ES2942484T3

ES2942484T3 - Diferenciación de células madre embrionarias humanas en células endocrinas pancreáticas usando reguladores de HB9

Info

Publication number: ES2942484T3
Application number: ES13869172T
Authority: ES
Inventors: Alireza Rezania
Original assignee: Janssen Biotech Inc
Current assignee: Janssen Biotech Inc
Priority date: 2012-12-31
Filing date: 2013-12-18
Publication date: 2023-06-01
Anticipated expiration: 2033-12-18
Also published as: MX2015008578A; JP6557147B2; CN105073979B; JP2020141704A; RU2684215C2; JP6792652B2; AU2018282310B2; PH12015501450A1; AU2023285720A1; BR112015015701A2; SG11201505112SA; DK2938723T3; JP2016503654A; US20190211309A1; AU2013368224A1; JP7278990B2; EP4219683A1; AU2013368224B2; WO2014105546A1; AU2021200941C1

Abstract

La presente invención proporciona métodos para promover la diferenciación de células madre pluripotentes en células del endodermo pancreático que expresan PDX1, NKX6.1 y HB9. En particular, los métodos abarcan el cultivo de células de la etapa 4 a la etapa 6 con una hormona tiroidea (por ejemplo, T3), un inhibidor de ALK5 o ambos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Diferenciación de células madre embrionarias humanas en células endocrinas pancreáticas usando reguladores de HB9

Campo de la invención

La presente invención pertenece al campo de la diferenciación celular.

Antecedentes

Los avances en la terapia de reemplazo celular para la diabetes mellitus tipo I y la escasez de islotes trasplantables de Langerhans se han centrado en el desarrollo de fuentes de células productoras de insulina, o células p, apropiadas para injerto. Un enfoque es la generación de células p funcionales a partir de células madre pluripotentes, tales como, células madre embrionarias.

En el desarrollo embrionario de vertebrados, una célula pluripotente da lugar a un grupo de células que comprenden tres capas germinales (ectodermo, mesodermo, y endodermo) en un proceso conocido como gastrulación. Tejidos tales como, tiroides, timo, páncreas, intestino, e hígado, se desarrollarán a partir del endodermo, a través de una fase intermedia. La fase intermedia en este proceso es la formación de endodermo definitivo.

Al final de la gastrulación, el endodermo se divide en dominios anteroposteriores que pueden reconocerse mediante la expresión de un panel de factores que marcan de manera única regiones anterior, media y posterior del endodermo. Por ejemplo, HHEX, y SOX2 identifican la región anterior mientras que CDX1, 2 y 4 identifican la región posterior del endodermo.

La migración de tejido endodérmico acerca el endodermo en estrecha proximidad a diferentes tejidos mesodérmicos que ayudan en la regionalización del tubo intestinal. Esto se logra mediante una plétora de factores secretados, tales como FGF, WNT, TGF-p, ácido retinoico (RA), y ligandos de BMP y sus antagonistas. Por ejemplo, FGF4 y BMP promueven la expresión de CDX2 en el supuesto endodermo del intestino posterior y reprimen la expresión de los genes anteriores HHEX y SOX2 (2000 Development, 127:1563-1567). También se ha mostrado que la señalización de WNT funciona en paralelo a la señalización de FGF para promover el desarrollo del intestino posterior e inhibir el destino del intestino anterior (2007 Development, 134:2207-2217). Por último, el ácido retinoico secretado por el mesénquima regula el límite de intestino anterior-intestino posterior (2002 Curr Biol, 12:1215-1220).

El nivel de expresión de factores de transcripción específicos puede usarse para designar la identidad de un tejido. Durante la transformación del endodermo definitivo en un tubo intestinal primitivo, el tubo intestinal se regionaliza en dominios amplios que pueden observarse a nivel molecular mediante patrones de expresión génica restringidos. El dominio pancreático regionalizado en el tubo intestinal muestra una expresión muy alta de PDX1 y una expresión muy baja de CDX2 y SOX2. PDX1, NKX6.1, PTF1A, y NKX2.2 son altamente expresados en tejido pancreático; y la expresión de CDX2 es alta en tejido intestinal.

La formación del páncreas surge de la diferenciación del endodermo definitivo en endodermo pancreático. Los dominios pancreáticos dorsal y ventral surgen del epitelio de intestino anterior. El intestino anterior también da lugar al esófago, tráquea, pulmones, tiroides, estómago, hígado, y sistema de conductos biliares.

Las células del endodermo pancreático expresan el gen de homeosecuencia pancreático-duodenal PDX1. En ausencia de PDX1, el páncreas no se desarrolla más allá de la formación de yemas ventrales y dorsales. Por lo tanto, la expresión de PDX1 marca una etapa crítica en la organogénesis pancreática. El páncreas maduro contiene tejidos tanto exocrinos como endocrinos que surgen de la diferenciación del endodermo pancreático.

D'Amour et al. describen la producción de cultivos enriquecidos de endodermo definitivo derivado de células madre embrionarias humanas en presencia de una alta concentración de activina y suero bajo (Nature Biotechnology 2005, 23:1534-1541; patente estadounidense n.° 7.704.738). El trasplante de estas células debajo de la cápsula renal de ratones dio como resultado, según se informa, la diferenciación en células más maduras con características de tejido endodérmico (patente estadounidense n.° 7.704.738). Las células endodérmicas definitivas derivadas de células madre embrionarias humanas pueden diferenciarse adicionalmente en células positivas para PDX1 después de la adición de FGF10 y ácido retinoico (publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2005/0266554). El trasplante posterior de estas células precursoras pancreáticas en la almohadilla de grasa de ratones inmunodeficientes dio como resultado la formación de células endocrinas pancreáticas funcionales después de una fase de maduración de 3-4 meses (patente estadounidense n.° 7.993.920 y patente estadounidense n.° 7.534.608).

Fisk et al. Informan de un sistema para producir células de islotes pancreáticos a partir de células madre embrionarias humanas (patente estadounidense n.° 7.033.831). En este caso, la ruta de diferenciación se dividió en tres fases. Las células madre embrionarias humanas se diferenciaron primero en endodermo usando una combinación de butirato de sodio y activina A (patente estadounidense n.° 7.326.572). Las células se cultivaron después con antagonistas de BMP, tal como nogina, en combinación con EGF o betacelulina para generar células positivas para PDX1. La diferenciación terminal fue inducida por nicotinamida.

También se han usado inhibidores de moléculas pequeñas para la inducción de células precursoras endocrinas pancreáticas. Por ejemplo, se han usado inhibidores de moléculas pequeñas del receptor de TGF-p y receptores de BMP (Development 2011, 138:861-871; Diabetes 2011, 60:239-247) para mejorar significativamente el número de células endocrinas pancreáticas. Además, también se han usado activadores de moléculas pequeñas para generar células endodérmicas definitivas o células precursoras pancreáticas (Curr Opin Cell Biol 2009, 21:727-732; Nature Chem Biol 2009, 5:258-265).

Además, se ha desarrollado un protocolo por etapas para diferenciar células madre embrionarias humanas (hESC) in vitro en una población de células progenitoras pancreáticas PDX1+ altamente enriquecida que se desarrollan adicionalmente in vivo a células endocrinas pancreáticas maduras (Rezania et al. (2012), Diabetes, Vol. 61).

HB9 (también conocida como H1XB9 y MNX1) es una proteína activadora transcripcional bHLH expresada temprano en el desarrollo del páncreas empezando a partir de aproximadamente el día embrionario 8. HB9 también se expresa en notocorda y la médula espinal. La expresión de HB9 es transitoria y alcanza su punto máximo aproximadamente el día 10,5 en el epitelio pancreático que se expresa en células que expresan PDX1 y NKX6.1. Aproximadamente el día 12,5, la expresión de HB9 disminuye y en fases posteriores pasa a estar restringida solo a las células p. En ratones homocigóticos para una mutación nula de H1XB9, el lóbulo dorsal del páncreas no se desarrolla (Nat Genet 23:67-70, 1999; Nat Genet 23:71-75, 1999). Las células HB9-/-P expresan bajos niveles del transportador de glucosa, GLUT2, y NKX6.1. Además, el páncreas HB9 -/- muestra una reducción significativa en el número de células positivas para insulina sin afectar significativamente a la expresión de otras hormonas pancreáticas. Por lo tanto, el control temporal de HB9 es esencial para el desarrollo y la función normales de las células p. Si bien no se sabe mucho sobre los factores que regulan la expresión de HB9 en células p, un estudio reciente en pez cebra sugiere que el ácido retinoico puede regular positivamente la expresión de HB9 (Development, 138, 4597-4608, 2011).

Las hormonas tiroideas, tiroxina (“T4”) y triyodotironina (“T3”), son hormonas basadas en tirosina producidas por la glándula tiroides y son las principales responsables de la regulación del metabolismo. La forma principal de hormona tiroidea en la sangre es T4, que tiene una vida media más larga que T3. La relación de T4 con respecto a T3 liberada en la sangre es de aproximadamente 20 a 1. T4 se convierte en la T3 más activa (tres a cuatro veces más potente que T4) dentro de las células por deyodinasa.

T3 se une a los receptores de hormona tiroidea, TRa1 y TRp1 (TR). TR es un receptor de hormonas nucleares, que se heterodimeriza con el receptor X retinoide. Los dímeros se unen a los elementos de respuesta tiroidea (TRE) en ausencia de ligando y actúan como represores transcripcionales. La unión de T3 a TR reduce la represión de genes dependientes de TRE e induce la expresión de diversos genes diana. Aunque numerosos estudios han sugerido un papel para T3 en el aumento de la proliferación de células p, reducción de la apoptosis, y mejora de la secreción de insulina, su papel en la diferenciación celular no está definido.

El factor de crecimiento transformante p (TGF-p) es un miembro de una gran familia de citocinas pleiotrópicas que están implicadas en muchos procesos biológicos, incluyendo control de crecimiento, diferenciación, migración, supervivencia celular, fibrosis y especificación del destino de desarrollo. Los miembros de la superfamilia de TGF-p señalizan a través de un complejo receptor que comprende un receptor de tipo I y de tipo II. Ligandos de TGF-B (tales como activinas, y los GDF (factores de diferenciación de crecimiento) unen un receptor de tipo II con un receptor de tipo I. El receptor de tipo II fosforila y activa el receptor de tipo I en el complejo. Hay cinco receptores de mamífero tipo II: TpR-II, ActR-II, ActR-IIB, BMPR-II, y AMHR-II y siete receptores de tipo I (ALK1-7). La activina y los ligandos relacionados señalizan a través de combinaciones de ActR-II o ActR-IIB y ALK4 o ALK5, y BMP señalizan a través de combinaciones de ALK2, ALK3, y ALK6 con ActR-II, ActR-IIB, o BMPR-II. AMH señaliza a través de un complejo de AMHR-II con ALK6, y se ha mostrado recientemente que el nodo señaliza a través de un complejo de ActR-IIB y ALK7 (Cell. 2003,113(6):685-700). Después de la unión del ligando de TGF-B al receptor apropiado, las señales siguientes se transducen al núcleo principalmente a través de la activación de complejos de Smad. Tras la activación, los receptores de tipo I fosforilan miembros de la subfamilia regulada por receptor de Smad. Esto activa los mismos y les permite formar complejos con un mediador común Smad, Smad4. Smad 1, 5, y 8 son sustratos para ALK 1, 2, 3, y 6, mientras que Smad 2 y 3 son sustratos para ALK 4, 5, y 7 (FASEB J 13:2105-2124). Los complejos Smad activados se acumulan en el núcleo, donde están directamente implicados en la transcripción de genes diana, generalmente en asociación con otros factores de transcripción de unión a ADN específicos. Compuestos que inhiben selectivamente los receptores para TGF-p, se han desarrollado para aplicaciones terapéuticas y para modular el destino celular en el contexto de la reprogramación y diferenciación de diversas poblaciones de células madre. En particular, inhibidores de ALK5 se han usado previamente para dirigir la diferenciación de células madre embrionarias a un destino endocrino (Diabetes, 2011, 60(1):239-47).

En general, el proceso de diferenciación de células progenitoras a células p funcionales pasa por varias fases. Sin embargo, se reconoce que dirigir las células madre embrionarias humanas (“hES”) in vitro progresivamente a través de fases de determinación a células que se asemejan a las células p es un desafío y la producción de células P funcionales a partir de células hES no es un proceso sencillo. Cada etapa en el proceso de diferenciación de células progenitoras presenta un desafío único. Aunque se han realizado avances en la mejora de protocolos para generar células pancreáticas a partir de células progenitoras tales como células madre pluripotentes humanas, todavía existe la necesidad de generar un protocolo que dé como resultado células endocrinas funcionales y, en particular, células P-

Breve descripción de los dibujos

Las figuras 1A a 1C representan datos de análisis de PCR en tiempo real de la expresión de los siguientes genes en células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 diferenciadas en células precursoras endodérmicas/endocrinas pancreáticas como se describe en el ejemplo 1: PDX1 (figura 1A); NKX6.1 (figura 1B); y HB9 (figura 1C).

Las figuras 2A a 2C muestran los resultados del análisis de FACS de la línea de células madre embrionarias humanas H1 diferenciadas en células precursoras endodérmicas/endocrinas pancreáticas como se describe en el ejemplo 1 para PDX1 (figura 2A), NKX6.1 (figura 2B) y HB9 (figura 2C).

Las figuras 3A y 3B muestran imágenes de células sometidas a inmunotinción para NXK6.1, insulina o HB9. Las células se diferenciaron en células precursoras endodérmicas/endocrinas pancreáticas como se describe en el ejemplo 1. La figura 3A muestra inmunotinción para NKX6.1 (panel izquierdo) e insulina (panel derecho). La figura 3B muestra inmunotinción para HB9 (panel izquierdo) e insulina (panel derecho).

Las figuras 4A, B y C representan los datos de FACS para el porcentaje de expresión de PDX1, NKX6.1, y HB9 en la fase 4, día 3 (panel A), la fase 5, día 4 (panel B) y la fase 6, día 3 (panel C) de la línea de células madre embrionarias H1 diferenciadas a las fases 4 a 6 como se describe en el ejemplo 2.

La figura 5A muestra la expresión de ARNm de HB9 en comparación con islotes humanos en las fases 2 a 6 para células diferenciadas como se describe en el ejemplo 2.

La figura 5B representa imágenes de células de fase 4, día 3, que se diferenciaron como se describe en el ejemplo 2, sometidas a inmunotinción para NXK6.1 (panel izquierdo) y HB9 (panel derecho).

Las figuras 6A a 6J representan datos de análisis de PCR en tiempo real de la expresión de los siguientes genes en células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 diferenciadas a la fase 4 como se describe en el ejemplo 2 y luego tratadas solo en la fase 4, de la fase 4 a la fase 5, o de la fase 4 a la fase 6. Las figuras 6A a 6J representan los datos para lo siguiente: NKX6.1 (figura 6A); PDX1 (figura 6B); NKX2.2 (figura 6C); glucagón (figura 6D); insulina (figura 6E); somatostatina (figura 6F); CDX2 (figura 6G); albúmina (figura 6H); gastrina (figura 6I); y SOX2 (figura 6J).

Las figuras 7A y 7B muestran los resultados de inmunotinción de control (figura 7A) y cultivos tratados (figura 7B) como se describe en el ejemplo 2. La inmunotinción del control (figura 7A) y cultivos tratados (figura 7B) en la fase 6 reveló un aumento significativo en el número de células positivas para HB9 en el grupo tratado con T3 (figura 7B) en comparación con el control (figura 7A) en la fase 6.

Las figuras 8A y 8B representan inmunotinción para NKX6.1 y HB9 en la fase 6, día 7, para células diferenciadas a la fase 6 como se describe en el ejemplo 3. La figura 8C representa datos de análisis de PCR en tiempo real de la expresión de la HB9 en células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 diferenciadas a la fase 6 como se describe en el ejemplo 3.

Las figuras 9A y B representan los datos de FACS en la fase 6, día 5 y día 15, respectivamente, de la HB9 en células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 diferenciadas a la fase 6 como se describe en el ejemplo 3.

Las figuras 10A a 10E representan inmunotinción para NKX6.1 y HB9 en la fase 6, día 6, para células que se diferenciaron según el protocolo descrito en el ejemplo 4. T3 de una manera dependiente de la dosis mejoró significativamente el número de células positivas para HB9 en las células precursoras endodérmicas pancreáticas positivas para NKX6.1.

Las figuras 11A a 11L representan datos de análisis de PCR en tiempo real de la expresión de los siguientes genes en células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 diferenciadas a la fase 6 como se describe en el ejemplo 4: SOX2 (figura 11A); NKX6.1 (figura 11B); NKX2.2 (figura 11C); gastrina (figura 11D); PDX1 (figura 11E); NGN3 (figura 11F); PAX6 (figura 11G); PAX4 (figura 11H); insulina (figura 11I); glucagón (figura 11J); grelina (figura 11K); y somatostatina (figura 11L).

Descripción detallada

La siguiente descripción detallada de la invención, se entenderá mejor cuando al leerse junto con las figuras adjuntas.

Las figuras se proporcionan con fines ilustrativos. Sin embargo, la invención no se limita a las disposiciones precisas, ejemplos, e instrumentos mostrados. Para mayor claridad de la divulgación, y no a modo de limitación, la descripción detallada de la invención se divide en subsecciones.

La presente invención se refiere a las realizaciones tal como se caracterizan en las reivindicaciones y se describen a continuación. Por consiguiente, la invención se refiere a un método para generar células que expresan marcadores característicos de células endocrinas pancreáticas que comprende cultivar células endodérmicas de intestino anterior en un primer medio de crecimiento suplementado con una hormona tiroidea pero sin inhibidor de ALK5 durante aproximadamente de dos a cuatro días, seguido por cultivar la población celular resultante en un segundo medio de crecimiento suplementado con una hormona tiroidea y un inhibidor de ALK5 durante aproximadamente de dos a cuatro días. Por lo tanto, se describe adicionalmente en el presente documento la generación de células endodérmicas pancreáticas que son positivas para NKX6.1, PDX1, y HB9 mediante el uso de ciertas hormonas tiroideas, o análogos de las mismas, e inhibidores de ALK5 (receptor quinasa TGFp tipo I) en una secuencia de cultivo específica. Se describe además un cultivo celular in vitro para diferenciar células derivadas de células madre pluripotentes en células que expresan marcadores característicos del linaje de células p que expresan NKX6.1, PDX1 y HB9. Por lo tanto, también se describe un método para obtener tales células a través de un cultivo celular in vitro. En ciertas realizaciones, la invención se basa en el descubrimiento de que la inclusión de T3, T4, o análogos de las mismas, actúan como un inductor de la expresión de proteína HB9 en la diferenciación de células para facilitar la diferenciación hacia células p. La HB9 no se expresa a nivel de proteína en la fase 3 o la fase 4. Por consiguiente, en el presente documento se describen métodos para diferenciar células madre regulando la expresión de proteína HB9. También se describe la generación de células endodérmicas pancreáticas que son positivas para NKX6.1, PDX1, y HB9 mediante el uso de T3 o T4, o análogos de las mismas, e inhibición de ALK5 en una secuencia de cultivo específica.

Definiciones

Las células madre son células indiferenciadas definidas por su capacidad, a nivel de célula individual, tanto para autorrenovarse como para diferenciarse. Las células madre pueden producir células progenitoras, incluyendo células progenitoras autorrenovadoras, progenitoras no renovadoras, y diferenciadas terminalmente. Las células madre también se caracterizan por su capacidad para diferenciarse in vitro en células funcionales de diversos linajes celulares de múltiples capas germinales (endodermo, mesodermo y ectodermo). Las células madre también dan lugar a tejidos de múltiples capas germinales después del trasplante y contribuyen sustancialmente a la mayoría de, si no todos, los tejidos después de la inyección en blastocistos.

Las células madre se clasifican por su potencial de desarrollo. Las células madre pluripotentes pueden ser capaces de dar lugar a todos los tipos de células embrionarias.

La diferenciación es el proceso por el cual una célula no especializada (“no comprometida”) o menos especializada adquiere las características de una célula especializada tal como, por ejemplo, una célula nerviosa o una célula muscular. Una célula diferenciada es una que ha adoptado una posición más especializada (“comprometida”) dentro del linaje de una célula. El término “comprometida”, cuando se aplica al proceso de diferenciación, se refiere a una célula que ha avanzado en la ruta de diferenciación hasta un punto donde, en circunstancias normales, continuará para diferenciarse en un tipo celular específico o subconjunto de tipos celulares, y no puede, en circunstancias normales, diferenciarse en un tipo celular diferente o volver a un tipo celular menos diferenciado. “Desdiferenciación” se refiere al proceso por el cual una célula vuelve a una posición menos especializada (o comprometida) dentro del linaje de una célula. Como se usa en el presente documento, el linaje de una célula define la herencia de la célula, es decir, de qué células provienen y a qué células pueden dar lugar. El linaje de una célula coloca la célula dentro de un esquema hereditario de desarrollo y diferenciación. Un marcador específico de linaje se refiere a una característica asociada específicamente con el fenotipo de células de un linaje de interés y puede usarse para evaluar la diferenciación de una célula no comprometida con el linaje de interés.

“Marcadores”, como se usa en el presente documento, son moléculas de ácido nucleico o de polipéptido que se expresan diferencialmente en una célula de interés. En este contexto, expresión diferencial significa un nivel aumentado para un marcador positivo y un nivel disminuido para un marcador negativo en comparación con una célula indiferenciada. El nivel detectable del ácido nucleico o polipéptido marcador es suficientemente mayor o menor en las células de interés en comparación con otras células, de modo que la célula de interés puede identificarse y distinguirse de otras células usando cualquiera de una variedad de métodos conocidos en la técnica.

Como se usa en el presente documento, una célula es “positiva para” un marcador específico o “positiva” cuando el marcador específico se detecta suficientemente en la célula. De manera similar, la célula es “negativa para” un marcador específico, o “negativa” cuando el marcador específico no se detecta suficientemente en la célula. En particular, positiva por FACS es generalmente mayor que un 2 %, mientras que el umbral negativo por FACS es normalmente inferior a un 1 %. Positiva por PCR es habitualmente inferior a 34 ciclos (Ct); mientras que negativa por PCR es habitualmente superior a 34,5 ciclos.

En intentos de replicar la diferenciación de células madre pluripotentes en células endocrinas pancreáticas funcionales en cultivos celulares estáticos in vitro, a menudo se considera que el proceso de diferenciación progresa a través de varias fases consecutivas. En particular, el proceso de diferenciación se ve comúnmente como que progresa a través de seis fases. En esta progresión por etapas, “fase 1” se refiere a la primera etapa en el proceso de diferenciación, la diferenciación de células madre pluripotentes en células que expresan marcadores característicos de células endodérmicas definitivas (denominadas a continuación en el presente documento alternativamente “células de fase 1”). “Fase 2” se refiere a la segunda etapa, la diferenciación de células que expresan marcadores característicos de células endodérmicas definitivas en células que expresan marcadores característicos de células de tubo intestinal (denominadas a continuación en el presente documento alternativamente “células de fase 2”). “Fase 3” se refiere a la tercera etapa, la diferenciación de células que expresan marcadores característicos de células de tubo intestinal en células que expresan marcadores característicos de células endodérmicas de intestino anterior (denominadas a continuación en el presente documento alternativamente “células de fase 3”). “Fase 4” se refiere a la cuarta etapa, la diferenciación de células que expresan marcadores característicos de células endodérmicas de intestino anterior en células que expresan marcadores característicos de células precursoras de intestino anterior pancreáticas (denominadas a continuación en el presente documento alternativamente “células de fase 4”). “Fase 5” se refiere a la quinta etapa, la diferenciación de células que expresan marcadores característicos de células precursoras de intestino anterior pancreáticas en células que expresan marcadores característicos de células endodérmicas pancreáticas y/o células precursoras endocrinas pancreáticas (denominadas a continuación en el presente documento colectivamente “células precursoras endodérmicas/endocrinas pancreáticas” o, como alternativa, “células de fase 5”). “Fase 6” se refiere a la diferenciación de células que expresan marcadores característicos de células precursoras endodérmicas/endocrinas pancreáticas en células que expresan marcadores característicos de células endocrinas pancreáticas (denominadas a continuación en el presente documento alternativamente “células de fase 6”).

Sin embargo, debe indicarse que no todas las células en una población particular progresan a través de estas fases a la misma velocidad. Por consiguiente, no es raro en cultivos celulares in vitro detectar la presencia de células que han progresado menos, o más, a través de la ruta de diferenciación que la mayoría de las células presentes en la población, particularmente en las fases de diferenciación posteriores. Por ejemplo, no es raro ver la aparición de marcadores característicos de células endocrinas pancreáticas durante el cultivo de células en la fase 5. Con el fin de ilustrar la presente invención, las características de los diversos tipos de células asociados con las fases identificadas anteriormente se describen en el presente documento.

“Células endodérmicas definitivas”, como se usa en el presente documento, se refiere a células que portan las características de células que surgen del epiblasto durante la gastrulación y que forman el tracto gastrointestinal y sus derivados. Las células endodérmicas definitivas expresan al menos uno de los siguientes marcadores: FOXA2 (también conocido como factor nuclear de hepatocitos 3- p (“HNF3P”)), GATA4, SOX17, CXCR4, Brachyury, Cerberus, OTX2, goosecoid, C-Kit, CD99 y MIXL1. Los marcadores característicos de las células endodérmicas definitivas incluyen CXCR4, FOXA2 y SOX17. Por lo tanto, las células endodérmicas definitivas pueden caracterizarse por su expresión de CXCR4, FOXA2 y SOX17. Además, dependiendo del período de tiempo que se permite que las células permanezcan en la fase 1, puede observarse un aumento en HNF4a.

“Células de tubo intestinal”, como se usa en el presente documento, se refiere a células derivadas de endodermo definitivo que pueden dar lugar a todos los órganos endodérmicos, tales como pulmones, hígado, páncreas, estómago e intestino. Las células de tubo intestinal pueden caracterizarse por su expresión sustancialmente aumentada de HNF4a por encima de la expresada por células endodérmicas definitivas. Por ejemplo, puede observarse un aumento de diez a cuarenta veces en la expresión de ARNm de HNF4a durante la fase 2.

“Células endodérmicas de intestino anterior”, como se usa en el presente documento, se refiere a células endodérmicas que dan lugar al esófago, pulmones, estómago, hígado, páncreas, vesícula biliar, y una porción del duodeno. Las células endodérmicas de intestino anterior expresan al menos uno de los siguientes marcadores: PDX1, FOXA2, CDX2, SOX2 y HNF4a. Las células endodérmicas de intestino anterior pueden caracterizarse por un aumento en la expresión de PDX1 en comparación con células de tubo intestinal. Por ejemplo, más del cincuenta por ciento de las células en cultivos en la fase 3 normalmente expresan PDX1.

“Células precursoras de intestino anterior pancreáticas”, como se usa en el presente documento, se refiere a células que expresan al menos uno de los siguientes marcadores: PDX1, NKX6.1, Hn F6, NGN3, SOX9, PAX4, PAX6, ISL1, gastrina, FOXA2, PTF1a, PROX1 y HNF4a. Las células precursoras de intestino anterior pancreáticas pueden caracterizarse por ser positivas para la expresión de PDX1, NKX6.1 y SOX9.

“Células endodérmicas pancreáticas”, como se usa en el presente documento, se refiere a células que expresan al menos uno de los siguientes marcadores: PDX1, NKX6.1, HNF1 p, PTF1 a, HNF6, HNF4a, SOX9, NGN3; gastrina; HB9 o PROX1. Las células endodérmicas pancreáticas pueden caracterizarse por su falta de expresión sustancial de CDX2 o SOX2.

“Células precursoras endocrinas pancreáticas”, como se usa en el presente documento, se refiere a células endodérmicas pancreáticas capaces de convertirse en una célula que expresa hormona pancreática. Las células precursoras endocrinas pancreáticas expresan al menos uno de los siguientes marcadores: NGN3; NKX2.2; NeuroD1; ISL1; PAX4; PAX6; o ^aR^x. Las células precursoras endocrinas pancreáticas pueden caracterizarse por su expresión de NKX2.2 y NeuroDI.

“Células endocrinas pancreáticas”, como se usa en el presente documento, se refiere a células capaces de expresar al menos una de las siguientes hormonas: insulina, glucagón, somatostatina, grelina y polipéptido pancreático. Además de estas hormonas, los marcadores característicos de células endocrinas pancreáticas incluyen uno o más de NGN3, NeuroD1, ISL1, PDX1, NKX6.1, PAX4, ARX, NKX2.2 y PAX6. Las células endocrinas pancreáticas que expresan marcadores característicos de las células p pueden caracterizarse por su expresión de insulina y al menos uno de los siguientes factores de transcripción: PDX1, NKX2.2, NKX6.1, NeuroD1, ISL1, HNP3p, MAFA y PAX6.

En el presente documento se usan indistintamente “d1”, “1d”, y “día 1”; “d2”, “2d”, y “día 2”, y así sucesivamente. Estas combinaciones de letras y números se refieren a un día específico de incubación en las diferentes fases durante el protocolo de diferenciación por etapas de la presente solicitud.

“Glucosa” se usa en el presente documento para referirse a dextrosa, un azúcar que se encuentra comúnmente en la naturaleza.

“NeuroD1” se usa en el presente documento para identificar una proteína expresada en células progenitoras endocrinas pancreáticas y el gen que codifica las mismas.

“LDN-193189” se refiere a clorhidrato de ((6-(4-(2-(piperidin-1-il)etoxi)fenil)-3-(piridin-4-il)pirazolo[1,5-a]pirimidina; DM-3189)) un inhibidor de receptor de BMP disponible bajo la marca registrada STEMOLECULE™ de Stemgent, Inc., Cambridge, MA, EE.UU.

Caracterización, fuente, expansión y cultivo de células madre pluripotentes

A. Caracterización de células madre pluripotentes

Células madre pluripotentes pueden expresar uno o más de los antígenos embrionarios específicos de fase (SSEA) 3 y 4, y marcadores detectables usando anticuerpos Tra-1-60 y Tra-1-81 (Thomson et al. 1998, Science 282:1145-1147, citado solo como referencia). La diferenciación de células madre pluripotentes in vitro da como resultado la pérdida de expresión de Tra-1-60 y Tra-1-81. Las células madre pluripotentes indiferenciadas normalmente tienen actividad fosfatasa alcalina, que puede detectarse fijando las células con paraformaldehído al 4 %, y luego desarrollarse con VECTOR® Red como sustrato, según lo descrito por el fabricante (Vector Laboratories, C^a, EE.UU.). Las células madre pluripotentes indiferenciadas también expresan normalmente OCT4 y TERT, como se detecta por RT-PCR.

Otro fenotipo deseable de células madre pluripotentes propagadas es un potencial para diferenciarse en células de las tres capas germinales: tejidos de endodermo, mesodermo y ectodermo. Puede confirmarse la pluripotencia de células madre, por ejemplo, inyectando células en ratones con inmunodeficiencia combinada grave (“SCID”), fijando los teratomas que se forman usando paraformaldehído al 4 %, y luego examinando histológicamente la evidencia de tipos de células de estas tres capas germinales. Alternativamente, la pluripotencia puede determinarse mediante la creación de cuerpos embrioides y evaluando la presencia de marcadores asociados con las tres capas germinales.

Las líneas de células madre pluripotentes propagadas pueden ser cariotipadas usando una técnica de bandeo G estándar y comparadas con los cariotipos publicados de las especies de primates correspondientes. Es deseable obtener células que tengan un “cariotipo normal”, lo que significa que las células son euploides, en donde todos los cromosomas humanos están presentes y no están alterados notablemente.

B. Fuentes de células madre pluripotentes

Tipos de células madre pluripotentes que no forman parte de la invención y que se dan a conocer como referencia solo incluyen líneas establecidas de células pluripotentes, incluyendo tejido preembrionario (tal como, por ejemplo, un blastocisto), tejido embrionario, o tejido fetal tomado en cualquier momento durante la gestación, normalmente, pero no necesariamente, antes de aproximadamente 10 a 12 semanas de gestación. Por ejemplo, se dan a conocer solo como referencia, líneas establecidas de células madre embrionarias humanas o células germinales embrionarias humanas, tales como, por ejemplo, las líneas de células madre embrionarias humanas H1, H7 y H9 (WiCell Research Institute, Madison, WI, EE.U^u.). Como se da a conocer para referencia, también son adecuadas células tomadas de una población de células madre pluripotentes ya cultivadas en ausencia de células alimentadoras. Pueden usarse células pluripotentes inducibles (IPS), o células pluripotentes reprogramadas, derivadas de células somáticas adultas usando la expresión forzada de un número de factores de transcripción relacionados con pluripotentes, tales como OCT4, NANOG, SOX2, KLF4 y ZFP42 (Annu Rev Genomics Hum Genet 2011, 12:165-185; véase también IPS, Cell, 126(4): 663-676). Las células madre embrionarias humanas también pueden prepararse como se describe por Thomson et al. (patente estadounidense n.° 5.843.780; Science, 1998, 282:1145-1147; Curr Top Dev Biol 1998, 38:133-165; Proc Natl Acad Sci U.S.A. 1995, 92:7844-7848), que se da a conocer solo como referencia. Líneas de células madre embrionarias humanas mutantes, tales como, BG01v (BresaGen, Athens, Ga.) también se dan a conocer solo como referencia. También pueden usarse células derivadas de células somáticas humanas adultas, tales como, células dadas a conocer en Takahashi et al., Cell 131: 1-12 (2007). Como se da a conocer para referencia, las células madre pluripotentes pueden derivarse adicionalmente según los métodos dados a conocer en: Li et al. (Cell Stem Cell 4: 16-19, 2009); Maherali et al. (Cell Stem Cell 1: 55-70, 2007); Stadtfeld et al. (Cell Stem Cell 2: 230-240); Nakagawa et al. (Nature Biotechnol 26: 101-106, 2008); Takahashi et al. (Cell 131: 861-872, 2007); y publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2011/0104805. En ciertas realizaciones, las células madre pluripotentes pueden ser de origen no embrionario.

C. Expansión y cultivo de células madre pluripotentes

Las células madre pluripotentes pueden cultivarse normalmente en una capa de células alimentadoras que sustentan las células madre pluripotentes de diversas maneras. Alternativamente, las células madre pluripotentes se cultivan en un sistema de cultivo que está esencialmente libre de células alimentadoras, pero, sin embargo, sustenta la proliferación de células madre pluripotentes sin experimentar una diferenciación sustancial. El crecimiento de células madre pluripotentes en cultivo sin células alimentadoras sin diferenciación se sustenta usando un medio acondicionado mediante cultivo previo con otro tipo de célula. Alternativamente, el crecimiento de células madre pluripotentes en cultivo sin células alimentadoras sin diferenciación se sustenta usando un medio químicamente definido.

Las células pluripotentes pueden expandirse fácilmente en cultivo usando diversas capas alimentadoras o usando recipientes recubiertos con proteína de matriz. Alternativamente, superficies químicamente definidas en combinación con medios definidos tales como medios mTesr®1 (StemCell Technologies, Vancouver, Canadá) pueden usarse para la expansión rutinaria de las células. Las células pluripotentes pueden retirarse fácilmente de las placas de cultivo usando digestión enzimática, separación mecánica, o diversos quelantes de calcio tales como EDTA (ácido etilendiaminotetraacético). Alternativamente, las células pluripotentes pueden expandirse en suspensión en ausencia de cualquier proteína de matriz o capa alimentadora.

Pueden usarse muchos métodos diferentes de expansión y cultivo de células madre pluripotentes en la invención reivindicada. Solo se dan a conocer como referencia los métodos de Reubinoff et al., Thompson et al., Richard et al. y la publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2002/0072117. Reubinoff et al. (Nature Biotechnology 18: 399-404 (2000)) y Thompson et al. (Science 282: 1145-1147 (1998)), citados solo como referencia, dan a conocer el cultivo de líneas de células madre pluripotentes de blastocistos humanos usando una capa de células alimentadoras de fibroblastos embrionarios de ratón. Richards et al. (Stem Cells 21: 546-556, 2003) evaluaron un panel de once capas de células alimentadoras neonatales, fetales y adultas humanas diferentes y con respecto a su capacidad para sustentar el cultivo de células madre pluripotentes humanas, indicando que las líneas de células madre embrionarias humanas cultivadas en células alimentadoras de fibroblastos de piel adultos retienen la morfología de células madre embrionarias humanas y permanecen pluripotentes. La publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2002/0072117 da a conocer líneas de células que producen medios que sustentan el crecimiento de células madre pluripotentes de primates en cultivo sin células alimentadoras. Las líneas de células empleadas son líneas de células mesenquimales y de tipo fibroblasto obtenidas de tejido embrionario o diferenciadas de células madre embrionarias, y dadas a conocer en el presente documento solo como referencia. La publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2002/072117 también da a conocer el uso de las líneas de células como una capa de células alimentadoras primaria.

Se dan a conocer otros métodos para expandir y cultivar células madre pluripotentes, por ejemplo, en Wang et al., Stojkovic et al., Miyamoto et al. y Amit et al., que se citan solo como referencia. Wang et al. (Stem Cells 23: 1221 1227, 2005) dan a conocer métodos para el crecimiento a largo plazo de células madre pluripotentes humanas sobre capas de células alimentadoras derivadas de células madre embrionarias humanas. Stojkovic et al. (Stem Cells 2005 23: 306-314, 2005) dan a conocer un sistema de células alimentadoras derivado a partir de la diferenciación espontánea de células madre embrionarias humanas. Miyamoto et al. (Stem Cells 22: 433-440, 2004) dan a conocer una fuente de células alimentadoras obtenidas de la placenta humana. Amit et al. (Biol. Reprod 68: 2150-2156, 2003) dan a conocer una capa de células alimentadoras derivada del prepucio humano.

Se dan a conocer métodos adicionales de expansión y cultivo de células madre pluripotentes, por ejemplo, en Inzunza et al., patente estadounidense n.° 6.642.048, los documentos WO 2005/014799, Xu et al. y la solicitud de publicación estadounidense n.° 2007/0010011, que se citan solo como referencia. Inzunza et al. (Stem Cells 23: 544-549, 2005) dan a conocer una capa de células alimentadoras a partir de fibroblastos de prepucio postnatales humanos. La patente estadounidense n.° 6.642.048 da a conocer medios que sustentan el crecimiento de células madre pluripotentes de primates en cultivo sin células alimentadoras, y líneas de células útiles para la producción de tales medios. La patente estadounidense n.° 6.642.048, citada solo como referencia, informa de líneas de células mesenquimales y de tipo fibroblasto obtenidas de tejido embrionario o diferenciadas de células madre embrionarias; así como métodos para derivar tales líneas de células, medios de procesamiento y crecimiento de células madre usando tales medios. El documento WO 2005/014799 da a conocer un medio acondicionado para el mantenimiento, la proliferación, y la diferenciación de células de mamífero. El documento WO 2005/014799 informa de que el medio de cultivo producido a través de la divulgación se acondiciona por la actividad de secreción celular de células murinas; en particular, aquellos hepatocitos transgénicos diferenciados e inmortalizados, denominados MMH (hepatocito murino de Met, del inglés Met Murine Hepatocyte). Xu et al. (Stem Cells 22: 972-980, 2004) da a conocer un medio acondicionado obtenido a partir de derivados de células madre embrionarias humanas que se han modificado genéticamente para sobreexpresar la transcriptasa inversa de telomerasa humana. La publicación de solicitud estadounidense n.° 2007/0010011 da a conocer un medio de cultivo químicamente definido para el mantenimiento de células madre pluripotentes.

Un sistema de cultivo alternativo emplea medio libre de suero suplementado con factores de crecimiento capaces de promover la proliferación de células madre embrionarias. Ejemplos de tales sistemas de cultivo incluyen, pero no se limitan a, Cheon et al., Levenstein et al. y solicitud publicada estadounidense n.° 2005/0148070. Cheon et al. (BioReprod D0I:10.1095/biolreprod.105.046870, 19 de octubre, 2005) dan a conocer un sistema de cultivo sin suero y sin células alimentadoras en el que las células madre embrionarias se mantienen en medio de reemplazo de suero (SR) no acondicionado suplementado con diferentes factores de crecimiento capaces de desencadenar la autorrenovación de células madre embrionarias. Levenstein et al. (Stem Cells 24: 568-574, 2006) dan a conocer métodos para el cultivo a largo plazo de células madre embrionarias humanas en ausencia de fibroblastos o medio acondicionado, usando medios suplementados con bFGF. La solicitud pública estadounidense n.° 2005/0148070 da a conocer un método para cultivar células madre embrionarias humanas en medios definidos sin suero y sin células alimentadoras de fibroblastos, comprendiendo el método: cultivar las células madre en un medio de cultivo que contiene albúmina, aminoácidos, vitaminas, minerales, al menos una transferrina o un sustituto de transferrina, al menos una insulina o un sustituto de insulina, el medio de cultivo esencialmente libre de suero fetal de mamífero y que contiene al menos aproximadamente 100 ng/ml de un factor de crecimiento de fibroblastos capaz de activar un receptor de señalización de factor de crecimiento de fibroblastos, en donde el factor de crecimiento se suministra desde una fuente distinta de solo una capa alimentadora de fibroblastos, el medio sustentaba la proliferación de células madre en un estado indiferenciado sin células alimentadoras o medio acondicionado.

Otros métodos adecuados para cultivar y expandir células madre pluripotentes se dan a conocer en la publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2005/0233446, la patente estadounidense n.° 6.800.480, la publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2005/0244962 y el documento WO 2005/065354. La publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2005/0233446 da a conocer un medio definido útil en el cultivo de células madre, incluyendo células madre primordiales de primates indiferenciadas. En disolución, los medios son sustancialmente isotónicos en comparación con las células madre que se cultivan. En un cultivo dado, el medio particular comprende un medio base y una cantidad de cada uno de bFGF, insulina, y ácido ascórbico necesario para sustentar el crecimiento sustancialmente indiferenciado de las células madre primordiales. La patente estadounidense n.° 6.800.480 informa que se proporciona un medio de cultivo celular para hacer crecer células madre primordiales derivadas de primates en un estado sustancialmente indiferenciado que incluye un medio básico de endotoxina baja y presión osmótica baja que es eficaz para sustentar el crecimiento de células madre primordiales derivadas de primates. La divulgación de la patente 6.800.480 informa además que el medio básico se combina con un suero nutritivo eficaz para sustentar el crecimiento de células madre primordiales derivadas de primates y un sustrato seleccionado del grupo que consiste en células alimentadoras y un componente de matriz extracelular derivado de células alimentadoras. Se indica además que este medio incluye aminoácidos no esenciales, un antioxidante, y un primer factor de crecimiento seleccionado del grupo que consiste en nucleósidos y una sal de piruvato. La publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2005/0244962 informa que un aspecto de la divulgación proporciona un método para cultivar células madre embrionarias de primates y que las células madre en cultivo están esencialmente libres de suero fetal de mamífero (preferiblemente también esencialmente libres de cualquier suero animal) y en presencia de factor de crecimiento de fibroblastos que se suministra desde una fuente distinta de solo una capa alimentadora de fibroblastos.

El documento WO 2005/065354 da a conocer un medio de cultivo isotónico definido que está esencialmente libre de alimentador y libre de suero, que comprende: un medio basal; bFGF; insulina; y ácido ascórbico. Además, el documento W ^o2005/086845 da a conocer un método para el mantenimiento de una célula madre indiferenciada, comprendiendo dicho método exponer una célula madre a un miembro de la familia de proteínas del factor de crecimiento transformante p (TGF-P), un miembro de la familia de proteínas del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), o nicotinamida (NIC) en una cantidad suficiente para mantener la célula en un estado indiferenciado durante un período de tiempo suficiente para lograr un resultado deseado.

Las células madre pluripotentes pueden sembrarse en un sustrato de cultivo adecuado. El sustrato de cultivo adecuado puede ser un componente de matriz extracelular, tales como los derivados de la membrana basal o que pueden formar parte de acoplamientos de ligando-receptor de molécula de adhesión. El sustrato de cultivo adecuado puede ser MATRIGEL™ (Becton Dickenson). MATR|GELtm es una preparación soluble de células tumorales Engelbreth-Holm Swarm que se gelifica a temperatura ambiente para formar una membrana basal reconstituida.

Otros componentes de la matriz extracelular y mezclas de componentes son adecuados como alternativa. Dependiendo del tipo de célula que se está proliferando, esto puede incluir laminina, fibronectina, proteoglicano, entactina, sulfato de heparán, y similares, solos o en diversas combinaciones.

Las células madre pluripotentes pueden sembrarse en placa sobre el sustrato en una distribución adecuada y en presencia de un medio, que promueve la supervivencia celular, la propagación y la retención de las características deseables. Todas estas características se benefician de la cuidadosa atención a la distribución de siembra y pueden determinarse fácilmente por un experto en la técnica. Pueden prepararse medios de cultivo adecuados, por ejemplo, a partir de los siguientes componentes: medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), comercializado bajo la marca registrada GibcoTM (parte n.° 11965-092) por Life Technologies Corporation, Grand Island, NY; Medio Eagle modificado de desactivación de Dulbecco (KO DMEM), comercializado bajo la marca registrada GibcoTM (parte n.° 10829-018) por Life Technologies Corporation, Grand Island, NY; medio basal F12/DMEM al 50% de Ham; L-glutamina 200 mM, comercializado bajo la marca registrada GibcoTM (parte n.° 15039-027) por Life Technologies Corporation, Grand Island, NY; disolución de aminoácidos no esenciales, comercializado bajo la marca registrada GibcoTM (parte n.° 11140-050) por Life Technologies Corporation, Grand Island, NY; p-mercaptoetanol, (parte n.° M7522) comercializado por Sigma-Aldrich, Company, LLC, Saint Louis, MO; y factor de crecimiento de fibroblastos básico recombinante humano (bFGF), comercializado bajo la marca registrada GibcoTM (parte n.° 13256-029) por Life Technologies Corporation, Grand Island, NY.

Diferenciación de células madre pluripotentes

Como las células pluripotentes se diferencian hacia células p, se diferencian a través de diversas fases, cada una de las cuales puede caracterizarse por la presencia o ausencia de marcadores particulares. La diferenciación de las células en estas fases se logra mediante las condiciones de cultivo específicas, incluyendo la presencia o falta de ciertos factores añadidos al medio de cultivo. En general, esta diferenciación puede implicar diferenciación de células madre pluripotentes en células endodérmicas definitivas. Estas células endodérmicas definitivas pueden entonces diferenciarse adicionalmente en células de tubo intestinal, que a su vez pueden diferenciarse en células endodérmicas de intestino anterior. Las células endodérmicas de intestino anterior pueden diferenciarse en células precursoras de intestino anterior pancreáticas que pueden, a su vez, diferenciarse en células endodérmicas pancreáticas, células precursoras endocrinas pancreáticas o ambas. Estas células pueden diferenciarse entonces en células productoras de hormonas pancreáticas (tales como células p).

Esta invención proporciona diferenciación por fases de células madre pluripotentes hacia células endocrinas pancreáticas usando una hormona tiroidea (tal como T3, análogos de T3, T4, análogos de T4 o combinaciones de las mismas (denominadas colectivamente en lo sucesivo “T3/T4”)) y un inhibidor de ALK5. También se describe la diferenciación por fases de células madre pluripotentes hacia células endocrinas pancreáticas usando una hormona tiroidea (tal como T3/T4) o un inhibidor de ALK5. Los análogos de hormona tiroidea adecuados pueden incluir: GC-1 (Sobertirome) disponible de R & D Systems, Inc. n.° de catálogo 4554; DITPA (ácido 3,5-diyodotiropropiónico); KB-141, comentado en J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 2008, 111: 262-267 y Proc. Natl. Acad. Sci. US 2003, 100: 10067 10072; MB07344, comentado en Proc. Natl. Acad. Sci. US 2007, 104: 15490-15495; T0681, comentado en PLoS One, 2010, 5e8722 y J. Lipid Res. 2009, 50: 938-944; y GC-24, comentado en PLoS One, 2010 e8722 y Endocr. Pract.

2012, 18(6): 954-964. Inhibidores de ALK5 útiles incluyen: inhibidor II de ALK5 (Enzo, Farmingdale, NY); ALK5i (Axxora, San Diego, CA); SD208 (R & D Systems (MN)); inhibidor de TGF-B SB431542 (Xcess Biosciences (San Diego, CA)); ITD-1 (Xcess Biosciences (San Diego, CA)); LY2109761 (Xcess Biosciences (San Diego, CA)); A83-01 (Xcess Biosciences (San Diego, CA)); LY2157299 (Xcess Biosciences (San Diego, CA)); inhibidor V de receptor de TGF-p (EMD Chemicals, Gibstown, NJ); inhibidor I de receptor de TGF-p (EMD Chemicals, Gibstown, NJ); inhibidor IV de receptor de TGF-p (EMD Chemicals, Gibstown, NJ); inhibidor VII de receptor de TGF-p (EMD Chemicals, Gibstown, NJ); inhibidor VIII de receptor de TGF-p (EMD Chemicals, Gibstown, NJ); inhibidor II de receptor de TGF-p (EMD Chemicals, Gibstown, NJ); inhibidor VI de receptor de TGF-p (EMD Chemicals, Gibstown, NJ); inhibidor III de receptor de TGF-p (EMD Chemicals, Gibstown, NJ).

Diferenciación de células madre pluripotentes en células que expresan marcadores característicos de células endocrinas pancreáticas

Las características de células madre pluripotentes son bien conocidas por los expertos en la técnica, y se siguen identificando características adicionales de las células madre pluripotentes. Los marcadores de células madre pluripotentes incluyen, por ejemplo, la expresión de uno o más de los siguientes: ABCG2; cripto; FOXD3; CONNEXIN43; CONNEXIN45; OCT4; SOX2; NANOG; hTERT; UTF1; ZFP42; SSEA-3; SSEA-4; TRA-1-60; y TRA-1-81.

Las células madre pluripotentes incluyen la línea de células madre embrionarias humanas H9 (código NIH: WA09), la línea de células madre embrionarias humanas H1 (código NIH: WA01), la línea de células madre embrionarias humanas H7 (código NIH: WA07), y la línea de células madre embrionarias humanas SA002 (Cellartis, Suecia), que se dan a conocer solo como referencia. También son adecuadas las células que expresan al menos uno de los siguientes marcadores característicos de células pluripotentes: ABCG2, cripto, CD9, FOXD3, CONEXIN43, CONEXIN45, OCT4, SOX2, NANOG, hTERT, UTF1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60 y TRA-1-81.

También es adecuada para su uso en la presente invención una célula que expresa al menos uno de los marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo. En una realización de la invención, una célula que expresa marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo es una célula precursora de línea primitiva. En una realización alternativa, una célula que expresa marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo es una célula mesendodérmica. En una realización alternativa, una célula que expresa marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo es una célula endodérmica definitiva.

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Además se da a conocer una célula que expresa al menos uno de los marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático. Una célula que expresa marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático puede ser una célula endodérmica pancreática en la que la expresión de PDX1 y NKX6.1 es sustancialmente más alta que la expresión de CDX2 y SOX2. Son particularmente útiles las células en las que la expresión de PDX1 y NKX6.1 es al menos dos veces mayor que la expresión de CDX2 o SOX2.

En una realización, células endocrinas pancreáticas capaces de expresar al menos una de las siguientes hormonas: insulina, glucagón, somatostatina, y se generan polipéptidos pancreáticos. Además se da a conocer una célula precursora que expresa al menos uno de los marcadores característicos del linaje endocrino pancreático. En una realización de la presente invención, una célula que expresa marcadores característicos del linaje endocrino pancreático es una célula endocrina pancreática. En una realización preferida, la célula endocrina pancreática es una célula p productora de insulina.

En ciertas realizaciones de la invención, para llegar a las células que expresan marcadores característicos de células endocrinas pancreáticas, se emplea un protocolo que comienza con células madre pluripotentes o células pluripotentes inducibles, preferiblemente células madre pluripotentes. Como se da a conocer para referencia, este protocolo puede incluir las siguientes fases.

Fase 1: células madre pluripotentes, tales como células madre embrionarias obtenidas para líneas de cultivo celular, se tratan con factores apropiados para inducir la diferenciación en células que expresan marcadores característicos de células endodérmicas definitivas.

Fase 2: células resultantes de la fase 1 se tratan con factores apropiados para inducir una diferenciación adicional en células que expresan marcadores característicos de células de tubo intestinal.

Fase 3: células resultantes de la fase 2 se tratan con factores apropiados para inducir una diferenciación adicional en células que expresan marcadores característicos de células endodérmicas de intestino anterior.

Fase 4: células resultantes de la fase 3 se tratan con factores apropiados (incluyendo en ciertas realizaciones T3/T4) para inducir una diferenciación adicional en células que expresan marcadores característicos de células precursoras de intestino anterior pancreáticas.

Fase 5: células resultantes de la fase 4 se tratan con factores apropiados (incluyendo en ciertas realizaciones: (i) T3/T4; (ii) un inhibidor de ALK5; o (iii) tanto T3/T4 como un inhibidor de ALK 5) para inducir una diferenciación adicional en células que expresan marcadores característicos de células precursoras endodérmicas/endocrinas pancreáticas.

Fase 6: células resultantes de la fase 5 se tratan con factores apropiados (incluyendo en ciertas realizaciones T3/T4, un inhibidor de ALK5, o ambos) para inducir una diferenciación adicional en células que expresan marcadores característicos de células endocrinas pancreáticas.

Mientras que la invención, en ciertas realizaciones, abarca la diferenciación de células madre pluripotentes en células que expresan marcadores característicos de células endocrinas pancreáticas, también se describe en el presente documento la diferenciación de células que resultan de otras fases intermedias hacia células endocrinas pancreáticas. En particular, también se da a conocer la diferenciación de células que expresan marcadores característicos de células precursoras de intestino anterior pancreáticas en células que expresan marcadores característicos de células endocrinas pancreáticas. Además, aunque el proceso se describe en fases discretas, el tratamiento, así como el progreso de las células a través del proceso de diferenciación, puede ser secuencial o continuo.

Los métodos para evaluar la expresión de marcadores de ácido nucleico y proteína en células cultivadas o aisladas son habituales en la técnica. Estos métodos incluyen RT-PCR, inmunoelectrotransferencias de tipo Northern, hibridación in situ (véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 2001, suplemento)), e inmunoensayos (tales como análisis inmunohistoquímico de material seccionado), inmunoelectrotransferencia de tipo Western, y para marcadores que son accesibles en células intactas, FACS (véase, por ejemplo, Harlow y Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)). Además, la eficiencia de diferenciación puede determinarse exponiendo una población de células tratadas a un agente (tal como un anticuerpo) que reconoce específicamente un marcador de proteína expresado por células que expresan marcadores característicos del tipo de célula de interés.

Las células diferenciadas también pueden purificarse adicionalmente. Por ejemplo, después de tratar células madre pluripotentes con los métodos de la presente invención, las células diferenciadas pueden purificarse exponiendo una población de células tratadas a un agente (tal como un anticuerpo) que reconoce específicamente un marcador de proteína expresado característicamente por las células diferenciadas que se purifican.

Fase 1: Diferenciación de células madre pluripotentes en células que expresan marcadores característicos de células endodérmicas definitivas

Las células madre pluripotentes pueden diferenciarse en células que expresan marcadores característicos de células endodérmicas definitivas mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica, o mediante cualquier método propuesto en esta invención. Métodos adecuados para diferenciar células madre pluripotentes en células que expresan marcadores característicos de células endodérmicas definitivas se dan a conocer en: publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2007/0254359; publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2009/0170198; publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2009/0170198; publicación de solicitud de patente estadounidense n.°2011/0091971; publicación de solicitud de patente estadounidense n.°2010/0015711; publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2010/0015711; publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2012/0190111; publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2012/0190112; publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2012/0196365; publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 20100015711; publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2012/0190111; publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2012/0190112; publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2012/0196365; publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 20100015711; publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2012/0190111; publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2012/0190112; publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2012/0196365; solicitud de patente provisional estadounidense n.° 61/076.900; solicitud de patente provisional estadounidense n.° 61/076.908; y solicitud de patente provisional estadounidense n.° 61/076.915.

En una realización de la invención, células madre pluripotentes se tratan con un medio suplementado con activina A y Wnt3A para dar como resultado la generación de células que expresan marcadores característicos de células endodérmicas definitivas. El tratamiento puede implicar poner en contacto células madre pluripotentes con un medio que contiene de aproximadamente 50 ng/ml a aproximadamente 150 ng/ml, alternativamente de aproximadamente 75 ng/ml a aproximadamente 125 ng/ml, alternativamente aproximadamente 100 ng/ml de activina A. El tratamiento también puede implicar poner en contacto las células con aproximadamente de 10 ng/ml a aproximadamente 50 ng/ml, alternativamente de aproximadamente 15 ng/ml a aproximadamente 30 ng/ml, alternativamente aproximadamente 20 ng/ml de Wnt3A. Las células pluripotentes pueden cultivarse durante aproximadamente de dos a cinco días, preferiblemente aproximadamente de dos a tres días, para facilitar su diferenciación en células que expresan marcadores característicos de células endodérmicas definitivas. En una realización, las células pluripotentes se cultivan en presencia de activina A y Wnt3A durante un día, seguido de cultivo en presencia de activina A (sin presencia de Wnt3A).

Células madre pluripotentes también pueden tratarse con un medio suplementado con factor de diferenciación de crecimiento 8 (“GDF8”) y un inhibidor de glucógeno sintasa quinasa-3 p (“GSK3P”) (tal como los compuestos cíclicos de anilina-piridinotriazina dados a conocer en la publicación de solicitud de patente estadounidense n.°2010/0015711) para inducir la diferenciación en células que expresan marcadores característicos de células endodérmicas definitivas. El inhibidor de GSK3p es (14-Prop-2-en-1-il-3,5,7,14,17,23,27-heptaazatetraciclo[19.3.1.1~2,6~.1~8,12~]heptacosa-1(25),2(27),3,5,8(26),9,11,21,23-nonaen-16-ona, denominado en el presente documento “compuesto MCX”. El tratamiento puede implicar poner en contacto células madre pluripotentes con un medio suplementado con aproximadamente de 50 ng/ml a aproximadamente 150 ng/ml, alternativamente de aproximadamente de 75 ng/ml a aproximadamente 125 ng/ml, alternativamente aproximadamente 100 ng/ml de GDF8. El tratamiento también puede implicar poner en contacto las células con aproximadamente de 0,1 a 5 |iM, alternativamente aproximadamente de 0,5 a aproximadamente 2,5 |iM, preferiblemente aproximadamente 1 |iM de compuesto MCX. Las células pluripotentes pueden cultivarse durante aproximadamente de dos a cinco días, preferiblemente de aproximadamente tres a cuatro días, para facilitar su diferenciación en células endodérmicas definitivas. En una realización, las células pluripotentes se cultivan en presencia de GDF8 y compuesto MCX durante un día, seguido de cultivo en presencia de GDF8 y una concentración más baja de compuesto MCX durante un día, seguido de cultivo en presencia de GDF8 durante un día en ausencia del compuesto MCX. En particular, las células pueden cultivarse en presencia de GDF8 y aproximadamente 1 |iM de compuesto MCX durante un día, seguido de cultivo en presencia de GDF8 y aproximadamente compuesto MCX 0,1 |iM durante un día, seguido de cultivo en presencia de GDF8 durante un día en ausencia del compuesto MCX. En una realización alternativa, las células pueden cultivarse en presencia de GDF8 y aproximadamente compuesto MCX 1 |iM durante un día, seguido de cultivo en presencia de GDF8 y aproximadamente compuesto MCX 0,1 |iM durante un día.

La generación de células que expresan marcadores característicos de células endodérmicas definitivas puede determinarse sometiendo a prueba la presencia de los marcadores antes y después de seguir un protocolo particular. Las células madre pluripotentes normalmente no expresan tales marcadores. Por lo tanto, la diferenciación de células pluripotentes puede detectarse cuando las células comienzan a expresar marcadores característicos de células endodérmicas definitivas.

Fase 2: Diferenciación de células que expresan marcadores característicos de células endodérmicas definitivas en células que expresan marcadores característicos de células de tubo intestinal

Las células que expresan marcadores característicos de células endodérmicas definitivas pueden diferenciarse adicionalmente en células que expresan marcadores característicos de las células de tubo intestinal. En el presente documento se describe la formación de células que expresan marcadores característicos de células de tubo intestinal que incluye cultivar células que expresan marcadores característicos de células endodérmicas definitivas con un medio que contiene factor de crecimiento de fibroblastos (“FGF”)7 o FGF10 para diferenciar estas células. Por ejemplo, el medio de cultivo puede incluir de aproximadamente 25 ng/ml a aproximadamente 75 ng/ml, alternativamente de aproximadamente 30 ng/ml a aproximadamente 60 ng/ml, alternativamente aproximadamente 50 ng/ml de FGF7 o FGF10, preferiblemente FGF7. Las células pueden cultivarse en estas condiciones durante aproximadamente de dos a tres días, preferiblemente aproximadamente dos días.

En una realización, la diferenciación en células que expresan marcadores característicos de células de tubo intestinal incluye cultivar células que expresan marcadores característicos de células endodérmicas definitivas con FGF7, y ácido ascórbico (vitamina C). El medio de cultivo puede incluir ácido ascórbico de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 0,5 mM, alternativamente de aproximadamente 0,2 mM a aproximadamente 0,4 mM, alternativamente ácido ascórbico aproximadamente 0,25 mM. El medio de cultivo también puede incluir de aproximadamente 10 ng/ml a aproximadamente 35 ng/ml, alternativamente de aproximadamente 15 ng/ml a aproximadamente 30 ng/ml, alternativamente aproximadamente 25 ng/ml de FGF7. Por ejemplo, el medio de cultivo puede incluir ácido ascórbico aproximadamente 0,25 mM y aproximadamente 25 ng/ml de FGF-7. En una realización, células que expresan marcadores característicos de células endodérmicas definitivas se tratan durante 2 días con FGF7 y ácido ascórbico.

Fase 3: Diferenciación de células que expresan marcadores característicos de células de tubo intestinal en células que expresan marcadores característicos de células endodérmicas de intestino anterior

Células que expresan marcadores característicos de células de tubo intestinal pueden diferenciarse adicionalmente en células que expresan marcadores característicos de células endodérmicas de intestino anterior. Como se da a conocer en el presente documento, células de fase 2 pueden diferenciarse adicionalmente en células de fase 3 cultivando estas células en un medio de cultivo suplementado con un inhibidor del receptor Smoothened (“SMO”) (tal como ciclopamina o MRT10 (N-[[3-benzoilamino)fenil]amino]tioxometil]-3,4,5-trimetoxibenzamida)) o un antagonista de la ruta de señalización de Hedgehog (“SHH”) (tal como antigonista 1 Smoothened (“SANT-1”) ((E)-4-bencil-N-((3,5-dimetil-1-fenil-1H-pirazol-4-il)metilen-piperazin-1-amina)), inhibidor de la ruta de Hedgehog 1 (“H PM ”) (2-metoxietilo 1,4,5,6,7,8-hexahidro-4-(3-hidroxifenil)-7-(2-metoxifenil)-2-metil-5-oxo-3-quinolincarboxilato), ácido retinoico y nogina. Alternativamente, el medio puede suplementarse con un inhibidor de SMO, antagonista de la ruta de señalización de SHH, ácido retinoico y nogina. Las células pueden cultivarse durante aproximadamente de dos a cuatro días, preferiblemente aproximadamente dos días. En una realización, el medio se suplementa con de aproximadamente 0,1 |iM a aproximadamente 0,3 |iM de SANT-1, de aproximadamente 0,5 |iM a aproximadamente 3 |iM de ácido retinoico y de aproximadamente 75 ng/ml a aproximadamente 125 ng/ml de nogina. En otra realización, el medio se suplementa con aproximadamente 0,25 |iM de SANT-1, aproximadamente 2 |iM de ácido retinoico y aproximadamente 100 ng/ml de nogina.

Como también se da a conocer en el presente documento, las células de fase 2 pueden diferenciarse adicionalmente en células de fase 3 tratando las células de fase 2 con un medio suplementado con FGF7 o FGF10, ácido retinoico, un inhibidor de SMO (tal como MRT10 o ciclopamina) o antagonista de la ruta de señalización de SHH (tal como SANT-1 o HPI-1), un activador de proteína quinasa C (“PKC”) (tal como ((2S,5S)-(E,E)-8-(5-(4-(trifluorometil)fenil)-2,4-pentadienoilamino)benzolactama) (“TPB”); EMD Chemicals Inc., Gibbstown NJ), forbol-12,13-dibutirato (“PDBu”), forbol-12-miristato-13-acetato (“PMA”) o indolactama V (“ILV”), un inhibidor de proteína morfogénica ósea (“BMP”) (tal como LDN-193189, nogina o cordina), y ácido ascórbico. El medio puede suplementarse con FGF7 o FGF10, ácido retinoico, un inhibidor de SMO, un antagonista de la ruta de señalización de SHH (tal como SANT-1), un activador de PKC (tal como TPB), un inhibidor de BMP (tal como LDN-193189), y ácido ascórbico. Las células pueden cultivarse en presencia de estos factores de crecimiento, agonistas de molécula pequeña, y antagonistas durante aproximadamente de dos a tres días.

En una realización, el medio se suplementa con de aproximadamente 15 ng/ml a aproximadamente 35 ng/ml de FGF7, de aproximadamente 0,5 |iM a aproximadamente 2 |iM de ácido retinoico, de aproximadamente 0,1 |iM a aproximadamente 0,4 |iM de SANT-1, de aproximadamente 100 nM a aproximadamente 300 nM de TPB, de aproximadamente 50 nM a aproximadamente 200 nM de LDN-193189, y de aproximadamente 0,15 mM a aproximadamente 0,35 mM de ácido ascórbico. En otra realización, el medio se suplementa con aproximadamente 25 ng/ml de FGF7, aproximadamente 1 |iM de ácido retinoico, aproximadamente 0,25 |iM de SANT-1, aproximadamente 200 nM de TPB, aproximadamente 100 nM de LDN-193189, y aproximadamente 0,25 mM de ácido ascórbico.

Fases 4 a 6: En el presente documento se da a conocer la diferenciación de células que expresan marcadores característicos de células endodérmicas de intestino anterior en células que expresan marcadores característicos de células endodérmicas pancreáticas mediante tratamiento con medios de cultivo suplementados con hormonas tiroideas T3/T4 o inhibidor de ALK5, o tanto T3/T4 como inhibidor de ALK5.

Se da a conocer la diferenciación adicional de células que expresan marcadores característicos de células endodérmicas de intestino anterior mediante tratamiento con medios de cultivo suplementados con hormona tiroidea T3/T4, o un inhibidor de ALK5, o tanto T3/T4 como un inhibidor de ALK5. Se da a conocer la diferenciación adicional

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de tales células en la fase 4 a la fase 6 por tratamiento con medios de cultivo suplementados con (a) T3, (b) un inhibidor de ALK5 o (c) T3 y un inhibidor de ALK5 en una o más de estas fases.

Además se da a conocer un método para producir células que expresan marcadores característicos de células endocrinas pancreáticas a partir de células madre pluripotentes que comprende:

a. cultivar células madre pluripotentes;

b. diferenciar las células madre pluripotentes en células que expresan marcadores característicos de células endodérmicas de intestino anterior; y

c. diferenciar las células que expresan marcadores característicos de células endodérmicas de intestino anterior en células que expresan marcadores característicos de células endocrinas pancreáticas mediante tratamiento con un medio suplementado con (i) T3/T4, (ii) un inhibidor de ALK5, o (iii) tanto T3/T4 como un inhibidor de ALK5.

En una realización, las células que expresan marcadores característicos de células endocrinas pancreáticas son células p. En otra realización, las células resultantes son positivas para NKX6.1, PDX1 y HB-9. El método puede mejorar el número de células positivas para HB9 en células precursoras endodérmicas pancreáticas positivas para NKX6.1. El método también puede disminuir la expresión de NKX2.2 o SOX2, o ambas, así como la expresión de albúmina. El método dado a conocer en el presente documento también puede proporcionar células que expresan marcadores característicos de células endocrinas pancreáticas, incluyendo células p, mediante cultivo de células que expresan marcadores característicos de células endodérmicas/endocrinas pancreáticas en un medio suplementado con T3/T4. Los métodos de producción de células que expresan marcadores característicos de células endocrinas pancreáticas a partir de células madre pluripotentes pueden emplear las condiciones de cultivo mostradas en las tablas I a III, o descritas en el presente documento. En una realización, el inhibidor de ALK 5 es SD208 (2-(5-cloro-2-fluorofenil)pteridin-4-il]piridin-4-il-amina). En otra realización, también puede usarse inhibidor II de ALK5 ((2-(3-(6-metilpiridin-2-il)-1H-pirazol-4-il)-1,5-naftiridina), ALX-270-445, ENZO, Farmingdale, NY).

El tratamiento de células en las fases 4 a 6 con medios de cultivo suplementados con T3/T4, un inhibidor de ALK5, o ambos, proporciona varias ventajas. Por ejemplo, la adición de las hormonas tiroideas en la fase 4 a la fase 6 regula negativamente significativamente glucagón, somatostatina y grelina mientras que aumenta moderadamente la expresión de insulina en la fase 5. La adición de T3/T4 en las fases 4 a 6 también parece disminuir significativamente la expresión de NKX2.2 sin afectar a la expresión de NKX6.1 y PDX1. Además, la adición de T3/T4 en las fases 4 a 6 suprime la expresión de SOX2 (marcador de estómago) y albúmina (marcador de hígado) sin afectar a la expresión de CDX2 (marcador de intestino). Además, en comparación con un control no tratado, el tratamiento con T3 en la fase 4 aumenta el número de células positivas para HB9 en la fase 6. Además, el tratamiento con T3 dio como resultado un mayor número de células positivas para NKX6.1 que expresan HB9. La exposición prolongada tanto a un inhibidor de ALK5 como a T3/T4 parece potenciar significativamente la expresión de HB9 mientras se mantiene una expresión robusta de NKX6.1. La inclusión de T3/T4 en un medio de cultivo, parece, de una manera dependiente de la dosis, mejorar significativamente el número de células positivas para HB9 en las células precursoras endodérmicas pancreáticas positivas para NKX6.1.

Por consiguiente, se describen adicionalmente métodos de regulación negativa de glucagón, somatostatina y grelina en las células diferenciadas proporcionadas en la fase 4 a la fase 6 mediante tratamiento con un medio suplementado con al menos hormonas tiroideas T3/T4. Además, también se describen métodos para disminuir la expresión de NKX 2.2 en las células diferenciadas proporcionadas en la fase 4 a la fase 6 que expresan NKX6.1 y PDX1 por tratamiento con un medio suplementado con al menos hormonas tiroideas T3/T4. Además, se dan a conocer en el presente documento métodos para aumentar células positivas para NKX6.1 que expresan HB9 mediante cultivo en un medio con hormonas tiroideas T3/T4 y opcionalmente un inhibidor de ALK5. En ciertas realizaciones, los métodos usan las condiciones de cultivo mostradas en las tablas I - III.

En el presente documento se da a conocer un método para formar células que expresan marcadores característicos de células p que comprende diferenciar células que expresan marcadores característicos del endodermo de intestino anterior en células que expresan marcadores característicos de células p mediante tratamiento con medios suplementados con hormonas tiroideas T3/T4, un inhibidor de ALK5, o ambos (tal como T3 y un inhibidor de ALK5). Las células resultantes son positivas para NKX6.1, PDX1 y Hb-9. El método puede usarse para mejorar el número de células positivas para HB9 en células precursoras endodérmicas pancreáticas positivas para NKX6.1. El método también puede usarse para disminuir la expresión de NKX2.2. Adicionalmente, el método puede usarse para suprimir la expresión de albúmina y SOX2. La hormona tiroidea puede ser T3. El método también puede usarse para potenciar la expresión de HB9 en comparación con células que no se cultivan con un medio suplementado con T3 y un inhibidor de ALK5. Además, el método comprende la formación de células que expresan marcadores característicos de células p mediante el cultivo de células que expresan marcadores celulares característicos de células precursoras endodérmicas/endocrinas pancreáticas en un medio suplementado con T3/T4. El método puede emplear las condiciones de cultivo mostradas en las tablas I - III o descritas en el presente documento.

También se da a conocer en el presente documento un método para regular negativamente glucagón, somatostatina y grelina en células que expresan marcadores característicos de células precursoras de intestino anterior pancreáticas, células que expresan marcadores característicos de células precursoras endodérmicas/endocrinas pancreáticas o células que expresan marcadores característicos de células endocrinas pancreáticas mediante el cultivo de las células en un medio suplementado con T3/T4 y un inhibidor de ALK5. El medio puede suplementarse adicionalmente con un inhibidor de ^sM^o, un antagonista de la ruta de señalización de SHH (tal como SANT-1), ácido retinoico y ácido ascórbico. Alternativamente, el medio puede suplementarse adicionalmente con un inhibidor de SMO o un antagonista de la ruta de señalización de SHH, ácido retinoico y ácido ascórbico. El medio, especialmente cuando se usa en la fase 4, preferiblemente puede suplementarse con FGF7. El método puede emplear las condiciones de cultivo mostradas en las tablas I - III o descritas en el presente documento.

Específicamente, en ciertas realizaciones, las células pueden tratarse en la fase 4 a la fase 6 (es decir, en la fase 4 y la fase 5 y la fase 6, o en la fase 4 y la fase 5, o en la fase 5 y la fase 6, o en la fase 4 y la fase 6) como se indica en la tabla I a continuación, que muestra condiciones de cultivo a modo de ejemplo adecuadas para su uso en los métodos de la invención. Como se da a conocer en el presente documento, uno cualquiera de los tratamientos en una fase (por ejemplo, la fase 4) puede combinarse con uno cualquiera de los tratamientos en otra fase (por ejemplo, la fase 5).

Además se da a conocer un cultivo celular in vitro para diferenciar células derivadas de células madre pluripotentes en células que expresan marcadores característicos de células p endocrinas pancreáticas, así como PDX1, NKX6.1 y HB9. El cultivo celular comprende un recipiente de cultivo, medio de diferenciación, y una población de células diferenciadas derivadas de células madre pluripotentes. El cultivo celular proporciona una población de células diferenciadas en donde al menos el diez por ciento de las células diferenciadas expresan PDX1, NKX6.1 y HB9. Medios útiles en el cultivo celular se exponen en las tablas I-III, y preferiblemente contienen T3/T4, o un inhibidor de ALK5, o ambos.

Aunque generalmente se prefiere T3, pueden usarse otras hormonas tiroideas en lugar de T3. En particular, puede usarse T4 en lugar de T3, así como análogos adecuados de T3 y T4. Análogos de hormona tiroidea adecuados pueden incluir: GC-1 (Sobertirome) disponible de R & D Systems Inc., n.° de catálogo 4554; DITPA (ácido 3,5-diyodotiropropiónico); KB-141, comentado en J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 2008, 111: 262-267 y Proc. Natl. Acad. Sci. US 2003, 100: 10067-10072; MB07344, comentado en Proc. Natl. Acad. Sci. US 2007, 104: 15490-15495; T0681, comentado en PLoS One, 2010, 5e8722 y J. Lipid Res. 2009, 50: 938-944; y GC-24, comentado en PLoS One, 2010 e8722 y Endocr. Pract. 2012, 18(6): 954-964. Las cantidades de T3, inhibidor de ALK5, SANT-1, ácido retinoico, ácido ascórbico, FGF7, LDN-193189 y TPB pueden variar en cada fase. Intervalos adecuados a modo de ejemplo de estos componentes se muestran a continuación en la tabla II.

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Los métodos de la invención pueden incluir además tratar células que expresan marcadores característicos de células endodérmicas de intestino anterior con un medio suplementado con SANT-1, ácido retinoico (“RA”), FGF7, LDN-193189, ácido ascórbico y TPB durante aproximadamente de dos a cuatro días, preferiblemente aproximadamente tres días, para diferenciar las mismas en células que expresan marcadores característicos de células precursoras de intestino anterior pancreáticas. En particular, pueden tratarse células de fase 3 con un medio suplementado con SANT-1 aproximadamente 0,25 |iM; RA aproximadamente 100 nM; aproximadamente 2 ng/ml de FGF7; LDN-193189 aproximadamente 100 nM; y ácido ascórbico aproximadamente 0,25 mM; y TPB aproximadamente 100 nM durante tres días. El medio se suplementa adicionalmente con T3, tal como aproximadamente 1 |iM de T3.

Además, los métodos pueden incluir el tratamiento de células que expresan marcadores característicos de células precursoras de intestino anterior pancreáticas con un medio suplementado con SANT-1, RA, ácido ascórbico, y un inhibidor de ALK5 durante aproximadamente de dos a tres días para diferenciar las células en células que expresan marcadores característicos de células precursoras endodérmicas/endocrinas pancreáticas. El medio se suplementa adicionalmente con T3. Las células de fase 4 pueden diferenciarse en células de fase 5 tratando las células con un medio suplementado con SANT-1 aproximadamente 0,25 |iM, RA aproximadamente 50 nM, ácido ascórbico aproximadamente 0,25 mM, e inhibidor de ALK5 aproximadamente 500 nM. Además, las células de fase 4 pueden diferenciarse adicionalmente en células de fase 5 tratando las células con un medio suplementado con SANT-1 aproximadamente 0,25 |iM, RA aproximadamente 50 nM, ácido ascórbico aproximadamente 0,25 mM, inhibidor de ALK5 aproximadamente 1 |iM y T3/T4 0-1000 (por ejemplo, 100) nM durante aproximadamente de dos a cuatro días, preferiblemente aproximadamente tres días. Las células de fase 4 derivadas según las realizaciones de la invención pueden utilizarse y diferenciarse en células de fase 5.

Células que expresan marcadores característicos de células precursoras endodérmicas/endocrinas pancreáticas pueden diferenciarse en células que expresan marcadores característicos de células endocrinas pancreáticas tratando las mismas con un medio suplementado con SANT-1, RA, ácido ascórbico y (1) T3/T4 o (2) inhibidor de ALK5 y T3/T4 durante aproximadamente de dos a cuatro días, preferiblemente aproximadamente tres días. Por ejemplo, células de fase 5 pueden diferenciarse en células de fase 6 mediante tratamiento con un medio suplementado con SANT-1 aproximadamente 0,25 |iM, RA aproximadamente 50 nM, ácido ascórbico aproximadamente 0,25 mM y aproximadamente 1 |iM de T3/T4 durante aproximadamente tres días. Alternativamente, células de fase 5 pueden diferenciarse en células de fase 6 mediante tratamiento con un medio suplementado con SANT-1 aproximadamente 0,25 |iM, RA aproximadamente 50 nM, ácido ascórbico aproximadamente 0,25 mM, inhibidor de ALK5 aproximadamente 500 nM y T3/T4 10 nM durante aproximadamente tres días. Alternativamente, células de fase 5 pueden diferenciarse en células de fase 6 mediante tratamiento con un medio suplementado con SANT-1 aproximadamente 0,25 |iM, RA aproximadamente 50 nM, ácido ascórbico aproximadamente 0,25 mM, aproximadamente 1 |iM de inhibidor de ALK5 y T3/T4 0-1000 nM durante aproximadamente tres días. Las células pueden cultivarse adicionalmente en tales medios según se desee, por ejemplo, durante un total de aproximadamente 15 días.

Células de fase 5 derivadas según las realizaciones de la invención pueden utilizarse y diferenciarse en células de fase 6.

Se dan a conocer además métodos para potenciar la expresión de HB9 tratando células de fase 4 a fase 6 en un medio que comprende T3/T4 o un inhibidor de ALK5 o combinaciones de los mismos. Las células de fase 4, de fase 5 y de fase 6 pueden ser células precursoras de intestino anterior pancreáticas, células precursoras endodérmicas/endocrinas pancreáticas y células endocrinas pancreáticas, respectivamente. La población de células tratada puede expresar al menos dos veces más proteína HB9 que cultivos no tratados. Además, el nivel de expresión de insulina puede verse afectado positivamente en cultivos tratados en comparación con cultivos no tratados. Sin embargo, la expresión de somatostatina, grelina y glucagón disminuye en cultivos tratados frente a cultivos no tratados. En realizaciones adicionales, células de fase 5 no expresan sustancialmente CDX2 o SOX2.

Además se da a conocer un método por etapas para diferenciar células pluripotentes que comprende cultivar células de fase 4 a fase 6 en un medio que comprende cantidades suficientes de T3/T4 o inhibidor de ALK5, o combinaciones de los mismos, para generar una población de células de linaje endodérmico pancreático positivas para NKX6.1, PDX1, y proteína HB9. Al menos el 5 % de células positivas de manera conjunta para PDX1 y NKX6.1 pueden expresar la proteína HB9. Alternativamente, al menos el 10 % de células positivas de manera conjunta para PDX1 y NKX6.1 pueden expresar la proteína HB9 Alternativamente, al menos el 20 % de células positivas de manera conjunta para PDX1 y NKX6.1 pueden expresar la proteína HB9. Alternativamente, al menos el 30 % de células positivas de manera conjunta para PDX1 y NKX6.1 pueden expresar la proteína HB9. Alternativamente, al menos el 40 % de células positivas de manera conjunta para PDX1 y NKX6.1 pueden expresar la proteína HB9. Además, al menos el 50 % de células positivas de manera conjunta para PDX1 y NKX6.1 pueden expresar la proteína HB9. Alternativamente, al menos el 60 % de células positivas de manera conjunta para PDX1 y NKX6.1 pueden expresar la proteína HB9. Alternativamente, al menos el 70 % de células positivas de manera conjunta para PDX1 y NKX6.1 pueden expresar la proteína HB9. Alternativamente, al menos el 80 % de células positivas de manera conjunta para PDX1 y NKX6.1 pueden expresar la proteína HB9. Alternativamente, al menos el 90 % de células positivas de manera conjunta para PDX1 y NKX6.1 pueden expresar la proteína HB9. Alternativamente, al menos el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % de células positivas de manera conjunta para PDX1 y NKX6.1 pueden expresar la proteína HB9.

Como se da a conocer para referencia, una población de células de linaje endodérmico pancreático que consiste en células positivas para PDX1, NKX6.1 y proteína HB9 pueden trasplantarse a animales diabéticos para una maduración adicional in vivo a células endocrinas pancreáticas funcionales. También se dan a conocer como referencia células que expresan insulina y NKX6.1 preparadas por los métodos de la invención. Además se da a conocer un proceso por etapas de diferenciación de células precursoras tales como células madre pluripotentes en células de linaje endodérmico pancreático que expresan HB9. Se dan a conocer una o más de estas etapas. En particular, el método abarca la etapa de diferenciar células madre pluripotentes en células que expresan marcadores característicos de células endodérmicas definitivas. Esta etapa puede llevar aproximadamente tres días. Estas células se diferencian luego en células que expresan marcadores característicos de células de tubo intestinal cultivando las células en condiciones apropiadas. En una realización, las células pueden cultivarse durante aproximadamente dos días. Las células que expresan marcadores característicos de células de tubo intestinal se diferencian luego en células que expresan marcadores característicos de células endodérmicas de intestino anterior. Esta diferenciación puede lograrse cultivando las células durante aproximadamente dos días. En realizaciones adicionales, las células madre pluripotentes son células madre pluripotentes embrionarias humanas.

Estas células se diferencian luego en células que expresan marcadores característicos de células precursoras de intestino anterior pancreáticas, que a su vez pueden diferenciarse en células que expresan marcadores característicos de células precursoras endodérmicas/endocrinas pancreáticas, que a su vez puede diferenciarse en células que

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expresan marcadores característicos de células endocrinas pancreáticas. Como se da a conocer en el presente documento, para lograr la diferenciación en células de linaje endodérmico pancreático que expresan HB9, las células que expresan marcadores característicos de células precursoras de intestino anterior pancreáticas, y células precursoras endodérmicas/endocrinas pancreáticas pueden cultivarse con uno o más de un inhibidor de receptor de activina (preferiblemente un inhibidor de ALK5), y/o una hormona tiroidea T3/T4 Las células que expresan marcadores característicos de células precursoras de intestino anterior pancreáticas, y las células precursoras endodérmicas/endocrinas pancreáticas pueden cultivarse con T3/T4. Se da a conocer además que las células que expresan marcadores característicos de células precursoras de intestino anterior pancreáticas, y las células precursoras endodérmicas/endocrinas pancreáticas pueden cultivarse con un inhibidor del receptor de activina. Las células pueden cultivarse tanto con un inhibidor del receptor de activina como con T3/T4. Los métodos dados a conocer en el presente documento son adecuados para cualquier célula que puede diferenciarse en células de linaje endodérmico pancreático que expresan HB9. La tabla III ilustra condiciones de cultivo adecuadas a modo de ejemplo para su uso en realizaciones de métodos de la invención. Como se usa en la tabla III a continuación, “MCX” es compuesto MXC, “AA” es activina, “inh. de ALK5” es inhibidor de ALK5, “RA” es ácido retinoico, “Vit. C” es ácido ascórbico, “inh.” es inhibidor, y “act.” es activador. Como se da a conocer en el presente documento, uno cualquiera de los tratamientos en una fase (por ejemplo, cualquiera de la fase 1, 2, 3, 4, 5 o 6) pueden combinarse con uno cualquiera de los tratamientos en otra fase (por ejemplo, cualquiera de la fase 1, 2, 3, 4, 5 o 6).

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Además se da a conocer un método para potenciar la expresión de HB9 cultivando una población de células de linaje endodérmico pancreático en medios que comprenden T3. Es posible que la población de células de linaje endodérmico pancreático no exprese sustancialmente CDX2 o SOX2. La población de células de linaje endodérmico pancreático puede obtenerse mediante una diferenciación por etapas de células pluripotentes. Las células pluripotentes pueden ser células pluripotentes embrionarias humanas.

Además se da a conocer un método para potenciar la expresión de HB9 cultivando una población de células de linaje endodérmico pancreático en un medio que comprende inhibidor de ALK5. La población de células de linaje endodérmico pancreático puede obtenerse mediante una diferenciación por etapas de células pluripotentes. Las células pluripotentes pueden ser células pluripotentes embrionarias humanas.

Además se da a conocer un método para potenciar la expresión de HB9 cultivando una población de células de linaje endodérmico pancreático en un medio que comprende un inhibidor de ALK5 y T3. La población de células de linaje endodérmico pancreático puede obtenerse mediante una diferenciación por etapas de células pluripotentes. Las células pluripotentes pueden ser células pluripotentes embrionarias humanas.

Además se da a conocer un método para potenciar la expresión de HB9 en células que expresan de manera conjunta PDX1 y NKX6.1 tratando tales células en un medio que comprende una cantidad suficiente de T3, inhibidor de ALK5 o combinaciones de los mismos.

También se da a conocer un método para producir células que expresan marcadores característicos de células pa partir de células madre pluripotentes, que incluye las etapas de: (a) cultivar células madre pluripotentes; (b) diferenciar las células madre pluripotentes en células que expresan marcadores característicos de células endodérmicas de intestino anterior; y (c) diferenciar las células que expresan marcadores característicos de células endodérmicas de intestino anterior en células que expresan marcadores característicos de células p mediante tratamiento con un medio suplementado con T3/T4, un inhibidor de ALK5, o ambos. Las células resultantes pueden ser positivas para NKX6.1, PDX1, y Hb-9. El método puede usarse para mejorar el número de células positivas para h B9 en células positivas para NKX6.1 que expresan marcadores característicos de células precursoras endodérmicas pancreáticas. El método también puede usarse para disminuir la expresión de NKX2.2. Además, el método suprime la expresión de albúmina y SOX2. Además, el método puede usarse para aumentar el rendimiento de células que expresan insulina.

Puede usarse T3. El método puede incluir cultivar células en un medio suplementado con T3 y un inhibidor de ALK5. El método también puede mejorar la expresión de HB9 en comparación con células que no se cultivan con un medio suplementado con T3 y un inhibidor de ALK5. El medio también puede suplementarse adicionalmente con uno cualquiera o más (por ejemplo, 1, 2, 3 o todos) de un inhibidor de SMO, un antagonista de la ruta de señalización de SHH (tal como ^sA ⁿT-1), ácido retinoico y ácido ascórbico. El método puede proporcionar células que expresan marcadores característicos de células p cultivando células que expresan marcadores característicos de células precursoras endodérmicas/endocrinas pancreáticas en un medio suplementado con T3, que también puede suplementarse adicionalmente con un inhibidor de ALK5.

Se da a conocer además un método para proporcionar células que expresan marcadores característicos de células p que incluye diferenciar células que expresan marcadores característicos de células endodérmicas de intestino anterior en células que expresan marcadores característicos de células p mediante tratamiento con un medio suplementado con T3/T4, un inhibidor de ALK5, o ambos. El medio puede suplementarse adicionalmente con un inhibidor del receptor de BMP y un activador de PKC. Las células resultantes son preferiblemente positivas para NKX6.1, PDX1 y Hb-9. El método puede usarse para mejorar el número de células positivas para HB9 en células precursoras endodérmicas pancreáticas positivas para NKX6.1, disminuir la expresión de NKX2.2, y/o suprimir la expresión de albúmina y SOX2. Preferiblemente, puede usarse T3. El método también puede incluir cultivar células en un medio suplementado con T3 y un inhibidor de ALK5. El método también puede mejorar la expresión de HB9 en comparación con células que no se cultivan con un medio suplementado con T3 y un inhibidor de ALK5. Además, el método puede incluir la formación de células que expresan marcadores característicos de células p cultivando células que expresan marcadores característicos de células precursoras endodérmicas/endocrinas pancreáticas en un medio suplementado con T3 y opcionalmente un inhibidor de ALK5.

Además se da a conocer un método para aumentar la expresión de HB9 y suprimir la expresión de albúmina y SOX2 cultivando células que expresan marcadores característicos de células precursoras de intestino anterior pancreáticas en un medio suplementado con T3/T4 y un inhibidor de ALK5. También se da a conocer un método para regular negativamente glucagón, somatostatina y grelina en células que expresan marcadores característicos de células precursoras de intestino anterior pancreáticas, células que expresan marcadores característicos de células precursoras endodérmicas/endocrinas pancreáticas, o células que expresan marcadores característicos de células endocrinas, que comprende cultivar las células en un medio suplementado con T3/T4 y un inhibidor de ALK5. El medio puede suplementarse adicionalmente con uno o más de un inhibidor de SMO, un antagonista de la ruta de señalización de SHH (tal como SANT-1), ácido retinoico y ácido ascórbico. Las células pueden ser células de fase 4 y el medio puede suplementarse adicionalmente con FGF7.

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También se da a conocer una célula o población de células que puede obtenerse por un método de la invención, o una célula o población de células obtenida por un método de la invención.

Además, se dan a conocer como referencia métodos de tratamiento. En particular, se dan a conocer métodos para tratar a un paciente que padece, o en riesgo de desarrollar, diabetes.

También se da a conocer una célula o población de células que puede obtenerse u obtenida por un método de la invención para su uso en un método de tratamiento. En particular, se da a conocer una célula o población de células que puede obtenerse u obtenida por un método de la invención para su uso en un método de tratamiento de un paciente que padece, o en riesgo de desarrollar, diabetes.

La diabetes puede ser diabetes tipo 1 o tipo 2.

Como se da a conocer para referencia, el método de tratamiento puede comprender implantar células obtenidas u que pueden obtenerse por un método de la invención en un paciente.

El método de tratamiento, dado a conocer solo como referencia, puede comprender diferenciar células madre pluripotentes in vitro en células de fase 1, fase 2, fase 3, fase 4, fase 5 o fase 6, por ejemplo, como se da a conocer en el presente documento, e implantar las células diferenciadas en un paciente.

El método puede comprender además la etapa de cultivar células madre pluripotentes, por ejemplo, como se describe en el presente documento, antes de la etapa de diferenciar las células madre pluripotentes.

El método puede comprender además la etapa de diferenciar células in vivo, después de la etapa de implantación.

El paciente puede ser un mamífero, preferiblemente un ser humano.

Como se da a conocer en el presente documento solo como referencia, las células pueden implantarse como células dispersas o formarse en agrupaciones que pueden infundirse en la vena porta hepática. Alternativamente, pueden proporcionarse células en soportes poliméricos degradables biocompatibles, dispositivos porosos no degradables o encapsulados para proteger las mismas de la respuesta inmunitaria del huésped. Las células pueden implantarse en un sitio apropiado en un receptor. Los sitios de implantación incluyen, por ejemplo, el hígado, páncreas natural, espacio subcapsular renal, epiplón, peritoneo, espacio subseroso, intestino, estómago, o una bolsa subcutánea.

Como se da a conocer solo como referencia, para mejorar adicionalmente la diferenciación, la supervivencia o la actividad de las células implantadas in vivo, factores adicionales, tales como factores de crecimiento, agentes antiinflamatorios o antioxidantes, pueden administrarse antes, simultáneamente con, o después de la administración de las células. Estos factores pueden secretarse por células endógenas y exponerse a las células administradas in situ. Pueden inducirse a las células implantadas para que se diferencien mediante cualquier combinación de factores de crecimiento endógenos y administrados exógenamente conocidos en la técnica.

La cantidad de células utilizadas en la implantación, dada a conocer en el presente documento solo como referencia, depende de varios factores, incluyendo el estado del paciente y la respuesta a la terapia, y puede determinarse por un experto en la técnica.

El método de tratamiento puede comprender además incorporar las células en un soporte tridimensional antes de la implantación. Las células pueden mantenerse in vitro sobre este soporte antes de la implantación en el paciente. Alternativamente, el soporte que contiene las células puede implantarse directamente en el paciente sin cultivo in vitro adicional, como se da a conocer solo como referencia. El soporte puede incorporarse opcionalmente con al menos un agente farmacéutico que facilita la supervivencia y la función de las células trasplantadas.

La presente invención no está limitada por los siguientes ejemplos.

Ejemplos

Ejemplo de referencia 1

Protocolos publicados anteriormente que generan una población endodérmica pancreática derivada de células pluripotentes humanas no expresan sustancialmente proteína HB9.

Este ejemplo se refiere a identificación del patrón de expresión de HB9 en células derivadas de células madre pluripotentes como se describe en este ejemplo. Las células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 (pase 40) se sembraron como células individuales a 1 x 105 células/cm2 en placas recubiertas con MATRIGEL™ (dilución 1:30; BD Biosciences, NJ) en medio MTESR®1 (StemCell Technologies, Vancouver, Canadá) suplementado con 10 |iM de Y27632 (inhibidor de Rock, n.° Y0503, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Cuarenta y ocho horas después de la siembra, los cultivos se lavaron con PBS incompleto (solución salina tamponada con fosfato sin Mg o Ca). Los cultivos se diferenciaron luego en células precursoras endodérmicas/endocrinas pancreáticas como se describió previamente en Diabetes, 61,2016, 2012. El protocolo de diferenciación usado fue el siguiente:

a. Cultivos adherentes con confluencia del 60-70 % de células H1 no diferenciadas se sembraron en placa sobre superficies recubiertas con MATRIGEL™ 1:30 se expusieron a medio RPMI 1640 (Invitrogen) suplementado con suero bovino fetal al 0,2 % (FBS) (Hyclone, Utah), 100 ng/ml de activina-A (AA; Pepro-tech; Rocky Hill, NJ), y 20 ng/ml de Wnt3A (R&D Systems) solo durante el día uno. Durante los siguientes dos días, las células se cultivaron en RPMI con FBS al 0,5 % y 100 ng/ml de AA.

b. Las células resultantes de (a) se expusieron a medio DMEM-F12 (Invitrogen) suplementado con FBS al 2% y 50 ng/ml de FGF7 (Pepro-tech) durante tres días.

c. Los cultivos resultantes de (b) se continuaron durante cuatro días en medio DMEM-HG (Invitrogen) suplementado con SANT-1 0,25 |iM (Sigma-Aldrich; St. Louis, MO), ácido retinoico 2 |iM (Sigma-Aldrich), 100 ng/ml de nogina (R&D Systems), y 1 % (v/v) de un suplemento vendido bajo la marca registrada B27® (n.° de catálogo 17504044, Life Technologies Corporation, Grand Island, NY).

d. Las células resultantes de (c) se cultivaron durante tres días en medio DMEM-HG suplementado con inhibidor 1 de ALK5 |iM (ALK5i; Farmingdale, NY), 100 ng/ml de nogina, TPB 50 nM ((2S,SS)-(E,E)-8-(5-(4-(Trifluorometil)fenil)-2,4-pentadienoilamino)benzolactama; EMD Chemicals Inc., Gibbstown NJ) y B27 al 1 % en formato de monocapa. Durante el último día de cultivo, las células se trataron con 5 mg/ml de dispasa durante 5 min, seguido de pipeteo suave para mezclar y romper en aglutinaciones celulares (< 100 micrómetros). Las agrupaciones celulares se transfirieron a un matraz de agitación de 125 ml de poliestireno desechable (Corning), y se centrifugaron a de 80 a 100 r. p. m. durante la noche en suspensión con DMEM-HG suplementado con inhibidor 1 de ALK5 |iM, 100 ng/ml de nogina y un 1 % de B27.

Al final de (d), se recogió ARNm para análisis de PCR de genes endodérmicos/endocrinos pancreáticos relevantes. El ARN total se extrajo con el Mini Kit RNeasy® (Qiagen; Valencia, CA) y se transcribió de manera inversa usando un kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad (Applied Biosystems, Foster City, CA) según las instrucciones del fabricante. El ADNc se amplificó usando la mezcla maestra universal Taqman® y ensayos de expresión génica Taqman® que se precargaron en matrices personalizadas Taqman® (Applied Biosystems). Los datos se analizaron usando el software de detección de secuencia (Applied Biosystems) y se normalizaron a células madre embrionarias humanas no diferenciadas (hES) usando el método AACt (es decir, resultados de qPCR corregidos con controles internos (AACt = ACtmuestra - ACtreferencia)). Todos los cebadores se adquirieron de Applied Biosystems. Los análisis de FACS e inmunofluorescencia se realizaron como se describió anteriormente (Diabetes, 61, 20126, 2012). El anticuerpo HB9 se obtuvo de Developmental Studies Hybridoma Bank (Universidad de Iowa, lowa). Como se usa en los ejemplos, Y27632 ((1R,4r)-4-((R)-1-aminoetil)-N-(piridin-4-il)ciclohexanocarboxamida) es un inhibidor de quinasa asociada a Rho (ROCK) de moléculas pequeñas permeable a células.

Las figuras 1A a 1C representan datos de análisis de PCR en tiempo real de la expresión de los siguientes genes en células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 diferenciadas en células precursoras endodérmicas/endocrinas pancreáticas como se describe en el ejemplo 1: PDX1 (figura 1A), NKX6.1 (figura 1B), y HB9 (figura 1C). Como se muestra en la figura 1, se detectó expresión robusta de ARNm de PDX1, NKX6.1 y HB9 en estos cultivos. Además, la expresión de ARNm de HB9 fue equivalente o mayor en estas células en comparación con los islotes cadavéricos humanos. Sin embargo, como se muestra en la figura 2, mientras que los datos de expresión génica para PDX1 y NKX6.1 estuvieron de acuerdo con la alta expresión de las proteínas correspondientes medida por análisis de FACs , la expresión de ARNm de HB9 fue discordante con la expresión de proteína de HB9. El día siguiente a la finalización de (d), es decir, el día 5, aproximadamente el 1 % de las células fueron positivas para HB9, mientras que aproximadamente el 50 % de las células fueron positivas para NKX6.1 y aproximadamente el 90 % fueron positivas para PDX1. La inmunotinción de las agrupaciones celulares también confirmó los datos de FACS. Como se muestra en las figuras 3A-B, un número significativo de células positivas para NKX6.1 y pocas células positivas para insulina estaban presentes en las agrupaciones. Sin embargo, no se detectaron células positivas para HB9 mediante inmunotinción (figura 3B).

Ejemplo de referencia 2

Adición de T3 en de la fase 4 a la fase 6 mejora el número de células positivas para HB9

Este ejemplo se refiere a la adición de T3 en de la fase 4 a la fase 6 para mejorar significativamente el número de células positivas para HB9.

Células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 (pase 40) se sembraron como células individuales a 1 X 105 células/cm2 en MATRIGEL™ (dilución 1:30; BD Biosciences, NJ) en medio mTeSR®1 suplementado con 10 |iM de Y27632. Cuarenta y ocho horas después de la siembra, los cultivos se lavaron con PBS incompleto (solución salina tamponada con fosfato sin Mg o Ca). Los cultivos se diferenciaron en células que expresan marcadores característicos de células precursoras endodérmicas/endocrinas pancreáticas mediante el protocolo descrito a continuación.

a. Fase 1 (3 días): Las células madre se cultivaron durante un día en: medio MCDB-131 (Invitrogen, n.° de catálogo 10372-019) suplementado con BSA libre de ácidos grasos al 2 % (Proliant, n.° de catálogo 68700), 0,0012 g/ml de bicarbonato de sodio (Sigma-Aldrich, n.° de catálogo S3187), 1X GlutaMax™ (Invitrogen, n.° de catálogo 35050-079), D-glucosa 4,5 mM (Sigma-Aldrich, n.° de catálogo G8769), 100 ng/ml de GDF8 (R&D Systems) y 1 |iM del compuesto MCX. Las células se cultivaron después durante un día adicional en medio MCDB-131 suplementado con BSA libre de ácidos grasos al 2 %, 0,0012 g/ml de bicarbonato de sodio, 1X GlutaMax™, D-glucosa 4,5 mM, 100 ng/ml de GDF8, y compuesto MCX 0,1 |iM. Las células se cultivaron después durante un día adicional en medio MCDB-131 suplementado con BSA libre de ácidos grasos al 2 %, 0,0012 g/ml de bicarbonato de sodio, 1X GlutaMax™, D-glucosa 4,5 mM, y 100 ng/ml de GDF8.

b. Fase 2 (2 días): Las células de fase 1 se trataron luego durante dos días con medio MCDB-131 suplementado con BSA libre de ácidos grasos al 2 %; 0,0012 g/ml de bicarbonato de sodio; 1X GlutaMax™; D-glucosa 4,5 mM; ácido ascórbico 0,25 mM (Sigma, MO) y 25 ng/ml de FGF7 (R & D Systems, MN).

c. Fase 3 (2 días): Las células de fase 2 se trataron luego con medio MCDB-131 suplementado con una dilución 1:200 de ITS-X (Gibco® Insulina-Transferrina-Selenio-Etanolamina; Invitrogen, Ca); glucosa 4,5 mM; 1X GlutaMax™; 0,0017 g/ml de bicarbonato de sodio; BSA libre de ácidos grasos al 2 %; SANT-1 0,25 |iM (Sigma, MO); RA 1 |iM (Sigma, MO); 25 ng/ml de FGF7; ácido ascórbico 0,25 mM; TPB 200 nM (activador de pKC; n.° de catálogo 565740; EMD Chemicals, Gibbstown, NJ); y LDN 100 nM (inhibidor de receptor de BMP; n.° de catálogo 04-0019; Stemgent) durante dos días.

d. Fase 4 (3 días): Las células de fase 3 se trataron luego con medio MCDB-131 suplementado con una dilución 1:200 de ITS-X; glucosa 4,5 mM; 1X GlutaMax™; 0,0017 g/ml de bicarbonato de sodio; BSA libre de ácidos grasos al 2 %; SANT-1 0,25 |iM; RA 100 nM; 2 ng/ml de FGF7; LDN-193189100 nM; ácido ascórbico 0,25 mM; y TPB 100 nM durante tres días.

e. Fase 5 (3 días): Las células de fase 4 se trataron luego con medio MCDB-131 suplementado con una dilución 1:200 de ITS-X; glucosa 4,5 mM; 1X GlutaMax™; 0,0015 g/ml de bicarbonato de sodio; BSA libre de ácidos grasos al 2 %; SANT-1 0,25 |iM; RA 50 nM; ácido ascórbico 0,25 mM; y 500 nM de inhibidor de ALK5 SD208 durante tres días. SD208 es 2-(5-cloro-2-fluorofenil)pteridin-4-il]piridin-4-il-amina) que tiene la estructura de fórmula I, y se da a conocer en Molecular Pharmacology 2007, 72:152-161. SD208 es un pteridina 2,4-disustituida, inhibidor competitivo de ATP de la quinasa TGF-pR I.

f. Fase 6 (3-15 días): Las células de fase 5 se trataron con medio MCDB-131 suplementado con una dilución 1:200 de ITS-X; glucosa 4,5 mM; 1X GlutaMax™; 0,0015 g/ml de bicarbonato de sodio; BSA libre de ácidos grasos al 2 %; SANT-1 0,25 |iM; RA 50 nM; ácido ascórbico 0,25 mM durante tres días.

En algunos cultivos, se añadió T3 1 |iM (T6397, Sigma, MO) en las fases 4 a 6. Al final de las fases 4 a 6, los cultivos de control y los cultivos tratados se analizaron mediante FACS e inmunotinción. Además, se recogió ARNm para los cultivos de control y los cultivos tratados en las fases 2 a 6.

La figura 4 representa los datos de FACS en la fase 4 (figura 4A), la fase 5 (figura 4B), y la fase 6 (figura 4C) para PDX1, NKX6.1 y HB9. Según los datos del ejemplo 1, aunque hubo un número sustancial de células positivas para NKX6.1 y PDX1 en las fases 4 a 6, la expresión de HB9 fue mucho menor. La expresión de HB9 alcanzó su punto máximo en la fase 5 y disminuyó en la fase 6. En general, la expresión de HB9 para las células generadas usando el protocolo descrito en el ejemplo 2 fue mayor en comparación con las células generadas usando el protocolo descrito en el ejemplo 1. La figura 5A muestra la expresión de ARNm de HB9 en comparación con islotes humanos en las

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fases 2 a 6. De manera similar al ejemplo 1, aunque el nivel de expresión de ARNm de HB9 en las fases 3 a 4 fue equivalente a islotes humanos, la expresión de proteína HB9 fue muy baja en la fase 4 (figura 5B).

Las figuras 6A a 6J representan datos de análisis de PCR en tiempo real de la expresión de los siguientes genes en células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 diferenciadas a la fase 4 como se describe en el ejemplo 2 y tratadas solo en la fase 4, de la fase 4 a la fase 5, de la fase 4 a la fase 6: NKX6.1 (figura 6A); PDX1 (figura 6B); NKX2.2 (figura 6C); glucagón (figura 6D); insulina (figura 6E); somatostatina (figura 6F); CDX2 (figura 6G); albúmina (figura 6H); gastrina (figura 6I); y SOX2 (figura 6J). La adición de T3 en las fases 4 a 6 reguló negativamente significativamente glucagón, somatostatina, y grelina mientras que aumentó moderadamente la expresión de insulina en la fase 5. La adición de T3 en las fases 4 a 6 parece haber disminuido significativamente la expresión de NKX2.2, mientras que aparentemente no afecta a la expresión de PDX1 y NKX6.1. Además, la adición de T3 suprimió la expresión de SOX2 (marcador de estómago) y albúmina (marcador de hígado) sin afectar a la expresión de CDX2 (marcador de intestino). La inmunotinción de cultivos de control y cultivos tratados en la fase 6 reveló un aumento significativo en el número de células positivas para HB9 en el grupo tratado con T3 (figura 7B) en comparación con el grupo de control (figura 7A) en la fase 6. Además, un número aumentado de células positivas para NKX6.1 mostró expresión de HB9 en cultivos tratados con T3.

Ejemplo de referencia 3

Tratamiento combinado con T3 y un inhibidor de ALK5 en la fase 6 mejora la expresión de HB9

Este ejemplo demuestra que la combinación de un inhibidor de ALK5 y T3 en el medio en la fase 6 parece aumentar significativamente la expresión de HB9.

Células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 (pase 40) se sembraron como células individuales a 1 X 105 células/cm2 en MATRIGEL™ (dilución 1:30; BD Biosciences, NJ) en medio mTeSR®1 suplementado con 10 |iM de Y27632. Cuarenta y ocho horas después de la siembra, los cultivos se lavaron con PBS incompleto (solución salina tamponada con fosfato sin Mg o Ca). Los cultivos se diferenciaron en linajes endodérmicos/endocrinos pancreáticos mediante el protocolo descrito a continuación.

a. Fase 1 (3 días): Las células se cultivaron durante un día en: medio MCDB-131 (Invitrogen, n.° de catálogo 10372 019) suplementado con BSA libre de ácidos grasos al 2 % (Proliant, n.° de catálogo 68700), 0,0012 g/ml de bicarbonato de sodio (Sigma-Aldrich, n.° de catálogo S3187), 1X GlutaMax™ (Invitrogen, n.° de catálogo 35050-079), D-glucosa 4.5 mM (Sigma-Aldrich, n.° de catálogo G8769), 100 ng/ml de GDF8 (R&D Systems) y compuesto MCX 1 |iM. Las células se cultivaron después durante un día adicional en medio MCDB-131 suplementado con BSA libre de ácidos grasos al 2 %, 0,0012 g/ml de bicarbonato de sodio, 1X GlutaMax™, D-glucosa 4,5 mM, 100 ng/ml de GDF8, y compuesto MCX 0,1 |iM. Las células se cultivaron después durante un día adicional en medio MCDB-131 suplementado con BSA libre de ácidos grasos al 2 %, 0,0012 g/ml de bicarbonato de sodio, 1X GlutaMax™, D-glucosa 4.5 mM, y 100 ng/ml de GDF8.

b. Fase 2 (2 días): Las células de fase 1 se trataron durante dos días con medio MCDB-131 suplementado con BSA libre de ácidos grasos al 2 %; 0,0012 g/ml de bicarbonato de sodio; 1X GlutaMax™; D-glucosa 4,5 mM; ácido ascórbico 0,25 mM (Sigma, MO) y 25 ng/ml de FGF7 (R & D Systems, MN).

c. Fase 3 (2 días): Las células de fase 2 se trataron con medio MCDB-131 suplementado con una dilución 1:200 de ITS-X (Invitrogen, Ca); glucosa 4,5 mM; 1X GlutaMax™; 0,0017 g/ml de bicarbonato de sodio; BSA libre de ácidos grasos al 2 %; SANT-1 0,25 |iM (Sigma, MO); RA 1 |iM (Sigma, MO); 25 ng/ml de FGF7; ácido ascórbico 0,25 mM; TPB 200 nM (activador de p Kc ; n.° de catálogo 565740; EMD Chemicals, Gibbstown, NJ); y LDN 100 nM (inhibidor de receptor de BMP; n.° de catálogo 04-0019; Stemgent) durante dos días.

d. Fase 4 (3 días): Las células de fase 3 se trataron con medio MCDB-131 suplementado con una dilución 1:200 de ITS-X; glucosa 4,5 mM; 1X GlutaMax™; 0,0017 g/ml de bicarbonato de sodio; BSA libre de ácidos grasos al 2 %; SANT-1 0,25 |iM; RA 100 nM; 2 ng/ml de FGF7; LDN-193189 100 nM; ácido ascórbico 0,25 mM; TPB 100 nM, y T3 1 |iM durante tres días.

e. Fase 5 (3 días): Las células de fase 4 se trataron con medio MCDB-131 suplementado con un dilución 1:200 de ITS-X; glucosa 4,5 mM; 1X GlutaMax™; 0,0015 g/ml de bicarbonato de sodio; BSA libre de ácidos grasos al 2 %; SANT-1 0,25 |iM; RA 50 nM; ácido ascórbico 0,25 mM; inhibidor 1 de ALK5 |iM SD208, y T3100 nM durante tres días.

f. Fase 6 (3-15 días): Las células de fase 5 se trataron con medio MCDB-131 suplementado con una dilución 1:200 de ITS-X; glucosa 4,5 mM; 1X GlutaMax™; 0,0015 g/ml de bicarbonato de sodio; BSA libre de ácidos grasos al 2 %; SANT-1 0,25 |iM; inhibidor de ALK5500 nM, RA 50 nM; ácido ascórbico 0,25 mM y T3 10 nM durante tres días.

Las figuras 8A y 8B representan inmunotinción para NKX6.1 y HB9 en la fase 6, día 7. La figura 8C representa datos de análisis de PCR en tiempo real de la expresión de la HB9 en células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 diferenciadas a la fase 6 como se describe en el ejemplo 3. La expresión de ARNm de HB9 junto con las imágenes de inmunotinción muestra que la exposición prolongada a inhibidor de ALK5 y T3 parece potenciar significativamente la expresión de HB9 mientras se mantiene una expresión robusta de NKX6.1. Las figuras 9A y 9B representan los datos de FACS en la fase 6, día 5 y día 15, respectivamente. Una fracción significativa de células de la fase 6 muestra la expresión de HB9 en cultivos de la fase 6, día 15.

Ejemplo de referencia 4

T3 de una manera dependiente de la dosis mejora la expresión de HB9

Este ejemplo muestra que T3 de una manera dependiente de la dosis puede usarse para mejorar la expresión de HB9 mientras se mantiene la expresión de NKX6.1 en la fase 6. Las células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 (pase 40) se sembraron como células individuales a 1 X 105 células/cm2 en MATRIGEL™ (dilución 1:30; BD Biosciences, NJ) en medio mTeSR®1 suplementado con 10 |iM de Y27632. Cuarenta y ocho horas después de la siembra, los cultivos se lavaron en PBS incompleto (solución salina tamponada con fosfato sin Mg o Ca). Los cultivos se diferenciaron en células que expresan marcadores característicos de células precursoras endodérmicas/endocrinas pancreáticas mediante el protocolo descrito a continuación.

a. Fase 1 (3 días): Las células se cultivaron durante un día en: medio MCDB-131 (Invitrogen, n.° de catálogo 10372 019) suplementado con BSA libre de ácidos grasos al 2 % (Proliant, n.° de catálogo 68700), 0,0012 g/ml de bicarbonato de sodio (Sigma-Aldrich, n.° de catálogo S3187), 1X GlutaMax™ (Invitrogen, n.° de catálogo 35050-079), D-glucosa 4.5 mM (Sigma-Aldrich, n.° de catálogo G8769), 100 ng/ml de GDF8 (R&D Systems) y compuesto MCX 1 |iM. Las células se cultivaron después durante un día adicional en medio MCDB-131 suplementado con BSA libre de ácidos grasos al 2 %, 0,0012 g/ml de bicarbonato de sodio, 1X GlutaMax™, D-glucosa 4,5 mM, 100 ng/ml de GDF8, y compuesto MCX 0,1 |iM. Las células se cultivaron después durante un día adicional en medio MCDB-131 suplementado con BSA libre de ácidos grasos al 2 %, 0,0012 g/ml de bicarbonato de sodio, 1X GlutaMax™, D-glucosa 4.5 mM y 100 ng/ml de GDF8.

c. Fase 3 (2 días): Las células de fase 2 se trataron luego con medio MCDB-131 suplementado con una dilución 1:200 de ITS-X (Invitrogen, Ca); glucosa 4,5 mM; 1X GlutaMax™; 0,0017 g/ml de bicarbonato de sodio; BSA libre de ácidos grasos al 2 %; SANT-1 0,25 |iM (Sigma, MO); RA 1 |iM (Sigma, MO); 25 ng/ml de FGF7; ácido ascórbico 0,25 mM; TPB 200 nM (activador de p Kc ; n.° de catálogo 565740; EMD Chemicals, Gibbstown, NJ); y LDN 100 nM (inhibidor de receptor de BMP; n.° de catálogo 04-0019; Stemgent) durante dos días.

d. Fase 4 (3 días): Las células de fase 3 se trataron luego con medio MCDB-131 suplementado con una dilución 1:200 de ITS-X; glucosa 4,5 mM; 1X GlutaMax™; 0,0017 g/ml de bicarbonato de sodio; BSA libre de ácidos grasos al 2 %; SANT-1 0,25 |iM; RA 100 nM; 2 ng/ml de FGF7; LDN-193189 100 nM; ácido ascórbico 0,25 mM; TPB 100 nM durante tres días.

e. Fase 5 (3 días): Las células de fase 4 se trataron luego con medio MCDB-131 suplementado con una dilución 1:200 de ITS-X; glucosa 4,5 mM; 1X GlutaMax™; 0,0015 g/ml de bicarbonato de sodio; BSA libre de ácidos grasos al 2 %; SANT-1 0,25 |iM; RA 50 nM; ácido ascórbico 0,25 mM; inhibidor 1 de ALK5 |iM SD208, y T30-1000 nM durante tres días.

f. Fase 6 (6 días): Las células de fase 5 se trataron luego con medio MCDB-131 suplementado con una dilución 1:200 de ITS-X; glucosa 4,5 mM; 1X GlutaMax™; 0,0015 g/ml de bicarbonato de sodio; BSA libre de ácidos grasos al 2 %; SANT-1 0,25 |iM; inhibidor de ALK5500 nM; RA 50 nM; ácido ascórbico 0,25 mM y T30-1000 nM durante seis días.

Las figuras 10A a 10E representan inmunotinción para NKX6.1 y HB9 en la fase 6, día 6. T3 de una manera dependiente de la dosis mejoró significativamente el número de células positivas para HB9 en las células precursoras endodérmicas pancreáticas positivas para NKX6.1. Las figuras 11A a 11L representan datos de análisis de PCR en tiempo real de la expresión de los siguientes genes en células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 diferenciadas a la fase 6 como se describe en el ejemplo 4: SOX2 (figura 11A); NKX6.1 (figura 11B); NKX2.2 (figura 11C); gastrina (figura 11D); PDX1 (figura 11E); NGN3 (figura 11F); PAX6 (figura 11G); PAX4 (figura 11H); insulina (figura 11I); glucagón (figura 11J); grelina (figura 11K); y somatostatina (figura 11L).

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Claims

REIVINDICACIONES

i. Un método para generar células que expresan marcadores característicos de células endocrinas pancreáticas que comprende cultivar células endodérmicas de intestino anterior en un primer medio de crecimiento suplementado con una hormona tiroidea pero sin inhibidor de ALK5 durante aproximadamente de dos a cuatro días, seguido de cultivar la población celular resultante en un segundo medio de crecimiento suplementado con tanto una hormona tiroidea como un inhibidor de ALK5 durante aproximadamente de dos a cuatro días.
2. El método según la reivindicación 1, en el que las células se cultivan posteriormente en un tercer medio de crecimiento suplementado con (i) hormona tiroidea u (ii) hormona tiroidea e inhibidor de ALK5 durante aproximadamente de dos a cuatro días.
3. El método según las reivindicaciones 1 o 2, en el que la hormona tiroidea se selecciona de triyodotironina (T3), tiroxina (T4), GC-1, ácido 3,5-diyodotiropropiónico (DITPA), KB-141, MB07344, T0681 o GC-24.
4. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la hormona tiroidea es T3.
5. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho inhibidor de ALK5 se selecciona del grupo que consiste en inhibidor II de ALK5, ALK5i, SD208, inhibidor de TGF-B SB431542, ITD-1, LY2109761, A83-01, LY2157299, inhibidor V de receptor de TGF-p, inhibidor I de receptor de TGF-p, inhibidor IV de receptor de TGF-p, inhibidor VII de receptor de TGF-p, inhibidor VIII de receptor de TGF-p, inhibidor II de receptor de TGF-p, inhibidor VI de receptor de TGF-p, inhibidor III de receptor de TGF-p, o en el que dicho inhibidor de ALK5 es el inhibidor II de ALK5.
6. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el medio se suplementa además con uno o más de SANT-1, ácido retinoico y ácido ascórbico.
7. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el método comprende además las etapas de

a. cultivar células madre pluripotentes humanas;

b. diferenciar las células madre pluripotentes humanas en células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo mediante el tratamiento de las células madre pluripotentes humanas con (i) activina A y Wnt3a o (ii) GDF-8 y 14-Prop-2-en-1-il-3,5,7,14,17,23,27-heptaazatetraciclo[19.3.1.1~2,6~.1~8,12~]heptacosa-1(25),2(27),3,5,8(26),9,11,21,23-nonaen-16-ona;

c. diferenciar las células características del linaje endodérmico definitivo en células que expresan marcadores característicos de células de tubo intestinal tratando las células características del linaje endodérmico definitivo con FGF-7 y ácido ascórbico, y

d. diferenciar las células que expresan marcadores característicos de células de tubo intestinal en dichas células endodérmicas de intestino anterior tratando las células que expresan marcadores característicos de células de tubo intestinal con (1) SANT-1, ácido retinoico y nogina o (2) FGF-7, ácido retinoico, SANT-1, un activador de PKC, un inhibidor de BMP y ácido ascórbico.
8. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dichas células que expresan marcadores característicos de células endocrinas pancreáticas producen insulina.
9. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dichas células que expresan marcadores característicos de células endocrinas pancreáticas expresan NKX6.1, PDX1 y HB9.

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