttgtaacata 1980
tgtattccct tcctctgatt tgaaggcaaa aatctacagt gtttcttcac ttcttttctg 2040
atctggggca tgaaaaaagc aagattgaaa tttgaactat gagtctcctg catggcaaca 2100
aaatgtgtgt caccatcagg ccaacaggcc agcccttgaa tggggattta ttactgttgt 2160
atctatgttg catgataaac attcatcacc ttcctcctgt agtcctgcct cgtactcccc 2220
ttcccctatg attgaaaagt aaacaaaacc cacatttcct atcctggtta gaagaaaatt 2280
aatgttctga cagttgtgat cgcctggagt acttttagac ttttagcatt cgttttttac 2340
ctgtttgtgg atgtgtgttt gtatgtgcat acgtatgaga taggcacatg catcttctgt 2400
atggacaaag gtggggtacc tacaggagag caaaggttaa ttttgtgctt ttagtaaaaa 2460
catttaaata caaagttctt tattgggtgg aattatattt gatgcaaata tttgatcact 2520
taaaactttt aaaacttcta ggtaatttgc cacgcttttt gactgctcac caataccctg 2580
taaaaatacg taattcttcc tgtttgtgta ataagatatt catatttgta gttgcattaa 2640
taatagttat ttcttagtcc atcagatgtt cccgtgtgcc tcttttatgc caaattgatt 2700
gtcatatttc atgttgggac caagtagttt gcccatggca aacctaaatt tatgacctgc 2760
tgaggcctct cagaaaactg agcatactag caagacagct cttcttgaaa aaaaaaatat 2820
gtatacacaa atatatacgt atatctatat atacgtatgt atatacacac atgtatattc 2880
ttccttgatt gtgtagctgt ccaaaataat aacatatata gagggagctg tattccttta 2940
tacaaatctg atggctcctg cagcactttt tccttctgaa aatatttaca ttttgctaac 3000
ctagtttgtt actttaaaaa tcagttttga tgaaaggagg gaaaagcaga tggacttgaa 3060
aaagatccaa gctcctatta gaaaaggtat gaaaatcttt atagtaaaat tttttataaa 3120
ctaaagttgt accttttaat atgtagtaaa ctctcattta tttggggttc gctcttggat 3180
ctcatccatc cattgtgttc tctttaatgc tgcctgcctt ttgaggcatt cactgcccta 3240
gacaatgcca ccagagatag tgggggaaat gccagatgaa accaactctt gctctcacta 3300
gttgtcagct tctctggata agtgaccaca gaagcaggag tcctcctgct tgggcatcat 3360
tgggccagtt ccttctcttt aaatcagatt tgtaatggct cccaaattcc atcacatcac 3420
atttaaattg cagacagtgt tttgcacatc atgtatctgt tttgtcccat aatatgcttt 3480
ttactccctg atcccagttt ctgctgttga ctcttccatt cagttttatt tattgtgtgt 3540
tctcacagtg acaccatttg tccttttctg caacaacctt tccagctact tttgccaaat 3600
tctatttgtc ttctccttca aaacattctc ctttgcagtt cctcttcatc tgtgtagctg 3660
ctcttttgtc tcttaactta ccattcctat agtactttat gcatctctgc ttagttctat 3720
tagttttttg gccttgctct tctccttgat tttaaaattc cttctatagc tagagctttt 3780
ctttctttca ttctctcttc ctgcagtgtt ttgcatacat cagaagctag gtacataagt 3840
taaatgattg agagttggct gtatttagat ttatcacttt ttaatagggt gagcttgaga 3900
gttttctttc tttctgtttt ttttttttgt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3960
tgactaattt cacatgctct aaaaaccttc aaaggtgatt atttttctcc tggaaactcc 4020
aggtccattc tgtttaaatc cctaagaatg tcagaattaa aataacaggg ctatcccgta 4080
attggaaata tttctttttt caggatgcta tagtcaattt agtaagtgac caccaaattg 4140
ttatttgcac taacaaagct caaaacacga taagtttact cctccatctc agtaataaaa 4200
attaagctgt aatcaacctt ctaggtttct cttgtcttaa aatgggtatt caaaaatggg 4260
gatctgtggt gtatgtatgg aaacacatac tccttaattt acctgttgtt ggaaactgga 4320
gaaatgattg tcgggcaacc gtttattttt tattgtattt tatttggttg agggattttt 4380
ttataaacag ttttacttgt gtcatatttt aaaattacta actgccatca cctgctgggg 4440
tcctttgtta ggtcattttc agtgactaat agggataatc caggtaactt tgaagagatg 4500
agcagtgagt gaccaggcag tttttctgcc tttagctttg acagttctta attaagatca 4560
ttgaagacca gctttctcat aaatttctct ttttgaaaaa aagaaagcat ttgtactaag 4620
ctcctctgta agacaacatc ttaaatctta aaagtgttgt tatcatgact ggtgagagaa 4680
gaaaacattt tgtttttatt aaatggagca ttatttacaa aaagccattg ttgagaatta 4740
gatcccacat cgtataaata tctattaacc attctaaata aagagaactc cagtgttgct 4800
atgtgcaaga tcctctcttg gagctttttt gcatagcaat taaaggtgtg ctatttgtca 4860
gtagccattt ttttgcagtg atttgaagac caaagttgtt ttacagctgt gttaccgtta 4920
aaggtttttt tttttatatg tattaaatca atttatcact gtttaaagct ttgaatatct 4980
gcaatctttg ccaaggtact tttttattta aaaaaaaaca taactttgta aatattaccc 5040
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<210> 63
<211> 323
<212> PRT
<213> 人(human)
<400> 63
Met Trp Pro Leu Val Ala Ala Leu Leu Leu Gly Ser Ala Cys Cys Gly
1 5 10 15
Ser Ala Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe
20 25 30
Cys Asn Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu Ala
35 40 45
Gln Asn Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp
50 55 60
Ile Tyr Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Val Pro Thr Asp
65 70 75 80
Phe Ser Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp Ala
85 90 95
Ser Leu Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn Tyr
100 105 110
Thr Cys Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu
115 120 125
Leu Lys Tyr Arg Val Val Ser Trp Phe Ser Pro Asn Glu Asn Ile Leu
130 135 140
Ile Val Ile Phe Pro Ile Phe Ala Ile Leu Leu Phe Trp Gly Gln Phe
145 150 155 160
Gly Ile Lys Thr Leu Lys Tyr Arg Ser Gly Gly Met Asp Glu Lys Thr
165 170 175
Ile Ala Leu Leu Val Ala Gly Leu Val Ile Thr Val Ile Val Ile Val
180 185 190
Gly Ala Ile Leu Phe Val Pro Gly Glu Tyr Ser Leu Lys Asn Ala Thr
195 200 205
Gly Leu Gly Leu Ile Val Thr Ser Thr Gly Ile Leu Ile Leu Leu His
210 215 220
Tyr Tyr Val Phe Ser Thr Ala Ile Gly Leu Thr Ser Phe Val Ile Ala
225 230 235 240
Ile Leu Val Ile Gln Val Ile Ala Tyr Ile Leu Ala Val Val Gly Leu
245 250 255
Ser Leu Cys Ile Ala Ala Cys Ile Pro Met His Gly Pro Leu Leu Ile
260 265 270
Ser Gly Leu Ser Ile Leu Ala Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Val Tyr
275 280 285
Met Lys Phe Val Ala Ser Asn Gln Lys Thr Ile Gln Pro Pro Arg Lys
290 295 300
Ala Val Glu Glu Pro Leu Asn Ala Phe Lys Glu Ser Lys Gly Met Met
305 310 315 320
Asn Asp Glu
<210> 64
<211> 305
<212> PRT
<213> 人(human)
<400> 64
Met Trp Pro Leu Val Ala Ala Leu Leu Leu Gly Ser Ala Cys Cys Gly
1 5 10 15
Ser Ala Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe
20 25 30
Cys Asn Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu Ala
35 40 45
Gln Asn Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp
50 55 60
Ile Tyr Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Val Pro Thr Asp
65 70 75 80
Phe Ser Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp Ala
85 90 95
Ser Leu Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn Tyr
100 105 110
Thr Cys Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu
115 120 125
Leu Lys Tyr Arg Val Val Ser Trp Phe Ser Pro Asn Glu Asn Ile Leu
130 135 140
Ile Val Ile Phe Pro Ile Phe Ala Ile Leu Leu Phe Trp Gly Gln Phe
145 150 155 160
Gly Ile Lys Thr Leu Lys Tyr Arg Ser Gly Gly Met Asp Glu Lys Thr
165 170 175
Ile Ala Leu Leu Val Ala Gly Leu Val Ile Thr Val Ile Val Ile Val
180 185 190
Gly Ala Ile Leu Phe Val Pro Gly Glu Tyr Ser Leu Lys Asn Ala Thr
195 200 205
Gly Leu Gly Leu Ile Val Thr Ser Thr Gly Ile Leu Ile Leu Leu His
210 215 220
Tyr Tyr Val Phe Ser Thr Ala Ile Gly Leu Thr Ser Phe Val Ile Ala
225 230 235 240
Ile Leu Val Ile Gln Val Ile Ala Tyr Ile Leu Ala Val Val Gly Leu
245 250 255
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260 265 270
Ser Gly Leu Ser Ile Leu Ala Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Val Tyr
275 280 285
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290 295 300
Asn
305
<210> 65
<211> 293
<212> PRT
<213> 人(human)
<400> 65
Met Trp Pro Leu Val Ala Ala Leu Leu Leu Gly Ser Ala Cys Cys Gly
1 5 10 15
Ser Ala Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe
20 25 30
Cys Asn Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu Ala
35 40 45
Gln Asn Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp
50 55 60
Ile Tyr Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Val Pro Thr Asp
65 70 75 80
Phe Ser Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp Ala
85 90 95
Ser Leu Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn Tyr
100 105 110
Thr Cys Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu
115 120 125
Leu Lys Tyr Arg Val Val Ser Trp Phe Ser Pro Asn Glu Asn Ile Leu
130 135 140
Ile Val Ile Phe Pro Ile Phe Ala Ile Leu Leu Phe Trp Gly Gln Phe
145 150 155 160
Gly Ile Lys Thr Leu Lys Tyr Arg Ser Gly Gly Met Asp Glu Lys Thr
165 170 175
Ile Ala Leu Leu Val Ala Gly Leu Val Ile Thr Val Ile Val Ile Val
180 185 190
Gly Ala Ile Leu Phe Val Pro Gly Glu Tyr Ser Leu Lys Asn Ala Thr
195 200 205
Gly Leu Gly Leu Ile Val Thr Ser Thr Gly Ile Leu Ile Leu Leu His
210 215 220
Tyr Tyr Val Phe Ser Thr Ala Ile Gly Leu Thr Ser Phe Val Ile Ala
225 230 235 240
Ile Leu Val Ile Gln Val Ile Ala Tyr Ile Leu Ala Val Val Gly Leu
245 250 255
Ser Leu Cys Ile Ala Ala Cys Ile Pro Met His Gly Pro Leu Leu Ile
260 265 270
Ser Gly Leu Ser Ile Leu Ala Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Val Tyr
275 280 285
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<211> 312
<212> PRT
<213> 人(human)
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1 5 10 15
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115 120 125
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130 135 140
Ile Val Ile Phe Pro Ile Phe Ala Ile Leu Leu Phe Trp Gly Gln Phe
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165 170 175
Ile Ala Leu Leu Val Ala Gly Leu Val Ile Thr Val Ile Val Ile Val
180 185 190
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195 200 205
Gly Leu Gly Leu Ile Val Thr Ser Thr Gly Ile Leu Ile Leu Leu His
210 215 220
Tyr Tyr Val Phe Ser Thr Ala Ile Gly Leu Thr Ser Phe Val Ile Ala
225 230 235 240
Ile Leu Val Ile Gln Val Ile Ala Tyr Ile Leu Ala Val Val Gly Leu
245 250 255
Ser Leu Cys Ile Ala Ala Cys Ile Pro Met His Gly Pro Leu Leu Ile
260 265 270
Ser Gly Leu Ser Ile Leu Ala Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Val Tyr
275 280 285
Met Lys Phe Val Ala Ser Asn Gln Lys Thr Ile Gln Pro Pro Arg Lys
290 295 300
Ala Val Glu Glu Pro Leu Asn Glu
305 310
<210> 67
<211> 1934
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
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cggcggcgcg gagatgtggc ccttggcggc ggcgctgttg ctgggctcct gctgctgcgg 180
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aaagtggaaa tttaaaggaa gagatatcta cacctttgat ggagctctaa acaagtccac 360
tgtccccact gactttagta gtgcaaaaat tgaagtctca caattactaa aaggagatgc 420
ctctttgaag atggataaga gtgatgctgt ctcacacaca ggaaactaca cttgtgaagt 480
aacagaatta accagagaag gtgaaacgat catagagctg aaaaaccgca cggccttcaa 540
cactgaccaa ggatcagcct gttcttacga ggaggagaaa ggaggttgca aattagtttc 600
gtggttttct ccaaatgaaa agatcctcat tgttattttc ccaattttgg ctatactcct 660
gttctgggga aagtttggta ttttaacact caaatataaa tccagccata cgaataagag 720
aatcattctg ctgctcgttg ccgggctggt gctcacagtc atcgtggttg ttggagccat 780
ccttctcatc ccaggagaaa agcccgtgaa gaatgcttct ggacttggcc tcattgtaat 840
ctctacgggg atattaatac tacttcagta caatgtgttt atgacagctt ttggaatgac 900
ctctttcacc attgccatat tgatcactca agtgctgggc tacgtccttg ctttggtcgg 960
gctgtgtctc tgcatcatgg catgtgagcc agtgcacggc ccccttttga tttcaggttt 1020
ggggatcata gctctagcag aactacttgg attagtttat atgaagtttg tcgcttccaa 1080
ccagaggact atccaacctc ctaggaatag gtgaagggaa gtgacggact gtaacttgga 1140
agtcagaaat ggaagaatac agttgtctaa gcaccaggtc ttcacgactc acagctggaa 1200
ggaacagaca acagtaactg acttccatcc aggaaaacat gtcacataaa tgattactaa 1260
gtttatattc aaagcagctg tactttacat aataaaaaaa atatgatgtg ctgtgtaacc 1320
aattggaatc ccatttttct attgtttcta ctcaactagg ggcaaacgtt tcaggggcaa 1380
cttccaagaa tgatgcttgt tagatcctag agtctctgaa cactgagttt aaattgattc 1440
cgagtgagac tcgccaagca ctaacctgag ggttagttac ccagagatac ctatgaaaaa 1500
cagtggtatc cagcaagcct tagtaaactc aggttgccag cagctttgcc acttccgctg 1560
ctagctgaat aacaagactg ccacttctgg gtcatagtga tagagactga agtagaaaaa 1620
cgaatgtggt tgggcaaatc ccgtgtggcc cctctgtgtg ctatgatatt gatggcactg 1680
gtgtcttcat tcttgggggt tgccatcatt cacacacacc cctttgacat acagtgcacc 1740
ccagttttga atacattttt tttgcaccct gtcccgttct gctactttga tttgcgttat 1800
gatatatata tatatatata ataccttttc tcctctttaa acatggtcct gtgacacaat 1860
agtcagttgc agaaaggagc cagacttatt cgcaaagcac tgtgctcaaa ctcttcagaa 1920
aaaaaaaaaa aaaa 1934
<210> 68
<211> 3107
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
tggtgaaagc agaagcagcg cctacaccgg gagagcaggg aggaggagtt ggactgaggt 60
tgggcggctc cgaggtccag ggcgagcttg gccagaggga gtagagagca gcggggctgc 120
gcagggacgc gtgccgtgag ttccggtgag cgtgtgtgtc ccatgctccc gtctttcagg 180
ccggcccagg acacgaagcc ggaagagagc tggctggagg gacgggggcc gtgagcagag 240
agtgcaaccc gcgcagcccc ggggacaggc tgattcttgg cgctctccgc cggagcctgc 300
ccagggctgg gtgtgaggct ggcgtcacgt caacgagcag aggcggccag gcggggcgga 360
gtgcgcgtgc gcggggcggc gagcacgcgc gcgcgcgcac ccccgggcag cctgggcggc 420
cgctcctgcc tgtcactgct gcggcgctgc tggtcggtcg tttcccttga aggcagcagc 480
ggaggcggcg gctgctccag acacctgcgg cggcgacccc ccggcggcgc ggagatgtgg 540
cccttggcgg cggcgctgtt gctgggctcc tgctgctgcg gttcagctca actactgttt 600
aataaaacaa aatctgtaga attcacgttt tgtaatgaca ctgtcgtcat tccatgcttt 660
gttactaata tggaggcaca aaacactact gaagtatacg taaagtggaa atttaaagga 720
agagatatct acacctttga tggagctcta aacaagtcca ctgtccccac tgactttagt 780
agtgcaaaaa ttgaagtctc acaattacta aaaggagatg cctctttgaa gatggataag 840
agtgatgctg tctcacacac aggaaactac acttgtgaag taacagaatt aaccagagaa 900
ggtgaaacga tcatagagct gaaaaaccgc acggccttca acactgacca aggatcagcc 960
tgttcttacg aggaggagaa aggaggttgc aaattagttt cgtggttttc tccaaatgaa 1020
aagatcctca ttgttatttt cccaattttg gctatactcc tgttctgggg aaagtttggt 1080
attttaacac tcaaatataa atccagccat acgaataaga gaatcattct gctgctcgtt 1140
gccgggctgg tgctcacagt catcgtggtt gttggagcca tccttctcat cccaggagaa 1200
aagcccgtga agaatgcttc tggacttggc ctcattgtaa tctctacggg gatattaata 1260
ctacttcagt acaatgtgtt tatgacagct tttggaatga cctctttcac cattgccata 1320
ttgatcactc aagtgctggg ctacgtcctt gctttggtcg ggctgtgtct ctgcatcatg 1380
gcatgtgagc cagtgcacgg cccccttttg atttcaggtt tggggatcat agctctagca 1440
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tgagaggcaa gaaggaaagc ttccaaccag aggactatcc aacctcctag gaataggtga 1560
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tggtgaaagc agaagcagcg cctacaccgg gagagcaggg aggaggagtt ggactgaggt 60
tgggcggctc cgaggtccag ggcgagcttg gccagaggga gtagagagca gcggggctgc 120
gcagggacgc gtgccgtgag ttccggtgag cgtgtgtgtc ccatgctccc gtctttcagg 180
ccggcccagg acacgaagcc ggaagagagc tggctggagg gacgggggcc gtgagcagag 240
agtgcaaccc gcgcagcccc ggggacaggc tgattcttgg cgctctccgc cggagcctgc 300
ccagggctgg gtgtgaggct ggcgtcacgt caacgagcag aggcggccag gcggggcgga 360
gtgcgcgtgc gcggggcggc gagcacgcgc gcgcgcgcac ccccgggcag cctgggcggc 420
cgctcctgcc tgtcactgct gcggcgctgc tggtcggtcg tttcccttga aggcagcagc 480
ggaggcggcg gctgctccag acacctgcgg cggcgacccc ccggcggcgc ggagatgtgg 540
cccttggcgg cggcgctgtt gctgggctcc tgctgctgcg gttcagctca actactgttt 600
aataaaacaa aatctgtaga attcacgttt tgtaatgaca ctgtcgtcat tccatgcttt 660
gttactaata tggaggcaca aaacactact gaagtatacg taaagtggaa atttaaagga 720
agagatatct acacctttga tggagctcta aacaagtcca ctgtccccac tgactttagt 780
agtgcaaaaa ttgaagtctc acaattacta aaaggagatg cctctttgaa gatggataag 840
agtgatgctg tctcacacac aggaaactac acttgtgaag taacagaatt aaccagagaa 900
ggtgaaacga tcatagagct gaaaaaccgc acggtttcgt ggttttctcc aaatgaaaag 960
atcctcattg ttattttccc aattttggct atactcctgt tctggggaaa gtttggtatt 1020
ttaacactca aatataaatc cagccatacg aataagagaa tcattctgct gctcgttgcc 1080
gggctggtgc tcacagtcat cgtggttgtt ggagccatcc ttctcatccc aggagaaaag 1140
cccgtgaaga atgcttctgg acttggcctc attgtaatct ctacggggat attaatacta 1200
cttcagtaca atgtgtttat gacagctttt ggaatgacct ctttcaccat tgccatattg 1260
atcactcaag tgctgggcta cgtccttgct ttggtcgggc tgtgtctctg catcatggca 1320
tgtgagccag tgcacggccc ccttttgatt tcaggtttgg ggatcatagc tctagcagaa 1380
ctacttggat tagtttatat gaagtttgtc gcttccaacc agaggactat ccaacctcct 1440
aggaataggt gaagggaagt gacggactgt aacttggaag tcagaaatgg aagaatacag 1500
ttgtctaagc accaggtctt cacgactcac agctggaagg aacagacaac agtaactgac 1560
ttccatccag gaaaacatgt cacataaatg attactaagt ttatattcaa agcagctgta 1620
ctttacataa taaaaaaaat atgatgtgct gtgtaaccaa ttggaatccc atttttctat 1680
tgtttctact caactagggg caaacgtttc aggggcaact tccaagaatg atgcttgtta 1740
gatcctagag tctctgaaca ctgagtttaa attgattccg agtgagactc gccaagcact 1800
aacctgaggg ttagttaccc agagatacct atgaaaaaca gtggtatcca gcaagcctta 1860
gtaaactcag gttgccagca gctttgccac ttccgctgct agctgaataa caagactgcc 1920
acttctgggt catagtgata gagactgaag tagaaaaacg aatgtggttg ggcaaatccc 1980
gtgtggcccc tctgtgtgct atgatattga tggcactggt gtcttcattc ttgggggttg 2040
ccatcattca cacacacccc tttgacatac agtgcacccc agttttgaat acattttttt 2100
tgcaccctgt cccgttctgc tactttgatt tgcgttatga tatatatata tatatataat 2160
accttttctc ctctttaaac atggtcctgt gacacaatag tcagttgcag aaaggagcca 2220
gacttattcg caaagcactg tgctcaaact cttcagaaaa aaaggaaaaa aaaaaaaagc 2280
tatagttgta acatatgtat tccagacctc tggtttaaag gcaaaagaaa aaaaatctac 2340
agtgtttctt ctcatgtttt ctgatcggag gcatgacaaa gcaagactga aatctgaact 2400
gtgtctcctg catggcaaca cgtgtctccg tcaggccctc gcaaggcccg gggagggggt 2460
tctacgcctc ttgtctcttt gttgcatgct gaacactcat cgccttccta ctgtatcctg 2520
cctcctgcag cctccctctt cctcctcctc ttcctcttcc tcctcttcct cctcctcctc 2580
ctcttcctcc aagtttgaaa ggtcaaacaa aactaccaca ttccctaccc agttagaaga 2640
aaaccaccgt cctgacagtt gtgatcgcat ggagtacttt tagattatta gcacctgttt 2700
ttacctcgtt tgtgggcgtg tttgtatgtg cacatgtatg aagtcggcac atgcaccttc 2760
tgtatgggca gaggcgtggc atctacagaa gagcagatgc caactttgtg cttttagtga 2820
atacattaaa aaaaaaaaac caacggtcct tattgagtgg aattctattt gatgcaaata 2880
tttgagctct ttaagacttt aaaactagat aatgtgccaa gcttttagga ctgctcacca 2940
gtgccctctg aagaaacacc agtacttttt cctgtttgtg taataaaggc atatttgta 2999
<210> 74
<211> 326
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 74
Met Trp Pro Leu Ala Ala Ala Leu Leu Leu Gly Ser Cys Cys Cys Gly
1 5 10 15
Ser Ala Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe
20 25 30
Cys Asn Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu Ala
35 40 45
Gln Asn Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp
50 55 60
Ile Tyr Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Val Pro Thr Asp
65 70 75 80
Phe Ser Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp Ala
85 90 95
Ser Leu Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn Tyr
100 105 110
Thr Cys Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu
115 120 125
Leu Lys Asn Arg Thr Ala Phe Asn Thr Asp Gln Gly Ser Ala Cys Ser
130 135 140
Tyr Glu Glu Glu Lys Gly Gly Cys Lys Leu Val Ser Trp Phe Ser Pro
145 150 155 160
Asn Glu Lys Ile Leu Ile Val Ile Phe Pro Ile Leu Ala Ile Leu Leu
165 170 175
Phe Trp Gly Lys Phe Gly Ile Leu Thr Leu Lys Tyr Lys Ser Ser His
180 185 190
Thr Asn Lys Arg Ile Ile Leu Leu Leu Val Ala Gly Leu Val Leu Thr
195 200 205
Val Ile Val Val Val Gly Ala Ile Leu Leu Ile Pro Gly Glu Lys Pro
210 215 220
Val Lys Asn Ala Ser Gly Leu Gly Leu Ile Val Ile Ser Thr Gly Ile
225 230 235 240
Leu Ile Leu Leu Gln Tyr Asn Val Phe Met Thr Ala Phe Gly Met Thr
245 250 255
Ser Phe Thr Ile Ala Ile Leu Ile Thr Gln Val Leu Gly Tyr Val Leu
260 265 270
Ala Leu Val Gly Leu Cys Leu Cys Ile Met Ala Cys Glu Pro Val His
275 280 285
Gly Pro Leu Leu Ile Ser Gly Leu Gly Ile Ile Ala Leu Ala Glu Leu
290 295 300
Leu Gly Leu Val Tyr Met Lys Phe Val Ala Ser Asn Gln Arg Thr Ile
305 310 315 320
Gln Pro Pro Arg Asn Arg
325
<210> 75
<211> 322
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 75
Met Trp Pro Leu Ala Ala Ala Leu Leu Leu Gly Ser Cys Cys Cys Gly
1 5 10 15
Ser Ala Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe
20 25 30
Cys Asn Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu Ala
35 40 45
Gln Asn Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp
50 55 60
Ile Tyr Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Val Pro Thr Asp
65 70 75 80
Phe Ser Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp Ala
85 90 95
Ser Leu Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn Tyr
100 105 110
Thr Cys Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu
115 120 125
Leu Lys Asn Arg Thr Ala Phe Asn Thr Asp Gln Gly Ser Ala Cys Ser
130 135 140
Tyr Glu Glu Glu Lys Gly Gly Cys Lys Leu Val Ser Trp Phe Ser Pro
145 150 155 160
Asn Glu Lys Ile Leu Ile Val Ile Phe Pro Ile Leu Ala Ile Leu Leu
165 170 175
Phe Trp Gly Lys Phe Gly Ile Leu Thr Leu Lys Tyr Lys Ser Ser His
180 185 190
Thr Asn Lys Arg Ile Ile Leu Leu Leu Val Ala Gly Leu Val Leu Thr
195 200 205
Val Ile Val Val Val Gly Ala Ile Leu Leu Ile Pro Gly Glu Lys Pro
210 215 220
Val Lys Asn Ala Ser Gly Leu Gly Leu Ile Val Ile Ser Thr Gly Ile
225 230 235 240
Leu Ile Leu Leu Gln Tyr Asn Val Phe Met Thr Ala Phe Gly Met Thr
245 250 255
Ser Phe Thr Ile Ala Ile Leu Ile Thr Gln Val Leu Gly Tyr Val Leu
260 265 270
Ala Leu Val Gly Leu Cys Leu Cys Ile Met Ala Cys Glu Pro Val His
275 280 285
Gly Pro Leu Leu Ile Ser Gly Leu Gly Ile Ile Ala Leu Ala Glu Leu
290 295 300
Leu Gly Leu Val Tyr Met Lys Phe Val Glu Trp Arg Glu Thr Pro Ser
305 310 315 320
Val Ser
<210> 76
<211> 344
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 76
Met Trp Pro Leu Ala Ala Ala Leu Leu Leu Gly Ser Cys Cys Cys Gly
1 5 10 15
Ser Ala Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe
20 25 30
Cys Asn Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu Ala
35 40 45
Gln Asn Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp
50 55 60
Ile Tyr Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Val Pro Thr Asp
65 70 75 80
Phe Ser Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp Ala
85 90 95
Ser Leu Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn Tyr
100 105 110
Thr Cys Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu
115 120 125
Leu Lys Asn Arg Thr Ala Phe Asn Thr Asp Gln Gly Ser Ala Cys Ser
130 135 140
Tyr Glu Glu Glu Lys Gly Gly Cys Lys Leu Val Ser Trp Phe Ser Pro
145 150 155 160
Asn Glu Lys Ile Leu Ile Val Ile Phe Pro Ile Leu Ala Ile Leu Leu
165 170 175
Phe Trp Gly Lys Phe Gly Ile Leu Thr Leu Lys Tyr Lys Ser Ser His
180 185 190
Thr Asn Lys Arg Ile Ile Leu Leu Leu Val Ala Gly Leu Val Leu Thr
195 200 205
Val Ile Val Val Val Gly Ala Ile Leu Leu Ile Pro Gly Glu Lys Pro
210 215 220
Val Lys Asn Ala Ser Gly Leu Gly Leu Ile Val Ile Ser Thr Gly Ile
225 230 235 240
Leu Ile Leu Leu Gln Tyr Asn Val Phe Met Thr Ala Phe Gly Met Thr
245 250 255
Ser Phe Thr Ile Ala Ile Leu Ile Thr Gln Val Leu Gly Tyr Val Leu
260 265 270
Ala Leu Val Gly Leu Cys Leu Cys Ile Met Ala Cys Glu Pro Val His
275 280 285
Gly Pro Leu Leu Ile Ser Gly Leu Gly Ile Ile Ala Leu Ala Glu Leu
290 295 300
Leu Gly Leu Val Tyr Met Lys Phe Val Ala Ser Asn Gln Arg Thr Ile
305 310 315 320
Gln Pro Pro Arg Lys Ala Val Glu Glu Pro Leu Asn Ala Phe Lys Glu
325 330 335
Ser Lys Gly Met Met Asn Asp Glu
340
<210> 77
<211> 333
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 77
Met Trp Pro Leu Ala Ala Ala Leu Leu Leu Gly Ser Cys Cys Cys Gly
1 5 10 15
Ser Ala Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe
20 25 30
Cys Asn Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu Ala
35 40 45
Gln Asn Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp
50 55 60
Ile Tyr Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Val Pro Thr Asp
65 70 75 80
Phe Ser Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp Ala
85 90 95
Ser Leu Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn Tyr
100 105 110
Thr Cys Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu
115 120 125
Leu Lys Asn Arg Thr Ala Phe Asn Thr Asp Gln Gly Ser Ala Cys Ser
130 135 140
Tyr Glu Glu Glu Lys Gly Gly Cys Lys Leu Val Ser Trp Phe Ser Pro
145 150 155 160
Asn Glu Lys Ile Leu Ile Val Ile Phe Pro Ile Leu Ala Ile Leu Leu
165 170 175
Phe Trp Gly Lys Phe Gly Ile Leu Thr Leu Lys Tyr Lys Ser Ser His
180 185 190
Thr Asn Lys Arg Ile Ile Leu Leu Leu Val Ala Gly Leu Val Leu Thr
195 200 205
Val Ile Val Val Val Gly Ala Ile Leu Leu Ile Pro Gly Glu Lys Pro
210 215 220
Val Lys Asn Ala Ser Gly Leu Gly Leu Ile Val Ile Ser Thr Gly Ile
225 230 235 240
Leu Ile Leu Leu Gln Tyr Asn Val Phe Met Thr Ala Phe Gly Met Thr
245 250 255
Ser Phe Thr Ile Ala Ile Leu Ile Thr Gln Val Leu Gly Tyr Val Leu
260 265 270
Ala Leu Val Gly Leu Cys Leu Cys Ile Met Ala Cys Glu Pro Val His
275 280 285
Gly Pro Leu Leu Ile Ser Gly Leu Gly Ile Ile Ala Leu Ala Glu Leu
290 295 300
Leu Gly Leu Val Tyr Met Lys Phe Val Ala Ser Asn Gln Arg Thr Ile
305 310 315 320
Gln Pro Pro Arg Lys Ala Val Glu Glu Pro Leu Asn Glu
325 330
<210> 78
<211> 314
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 78
Met Trp Pro Leu Ala Ala Ala Leu Leu Leu Gly Ser Cys Cys Cys Gly
1 5 10 15
Ser Ala Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe
20 25 30
Cys Asn Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu Ala
35 40 45
Gln Asn Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp
50 55 60
Ile Tyr Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Val Pro Thr Asp
65 70 75 80
Phe Ser Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp Ala
85 90 95
Ser Leu Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn Tyr
100 105 110
Thr Cys Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu
115 120 125
Leu Lys Asn Arg Thr Ala Phe Asn Thr Asp Gln Gly Ser Ala Cys Ser
130 135 140
Tyr Glu Glu Glu Lys Gly Gly Cys Lys Leu Val Ser Trp Phe Ser Pro
145 150 155 160
Asn Glu Lys Ile Leu Ile Val Ile Phe Pro Ile Leu Ala Ile Leu Leu
165 170 175
Phe Trp Gly Lys Phe Gly Ile Leu Thr Leu Lys Tyr Lys Ser Ser His
180 185 190
Thr Asn Lys Arg Ile Ile Leu Leu Leu Val Ala Gly Leu Val Leu Thr
195 200 205
Val Ile Val Val Val Gly Ala Ile Leu Leu Ile Pro Gly Glu Lys Pro
210 215 220
Val Lys Asn Ala Ser Gly Leu Gly Leu Ile Val Ile Ser Thr Gly Ile
225 230 235 240
Leu Ile Leu Leu Gln Tyr Asn Val Phe Met Thr Ala Phe Gly Met Thr
245 250 255
Ser Phe Thr Ile Ala Ile Leu Ile Thr Gln Val Leu Gly Tyr Val Leu
260 265 270
Ala Leu Val Gly Leu Cys Leu Cys Ile Met Ala Cys Glu Pro Val His
275 280 285
Gly Pro Leu Leu Ile Ser Gly Leu Gly Ile Ile Ala Leu Ala Glu Leu
290 295 300
Leu Gly Leu Val Tyr Met Lys Phe Val Glu
305 310
<210> 79
<211> 323
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 79
Met Trp Pro Leu Ala Ala Ala Leu Leu Leu Gly Ser Cys Cys Cys Gly
1 5 10 15
Ser Ala Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe
20 25 30
Cys Asn Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu Ala
35 40 45
Gln Asn Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp
50 55 60
Ile Tyr Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Val Pro Thr Asp
65 70 75 80
Phe Ser Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp Ala
85 90 95
Ser Leu Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn Tyr
100 105 110
Thr Cys Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu
115 120 125
Leu Lys Asn Arg Thr Val Ser Trp Phe Ser Pro Asn Glu Lys Ile Leu
130 135 140
Ile Val Ile Phe Pro Ile Leu Ala Ile Leu Leu Phe Trp Gly Lys Phe
145 150 155 160
Gly Ile Leu Thr Leu Lys Tyr Lys Ser Ser His Thr Asn Lys Arg Ile
165 170 175
Ile Leu Leu Leu Val Ala Gly Leu Val Leu Thr Val Ile Val Val Val
180 185 190
Gly Ala Ile Leu Leu Ile Pro Gly Glu Lys Pro Val Lys Asn Ala Ser
195 200 205
Gly Leu Gly Leu Ile Val Ile Ser Thr Gly Ile Leu Ile Leu Leu Gln
210 215 220
Tyr Asn Val Phe Met Thr Ala Phe Gly Met Thr Ser Phe Thr Ile Ala
225 230 235 240
Ile Leu Ile Thr Gln Val Leu Gly Tyr Val Leu Ala Leu Val Gly Leu
245 250 255
Cys Leu Cys Ile Met Ala Cys Glu Pro Val His Gly Pro Leu Leu Ile
260 265 270
Ser Gly Leu Gly Ile Ile Ala Leu Ala Glu Leu Leu Gly Leu Val Tyr
275 280 285
Met Lys Phe Val Ala Ser Asn Gln Arg Thr Ile Gln Pro Pro Arg Lys
290 295 300
Ala Val Glu Glu Pro Leu Asn Ala Phe Lys Glu Ser Lys Gly Met Met
305 310 315 320
Asn Asp Glu
<210> 80
<211> 305
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 80
Met Trp Pro Leu Ala Ala Ala Leu Leu Leu Gly Ser Cys Cys Cys Gly
1 5 10 15
Ser Ala Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe
20 25 30
Cys Asn Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu Ala
35 40 45
Gln Asn Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp
50 55 60
Ile Tyr Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Val Pro Thr Asp
65 70 75 80
Phe Ser Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp Ala
85 90 95
Ser Leu Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn Tyr
100 105 110
Thr Cys Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu
115 120 125
Leu Lys Asn Arg Thr Val Ser Trp Phe Ser Pro Asn Glu Lys Ile Leu
130 135 140
Ile Val Ile Phe Pro Ile Leu Ala Ile Leu Leu Phe Trp Gly Lys Phe
145 150 155 160
Gly Ile Leu Thr Leu Lys Tyr Lys Ser Ser His Thr Asn Lys Arg Ile
165 170 175
Ile Leu Leu Leu Val Ala Gly Leu Val Leu Thr Val Ile Val Val Val
180 185 190
Gly Ala Ile Leu Leu Ile Pro Gly Glu Lys Pro Val Lys Asn Ala Ser
195 200 205
Gly Leu Gly Leu Ile Val Ile Ser Thr Gly Ile Leu Ile Leu Leu Gln
210 215 220
Tyr Asn Val Phe Met Thr Ala Phe Gly Met Thr Ser Phe Thr Ile Ala
225 230 235 240
Ile Leu Ile Thr Gln Val Leu Gly Tyr Val Leu Ala Leu Val Gly Leu
245 250 255
Cys Leu Cys Ile Met Ala Cys Glu Pro Val His Gly Pro Leu Leu Ile
260 265 270
Ser Gly Leu Gly Ile Ile Ala Leu Ala Glu Leu Leu Gly Leu Val Tyr
275 280 285
Met Lys Phe Val Ala Ser Asn Gln Arg Thr Ile Gln Pro Pro Arg Asn
290 295 300
Arg
305
<210> 81
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 81
acaaacattt cttcggtgct ttgcg 25
<210> 82
<211> 26
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 82
gtcttgagtt acaggctcat gtgggg 26
<210> 83
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 83
cgaggaacgt attctcctgc gaaac 25
<210> 84
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 84
agctatgtgg cttagcactc tgtgc 25
<210> 85
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 85
cttaaactcc acgtcatcgg ggctc 25
<210> 86
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 86
ttgctgctgg ggattcgac 19
<210> 87
<211> 22
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 87
ctgctggggt gacattactg at 22
<210> 88
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 88
cctgacaagt ccgtgttgg 19
<210> 89
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 89
ctcctctgaa ccactggatg g 21

Claims (28)

1.一种人源化动物模型构建的方法，其特征在于，所述方法包括导入人CD47基因第2号外显子的部分序列、使得该人CD47基因在动物细胞中表达并且促进该细胞产生人或人源化CD47蛋白，同时降低或消除了动物体内内源的Cd47基因的表达，所述的人CD47基因第2号外显子的部分序列如SEQ ID NO：27所示。
2.根据权利要求1所述的人源化动物模型构建的方法，其特征在于，所述人源化动物模型的基因组中包括人源化CD47基因，所述人源化CD47基因编码人源化CD47蛋白的胞外区、跨膜结构域和胞内区，其中所述跨膜结构域和胞内区为动物来源，所述胞外区的部分由SEQID NO：27所示核苷酸序列编码，同时该动物来源部分和人源部分通过序列拼接连接于动物模型内源的Cd47启动子后。
3. 根据权利要求2所述的人源化动物模型构建的方法，其特征在于，所述人源化CD47蛋白的胞外区包括IgV结构域，所述人源化CD47基因包括动物来源部分和人源部分，所述人源部分如SEQ ID NO：27所示，所述人源部分编码IgV结构域。
4.根据权利要求3所述的人源化动物模型构建的方法，其特征在于，其中所述动物来源部分包括动物来源Cd47基因的第1号外显子全部序列、第2号外显子部分序列、第3号外显子及其后所有外显子的全部序列。
5.根据权利要求1-4任一所述的人源化动物模型构建的方法，其特征在于，使用基因编辑技术进行CD47基因人源化动物模型的构建，所述基因编辑技术包括利用胚胎干细胞的基因打靶技术、CRISPR/Cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术或归巢核酸内切酶。
6.根据权利要求5所述的人源化动物模型构建的方法，其特征在于，所述方法包括使用sgRNA靶向技术实现将动物来源的Cd47的第2号外显子部分序列替换为人CD47的第2号外显子部分序列，所述人CD47的第2号外显子部分序列为SEQ ID NO：27，其中，所述sgRNA在待改变的非人动物Cd47基因上的靶序列上是唯一的，且符合5’-NNN(20)-NGG3’或5’-CCN-N(20)-3’的序列排列规则，所述sgRNA靶向的5’端靶位点序列如SEQ ID NO：1-8任一项所示，3’端靶位点序列如SEQ ID NO：9-17任一项所示。
7.根据权利要求1-4和6任一所述的人源化动物模型构建的方法，其特征在于，所述动物来源的Cd47基因为非人类哺乳动物来源的Cd47基因，所述非人类哺乳动物为啮齿类动物，所述啮齿类动物为小鼠。
8.根据权利要求1-4和6任一所述的人源化动物模型构建的方法，其特征在于，所述人源化CD47蛋白为嵌合CD47蛋白，所述嵌合CD47蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：74、SEQ IDNO：75、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：79或SEQ ID NO：80。
9.根据权利要求2-4和6任一所述的人源化动物模型构建的方法，其特征在于，所述人源化动物模型的基因组中包含嵌合CD47基因，所述嵌合CD47基因编码权利要求8所述的嵌合CD47蛋白或所述的嵌合CD47基因选自下列组中的一种：a）嵌合CD47基因中人CD47基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：27所示；
b）嵌合CD47基因的mRNA序列如SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ IDNO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72或SEQ ID NO：73所示；或c）嵌合CD47基因的核苷酸的部分序列如SEQ ID NO：23所示。
10.一种用于Cd47基因人源化的靶向载体，其包含：a)与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自Cd47基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；b)***或替换的供体DNA序列，其编码供体转换区；和c)与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，即3’臂，其选自Cd47基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸，其中，所述的待改变的转换区位于Cd47基因的第2号外显子，所述的***或替换的供体DNA序列为人CD47基因DNA序列的第2号外显子的部分，所述的人CD47基因DNA序列的第2号外显子的部分为SEQ ID NO：27。
11.根据权利要求10所述的靶向载体，其特征在于，a) 与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自如NCBI登录号为NC_000082.6的第49866727- 49867784位核苷酸；c)与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，即3’臂，其选自如NCBI登录号为NC_000082.6的第49868091- 49869239位核苷酸。
12.一种能够特异的靶向Cd47基因的sgRNA序列，其特征在于，所述sgRNA序列靶向非人动物Cd47基因，同时所述sgRNA在待改变的非人动物Cd47基因上的靶序列上是唯一的，且符合5’-NNN(20)-NGG3’或5’-CCN-N(20)-3’的序列排列规则，其中，所述的sgRNA序列在小鼠Cd47基因的靶位点位于小鼠的Cd47基因的第2号外显子上，所述sgRNA序列靶向的5’端靶位点的序列如SEQ ID NO：1-8任一项所示，sgRNA靶向的3’端靶位点的序列如SEQ ID NO：9-17任一项所示。
13.根据权利要求12所述的sgRNA序列，其特征在于，sgRNA靶向的5’端靶位点的序列如SEQ ID NO：6所示，sgRNA靶向的3’端靶位点的序列如SEQ ID NO：9所示。
14.一种编码权利要求12或13所述sgRNA序列的DNA分子，其特征在于，所述DNA分子的双链序列分别如SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19，或SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21所示。
15.一种构建动物模型的载体，其特征在于，所述载体能够产生如权利要求12-13任一所述的sgRNA序列，用于敲除或替换CD47基因的第2号外显子的部分。
16.一种细胞，其特征在于，所述细胞包含权利要求10-11任一所述的靶向载体、一种或多种权利要求12-13任一所述的sgRNA序列、一种或多种权利要求15所述的载体和/或一种或多种权利要求15所述的载体的体外转录产物。
17.权利要求10-11任一所述的靶向载体、权利要求12-13任一所述的sgRNA序列、权利要求15所述的载体或权利要求16所述的细胞在基因修饰Cd47基因座中的应用。
18.一种CD47基因人源化细胞株，其特征在于，使用权利要求12-13任一所述的sgRNA序列、权利要求14所述的DNA分子、权利要求15所述的载体或权利要求16所述的细胞，通过对第2号外显子的部分进行替换制备获得。
19.一种制备多基因人源化动物模型的方法，其特征在于，
(a) 利用权利要求1-9任一所述方法获得的人源化动物模型；
(b) 将步骤(a)获得的人源化动物模型与其他人源化动物交配或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因人源化动物模型。
20.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述其他人源化动物为人源化SIRPα基因或PD-1基因的动物。
21.一种细胞或细胞系或原代细胞培养物，其特征在于，所述细胞或细胞系或原代细胞培养物来源于权利要求1-9任一所述的方法构建的人源化动物模型或其后代、权利要求19-20任一所述的方法制备的多基因人源化动物模型或其后代。
22.一种组织或器官或其培养物，其特征在于，所述的组织或器官或其培养物来源于权利要求1-9任一所述的方法构建的人源化动物模型或其后代、权利要求19-20任一所述的方法制备的多基因人源化动物模型或其后代。
23.一种嵌合CD47蛋白，其特征在于，所述嵌合CD47蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：79或SEQ IDNO：80所示。
24.一种编码权利要求23所述的嵌合CD47蛋白的嵌合CD47基因，其特征在于，所述
a）嵌合CD47基因中人CD47基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：27所示；
b）嵌合CD47基因的mRNA序列如SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ IDNO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72或SEQ ID NO：73所示；或c）嵌合CD47基因的核苷酸的部分序列如SEQ ID NO：23所示。
25.根据权利要求24所述的嵌合CD47基因，其特征在于，其中SEQ ID NO：67、SEQ IDNO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72或SEQ ID NO：73所示序列为嵌合小鼠CD47基因的非模板链、编码链或有义链。
26.来源于权利要求1-9任一所述的方法构建的人源化动物模型或其后代、权利要求19-20任一所述的方法制备的多基因人源化动物模型或其后代在需要涉及人类细胞的免疫过程的产品开发，制造人类抗体，或者作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的模型***中的应用。
27.来源于权利要求1-9任一所述的方法构建的人源化动物模型或其后代、权利要求19-20任一所述的方法制备的多基因人源化动物模型或其后代在生产和利用动物实验疾病模型，用于病原学研究、用于开发新的诊断策略和/或治疗策略中的应用。
28.来源于权利要求1-9任一所述的方法构建的人源化动物模型或其后代、权利要求19-20任一所述的方法制备的多基因人源化动物模型或其后代在筛选、验证、评价或研究CD47基因功能、CD47/SIRPA信号通路、CD47抗体、SIRPA抗体、针对CD47和/或SIRPA靶位点的药物、药效研究，免疫相关疾病药物以及抗肿瘤药物，筛选和评估人用药及药效研究方面的用途。
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Address after: 101111 floor 12, building 3, yard 88, Kechuang 6th Street, East District, economic and Technological Development Zone, Daxing District, Beijing

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Patentee after: BIOCYTOGEN JIANGSU GENE BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd.

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Patentee before: BEIJING BIOCYTOGEN Co.,Ltd.

Patentee before: BIOCYTOGEN JIANGSU GENE BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd.

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